BR112018002887B1 - Vetor viral recombinante, seu uso, e composição imunogênica - Google Patents

Abstract

VACINAS DE HERPES-VÍRUS RECOMBINANTE EM PERUS E USOS DAS MESMAS. A presente invenção fornece um vetor viral recombinante compreendendo pelo menos um transgene inserido em um genoma viral de doença de Marek para o tratamento de doenças em aves. Também são fornecidas composições imunogênicas compreendendo tais vetores virais recombinantes e métodos para prevenir ou inibir a doença de Marek em combinação com pelo menos uma segunda doença em aves.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[1] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US. No. 62/203.305, depositado em 10 de agosto de 2015, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[2] A presente invenção refere-se ao campo da imunologia e mais especificamente a métodos e composições para a produção de vacinas vetoriais para tratamento de doenças em aves.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[3] A listagem de sequências contida no arquivo chamado “TAMC039WO_ST25.txt”, que tem 28,6 quilobytes, conforme medido no sistema operacional Microsoft Windows e foi criada em 2 de agosto de 2016, é arquivada eletronicamente e aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[4] A vacinação de aves é uma estratégia amplamente utilizada para prevenir surtos de doença de Marek (MD), doença infecciosa da bursa (IBD), doença de Newcastle (ND), bronquite infecciosa (IB), gripe aviária (AI), e laringotraqueíte infecciosa (ILT). Atualmente, vacinas vivas são usadas para controlar essas doenças. Usar vacinas vivas tem a desvantagem de proteger contra apenas uma única doença e muitas vacinas vivas usadas na indústria avícola causam uma forma leve da doença que afeta os rendimentos da produção. A proteção simultânea de aves contra múltiplas doenças através do uso de uma única vacina seria benéfica. Nos últimos anos, os vetores virais aviários recom- binantes foram utilizados experimental e comercialmente para vacinar aves contra essas doenças. O herpes-vírus da doença de Marek sorotipo 3 de peru (HVT) é o vetor de base mais comumente utilizado na indústria avícola. A HVT é também a vacina mais utilizada para controlar MD. Atualmente, existem vacinas de IBD vetorizada por HVT, ND vetorizada por HVT, AI vetorizada por HVT, e ILT vetorizada por HVT usadas para controlar a doença em bandos de aves em todo o mundo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[5] Em um aspecto, a invenção fornece um vetor viral recom- binante compreendendo ao menos um transgene inserido em um genoma viral de doença de Marek em uma região selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma; e (b) uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Em outra modalidade, ao menos um transgene compreende um primeiro transgene inserido na região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma, e um segundo transgene inserido na região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma, ou ao menos um transgene compreende mais de um transgene inserido na região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma, e a região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Em outra modalidade, o gene viral antigênico compreende um gene selecionado a partir do grupo que consiste em um gene do vírus da doença infecciosa da bursa, um gene do vírus da doença de Newcastle, um gene do vírus da gripe aviária, e um gene do vírus da laringotraqueíte infecciosa. Em outra modalidade, o gene do vírus da doença infecciosa da bursa é um gene VP2, ou o gene do vírus da doença de Newcastle é um gene F ou um gene HN ou uma quimera F/HN. Em outra modalidade, ao menos um transgene está operativamente ligado a um promotor heterólogo, tal como um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em um promotor IE de citomegalovírus humano, um promotor CMV de porquinho-da-índia, um promotor de SV40, um promotor de vírus da Doença de Aujeszky, um promotor X de glicoproteína, promotor do vírus do Herpes Simples tipo 1 e promotores de vírus da doença de Marek. Em outra modalidade, ao menos um transgene está operativamente ligado a um sinal poliA, tal como um sinal poliA de hormônio de crescimento bovino, um sinal poliA de SV40, um sinal poli (A) de AcNPV 1629 ORF, e um sinal poliA de HSV TK. Em outras modalidades adicionais, ao menos um transgene é inserido em um genoma viral de doença de Marek em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma.

[6] Em outras modalidades, a invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo tal vetor viral recombinante. Em uma modalidade, ao menos um transgene compreende um primeiro transgene inserido no genoma viral em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma; e um segundo transgene inserido no genoma viral em uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Em outra modalidade, tal composição imunogênica compreende ainda ao menos um terceiro transgene que confere proteção contra uma terceira doença. Ainda em outras modalidades, ao menos um transgene está operativamente ligado a um promotor heterólogo, ou o primeiro e o segundo transgene está operativamente ligado ao mesmo promotor, ou o primeiro transgene está operativamente ligado a um promotor heterólogo e o segundo transgene está operativamente ligado a um segundo promotor heterólogo. Em outras modalidades, ao menos um transgene codifica um gene viral selecionado a partir do grupo que consiste em um gene do vírus da doença infecciosa da bursa, um gene do vírus da doença de Newcastle, um gene do vírus da gripe aviária, e um gene do vírus da laringotraqueíte infeciosa, ou o gene do vírus da doença da bursa infecciosa é um gene VP2, ou o gene do vírus da doença de Newcastle é um gene F ou um gene HN ou uma quimera F/HN.

[7] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para prevenir ou inibir a doença de Marek em combinação com ao menos uma segunda doença em aves, compreendendo fornecer uma composição como aqui descrita a um pássaro, onde a composição é fornecida em uma quantidade eficaz para prevenir ou inibir a doença de Marek e ao menos uma segunda doença no pássaro. Em uma modalidade, a composição é fornecida ao pássaro por injeção. Em outras modalidades, a injeção é selecionada a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea e injeção no ovo, ou a composição é fornecida ao pássaro antes da infeção ou exposição a uma doença. Em outra modalidade, o pássaro é uma espécie de ave, tal como um frango, peru, codorna, ganso, pato, cisne, galinha de angola e pombo. Ainda em outra modalidade, a composição é fornecida ao pássaro em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável de ocorrência não natural.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[8] A Figura 1 mostra a orientação do gene VP2 clonado no vetor de clonagem pCR Topo TA.

[9] A Figura 2 mostra o gene VP2 clonado no vetor de clonagem pcDNA3.1 após a digestão com NheI e XbaI.

[10] A Figura 3 mostra o construto pcDNA VP2 E/2512 no qual o fragmento correspondente do gene Edgar VP2 foi removido.

[11] A Figura 4 mostra um fragmento de HVT DNA amplificado correspondente às posições 12878-14149 do genoma de HVT no vetor de PDCR 2.1 Topo TA. O braço esquerdo do segmento de HVT DNA amplificado foi de aproximadamente 507 pb, e o braço direito foi de 765 pb para recombinação homóloga.

[12] A Figura 5 representa o painel superior que mostra o construto produzido a partir da inserção da cassete do gene VP2 E/2512 no sítio HincII (13385-13386) do pCR Topo TA HVT 12878-14149. O painel inferior mostra elementos do cassete de expressão VP2 E/2512, incluindo o promotor de citomegalovírus humano (CMV) e o sinal poliA do hormônio de crescimento bovino.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[13] SEQ ID NO: 1 - Iniciador IBDV VP2 Start Nhel para amplificação do gene VP2 a partir da cepa Edgar do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV) juntamente com SEQ ID NO: 2.

[14] SEQ ID NO: 2 - Iniciador IBDV VP2 end XbaI para amplificação do gene VP2 da cepa Edgar de IBDV juntamente com SEQ ID NO: 1.

[15] SEQ ID NO: 3 - Iniciador HVT>12878 para amplificação de um fragmento de DNA correspondente a 12878-14149 do genoma HVT juntamente com SEQ ID NO: 4.

[16] SEQ ID NO: 4 - Iniciador HVT<14149 para amplificação de um fragmento de DNA correspondente a 12878-14149 do genoma HVT juntamente com SEQ ID NO: 3.

[17] SEQ ID NO: 5 - Iniciador pCVM para amplificação do cassete de expressão VP2 E/2512 e para amplificação de sequências reguladoras correspondentes ao promotor precoce imediato (IE) do citomegalovírus e à região poliA do hormônio de crescimento bovino, juntamente com SEQ ID NO: 6.

[18] SEQ ID NO: 6 - Iniciador BGH pA para amplificação do cassete de expressão VP2 E/2512 e para amplificação de sequências reguladoras correspondentes ao promotor precoce imediato (IE) do citomegalovírus e à região poliA do hormônio de crescimento bovino, juntamente com SEQ ID NO: 5.

[19] SEQ ID NO: 7 - Iniciador rVP2>628 para a detecção do gene VP2 no HVT-E2512 recombinante, juntamente com SEQ ID NO: 8, gerando um fragmento de DNA de 360 pb.

[20] SEQ ID NO: 8 - Iniciador rVP2<988 para a detecção do gene VP2 em HVT-E2512 recombinante, juntamente com SEQ ID NO: 7, gerando um fragmento de DNA de 360 pb.

[21] SEQ ID NO: 9 - Iniciador NDV F>start Nhel para amplificação do gene F a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle juntamente com SEQ ID NO: 10; e para a clonagem do gene F-P2A-HN a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle juntamente com SEQ ID NO: 13.

[22] SEQ ID NO: 10 - Iniciador NDV F>end XbaI para amplificação do gene F a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle.

[23] SEQ ID NO: 11 - Iniciador NDV HN start>XbaI para clonagem do gene HN a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle.

[24] SEQ ID NO: 12 - Iniciador NDV HN end<XbaI para clonagem do gene HN a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle.

[25] SEQ ID NO: 13 - Iniciador NDV F-P2A end<Xba para clonagem do gene F-P2A-HN a partir cepa Lasota da doença de Newcastle.

[26] SEQ ID NO: 14 - Sequência de nucleotídeo do quadro de leitura aberto VP2 E2512.

[27] SEQ ID NO: 15 - Sequência de aminoácidos deduzida do quadro de leitura aberto VP2 E2512.

[28] SEQ ID NO: 16 - Sequência do vetor de transferência de HVT contendo DNA genômico de HVT, o promotor de citomegalovírus humano (CMV), o quadro de leitura aberto VP2 E2512, e o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino.

[29] SEQ ID NO: 17 - Sequência de região estimuladora do promotor de citomegalovírus (CMV) do vetor de transferência de HVT.

[30] SEQ ID NO: 18 - Sequência do sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino.

[31] SEQ ID NO: 19 - Sequência do vetor de transferência HVT US10-Sorf3.

[32] SEQ ID NO: 20 - Sequência do gene HN a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle que foi clonado no sítio US10/Sorf3.

[33] SEQ ID NO: 21 - Sequência dos quadros de leitura abertos da quimera do gene F-2A-HN a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle que foi clonado no sítio US10/Sorf3.

[34] SEQ ID NO: 22 - Sequência do gene F a partir da cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle que foi clonado no sítio US10/Sorf3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[35] Segue uma descrição detalhada fornecida para auxiliar os versados na técnica. Os versados na técnica podem fazer modificações e variações nas modalidades aqui descritas, sem abandonar o espírito ou escopo da presente invenção.

[36] A presente invenção fornece um vírus recombinante da doença de Marek compreendendo ao menos um transgene inserido no genoma viral em uma região selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma; e (b) uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Também são fornecidas composições imunogênicas e métodos para tratar ou prevenir a doença de Marek (MD) em combinação com ao menos uma segunda doença viral.

[37] A doença de Marek é uma doença linfoproliferativa comum de frangos, causada pelo vírus da doença de Marek (MDV), o que pode resultar em perdas significativas na indústria avícola. Atualmente, MD é controlada em aves usando vacinas utilizando o sorotipo 3 de MDV, que é o herpes-vírus dos perus (HVT) relacionado. Ao introduzir genes de vírus de aves diferentes de MDV no genoma de HVT em posições genéticas particulares, os inventores conseguiram desenvolver novas vacinas virais recombinantes que permitem a proteção simultânea em aves contra MD e uma ou mais doenças adicionais através da administração de uma única vacina viral.

[38] De acordo com a invenção, os vetores virais recombinantes como aqui descritos podem permitir a proteção de aves contra dois ou mais agentes patógenos virais diferentes fornecendo vetores virais recombinantes que expressam genes de tais patógenos virais. Em algumas modalidades, os vetores virais recombinantes da presente invenção podem ser fornecidos a aves em uma composição imunogênica como aqui descrita. Genes de qualquer patógeno viral adequado para uso com um vetor viral recombinante tal como aqui descrito podem ser utilizados. Por exemplo, em algumas modalidades, o vetor viral recombinante pode expressar genes do vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da gripe aviária (AIV), bronquite infecciosa (IBV) e laringotraqueíte infecciosa (ILTV) ou similares.

[39] De acordo com a invenção, um transgene que confere proteção ou resistência a um vírus particular pode ser inserido no genoma viral em uma localização específica. Por exemplo, em algumas modalidades, um transgene como aqui descrito pode ser inserido no genoma viral em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma, e/ou pode ser inserido em uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Em outra modalidade, um vírus recombinante da doença de Marek da invenção pode ter um transgene inserido nestas duas regiões. Em outras modalidades, mais de um transgene pode ser inserido em uma ou ambas as regiões.

[40] Em algumas modalidades, o vetor viral recombinante pode expressar múltiplos genes a partir de uma única espécie de vírus ou pode expressar genes de mais de uma espécie de vírus de modo a obter resistência a múltiplos vírus. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção fornece um vetor viral recombinante compreendendo o genoma de HVT e ao menos um transgene de um patógeno viral diferente, fornecendo assim proteção em um pássaro tal como aves contra a doença de Marek, e ao menos outra doença viral. Por exemplo, em uma modalidade, um vetor viral recombinante de acordo com a invenção pode fornecer proteção em aves contra MDV e NDV, ou pode fornecer proteção contra MDV e IBDV, ou pode fornecer proteção contra MDV, NDV e IBDV.

[41] Os antígenos virais para expressão em aves por um vetor viral recombinante da presente invenção podem ser codificados por um gene viral, tal como um gene viral como aqui descrito. Um versado na técnica apreciará, nesse aspecto, que pode não ser necessário incorporar a totalidade de um gene viral particular para obter uma resistência viral desejada. Em vez disso, uma porção de tal gene pode ser usada. Pode ser desejável escolher uma porção específica de um gene desejado que seja específico a qualquer vírus alvo. A otimização de uma proteína viral desejada ou sequência codificando tal proteína independentemente do comprimento da proteína pode ser prontamente realizada utilizando as metodologias conhecidas na técnica que são apropriadas para utilização com a presente invenção. Um versado na técnica apreciará que modificações podem ser feitas em um gene ou genes virais, ou as proteínas codificadas desse modo, para aumentar a atividade da proteína viral quando introduzida no indivíduo. As modificações feitas em genes ou proteínas virais podem aumentar ou diminuir a resposta em um hospedeiro a um vírus específico.

[42] Em certas modalidades, um vírus recombinante da doença de Marek ou um vetor viral recombinante da invenção pode ter um transgene que codifica uma proteína viral ou produto gênico de IBDV, tal como uma proteína IBDV VP2 ou produto gênico. Em outra modalidade, tal vírus ou vetor viral recombinante pode ter um transgene que codifica uma proteína viral ou produto gênico de NDV, tal como uma proteína NDV F ou HN ou produto gênico. Em outra modalidade, tal vírus ou vetor viral recombinante pode ter um transgene codificando uma proteína viral ou produto gênico do vírus da gripe aviária (AIV), tal como uma proteína ou produto gênico AIV HA ou N. Em outra modalidade, tal vírus ou vetor viral recombinante pode ter um transgene codificando uma proteína viral ou produto gênico do vírus da Laringotraqueíte Infecciosa (ILTV), tal como um ILTV gB ou gC ou gD ou gE ou gI, proteína UL-32 ou produto gênico. Em outra modalidade, tal vírus ou vetor viral recombinante pode ter um transgene codificando uma proteína ou produto viral do vírus da bronquite infecciosa (IBV), tal como a proteína IBV S1 ou S2 ou produto gênico. Um transgene da invenção pode ter mais de um gene, incluindo uma proteína de fusão- gene ou produto gênico, tal como uma proteína de fusão NDV F-HN, quimera ou produto gênico. Em algumas modalidades, a sequência de codificação completa de tal gene pode ser utilizada de tal modo que uma proteína ou polipeptídeo de comprimento total ou totalmente funcional seja produzida. Alternativamente, uma porção ou fragmento de uma proteína ou polipeptídeo viral pode ser suficiente para fornecer proteção ou resistência a um vírus específico.

Isolamento de Genes ou Proteínas Virais

[43] Em modalidades da invenção, um gene viral como aqui descrito pode ser isolado utilizando sondas de ácido nucleico e/ou oligonucleotídeos sob condições de hibridização rigorosas, PCR ou microarranjo, bibliotecas de DNA de triagem, ou usando quaisquer outros métodos conhecidos na técnica. Um versado na técnica compreenderá prontamente como isolar genes ou proteínas virais para utilização de acordo com a invenção. Alternativamente, as bibliotecas de expressão podem ser usadas para clonar um vírus, suas variantes polimórficas, ortólogos, ou alelos, detectando homólogos imunologica- mente com antissoro ou anticorpos purificados dirigidos contra um vírus de outra espécie ou porções do mesmo.

[44] Os métodos para preparar e triar bibliotecas de cDNA são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, para preparar uma biblioteca de cDNA para clonar genes virais expressos pelo genoma, o mRNA pode ser transcrito reversamente para o cDNA usando transcriptase reversa. O cDNA pode então ser ligado a um vetor, tal como vetor recombinante, e introduzido em uma célula ou organismo hospedeiro para propagação, triagem e clonagem.

[45] Para uma biblioteca genômica, o DNA pode ser extraído de um tecido desejado e pode ser digerido usando enzimas biológicas, ou pode ser cortado mecanicamente. Os fragmentos de DNA resultantes podem então ser isolados a partir de fragmentos de DNA indesejados e construídos em um vetor apropriado, o qual pode então ser embalado in vitro. Os vetores recombinantes podem ser analisados por qualquer método conhecido na técnica.

[46] Métodos tais como reação em cadeia da polimerase (PCR e RT-PCR) e reação em cadeia da ligase (LCR) podem ser usados para amplificar as sequências de ácido nucleico diretamente a partir do mRNA, do cDNA, das bibliotecas genômicas ou das bibliotecas de cDNA. Os oligonucleotídeos degenerados podem ser concebidos para amplificar homólogos utilizando as sequências aqui fornecidas. Os sítios de endonuclease de restrição podem ser incorporados nos iniciadores. A reação em cadeia da polimerase ou outros métodos de amplificação in vitro podem também ser úteis, por exemplo, para clonar as sequências de ácido nucleico que codificam para que as proteínas sejam expressas, para fazer os ácidos nucleicos utilizados como sondas para detectar a presença da doença a ser alvo, tal como como MDV, NDV e/ou IBDV, codificando mRNA em amostras biológicas, para sequência de ácidos nucleicos, ou para outros fins. Os genes amplificados por PCR podem ser purificados a partir de agarose e clonados em um vetor apropriado.

[47] A expressão de genes virais também pode ser analisada por técnicas conhecidas, por exemplo, transcrição reversa e amplificação de mRNA, isolamento de RNA total ou poliA RNA, Northern blotting, dot blotting, hibridização in situ, proteção de RNase, tecnologia de arranjo de polinucleotídeos de alta densidade, e similar.

[48] Os ácidos nucleicos que codificam um genoma ou proteína viral podem ser utilizados com tecnologia de arranjo de oligonucle- otídeos de alta densidade (por exemplo, GeneChip™) para identificar genes virais, ortólogos, alelos, suas variantes e variantes polimórficas nesta invenção. O gene de escolha pode ser clonado em um vetor intermediário antes da transformação em células procarióticas ou eucarióticas para replicação e/ou expressão. Estes vetores intermediários podem ser vetores procarióticos, por exemplo, plasmídeos, ou vetores de transporte.

Modificação de Ácidos Nucleicos

[49] Qualquer número de métodos bem conhecidos dos versados na técnica podem ser usados para isolar e manipular uma molécula de DNA. Por exemplo, a tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser utilizada para amplificar uma molécula de DNA de partida particular e/ou para produzir variantes da molécula de DNA de partida. Moléculas de DNA ou seus fragmentos também podem ser obtidos por qualquer técnica conhecida, incluindo a síntese direta de um fragmento por meios químicos. Assim, todo ou uma porção de um ácido nucleico como aqui descrito pode ser sintetizada.

[50] Tal como aqui utilizado, o termo “ácidos nucleicos complementares” refere-se a duas moléculas de ácido nucleico que são capazes de hibridizar especificamente, onde as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura antiparalela de ácido nucleico de cadeia dupla. Nesse aspecto, diz-se que uma molécula de ácido nucleico é o complemento de outra molécula de ácido nucleico se apresentarem complementaridade completa. Diz-se que duas moléculas são “minimamente complementares” se podem se hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas entre si em ao menos condições convencionais de baixa estringência. Da mesma forma, as moléculas são ditas complementares se hibridizarem entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas entre si em condições convencionais de alta estringência. As condições convencionais de estringência são descritas por Sambrook, e outros (1989), e por Haymes e outros (1985).

[51] São permitidas partidas da complementaridade completa, desde que permaneça a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de cadeia dupla. Assim, para que uma molécula de ácido nucleico ou um fragmento da molécula de ácido nucleico sirva como iniciador ou sonda, tal molécula ou fragmento só precisa ser suficientemente complementar em sequência para poder formar uma estrutura estável de cadeia dupla sob as concentrações de solvente e sal particulares empregadas.

[52] Tal como aqui utilizado, os termos “identidade de sequência”, “similaridade de sequência” ou “homologia” são utilizados para descrever as relações de sequência entre duas ou mais sequências de nucleotídeos. A percentagem de “identidade de sequência” entre duas sequências é determinada pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre um número específico de nucleotídeos, onde a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com uma sequência de referência. Duas sequências são idênticas se o nucleotídeo em cada posição for o mesmo. Uma sequência de nucleotídeos quando observada na direção 5’ a 3’ é dita como sendo um “complemento” de, ou complementar a, uma segunda sequência de nucleotídeos observada na direção 3’ a 5’ se a primeira sequência de nucleotídeos exibe uma complementaridade completa com a segunda sequência ou sequência de referência. Tal como aqui utilizado, as moléculas da sequência de ácido nucleico são ditas como exibindo “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das sequências quando lido 5’ a 3’ é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lido 3’ a 5’. Uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de referência exibirá uma sequência idêntica à sequência complementar reversa da sequência de nucleotídeos de referência.

Vetores Recombinantes e Células Hospedeiras

[53] Um vetor de DNA recombinante pode ser, por exemplo, um plasmídeo linear ou circular. O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de uma célula hospedeira. Um vetor recombinante tal como aqui descrito pode ser um vetor de expressão, por exemplo, para permitir a produção de uma proteína desejada em uma célula hospedeira tal como uma célula bacteriana. As moléculas de ácido nucleico tal como aqui descritas ou os seus complementos ou fragmentos podem ser inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros microbianos para conduzir a expressão de uma sequência de codificação ligada ou outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis e são conhecidos na técnica para este fim, e a seleção do vetor apropriado depende do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e a célula hospedeira a ser transformada com o vetor. Cada vetor pode conter vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira particular com a qual é compatível. Os componentes vetoriais para a transformação bacteriana geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores selecionáveis, e um promotor induzível que permite a expressão de DNA exógeno.

[54] Tal como aqui utilizado, um “vírus recombinante da doença de Marek” ou “HVT recombinante” ou “vírus recombinante” denota um vírus infeccioso ou uma partícula viral que foi geneticamente modificada pela incorporação no genoma viral de uma ou mais sequências heterólogas de ácido nucleico, ou seja DNA que codifica para um gene ou fragmento viral ou porção dele não idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene naturalmente presente no vírus. Na infecção de uma célula pelo vírus recombinante da doença de Marek, o vírus recombinante expressa o gene heterólogo na forma de um polipeptídeo heterólogo.

[55] Um “vetor viral recombinante” ou “vetor viral”, tal como aqui utilizado, refere-se a um construto recombinante que é inserido em um vírus para introdução em uma célula hospedeira. Tal vetor de acordo com a invenção pode ser derivado de qualquer cepa de HVT. Conforme apropriado, genes virais ou sequências codificadoras de proteínas podem ser incorporados em tal vetor viral recombinante como aqui descrito para introdução em uma frango ou outras aves para proteção contra uma ou mais doenças virais.

[56] Tal como aqui utilizado, um “sítio de inserção” refere-se a uma região em um genoma viral em que um transgene ou DNA exógeno é inserido. Os sítios de inserção da presente invenção podem ser regiões intergênicas. Uma região intergênica de acordo com a invenção pode ser flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma ou pode ser flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Em algumas modalidades, os sítios de inserção da presente invenção podem incluir a totalidade ou uma porção de um gene flanqueador em ambos os lados da região intergênica. A inserção de um ou mais transgenes em uma dessas regiões permite a produção de um vetor viral recombinante que pode então ser introduzido em uma frango ou outras aves para proteção contra uma ou mais doenças. Em algumas modalidades, um transgene como aqui descrito pode ser inserido em um sítio de inserção como aqui descrito, além de um ou mais sítios de inserção conhecidos na técnica, por exemplo incluindo, mas não limitado ao locus IG1 do genoma de HVT, o locus SORF3-US2 do genoma de HVT, um locus entre os genes HVT 65 e HVT 66, e um sítio descrito nas Patentes US Nos. 6.045.803 e 5.980.906, aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[57] Tal como aqui utilizado, o termo “operativamente ligado”, quando utilizado em referência a uma sequência reguladora e uma sequência de nucleotídeos, significa que a sequência reguladora provoca a expressão regulada da sequência de nucleotídeos estrutural ligada. Os termos “sequências reguladoras”, “elementos reguladores” ou “elementos de controle” referem-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências 5’), dentro ou à jusante (sequências 3’) de uma sequência de nucleotídeos estrutural. Tais sequências influenciam o tempo e o nível ou quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução de uma sequência de nucleotídeos estrutural associada. As sequências reguladoras podem incluir, mas não estão limitadas a, promotores, sequências líderes, íntrons, potenciadores, estruturas de tronco-laço, sequências de ligação ao repressor, e sequências de reconhecimento de poliadeni- lação, incluindo, mas não limitadas a, um sinal poliA de hormônio de crescimento bovino, um sinal de poli(A) de vírus Simian 40 (SV40), um sinal poli(A) de vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) 1629 ORF, e um sinal poliA de timidina quinase (TK) de vírus de herpes simples (HSV). Um versado na técnica reconhecerá que podem ser utilizadas diferentes combinações de promotores e/ou elementos reguladores para aumentar ou diminuir a expressão de um transgene como aqui descrito.

[58] Os promotores que funcionam em diferentes espécies também são bem conhecidos na técnica. Os promotores úteis para a expressão de polipeptídeos incluem aqueles que podem ser induzidos, virais, sintéticos ou constitutivos, e/ou promotores que são específicos de tecido, regulados temporalmente, regulados espacialmente e regulados espaço-temporalmente. Por exemplo, um promotor útil de acordo com a invenção pode incluir, mas não está limitado a, um promotor precoce imediato (IE) de citomegalovírus (CMV), um promotor de CMV de porquinho-da-Índia, um promotor de SV40, promotores de Doença de Aujeszky Virus tal como o promotor X de glicoproteína, Vírus da Herpes Simples tipo 1, tal como o promotor alfa 4, promotores de vírus da doença de Marek, incluindo qualquer isolado ou cepa de MDV, tal como MDV-1, MDV-2 e HVT, por exemplo, um promotor que controla a expressão de glicoproteínas tais como como gC, gB, gE ou gI, promotores do vírus da Laringotraqueíte Infecciosa, tais como os genes glicoproteína gB, gE, gI, gD ou quaisquer outros promotores adequados. Um versado na técnica saberá bem como identificar um promotor útil de acordo com a invenção.

[59] De acordo com a invenção, um vírus recombinante da doença de Marek ou vetor viral recombinante como aqui descrito pode compreender um ou mais transgenes operativamente ligados a um ou mais promotores para a expressão de uma ou mais proteínas ou peptídeos virais ou fragmentos ou suas porções. Em algumas modalidades, um único transgene pode estar operativamente ligado a um único promotor, ou mais de um transgene pode estar operativamente ligado a um único promotor. Em outras modalidades, mais de um transgene pode estar presente em um vetor recombinante onde um primeiro transgene está operativamente ligado a um primeiro promotor, um segundo transgene está operativamente ligado a um segundo promotor.

Construção e Seleção de Vetores

[60] A construção de vetores contendo um ou mais componentes, tal como aqui descrito, útil para inserir genes ou transgenes, ou suas porções, em um sítio alvo é conhecida por um versado na técnica e pode empregar técnicas padrão de DNA recombinante. Um vetor ou construto de DNA recombinante pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável a uma célula. Os marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar células que contêm os ácidos nucleicos exógenos que codificam polipeptídeos ou proteínas como aqui descrito. Tal marcador pode codificar, por exemplo, resistência a biocidas, ou resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina, higromicina, etc.). Os marcadores selecionáveis são bem conhecidos dos versados na técnica e podem incluir quaisquer marcadores adequados para utilização de acordo com a invenção.

[61] Um vetor ou construto recombinante também pode incluir um marcador selecionável, que pode ser usado para monitorar a expressão, mas que não pode resultar na morte de uma célula. Os marcadores triáveis adequados podem incluir, por exemplo, um gene de β- glucuronidase ou uidA (GUS), um ou mais dos vários genes da proteína fluorescente, tal como a proteína fluorescente verde (GFP), a proteína fluorescente vermelha (RFP) ou qualquer uma de uma grande família de proteínas que fluorescem em comprimentos de onda característicos, um gene de β-lactamase, um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos, um gene de luciferase, um gene xylE, que codifica uma catecol dioxigenase que converte catecois cromogênicos, um gene de α-amilase, um gene de tirosinase, que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona, que por sua vez se condensa em melanina, ou uma α- galactosidase, que catalisa um substrato de α-galactose cromogênico.

Expressão de Proteínas em Células Hospedeiras

[62] Para obter a expressão de alto nível de um gene viral clonado, como aqui descrito, um ácido nucleico pode ser subclonado em um vetor de expressão que contém um forte promotor para a transcrição direta, e um terminador de transcrição/tradução. Para as proteínas codificadas, um sítio de ligação ao ribossoma para iniciação da tradução também pode ser incluído. Os promotores adequados para utilização em vetores de expressão são bem conhecidos na técnica, tal como um promotor bacteriano, um promotor viral ou similar. Sistemas de expressão para expressar uma proteína estão disponíveis em várias espécies procarióticas e eucarióticas conhecidas na técnica. Os kits comerciais para tais sistemas de expressão também estão prontamente disponíveis. Os sistemas de expressão eucarióticos para células de mamíferos, leveduras e células de insetos são bem conhecidos na técnica e também estão comercialmente disponíveis.

[63] A seleção de um promotor apropriado para direcionar a expressão de um ácido nucleico heterólogo dependerá da aplicação particular. Tal promotor pode ser posicionado a uma distância do sítio de início da transcrição heteróloga que é similar à distância em seu ambiente natural, embora um versado na técnica compreenda que alguma variação nesta distância pode ser permitida sem perda da função do promotor.

[64] Além de um promotor, um vetor de expressão contém tipicamente um cassete de transcrição ou expressão que contém todos os elementos necessários para a expressão de um ácido nucleico em uma célula hospedeira. Todos os vetores convencionais conhecidos na técnica que podem ser utilizados para expressão em células eucarió- ticas ou procarióticas podem ser utilizados para transportar informação genética para uma célula. Um cassete de expressão típico contém assim um promotor operativamente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica o ácido nucleico de escolha e os sinais correspondentes necessários para um processamento eficiente, por exemplo, sítios de ligação ao ribossoma, poliadenilação e terminação de tradução. Elementos adicionais podem incluir potenciadores e, para o caso do DNA genômico como o gene estrutural, íntrons com sítios doadores e aceitadores funcionais.

[65] Além de uma sequência promotora, tal como um promotor aqui apresentado, um cassete de expressão também pode conter uma região de terminação da transcrição à jusante do gene estrutural de modo a fornecer uma terminação de transcrição eficiente. A região de terminação pode ser do mesmo gene que a sequência promotora, ou pode ser de um gene diferente. Marcadores tal como proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes verdes ou vermelhas, β-gal, CAT e similares podem ser incluídos nos vetores como marcadores para transdução vetorial. Etiquetas de epítopo ou etiquetas de sequência também podem ser adicionadas a proteínas recombinantes para fornecer métodos convenientes de isolamento.

[66] Os vetores de expressão contendo elementos reguladores a partir de vírus eucarióticos são tipicamente utilizados em vetores de expressão eucarióticos, por exemplo, vetores SV40, vetores de vírus de papiloma, vetores retrovirais e vetores derivados do vírus Epstein-Barr. Outros vetores eucarióticos exemplificativos incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovírus pDSVE e qualquer outro vetor que permita a expressão de proteínas sob a direção do promotor de CMV, promotor precoce de SV40, promotor tardio de SV40, promotor de metalotioneína, promotor do vírus do tumor mamário murino, promotor do vírus do sarcoma de Rous, promotor de poliedrina, ou outros promotores conhecidos na técnica que podem ser eficazes para a expressão em células eucarióticas.

[67] A expressão de proteínas de vetores eucarióticos também pode ser regulada usando promotores induzíveis. Com promotores induzíveis, os níveis de expressão estão ligados à concentração de agentes indutores, tal como tetraciclina ou ecdisona, pela incorporação de elementos de resposta para estes agentes no promotor. Altos níveis de expressão podem ser obtidos a partir de promotores induzíveis na presença de um agente indutor. Alguns sistemas de expressão têm marcadores tais como timidina quinase e dihidrofolato redutase, que fornecem amplificação de genes.

[68] Um vetor de expressão também pode incluir um replicon que funciona em E. coli, um gene de resistência a antibióticos para a seleção de bactérias que abrigam plasmídeos recombinantes, e sítios de restrição únicos em regiões não essenciais do plasmídeo para permitir a inserção de sequências eucarióticas. Qualquer gene de resistência a antibióticos adequado para utilização com a presente invenção pode ser utilizado.

[69] Os métodos de transfecção padrão conhecidos na técnica podem ser utilizados para produzir linhagens de células bacterianas, de mamíferos, leveduras ou insetos que expressam grandes quantidades de proteína. Tais linhagens de células podem então ser purificadas utilizando técnicas padrão conhecidas, e as células procarióticas e/ou eucarióticas podem ser transformadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintético ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira. Tais métodos podem incluir, mas não estão limitados a, plasmídeos ou vetores virais, transfecção de fosfato de cálcio, fusão de protoplastos, eletroporação, biolísticos, lipossomas, microinjeção ou quaisquer métodos disponíveis na técnica.

[70] Depois de um vetor de expressão ou transgene ser introduzido em uma célula hospedeira, a célula pode então ser cultivada sob condições ótimas para a expressão da proteína desejada, que pode ser recuperada usando técnicas padrão conhecidas na técnica. Os patógenos virais ou proteínas virais tais como os aqui descritos podem então ser purificados para utilização em ensaios de diagnóstico, para produzir anticorpos e composições imunogênicas, e para a identificação de compostos antivirais. As proteínas de ocorrência natural podem ser purificadas a partir de amostras biológicas, tal como uma amostra de tecido a partir de um pássaro infectado com um vírus tal como aqui descrito, enquanto as proteínas recombinantes podem ser purificadas utilizando quaisquer métodos adequados ou sistemas de expressão conhecidos na técnica.

[71] Uma série de procedimentos para purificar proteína recombinante estão disponíveis na técnica. Por exemplo, as proteínas que têm propriedades de adesão molecular estabelecidas podem ser reversivelmente fusionadas a outra proteína. Adicionalmente, uma proteína específica pode ser adsorvida seletivamente a uma coluna de purificação e depois liberada da coluna em uma forma relativamente pura utilizando ligandos ou substratos adequados. A proteína fusionada pode então ser removida por atividade enzimática. As proteínas também podem ser purificadas usando colunas de afinidade. A proteína recombinante pode ser purificada a partir de qualquer fonte adequada.

Purificação de Proteína a Partir de Bactérias Recombinantes

[72] As proteínas recombinantes podem ser expressas por bactérias em grandes quantidades, por exemplo, usando um promotor induzível ou constitutivo. A indução do promotor usando IPTG é um exemplo de um sistema promotor induzível. As bactérias podem ser cultivadas a partir de cultura fresca ou congelada de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica.

[73] As proteínas expressas em bactérias podem formar agregados insolúveis chamados corpos de inclusão. Protocolos adequados para purificação de corpos de inclusão de proteínas são conhecidos na técnica. A lise de bactérias para a recuperação de proteínas expressas pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, que pode incluir a introdução de tampões químicos, sonicação, ruptura mecânica e similares. Os corpos de inclusão também podem ser solubilizados, e a suspensão de células lisadas pode ser centrifugada para remover detritos celulares indesejados. As proteínas do corpo de inclusão podem ser renaturadas por diluição ou diálise com um tampão apropriado.

[74] Proteínas recombinantes também podem ser obtidas a partir de periplasma de bactérias. Após a lise de células bacterianas, a fração periplasmática das bactérias pode ser isolada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. As proteínas recombinantes presentes no sobrenadante podem ser separadas das proteínas hospedeiras por técnicas de separação padrão bem conhecidas dos versados na técnica.

[75] As proteínas podem ser separadas usando qualquer técnica conhecida, por exemplo, fracionamento de solubilidade ou filtração diferencial de tamanho, que isola uma proteína com base no peso molecular usando filtração através de membranas de diferentes tamanhos de poro. A cromatografia em coluna pode ser utilizada para o isolamento de uma proteína de outras proteínas com base em tamanho, carga de superfície líquida, hidrofobicidade, ou afinidade para ligandos ou substratos. Além disso, os anticorpos criados contra uma proteína de interesse podem ser conjugados a uma coluna e as proteínas imuno- purificadas. Todos estes métodos são bem conhecidos na técnica. Será evidente para os versados na técnica que conhece as técnicas cromatográficas podem ser realizadas em qualquer escala e usando qualquer equipamento comercial apropriado.

Produção de Anticorpos

[76] Os métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais que reagem especificamente com proteínas virais, partículas de vírus e/ou ácidos nucleicos são conhecidos na técnica. Tais técnicas podem incluir a preparação de anticorpos por seleção de anticorpos a partir de bibliotecas de anticorpos recombinantes em fagos ou outros vetores, bem como a preparação de anticorpos policlonais e monoclonais por imunização de coelhos ou camundongos.

[77] Vários antígenos ou regiões antigênicas que compreendem uma proteína viral ou porções da mesma, partículas de vírus e/ou ácidos nucleicos podem ser usados para produzir anticorpos especificamente reativos a um patógeno viral desejado. Por exemplo, uma proteína viral recombinante ou um seu fragmento antigênico pode ser isolado utilizando quaisquer métodos aqui descritos ou conhecidos na técnica. As proteínas recombinantes podem ser expressas em células procarióticas ou eucarióticas e purificadas como aqui descrito. Os anticorpos monoclonais e/ou policlonais podem ser produzidos usando formas de ocorrência natural (em forma pura ou impura) ou proteínas recombinantes usando métodos conhecidos na técnica. Os peptídeos sintéticos derivados de uma sequência viral também podem ser utilizados para gerar anticorpos e podem ser conjugados a uma proteína transportadora e injetados em um animal capaz de produzir anticorpos (por exemplo, coelho).

[78] Os métodos de produção de anticorpos policlonais são conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, uma cepa de linhagem de ratos ou coelhos pode ser imunizada com uma proteína utilizando um adjuvante padrão, tal como um adjuvante aqui descrito, utilizando um protocolo de imunização padrão conhecido na técnica. Quando titulações apropriadamente altas de anticorpos para a proteína são obtidas, antissoro pode ser preparado e enriquecimento executado para obter anticorpos reativos à proteína.

[79] Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos por vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células de baço de um animal imunizado com um antígeno desejado podem ser imortalizadas, geralmente por fusão com uma célula de mieloma ou por transformação com vírus Epstein Barr (EBV), oncogenes, ou retrovírus ou outros métodos bem conhecidos na técnica. As células imortalizadas podem então ser triadas quanto à produção de anticorpos da especificidade desejada e afinidade ao antígeno. O rendimento dos anticorpos monoclonais produzidos por tais células pode ser aumentado por várias técnicas conhecidas, por exemplo, por injeção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado.

[80] Os anticorpos monoclonais e os soros policlonais podem ser coletados e titulados contra o antígeno ou proteína desejada em um imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio em fase sólida com a proteína imobilizada em um suporte sólido. Anticorpos específicos apenas para uma proteína viral particular também podem ser produzidos subtraindo-se outras proteínas de reação cruzada. Desta forma, anticorpos que se ligam apenas à proteína de escolha podem ser obtidos.

[81] Uma vez que os anticorpos específicos contra o antígeno viral desejado, tal como proteína, vírus e/ou ácido nucleico, estão disponíveis, o antígeno desejado pode ser detectado utilizando uma variedade de métodos de imunoensaio. O anticorpo também pode ser usado terapeuticamente.

[82] As proteínas ou associadas ou distintas de uma partícula viral como aqui descritas podem ser detectadas e/ou quantificadas usando qualquer um de vários ensaios de ligação imunológica bem reconhecidos. As partículas virais podem ser detectadas com base em um epítopo definido pelas proteínas virais como apresentado em uma partícula viral e/ou um epítopo definido por uma proteína viral que é separada de uma partícula viral (por exemplo, tal como pode estar presente em uma célula infectada). Os ensaios imunológicos podem usar um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína ou antígeno de escolha. O anticorpo pode ser produzido por qualquer um de vários métodos bem conhecidos dos versados na técnica. Os imunoensaios também podem usar um agente de marcação para se ligar especificamente ao complexo formado pelo anticorpo e antígeno para fins de detecção. O agente de marcação pode ser ele próprio uma das porções compreendendo o complexo anticorpo/antígeno. Assim, o agente de marcação pode ser um ácido nucleico de proteína viral marcado ou um anticorpo antiviral marcado. Alternativamente, o agente de marcação pode ser uma terceira porção, tal como um anticorpo secundário, que se liga especificamente ao complexo anticorpo/antí- geno. Um anticorpo secundário pode ser específico para anticorpos das espécies a partir das quais o primeiro anticorpo é derivado. Um agente de marcação pode ser modificado com uma fração detectável, tal como biotina, à qual outra molécula pode se ligar especificamente, tal como estreptavidina. Uma variedade de porções detectáveis é bem conhecida dos versados na técnica.

[83] Os imunoensaios para detecção de proteínas virais, vírus e/ou ácido nucleico em amostras são bem conhecidos na técnica. Tais ensaios podem ser competitivos ou não competitivos, e podem ser quantitativos ou não quantitativos. Os imunoensaios não competitivos são ensaios nos quais o antígeno pode ser detectado diretamente e, em alguns casos, a quantidade de antígeno diretamente medida. Em ensaios competitivos, o antígeno viral presente em uma amostra é detectado indiretamente por um sinal detectável associado a um antígeno viral conhecido adicionado (exógeno), deslocado de um anticorpo/antígeno antiviral pelo antígeno viral presente em uma amostra. Desta forma, tais ensaios também podem ser adaptados para fornecer uma medida indireta da quantidade de antígeno viral presente na amostra. Os imunoensaios de ligação competitiva também podem ser utilizados para determinar a reatividade cruzada, em que quaisquer anticorpos de reação cruzada podem ser removidos dos antissoros agrupados. Tipos de ensaio adicionais, incluindo, mas não limitados a, imunoensaios de Western blot ou lipossomas também podem ser utilizados de acordo com a presente invenção.

[84] Um versado na técnica apreciará que é frequentemente desejável minimizar a ligação não específica em imunoensaios. Particularmente, quando o ensaio envolve um antígeno ou anticorpo imobilizado em um substrato sólido, é desejável minimizar a quantidade de ligação não específica ao substrato. Os meios de redução de tal ligação não específica são bem conhecidos dos versados na técnica.

[85] Um ensaio como aqui descrito pode incluir um marcador ou grupo detectável que não interfere significativamente com a ligação específica do anticorpo utilizado no ensaio. Um grupo detectável pode ser qualquer material com uma propriedade física ou química detectável. Tais marcadores detectáveis são conhecidos na técnica e geralmente, qualquer marcador útil nesses métodos pode ser aplicado à presente invenção. Assim, um “marcador” tal como aqui utilizado pode ser qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Os marcadores úteis na presente invenção podem incluir grânulos magnéticos (por exemplo, DYNABEADS™), corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, Texas red, rodamina e similares), radiomarcadores (por exemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P), enzimas (por exemplo, peroxidase de rabanete, fosfatase alcalina e/ou outros conhecidos na técnica e utilizados em ELISA), e marcadores colorimétricos tais como ouro coloidal ou grânulos de vidro ou plástico colorido (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

[86] Um marcador de acordo com a invenção pode ser acoplado direta ou indiretamente ao componente desejado do ensaio de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Conforme descrito acima, uma ampla variedade de marcadores pode ser usada, com a escolha do marcador dependendo da sensibilidade, facilidade de conjugação com o composto, exigências de estabilidade, ou instrumentação disponível, entre outros.

[87] Os marcadores não radioativos podem ser acoplados por meios indiretos. Geralmente, uma molécula de ligando (por exemplo, biotina) é ligada covalentemente à molécula. O ligando pode então ligar- se a outra molécula (por exemplo, estreptavidina), que pode ser detectável de forma intrínseca ou ligado covalentemente a um sistema sinal, tal como uma enzima detectável, um composto fluorescente, ou um composto quimioluminescente. Os ligandos e os seus alvos correspondentes podem ser utilizados em qualquer combinação adequada com anticorpos que reconheçam um antígeno viral, ou anticorpos secundários que reconhecem um antígeno antiviral. As moléculas também podem ser conjugadas diretamente com compostos geradores de sinal, por exemplo, por conjugação a uma enzima ou fluoróforo. As enzimas de interesse a serem usadas como marcadores podem ser hidrolases, por exemplo, fosfatases, esterases e glicosidases, ou oxotasases, tal como peroxidases. Os compostos fluorescentes podem incluir fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona e similares. Os compostos quimioluminescentes podem incluir luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, por exemplo, luminol, ou outros conhecidos na técnica.

[88] Os meios de detecção de marcadores são bem conhecidos dos versados na técnica e dependerão do tipo de marcador utilizado. Por exemplo, a autorradiografia pode ser usada para detectar um marcador radioativo, ou os fluorocromos podem ser usados para detectar um marcador fluorescente. A fluorescência pode ser detectada visualmente, por exemplo, por detectores eletrônicos tais como dispositivos de carga acoplada (CCDs) ou fotomultiplicadores, e similares. Da mesma forma, os marcadores enzimáticos podem ser detectados fornecendo os substratos apropriados para a enzima e detectando o produto da reação resultante. Os marcadores colorimétricos ou quimioluminescentes podem ser detectados observando-se uma cor associada a um marcador particular. Em algumas modalidades, um formato de ensaio pode não exigir o uso de um componente marcado, mas pode ser detectado por inspeção visual simples.

Composições Farmacêuticas/Imunogênicas e Administração das mesmas

[89] Em alguns aspectos, os vetores recombinantes que compreendem um ou mais transgenes que expressam uma ou mais proteínas ou peptídeos virais ou seus fragmentos como aqui descrito podem ser usados como composições farmacêuticas ou composições imunogênicas para administrar a um indivíduo, tal como uma frango ou outras aves, de modo a fornecer proteção contra um ou mais vírus. Por exemplo, uma composição imunogênica como aqui descrita compreende um vetor recombinante com um ou mais transgenes como aqui descrito, que são inseridos no genoma viral, por exemplo, em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na única longa região do genoma e/ou em uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma. Em outros aspectos, proteínas ou peptídeos e fragmentos imunogênicos dos mesmos e/ou polinucleotídeos, bem como anticorpos antivirais e/ou células T, podem ser incorporados em composições farmacêuticas ou composições imunogênicas (por exemplo, vacinas). Em outra modalidade, uma composição imunogênica de acordo com a invenção pode compreender ao menos um terceiro transgene, um quarto transgene ou similar, que pode codificar proteínas virais adicionais. De tal maneira, é possível fornecer uma composição imunogênica a um indivíduo, tal como aves, que fornece proteção contra qualquer número desejado de vírus. As vacinas de vírus integral (vivas e atenuadas, ou replicativas incompetentes ou mortas) ou vacinas subunitárias, tal como proteínas virais estruturais ou não estruturais ou fragmentos imunogênicos dessas, podem ser usadas para tratar ou prevenir infecções virais provocando uma resposta imune em um indivíduo. Alternativamente, uma composição farmacêutica pode compreender uma célula apresentadora de antígeno transfectada com um polinucleotídeo viral de tal modo que a célula apresentadora de antígeno exprime um peptídeo viral.

[90] As composições imunogênicas de acordo com a invenção podem ser concebidas para gerar imunidade de anticorpo e/ou imunidade celular em um indivíduo. Tais composições podem compreender um ou mais desses compostos juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável de ocorrência não natural. Em outras modalidades, uma composição imunogênica de acordo com a invenção pode incluir mais de um adjuvante ou carreador farmaceuticamente aceitável de tal modo que ao menos um é de ocorrência não natural. Um carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer substância que melhore uma resposta imune em um indivíduo a um antígeno exógeno, incluindo mas não limitado a, adjuvantes, lipossomas, microesferas biodegradáveis. Um carreador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável pode conter uma substância destinada a proteger o antígeno do catabolismo rápido, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral, ou um estimulador de respostas imunes, tal como proteínas derivadas de Bortadella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. Os adjuvantes comercialmente disponíveis podem incluir, por exemplo, o Adjuvante Incompleto de Freund e o Adjuvante Completo, o Adjuvante 65 da Merck, sais de alumínio tal como o gel de hidróxido de alumínio (alum) ou o fosfato de alumínio; Oligonucleotídeos CpG, sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacarídeos catiônica ou anionicamente derivatizados; polifos- fazenos; microesferas biodegradáveis; e monofosforil lipídio A. Um versado na técnica será capaz de identificar carreadores farmaceuti- camente aceitáveis adequados para utilização com a presente invenção.

[91] As composições farmacêuticas ou imunogênicas e/ou as vacinas dentro do escopo da presente invenção também podem conter outros compostos, que podem ser biologicamente ativos ou inativos. Por exemplo, uma ou mais porções imunogênicas de outros antígenos podem estar presentes, ou incorporadas em um polipeptídeo de fusão ou como um composto separado, dentro de uma composição ou vacina de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, os polipeptídeos úteis com a presente invenção podem ser conjugados com outras macromoléculas. As composições farmacêuticas ou imunogênicas e as vacinas podem geralmente ser utilizadas para fins profiláticos e/ou terapêuticos. Por exemplo, de acordo com a invenção, uma composição como aqui descrita pode ser fornecida a um indivíduo, tal como um pássaro, antes da infecção ou exposição a um vírus, de modo a fornecer proteção contra infecção com um ou mais vírus ou desenvolvimento de sintomas de infecção. Em outras modalidades, tal composição pode ser fornecida a um indivíduo, tal como um pássaro, após a infecção ou a exposição a um ou mais vírus, de modo a fornecer o tratamento dos vírus no indivíduo, tal como reduzindo ou eliminando a infecção no indivíduo.

[92] As vacinas de ácido nucleico que codificam um genoma, uma proteína estrutural ou não estrutural, ou um seu fragmento de um vírus aqui descrito podem também ser utilizados para provocar uma resposta imune para tratar ou prevenir a infecção viral. Numerosas técnicas de entrega de genes são bem conhecidas. Os sistemas de expressão de ácido nucleico apropriados podem conter as sequências de DNA necessárias para expressão em um indivíduo (tal como um promotor e sinal de terminação adequados). Em algumas modalidades, um DNA como aqui descrito pode ser introduzido usando um sistema de expressão viral (por exemplo, vírus da doença de Marek ou HVT), o que pode envolver a utilização de um vírus não patogênico competente para replicação.

[93] As composições farmacêuticas ou imunogênicas podem ser fornecidas em recipientes de dose única ou multidoses, tal como ampolas ou frascos selados. Tais recipientes podem ser selados para preservar a esterilidade da composição até o uso. Em geral, as composições como aqui descritas podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. Alternativamente, tal composição pode ser armazenada em uma condição liofilizada que exige apenas a adição de um carreador líquido estéril imediatamente antes do uso.

[94] Tal como aqui descrito, uma composição imunogênica pode ser combinada com um veículo farmaceuticamente aceitável. A seleção de um veículo adequado pode ser determinada em parte pela composição particular sendo administrada (por exemplo, ácido nucleico, proteína, compostos moduladores ou célula transduzida), bem como pelo método particular utilizado para administrar a composição. Consequentemente, uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas ou imunogênicas que está disponível pode ser utilizada na presente invenção. A administração pode ser de qualquer maneira conveniente, por exemplo, por injeção, administração oral, inalação, aplicação transdérmica ou administração retal. A injeção de um vetor recombinante ou uma composição imunogênica como aqui descrita pode ser fornecida a um indivíduo, tal como aves, em uma única administração ou dose, ou pode ser administrada mais de uma vez, tal como doses repetidas.

[95] As formulações adequadas para administração parenteral, tal como, por exemplo, por via intra-articular (nas juntas), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, em ovo e subcutânea, incluem soluções de injeção estéril isotônicas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do indivíduo pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes. Na prática desta invenção, as composições podem ser administradas, por exemplo, por infusão intravenosa, por via oral, tópica, intraperitoneal, intravesical ou intratecal.

[96] Tais composições podem também compreender tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa, adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio), solutos que tornam a formulação isotônica, hipotônica ou fracamente hipertônica com o sangue de um indivíduo, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Os compostos também podem ser encapsulados dentro de lipossomas usando métodos conhecidos na técnica.

[97] As soluções e suspensões de injeção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis como aqui descrito. As células transduzidas por ácidos nucleicos para terapia ex vivo também podem ser administradas por via intravenosa ou parenteral como descrito acima. Uma injeção como aqui descrita pode envolver uma suspensão de uma ou mais de uma cultura de vírus morto, inativado, atenuado ou, de outra forma, não virulento, solução purificada ou não purificada de uma proteína viral, ou um ácido nucleico como aqui descrito. Uma solução de injeção também pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável como aqui descrito.

[98] As formulações adequadas para administração oral podem consistir de (a) soluções líquidas, tal como uma quantidade eficaz da proteína viral embalada ou ácido nucleico suspenso em diluentes, tal como água, solução salina ou PEG 400; (b) cápsulas ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, como líquidos, sólidos, grânulos ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; ou (d) emulsões adequadas. As formas de comprimidos podem incluir uma ou mais de lactose, sacarose, manitol, sorbitol, fosfatos de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico e outros excipientes, corantes, enchimentos, aglutinantes, diluentes, agentes tampão, agentes umidificantes, conservantes, agentes flavorizantes, corantes, agentes desintegrantes e carreadores farmaceuticamente compatíveis. As formas de losangos podem compreender o ingrediente ativo em um sabor, por exemplo, sacarose, bem como pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tal como emulsões de gelatina e glicerina ou sacarose e acácia, géis e similares contendo, além do ingrediente ativo, carreadores conhecidos na técnica.

[99] O composto de escolha, sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser feito em formulações de aerossol a serem administradas por inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propelentes aceitáveis pressurizados, tal como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e similares.

[100] A dose administrada a um indivíduo no contexto da presente invenção deve ser suficiente para efetuar uma resposta terapêutica benéfica no indivíduo ao longo do tempo. A dose será determinada pela eficácia do vetor particular empregado e pela condição do indivíduo, bem como o peso corporal e/ou a área superficial do paciente a ser tratado. O tamanho da dose também pode ser determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanhem a administração de um vetor particular, ou o tipo de célula transduzida em um paciente particular. Para as composições que compreendem um vetor tal como aqui descrito, a quantidade eficaz do vetor a ser administrado pode ser determinada em parte com base nos níveis plasmáticos circulantes do vetor, toxicidades do vetor, saúde do indivíduo e produção de anticorpos antivetor.

[101] Para a administração, os compostos e as células transdu- zidas da presente invenção podem ser administrados a uma taxa determinada pela DL-50 do inibidor, vetor ou tipo de célula transduzida, e os efeitos colaterais do inibidor, vetor ou tipo de célula em várias concentrações, conforme aplicado à massa e à saúde geral do indivíduo. A administração pode ser realizada por doses únicas, múltiplas ou divididas.

Detecção Imunológica de Polipeptídeos e Ácidos Nucleicos

[102] Os imunoensaios podem ser utilizados para detectar proteínas virais, partículas de vírus e/ou ácidos nucleicos. Tais ensaios podem ser úteis para aplicações terapêuticas e/ou de diagnóstico, tal como as aqui descritas. Os imunoensaios são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para analisar qualitativa ou quantitativamente proteínas, partículas de vírus e/ou ácidos nucleicos.

Ensaios para Proteínas Virais e Anticorpos para Antígenos Virais

[103] Em uma modalidade da presente invenção, a presença de um vírus tal como aqui descrito, um ácido nucleico viral ou uma proteína viral em uma amostra pode ser determinada por um imunoensaio. Os imunoensaios mediados por enzimas tal como ensaios de imunofluores- cência (IFA), ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA), ensaios de captura, testes de microaglutinação e ensaios de immunoblotting (por exemplo, Western Blot) podem ser prontamente adaptados para realizar a detecção de vírus ou proteínas virais. Um método ELISA pode ser eficaz para a detecção de um vírus ou proteína viral como aqui descrito. Tal ELISA pode, por exemplo, ter etapas tais como: (1) ligar um anticorpo ou antígeno antiviral a um substrato; (2) contatar o receptor ligado com uma amostra biológica contendo um vírus, um antígeno viral, uma proteína viral ou anticorpos para o vírus; (3) contatar a amostra biológica com um anticorpo ligado a uma porção detectável (por exemplo, enzima horseradish peroxidase ou enzima fosfatase alcalina); (4) contatar a amostra biológica com o substrato para a enzima; (5) contatar a amostra biológica com um reagente de detecção, tal como um reagente de cor; (6) observar um resultado detectável. Em algumas modalidades, uma amostra biológica adequada para uso em tal ELISA pode ser sangue ou outros fluidos. Em outra modalidade, um ELISA como aqui descrito pode detectar um vírus ou proteína viral em uma amostra de tecido. Tais métodos podem ser facilmente modificados pelos versados na técnica para detectar a presença de um anticorpo antiviral em uma amostra, ou uma proteína viral específica, bem como o vírus. Em certas modalidades, um ELISA de acordo com a invenção pode detectar a presença de um anticorpo antiviral.

[104] Os ensaios ELISA como aqui descritos podem incluir uma tira de nitrocelulose impregnada com uma proteína viral como aqui descrito. A tira de nitrocelulose pode produzir um resultado visual quando contactada com uma amostra de teste contendo anticorpos de nucleoproteína antiviral. Tal teste pode identificar um indivíduo que já tem anticorpos contra uma proteína viral e, portanto, o indivíduo pode ter imunidade ao vírus. A administração de uma composição imunogênica para prevenir a infecção viral, tal como aqui descrita, pode ser desnecessária nesse indivíduo e, portanto, a identificação de indivíduos que já têm anticorpos imunogênicos pode impedir a administração desnecessária de um composto imunogênico a tal indivíduo. Nesse aspecto, uma modalidade da presente invenção pode envolver a identificação de um indivíduo que não tem anticorpos antivirais usando um ensaio tal como aqui descrito, tal como um ensaio ELISA e, em seguida, fornecer uma composição imunogênica como aqui descrita a esse indivíduo de modo a prevenir a infecção viral. Em outra modalidade, uma tira de nitrocelulose para utilização em um ELISA de acordo com a invenção pode ser impregnada com um anticorpo, tal como anticorpo antiviral, e pode produzir um resultado visual quando em contato com uma amostra de teste contendo uma proteína viral. Tal teste pode identificar um indivíduo infectado com um vírus como descrito aqui.

[105] Outra técnica imunológica que pode ser útil na detecção de um vírus é um ensaio de inibição competitiva. Tal ensaio utiliza anticorpos monoclonais (MABs) reativos com um vírus específico. Um fluido biológico (por exemplo, sangue) a partir de um indivíduo pode ser colocado em contato com um primeiro anticorpo ligado a um substrato, e um anticorpo monoclonal marcado colocado em contato com o primeiro complexo anticorpo-vírus. A quantidade de inibição da ligação do anticorpo monoclonal é medida em relação a um controle.

[106] Como será facilmente compreendido por um versado na técnica, uma amostra biológica para uso nos ensaios acima pode ser obtida diretamente a partir de um indivíduo ou pode estar em uma forma parcialmente purificada. Um anticorpo específico para um vírus particular reagirá por ligação ao vírus como uma reação primária. Posteriormente, uma reação secundária com um anticorpo ligado ou marcado com uma porção detectável também pode ser adicionada de modo a aumentar a detecção da reação primária. Geralmente, na reação secundária, um anticorpo ou outro ligando que é reativo, ou especificamente ou não especificamente com um sítio de ligação diferente (epítopo) do vírus, será selecionado quanto à sua capacidade de reagir com múltiplos sítios no complexo de anticorpo e vírus. Assim, por exemplo, várias moléculas do anticorpo na reação secundária podem reagir com cada complexo formado pela reação primária, tornando a reação primária mais detectável.

[107] A porção detectável pode permitir a detecção visual de um precipitado ou uma mudança de cor, detecção visual por microscopia, ou detecção automática por espectrometria, medição radiométrica ou similares. Exemplos de porções detectáveis incluem fluoresceína e rodamina (para microscopia de fluorescência), horseradish peroxidase (para microscopia de luz ou eletrônica e detecção bioquímica), biotina- estreptavidina (para microscopia de luz ou eletrônica) e fosfatase alcalina (para detecção bioquímica por alteração de cor). Os métodos e porções de detecção utilizados podem ser selecionados, por exemplo, a partir de qualquer descrição aqui descrita ou disponível na técnica.

Detectando a Presença de um Ácido Nucleico Viral

[108] Em algumas modalidades, uma infecção viral como aqui descrita pode ser detectada com base no nível de um RNA ou DNA particular em uma amostra biológica. Iniciadores de um determinado vírus ou patógeno viral podem ser usados para detecção, diagnóstico e determinação da presença de um vírus. Qualquer iniciador adequado pode ser utilizado para detectar DNA genômico ou qualquer sequência nele contida, um quadro de leitura aberto ou gene, ou uma proteína de escolha, utilizando quaisquer métodos apropriados conhecidos na técnica. Uma sequência de ácido nucleico adequada pode ser utilizada como sondas ou iniciadores de cadeia simples ou dupla para a detecção de mRNA ou cDNA viral gerado a partir da mesma, como pode estar presente em uma amostra biológica. Os polinucleotídeos virais como aqui descritos podem também ser utilizados para gerar cópias adicionais dos polinucleotídeos, de modo a gerar oligonucleotídeos antissenso, ou como oligonucleotídeos formadores de cadeia tripla. Por exemplo, dois iniciadores de oligonucleotídeos podem ser utilizados em um ensaio baseado em PCR para amplificar uma porção de um cDNA viral derivado de uma amostra biológica, onde ao menos um dos iniciadores de oligonucleotídeos é específico (isto é, hibridiza com) o polinucleotídeo viral. Tais iniciadores podem ter qualquer comprimento suficiente para hibridizar e permitir a amplificação de um ácido nucleico viral tal como aqui descrito, incluindo ao menos aproximadamente 10 nucleotídeos, 11 nucleotídeos, 12 nucleotídeos, 13 nucleotídeos, 14 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 16 nucleotídeos, 17 nucleotídeos 18 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 22 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 26 nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 28 nucleotídeos, 29 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 35 nucleotídeos, 40 nucleotídeos, 45 nucleotídeos ou 50 nucleotídeos; ou de aproximadamente 12 a aproximadamente 50 nucleotídeos de comprimento, 15 a 30 nucleotídeos de comprimento, 15 a 25 nucleotídeos de comprimento, ou 20 a 30 nucleotídeos de comprimento. Os iniciadores de DNA adequados para uso com a presente invenção podem ser quaisquer iniciadores aqui descritos, tal como aqueles apresentados como SEQ ID NO: 1-13. Um nucleotídeo amplificado, por exemplo, um cDNA, pode então ser separado e detectado utilizando técnicas bem conhecidas, tal como eletroforese em gel. De modo similar, sondas de oligonucleotídeos que se hibridizam especificamente com um polinucleotídeo viral podem ser utilizadas em um ensaio de hibridização para detectar a presença de um polinucleotídeo viral em uma amostra biológica.

[109] Sondas de ácido nucleico ou iniciadores específicos para um vírus como aqui descrito podem ser gerados usando as sequências de polinucleotídeos aqui descritas. As sondas têm, de preferência, ao menos aproximadamente 12, 15, 16, 18, 20, 22, 24 ou 25 fragmentos de nucleotídeos ou outra sequência de polinucleotídeos que codifica um ácido nucleico ou polipeptídeo viral. As sondas de ácido nucleico podem ser inferiores a aproximadamente 200 pb, 150 pb, 100 pb, 75 pb, 50 pb, 60 pb, 40 pb, 30 pb, 25 pb 2 kb, 1,5 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,25 kb, 0,1 kb, ou 0,05 kb de comprimento. As sondas podem ser produzidas, por exemplo, por síntese química, amplificação por PCR, geração de polinucleotídeos mais longos usando enzimas de restrição, ou outros métodos bem conhecidos na técnica. Os polinucleotídeos aqui descritos também podem ser utilizados em métodos ou ensaios que envolvem a utilização de substratos sólidos, tais como matrizes. Tal matriz pode ter um ou mais polinucleotídeos diferentes, que podem ser imobilizados nas matrizes usando métodos conhecidos na técnica.

[110] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da invenção pode ser marcado de forma detectável. Os marcadores detectáveis podem incluir, mas não estão limitados a, radiomarcadores, fluorocromos, incluindo isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Texas Red, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2’,7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína, 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxi fluoresceína (5- FAM) ou N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxi-rodamina (TAMRA); marcadores radioativos, tal como 32P, 35S e 3H) e similares. Em algumas modalidades, um marcador detectável pode envolver múltiplas etapas (por exemplo, biotina-avidina, anticorpo hapteno-anti- hapteno, e similares).

[111] De acordo com a invenção, quaisquer métodos qualitativos ou quantitativos adequados conhecidos na técnica para detectar ácidos nucleicos virais específicos (por exemplo, RNA ou DNA) podem ser utilizados. Um ácido nucleico viral como aqui descrito pode ser detectado, por exemplo, por hibridização in situ em seções de tecido, usando métodos que detectam diferenças de pares de bases simples entre o ácido nucleico hibridizante, por transcriptase reversa-PCR, ou em Northern blots contendo poli A mRNA, ou outros métodos bem conhecidos na técnica. Para a detecção de polinucleotídeos virais no sangue ou amostras derivadas de sangue, métodos que permitem a detecção de desajustes de pares de bases simples podem ser utilizados.

[112] Uma sequência de ácido nucleico viral pode estar presente em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo infectado em níveis relativamente baixos e, por conseguinte, as técnicas de amplificação conhecidas na técnica (por exemplo, PCR) podem ser utilizadas para amplificar a sequência antes da realização de ensaios de hibridização.

[113] As sondas de ácido nucleico podem ser preparadas usando um genoma viral como aqui descrito. Tal sonda pode incluir ao menos aproximadamente 8 nucleotídeos ou mais e pode ser preparada sinteticamente ou por excisão a partir de polinucleotídeos recombi- nantes. Uma sonda como aqui descrita pode hibridizar com um ácido nucleico viral e, assim, tal sonda pode ser útil para a detecção de um vírus particular em uma amostra biológica. As sondas como aqui descritas também podem ser úteis para a identificação de indivíduos infectados, bem como para uma maior caracterização de genomas virais. Uma sonda para detectar polinucleotídeos virais (natural ou derivada) pode ser de um comprimento específico ou pode ter uma sequência que permita a detecção de sequências virais únicas por hibridização. Embora aproximadamente 6-8 nucleotídeos possam ser úteis, sequências mais longas podem ser preferenciais, por exemplo, sequências de aproximadamente 10-12 nucleotídeos ou de aproximadamente 20 nucleotídeos ou mais. Um versado na técnica estará bem ciente de como fazer e usar uma sonda conforme descrito aqui.

[114] As sondas de ácido nucleico podem ser preparadas utilizando métodos de rotina, incluindo, mas não limitados a, métodos sintéticos de oligonucleotídeos automatizados. Uma sequência útil para preparar tal sonda pode incluir um complemento a qualquer porção única de um genoma viral, por exemplo, uma porção do genoma viral que permite distinguir um vírus particular de outros vírus que podem estar presentes na amostra. Uma sonda como aqui descrita pode ter uma complementaridade completa para a sequência alvo de interesse, ou pode ter uma ou mais incompatibilidades. Uma sonda útil de acordo com a invenção tendo uma das incompatibilidades ainda hibridizará com a sequência alvo de interesse. Para o uso de tais sondas como diagnóstico, a amostra biológica a ser analisada pode ser tratada antes da análise, se desejado, para extrair os ácidos nucleicos contidos na mesma. Os ácidos nucleicos resultantes da amostra podem ser submetidos à eletroforese em gel ou a outras técnicas de separação por tamanho. Uma sonda pode ser marcada com um marcador detectável como aqui descrito. Os marcadores adequados e os métodos para marcar sondas são conhecidos na técnica e podem incluir quaisquer marcadores aqui descritos ou outros úteis com a presente invenção.

[115] Uma sonda pode ser completamente complementar a um genoma viral ou uma porção do mesmo (por exemplo, toda ou uma porção de uma sequência codificando uma proteína viral como aqui descrito). Condições de alta estringência podem ser desejáveis para prevenir ou ao menos minimizar resultados falso-positivos. A estrin- gência da hibridização pode ser determinada por uma série de fatores durante a hibridização e lavagem, incluindo temperatura, força iônica, período de tempo e concentração de reagentes. Uma sonda ou ácido nucleico a partir de uma amostra pode ser fornecida em solução para tais ensaios, ou pode ser afixada a um suporte (por exemplo, suporte sólido ou semissólido). Exemplos de suportes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, nitrocelulose (por exemplo, forma de membrana ou poços de microtitulação), polivinil cloreto (por exemplo, folhas ou poços de microtitulação), látex de poliestireno (por exemplo, grânulos ou placas de microtitulação, fluoreto de polivinilidina, papel diazotizado, membranas de náilon, grânulos ativados e grânulos de Proteína A).

[116] Em uma modalidade, uma sonda ou amostra de ácido nucleico pode ser fornecida em uma matriz para detecção. As matrizes podem ser criadas, por exemplo, detectando sondas de polinucleotídeos sobre um substrato (por exemplo, vidro, nitrocelulose e similares) em uma matriz ou arranjo bidimensional. As sondas podem ser ligadas ao substrato por ligações covalentes ou por interações não específicas, tal como interações hidrofóbicas. As amostras de polinucleotídeos podem ser marcadas de forma detectável (por exemplo, usando marcadores radioativos ou fluorescentes) e depois hibridizadas com as sondas. Os polinucleotídeos de cadeia dupla, que compreendem os polinucleotídeos de amostra marcados ligados a polinucleotídeos de sonda, podem ser detectados uma vez que a porção não ligada de uma amostra é removida. Técnicas para a construção de matrizes e métodos de utilização dessas matrizes são conhecidas. As matrizes podem ser usadas para uma única amostra a ser analisada quanto à presença de duas ou mais regiões alvo de ácido nucleico. Nesse caso, as sondas para cada uma das regiões alvo, bem como controles (tanto positivos quanto negativos) podem ser fornecidas em uma única matriz. As matrizes facilitam assim análises rápidas e de conveniência.

Testes e Kits de Diagnóstico

[117] A invenção fornece ainda reagentes e kits de diagnóstico que compreendem um ou mais tais reagentes para utilização em uma variedade de ensaios de diagnóstico, incluindo, por exemplo, imunoen- saios tal como ensaios ELISA e imunoensaios de tipo “sanduíche”, bem como ensaios de ácido nucleico, por exemplo, ensaios de PCR. Em uma modalidade relacionada, um ensaio pode ser realizado em um formato de teste de tira ou fluxo, onde o agente de ligação é imobilizado em uma membrana, tal como nitrocelulose. Tais kits podem preferencialmente incluir ao menos um primeiro peptídeo, ou um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, um fragmento funcional do mesmo, ou um coquetel do mesmo, ou um primeiro par de oligonucleotídeos, e meios para a geração de sinal. Em algumas modalidades, um kit pode compreender uma composição imunogênica, tal como um vírus recombinante como aqui descrito. Os reagentes e outros compostos, tais como um veículo farmaceuticamente aceitável, podem ser incluídos no kit. Uma composição imunogênica, quando fornecida em tal kit, pode estar em uma solução tal como em uma dose ou quantidade pré-medida, ou pode ser uma composição seca, tal como na forma dessecada ou liofilizada adequada para reidratação ou ressuspensão. Os componentes do kit podem ser pré-acoplados a um suporte sólido, ou podem ser aplicados à superfície de um suporte sólido quando o kit é usado. Os meios de geração de sinal podem estar pré-associados com um anticorpo ou ácido nucleico da invenção ou podem exigir combinação com um ou mais componentes, por exemplo, tampões, ácidos nucleicos, conjugados anticorpo-enzima, substratos enzimáticos ou similares, antes do uso.

[118] Os kits também podem incluir reagentes adicionais, por exemplo, reagentes de bloqueio para reduzir a ligação não específica à superfície de fase sólida, reagentes de lavagem, substratos enzimáti- cos, enzimas e similares. A superfície de fase sólida pode estar na forma de placas de microtitulação, microesferas ou outros materiais adequados para imobilizar ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos ou polipep- tídeos. Uma enzima que catalisa a formação de um produto quimiolum- inescente ou cromogênico ou a redução de um substrato quimiolumines- cente ou cromogênico é um tal componente do meio de geração de sinal. Tais enzimas são bem conhecidas na técnica. Quando um radiomarcador, cromogênico, fluorigênico ou outro tipo de marcador detectável ou meio de detecção estão incluídos dentro do kit, o agente de marcação pode ser fornecido ou no mesmo recipiente da própria composição de diagnóstico ou terapêutica, ou pode ser colocado alternativamente em um segundo recipiente separado no qual esta segunda composição pode ser colocada e adequadamente aliquotada. Alternativamente, o reagente de detecção e o marcador podem ser preparados em um único recipiente.

Definições

[119] Como aqui utilizado “vírus da doença de Marek” ou “MDV” refere-se a qualquer alfaherpes vírus do gênero Mardivirus, incluindo o Herpes-vírus dos perus (HVT). Em uma modalidade específica, a invenção refere-se ao vírus da doença de Marek, seus componentes genéticos, genes e proteínas produzidas desse modo. Tal como aqui utilizado, tal vírus pode incluir os componentes genéticos do vírus, isto é, o genoma e seus transcritos, proteínas codificadas pelo genoma (incluindo proteínas estruturais e não estruturais), e partículas virais funcionais ou não funcionais. As sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos que codificam esses vírus são bem conhecidas na técnica e seriam facilmente encontradas por um versado na técnica. Uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos, como aqui descrita, pode ser de um pássaro incluindo, mas não limitado a, aves tais como frangos, codornas e perus. Os ácidos nucleicos e as proteínas da invenção incluem moléculas de ocorrência natural ou recombinantes.

[120] Tal como aqui utilizado, “aves” refere-se a uma ave doméstica ou comercial mantida pelos ovos que produze, bem como a sua carne e penas. Em algumas modalidades, as aves podem incluir um pássaro da ordem Galliformes, que inclui frangos, codornas e perus, e também pode incluir gansos, patos, cisnes, galinha de angola, pombos e outros.

[121] Tal como aqui utilizado, “proteínas virais” ou “polipeptídeos virais” refere-se a uma proteína codificada por um vírus aqui descrito, incluindo proteínas estruturais e não estruturais. Tais proteínas podem incluir proteínas virais de ocorrência natural ou de ocorrência não natural de MDV, NDV e/ou IBDV, incluindo proteínas VP2, F e/ou HN. Tal como aqui utilizado, um “antígeno” refere-se a uma proteína ou polipeptídeo viral, tal como um polipeptídeo viral, bem como partículas virais. Em algumas modalidades, um antígeno de acordo com a invenção também pode ser um ácido nucleico viral.

[122] Tal como aqui utilizado, os termos “tratamento”, “tratando” e “tratar” são definidos como atuando sobre uma doença, distúrbio ou condição com um agente para reduzir ou melhorar os efeitos farmacológicos e/ou fisiológicos da doença, distúrbio, ou condição e/ou seus sintomas. “Tratamento”, tal como aqui utilizado, abrange qualquer tratamento de uma doença em um indivíduo ou hospedeiro (por exemplo, um animal de interesse veterinário) e inclui: (a) reduzir o risco de ocorrência da doença em um indivíduo determinado como sendo predisposto à doença, mas ainda não diagnosticado como infectado com a doença, (b) impedir o desenvolvimento da doença, e (c) aliviar a doença, ou seja, causar regressão da doença e/ou aliviar um ou mais sintomas da doença. O “tratamento” também pretende englobar a entrega de um agente inibidor para fornecer um efeito farmacológico, mesmo na ausência de uma doença ou condição. Por exemplo, o “tratamento” engloba a administração de um agente inibidor de patógenos ou doenças que fornece efeitos melhorados ou desejáveis no indivíduo (por exemplo, redução da carga de patógenos, redução dos sintomas da doença, etc.).

[123] Tal como aqui utilizado, os termos “tratar profilaticamente” ou “tratamento profilático” refere-se à prevenção total ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuído à doença.

[124] Tal como aqui utilizado, um “transgene” refere-se a um segmento de DNA que contém uma sequência de codificação heteróloga ou outro material genético para introdução de um organismo para outro. Por exemplo, em certas modalidades, um transgene de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência de codificação antigênica, tal como um gene viral, ou uma sequência codificando uma proteína viral.

[125] Tal como aqui utilizado, o termo “hospedeiro”, “indivíduo”, “paciente” ou “organismo” pode incluir animais, particularmente pássaros, especialmente aves. Para aplicações veterinárias, um pássaro pode ser da ordem Galliformes, que inclui frangos, codornas e perus e similares. O termo “hospedeiro vivo” refere-se a um hospedeiro como mencionado acima ou a outro organismo que está vivo. O termo também pode se referir a todo o hospedeiro ou organismo e não apenas uma parte excisada (por exemplo, um cérebro ou outro órgão) do hospedeiro vivo. Estes termos também incluem um indivíduo em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo estágios embrionário e fetal.

[126] Tal como aqui utilizado, uma “amostra biológica” ou “amostra” pode incluir sangue e partes de sangue incluindo, mas não se limitando a soro, plasma, plaquetas ou glóbulos vermelhos; esputo, esfregaços cloacais, mucosas, tecidos, células cultivadas, incluindo culturas primárias, explantes e células transformadas; fluidos biológicos, fezes e urina. Uma amostra biológica também pode incluir seções de tecidos, tal como amostras de biópsia e autópsia, e seções congeladas obtidas para fins histológicos. Uma amostra biológica pode ser obtida a partir de um organismo eucariótico, tal como um pássaro, incluindo, mas não limitado a, um pássaro da ordem Galliformes, tal como frangos, codornas e perus. Qualquer tecido apropriado para uso de acordo com a invenção pode ser usado, por exemplo, pele, cérebro, medula espinal, glândulas suprarrenais, músculo peitoral, pulmão, coração, fígado, colágeno, proventrículo, ventrículo, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, cloaca, rim, bursa de Fabricius, baço, pâncreas, glândula adrenal, medula óssea, medula espinal lombossacral ou sangue.

[127] O termo “isolado” significa uma substância substancialmente separada ou enriquecida em relação a outras substâncias com as quais ela ocorre na natureza. As substâncias isoladas são geralmente ao menos aproximadamente 80%, ao menos 90% puras, ao menos 98% puras, ou ao menos aproximadamente 99% puras, em peso.

[128] O termo “forma de dosagem unitária”, tal como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de um composto (por exemplo, um composto antiviral, como aqui descrito) calculado em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente, carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para formas de dosagem unitária dependem do composto particular empregado, da rota e da frequência de administração, do efeito a ser alcançado, e da farmacodinâmica associada a cada composto no hospedeiro.

[129] Tal como aqui utilizado, um “veículo farmaceuticamente aceitável”, “adjuvante farmaceuticamente aceitável” ou “adjuvante” refere-se a um agente que modifica o efeito de outros agentes e é útil na preparação de uma composição imunogênica geralmente segura, não tóxica e nem biologicamente nem indesejável. Tal agente pode ser adicionado a uma composição imunogênica para modificar a resposta imune de um indivíduo aumentando a resposta, de modo a fornecer uma maior quantidade de anticorpos e uma proteção mais duradoura. Tal agente pode incluir um excipiente, diluente, carreador ou adjuvante que é aceitável para uso veterinário ou farmacêutico. Tal agente pode ocorrer de forma não natural, ou pode ocorrer de forma natural, mas não encontrado naturalmente em combinação com outros agentes na composição imunogênica.

[130] Tal como aqui utilizado, uma “composição imunogênica” ou “composição farmacêutica” ou “vacina” visa englobar uma composição adequada para administração a um indivíduo, tal como um indivíduo aviário. Em geral, uma “composição imunogênica” é estéril, e de preferência livre de contaminantes que são capazes de provocar uma resposta indesejável dentro do indivíduo (por exemplo, o(s) composto(s) na composição imunogênica é de grau farmacêutico). As composições imunogênicas podem ser concebidas para administração a indivíduos que dela necessitem através de várias vias de administração diferentes, incluindo em ovo, oral, intravenosa, bucal, retal, parentérica, intraperitoneal, intradérmica, intratecal, intramuscular, subcutânea, por inalação e similares.

[131] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, “quantidade eficaz” ou “dose terapeuticamente eficaz”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma dose que produz um efeito para o qual ela é administrada. Tal dose ou quantidade pode também referir-se à quantidade de uma modalidade do agente (que pode ser chamado de um composto, um agente inibidor e/ou um fármaco) sendo administrado que aliviará um ou mais dos sintomas da doença, ou seja, infecção, sendo tratada, e/ou quantidade que evita, até certo ponto, um ou mais dos sintomas da doença, ou seja, infecção, que o hospedeiro que está sendo tratado tem ou está em risco de desenvolver. A dose exata dependerá da finalidade do tratamento, e um versado na técnica será capaz de determinar tal dose usando técnicas conhecidas.

[132] Tal como aqui utilizado, um “anticorpo” refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma região de estrutura a partir de um gene de imunoglobulina ou seus fragmentos que se liga especificamente e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos podem incluir os genes da região constante da kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon e mu, bem como a miríade de genes da região variável da imunoglobulina. As cadeias leves podem ser classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas podem ser classificadas como gamma, mu, alfa, delta ou epsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgY, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[133] Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplificativa pode compreender um tetrâmero, com cada tetrâmero composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, tendo cada par uma cadeia “leve” (aproximadamente 25 kD) e uma cadeia “pesada” (aproximadamente 50-70 kD). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígenos. Os termos cadeia leve variável e cadeia pesada variável referem-se a estas cadeias leves e pesadas.

[134] Existem anticorpos, por exemplo, como imunoglobulinas intactas ou como uma série de fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Enquanto vários fragmentos de anticorpos são definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um dos versados apreciará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo ou quimicamente ou usando metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo “anticorpo”, tal como aqui utilizado, também inclui fragmentos de anticorpos ou produzidos pela modificação de anticorpos integrais, ou aqueles sintetizados de novo utilizando metodologias de DNA recombinante ou aqueles identificados utilizando outros métodos conhecidos na técnica.

[135] Para a preparação de anticorpos, por exemplo, anticorpos recombinantes, monoclonais ou policlonais, podem ser utilizadas muitas técnicas conhecidas. Os genes que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo de interesse podem ser clonados a partir de uma célula e utilizados para produzir um anticorpo monoclonal recombinante. As bibliotecas de genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos monoclonais também podem ser utilizadas. As combinações aleatórias dos produtos gênicos de cadeia pesada e leve geram um grande grupo de anticorpos com diferentes especificidades antigênicas. As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples ou anticorpos recombinantes são encontradas na área e podem ser adaptadas para produzir anticorpos para polipeptídeos de acordo com a invenção. A tecnologia de exibição de fagos também pode ser usada para identificar anticorpos e fragmentos heteroméricos que se ligam especificamente a antígenos selecionados. Os anticorpos também podem ser feitos biespecíficos, isto é, capazes de reconhecer dois antígenos diferentes, ou heteroconjugados, por exemplo, dois anticorpos unidos covalentemente, ou imunotoxinas.

[136] A frase “se liga especificamente (ou seletivamente) a um anticorpo” ou “imunorreativo especificamente (ou seletivamente) com”, quando se refere a uma proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de ligação que é determinante da presença da proteína, frequentemente em uma população heterogênea de proteínas. Assim, sob condições particulares de imunoensaio, um anticorpo especificado pode ligar-se a uma proteína particular ao menos duas vezes e, mais tipicamente, mais de 10 a 100 vezes. A ligação específica a um anticorpo sob tais condições exige um anticorpo que seja selecionado em virtude da sua especificidade para uma proteína particular. Por exemplo, os anticorpos policlonais criados para um vírus como aqui descrito, variantes polimórficas, alelos, ortólogos e suas variantes, ou variantes de corte, ou suas porções, podem ser selecionados para obter apenas os anticorpos policlonais que são especificamente imunorreativos com tais vírus e não com outras proteínas. Esta seleção pode ser conseguida subtraindo-se anticorpos que reagem de forma cruzada com outras moléculas. Pode utilizar-se uma variedade de formatos de imunoensaio para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, os imunoensaios ELISA de fase sólida são rotineiramente utilizados para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína. Os anticorpos preferenciais são aqueles que podem distinguir uma proteína viral como aqui descrita, em relação às proteínas codificadas pelos genes VP2, F e/ou HN.

[137] A frase “efeitos funcionais” no contexto de ensaios para testar compostos que modulam a atividade de um vírus tal como aqui descrito inclui a determinação de um parâmetro que está indireta ou diretamente sob a influência de tal vírus, por exemplo, um efeito fenotípico ou químico. Os “efeitos funcionais” podem incluir atividades in vitro, in vivo e ex vivo e podem ser medidos por qualquer meio conhecido dos versados na técnica, tais como alterações nas características espectroscópicas, forma, cromatografia ou propriedades de solubilidade para uma proteína, medindo marcadores induzíveis ou ativação transcricional de uma proteína; medindo a atividade de ligação ou ensaios de ligação, por exemplo, a ligação a anticorpos; medindo mudanças na atividade de ligação do ligando ou substrato, medindo a replicação viral, medindo a expressão do marcador da superfície celular, medindo as alterações nos níveis de proteína, medindo a estabilidade do RNA, a identificação da expressão do gene à jusante ou repórter através, por exemplo, de quimioluminescência, fluorescência, reações colorimétricas, ligação ao anticorpo e/ou marcadores induzíveis.

[138] Os termos “inibidores”, “ativadores” e “moduladores” de sequências de ácido nucleico e polipeptídeos virais são utilizados para se referir a moléculas ativadoras, inibidoras ou moduladoras identificadas utilizando ensaios in vitro e in vivo das sequências de ácido nucleico e polipeptídeos virais. Os inibidores são compostos que podem se ligar, bloquear parcial ou totalmente a atividade, diminuir, prevenir, retardar a ativação, inativar, dessensibilizar ou reduzir a atividade ou a expressão de um vírus. Os ativadores referem-se a compostos que aumentam, abrem, ativam, facilitam, aprimoram a ativação, sensibilizam, agonizam ou regulam a atividade viral. Os inibidores, ativadores ou moduladores também incluem versões geneticamente modificadas de um vírus como aqui descrito, por exemplo, versões com atividade alterada, bem como ligandos, substratos, antagonistas, agonistas, anticorpos, peptídeos, peptídeos cíclicos, ácidos nucleicos, moléculas antissenso, ribozimas, pequenas moléculas químicas de ocorrência natural ou sintéticos, e similares. Os ensaios para inibidores e ativadores incluem, por exemplo, a expressão de um vírus da invenção in vitro, em células ou membranas celulares, aplicando supostos compostos moduladores e depois determinando os efeitos funcionais na atividade, como aqui descrito.

[139] As amostras de teste ou ensaios que compreendem um vírus da invenção que são tratados com um potencial ativador, inibidor ou modulador podem ser comparados com uma amostra de controle que não tem o inibidor, o ativador ou o modulador para determinar a extensão da inibição. As amostras de controle às quais uma amostra de teste ou ensaio é comparado podem receber um valor relativo da atividade de proteína de 100%. A inibição do vírus é conseguida quando o valor de atividade da amostra de teste em relação à amostra de controle é inferior a aproximadamente 80%, incluindo aproximadamente 75%, aproximadamente 70%, aproximadamente 65%, aproximadamente 60%, aproximadamente 55%, aproximadamente 50%, aproximadamente 45%, aproximadamente 40%, aproximadamente 35%, aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5% e aproximadamente 0%.

[140] Os termos “idênticos” ou “percentagem de identidade”, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem específica de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, aproximadamente 60% de identidade, de preferência 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou maior identidade em uma região especificada, quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação ou região designada), conforme medido usando algoritmos de comparação de sequência BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros padrão descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, o site da rede NCBI encontrado em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ou similar). Tais sequências são então chamadas de “substancialmente idênticas”. Essa definição também se refere ou se aplica ao comprimento de uma determinada sequência. A definição também pode incluir sequências que possuem deleções, adições e/ou substituições.

[141] Para comparação de sequência, uma sequência tipicamente serve como uma sequência de referência, à qual outras sequências são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de referência e de comparação podem ser inseridas em um computador, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são selecionados conforme desejado. As identidades da sequência percentuais são então geradas para as sequências de comparação em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros selecionados. Um exemplo de um algoritmo que pode ser adequado para determinar a percentagem de identidade de sequências e similaridade de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos por Altschul e outros, (Nuc Acids Res 25: 3389 a 3402, 1977) e Altschul e outros, (J Mol Biol 215: 403 a 410, 1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados para determinar a percentagem de identidade de sequência para quaisquer ácidos nucleicos ou proteínas, tais como os aqui descritos.

[142] Tal como aqui utilizado, o termo “ácido nucleico” refere-se a um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucle- otídeos ou bases de ribonucleotídeos lidas a partir da extremidade 5’ para a 3’. Um “ácido nucleico” também pode conter, opcionalmente, bases de nucleotídeos de ocorrência não natural ou alteradas que permitem a leitura correta através de uma polimerase e não reduzem a expressão de um polipeptídeo codificado por esse ácido nucleico. O termo “sequência de nucleotídeos” ou “sequência de ácido nucleico” refere-se a ambas as cadeias senso e antissenso de um ácido nucleico como cadeias simples individuais ou no duplex. O termo “ácido ribonucleico” (RNA) é inclusivo de RNAi (RNA inibidor), RNAdr (RNA de cadeia dupla), siRNA (RNA de pequena interferência), RNAm (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), tRNA (RNA de transferência, seja carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar). Os termos “segmento de ácido nucleico”, “segmento de sequência de nucleotídeo”, ou mais geralmente, “segmento”, serão entendidos por aqueles versados na técnica como um termo funcional que inclui sequências genômicas, sequências de RNA ribossômico, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon, e sequências de nucleotídeos de engenharia menores que expressam ou podem ser adaptadas para expressar, proteínas, polipeptídeos ou peptídeos. A nomenclatura aqui utilizada é a exigida pelo Título 37 do Código de Regulamentos Federais dos Estados Unidos §1.822 e estabelecido nas tabelas da Norma WIPO ST.25 (1998), Apêndice 2, Tabelas 1 e 3.

[143] O termo “gene” refere-se a componentes que compreendem DNA ou RNA viral, cDNA, íntron viral e DNA éxon, polinucleotídeo de DNA viral artificial ou outro DNA que codifica um peptídeo viral, polipeptídeo viral, proteína viral ou molécula de transcrito de RNA viral, e os elementos genéticos que podem flanquear a sequência de codificação envolvida na regulação da expressão, tais como regiões promotoras, regiões líderes 5’, região não traduzida 3’ que pode existir como genes nativos ou transgenes em um genoma viral. O gene ou um seu fragmento pode ser submetido a métodos de sequenciação de polinucleotídeos que determinam a ordem dos nucleotídeos que compreendem o gene.

[144] Os polinucleotídeos como aqui descritos podem ser complementares a toda ou uma porção de uma sequência de genes virais, incluindo um promotor, íntron, sequência de codificação, éxon, região 5’ não traduzida e região 3’ não traduzida.

[145] Uma sequência de ácido nucleico particular também pode abranger “variantes de emenda”. De modo similar, uma proteína específica codificada por um ácido nucleico engloba implicitamente qualquer proteína codificada por uma variante de emenda do ácido nucleico. As “variantes de emenda” são produtos de emenda alternativa de um gene. Após a transcrição, um transcrito de ácido nucleico inicial pode ser emendado de modo que diferentes produtos de emenda de ácido nucleico (alternativa) codifiquem polipeptídeos diferentes. Os mecanismos para a produção de variantes de emenda variam, mas incluem a emenda alternativa de éxons. Os polipeptídeos alternativos derivados do mesmo ácido nucleico por transcrição de leitura também são abrangidos por esta definição. Todos os produtos de uma reação de emenda, incluindo formas recombinantes dos produtos de emenda, estão incluídos nesta definição.

[146] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui utilizados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente que ocorre naturalmente, bem como a polímeros de aminoácidos que ocorrem naturalmente e aos polímeros de aminoácidos que não ocorrem naturalmente.

[147] O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira similar aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, y- carboxiglutamato e O-fosfosserina. Os análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos modificaram grupos R (por exemplo, norleucina) ou estruturas de peptídeos modificados, mas mantêm a mesma estrutura química básica de um aminoácido que ocorre naturalmente. Os miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira similar a um aminoácido que ocorre naturalmente.

[148] Os aminoácidos podem ser referidos aqui por seus símbolos comumente conhecidos de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC- IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos pelos códigos comumente aceitos de uma única letra.

[149] Estruturas macromoleculares tais como estruturas polipeptí- dicas podem ser descritas em termos de vários níveis de organização. “Estrutura primária” refere-se à sequência de aminoácidos de um peptídeo particular. “Estrutura secundária” refere-se a estruturas tridimensionais ordenadas localmente dentro de um polipeptídeo. Essas estruturas são comumente conhecidas como domínios, por exemplo, domínios enzimáticos, domínios extracelulares, domínios transmem- brana, domínios de poros ou domínios de cauda citoplasmática. Os domínios são porções de um polipeptídeo que formam uma unidade compacta do polipeptídeo. Domínios exemplificativos incluem domínios com atividade enzimática. Um domínio pode ser constituído por seções de organização menor, tal como trechos de folhas β e hélices α. “Estrutura terciária” refere-se à estrutura tridimensional completa de um monômero de polipeptídeo. “Estrutura quaternária” refere-se à estrutura tridimensional formada pela associação não covalente de unidades terciárias independentes. Os termos anisotrópicos também são conhecidos como termos energéticos.

[150] Um “marcador” ou uma “porção detectável” é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos ou outros meios físicos. Por exemplo, os marcadores úteis incluem 32P, corantes fluorescentes, reagentes densos de elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos e proteínas que podem ser detectadas, por exemplo, incorporando um radiomarcador no peptídeo ou usado para detectar anticorpos especificamente reativos com o peptídeo.

[151] O termo “recombinante”, quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, o ácido nucleico, a proteína ou o vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou proteína ou a alteração de um ácido nucleico nativo ou proteína, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outra forma, são anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos. Em algumas modalidades, as sequências recombi- nantes podem também incluir ácidos nucleicos, proteínas ou genomas recombinantes, tal como genomas virais. Os vetores virais recombinan- tes como aqui descritos podem conter transgenes que estão operativamente ligados a um promotor heterólogo de modo a efetuar a transcrição do transgene.

[152] O termo “heterólogo”, quando utilizado com referência a porções de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, tendo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos para formar um novo ácido nucleico funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. De modo similar, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão). Heterológo também pode se referir a uma sequência viral, tal como um gene ou transgene, ou uma porção do mesmo, sendo inserida em um genoma viral no qual não é tipicamente encontrado, ou um gene introduzido em um organismo no qual ele não é tipicamente encontrado.

[153] A frase “condições de hibridização estringentes” refere-se a condições sob as quais uma sonda hibridizará com a sua subsequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas sem outras sequências. As condições estringentes podem ser dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas se hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Condições estringentes podem ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes tal como a formamida.

[154] As condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização de DNA são bem conhecidas por um versado na técnica e podem incluir, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio 6X (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uma lavagem de 2X SSC a 50°C . A concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa estringência de aproximadamente 2X SSC a 50°C até uma alta estringência de aproximadamente 0,2X SSC a 50°C. A temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixa estringência em temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, para condições de alta estringência a aproximadamente 65°C. As condições de temperatura e/ou sal podem ser variadas conforme apropriado para resultados ótimos. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode exibir ao menos aproximadamente 80% a aproximadamente 100% de identidade de sequência com uma ou mais moléculas de ácido nucleico como aqui descrito, por exemplo, ao menos aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, ou aproximadamente 100% de identidade de sequência.

[155] Os ácidos nucleicos que não se hibridizam entre si sob condições de estringência ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isso ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Nesses casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridizam sob condições de hibridização moderadamente estringentes. Exemplos de “condições de hibridização moderadamente estringentes” podem incluir hibridização em um tampão de formamida a 40%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 1X SSC a 45°C. Uma hibridização positiva pode ser ao menos duas vezes o segundo plano. Os versados na técnica reconhecerão que podem ser utilizadas condições alternativas de hibridização e lavagem para fornecer condições de estringência similares ou serão capazes de determinar condições ideais conforme apropriado.

[156] Para PCR, uma temperatura de aproximadamente 36°C é típica para amplificação de baixa estringência, embora as temperaturas de anelamento possam variar de acordo com o comprimento do iniciador. Para uma amplificação PCR de alta estringência, uma temperatura de aproximadamente 62°C é típica, embora temperaturas de anelamento de alta estringência possam variar dependendo do comprimento e da especificidade do iniciador. As condições típicas de ciclo para ambas as amplificações de alta e baixa estringência incluem uma fase de desnaturação de 90-95°C durante 30 segundos a 2 min, uma fase de anelamento com duração de 30 segundos a 2 min, e uma fase de extensão de aproximadamente 72°C por 1-2 min. Protocolos e diretrizes para reações de amplificação de baixa e alta estringência são encontrados na técnica.

[157] O termo “aproximadamente” é usado aqui para indicar que um valor inclui o desvio padrão de erro para o dispositivo ou método que está sendo empregado para determinar o valor. O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para significar “e/ou”, a menos que explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a descrição suporte uma definição que se refere apenas a alternativas e “e/ou. “Quando não usado em conjunto com a redação fechada nas reivindicações ou especificamente mencionado de outra forma, as palavras “um” e “uma” denotam “um ou mais”. O termo “conferido por um transgene”, por exemplo, abrange um mais transgenes.

[158] Os termos “compreender”, “ter” e “incluir” são verbos de ligação abertos. Quaisquer formas ou tempos de um ou mais desses verbos, como “compreende”, “compreendendo”, “tem”, “tendo”, “inclui” e “incluindo”, também são abertos. Por exemplo, qualquer método que “compreende”, “tem” ou “inclui” uma ou mais etapas não se limita a possuir apenas aquelas uma ou mais etapas e também cobre outras etapas não listadas. Da mesma forma, qualquer célula ou vírus que “compreende”, “tem” ou “inclui” um ou mais traços não se limita a possuir apenas esses um ou mais traços e abrange outros traços não listados.

[159] Antes de as modalidades da presente descrição serem descritas em detalhes, entende-se que, a menos que indicado de outra forma, a presente descrição não se limita a materiais, reagentes, materiais de reação, processos de fabricação ou similares, como tal, podem variar. Também entende-se que a terminologia aqui utilizada é para fins de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a ser limitante. Também é possível na presente descrição que as etapas possam ser executadas em diferentes sequências onde isso é logicamente possível. Conforme usado na especificação e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma” e “o”, “a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente ao contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um composto” inclui uma pluralidade de compostos. Nesta especificação e nas reivindicações que se seguem, será feita referência a uma série de termos que devem ser definidos para ter os seguintes significados, a menos que uma intenção contrária esteja aparente.

Exemplos Exemplo 1 Amplificação do gene VP2 da cepa Edgar do vírus da doença infecciosa da bursa

[160] O RNA foi isolado a partir da cepa Edgar do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV). RT-PCR foi executado para produzir cDNA correspondente ao gene VP2 utilizando os seguintes iniciadores:

[161] IBDV VP2 Start NheI: GATCGCTAGCACCATGACAAAC- CTGCAAGATCAAAC (SEQ ID NO: 1)

[162] IBDV VP2 end XbaI: GATCTCTAGATCACTACCTCCTT- ATGGCCCGGATTATG (SEQ ID NO: 2)

Exemplo 2 Clonagem do gene VP2 Edgar

[163] O produto de cDNA VP2 amplificado foi clonado no vetor de clonagem pCR 2.1 Topo TA (Invitrogen) em uma orientação positiva como mostrado na Figura 1. O gene VP2 Edgar foi então digerido com NheI e XbaI e transferido para pcDNA3.1, no qual o sítio PciI foi rompido (Figura 2). O sítio XbaI presente na sequência iniciadora no final do gene VP2 não foi funcional devido à metilação da cepa bacteriana utilizada e, por conseguinte, a digestão com XbaI excisou um fragmento maior usando o sítio XbaI funcional presente no vetor de clonagem pCR 2.1 Topo TA. Isso resultou no fragmento excisado contendo o quadro de leitura aberta VP2 inteiro também tendo 59 bases adicionais contendo os múltiplos sites de clonagem a partir do vetor (pcDNA3.1 VP2 Edgar).

Exemplo 3 Geração do gene VP2 E/2512 no vetor de clonagem pcDNA3.1

[164] A região hipervariável do gene VP2 da cepa 2512 de IBDV foi sintetizada (Biomatik). O fragmento sintético foi então digerido com PciI e BamHI e clonado em pcDNA3.1 VP2 Edgar no qual o fragmento correspondente do gene Edgar VP2 foi removido para gerar o construto de pcDNA VP2 E/2512 (Figura 3).

Exemplo 4 Clonagem da região HVT UL3/4 em vetor pCR Topo TA

[165] Um fragmento de DNA correspondente às posições 1287814149 do genoma de HVT foi amplificado utilizando Taq polimerase e clonado no vetor de clonagem pCR Topo TA (Invitrogen) utilizando os seguintes iniciadores:

[166] HVT> 12878: AACTGACAGATACAATACG (SEQ ID NO: 3)

[167] HVT <14149: CAGCGGATCAATTATATACT (SEQ ID NO: 4)

[168] A numeração HVT baseia-se na cepa FC126 de Herpes- vírus (número de acesso NCBI AF291866.1). Um sítio HincII estava presente nas posições 13385-13386 do fragmento amplificado. O braço esquerdo do segmento de HVT DNA amplificado foi de aproximadamente 507 pb, e o braço direito foi de 765 pb para recombinação homóloga. O segmento de HVT DNA amplificado no vetor pCR 2.1 Topo TA (pCR Topo TA HVT 12878-14149) é mostrado na Figura 4.

Exemplo 5 Clonagem do cassete de expressão VP2 E/2512 em braços de HVT

[169] O cassete de genes correspondente a VP2 E/2512 com o promotor de citomegalovírus humano (CMV) e o sinal de poliA do hormônio de crescimento bovino foi amplificado a partir de pcDNA3.1 VP2 E/2512 utilizando PCR e clonado no sítio HincII (13385-13386) do pCR Topo TA HVT 12878-14149. Conforme observado anteriormente, um fragmento adicional de 59 pb permaneceu na extremidade do quadro de leitura aberto VP2 devido ao estado de metilação do sítio XbaI.

[170] Os iniciadores utilizados para amplificação por PCR do cassete de expressão VP2 E/2512 foram os seguintes:

[171] pCVM> CGATGTACGGGCCAGATATAC (SEQ ID NO: 5)

[172] BGHpA <TCCCCAGCATGCCTGCTATTG (SEQ ID NO: 6)

[173] A Figura 5 mostra o vetor pCR Topo TA HVT 12878-14149 contendo os elementos inseridos.

Exemplo 6 Purificação de DNA genômico HVT

[174] HVT foi propagado em fibroblastos embrionários de frango, e o DNA foi isolado por técnicas padrão. O DNA foi posteriormente tratado com RNAase seguido de proteinase K para remover RNA e proteínas contaminantes. Alíquotas do DNA purificado foram congeladas a -20°C.

Exemplo 7 Geração de HVT recombinante expressando VP2

[175] Os fibroblastos secundários de embriões de frango foram transfectados com HVT DNA genômico e vetor de transferência VP2 usando fosfato de cálcio. Resumidamente, as células foram plaqueadas durante a noite e transfectadas com 1 ug de DNA genômico e 0,5 μg de vetor de transferência VP2 quando as células foram 80-90% confluentes. Após 4-5 dias de incubação a 37°C sob 5% de CO2, as monocamadas foram sobrepostas com ágar a 1% em meio de crescimento 2X. As placas foram isoladas usando tripsina 10X e plaqueadas em duplicado em placas de 24 poços. O DNA foi isolado a partir de uma placa para testar a inserção de VP2 no genoma de HVT. Aproximadamente 576 placas individuais foram examinadas. Os clones positivos foram propagados em duplicado em pratos de 60 mm. Esses clones foram examinados pela segunda vez quanto à presença da inserção de VP2. Foram identificados dois clones que expressaram de forma estável o gene VP2 após 2 rodadas de propagação. Um dos clones foi identificado e replaqueados e purificados. O HVT-VP2 E2512 clonado resultante foi utilizado para produzir estoques de vírus. Os iniciadores para a detecção do gene VP2 em HVT-E2512 recombinante são os seguintes:

[176] rVP2> 628: GCAGCCGATGACTACCAGT (SEQ ID NO: 7)

[177] rVP2 <988: TTGCTGACCATGACATTTGGT (SEQ ID NO: 8)

Exemplo 8 Administração em ovo de construto recombinante VPH-IBD VP2, HVT-IBD VP2 + NDV (F) e HVT-IBD VP2 + NDV (F/HN) para aves para a proteção contra a cepa STC de IBDV

[178] Para determinar a eficácia de construtos recombinantes HVT-IBD VP2, HVT-IBD VP2 + NDV (F) e HVT-IBD VP2 + NDV (F/HN) contra o desafio da doença infecciosa da bursa (IBD) realizado aos 28 dias de idade, embriões de frango Leghorn isentos de patógenos específicos (SPF) foram alocados em cinco grupos no dia 3. Dois grupos (T01 e T02) não foram vacinados, os grupos T03 foram vacinados em ovo no dia 18 da incubação com uma dose alvo de 1500 pfu de HVT- IBD VP2, HVT-IBD VP2 + NDV (F) e HVT-IBD VP2 + NDV (F/HN), respectivamente. Os ovos foram transferidos para incubadoras de acordo com o grupo. O percentual de incubação foi determinado para cada grupo (dia 0), e as aves foram colocadas em gaiolas de isolamento por tratamento de acordo com a randomização e monitoradas diariamente. No dia 28 após a incubação, 16 aves em cada grupo foram sangradas para determinar a titulação de anticorpos para IBDV, e um conjunto diferente de 20 aves por grupo foi desafiado com a cepa STC de IBDV clássico virulento, dado pela administração de gota ocular. As aves pós-desafio foram monitoradas quanto aos sinais clínicos e foram eutanasiadas e necropsiadas quatro dias após o desafio quanto a lesões agudas graves da bursa de Fabricius associada com IBD, incluindo edema, edema peri-bursal e hemorragia. As aves que morreram pós-desafio e as com lesões agudas de IBD na necropsia final foram consideradas suscetíveis ao IBDV. A soroconversão para IBDV foi determinada usando um ELISA comercial (Synbiotics, IBD plus), e as aves foram consideradas positivas para o anticorpo para IBDV de acordo com as especificações do fabricante.

[179] Tabela 1: Percentual de incubação e mortalidade pré- desafio até o dia 28

[180] O percentual de incubação foi similar para os grupos vacinados e não vacinados. Os sinais clínicos associados ao vírus da doença de Marek (MDV) ou ao IBDV não foram observados nos vacinados, incluindo uma ave que morreu após a incubação. Esses dados indicaram que o HVT-IBD VP2, HVT-IBD + NDV F e HVT-IBD + NDV F/HN eram seguros para administração em ovo.

[181] Tabela 2: Percentual de proteção contra desafio de IBDV e percentual de soroconversão para VP2 no dia 28

[182] Os frangos desafiados não vacinados foram altamente suscetíveis ao IBDV, validando a gravidade do desafio. Noventa e cinco por cento dos frangos vacinados em ovo com HVT-IBD VP2 foram protegidos do desafio de IBDV virulento. As aves de tratamento T04 foram vacinadas com construto de vetor de HVT contendo cassete de expressão IBDV VP2 e um cassete de expressão para a proteína NDV F. Oitenta e cinco por cento das aves em T04 foram protegidas do desafio de de IBDV virulento. As aves de tratamento T05 foram vacinadas com construção de vetor de HVT contendo cassete de expressão IBDV VP2 e um cassete de expressão para proteínas NDV F e HN. Noventa e cinco por cento das aves de T05 foram protegidas do desafio de IBDV virulento. No dia 28 pó- incubação, 93,8% de aves T03, 100% de aves T04 e 100% de aves T05 foram soropositivas para anticorpos para IBDV por ELISA. Portanto, construtos HVT-IBD VP2, HVT-IBD + NDV F e HVT-IBD + NDV F/HN administrados em ovo foram capazes de estimular a imunidade protetora e uma resposta de anticorpos específica de IBDV em frangos SPF.

Exemplo 9 Administração subcutânea de construto recombinante HVT-IBDV VP2 para aves em incubação para proteção contra cepa STC de IBDV

[183] Para determinar a eficácia do construto recombinante HVT-IBD VP2 contra o desafio de IBDV realizado no dia 28 de idade, os frangos Leghorn SPF foram alocadas em três grupos no dia 0. Dois grupos (T01 e T02) não foram vacinados e o terceiro grupo (T03) foi vacinado com uma dose alvo de 1500 pfu HVT-IBD VP2 subcutanea- mente na nuca no dia da incubação. As aves foram colocadas em gaiolas de isolamento por tratamento de acordo com a randomização e monitoradas diariamente. No dia 28, 16 aves em cada grupo foram sangradas para determinar a titulação de anticorpos para IBDV, e 20 aves por grupo foram desafiadas com a cepa clássica STC de IBDV virulento dada por administração de gota ocular. As aves pós-desafio foram monitoradas quanto aos sinais clínicos e foram eutanasiadas e necropsiadas quatro dias pós-desafio quanto a lesões graves agudas como descrito no Exemplo 8. As aves que morreram pós-desafio e as que apresentaram lesões agudas de IBD na necropsia final foram consideradas susceptíveis ao IBDV. A soroconversão para IBDV foi determinada usando um ELISA comercial (Synbiotics, IBD plus), e as aves foram consideradas positivas para o anticorpo para IBDV de acordo com as especificações do fabricante.

[184] Tabela 3: Percentual de proteção a partir do desafio de IBDV e percentual de soroconversão no dia 28

[185] Os frangos desafiados não vacinados foram altamente susceptíveis ao IBDV, à medida que 100% apresentaram sinais de IBD, validando a gravidade do desafio. Oito a nove por cento dos frangos vacinados na incubação com HVT-IBD VP2 foram protegidos do desafio virulento. No dia 28 pós-incubação, 15 de 16 frangos amostrados foram soropositivos para anticorpos para IBDV. Portanto, o construto HVT-IBD VP2 administrado a frangos na incubação foi capaz de estimular a imunidade protetora e uma resposta específica de anticorpo IBDV em frangos SPF.

Exemplo 10 Administração em ovo de construto recombinante HVT-IBDV VP2 para aves para proteção contra a cepa GA22 de MDV

[186] Para determinar a eficácia do construto recombinante HVT- IBD VP2 contra desafio de MDV realizado aos 5 dias de idade. No dia 3, os embriões de frango Leghorn SPF foram alocados em dois grupos. Um grupo não foi vacinado e o outro grupo foi vacinado com uma dose alvo de 1300 pfu de HVT-IBD VP2 em ovo no dia 18 da incubação. Os ovos foram transferidos para incubadoras de acordo com o grupo. No dia 0, as aves foram colocadas em gaiolas de isolamento por tratamento de acordo com a randomização. No dia 5 da idade, as aves em cada grupo foram desafiadas com a cepa GA22 de MDV virulento. As aves foram monitoradas diariamente até o dia 54 de idade, momento em que foram sacrificadas e necropsiadas quanto a lesões graves associadas à doença de Marek. As aves que morreram durante o curso do estudo foram necropsiadas quanto a lesões graves associadas à doença de Marek.

[187] Tabela 4: Percentual de proteção a partir do desafio de MDV

[188] Oitenta por cento do grupo de desafio não vacinado foi suscetível a MDV, e 40% dessas aves morreram do desafio antes da necropsia no dia 54, validando a gravidade do desafio. Os frangos vacinados com HVT-IBD VP2 em ovo foram bem protegidos quando desafiados com a cepa GA22 de MDV virulento, já que apenas 2 de 30 (6,7%) aves eram suscetíveis. Portanto, o vetor recombinante HVT-IBD VP2 foi capaz de estimular a forte imunidade protetora ao MD em frangos desafiadas com MDV virulento.

Exemplo 11 Soroconversão de frangos de corte com altos níveis de imunidade materna, dado o vetor recombinante de HVT expressando IBDV VP2 em ovo

[189] Para determinar a soroconversão para IBDV em frangos de corte vacinados em ovo com contruto recombinante HVT-IBD VP2, os embriões comerciais de frango de corte foram alocados em dois grupos no dia 3 da incubação. Um grupo não foi vacinado e o outro grupo foi vacinado com uma dose alvo de 4000 pfu de HVT-IBD VP2 em ovo no dia 18 da incubação. Os ovos foram transferidos para incubadoras de acordo com o grupo. O percentual de incubação foi determinado para cada grupo no dia 0 e as aves foram colocadas em gaiolas de isolamento por tratamento de acordo com a randomização e monitoradas diariamente. As aves foram sangradas e o soro foi coletado nos dias 0, 14, 20, 28, 35, 41, 49 e 56. A soroconversão para IBDV foi determinada usando um ELISA comercial (Synbiotics, IBD plus) e de acordo com as instruções do fabricante. Tabela 5: Percentual de incubação e mortalidade pré-desafio ao dia 56 de frangos de corte comerciais

[190] O percentual de incubação e a mortalidade pós-incubação foram similares para grupos vacinados e não vacinados. Os sinais clínicos associados ao MDV ou IBDV não foram observados nos vacinados. Esses dados indicam que o HVT-IBD VP2 foi seguro para a administração em ovo. Tabela 6: Titulações de anticorpos ELISA de IBDV em frangos de corte comerciais vacinadas em ovo com vetor recombinante VHV-IBD VP2 NT = Não testado

[191] Esses dados mostram que os frangos de corte comerciais utilizados neste estudo apresentaram níveis muito altos de imunidade materna ao IBDV no dia da incubação, com uma titulação de 18.822. No dia 35, o anticorpo materno para IBDV ainda era detectável no soro de frangos não vacinados. A vacinação em ovo com vetor recombinante VPV-IBD HVT-IBD estimulou anticorpo para IBDV que foi primeiramente evidente aos 28 dias de idade. No dia 28, a titulação de anticorpo média de grupo para frangos vacinados foi de 6079, que estava bem acima do valor 1234 determinado para o grupo não vacinado. Após o dia 35, a imunidade materna ao IBDV continuou a diminuir no grupo não vacinado para próximo de zero no dia 56, enquanto a titulação média para aves vacinadas com HVT-IBD VP2 continuou a aumentar até o dia 56. Portanto, o vetor recombinante HVT-IBD VP2 estimulou uma forte resposta imune em frangos de corte comerciais com altos níveis de imunidade materna.

Exemplo 12 Soroconversão e proteção de frangos de corte com altos níveis de imunidade materna, dado o vetor recombinante IBDV VP2 expressando HVT em ovo

[192] Para determinar a soroconversão para o IBDV e a proteção contra um desafio de IBDV virulento em frangos de corte vacinados em ovo com HVT-IBD VP2, embriões comerciais de frangos de corte foram alocados em dois grupos no dia 3. Um grupo não foi vacinado, enquanto os frangos no outro grupo foram vacinados com uma dose alvo de 4000 pfu de HVT-IBD VP2 em ovo no dia 18 da incubação. Os ovos foram transferidos para incubadoras de acordo com o estado da vacinação. O percentual de incubação foi determinado no dia 0 para ambos os grupos, e as aves foram colocadas em gaiolas de isolamento por tratamento de acordo com a randomização e monitoradas diariamente. As aves foram sangradas e o soro coletado nos dias 0, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 55. A soroconversão para IBDV foi determinada usando um ELISA comercial (Synbiotics, IBD plus) de acordo com as instruções do fabricante. Quinze aves vacinadas e 15 aves não vacinadas foram desafiadas nos dias 27 e 56 com a cepa STC de IBDV virulento clássico por administração de gota ocular. As aves pós-desafio foram monitoradas quanto aos sinais clínicos e foram eutanasiados e necropsiados quatro dias após o desafio, juntamente com 10 aves não vacinadas e não desafiadas para lesões agudas graves da bursa de Fabricius associada com IBD, incluindo edema, edema peribursal, e hemorragia. As aves que morreram após o desafio e as com lesões agudas de IBD foram consideradas suscetíveis ao IBDV.

[193] Tabela 7: Percentual de incubação e mortalidade pré-desafio até ao dia 56 usando frangos de corte comerciais

[194] O percentual de incubação foi similar para grupos vacinados e não vacinados. Nenhuma ave morreu pós-incubação no grupo tratado com vetor recombinante HVT-IBD VP2. Esses dados indicam que o vetor recombinante HVT-IBD VP2 foi seguro para a administração em ovo.

[195] Tabela 8: Titulações de anticorpos ELISA para IBDV em frangos de corte comerciais vacinados em ovo com HVT-IBD VP2 NT = não testado Tabela 9: Percentual de proteção a partir de desafios de IBDV nos dias 27 e 56

[196] Esses dados mostram que os frangos de corte comerciais usados neste estudo apresentaram níveis muito altos de imunidade materna ao IBDV no dia da incubação com uma titulação de 20.213. No dia 42, o anticorpo materno para IBDV ainda era detectável no soro de frangos não vacinados. A vacina em ovo com vetor recombinante HVT-IBD VP2 estimulou o anticorpo para IBDV que foi primeiro evidente no dia 35 de idade. No dia 35, a titulação de anticorpo média de grupo para IBDV das aves vacinadas foi 6502, que foi maior do que 4642 do grupo não vacinado. Após o dia 35, a imunidade materna ao IBDV continuou a diminuir no grupo não vacinado para próximo de zero no dia 55, enquanto a titulação média para o grupo de aves vacinadas com HVT-IBD VP2 aumentou até o dia 55. No dia 27, 15 frangos não vacinados e 15 frangos vacinados foram desafiados com IBDV virulento. A imunidade materna ainda era alta no dia 27, o que afetou a susceptibilidade dos frangos desafiados não vacinados, já que apenas 33,3% dos frangos desse grupo eram suscetíveis. Nenhuma das aves no grupo vacinado foi susceptível a IBDV virulento no dia 27. No dia 56, 13 frangos não vacinados e 14 frangos vacinados foram desafiados com IBDV virulento. O grupo não vacinado e desafiado teve uma taxa de susceptibilidade de 61,5%, enquanto nenhuma das aves no grupo vacinado foi susceptível a IBDV virulento. Portanto, o vetor recombinante HVT-IBD estimulou uma forte resposta de anticorpos ao IBDV que continuou a aumentar até o dia 55. Quando desafiadas nos dias 27 e 55, as aves no grupo vacinado foram protegidas contra doenças e lesões causadas por IBDV virulento.

Exemplo 13 Construção da região de recombinação HVT86 (US10) HVT87 (sorf3)

[197] O genoma de HVT (AF291988.1) correspondente às posições genômicas 137667-138771 e 138772-140634 foi amplificado por PCR e clonado para gerar pUS10-sorf3. As sequências reguladoras correspondentes ao promotor precoce imediato (IE) do citomegalovírus e à região poliA do hormônio de crescimento bovino foram amplificadas por PCR utilizando:

[198] PCVM: CGATGTACGGGCCAGATATAC (SEQ ID NO: 5)

[199] BGH pA: TCCCCAGCATGCCTGCTATTG (SEQ ID NO: 6)

[200] O fragmento de DNA correspondente às sequências reguladoras foi clonado no vetor pUS10-sorf3 entre o genoma HVT na posição 138771-138772 para o vetor pUS10-CVM-pA-sorf3

Exemplo 14 Clonagem de genes NDV em pUS10-CVM-pA-sorf3

[201] Clonagem de genes F: A cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle foi amplificada usando PCR de transcriptase reversa (RT- PCR) usando os seguintes iniciadores:

[202] NDV F>start NheI: GCTAGCATGGGCTCCAGACCTTCTAC (SEQ ID NO: 9)

[203] NDV F>end XbaI: TCTAGATCACATTTTTGTAGTGGCTCT- CATCTGATCGAGAGTATTCCCAAGCC (SEQ ID NO: 10)

[204] O produto de PCR resultante foi digerido com NheI e XbaI e clonado nos sítios correspondentes em pus10-CVM-pA-sorf3 para gerar vetor de transferência de gene F.

[205] Clonagem do gene HN: A cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle foi amplificada usando PCR de transcriptase reversa (RT- PCR) usando os seguintes iniciadores:

[206] NDV HN star t> XbaI: GATATCTCTAGAATGGACCGCGC- CGTTAGCC (SEQ ID NO: 11)

[207] ND ND HN end < XbaI: GATATCTCTAGACTAGCCA- GACCTGGCTTCTC (SEQ ID NO: 12)

[208] O produto de PCR resultante foi digerido com XbaI e clonado nos sítios correspondentes em pus10-CVM-pA-sorf3 para gerar vetor de transferência de gene HN.

[209] Clonagem do gene F-P2A-HN: A cepa Lasota do vírus da doença de Newcastle foi amplificada usando PCR de transcriptase reversa (RT-PCR) utilizando os seguintes iniciadores:

[210] NDV F>start NheI: GCTAGCATGGGCTCCAGACCTTCTAC (SEQ ID NO: 9)

[211] NDV F-P2A end < Xba: CATTCTAGATCCGCTTCCA- GGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCT GAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCATTTTTGTAGTGGCTCTCAT (SEQ ID NO: 13)

[212] O produto de PCR resultante foi digerido com NheI e XbaI e clonado nos sítios correspondentes do vetor pus10-CVM-pA-sorf3 para gerar pus10-CVM-pA-sorf3-F-P2A. O fragmento XbaI correspondente ao gene HN de NDV foi clonado em quadro em pus10-CVM-pA-sorf3-F- P2A para gerar o vetor de transferência de gene F-P2A-HN. O vetor de transferência resultante tem um peptídeo 2A derivado de Teschovirus-1 de suínos.

Exemplo 15 Inserção de genes NDV em genoma de HVT

[213] A recombinação homóloga foi utilizada para gerar recombinantes em que os genes estranhos foram inseridos entre US10 e sorf3 (posição de HVT 138771). Resumidamente, um micrograma de fibroblastos de embrião de frango infectados com HVT e 0,5-1 micrograma de vetor de transferência foram transfectados para fibroblastos de embrião de frango usando o método do fosfato de cálcio. Cinco dias depois, as placas de HVT foram purificadas e examinadas quanto à presença de inserção de genes estranhos. Os clones positivos foram propagados e a placa foi purificada para examinar a estabilidade e a expressão de genes estranhos.

[214] Para gerar recombinantes duplos, o DNA genômico de HVT- VP2 foi transfectado em vez de HVT para gerar a expressão do vetor HVT VP2 entre os genes UL3-UL4 e NDV (F, HN ou F/HN) na posição US10-sorf3.

Exemplo 16 Administração subcutânea em incubação de construto recombinante HVT-IBD VP2 + NDV (F) para aves para proteção contra a cepa STC de IBDV

[215] Para determinar a eficácia do construto recombinante HVT- IBD VP2 + NDV (F) contra o desafio da doença infecciosa da bursa (IBD) realizado aos 28 dias de idade, pintos Leghorn livres de patógenos específicos (SPF) foram alocados em três grupos. Dois grupos (T01 e T02) não foram vacinados, o grupo T03 foi vacinado subcutaneamente na incubação com uma dose alvo de 5000 pfu de HVT-IBD VP2 + NDV (F). Trinta e dois pintos por tratamento foram colocados em gaiolas de isolamento por tratamento e de acordo com a randomização. As aves foram monitoradas diariamente. No dia 28, após a incubação, todas as aves em cada grupo foram sangradas e desafiadas com a cepa STC de IBDV clássico virulento, dada pela administração de gotas oculares. As aves pós-desafio foram monitoradas quanto aos sinais clínicos e foram eutanasiadas e necropsiadas quatro dias após o desafio quanto a lesões agudas graves da bolsa de Fabricius associada ao IBD, incluindo edema, edema peribursal e hemorragia. As aves que morreram pós- desafio e as pessoas com lesões agudas de IBD na necropsia final foram consideradas susceptíveis ao IBDV. A soroconversão para IBDV foi determinada usando um ELISA comercial (Synbiotics, IBD plus), e as aves foram consideradas positivas para o anticorpo para IBDV de acordo com as especificações do fabricante. Tabela 10: Percentual de proteção a partir de desafio de IBDV e percentual de soroconversão no dia 28

[216] Os frangos desafiados não vacinados foram altamente susceptíveis ao IBDV, validando a gravidade do desafio. Oito a sete por cento dos frangos vacinados subcutaneamente na incubação HVT-IBD VP2 + NDV (F) foram protegidos a partir do desafio de IBDV virulento. No dia 28 pós-incubação, 100% de aves T03 eram soropositivas para anticorpos para IBDV por ELISA. Por conseguinte, o HVT-IBD VP2 + NDV (F) administrado por via subcutânea foi capaz de estimular a imunidade protetora e uma resposta de anticorpos específicos de IBDV em frangos SPF.

[217] Todas as composições e/ou métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida face à presente descrição. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferenciais, será evidente para os versados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência das etapas do método aqui descrito sem abandonar o conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão ligados química e fisiologica- mente podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos, enquanto os resultados iguais ou similares seriam alcançados. Todos esses substitutos e modificações similares aparentes para os versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações em anexo.

Claims (29)

1. Vetor viral recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende ao menos um transgene inserido em um genoma viral da doença de Marek em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma.

2. Vetor viral recombinante, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene inserido em um genoma viral da doença de Marek em uma região selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma; e (b) uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma.

3. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene expressa um gene viral antigênico.

4. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene compreende um primeiro transgene inserido na região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma, e um segundo transgene inserido na região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma.

5. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene compreende mais do que um transgene inserido na região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma, e a região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma.

6. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene viral antigênico compreende um gene selecionado a partir do grupo que consiste em um gene do vírus da doença infecciosa da bursa, um gene do vírus da doença de Newcastle, um gene do vírus da gripe aviária, e um gene do vírus da laringotraqueíte infecciosa e um gene do vírus da bronquite infecciosa.

7. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o gene do vírus da doença infecciosa da bursa é um gene VP2, ou o gene do vírus da doença de Newcastle é um gene F ou um gene HN ou uma quimera F/HN.

8. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene está operativamente ligado a um promotor heterólogo.

9. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o promotor compreende um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em um promotor IE de citomegalovírus humano, um promotor de CMV de porquinho-da-Índia, um promotor de SV40, um promotor de vírus de Doença de Aujeszky, um promotor de glicoproteína X, um promotor de Herpes-vírus simples do tipo 1, e um promotor do vírus da doença de Marek.

10. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o promotor compreende um promotor IE de citomegalovírus humano.

11. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene está operativamente ligado a um sinal poliA.

12. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sinal poliA é selecionado a partir do grupo que consiste em um sinal poliA de hormônio de crescimento bovino, um sinal poliA de SV40, um sinal AcNPV 1629 ORF poli(A) e um sinal HSV TK poliA.

13. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sinal poliA é um sinal poliA de hormônio de crescimento bovino.

14. Vetor viral recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que ao menos um transgene é inserido em um genoma viral da doença de Marek em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma.

15. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende a) o vetor viral recombinante como definido na reivindicação 1 ou 2; e b) um adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.

16. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que ao menos um transgene compreende um primeiro transgene inserido no genoma viral em uma região intergênica flanqueada por HVT10 (UL3) e HVT11 (UL4) na região longa única do genoma; e um segundo transgene inserido no genoma viral em uma região intergênica flanqueada por HVT86 (US10) e HVT87 (Sorf3) na região curta única do genoma.

17. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente ao menos um terceiro transgene que confere proteção contra uma terceira doença.

18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que ao menos um transgene está operativamente ligado a um promotor heterólogo.

19. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo transgene estão ligados operativamente ao mesmo promotor.

20. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o primeiro transgene está operativamente ligado a um promotor heterólogo e o segundo transgene está operativamente ligado a um segundo promotor heterólogo.

21. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que ao menos um transgene codifica um gene viral selecionado a partir do grupo que consiste em um gene do vírus da doença infecciosa da bursa, um gene do vírus da doença de Newcastle, um gene do vírus da gripe aviária, e um gene do vírus da laringotraqueíte infecciosa e um gene do vírus da bronquite infecciosa.

22. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o gene do vírus da doença infecciosa da bursa é um gene VP2, ou o gene do vírus da doença de Newcastle é um gene F ou um gene HN ou uma quimera F/HN.

23. Uso do vetor viral recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição farmacêutica para prevenir ou inibir a doença de Marek em combinação com ao menos uma segunda doença em aves.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição é fornecida ao pássaro por injeção.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a injeção é selecionada a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea e injeção em ovo.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição é fornecida ao pássaro antes da infecção ou exposição a uma doença.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o pássaro é uma espécie de ave.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a espécie de ave é selecionada a partir do grupo que consiste em um frango, um peru, uma codorna, um ganso, um pato, um cisne, uma galinha de angola e um pombo.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição é fornecida ao pássaro em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável de ocorrência não natural.