BR112018001145B1

BR112018001145B1 - READY-TO-USE VINCRISTINE COMPOSITION, METHOD FOR TREATING CANCER IN A MAMMAL, METHOD FOR TREATING A RECURRENCE OF CANCER IN A MAMMALAN, AND METHOD FOR STABILIZING VINCRISTINE IN A LIPOSOME

Info

Publication number: BR112018001145B1
Application number: BR112018001145-2A
Authority: BR
Inventors: William T. Monte; Robert Malcolm Abra; Bing Luo; Yuanpeng Zhang
Original assignee: Spectrum Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2023-07-18

Abstract

COMPOSIÇÃO DE VINCRISTINA PRONTA PARA USO, MÉTODO PARA TRATAR O CÂNCER NUM MAMÍFERO, MÉTODO PARA TRATAR UMA RECIDIVA DE CÂNCER NUM MAMÍFERO, E MÉTODO PARA ESTABILIZAR A VINCRISTINA NUM LIPOSSOMA. São aqui divulgadas várias composições compreendendo formulações neoplásicas e seus métodos de uso.READY-TO-USE VINCRISTINE COMPOSITION, METHOD FOR TREATING CANCER IN A MAMMALS, METHOD FOR TREATING A RECURRENCE OF CANCER IN A MAMMALS, AND METHOD FOR STABILIZING VINCRISTINE IN A LIPOSOME. Disclosed herein are various compositions comprising neoplastic formulations and methods of use thereof.

Description

Fundamentals

[0001] As formulações de lipossoma de agentes quimioterapêuticos, como a vincristina, podem proporcionar benefícios clínicos anticâncer significativos sobre as formas não encapsuladas. As formulações de nanopartículas farmacêuticas podem permitir a retenção prolongada de drogas in vivo, meias- vidas farmacocinéticas mais longas e aumento da acumulação em locais tumorais, o que pode se traduzir em melhores resultados clínicos. Estas características podem ser particularmente atraentes para drogas específicas do ciclo celular, como a Vincristina, que interrompe a ligação da tubulina durante a mitose celular. A dramática vantagem derivada do lipossoma é destacada na capacidade de administrar potencialmente a Injeção de Lipossoma de Sulfato de Vincristina (VSLI) sem capeamento de dose e pode, até mesmo permitir a intensificação da dose. Considerando que a vincristina não encapsulada pode ser prescrita com um tampão de dose para evitar toxicidades neuropatológicas limitativas de dose sérias.[0001] Liposome formulations of chemotherapeutic agents, such as vincristine, can provide significant anticancer clinical benefits over non-encapsulated forms. Pharmaceutical nanoparticle formulations can enable prolonged drug retention in vivo, longer pharmacokinetic half-lives, and increased accumulation at tumor sites, which can translate into improved clinical outcomes. These characteristics may be particularly attractive for cell cycle-specific drugs such as Vincristine, which disrupt tubulin binding during cell mitosis. The dramatic advantage derived from the liposome is highlighted in the ability to potentially deliver Vincristine Sulfate Liposome Injection (VSLI) without dose capping and may even allow for dose intensification. Whereas unencapsulated vincristine may be prescribed with a dose buffer to avoid serious dose-limiting neuropathological toxicities.

[0002] A eficácia da formulação lipossômica parece estar na capacidade do lipossoma de reter o agente terapêutico e manter a estabilidade química do agente ativo. Pensa-se que, quando se utilizam lipossomas compostos de esfingomielina-colesterol, como em VSLI, estes lipossomas resistentes à hidrólise permitem tempos de retenção de drogas terapeuticamente significativos. No entanto, a instabilidade química da vincristina pode limitar a estabilidade da vida útil da VSLI. Estudos de estabilidade para Marqibo® parecem mostrar que a degradação de VSLI ocorreu dentro de 24 horas de constituição à temperatura ambiente. O atual rótulo FDA aprovado exige administração dentro de 24 horas após a constituição. Como resultado das limitações de estabilidade a longo prazo vistas com VSLI, ele é preparado na farmácia imediatamente antes da administração.[0002] The effectiveness of the liposomal formulation appears to lie in the liposome's ability to retain the therapeutic agent and maintain the chemical stability of the active agent. It is thought that when sphingomyelin-cholesterol composite liposomes are used, as in VSLI, these hydrolysis-resistant liposomes allow for therapeutically significant drug retention times. However, the chemical instability of vincristine may limit the lifetime stability of VSLI. Stability studies for Marqibo® appear to show that degradation of VSLI occurred within 24 hours of constitution at room temperature. The current FDA approved label requires administration within 24 hours of constitution. As a result of the long-term stability limitations seen with VSLI, it is prepared in the pharmacy immediately prior to administration.

[0003] Como resultado da incapacidade de atingir uma formulação pronta para uso, nominalmente estável, a Injeção de Lipossomas de Sulfato de Vincristin (0,16 mg/mL) (VSLI) é constituída na farmácia de três componentes de medicamentos fornecidos como parte do Kit Marqibo®. Os três componentes do medicamento são Injeção de Sultafo de Vincristina, USP, (VSI), Injeção de Lipossoma de Colesterol com Esfingomielina (SCLI) e Injeção de Fosfato de Sódio (SPI). O kit de três componentes foi selecionado como forma de fornecer uma apresentação com uma vida útil adequada durante pelo menos 24 meses. A estabilidade do Kit pode ser regida pelo componente de Kit com o prazo de validade mais curto de 2 a 8°C, por exemplo, injeção de sulfato de vincristina.[0003] As a result of the inability to achieve a ready-to-use, nominally stable formulation, Vincristine Sulfate Liposome Injection (0.16 mg/mL) (VSLI) is constituted in the pharmacy from three drug components provided as part of the Marqibo® Kit. The three components of the medication are Vincristine Sulfate Injection, USP, (VSI), Sphingomyelin Cholesterol Liposome Injection (SCLI), and Sodium Phosphate Injection (SPI). The three-component kit was selected to provide a presentation with an adequate shelf life of at least 24 months. Kit stability may be governed by the Kit component with the shortest shelf life of 2 to 8°C, for example, vincristine sulfate injection.

[0004] Por conseguinte, pode ser desejável desenvolver uma formulação pronta para uso para evitar a necessidade de composição de múltiplas etapas na farmácia; isso aumentaria a facilidade da administração do Marqibo e eliminaria a necessidade de adquirir equipamentos auxiliares, por exemplo, banho de água constitucional e minimizar o potencial de erros de preparação de medicamentos. A estabilidade do produto é limitada pela degradação da vincristina, principalmente a formação de N- desformilvincristina (NFV). Este parece ser o maior degradante único de VSLI e também de VSI, o componente do Kit Marqibo. O aumento desta impureza ao longo do tempo faz com que o Kit Marqibo e a VSI tenham uma data de validade de 24 meses.[0004] Therefore, it may be desirable to develop a ready-to-use formulation to avoid the need for multi-step compounding in the pharmacy; This would increase the ease of administration of Marqibo and eliminate the need to purchase ancillary equipment, for example, constitutional water bath, and minimize the potential for medication preparation errors. Product stability is limited by the degradation of vincristine, mainly the formation of N-deformylvincristine (NFV). This appears to be the single biggest degrader of VSLI and also of VSI, the component of the Marqibo Kit. The increase in this impurity over time means that the Marqibo Kit and VSI have an expiration date of 24 months.

[0005] A vincristina é um composto de indolidroindol dimérico isolado das folhas da planta VINCA ROSEA. O alcaloide é composto por uma fração de N-desmetil-N-formil-reivindolina unida a uma espécie de velbanamina. Parece ser mais estável na sua forma de sal. Os sais são facilmente preparados por adição de uma quantidade teórica de ácido a uma solução da base livre de alcaloides, no entanto, como observado acima, até os sais de vincristina têm uma estabilidade limitada; 24 meses a 4°C. A N- deformilação do sulfato de vincristina é a via de degradação proeminente da vincristina. A N-formamida é posicionada no nitrogênio N1 de um heterociclo de vindolina tenso e provavelmente distende a função de carbonil da amida em uma posição vulnerável a ataque nucleofílico ou hidrólise. Outras vias de degradação menores incluem transformações hidrolíticas de vincristina, tais como 4-desacetilação ou perda de metil éster a 18' seguido de descarboxilação.[0005] Vincristine is a dimeric indolidroindole compound isolated from the leaves of the VINCA ROSEA plant. The alkaloid is composed of a fraction of N-desmethyl-N-formyl-reivindoline linked to a species of velbanamine. It appears to be more stable in its salt form. The salts are easily prepared by adding a theoretical amount of acid to a solution of the alkaloid-free base, however, as noted above, even vincristine salts have limited stability; 24 months at 4°C. Vincristine sulfate N-deformylation is the prominent degradation pathway of vincristine. N-formamide is positioned on the N1 nitrogen of a strained viverline heterocycle and likely stretches the amide carbonyl function into a position vulnerable to nucleophilic attack or hydrolysis. Other minor degradation pathways include hydrolytic transformations of vincristine, such as 4-deacetylation or loss of 18' methyl ester followed by decarboxylation.

[0006] Esta labilidade da vincristina prejudicou o desenvolvimento de formulações de vincristina não encapsuladas estáveis voltando ao inovador da USP VSI, Eli Lilly. Lilly procurou desenvolver uma formulação liofilizada ou liofilizada de injeção de sulfato de vincristina. A degradação da vincristina parece ter levado ao abandono dessas apresentações a favor de uma solução pronta para uso contendo sulfato de vincristina. A vincristina é sensível ao estresse térmico, ácido e fotográfico, o que leva à degradação das espécies de N-desformilvirinristina, bem como a outras impurezas relacionadas com substâncias. A oxidação do ar pode ser um contribuinte e foi demonstrado que a esterilização térmica não é compatível com VSLI ou VSI, devido à formação de impurezas de degradação.[0006] This lability of vincristine hampered the development of stable non-encapsulated vincristine formulations going back to USP VSI innovator, Eli Lilly. Lilly sought to develop a lyophilized or lyophilized formulation of vincristine sulfate injection. The degradation of vincristine appears to have led to the abandonment of these presentations in favor of a ready-to-use solution containing vincristine sulfate. Vincristine is sensitive to heat, acid, and photostress, which leads to degradation of N-desformylvirinristin species as well as other substance-related impurities. Air oxidation may be a contributor and it has been shown that thermal sterilization is not compatible with VSLI or VSI due to the formation of degradation impurities.

[0007] A comp estrutural da vincristina e a sensibilidade química frequentemente imprevisível do dimmer tem sido uma falha no uso de tipos comuns de excipientes tipicamente para formulações farmacêuticas. Os cientistas de Eli Lilly observaram em seu desenvolvimento de formulação de VSI que a presença de íon de cloreto deveria ser minimizada, pois poderia ter "efeitos deletérios sobre os dímeros de vinca oncolíticos". Os esforços indesejáveis de íons de cloreto nas formulações de drogas são raros. O cloreto de sódio é amplamente utilizado em formulações farmacêuticas para proporcionar propriedades isotônicas desejadas. Um relatório afirma que a Doxorrubicina e a Vincristina degradam-se rapidamente em misturas aquosas de cloreto de sódio a 0,45% e misturas de Ringers a 25°C a 37°C. O íon de cloreto também foi implicado na instabilidade de Thimerosal, um antifúngico, em formulações oftálmicas contendo cloreto de sódio como agente isotônico. Essas observações destacam a sensibilidade química única e extrema da vincristina.[0007] The structural composition of vincristine and the often unpredictable chemical sensitivity of the dimmer has been a flaw in the use of common types of excipients typically for pharmaceutical formulations. Eli Lilly scientists noted in their VSI formulation development that the presence of chloride ion should be minimized as it could have "deleterious effects on oncolytic vinca dimers." Undesirable stresses of chloride ions in drug formulations are rare. Sodium chloride is widely used in pharmaceutical formulations to provide desired isotonic properties. One report states that Doxorubicin and Vincristine degrade rapidly in aqueous mixtures of 0.45% sodium chloride and Ringers mixtures at 25°C to 37°C. The chloride ion has also been implicated in the instability of Thimerosal, an antifungal, in ophthalmic formulations containing sodium chloride as an isotonic agent. These observations highlight the unique and extreme chemical sensitivity of vincristine.

[0008] A falta de encontrar uma formulação pronta para uso para Marqibo® capaz de armazenamento prolongado resultou em uma busca por uma maneira alternativa de administrar VSLI levando ao desenvolvimento do kit de três frascos. O processo de constituição de três frascos para administração de Marqibo® (com a constituição em uma farmácia) recebeu aprovação de marketing da FDA em agosto de 2012.[0008] The failure to find a ready-to-use formulation for Marqibo® capable of prolonged storage resulted in a search for an alternative way to administer VSLI leading to the development of the three-vial kit. The process of forming three vials for administering Marqibo® (constituting in a pharmacy) received marketing approval from the FDA in August 2012.

[0009] O desenvolvimento de uma apresentação pronta para uso seria uma melhoria significativa para a administração de Marqibo®. Estudos foram propostos pelo Inex, inovador de Marqibo, para melhorar a estabilidade da formulação VSLI que utilizou liofilização, carregamento de ionóforo e/ou plataformas de carregamento de lipossomas de sulfato de manganês ou magnésio. Essas sugestões foram baseadas no uso de métodos de encapsulamento de segunda geração que alegadamente eram mais leves ou eletroneutrais em relação ao lipossoma em comparação com o método do gradiente de pH. No entanto, nenhuma formulação estável pronta par uso foi alcançada durante o desenvolvimento do Marqibo. Continua a haver uma necessidade de uma formulação pronta para uso de VSLI.[0009] The development of a ready-to-use presentation would be a significant improvement for the administration of Marqibo®. Studies were proposed by Marqibo innovator Inex to improve the stability of the VSLI formulation that utilized freeze-drying, ionophore loading and/or manganese or magnesium sulfate liposome loading platforms. These suggestions were based on the use of second-generation encapsulation methods that were claimed to be lighter or electroneutral to the liposome compared to the pH gradient method. However, no stable ready-to-use formulation was achieved during the development of Marqibo. There continues to be a need for a ready-to-use formulation of VSLI.

summary

[00010] Algumas modalidades incluem uma composição de vincristina pronta para uso compreendendo: uma fase aquosa contínua compreendendo um primeiro tampão aquoso, uma fase de lipossoma dispersa no primeiro tampão aquoso e uma solução aquosa estabilizante encapsulada como carga dentro da fase de lipossoma; em que a solução aquosa estabilizante compreende um segundo tampão aquoso e uma vincristina estabilizada dissolvida no mesmo; em que o segundo tampão aquoso compreende um sal com pelo menos um soluto que pode transportar para fora da fase de lipossoma e deixar um íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente na solução aquosa estabilizante, em que o íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente estabiliza a vincristina; e em que a fase aquosa contínua e a solução aquosa estabilizante têm uma diferença de pH de pelo menos 2 unidades de pH.[00010] Some embodiments include a ready-to-use vincristine composition comprising: a continuous aqueous phase comprising a first aqueous buffer, a liposome phase dispersed in the first aqueous buffer, and a stabilizing aqueous solution encapsulated as a filler within the liposome phase; wherein the stabilizing aqueous solution comprises a second aqueous buffer and a stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises a salt with at least one solute that can transport out of the liposome phase and leave a positively charged solute or hydronium ion in the stabilizing aqueous solution, wherein the positively charged solute or hydronium ion stabilizes vincristine; and wherein the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution have a pH difference of at least 2 pH units.

[00011] Algumas modalidades incluem um método de estabilização de vincristina num lipossoma compreendendo: dispersar uma fase de lipossoma dentro de uma fase aquosa contínua compreendendo um primeiro tampão aquoso; em que a fase de lipossoma contém uma solução aquosa estabilizante encapsulada dentro da fase de lipossoma; em que a solução aquosa estabilizante compreende um segundo tampão aquoso e uma vincristina estabilizada dissolvida no mesmo; em que o segundo tampão aquoso compreende um sal com pelo menos um soluto que pode transportar para fora da fase de lipossoma e deixar um íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente na solução aquosa estabilizante, em que o íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente estabiliza a vincristina; e em que a fase aquosa contínua e a solução aquosa estabilizante têm uma diferença de pH de pelo menos 2 unidades de pH.[00011] Some embodiments include a method of stabilizing vincristine in a liposome comprising: dispersing a liposome phase within a continuous aqueous phase comprising a first aqueous buffer; wherein the liposome phase contains a stabilizing aqueous solution encapsulated within the liposome phase; wherein the stabilizing aqueous solution comprises a second aqueous buffer and a stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises a salt with at least one solute that can transport out of the liposome phase and leave a positively charged solute or hydronium ion in the stabilizing aqueous solution, wherein the positively charged solute or hydronium ion stabilizes vincristine; and wherein the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution have a pH difference of at least 2 pH units.

[00012] Algumas modalidades incluem métodos de tratamento de câncer num mamífero compreendendo administrar uma quantidade terapêutica de uma composição compreendendo uma fase aquosa contínua compreendendo um primeiro tampão aquoso, uma fase de lipossoma dispersa no primeiro tampão aquoso e uma solução aquosa estabilizante encapsulada como carga dentro da fase de lipossoma; em que a solução aquosa estabilizante compreende um segundo tampão aquoso e uma vincristina estabilizada dissolvida no mesmo; em que o segundo tampão aquoso compreende um sal com pelo menos um soluto que pode transportar para fora da fase de lipossoma e deixar um íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente na solução aquosa estabilizante, em que o íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente estabiliza a vincristina; e em que a fase aquosa contínua e a solução aquosa estabilizante têm uma diferença de pH de pelo menos 2 unidades de pH.[00012] Some embodiments include methods of treating cancer in a mammal comprising administering a therapeutic amount of a composition comprising a continuous aqueous phase comprising a first aqueous buffer, a liposome phase dispersed in the first aqueous buffer, and a stabilizing aqueous solution encapsulated as a filler within from the liposome phase; wherein the stabilizing aqueous solution comprises a second aqueous buffer and a stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises a salt with at least one solute that can transport out of the liposome phase and leave a positively charged solute or hydronium ion in the stabilizing aqueous solution, wherein the positively charged solute or hydronium ion stabilizes vincristine; and wherein the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution have a pH difference of at least 2 pH units.

Brief Description of the Drawings

[00013] A FIG 1 é uma representação de um mecanismo de encapsulamento para a formulação de lipossoma de sulfato de vincristina.[00013] FIG 1 is a representation of an encapsulation mechanism for the vincristine sulfate liposome formulation.

Detailed Description

[00014] São aqui divulgados composições e métodos relacionados a uma formulação pronta para uso para injeção de lipossoma de sulfato de vincristina com estabilidade melhorada. Algumas modalidades foram obtidas substituindo o tampão de ácido cítrico usado na formulação de VSLI atual por um tampão de sulfato de amônio (AS) e criando um equilíbrio de pH de membrana de lipossoma multiplexas que aumenta a concentração das espécies estáveis de sulfato de vincristina (VER FIG. 1). O sulfato de amônio acoplado a um tampão de pH externo complementar pode mitigar a degradação da vincristina para N-desformilincristina, mantendo a integridade estrutural e dinâmica do lipossoma de esfingomielina-colesterol. Isso pode permitir o carregamento e a retenção eficientes da vincristina através de um método transmembranar. Algumas modalidades estão relacionadas a métodos para o tratamento de vários tipos de linfomas, como métodos para tratamento de formas recorrentes de linfoma não Hodgkin. Tipicamente, uma composição pronta para uso para estabilizar uma droga de acordo com esta divulgação, pode incluir uma fase aquosa contínua, uma fase de lipossoma dispersa na fase aquosa contínua e uma solução aquosa estabilizante encapsulada como carga dentro da fase de lipossoma.[00014] Compositions and methods related to a ready-to-use formulation for vincristine sulfate liposome injection with improved stability are disclosed herein. Some embodiments have been achieved by replacing the citric acid buffer used in the current VSLI formulation with an ammonium sulfate (AS) buffer and creating a multiplex liposome membrane pH balance that increases the concentration of the stable vincristine sulfate species (SEE FIG. 1). Ammonium sulfate coupled with a complementary external pH buffer can mitigate the degradation of vincristine to N-deformylincristine while maintaining the structural and dynamic integrity of the sphingomyelin-cholesterol liposome. This may allow efficient loading and retention of vincristine via a transmembrane method. Some modalities are related to methods for treating various types of lymphomas, such as methods for treating recurrent forms of non-Hodgkin's lymphoma. Typically, a ready-to-use composition for stabilizing a drug according to this disclosure may include a continuous aqueous phase, a liposome phase dispersed in the continuous aqueous phase, and a stabilizing aqueous solution encapsulated as a filler within the liposome phase.

[00015] Uma fase aquosa contínua pode compreender um primeiro tampão aquoso. O primeiro tampão pode estabilizar a vincristina e pode ajudar a facilitar o encapsulamento da vincristina. Por exemplo, uma fase aquosa contínua de pH neutro ou elevado, tal como o tampão de fosfato externo representado na FIG. 1, pode permitir que a vincristina atravesse a membrana de lipossoma principalmente na forma de base livre. Em contraste, a solução aquosa estabilizante encapsulada no lipossoma tem um pH suficientemente baixo para conduzir o equilíbrio ácido-base da vincristina, de modo que a quantidade de vincristina neutra dentro do lipossoma seja insignificante. Por exemplo, isso é ilustrado pelo equilíbrio entre a base livre de vincristina, sulfato de vincristina, amônia e sulfato de amônio representados na solução interna de lipossomas da FIG. 1. Isto pode proporcionar um gradiente de concentração de base livre de vincristina entre a fase aquosa contínua, que pode ter uma concentração de base livre de vincristina superior e a solução aquosa estabilizante encapsulada dentro do lipossoma, que pode ter uma concentração de base livre de vincristina negligenciável. Este gradiente de concentração pode impulsionar a migração de vincristina livre da fase aquosa contínua tendo uma elevada concentração de base livre de vincristina para a solução aquosa estabilizante dentro dos lipossomas, que possui uma concentração insignificante de vincristina neutra. Acredita-se que o carregamento de vincristina seja conduzido porque a forma de sal de vincristina normalmente não passa através da barreira do lipossoma para a fase aquosa contínua, mas a vincristina neutra pode passar através da barreira do lipossoma para a solução aquosa estabilizante dentro do lipossoma.[00015] A continuous aqueous phase may comprise a first aqueous buffer. The first buffer can stabilize vincristine and can help facilitate vincristine encapsulation. For example, a continuous aqueous phase of neutral or high pH, such as the external phosphate buffer depicted in FIG. 1, can allow vincristine to cross the liposome membrane mainly in the free base form. In contrast, the aqueous stabilizing solution encapsulated in the liposome has a low enough pH to drive the acid-base balance of vincristine such that the amount of neutral vincristine within the liposome is negligible. For example, this is illustrated by the balance between vincristine free base, vincristine sulfate, ammonia, and ammonium sulfate represented in the internal liposome solution of FIG. 1. This can provide a vincristine free base concentration gradient between the continuous aqueous phase, which may have a higher vincristine free base concentration, and the stabilizing aqueous solution encapsulated within the liposome, which may have a higher vincristine free base concentration. negligible vincristine. This concentration gradient can drive the migration of free vincristine from the continuous aqueous phase having a high concentration of vincristine free base to the stabilizing aqueous solution within the liposomes, which has a negligible concentration of neutral vincristine. Vincristine loading is believed to be driven because the salt form of vincristine does not normally pass through the liposome barrier into the continuous aqueous phase, but neutral vincristine can pass through the liposome barrier into the stabilizing aqueous solution within the liposome. .

[00016] Em algumas modalidades, a primeira solução tampão aquosa inclui qualquer tampão que pode amortecer a fase aquosa contínua até um pH que forneça vincristina primariamente neutra, tal como, mas não limitado a, um sal, um ácido ou base combinado com um conjugado de um ácido ou um base tal como, uma base conjugada monoaniônica, uma base conjugada dianiônica, uma base conjugada trianiônica, uma base conjugada, um ácido conjugado ou qualquer mistura ou combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, qualquer combinação do acima pode existir numa mistura titulada. Em algumas modalidades, o tampão é um tampão de sulfato. Em algumas modalidades, o tampão é um tampão de fosfato (por exemplo, um tampão de fosfato de sódio), um tampão de bicarbonato, um tampão de borato, etc. Em algumas modalidades, a primeira solução de tampão aquosa pode ser o solvente carreador primário ou o carreador de fluido da fase de lipossoma.[00016] In some embodiments, the first aqueous buffer solution includes any buffer that can buffer the continuous aqueous phase to a pH that provides primarily neutral vincristine, such as, but not limited to, a salt, an acid or base combined with a conjugate of an acid or a base such as a monoanionic conjugate base, a dianionic conjugate base, a trianionic conjugate base, a conjugate base, a conjugate acid or any mixture or combination thereof. In some embodiments, any combination of the above may exist in a titrated mixture. In some embodiments, the buffer is a sulfate buffer. In some embodiments, the buffer is a phosphate buffer (e.g., a sodium phosphate buffer), a bicarbonate buffer, a borate buffer, etc. In some embodiments, the first aqueous buffer solution may be the primary carrier solvent or fluid carrier of the liposome phase.

[00017] O primeiro tampão aquoso pode estar presente a qualquer concentração adequada. Por exemplo, o primeiro tampão aquoso pode estar presente numa concentração que faz o tampão aproximadamente isotônico, tal como uma concentração de cerca de 150 mM a cerca de 400 mM ou cerca de 250 mM a cerca de 350 mM.[00017] The first aqueous buffer may be present at any suitable concentration. For example, the first aqueous buffer may be present at a concentration that makes the buffer approximately isotonic, such as a concentration of about 150 mM to about 400 mM or about 250 mM to about 350 mM.

[00018] Um lipossoma inclui pelo menos o significado mais amplo compreendido por um versado na técnica e também inclui vesículas ou nanopartículas compostas por uma bicamada de fase lamelar, tal como uma bicamada lipídica. Em algumas modalidades, uma camada de lipossoma ou lipossômica é formada por qualquer substância substancialmente insolúvel na primeira solução tampão aquosa incluindo qualquer material conhecido na técnica para formar nanopartículas de lipossomas. Em algumas modalidades, os lipossomas compreendem qualquer material que possa formar uma vesícula composta por uma bicamada lipídica em fase lamelar. Os lipossomas podem compreender lipídeos, tais como fosfolipídeos (por exemplo, fosfatidilcolinas), esfingolipídeos (por exemplo, esfingomielina), glicolipídeos, fosfoglicerídeos, polietilenoglicol, colesterol, etc. Em algumas modalidades, os lipossomas compreendem lipídeos de fosfatidilcolina e/ou fosfolipídeos peguilados e/ou não peguilados. Em algumas modalidades, um componente lipídico de alguns lipossomas compreende qualquer cauda de ácido graxo que pode dar propriedades úteis à bicamada lipídica do lipossoma, por exemplo, elasticidade melhorada, carregamento de droga melhorado, etc.[00018] A liposome includes at least the broadest meaning understood by one skilled in the art and also includes vesicles or nanoparticles composed of a lamellar phase bilayer, such as a lipid bilayer. In some embodiments, a liposome or liposomal layer is formed by any substance substantially insoluble in the first aqueous buffer solution including any material known in the art to form liposome nanoparticles. In some embodiments, liposomes comprise any material that can form a vesicle composed of a lamellar phase lipid bilayer. Liposomes may comprise lipids such as phospholipids (e.g., phosphatidylcholines), sphingolipids (e.g., sphingomyelin), glycolipids, phosphoglycerides, polyethylene glycol, cholesterol, etc. In some embodiments, the liposomes comprise phosphatidylcholine lipids and/or pegylated and/or non-pegylated phospholipids. In some embodiments, a lipid component of some liposomes comprises any fatty acid tail that can impart useful properties to the lipid bilayer of the liposome, e.g., improved elasticity, improved drug loading, etc.

[00019] Em algumas modalidades, a nanopartícula ou lipossoma é usada para criar uma barreira solvente ou para criar um gradiente químico ou osmótico. O lipossoma ou a nanopartícula podem ser utilizados para separar duas soluções aquosas de pH substancialmente diferente. A nanopartícula também pode ser usada para separar duas soluções aquosas com substancialmente o mesmo pH. Em algumas modalidades, a nanopartícula é utilizada para separar duas soluções compreendendo tampões substancialmente diferentes. O lipossoma ou a nanopartícula também podem ser utilizados para separar duas soluções compreendendo tampões substancialmente semelhantes. Em algumas modalidades, o lipossoma é usado para separar duas soluções aquosas de pH substancialmente diferente e compreendendo soluções tampão substancialmente diferentes. Em algumas modalidades, o gradiente formado pela separação das duas soluções aquosas pode aumentar a eficiência de carregamento do lipossoma ou nanopartícula. Em algumas modalidades, a camada formada pelo lipossoma é descrita como fase de lipossoma, fase lipossômica ou fase interna de nanopartículas.[00019] In some embodiments, the nanoparticle or liposome is used to create a solvent barrier or to create a chemical or osmotic gradient. The liposome or nanoparticle can be used to separate two aqueous solutions of substantially different pH. The nanoparticle can also be used to separate two aqueous solutions with substantially the same pH. In some embodiments, the nanoparticle is used to separate two solutions comprising substantially different buffers. The liposome or nanoparticle can also be used to separate two solutions comprising substantially similar buffers. In some embodiments, the liposome is used to separate two aqueous solutions of substantially different pH and comprising substantially different buffer solutions. In some embodiments, the gradient formed by the separation of the two aqueous solutions can increase the loading efficiency of the liposome or nanoparticle. In some embodiments, the layer formed by the liposome is described as a liposome phase, liposomal phase, or internal nanoparticle phase.

[00020] A carga encapsulada deve ser entendida para incluir pelo menos o significado mais amplo compreendido por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica e inclui uma fase aquosa que é separada da fase aquosa envolvente por uma bicamada lipídica lipossômica.[00020] Encapsulated cargo should be understood to include at least the broadest meaning understood by a person of ordinary skill in the art and includes an aqueous phase that is separated from the surrounding aqueous phase by a liposomal lipid bilayer.

[00021] Em algumas modalidades, o lipossoma encapsula uma solução aquosa estabilizante que pode compreender um segundo tampão aquoso e a vincristina estabilizada dissolvida no mesmo.[00021] In some embodiments, the liposome encapsulates a stabilizing aqueous solution that may comprise a second aqueous buffer and the stabilized vincristine dissolved therein.

[00022] Em algumas modalidades, o segundo tampão aquoso compreende qualquer tampão que pode amortecer o pH da solução aquosa estabilizante que compreende um sal de amônio, por exemplo, um tampão de sulfato de amônio, um tampão de citrato de amônio, um tampão de fosfato de amônio, um tampão de bicarbonato de amônio, um tampão de carbonato de amônio, tampão de borato de amônio, etc. Acredita-se que um tampão de amônio pode ajudar a estabilizar a vincristina mantendo a solução aquosa estabilizante a um pH mais baixo ao longo do tempo em comparação com outros tampões que inicialmente proporcionam um pH semelhante. Acredita- se que os tampões não amônicos podem perder sua capacidade de tamponar ao longo do tempo. Uma vez que uma droga é encapsulada no lipossoma, pode tornar-se altamente concentrada no lipossoma, criando equilíbrio de migração iônica complexo, que se não equilibrado pode contribuir para a degradação da vincristina. Inesperadamente, os tampões de amônia podem manter um pH mais estável do que outros tampões com pH inicialmente similar. Isso pode ser porque, para sistemas como o representado na FIG. 1, a amônia livre pode escapar através da barreira lipossômica deixando um próton que estabiliza o pH do lipossoma interno.Em algumas modalidades, o agente terapeuticamente ativo estabilizado é qualquer medicamento que possa ser estabilizado na solução aquosa estabilizante. Em algumas modalidades, o agente terapeuticamente ativo estabilizado é uma droga anticancerígena tal como, mas não limitado a, vincristina.[00022] In some embodiments, the second aqueous buffer comprises any buffer that can buffer the pH of the stabilizing aqueous solution comprising an ammonium salt, e.g., an ammonium sulfate buffer, an ammonium citrate buffer, an ammonium phosphate, an ammonium bicarbonate buffer, an ammonium carbonate buffer, ammonium borate buffer, etc. It is believed that an ammonium buffer may help stabilize vincristine by keeping the stabilizing aqueous solution at a lower pH over time compared to other buffers that initially provide a similar pH. It is believed that non-ammonium buffers may lose their buffering ability over time. Once a drug is encapsulated in the liposome, it can become highly concentrated in the liposome, creating complex ionic migration balance, which if not balanced can contribute to the degradation of vincristine. Unexpectedly, ammonia buffers can maintain a more stable pH than other buffers with initially similar pH. This may be because, for systems like the one depicted in FIG. 1, free ammonia can escape through the liposomal barrier leaving a proton that stabilizes the pH of the internal liposome. In some embodiments, the stabilized therapeutically active agent is any drug that can be stabilized in the stabilizing aqueous solution. In some embodiments, the stabilized therapeutically active agent is an anticancer drug such as, but not limited to, vincristine.

[00023] A vincristina pode ser representada pela seguinte fórmula estrutural química: [00023] Vincristine can be represented by the following chemical structural formula:

[00024] A vincristina também pode ser representada pelo nome químico: (3aR,3a1R,4R,5S,5aR,10bR)-metil-4-acetoxi-3a-etil-9- ((5S,7S,9S)-5-etil-5-hidroxi-9-(metoxicarbonil)-2,4,5,6,7,8,9,10- octa-hidro-1H-3,7-metano[1] azacicloundecino[5,4-b]indol-9-il)-6- formil-5-hidroxi-8-metoxi-3a,3a1,4,5,5a,6,11, 12-octa-hidro-1H- indolizino[8,1-cd]carbazol-5-carboxilato.[00024] Vincristine can also be represented by the chemical name: (3aR,3a1R,4R,5S,5aR,10bR)-methyl-4-acetoxy-3a-ethyl-9- ((5S,7S,9S)-5- ethyl-5-hydroxy-9-(methoxycarbonyl)-2,4,5,6,7,8,9,10-octahydro-1H-3,7-methane[1] azacycloundecine[5,4-b] indol-9-yl)-6-formyl-5-hydroxy-8-methoxy-3a,3a1,4,5,5a,6,11, 12-octahydro-1H-indolizino[8,1-cd]carbazole -5-carboxylate.

[00025] Em algumas modalidades, a segunda solução de tampão aquosa ajuda a estabilizar a vincristina dissolvida dentro da solução aquosa estabilizante. Em algumas modalidades, um agente terapeuticamente ativo é substancialmente mais estável na solução aquosa estabilizante do que seria no primeiro tampão aquoso. Em algumas modalidades, a vincristina é substancialmente mais estável na solução aquosa estabilizante do que no primeiro tampão aquoso.[00025] In some embodiments, the second aqueous buffer solution helps to stabilize the vincristine dissolved within the stabilizing aqueous solution. In some embodiments, a therapeutically active agent is substantially more stable in the stabilizing aqueous solution than it would be in the first aqueous buffer. In some embodiments, vincristine is substantially more stable in the stabilizing aqueous solution than in the first aqueous buffer.

[00026] A solução aquosa estabilizante compreende um segundo tampão aquoso. O segundo tampão aquoso deve compreender um sal com pelo menos um soluto que pode transportar para fora da fase de lipossoma. Quando o soluto se transporta para fora da fase de lipossoma, ele deixa um íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente na solução aquosa estabilizante. Assim, o íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente pode estabilizar a vincristina. Há uma série de sais que podem transportar para fora da fase de lipossomas e deixar um íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente. Por exemplo, as bases neutras de carga podem ser transportadas para fora das fases de lipossoma. Assim, para um sal de uma base neutra, como amônia, aminas, aminoácidos, fosfinas, etc., a base neutra, por exemplo, amônia ou amina, pode transportar para fora da fase de lipossoma, e o cátion ou íon de hidrônio do sal pode permanecer na solução aquosa estabilizante. Exemplos de sais estabilizantes adequados podem incluir, mas não estão limitados a, sais de amônia ou sais de aminas, tais como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, etc.[00026] The stabilizing aqueous solution comprises a second aqueous buffer. The second aqueous buffer must comprise a salt with at least one solute that can transport out of the liposome phase. When the solute transports out of the liposome phase, it leaves a positively charged solute or hydronium ion in the stabilizing aqueous solution. Thus, the positively charged solute or hydronium ion can stabilize vincristine. There are a number of salts that can transport out of the liposome phase and leave a positively charged solute or hydronium ion. For example, charge-neutral bases can be transported out of the liposome phases. Thus, for a salt of a neutral base, such as ammonia, amines, amino acids, phosphines, etc., the neutral base, e.g., ammonia or amine, can transport out of the liposome phase, and the hydronium cation or ion of the salt may remain in the stabilizing aqueous solution. Examples of suitable stabilizing salts may include, but are not limited to, ammonium salts or amine salts, such as methylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, etc.

[00027] Em algumas modalidades, o agente terapeuticamente ativo é substancialmente estabilizado por um sal de amônio no segundo tampão aquoso. Em algumas modalidades, um tampão de sulfato de amônio reduz substancialmente a taxa de degradação da vincristina para desformilpinristina. Em algumas modalidades, o sulfato de amônio protege substancialmente a vincristina contra a deformilação. Em algumas modalidades, a presença de íon de amônio pode proteger substancialmente a vincristina contra a deformilação. Em algumas modalidades, o principal contribuinte de íon de amônio para a solução é o sulfato de amônio. Em algumas modalidades, qualquer tampão de sal de amônio pode contribuir para proteger a vincristina contra a deformilação.[00027] In some embodiments, the therapeutically active agent is substantially stabilized by an ammonium salt in the second aqueous buffer. In some embodiments, an ammonium sulfate buffer substantially reduces the rate of degradation of vincristine to deformylpinristine. In some embodiments, ammonium sulfate substantially protects vincristine against deformylation. In some embodiments, the presence of ammonium ion can substantially protect vincristine against deformylation. In some embodiments, the main ammonium ion contributor to the solution is ammonium sulfate. In some embodiments, any ammonium salt buffer can help protect vincristine against deformylation.

[00028] O segundo tampão aquoso pode estar presente na solução aquosa estabilizante a um pH que pode ajudar a estabilizar a vincristina. Em algumas modalidades, o segundo tampão aquoso, tal como um sal de amônio, por exemplo, sulfato de amônio, pode estar presente. Composição da reivindicação 1, em que o sal de amônio está presente no segundo tampão aquoso a uma concentração de cerca de 100 mM a cerca de 500 mM , cerca de 200 mM a cerca de 400 mM, cerca de 200 mM a cerca de 300 mM, cerca de 250 mM a cerca de 300 mM, cerca de 300 mM a cerca de 350 mM, ou cerca de 250 mM a cerca de 350 mM.[00028] The second aqueous buffer may be present in the stabilizing aqueous solution at a pH that may help stabilize the vincristine. In some embodiments, the second aqueous buffer, such as an ammonium salt, e.g., ammonium sulfate, may be present. The composition of claim 1, wherein the ammonium salt is present in the second aqueous buffer at a concentration of about 100 mM to about 500 mM, about 200 mM to about 400 mM, about 200 mM to about 300 mM , about 250 mM to about 300 mM, about 300 mM to about 350 mM, or about 250 mM to about 350 mM.

[00029] Em algumas modalidades, a fase aquosa contínua ou o primeiro tampão aquoso tem um pH de cerca de pH 5 a cerca de pH 8,8 ou cerca de pH 9, de cerca de pH 5 a cerca de pH 6, de cerca de pH 6 a cerca de pH 7, de cerca de pH 7 a cerca de pH 8, de cerca de pH 7 a cerca de pH 8,5, de cerca de pH 7 a cerca de pH 8,8 ou cerca de pH 9, de cerca de pH 7,2 a cerca de pH 7,8, de cerca de pH 7,4 a cerca de pH 7,8, de cerca de pH 7,8 a cerca de pH 8, de cerca de pH 8 a cerca de pH 8,2, de cerca de pH 8,2 a cerca de pH 8,8, de cerca de pH 8,4 a cerca de pH 8,8, cerca de pH 7,8, cerca de pH 7,4, cerca de pH 8 ou qualquer pH delimitado por ou entre qualquer um desses valores.[00029] In some embodiments, the continuous aqueous phase or the first aqueous buffer has a pH of about pH 5 to about pH 8.8 or about pH 9, of about pH 5 to about pH 6, of about from pH 6 to about pH 7, from about pH 7 to about pH 8, from about pH 7 to about pH 8.5, from about pH 7 to about pH 8.8 or about pH 9 , from about pH 7.2 to about pH 7.8, from about pH 7.4 to about pH 7.8, from about pH 7.8 to about pH 8, from about pH 8 to about pH 8.2, from about pH 8.2 to about pH 8.8, from about pH 8.4 to about pH 8.8, about pH 7.8, about pH 7.4 , about pH 8 or any pH bounded by or between any of these values.

[00030] Em algumas modalidades, a solução aquosa estabilizante ou o segundo tampão aquoso tem um pH de cerca de pH 3 a cerca de pH 5,5, de cerca de pH 3 a cerca de pH 4, de cerca de pH 3,5 a cerca de pH 4,5, de cerca de pH 4 a cerca de pH 5, cerca de pH 4, ou qualquer pH delimitado por ou entre qualquer um desses valores.[00030] In some embodiments, the stabilizing aqueous solution or second aqueous buffer has a pH of about pH 3 to about pH 5.5, of about pH 3 to about pH 4, of about pH 3.5 to about pH 4.5, from about pH 4 to about pH 5, about pH 4, or any pH bounded by or between any of these values.

[00031] Em algumas modalidades, a diferença de pH ou ΔpH entre a fase aquosa contínua e a solução aquosa estabilizante ou o primeiro tampão aquoso e o segundo tampão aquoso é de cerca de 1 unidade de pH a cerca de 4 unidades de pH, de cerca de 2 unidades de pH a cerca de 3 unidades de pH, de cerca de 1,5 unidades de pH a cerca de 2,5 unidades de pH, de cerca de 2,5 a cerca de 3,5 unidades de pH, de cerca de 3 unidades de pH a cerca de 4 unidades de pH, cerca de 3,8 unidades de pH ou qualquer diferença delimitada por ou entre qualquer um destes valores.[00031] In some embodiments, the difference in pH or ΔpH between the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution or the first aqueous buffer and the second aqueous buffer is from about 1 pH unit to about 4 pH units, from from about 2 pH units to about 3 pH units, from about 1.5 pH units to about 2.5 pH units, from about 2.5 to about 3.5 pH units, from about 3 pH units to about 4 pH units, about 3.8 pH units or any difference bounded by or between any of these values.

[00032] Em algumas modalidades, o ΔpH pode ajudar a aumentar a eficiência de encapsulamento de lipossomas. Em algumas modalidades, um ΔpH útil para obter o carregamento útil de lipossomas é de cerca de 1 unidade de pH a cerca de 4 unidades de pH, de cerca de 2 unidades de pH a cerca de 3 unidades de pH, de cerca de 1,5 unidades de pH a cerca de 2,5 unidades de pH, de cerca de 2,5 unidades de pH a cerca de 3,5 unidades de pH, de cerca de 3 unidades de pH a cerca de 4 unidades de pH, cerca de 3,8 unidades de pH, ou qualquer diferença delimitada por ou entre qualquer um desses valores.[00032] In some embodiments, ΔpH can help increase liposome encapsulation efficiency. In some embodiments, a useful ΔpH to obtain payload of liposomes is from about 1 pH unit to about 4 pH units, from about 2 pH units to about 3 pH units, from about 1, 5 pH units to about 2.5 pH units, from about 2.5 pH units to about 3.5 pH units, from about 3 pH units to about 4 pH units, about 3.8 pH units, or any difference bounded by or between any of these values.

[00033] Em algumas modalidades, o carregamento de lipossoma com ingrediente ativo pode ser descrito como o carregamento do potencial transmembranar. Em algumas modalidades, o potencial é criado pelo gradiente de prótons como descrito acima, o que leva à acumulação do agente terapêutico dentro do lipossoma.[00033] In some embodiments, loading the liposome with active ingredient can be described as loading the transmembrane potential. In some embodiments, the potential is created by the proton gradient as described above, which leads to the accumulation of the therapeutic agent within the liposome.

[00034] Em algumas modalidades, a combinação do ΔpH, dos tampões empregados e do lipossoma resulta em um equilíbrio de ambas as características necessárias para o bom carregamento do agente terapeuticamente ativo e as características que minimizam a degradação do agente terapeuticamente ativo.[00034] In some embodiments, the combination of ΔpH, the buffers used and the liposome results in a balance of both characteristics necessary for good loading of the therapeutically active agent and characteristics that minimize degradation of the therapeutically active agent.

[00035] Em algumas modalidades, a composição divulgada inclui um tampão de sulfato de amônio que pode criar um equilíbrio de pH de membrana de lipossomas multiplexas que resulta em uma concentração aumentada da espécie de sulfato de vincristina estável (VER FIG. 1). O uso divulgado da formulação de lipossoma do equilíbrio de sulfato de amônio acoplado ao controle de migração de íons por um tampão de pH externo complementar mitiga surpreendentemente a degradação de vincristina em N- desformilvincristina (NFV), mas mantém a integridade estrutural e dinâmica do lipossoma para permitir o carregamento e a retenção de vincristina através de um método transmembranar.[00035] In some embodiments, the disclosed composition includes an ammonium sulfate buffer that can create a multiplex liposome membrane pH balance that results in an increased concentration of the stable vincristine sulfate species (SEE FIG. 1). The liposome formulation's disclosed use of ammonium sulfate balance coupled to the control of ion migration by a complementary external pH buffer surprisingly mitigates the degradation of vincristine to N-deformylvincristine (NFV) but maintains the structural and dynamic integrity of the liposome. to allow loading and retention of vincristine via a transmembrane method.

[00036] A N-desformilpinristina pode ser representada pela fórmula estrutural: [00036] N-desformylpyristin can be represented by the structural formula:

[00037] A N-desformilvincristina também pode ser representada pelo nome químico, (3aR,3a1R,4R,5S,5aR,10bS)-metil 4-acetoxi-3a- etil-9-((5S,7S,9S)-5-etil-5-hidroxi-9-(metoxicarbonil)- 2,4,5,6,7,8,9,10-octa-hidro-1H-3,7-metano[1]azacicloundecino[5,4- b]indol-9-il)-5-hidroxi-8-metoxi-3a,3a1,4,5,5a,6,11,12-octa- hidro-1H-indolizino[8,1-cd]carbazol-5-carboxilato.[00037] N-desformylvincristine can also be represented by the chemical name, (3aR,3a1R,4R,5S,5aR,10bS)-methyl 4-acetoxy-3a-ethyl-9-((5S,7S,9S)-5 -ethyl-5-hydroxy-9-(methoxycarbonyl)- 2,4,5,6,7,8,9,10-octahydro-1H-3,7-methano[1]azacycloundecino[5,4- b ]indol-9-yl)-5-hydroxy-8-methoxy-3a,3a1,4,5,5a,6,11,12-octahydro-1H-indolizino[8,1-cd]carbazol-5- carboxylate.

[00038] O NFV às vezes pode ser formado mesmo quando existe um gradiente (isto é, pH 4 interno e pH 7,5 externo) ou se o pH externo e interno for o mesmo (ou seja, pH 4). Isso pode implicar que as espécies de vincristina, que podem ser suscetíveis à reação de deformilação irreversível, podem ser formadas dentro do lipossoma. Uma das espécies possíveis é a vincristina neutra, que pode ser suscetível às vias de degradação da vincristina. Uma vantagem das composições descritas atualmente é a sua capacidade de minimizar a formação de espécies de vincristina suscetíveis a degradação dentro do lipossoma.[00038] NFV can sometimes be formed even when a gradient exists (i.e., internal pH 4 and external pH 7.5) or if the external and internal pH are the same (i.e., pH 4). This may imply that vincristine species, which may be susceptible to the irreversible deformylation reaction, may be formed within the liposome. One of the possible species is neutral vincristine, which may be susceptible to vincristine degradation pathways. An advantage of the currently described compositions is their ability to minimize the formation of vincristine species susceptible to degradation within the liposome.

[00039] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas podem ser administradas a um mamífero para o tratamento de câncer ou para o tratamento de câncer recidivo. Em algumas modalidades, o câncer inclui linfoma ou leucemia. Em algumas modalidades, o mamífero pode ter sido previamente submetido à terapia de tratamento de câncer.[00039] In some embodiments, the compositions described herein can be administered to a mammal for the treatment of cancer or for the treatment of relapsed cancer. In some embodiments, the cancer includes lymphoma or leukemia. In some embodiments, the mammal may have previously undergone cancer treatment therapy.

[00040] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas podem ser incluídas em métodos para o tratamento de uma neoplasia em um mamífero. Em algumas modalidades, as composições aqui descritas podem ser incluídas em métodos para o tratamento de formas de recidiva de uma neoplasia em um mamífero. Em algumas modalidades, a composição aqui descrita pode ser incluída num método para o tratamento de vários tipos de linfomas. Em algumas modalidades, a composição aqui descrita pode ser administrada para o tratamento de linfoma não Hodgkin. Em algumas modalidades, a composição aqui descrita pode ser administrada para o tratamento da recidiva do linfoma não Hodgkin.[00040] In some embodiments, the compositions described herein can be included in methods for treating a neoplasm in a mammal. In some embodiments, the compositions described herein can be included in methods for treating relapsed forms of a neoplasm in a mammal. In some embodiments, the composition described herein can be included in a method for treating various types of lymphomas. In some embodiments, the composition described herein can be administered for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. In some embodiments, the composition described herein can be administered for the treatment of relapsed non-Hodgkin's lymphoma.

[00041] O termo neoplasia, tal como aqui utilizado, inclui pelo menos o significado mais amplo compreendido por uma pessoa versada comum na técnica e também inclui qualquer crescimento aberrante de células, tumores, derrames malignos, cistos, etc. Uma citação de neoplasia pode conter uma variedade de tipos de células, incluindo, sem limitação, células neoplásicas, células endoteliais ou células imunológicas, como leucócitos, mielócitos, linfócitos, etc.[00041] The term neoplasia, as used herein, includes at least the broadest meaning understood by a person of ordinary skill in the art and also includes any aberrant growth of cells, tumors, malignant effusions, cysts, etc. A neoplasm citation may contain a variety of cell types, including, without limitation, neoplastic cells, endothelial cells, or immune cells such as leukocytes, myelocytes, lymphocytes, etc.

[00042] Em algumas modalidades, a neoplasia a ser tratada é um câncer.[00042] In some embodiments, the neoplasm to be treated is cancer.

[00043] Em algumas modalidades em que a composição é injeção de lipossoma de sulfato de vincristina (VLSI), a composição pode ser administrada a um mamífero para o tratamento de câncer ou câncer recidivo. A composição pode ser administrada a uma dose de cerca de 1 mg/m2 a cerca de 4 mg/m2, cerca de 1,5 mg/m2 a cerca de 3 mg/m2, cerca de 2 mg/m2 a cerca de 3 mg/m2, cerca de 2 mg/m2 a cerca de 2,5 mg/m2, cerca de 2 mg/m2, cerca de 1,5 mg/m2, a cerca de 2,25 mg/m2, cerca de 2,5 mg/m2, cerca de 3 mg/m2, a cerca de 2,0 mg/m2, cerca de 2,1 mg/m2, cerca de 2,2 mg/m2, a cerca de 2,3 mg/m2, cerca de 2,4 mg/m2, ou cerca de 1,9 mg/m2. Em algumas modalidades, a VLSI é administrada em combinação com outros compostos terapêuticos. Em algumas modalidades, a VLSI é administrada em combinação com outros medicamentos antineoplásicos.[00043] In some embodiments in which the composition is vincristine sulfate liposome injection (VLSI), the composition can be administered to a mammal for the treatment of cancer or relapsed cancer. The composition can be administered at a dose of about 1 mg/m2 to about 4 mg/m2, about 1.5 mg/m2 to about 3 mg/m2, about 2 mg/m2 to about 3 mg /m2, about 2 mg/m2 to about 2.5 mg/m2, about 2 mg/m2, about 1.5 mg/m2, to about 2.25 mg/m2, about 2.5 mg/m2, about 3 mg/m2, about 2.0 mg/m2, about 2.1 mg/m2, about 2.2 mg/m2, about 2.3 mg/m2, about of 2.4 mg/m2, or about 1.9 mg/m2. In some embodiments, VLSI is administered in combination with other therapeutic compounds. In some embodiments, VLSI is administered in combination with other antineoplastic medications.

Example 1: Lower free drug content, dialyzed Marqibo formulation.

[00044] A estabilidade da injeção de lipossoma de sulfato de vincristina (VSLI) reflete-se na sua degradação para N- desformilpinristina (NFV). A VSLI quando constituída a partir da formulação do kit de 3 frascos, pode exigir administração em 24 horas devido à degradação potencial da vincristina. A preparação de VSLI também atinge sempre < 5% de vincristina livre. A vincristina livre seria no ambiente de tampão de pH 7,4 externo. No entanto, pensa-se que a vincristina é mais estável na sua forma de sal (pKa 5,0 e 7,4) e a pH 7,4, o equilíbrio seria menos favorável para a forma de sal em comparação com o pH 4,0 do interior do lipossoma. Pode ser útil examinar até que ponto a vincristina livre contribuiu para a formação do NFV e sua influência na estabilidade geral da VSLI.[00044] The stability of vincristine sulfate liposome injection (VSLI) is reflected in its degradation to N-desformylpinristine (NFV). VSLI, when constructed from the 3-vial kit formulation, may require administration within 24 hours due to potential degradation of vincristine. The VSLI preparation also always achieves <5% free vincristine. Free vincristine would be in the external pH 7.4 buffer environment. However, vincristine is thought to be more stable in its salt form (pKa 5.0 and 7.4) and at pH 7.4, the equilibrium would be less favorable for the salt form compared to pH 4. ,0 from inside the liposome. It may be useful to examine the extent to which free vincristine contributed to NFV formation and its influence on the overall stability of VSLI.

[00045] A VSLI foi preparada a partir de componentes equivalentes do kit Marqibo, isto é, VSI, SPI e SCLI. A vincristina livre (não encapsulada) foi removida por diálise usando vários tampões em condições variáveis de pH. As variantes foram colocadas em estabilidade por até 12 semanas e testadas para critérios principais de estabilidade de VSLI. As variações examinaram a diálise usando os seguintes tampões externos: a) Solução de sacarose tamponada com fosfato, pH 7,4 b) Salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 c) Soluções de sacarose tamponadas com fosfato, pH 4,0 d) Soluções de sacarose tamponadas com fosfato, pH 5,0[00045] The VSLI was prepared from equivalent components of the Marqibo kit, that is, VSI, SPI and SCLI. Free (unencapsulated) vincristine was removed by dialysis using various buffers under varying pH conditions. The variants were placed on stability for up to 12 weeks and tested for key VSLI stability criteria. Variations examined dialysis using the following external buffers: a) Phosphate-buffered sucrose solution, pH 7.4 b) Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 c) Phosphate-buffered sucrose solutions, pH 4.0 d) Phosphate-buffered sucrose solutions, pH 5.0

Preparation of External Vincristine-free VSLI with External Buffer pH 4.0-7.4

[00046] Foram realizadas três encapsulações de VSLI separadas dos componentes do kit (31 mL cada) e agrupadas. Uma amostra pós- carregamento foi removida para análise e o volume de amostra restante dividido em quatro porções (~ 21,75 mL cada). Estas amostras foram colocadas em sacos de membrana de diálise MWCO Spectrapor No. 1, 40 mm de largura, 6-8 kDa e dialisadas contra excesso de 20 volumes usando soluções salinas tamponadas com fosfato (PBS) ou soluções de sacarose tamponadas com fosfato, pH 7,4 para trocas de quatro volumes durante um período de 24 horas à temperatura ambiente protegidas da luz. O PBS preparado continha fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 130 mM, pH 7,4. A sacarose tamponada com fosfato continha 10% (p/v) de sacarose, fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4. Pós-diálise, as amostras do mesmo tampão foram juntas, filtradas por esterilidade sob condições assépticas usando filtros de seringa descartáveis (Pall Acrodiscs, 0,2 μm de tamanho de poro, membranas Supor) e alíquotas em tubos estéril individuais (4,2 mL) para cada ponto do tempo do estudo de estabilidade (0, 2, 4, 8, 12 semanas a 28°C; 2, 4, 8, 12 semanas à temperatura ambiente e 2 semanas a 40°C).[00046] Three VSLI encapsulations were performed separately from the kit components (31 mL each) and grouped together. A post-loading sample was removed for analysis and the remaining sample volume divided into four portions (~21.75 mL each). These samples were placed in MWCO Spectrapor No. 1 dialysis membrane bags, 40 mm wide, 6-8 kDa and dialyzed against excess 20 volumes using phosphate-buffered saline (PBS) or phosphate-buffered sucrose solutions, pH 7.4 for exchanges of four volumes over a period of 24 hours at room temperature protected from light. The prepared PBS contained 20 mM sodium phosphate, 130 mM sodium chloride, pH 7.4. Phosphate buffered sucrose contained 10% (w/v) sucrose, 20 mM sodium phosphate, pH 7.4. Post-dialysis, samples of the same buffer were pooled, sterile filtered under aseptic conditions using disposable syringe filters (Pall Acrodiscs, 0.2 μm pore size, Supor membranes), and aliquoted into individual sterile tubes (4.2 mL ) for each stability study time point (0, 2, 4, 8, 12 weeks at 28°C; 2, 4, 8, 12 weeks at room temperature and 2 weeks at 40°C).

Preparation of external Vincristine-free VSLI with pH 4 and 5 external buffers Preliminary small-scale assessments

[00047] Um estudo de teste inicial foi realizado para verificar se a diálise de Marqibo em condições de baixo pH realmente ocorreu. Um total de 8 mL de produto de VSLI foi preparado a partir de frascos de kit Marqibo como descrito acima e o material pós-carregamento foi dividido em alíquotas de 2 mL para diálise em sacos de membrana de diálise MWCO de Spectrapor No. 1, 20 mm de largura, 6-8 kDa contra excesso de 20 volumes usando soluções SPI em pH 4, 5 ou 6 para quatro trocas de volume durante um período de vinte e quatro horas a 2-8°C, protegido da luz. As amostras pós-diálise foram testadas para o teor de vincristina livre (Tabela 1) e mostram que a diálise com tampão externo de pH baixo é possível. Tabela 1. Efeito da diálise na droga total e porcentagem livre para as variantes de Marqibo. [00047] An initial test study was carried out to verify whether dialysis of Marqibo under low pH conditions actually occurred. A total of 8 mL of VSLI product was prepared from Marqibo kit vials as described above and the post-loading material was divided into 2 mL aliquots for dialysis in Spectrapor No. 1 MWCO dialysis membrane bags. mm wide, 6-8 kDa against excess of 20 volumes using SPI solutions at pH 4, 5 or 6 for four volume changes over a twenty-four hour period at 2-8°C, protected from light. Post-dialysis samples were tested for free vincristine content (Table 1) and show that dialysis with low pH external buffer is possible. Table 1. Effect of dialysis on total drug and percentage free for Marqibo variants.

Dialysis Variant Escalation

[00048] Uma solução de 50 mL de produto de VSLI foi preparada a partir de frascos de kit Marqibo como descrito acima. O volume do produto pós-carregamento foi dividido em dois e cada metade foi colocada em sacos de membrana de diálise MWCO Spectrapor No. 1, 40 mm de largura, 6-8 kDa e dialisado contra excesso de 20 volumes utilizando soluções de sacarose tamponadas com fosfato a pH 4 ou 5 para quatro trocas de volume durante um período de setenta e duas horas em 2-8C° protegido da luz. As amostras pós- diálise foram colhidas, esterilizadas e aliquotadas em tubos estéril individuais (3,5 mL) para cada período de tempo do estudo de estabilidade (0, 2, 4, 8, 12 semanas a 2-8°C e 2, 4 semanas à temperatura ambiente).[00048] A 50 mL solution of VSLI product was prepared from Marqibo kit vials as described above. The volume of post-loading product was divided into two and each half was placed in MWCO Spectrapor No. 1 dialysis membrane bags, 40 mm wide, 6-8 kDa and dialyzed against excess 20 volumes using buffered sucrose solutions with phosphate at pH 4 or 5 for four volume changes over a period of seventy-two hours at 2-8C° protected from light. Post-dialysis samples were collected, sterilized and aliquoted into individual sterile tubes (3.5 mL) for each stability study time period (0, 2, 4, 8, 12 weeks at 2-8°C and 2. 4 weeks at room temperature).

Stability Analysis Protocol

[00049] Em cada ponto de tempo de estabilidade, amostras foram analisadas para: pH (medidor de pH Beckman Phi 360), osmolalidade (Wescor Inc. Osmômetro de pressão de vapor Vapro 5520), tamanho de partícula, vincristina total e livre e impurezas relacionadas a drogas.[00049] At each stability time point, samples were analyzed for: pH (Beckman Phi 360 pH meter), osmolality (Wescor Inc. Vapro 5520 Vapor Pressure Osmometer), particle size, total and free vincristine, and impurities drug-related.

Results

[00050] Os resultados de estabilidade da remoção de vincristina livre a partir do tampão externo de VSLI preparado a partir da formulação de 3 frascos são mostrados na Tabela 2. A remoção de vincristina livre não pareceu melhorar a estabilidade de VSLI. Dentro de 4 semanas, a NFV dobrou em quantidade a 4 °C e por oito semanas a taxa de degradação foi > 1,3% NFV/mês para todas as variantes de tampão e pH. A vincristina total diminuiu em paralelo com a formação de NFV. A VSLI sem vincristina externa livre também acompanhou características de degradação química de vincristina conhecidas onde o medicamento se degradou mais rapidamente à temperatura ambiente, duplicando o percentual de NFV dentro de 2 semanas. Estas taxas de degradação são semelhantes ao 1,6% da NFV/mês observado para a estabilidade do kit Marqibo de 3 frascos a 4 °C, o que levou a exigir a administração de VSLI dentro de 24 horas de constituição, devido à degradação da vincristina para NFV.[00050] Stability results of removing free vincristine from the VSLI external buffer prepared from the 3-vial formulation are shown in Table 2. Removal of free vincristine did not appear to improve VSLI stability. Within 4 weeks, NFV doubled in quantity at 4°C and by eight weeks the degradation rate was >1.3% NFV/month for all buffer and pH variants. Total vincristine decreased in parallel with NFV formation. VSLI without free external vincristine also followed known chemical degradation characteristics of vincristine where the drug degraded more rapidly at room temperature, doubling the percentage of NFV within 2 weeks. These degradation rates are similar to the 1.6% NFV/month observed for the stability of the 3-vial Marqibo kit at 4°C, which led to requiring administration of VSLI within 24 hours of constitution due to degradation of vincristine for NFV.

[00051] Os resultados desses estudos de diálise confirmam que um fator de estabilidade da VSLI é a formação de N- desformilvincristina (NFV). A vida útil de VSLI seria determinada pela rapidez com que a NFV aumentaria para níveis fora do limite de especificação 3,0. A perda de vincristina total correlacionou-se com o crescimento observado de NFV. As impurezas totais não aumentaram de forma desproporcional ao crescimento de NFV, que está incluído na atribuição total de impurezas. Não foram observadas novas impurezas. Todas as variantes permaneceram dentro dos critérios de VSLI permitidos para pH, osmolalidade e tamanho de partícula e não foram observadas tendências em relação a especificações periféricas para esses critérios. Além disso, a substituição da sacarose como um agente isotônico para manitol, que está presente na formulação de 3 frascos, não teve efeito na taxa de degradação da vincristina.[00051] The results of these dialysis studies confirm that a factor in the stability of VSLI is the formation of N-desformylvincristine (NFV). The lifetime of VSLI would be determined by how quickly the NFV would increase to levels outside the 3.0 specification limit. The loss of total vincristine correlated with the observed growth of NFV. Total impurities did not increase disproportionately to the growth of NFV, which is included in the total impurity attribution. No new impurities were observed. All variants remained within the allowable VSLI criteria for pH, osmolality, and particle size and no trends toward outlying specifications for these criteria were observed. Furthermore, substitution of sucrose as an isotonic agent for mannitol, which is present in the 3-vial formulation, had no effect on the degradation rate of vincristine.

[00052] Adicionalmente, os resultados apresentados na Tabela 2 demonstraram que a remoção de vincristina livre por diálise usando tampões de pH 4 e pH 5 não alterou a integridade da membrana de lipossoma. Alterar a magnitude do gradiente ΔpH não causou vazamento de conteúdo de lipossomas (como poderia ser esperado se o gradiente de carregamento de pH tivesse sido comprometido). A vincristina livre permaneceu constantemente baixa em todas as variantes ao longo do tempo. TABELA 2. Estabilidade de VSLI pós-diálise de drogas livres externas Os resultados desses estudos de diálise demonstram que a degradação externa gratuita da vincristina não desempenha um papel importante na determinação da estabilidade observada da VSLI, embora provavelmente contribua de forma menor para a estabilidade geral da VSLI. Estes resultados mostram que a degradação da vincristina está ocorrendo dentro da constituição pós-lipossoma da VSLI preparada a partir do kit de 3 frascos. Mantendo um gradiente ΔpH entre o interior e o exterior do lipossoma ou removendo (ou minimizando) o ΔpH de VSLI não melhora a estabilidade da Vincristina dentro do lipossoma para a formulação de 3 frascos.[00052] Additionally, the results presented in Table 2 demonstrated that the removal of free vincristine by dialysis using pH 4 and pH 5 buffers did not alter the integrity of the liposome membrane. Changing the magnitude of the ΔpH gradient did not cause leakage of liposome contents (as might be expected if the pH loading gradient had been compromised). Free vincristine remained consistently low across all variants over time. TABLE 2. Post-dialysis VSLI stability of external free drugs The results of these dialysis studies demonstrate that free external degradation of vincristine does not play a major role in determining the observed stability of VSLI, although it likely makes a minor contribution to the overall stability of VSLI. These results show that vincristine degradation is occurring within the post-liposome constitution of VSLI prepared from the 3-vial kit. Maintaining a ΔpH gradient between the inside and outside of the liposome or removing (or minimizing) the ΔpH of VSLI does not improve the stability of Vincristine within the liposome for the 3-vial formulation.

Example 2: Ammonium sulfate VCR liposome variants.

[00053] O Marqibo é constituído pela incubação dos componentes do Kit Marqibo (VSI, SCLI e SPI) em uma farmácia. O sulfato de vincristina, uma base fraca, é carregado no lipossoma pela ação de um gradiente transmembranar criado pelo diferencial de pH da SCLI interno pH 4,0 e o tampão de SPI externo de lipossoma resultante pH 7,4. Durante o processo de carregamento, apenas a forma neutra de vincristina passa através da membrana do lipossoma e é presa no interior da SCLI como o citrato de sal. Este carregamento com tampão de citrato proporciona mais que 95% de carregamento de vincristina. No entanto, uma vez constituído, o citrato interno de vincristina é moderadamente instável, de modo que, dentro de 24 horas, o crescimento de NFV ocorre apesar do pH 4,0 do lipossoma, que deve manter a vincristina como espécie salina. A partir dos experimentos anteriores de diálise de drogas livres descritos acima, a degradação da vincristina parece estar ocorrendo dentro do lipossoma e não do ambiente externo de vincristina pH 7,4 ou vazamento de vincristina a partir do lipossoma. É concebível que a capacidade de tamponamento de citrato no lipossoma interior seja ineficiente e permita que os prótons e íons de soluto migrem através da membrana até uma medida que desestabilize o tampão interno do pH 4,0 do lipossoma. Para examinar esta possibilidade, o tampão de citrato de sódio do interior do lipossoma foi substituído por uma "bateria de carregamento" alternativa. Uma série de experiências foram realizadas onde o tampão interno de lipossoma foi solução de sulfato de amônio (AS). O pH do sulfato de amônio 250 mM é de cerca de 5,5: no entanto, dentro do lipossoma, o equilíbrio de dissociação entre amônia e sal de amônio permite que as moléculas de amônia neutras atravessem a membrana do lipossoma efetivamente diminuindo o pH interno como resultado dos íons de hidrogênio deixados para trás. O pH interno resultante é de cerca de 4. Este equilíbrio pode manter o sulfato de vincristina como a forma de sal melhor do que o equilíbrio citrato-cítrico de sódio dentro do ambiente de lipossomas de Marqibo. Nestas experiências, o pH externo variou de 5,5 a 8 mantendo um pH interno de cerca de 4,0 (como resultado do equilíbrio de amônia/amônio descrito acima). A variável ou a capacidade tampão variaram entre 250 e 350 mM AS, e os componentes isotônicos que contribuíram para a osmolalidade global foram variados usando polióis e sais iônicos. Em todos os experimentos, os lipossomas foram compostos de esfingomielina e colesterol essencialmente na mesma composição que SCLI. A única alteração foi a substituição do tampão de citrato por tampão de sulfato de amônio.[00053] Marqibo is constituted by incubating the components of the Marqibo Kit (VSI, SCLI and SPI) in a pharmacy. Vincristine sulfate, a weak base, is loaded into the liposome by the action of a transmembrane gradient created by the pH differential of the internal SCLI pH 4.0 and the resulting liposome external SPI buffer pH 7.4. During the loading process, only the neutral form of vincristine passes through the liposome membrane and is trapped inside the SCLI as salt citrate. This loading with citrate buffer provides greater than 95% loading of vincristine. However, once constituted, the internal vincristine citrate is moderately unstable, so that within 24 hours, NFV growth occurs despite the pH 4.0 of the liposome, which should maintain vincristine as a saline species. From the previous free drug dialysis experiments described above, vincristine degradation appears to be occurring within the liposome and not from the external vincristine pH 7.4 environment or leakage of vincristine from the liposome. It is conceivable that the citrate buffering capacity of the inner liposome is inefficient and allows protons and solute ions to migrate across the membrane to an extent that destabilizes the internal pH 4.0 buffer of the liposome. To examine this possibility, the sodium citrate buffer inside the liposome was replaced with an alternative "charging battery." A series of experiments were performed where the internal liposome buffer was ammonium sulfate (AS) solution. The pH of 250 mM ammonium sulfate is about 5.5: however, within the liposome, the dissociation balance between ammonia and ammonium salt allows neutral ammonia molecules to cross the liposome membrane effectively lowering the internal pH as a result of the hydrogen ions left behind. The resulting internal pH is about 4. This balance can maintain vincristine sulfate as the salt form better than the sodium citrate-citric balance within the liposome environment of Marqibo. In these experiments, the external pH varied from 5.5 to 8 while maintaining an internal pH of about 4.0 (as a result of the ammonia/ammonium balance described above). The variable or buffer capacity was varied between 250 and 350 mM AS, and the isotonic components that contributed to the overall osmolality were varied using polyols and ionic salts. In all experiments, liposomes were composed of sphingomyelin and cholesterol in essentially the same composition as SCLI. The only change was the replacement of the citrate buffer with ammonium sulfate buffer.

Liposome preparation unit processes.

[00054] Este exemplo descreve os métodos gerais utilizados para a produção de lipossomas de esfingomielina-colesterol.[00054] This example describes the general methods used for the production of sphingomyelin-cholesterol liposomes.

Ingredient preparation calculations for target liposome.

[00055] As membranas lipossômicas de Marqibo contêm esfingomielina (SM) e colesterol (CH) na relação de peso 2,5:1, onde o produto final VSLI contém 2,37 mg/mL de SM.[00055] Marqibo's liposomal membranes contain sphingomyelin (SM) and cholesterol (CH) in a 2.5:1 weight ratio, where the final VSLI product contains 2.37 mg/mL of SM.

[00056] Nestas experiências, foi escolhida uma concentração alvo para variantes de lipossomas não carregadas com droga a 43 mg/mL de SM para ser fácil de processar e ser suficientemente concentrada para a etapa de carregamento de droga.[00056] In these experiments, a target concentration for non-drug loaded liposome variants was chosen at 43 mg/mL of SM to be easy to process and to be sufficiently concentrated for the drug loading step.

[00057] Os processos da unidade de preparação de lipossomas são os seguintes: para um alvo de 70 mL de produto final:[00057] The processes of the liposome preparation unit are as follows: for a target of 70 mL of final product:

1. Hydration (Liposome Formation)

[00058] Dissolução lipídica. As matérias-primas lipídicas SM e CH são dissolvidas em etanol. O etanol suficiente é usado para dar uma concentração final na fase hidratada de 15,7% (v/v). No exemplo acima, 3 g de SM e 1,2 g de CH são pesadas e misturadas e dissolvidas em 13 mL de etanol à prova de 200. A dissolução é obtida através do aquecimento da mistura lipídica etanólica num recipiente vedado a 75°C até se obter uma solução etanólica límpida.[00058] Lipid dissolution. Lipid raw materials SM and CH are dissolved in ethanol. Sufficient ethanol is used to give a final concentration in the hydrated phase of 15.7% (v/v). In the example above, 3 g of SM and 1.2 g of CH are weighed and mixed and dissolved in 13 mL of 200 proof ethanol. Dissolution is achieved by heating the ethanolic lipid mixture in a sealed container at 75°C until a clear ethanolic solution is obtained.

[00059] Hidratação aquosa. A solução lipídica preparada acima é "hidratada", despejando rapidamente a solução lipídica etanólica em uma fase aquosa que foi previamente equilibrada a 65°C em um banho de água. Neste exemplo, utilizou-se 70 mL de fase aquosa contendo solutos de interesse que serão encapsulados pela formulação de lipossomas. Por exemplo, sulfato de amônio 350 mM ou sais relacionados. A mistura resultante é incubada durante 0,5-1 hora com agitação, para permitir que os lipídeos se hidratem completamente. Quando a solução etanólica de lipídeos é misturada com a fase aquosa, o solvente de etanol é rapidamente diluído, expondo os lipídeos à água, resultando em lipídeos formando espontaneamente vesículas de lipossomas com uma distribuição de tamanho heterogênea. A hidratação garante que as moléculas de água se associem completamente às porções hidrofílicas das moléculas.[00059] Aqueous hydration. The lipid solution prepared above is "hydrated" by quickly pouring the ethanolic lipid solution into an aqueous phase that has been previously equilibrated at 65°C in a water bath. In this example, 70 mL of aqueous phase was used containing solutes of interest that will be encapsulated by the liposome formulation. For example, 350 mM ammonium sulfate or related salts. The resulting mixture is incubated for 0.5-1 hour with shaking to allow the lipids to fully hydrate. When the ethanolic lipid solution is mixed with the aqueous phase, the ethanol solvent is rapidly diluted, exposing the lipids to water, resulting in lipids spontaneously forming liposome vesicles with a heterogeneous size distribution. Hydration ensures that water molecules completely associate with the hydrophilic portions of the molecules.

2. Size reduction.

[00060] Após a formação de lipossomas, as vesículas são dimensionadas de modo a criar uma população de lipossomas com um diâmetro de partícula uniforme e preferido (neste caso cerca de 100 nm). Isto é obtido por extrusão da suspensão de lipossoma, criada na etapa 1 acima, através de membranas de tamanho de poro definido sob pressão. A extrusão é realizada a 65°C e a passagem dos lipossomas através dos poros da membrana é facilitada pelo etanol que permanece da hidratação. Como resultado deste tratamento, os lipossomas são conformes aproximadamente ao diâmetro dos poros da membrana utilizados. Nestes estudos, utilizou-se um extrusor Lipex (Northern Lipids) capaz de manter o volume total de 100 mL e a suspensão de lipossoma foi passada através de membranas de policarbonato de 25 mm de diâmetro de 0,2 μm (três passagens) e 0,08 μm (cinco passagens) usando nitrogênio gasoso a pressões de 100-400 psi. (Whatman Nucleopore Track- Etched Membranes). O tamanho de partícula de lipossoma é medido por um dimensionador de partículas ZetaPALS utilizando a dispersão de luz dinâmica (Brookhaven Instruments Corporation).[00060] After liposome formation, the vesicles are sized to create a population of liposomes with a uniform and preferred particle diameter (in this case about 100 nm). This is achieved by extrusion of the liposome suspension, created in step 1 above, through membranes of defined pore size under pressure. Extrusion is carried out at 65°C and the passage of liposomes through the membrane pores is facilitated by the ethanol remaining from hydration. As a result of this treatment, the liposomes conform approximately to the diameter of the membrane pores used. In these studies, a Lipex extruder (Northern Lipids) capable of maintaining a total volume of 100 mL was used and the liposome suspension was passed through 25 mm polycarbonate membranes of 0.2 μm diameter (three passes) and 0 .08 μm (five passes) using nitrogen gas at pressures of 100-400 psi. (Whatman Nucleopore Track - Etched Membranes). Liposome particle size is measured by a ZetaPALS particle sizer using dynamic light scattering (Brookhaven Instruments Corporation).

3. Changing the external buffer.

[00061] Nesta fase, a fase aquosa externa (por exemplo, solução de sulfato de amônio 350 mM) é trocada por 10% de solução de sacarose ou outro tampão desejado, tal como SPI por diálise ou diafiltração; simultaneamente eliminando etanol. Este processo estabelece um gradiente de lipossoma (isto é, tampão de sulfato de amônio dentro do lipossoma e 10% de tampão de sacarose no lado de fora dos lipossomas). O sulfato de amônio é altamente desassociado em íons de amônio e sulfato no meio aquoso. Como íons carregados, eles não podem atravessar a membrana lipossômica, no entanto, os íons de amônio também estão em equilíbrio com água e amônia, que como um gás neutro pode atravessar a membrana do lipossoma. Quando uma molécula de amônia sai do interior do lipossoma, um próton é deixado para trás; reduzindo o pH dentro da membrana lipossômica para cerca de 4. Isto estabelece um gradiente ΔpH em que o interior do lipossoma é de cerca de pH 4,0 e o exterior é o pH do tampão de troca (por exemplo, 7,4). Este gradiente é usado para carregar vincristina nos lipossomas. O protocolo de diafiltração (para volumes de produto > 50mL) é de 15 volumes de troca de tampão usando um cartucho MidGee (modelo UFP-300-E-3MA, 300.000 MWCO) anexado a um sistema de diafiltração QuixStand (GE Healthcare Life Sciences). A diálise (para volumes de produto <50 ml) consiste em colocar a suspensão de lipossomas em uma membrana porosa molecular Spectrum Spectrapore com MWCO 6-8000 e suspendê-la em 20 volumes de excesso de tampão à temperatura ambiente, o tampão externo é trocado quatro vezes ao longo de um dia, incluindo uma troca de duração durante a noite. Após a troca de tampão externa, o conteúdo de SM de cada preparação de pós-diafiltração foi medido usando o ensaio de colina de fosfolipídeo de Stewart.[00061] At this stage, the external aqueous phase (e.g., 350 mM ammonium sulfate solution) is exchanged for 10% sucrose solution or other desired buffer, such as SPI by dialysis or diafiltration; simultaneously eliminating ethanol. This process establishes a liposome gradient (i.e., ammonium sulfate buffer inside the liposome and 10% sucrose buffer on the outside of the liposomes). Ammonium sulfate is highly dissociated into ammonium and sulfate ions in the aqueous medium. As charged ions, they cannot cross the liposomal membrane, however, ammonium ions are also in equilibrium with water and ammonia, which as a neutral gas can cross the liposome membrane. When an ammonia molecule leaves the liposome, a proton is left behind; reducing the pH within the liposomal membrane to about 4. This establishes a ΔpH gradient in which the inside of the liposome is about pH 4.0 and the outside is the pH of the exchange buffer (e.g., 7.4). This gradient is used to load vincristine into liposomes. The diafiltration protocol (for product volumes > 50mL) is 15 buffer exchange volumes using a MidGee cartridge (model UFP-300-E-3MA, 300,000 MWCO) attached to a QuixStand diafiltration system (GE Healthcare Life Sciences) . Dialysis (for product volumes <50 ml) consists of placing the liposome suspension on a Spectrum Spectrapore molecular porous membrane with MWCO 6-8000 and suspending it in 20 volumes of excess buffer at room temperature, the outer buffer is exchanged four times throughout a day, including a change in duration during the night. After external buffer exchange, the SM content of each postdiafiltration preparation was measured using the Stewart phospholipid choline assay.

4. Drug loading.

[00062] O carregamento de droga é realizado usando a razão de droga/lipídeo prescritas por VSLI para atingir o volume total desejado. A mistura de carregamento de VSLI é direcionada para 0,16 mg/mL de vincristina, 2,37 mg/mL de SM (como preparação de lipossomas) e ajustada para o volume total desejado com o tampão de lipossoma externo a ser utilizado para a variante experimental desejada. O carregamento é realizado misturando o tampão externo, a droga e as soluções de lipossomas (pré-equilibradas à temperatura ambiente) e incubando a mistura por 10 minutos a 65°C em banho-maria com mistura suave. A mistura é então removida do banho de água para resfriar até a temperatura ambiente e armazenada a 2-8°C.[00062] Drug loading is performed using the drug/lipid ratio prescribed by VSLI to achieve the desired total volume. The VSLI loading mixture is directed to 0.16 mg/mL vincristine, 2.37 mg/mL SM (as liposome preparation) and adjusted to the desired total volume with the external liposome buffer to be used for the desired experimental variant. Loading is accomplished by mixing the external buffer, drug, and liposome solutions (pre-equilibrated at room temperature) and incubating the mixture for 10 minutes at 65°C in a water bath with gentle mixing. The mixture is then removed from the water bath to cool to room temperature and stored at 2-8°C.

5. Sterile filtration and vial filling

[00063] A suspensão de lipossomas em massa carregada por droga pode ser esterilizada por técnicas convencionais de esterilização lipossômica, tais como filtração em frascos adequados para armazenamento. A técnica asséptica/estéril é utilizada por completo e as operações realizadas em um gabinete de segurança biológica Nunair Classe II, tipo A/B3. O produto a granel à temperatura ambiente é filtrado através de um diâmetro estéril de 25 mm, filtros de seringa de 0,2 μm® de tamanho de poro Acrodisc, membrana Supor® (Pall Corp.) usando uma seringa esterilizada de 10 mL com encaixe Luer. A massa é filtrada em quantidades de 10 mL em recipientes de recepção estéreis[00063] The drug-loaded bulk liposome suspension can be sterilized by conventional liposomal sterilization techniques, such as filtration into vials suitable for storage. Aseptic/sterile technique is fully utilized and operations performed in a Nunair Class II, type A/B3 biological safety cabinet. Room temperature bulk product is filtered through sterile 25 mm diameter, 0.2 μm® pore size Acrodisc syringe filters, Supor® membrane (Pall Corp.) using a sterile 10 mL syringe with fitting Luer. The mass is filtered in quantities of 10 mL into sterile receiving containers

[00064] As preparações de variantes de lipossomas foram preparadas atrapando várias molaridades de AS como o tampão de lipossoma interno. Os lipossomas foram preparados utilizando os processos descritos acima. Os lipossomas foram preparados com esfingomielina (SM) e colesterol (CH) pesados, em duplicado, para um volume final de hidratação de 70 mL a 43 mg/mL de SM e uma razão de peso SM/CH 2,5:1. As misturas de lipídeos foram dissolvidas em 9,5 mL de etanol a 75°C e hidratadas por vazamento da solução de lipídeo etanólico em 70 mL de solução pré-aquecida de 65°C de AS e mistura durante trinta minutos produzindo uma concentração final de etanol de 12% v/v. Os lipossomas assim formados foram dimensionados por extrusão sequencial em um extrusor de Lipex (Lipídeos do Norte) através de membranas de policarbonato de tamanho de poro μde 0,2 m (três passagens) e 0,08 μm (cinco passagens). Após a extrusão, cada preparação foi diafiltrada em solução de sacarose a 10% (removendo simultaneamente qualquer etanol) usando 15 trocas de volume em um cartucho MidGee (modelo UFP-300-E-3MA, 300,000 MWCO) e suporte QuixStand (GE Healthcare Life Sciences). O conteúdo de SM de cada preparação de pós-diafiltração foi medido usando o ensaio de colina de fosfolipídeo de Stewart.[00064] Liposome variant preparations were prepared by trapping various molarities of AS as the internal liposome buffer. Liposomes were prepared using the procedures described above. Liposomes were prepared with sphingomyelin (SM) and cholesterol (CH) weighed, in duplicate, to a final hydration volume of 70 mL at 43 mg/mL SM and a SM/CH weight ratio of 2.5:1. The lipid mixtures were dissolved in 9.5 mL of 75°C ethanol and hydrated by pouring the ethanolic lipid solution into 70 mL of preheated 65°C AS solution and mixing for thirty minutes yielding a final concentration of 12% v/v ethanol. The liposomes thus formed were sized by sequential extrusion in a Lipex extruder (Northern Lipids) through polycarbonate membranes of pore size 0.2 m (three passes) and 0.08 μm (five passes). After extrusion, each preparation was diafiltered into 10% sucrose solution (simultaneously removing any ethanol) using 15 volume changes on a MidGee cartridge (model UFP-300-E-3MA, 300,000 MWCO) and QuixStand holder (GE Healthcare Life Sciences). The SM content of each post-diafiltration preparation was measured using the Stewart phospholipid choline assay.

[00065] Os carregamentos de droga de ensaio em pequena escala utilizando os lipossomas preparados acima foram realizados usando tampão SPI ajustado a pH 5,5, 6,5 ou 7,5 ou sacarose tamponada com fosfato a pH 5,5, 6,5 ou 7,5. As variantes que carregaram menos de 5% de vincristina livre foram selecionadas para aumentar a escala, que foram tampão SPI a pH 6,5, 7,5 e sacarose tamponada com fosfato a pH 6,5. Os carregamentos de escala maior foram realizados para cada variante de AS e tampão seguindo o procedimento de constituição descrito anteriormente. As misturas de lipossomas encapsuladas em droga resultantes foram filtradas por esterilidade e monitorizadas quanto à estabilidade a 0, 2, 4, 8, 12 semanas a 2-8°C e 2, 4 semanas à temperatura ambiente.[00065] Small-scale test drug loadings using the liposomes prepared above were performed using SPI buffer adjusted to pH 5.5, 6.5 or 7.5 or phosphate buffered sucrose at pH 5.5, 6.5 or 7.5. Variants that carried less than 5% free vincristine were selected for upscaling, which were SPI buffer at pH 6.5, 7.5 and phosphate buffered sucrose at pH 6.5. Larger scale loadings were performed for each AS variant and buffer following the constitution procedure described previously. The resulting drug-encapsulated liposome mixtures were sterile filtered and monitored for stability at 0, 2, 4, 8, 12 weeks at 2-8°C and 2, 4 weeks at room temperature.

[00066] As experiências exploratórias de sulfato de amônio em pequena escala descritas na seção experimental acima examinaram a eficiência de encapsulamento de variantes de AS. Esses resultados sugerem que um tampão interno de sulfato de amônio, que leva a um pH interno do lipossoma de aproximadamente 4,0 sob condições de equilíbrio, é capaz de carregar a vincristina melhor quando o pH do tampão externo era de 6,5 ou superior e sem usar um poliol. Todas as variantes que utilizam um tampão externo de pH 5,5 carregaram menos de 90%; aparentemente fornecendo um gradiente de Δ pH transmembrana insuficiente. As variantes do tampão de PBS carregaram pelo menos 95 por cento da droga, enquanto as variantes que utilizavam sacarose apresentavam resultados mistos; mostrando uma gama mais ampla de encapsulamento de 89-95%. As variantes de capacidade de tampão de 250 mM e 350 mM mostraram tendências de encapsulamento semelhantes com variações de pH e poliol. Todas as variantes que apresentaram carga >95% foram ampliadas e avaliadas quanto à estabilidade.[00066] The small-scale ammonium sulfate exploratory experiments described in the experimental section above examined the encapsulation efficiency of AS variants. These results suggest that an internal ammonium sulfate buffer, which leads to an internal liposome pH of approximately 4.0 under equilibrium conditions, is able to load vincristine better when the pH of the external buffer was 6.5 or higher. and without using a polyol. All variants using an external pH 5.5 buffer loaded less than 90%; apparently providing an insufficient transmembrane ΔpH gradient. The PBS buffer variants carried at least 95 percent of the drug, while the variants using sucrose showed mixed results; showing a wider range of encapsulation of 89-95%. The 250 mM and 350 mM buffer capacity variants showed similar encapsulation trends with pH and polyol variations. All variants that showed loading >95% were scaled up and evaluated for stability.

[00067] Os resultados de estabilidade de 24 semanas dos lipossomas de sulfato de amônio aumentados estão resumidos na Tabela 3. Todas as variantes mantiveram o tamanho de partícula VSLI desejado e os critérios de osmolalidade. O pH e a percentagem de vincristina livre também permaneceram consistentes durante o período de monitoramento da estabilidade. O tampão de sulfato de amônio não alterou as características de permeabilidade do lipossoma de colesterol esfingomielínico. A estabilidade melhorada na formulação de 3 frascos de Marqibo foi observada com formulações de sulfato de amônio 250 mM e 350 mM com tampão PBS externo pH 7,5. Para estas variantes foram observadas taxas de degradação de 0,2 por cento de NFV por mês à temperatura refrigerada. Esta taxa poderia projetar a vida útil da formulação em cerca de um ano. Além disso, as impurezas totais apenas aumentaram proporcionalmente com qualquer aumento de % de NFV. O total de impurezas totais manteve níveis bem abaixo dos critérios de VSLI de menos de 6%.[00067] The 24-week stability results of the augmented ammonium sulfate liposomes are summarized in Table 3. All variants maintained the desired VSLI particle size and osmolality criteria. The pH and percentage of free vincristine also remained consistent during the stability monitoring period. Ammonium sulfate buffer did not alter the permeability characteristics of the sphingomyelin cholesterol liposome. Improved stability in the Marqibo 3-vial formulation was observed with 250 mM and 350 mM ammonium sulfate formulations with external PBS buffer pH 7.5. For these variants, degradation rates of 0.2 percent of NFV per month at refrigerated temperatures were observed. This rate could project the shelf life of the formulation to be about one year. Furthermore, total impurities only increased proportionally with any increase in NFV%. Total impurities maintained levels well below the VSLI criteria of less than 6%.

[00068] Os lipossomas de sulfato de amônio com um tampão externo de pH 6,5 ou em que o tampão continha um agente isotônico de poliol, por exemplo, sacarose, resultaram em taxas de estabilidade inferiores em comparação com as variantes de pH 7,5. As taxas de degradação para estas variantes variaram de 1,5-1,8 por cento de NFV/mês à temperatura refrigerada (Tabela 3); taxas similares ao componente de VSI da formulação atual do kit baseado em citrato de 3 frascos (Tabela 2). Ambas as variantes de 250 mM e 350 mM mostraram as mesmas tendências com pH e alterações do agente osmótico. Além disso, em todos os casos em que a estabilidade foi monitorada à temperatura ambiente, a degradação rápida da vincristina foi observada. Somente amostras refrigeradas forneceram características de estabilidade adequadas com as formulações de sulfato de amônio.[00068] Ammonium sulfate liposomes with an external buffer of pH 6.5 or where the buffer contained a polyol isotonic agent, e.g., sucrose, resulted in lower stability rates compared to pH 7 variants. 5. Degradation rates for these variants ranged from 1.5-1.8 percent NFV/month at refrigerated temperature (Table 3); similar rates to the VSI component of the current formulation of the 3-vial citrate-based kit (Table 2). Both the 250 mM and 350 mM variants showed the same trends with pH and osmotic agent changes. Furthermore, in all cases where stability was monitored at room temperature, rapid degradation of vincristine was observed. Only refrigerated samples provided adequate stability characteristics with the ammonium sulfate formulations.

[00069] As formulações SPI de pH 7,4 de lipossomas de sulfato de amônio 250 mM e 350 mM exibem requisitos de vida útil preliminar adequados para uma formulação comercial pronta para uso e foram selecionadas para avaliação posterior. Tabela 3. Resumo da estabilidade da variante da formulação de lipossoma de sulfato de amônio a 4°C SPI = tampão de injeção de fosfato de sódio (componente do kit Marqibo). Sacarose PB = 10% de sacarose em tampão fosfato (sem NaCl) AS = Sulfato de amônio[00069] The pH 7.4 SPI formulations of 250 mM and 350 mM ammonium sulfate liposomes exhibit preliminary shelf life requirements suitable for a ready-to-use commercial formulation and were selected for further evaluation. Table 3. Summary of Ammonium Sulfate Liposome Formulation Variant Stability at 4°C SPI = sodium phosphate injection buffer (component of the Marqibo kit). Sucrose PB = 10% sucrose in phosphate buffer (without NaCl) AS = Ammonium sulfate

Example 3: Ammonium Sulfate VCR Liposome Encapsulation and Stability with Ions and Divalent Polyols

[00070] Uma série de experimentos foram conduzidos para examinar se VSLI contendo íons divalentes ou polióis melhorou a vincristina encapsulada.[00070] A series of experiments were conducted to examine whether VSLI containing divalent ions or polyols improved encapsulated vincristine.

[00071] Foram feitas preparações de variantes de lipossomas tendo a mesma composição lipídica que o produto de Marqibo, encapsulando sulfato de amônio 200 mM com sulfato de magnésio 200 mM ou sulfato de manganês 200 mM; 200 mM de citrato de sódio e 200 mM de sulfato de magnésio ou 200 mM de sulfato de manganês. Cada uma destas preparações foi diafiltrada em 10% de sacarose e a concentração de lipídeos ensaiada como descrito anteriormente. Adicionalmente, prepararam-se lipossomas prendendo 250 mM de sulfato de amônio com 5% de manitol-20 mM PB pH 7,4, SPI pH 7,4 e SPI pH 7,0 no lipossoma. Tentou-se o carregamento de drogas para cada variante incubando em 10 minutos (condição padrão) ou 30 minutos 65°C durante 10 minutos.[00071] Preparations of liposome variants having the same lipid composition as the Marqibo product were made, encapsulating 200 mM ammonium sulfate with 200 mM magnesium sulfate or 200 mM manganese sulfate; 200 mM sodium citrate and 200 mM magnesium sulfate or 200 mM manganese sulfate. Each of these preparations was diafiltered in 10% sucrose and the lipid concentration assayed as previously described. Additionally, liposomes were prepared by trapping 250 mM ammonium sulfate with 5% mannitol-20 mM PB pH 7.4, SPI pH 7.4, and SPI pH 7.0 into the liposome. Drug loading for each variant was attempted by incubating for 10 minutes (standard condition) or 30 minutes at 65°C for 10 minutes.

[00072] Os resultados das experiências exploratórias em pequena escala são mostrados na Tabela 6. Resultados de carregamento de droga quando Mg2+ ou Mn2+ foram incluídos no tampão interno do lipossoma e incubados para 10 (condição padrão) ou 30 min a 65°C apresentaram carga menos eficiente em comparação com a constituição padrão do kit de 3 frascos. As melhores taxas de carregamento de 6-8% de droga livre foram observadas com incubações por dez minutos, com exceção da variante citrato-Mg, que mostrou 21% de droga livre. A presença dos íons metálicos divalentes parece resultar em interrupção do equilíbrio do gradiente de pH ou colapso da permeabilidade da membrana. Tabela 6. Carregamento de drogas para amostras contendo íons metálicos. [00072] The results of the small-scale exploratory experiments are shown in Table 6. Drug loading results when Mg2+ or Mn2+ were included in the internal buffer of the liposome and incubated for 10 (standard condition) or 30 min at 65°C showed loading less efficient compared to the standard 3-bottle kit constitution. The best loading rates of 6-8% free drug were observed with ten minute incubations, with the exception of the citrate-Mg variant, which showed 21% free drug. The presence of divalent metal ions appears to result in disruption of the pH gradient balance or collapse of membrane permeability. Table 6. Drug loading for samples containing metal ions.

[00073] O sulfato de amônio com variante de MgSO4 , que mostrou 6% de medicamento livre após o carregamento, foi ampliada e monitorada quanto à estabilidade. Na ampliação, esta variante de formulação reafirmou a eficiência de carga de lipossomas deficientemente observada na presença de um íon divalente; 38% de droga livre foi observado após a constituição (Tabela 7). Esta variante de gradiente misturado foi processada adicionalmente por re-dialisação para remover a vincristina externa livre. A variável pós-dialisada foi então monitorada quanto à estabilidade. Durante 5 semanas de monitoração, os níveis livres de droga permaneceram constantes, mostrando que nenhum vazamento adicional do medicamento estava ocorrendo a partir do lipossoma. No entanto, uma rápida degradação para NFV e perda de VCR foi observada; resultando em 12,2% de NFV às 5 semanas. Esta foi 62 vezes mais rápida do que a formulação de lipossomas AS SPI pH 7.4 de 250 mM (Figura 7). Estes resultados demonstraram que o VSLI contendo sulfato divalente não proporciona estabilidade melhorada da vincristina encapsulada.[00073] The ammonium sulfate with MgSO4 variant, which showed 6% free drug after loading, was scaled up and monitored for stability. On scale-up, this formulation variant reaffirmed the poorly observed liposome loading efficiency in the presence of a divalent ion; 38% free drug was observed after constitution (Table 7). This mixed gradient variant was further processed by re-dialysis to remove free external vincristine. The post-dialysis variable was then monitored for stability. During 5 weeks of monitoring, free drug levels remained constant, showing that no additional drug leakage was occurring from the liposome. However, rapid degradation to NFV and loss of VCR was observed; resulting in 12.2% NFV at 5 weeks. This was 62 times faster than the 250 mM AS SPI pH 7.4 liposome formulation (Figure 7). These results demonstrated that VSLI containing divalent sulfate did not provide improved stability of encapsulated vincristine.

[00074] A formulação de AS com manitol mostrou uma taxa de degradação de 0,17% de NFV/Mês em comparação com uma formulação não contendo poliol a 0,14% de NFV/Mês (Tabela 7). Contudo, o encapsulamento de apenas 93,4% de vincristina foi menos eficiente que as formulações sem poliol. Tabela 7. Estabilidade do VSLI para as variantes de AS adicionais às 20 semanas. *Após o carregamento inicial baixo, a variante foi dialisada para remover VSI livre, então T = 0 tinha 2,81% de NF Modalidades Modalidade 1. Uma composição compreendendo: uma fase aquosa contínua compreendendo um primeiro tampão aquoso, uma fase de lipossoma dispersa no primeiro tampão aquoso e uma solução aquosa estabilizante encapsulada como carga dentro da fase de lipossoma; em que a solução aquosa estabilizante compreende um segundo tampão aquoso e uma vincristina estabilizada dissolvida no mesmo; em que o segundo tampão aquoso compreende um sal com pelo menos um soluto que pode transportar para fora da fase de lipossoma e deixar um íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente na solução aquosa estabilizante, em que o íon de soluto ou de hidrônio carregado positivamente estabiliza a vincristina; e em que a fase aquosa contínua e a solução aquosa estabilizante têm uma diferença de pH de pelo menos 2 unidades de pH. Modalidade 2. Um método de estabilização de vincristina num lipossoma compreendendo: dispersar uma fase de lipossoma dentro de uma fase aquosa contínua compreendendo um primeiro tampão aquoso; em que a fase de lipossoma contém uma solução aquosa estabilizante encapsulada dentro da fase de lipossoma; em que a solução aquosa estabilizante compreende um segundo tampão aquoso e uma vincristina estabilizada dissolvida no mesmo; em que o segundo tampão aquoso compreende um sal com pelo menos um soluto que pode transportar para fora da fase de lipossoma e deixar um íon de soluto carregado positivamente ou de hidrônio na solução aquosa estabilizante, em que o íon de soluto carregado positivamente ou de hidrônio estabiliza a vincristina; e em que a fase aquosa contínua e a solução aquosa estabilizante têm uma diferença de pH de pelo menos 2 unidades de pH. Modalidade 3. A composição ou o método da modalidade 1 ou 2, em que o segundo tampão aquoso compreende um sal de amônio. Modalidade 4. A composição ou o método da modalidade 1, 2 ou 3, em que o primeiro tampão aquoso compreende uma solução de tampão fosfato. Modalidade 5. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3 ou 4, em que a fase de lipossoma compreende um lipossoma de esfingomielina-colesterol. Modalidade 6. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4 ou 5, em que o segundo tampão aquoso compreende sulfato de amônio. Modalidade 7. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a vincristina compreende sulfato de vincristina. Modalidade 8. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que o pH da solução aquosa estabilizante é de cerca de 3 a cerca de 5. Modalidade 9. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o pH da fase aquosa contínua é de cerca de 5 a cerca de 8. Modalidade 10. A composição da modalidade 9, em que o pH da fase aquosa contínua é de cerca de 7 a cerca de 8,8. Modalidade 11. A composição da modalidade 10, em que o pH da fase aquosa contínua é de cerca de 7,5 a cerca de 8,8. Modalidade 12. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, em que o lipossoma é resistente à hidrólise. Modalidade 13. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, em que a vincristina é mais estável na solução aquosa estabilizante do que na fase aquosa contínua. Modalidade 14. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, em que a razão da fase aquosa contínua e da solução aquosa estabilizante é tal que a mistura das duas fases resultaria em uma fase aquosa combinada com um pH de cerca de 6 a cerca de 8,8. Modalidade 15. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em que o sal de amônio está presente no segundo tampão aquoso a uma concentração de cerca de 150 mM a cerca de 350 mM. Modalidade 16. A composição ou o método da modalidade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, em que o sal de amônio é sulfato de amônio. Modalidade 17. Um método para tratar o câncer num mamífero compreendendo administrar uma quantidade terapêutica da composição da modalidade 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, para o mamífero em necessidade. Modalidade 18. O método da modalidade 17, em que o câncer é linfoma, leucemia ou mieloma. Modalidade 19. Um método para tratar uma recidiva de câncer num mamífero compreendendo administrar ao referido mamífero a composição da modalidade 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Modalidade 20. O método da modalidade 19, em que a recidiva do câncer é um linfoma, leucemia ou mieloma. Modalidade 21. O método da modalidade 17, 18, 19 ou 20, em que o mamífero já sofreu pelo menos um regime de combinação de múltiplos agentes. Modalidade 22. O método da modalidade 17, 18, 19, 20 ou 21, compreendendo ainda coadministrar pelo menos um outro agente quimioterapêutico Modalidade 23. O método da modalidade 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, em que o mamífero é um humano. Modalidade 24. Um método para proteger a vincristina contra a deformilação compreendendo misturar vincristina com um tampão de sal de amônio. Modalidade 25. O método da modalidade 23, em que a vincristina é administrada numa dose de cerca de 1,5 mg/m2 a cerca de 2,5 mg/m2[00074] The AS formulation with mannitol showed a degradation rate of 0.17% NFV/Month compared to a non-polyol-containing formulation at 0.14% NFV/Month (Table 7). However, the encapsulation of only 93.4% of vincristine was less efficient than formulations without polyol. Table 7. VSLI stability for additional AS variants at 20 weeks. *After initial low loading, the variant was dialyzed to remove free VSI, so T=0 had 2.81% NF Embodiments Embodiment 1. A composition comprising: a continuous aqueous phase comprising a first aqueous buffer, a dispersed liposome phase in the first aqueous buffer and a stabilizing aqueous solution encapsulated as cargo within the liposome phase; wherein the stabilizing aqueous solution comprises a second aqueous buffer and a stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises a salt with at least one solute that can transport out of the liposome phase and leave a positively charged solute or hydronium ion in the stabilizing aqueous solution, wherein the positively charged solute or hydronium ion stabilizes vincristine; and wherein the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution have a pH difference of at least 2 pH units. Embodiment 2. A method of stabilizing vincristine in a liposome comprising: dispersing a liposome phase within a continuous aqueous phase comprising a first aqueous buffer; wherein the liposome phase contains a stabilizing aqueous solution encapsulated within the liposome phase; wherein the stabilizing aqueous solution comprises a second aqueous buffer and a stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises a salt with at least one solute that can transport out of the liposome phase and leave a positively charged solute or hydronium ion in the stabilizing aqueous solution, wherein the positively charged solute or hydronium ion stabilizes vincristine; and wherein the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution have a pH difference of at least 2 pH units. Embodiment 3. The composition or method of embodiment 1 or 2, wherein the second aqueous buffer comprises an ammonium salt. Embodiment 4. The composition or method of embodiment 1, 2 or 3, wherein the first aqueous buffer comprises a phosphate buffer solution. Embodiment 5. The composition or method of embodiment 1, 2, 3 or 4, wherein the liposome phase comprises a sphingomyelin-cholesterol liposome. Embodiment 6. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4 or 5, wherein the second aqueous buffer comprises ammonium sulfate. Embodiment 7. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5 or 6, wherein the vincristine comprises vincristine sulfate. Embodiment 8. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, wherein the pH of the stabilizing aqueous solution is about 3 to about 5. Embodiment 9. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8, wherein the pH of the continuous aqueous phase is from about 5 to about 8. Embodiment 10. The composition of embodiment 9, wherein the pH of the continuous aqueous phase is about 7 to about 8.8. Embodiment 11. The composition of embodiment 10, wherein the pH of the continuous aqueous phase is about 7.5 to about 8.8. Embodiment 12. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11, wherein the liposome is resistant to hydrolysis. Embodiment 13. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12, wherein vincristine is more stable in the stabilizing aqueous solution than in the aqueous phase to be continued. Embodiment 14. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13, wherein the ratio of the continuous aqueous phase and the stabilizing aqueous solution is such that mixing the two phases would result in a combined aqueous phase with a pH of about 6 to about 8.8. Embodiment 15. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14, wherein the ammonium salt is present in the second aqueous buffer at a concentration of about 150 mM to about 350 mM. Embodiment 16. The composition or method of embodiment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15, wherein the ammonium salt is ammonium sulfate . Embodiment 17. A method of treating cancer in a mammal comprising administering a therapeutic amount of the composition of embodiment 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16, for the mammal in need. Modality 18. The method of modality 17, where the cancer is lymphoma, leukemia, or myeloma. Embodiment 19. A method for treating a recurrence of cancer in a mammal comprising administering to said mammal the composition of modality 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16. Modality 20. The method of modality 19, in which the cancer recurrence is lymphoma, leukemia or myeloma. Modality 21. The method of modality 17, 18, 19 or 20, wherein the mammal has already undergone at least one multi-agent combination regimen. Modality 22. The method of modality 17, 18, 19, 20 or 21, further comprising co-administering at least one other chemotherapeutic agent Modality 23. The method of modality 17, 18, 19, 20, 21 or 22, wherein the mammal is a human. Embodiment 24. A method for protecting vincristine against deformylation comprising mixing vincristine with an ammonium salt buffer. Embodiment 25. The method of embodiment 23, wherein vincristine is administered at a dose of about 1.5 mg/m2 to about 2.5 mg/m2

[00075] Salvo indicação de outra forma, todos os números expressando quantidades de ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condições de reação e assim por diante usados no relatório descritivo e nas reivindicações serão entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos estabelecidos do relatório descritivo e das reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas sendo obtidas pelas modalidades da presente divulgação. Ao final, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser pelo menos interpretado à luz do número de dígitos significativos relatados e pela aplicação de técnicas de arredondamento ordinárias. Apesar de as faixas numéricas e os parâmetros que definem o amplo escopo da presente divulgação serem aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados com a maior precisão possível. Qualquer valor numérico, no entanto, contém inerentemente certos erros que resultam necessariamente do desvio padrão encontrado em suas respectivas medidas de teste. Em uma modalidade, os termos "cerca de" e "aproximadamente" referem-se a parâmetros numéricos dentro de 10% da faixa indicada.[00075] Unless otherwise indicated, all numbers expressing quantities of ingredients, properties such as molecular weight, reaction conditions and so on used in the specification and claims will be understood to be modified in all cases by the term "about in". Therefore, unless otherwise indicated, the numerical parameters set forth in the specification and the appended claims are approximations that may vary depending on the desired desired properties being obtained by the embodiments of the present disclosure. Ultimately, and not as an attempt to limit the application of the doctrine of equivalents to the scope of the claims, each numerical parameter must at least be interpreted in light of the number of significant digits reported and by the application of ordinary rounding techniques. Although the numerical ranges and parameters defining the broad scope of the present disclosure are approximations, the numerical values set forth in the specific examples are reported as accurately as possible. Any numerical value, however, inherently contains certain errors that necessarily result from the standard deviation found in their respective test measurements. In one embodiment, the terms "about" and "approximately" refer to numerical parameters within 10% of the indicated range.

[00076] Os termos "um", "uma", "o/a", e referentes semelhantes utilizados no contexto da descrição das modalidades da presente divulgação (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) será entendido como cobrindo tanto o singular quanto o plural, a menos que de outro modo indicado neste documento ou claramente contradito pelo contexto. A recitação das faixas de valores aqui contidas é destinada apenas a servir de método abreviado para se referir individualmente a cada valor separado que se encaixe dentro da faixa. Salvo indicação em contrário aqui, cada valor individual é incorporado na especificação como se fosse individualmente indicado aqui. Todos os métodos descritos neste documento podem ser executados em qualquer ordem apropriada a menos que indicado o contrário neste documento ou caso contrário claramente contrariado pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") aqui proporcionada destina-se apenas a iluminar melhor as modalidades da presente divulgação e não representa uma limitação no âmbito da presente divulgação. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática das modalidades da presente divulgação.[00076] The terms "a", "an", "the", and similar referents used in the context of describing the embodiments of the present disclosure (especially in the context of the following claims) will be understood to cover both the singular and the plural , unless otherwise noted herein or clearly contradicted by the context. The recitation of the ranges of values contained herein is intended only to serve as a shorthand method for individually referring to each separate value that falls within the range. Unless otherwise indicated here, each individual value is incorporated into the specification as if it were individually indicated here. All methods described in this document may be performed in any appropriate order unless otherwise indicated in this document or otherwise clearly contradicted by the context. The use of any and all examples, or exemplary language (e.g., "such as") provided herein is intended only to further illuminate the embodiments of the present disclosure and is not a limitation on the scope of the present disclosure. No language in the specification should be construed as indicating any unclaimed element essential to the practice of the embodiments of the present disclosure.

[00077] Os agrupamentos de elementos ou modalidades alternativos aqui descritos não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Prevê-se que um ou mais membros de um grupo possam ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre tal inclusão ou exclusão, considera-se que a especificação contém o grupo como modificado, cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos de Markush usados nas reivindicações anexas.[00077] The groupings of alternative elements or modalities described here should not be interpreted as limitations. Each group member may be referred to and claimed individually or in any combination with other group members or other elements found herein. It is anticipated that one or more members of a group may be included or excluded from a group for reasons of convenience and/or patentability. When such inclusion or exclusion occurs, the specification is considered to contain the group as modified, thus complying with the written description of all Markush groups used in the appended claims.

[00078] Certas modalidades são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido do inventor para a realização das modalidades da presente divulgação. Obviamente, as variações nestas modalidades descritas tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica após a leitura da descrição anterior. O inventor espera que especialistas experientes empreguem tais variações conforme apropriado, e o inventor pretende que as modalidades da presente divulgação sejam praticadas de outra maneira que aqui especificamente descritas. Consequentemente, esta divulgação inclui todas as modificações e os equivalentes da matéria objeto citados nas reivindicações acrescentadas a este como permitido pela legislação aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos, em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela presente divulgação a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.[00078] Certain embodiments are described herein, including the best way known to the inventor for carrying out the embodiments of the present disclosure. Obviously, variations in these described embodiments will become apparent to those skilled in the art after reading the foregoing description. The inventor expects that skilled artisans will employ such variations as appropriate, and the inventor intends that embodiments of the present disclosure be practiced otherwise than specifically described herein. Accordingly, this disclosure includes all modifications and equivalents of the subject matter cited in the claims added hereto as permitted by applicable law. Furthermore, any combination of the above-described elements, in all possible variations thereof, is encompassed by the present disclosure unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by the context.

[00079] As modalidades específicas aqui descritas podem ser ainda limitadas nas reivindicações usando consistindo em ou consistindo essencialmente em linguagem. Quando usado nas reivindicações, seja conforme arquivado ou adicionado por alteração, o termo de transição "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado nas reivindicações. O termo de transição "consistindo essencialmente em" limita o alcance de uma reivindicação aos materiais ou às etapas especificadas e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas. As modalidades desta divlgaçaõ assim reivindicadas são descritas e ativadas de forma inerente ou expressa aqui.[00079] The specific embodiments described herein may be further limited in claims using consisting of or consisting essentially of language. When used in the claims, whether as filed or added by amendment, the transitional term "consisting of" excludes any element, step or ingredient not specified in the claims. The transitional term "consisting essentially of" limits the scope of a claim to the specified materials or steps and those that do not materially affect the basic and novel features. The embodiments of this disclosure so claimed are inherently or expressly described and enabled herein.

[00080] Além disso, se houver qualquer referência a patentes e publicações impressas ao longo desta divulgação, cada uma dessas referências e publicações impressas são incorporadas individualmente aqui por referência na sua totalidade.[00080] Furthermore, if there are any references to patents and printed publications throughout this disclosure, each such reference and printed publication is individually incorporated herein by reference in its entirety.

[00081] Para encerrar, deve ser entendido que as modalidades aqui descritas são ilustrativas dos princípios da presente divulgação. Outras modificações que podem ser empregadas estão dentro do escopo desta divulgação. Assim, a título de exemplo, mas não de limitação, configurações alternativas das modalidades da presente divulgação podem ser utilizadas de acordo com os ensinamentos aqui apresentados. Consequentemente, a presente divulgação não se limita àquela precisamente como mostrado e descrito.[00081] In closing, it should be understood that the modalities described here are illustrative of the principles of the present disclosure. Other modifications that may be employed are within the scope of this disclosure. Thus, by way of example, but not limitation, alternative configurations of embodiments of the present disclosure may be used in accordance with the teachings presented herein. Accordingly, the present disclosure is not limited to that precisely as shown and described.

Claims

1. Ready-to-use vincristine composition, characterized by comprising; a continuous aqueous phase comprising a phosphate buffer solution, a sphingomyelin-cholesterol liposome phase dispersed within the phosphate buffer solution, and a stabilizing aqueous solution encapsulated as filler within the sphingomyelin-cholesterol liposome phase; wherein the aqueous stabilization solution comprises a second aqueous buffer and stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises ammonium sulfate; and wherein the continuous aqueous phase and the aqueous stabilizing solution have a pH difference of at least 2 pH units.

2. Composition according to claim 1, characterized in that the vincristine comprises vincristine sulfate.

3. Composition, according to claim 1, characterized by the fact that the pH of the aqueous stabilization solution is 3 to 5.

4. Composition according to claim 1, characterized by the fact that the pH of the continuous aqueous phase is 5 to 8.8.

5. Composition according to claim 1, characterized by the fact that the pH of the continuous aqueous phase is 7 to 8.8.

6. Composition according to claim 1, characterized by the fact that the pH of the continuous aqueous phase is 7.5 to 8.8.

7. Compositions according to claim 6, characterized by the fact that the pH of the aqueous stabilization solution is 3 to 5.

8. Composition, according to claim 1, characterized by the fact that vincristine is in the form of sulfate salt.

9. Composition, according to claim 1, characterized by the fact that the liposome is resistant to hydrolysis.

10. Composition according to claim 1, characterized by the fact that the drug is more stable in the aqueous stabilization solution than in the continuous aqueous phase.

11. Composition according to claim 1, characterized by the fact that the proportion of the continuous aqueous phase and the aqueous stabilizing solution is such that mixing the two phases would result in a combined aqueous phase with a pH of 6 to 8, 8.

12. Composition according to claim 1, characterized by the fact that ammonium sulfate is present in the second aqueous buffer in a concentration of 150 mM to 350 mM.

13. Method of stabilizing vincristine in a liposome, characterized in that it comprises: dispersing a sphingomyelin-cholesterol liposome phase within a continuous aqueous phase comprising a phosphate buffer solution; wherein the sphingomyelin-cholesterol liposome phase contains an aqueous stabilization solution encapsulated in the sphingomyelin-cholesterol liposome phase; wherein the aqueous stabilization solution comprises a second aqueous buffer and stabilized vincristine dissolved therein; wherein the second aqueous buffer comprises ammonium sulfate; and wherein the continuous aqueous phase and the aqueous stabilizing solution have a pH difference of at least 2 pH units.

14. Method according to claim 13, characterized in that the vincristine comprises vincristine sulfate.

15. Method according to claim 13, characterized by the fact that the pH of the aqueous stabilization solution is 3 to 5.

16. Method according to claim 13, characterized by the fact that the pH of the continuous aqueous phase is 5 to 8.8.

17. Method according to claim 13 characterized by the fact that the pH of the continuous aqueous phase is 7 to 8.8.

18. Method according to claim 13, characterized by the fact that the pH of the continuous aqueous phase is 7.5 to 8.8.

19. Method according to claim 13, characterized in that the liposome is resistant to hydrolysis.

20. Method according to claim 13, characterized by the fact that the drug is more stable in the aqueous stabilization solution than in the continuous aqueous phase.

21. Method according to claim 13, characterized by the fact that the proportion of the continuous aqueous phase and the aqueous stabilizing solution is such that mixing the two phases would result in a combined aqueous phase with a pH of 6 to 8, 8.

22. Method according to claim 13, characterized by the fact that ammonium sulfate is present in the second aqueous buffer in a concentration of 150 mM to 350 mM.

23. Composition according to claim 1, characterized by the fact that said vincristine composition is stable for 4 weeks at room temperature.

24. Method according to claim 13, characterized by the fact that said vincristine is stable for 4 weeks at room temperature.