BR112017025788B1

BR112017025788B1 - USES OF SS-HYDROXY-SS-METHYLBUTYRIC ACID

Info

Publication number: BR112017025788B1
Application number: BR112017025788-2A
Authority: BR
Inventors: John Rathmacher; Naji Abumrad; Shawn Baier
Original assignee: Metabolic Technologies, Inc.
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2023-07-18

Abstract

A presente invenção provê uma composição compreendendo HMB. Métodos para administrar HMB a um animal também são descritos. HMB é administrado para intensificar ou promover lipólise, oxidação de gordura de adipócitos, induzir biogênise mitocondrial de adipócito e músculo, aumentar o gasto energético, reduzir do peso corporal total e aumentar a perda de gordura corporal intensificado.The present invention provides a composition comprising HMB. Methods for administering HMB to an animal are also described. HMB is administered to intensify or promote lipolysis, adipocyte fat oxidation, induce adipocyte and muscle mitochondrial biogenesis, increase energy expenditure, reduce total body weight, and enhance intensified body fat loss.

Description

[001] O pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisória US N° 62/169,334 depositado em 1 de junho de 2015 e aqui incorpora o pedido provisório por referência.[001] The patent application claims priority to US Provisional Patent Application No. 62/169,334 filed on June 1, 2015 and hereby incorporates the provisional application by reference.

Fundamentals of Invention 1. Technical Field

[002] A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo o ß-hidroxi-ß-metilbutirato (HMB) e os métodos de utilização de HMB para intensificar a lipólise, aumentar a perda de gordura corporal, reduzir o tamanho dos adipócitos, aumentar o metabolismo dos ácidos graxos adipócitos, reduzir o peso total corporal e inflamação por adipócitos inferiores.[002] The present invention relates to a composition comprising ß-hydroxy-ß-methylbutyrate (HMB) and methods of using HMB to intensify lipolysis, increase body fat loss, reduce adipocyte size, increase adipocyte fatty acid metabolism, reduce total body weight and inflammation by lower adipocytes.

2. Fundamentals

[003] A alta prevalência de obesidade representa um grande ônus à saúde pública e economia, que leva a uma necessidade urgente de gerenciamento nutricional efetivo da obesidade e da comorbidade associada à obesidade. Recentemente, a inflamação crônica tem sido reconhecida como um fator contribuinte na patogênese de muitas doenças metabólicas, que se origina, em parte, do tecido adiposo. Especificamente, a hipertrofia de adipócitos conduz a um perfil inflamatório de genes associado à disfunção metabólica. Atualmente, existe uma prioridade nacional no sentido de desenvolver ferramentas efetivas para o gerenciamento da obesidade e inflamação do tecido adiposo, incluindo produtos nutricionais para o controle do apetite e manutenção da composição corporal ideal durante a perda de peso. No entanto, a ciência por trás dos produtos para perda de peso até agora tem sido principalmente baseada unicamente na restrição calórica, e não na manutenção de tecido magro versus perda de tecido adiposo. O programa ideal de perda de peso levaria a perda preferencial de tecido adiposo em relação ao tecido muscular. As melhorias no metabolismo dos adipócitos levam a reduções no tamanho dos adipócitos, no estresse oxidativo e da inflamação e à promoção da saúde cardiometabólica;[003] The high prevalence of obesity represents a major burden on public health and the economy, which leads to an urgent need for effective nutritional management of obesity and the comorbidity associated with obesity. Recently, chronic inflammation has been recognized as a contributing factor in the pathogenesis of many metabolic diseases, which originate, in part, from adipose tissue. Specifically, adipocyte hypertrophy leads to an inflammatory gene profile associated with metabolic dysfunction. There is currently a national priority to develop effective tools for managing obesity and adipose tissue inflammation, including nutritional products for appetite control and maintaining ideal body composition during weight loss. However, the science behind weight loss products to date has primarily been based solely on calorie restriction, and not on maintaining lean tissue versus losing fat tissue. The ideal weight loss program would lead to a preferential loss of adipose tissue over muscle tissue. Improvements in adipocyte metabolism lead to reductions in adipocyte size, oxidative stress and inflammation, and promotion of cardiometabolic health;

[004] O aumento da prevalência da obesidade representa uma crise de saúde de extraordinária magnitude e prevê-se que, até 2030, aproximadamente 50% da população adulta seja obesa. A obesidade está ligada à diabetes tipo 2 (T2D), doenças cardiovasculares (DCV), hipertensão e muitos tipos de câncer. Além do impacto devastador na qualidade de vida, a obesidade e as comorbidades associadas aumentam os custos médicos anuais médios por pessoa em US$ 2.741 (dólares de 2005) em comparação com os custos de pessoas com peso normal, incluindo 46% de aumento nos custos de internação, 27% a mais em serviços ambulatoriais, e 80% a mais nas despesas com medicamentos prescritos. Além disso, os custos atribuíveis à perda de produtividade para empregados em tempo integral são estimados em US$ 42,8 bilhões anualmente.[004] The increase in the prevalence of obesity represents a health crisis of extraordinary magnitude and it is predicted that, by 2030, approximately 50% of the adult population will be obese. Obesity is linked to type 2 diabetes (T2D), cardiovascular disease (CVD), hypertension and many types of cancer. In addition to the devastating impact on quality of life, obesity and associated comorbidities increase average annual medical costs per person by $2,741 (2005 dollars) compared to costs for people of normal weight, including a 46% increase in costs hospitalization, 27% more in outpatient services, and 80% more in expenses with prescription medications. Additionally, costs attributable to lost productivity for full-time employees are estimated at $42.8 billion annually.

[005] Os aminoácidos de cadeia ramificada e a leucina, em particular, são reconhecidos como reguladores chave do metabolismo das proteínas. Vários estudos mostraram que o ß-hidroxi-ß-metilbutirato (HMB), um metabólito natural da leucina, é mais efetivo do que a leucina, levando a reduções na degradação da proteína muscular e promovendo a síntese de proteínas musculares, convertendo em aumento da massa corporal magra e em melhora da função muscular em adultos jovens e idosos, durante a saúde e a doença.[005] Branched-chain amino acids and leucine, in particular, are recognized as key regulators of protein metabolism. Several studies have shown that ß-hydroxy-ß-methylbutyrate (HMB), a natural metabolite of leucine, is more effective than leucine, leading to reductions in muscle protein breakdown and promoting muscle protein synthesis, converting into increased lean body mass and improved muscle function in young and older adults during health and illness.

[006] Foi demonstrado que uma dieta deficiente em leucina causa uma redução dramática na massa de gordura abdominal (Cheng et al., Diabetes, 2010 Jan, 59(1):17-25), tornando os resultados da presente invenção surpreendentes e inesperados.[006] A leucine-deficient diet has been shown to cause a dramatic reduction in abdominal fat mass (Cheng et al., Diabetes, 2010 Jan, 59(1):17-25), making the results of the present invention surprising and unexpected .

HMB

[007] O alfa-cetoisocaproato (KIC) é o primeiro metabólito principal e ativo da leucina. Um produto secundário do metabolismo de KIC é o ß- hidroxi-p-metilbutirato (HMB). O HMB foi considerado útil no contexto de uma variedade de aplicações. Especificamente, na Patente U.S. N° 5.360.613 (Nissen), HMB é descrito como útil para reduzir os níveis sanguíneos de colesterol total e colesterol de lipoproteínas de baixa densidade. Na Patente U.S. N° 5.348.979 (Nissen et al.), HMB é descrito como sendo útil para promover a retenção de nitrogênio em seres humanos. A Patente U.S. N° 5.028.440 (Nissen) discute a utilidade de HMB para aumentar o desenvolvimento de tecido magro em animais. Além disso, na Patente U.S. N° 4.992.470 (Nissen), HMB é descrito como eficaz no aumento da resposta imune de mamíferos. A Patente U.S. N° 6.031.000 (Nissen et al.) descreve o uso de HMB e pelo menos um aminoácido para tratar o desgaste associado à doença.[007] Alpha-ketoisocaproate (KIC) is the first main and active metabolite of leucine. A secondary product of KIC metabolism is ß-hydroxy-p-methylbutyrate (HMB). The HMB has been found useful in the context of a variety of applications. Specifically, in U.S. Patent No. 5,360,613 (Nissen), HMB is described as useful for reducing blood levels of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol. In U.S. Patent No. 5,348,979 (Nissen et al.), HMB is described as being useful for promoting nitrogen retention in humans. U.S. Patent No. 5,028,440 (Nissen) discusses the usefulness of HMB for increasing lean tissue development in animals. Furthermore, in U.S. Patent No. 4,992,470 (Nissen), HMB is described as effective in enhancing the immune response of mammals. U.S. Patent No. 6,031,000 (Nissen et al.) describes the use of HMB and at least one amino acid to treat wasting associated with the disease.

[008] O uso de HMB para suprimir a proteólise é originário das observações de que a leucina tem características de economia de proteínas. O aminoácido leucina essencial pode ser usado para síntese de proteínas ou transaminado para o a-cetoácido (a-cetoisocaproato, KIC). Em um aspecto, o KIC pode ser oxidado para HMB e isso representa aproximadamente 5% da oxidação de leucina. HMB é superior à leucina no aumento da massa muscular e de força. Os efeitos ideais de HMB podem ser alcançados em 3,0 gramas por dia quando administrados como sal de cálcio de HMB, ou 0,038 g<kg de peso corporal -Mia, enquanto os de leucina requerem mais de 30,0 gramas por dia.[008] The use of HMB to suppress proteolysis originates from the observations that leucine has protein-sparing characteristics. The essential amino acid leucine can be used for protein synthesis or transaminated to a-keto acid (a-ketoisocaproate, KIC). In one aspect, KIC can be oxidized to HMB and this represents approximately 5% of leucine oxidation. HMB is superior to leucine in increasing muscle mass and strength. Optimal effects of HMB can be achieved at 3.0 grams per day when administered as the calcium salt of HMB, or 0.038 g<kg of body weight -Mia, while those of leucine require more than 30.0 grams per day.

[009] Uma vez produzido ou ingerido, HMB parece ter dois destinos. O primeiro destino é a simples excreção na urina. Depois que HMB é conduzido, as concentrações de urina aumentam, resultando em uma perda aproximada de 20-50% de HMB na urina. Outro destino diz respeito à ativação do HMB para HMB-CoA. Uma vez convertido em HMB-CoA, pode ocorrer mais metabolismo, desidratação de HMB-CoA em MC-CoA ou conversão direta de HMB-CoA em HMG-CoA, que fornece substratos para a síntese de colesterol intracelular. Vários estudos demonstraram que HMB é incorporado na via sintética do colesterol e pode ser uma fonte de novas membranas celulares que são usadas para a regeneração de membranas celulares danificadas. Estudos em seres humanos mostraram que o dano muscular após o exercício intenso, medido por CPK no plasma elevado (creatina fosfoquinase), é reduzido com suplementação de HMB nas primeiras 48 horas. O efeito protetor do HMB dura até três semanas com o uso diário contínuo. Numerosos estudos mostraram uma dose efetiva de HMB para 3,0 gramas por dia como CaHMB (HMB de cálcio) (~38 mgVkg de peso corporal-1-dia-1). Esta dosagem aumenta a massa muscular e os ganhos de força associados ao treinamento de resistência, minimizando os danos musculares associados ao exercício extenuante. HMB foi testado para segurança, não mostrando efeitos colaterais em adultos saudáveis ou jovens. HMB em combinação com L-arginina e L-glutamina também foi mostrado como sendo seguro quando suplementado em pacientes com AIDS e pacientes com câncer.[009] Once produced or ingested, HMB appears to have two fates. The first destination is simple excretion in the urine. After HMB is administered, urine concentrations increase, resulting in an approximate 20-50% loss of HMB in the urine. Another fate concerns the activation of HMB to HMB-CoA. Once converted to HMB-CoA, further metabolism may occur, dehydration of HMB-CoA to MC-CoA or direct conversion of HMB-CoA to HMG-CoA, which provides substrates for intracellular cholesterol synthesis. Several studies have demonstrated that HMB is incorporated into the cholesterol synthetic pathway and can be a source of new cell membranes that are used for the regeneration of damaged cell membranes. Studies in humans have shown that muscle damage after intense exercise, as measured by elevated plasma CPK (creatine phosphokinase), is reduced with HMB supplementation in the first 48 hours. The protective effect of HMB lasts up to three weeks with continuous daily use. Numerous studies have shown an effective dose of HMB to be 3.0 grams per day as CaHMB (calcium HMB) (~38 mgVkg body weight-1-day-1). This dosage increases muscle mass and strength gains associated with resistance training while minimizing muscle damage associated with strenuous exercise. HMB has been tested for safety, showing no side effects in healthy or young adults. HMB in combination with L-arginine and L-glutamine has also been shown to be safe when supplemented in AIDS patients and cancer patients.

[0010] Recentemente, foi desenvolvido o ácido livre de HMB, uma nova forma de administração de HMB. Esta nova forma de administração mostrou ser absorvida mais rapidamente e possui uma maior depuração de tecido do que o CaHMB. A nova forma de administração é descrita na Publicação da Patente U.S. N° de Série 20120053240 que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.[0010] Recently, HMB free acid, a new form of HMB administration, was developed. This new form of administration has been shown to be absorbed more quickly and has greater tissue clearance than CaHMB. The new form of administration is described in U.S. Patent Publication Serial No. 20120053240 which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0011] As evidências atuais sugerem que o HMB atua acelerando a capacidade regenerativa do músculo esquelético após exercício de alta intensidade ou exercício prolongado. Quando o treinamento e/ou a dieta são controlados, o HMB pode diminuir os índices de danos nos músculos esqueléticos e degradação de proteínas de forma dependente da dose. Recentemente, o HMB em uma forma de ácido livre (HMB-FA) foi desenvolvido com biodisponibilidade melhorada. Estudos iniciais mostraram que esta forma de suplementação de HMB resulta em aproximadamente o dobro dos níveis plasmáticos de HMB em cerca de um quarto do tempo após a administração quando comparado com a forma atualmente disponível, HMB de cálcio. Além disso, o HMB-FA, administrado 30 minutos antes de um episódio agudo de treinamento de resistência de alto volume, conseguiu atenuar os índices de dano muscular e melhorar a recuperação percebida em atletas treinados quanto à resistência. Além disso, a ingestão aguda de 2,4 gramas de HMB-FA aumenta a síntese da proteína do músculo esquelético e diminui a redução da proteína em +70% e - 56%, respectivamente.[0011] Current evidence suggests that HMB acts by accelerating the regenerative capacity of skeletal muscle after high-intensity exercise or prolonged exercise. When training and/or diet are controlled, HMB can decrease rates of skeletal muscle damage and protein degradation in a dose-dependent manner. Recently, HMB in a free acid form (HMB-FA) was developed with improved bioavailability. Initial studies have shown that this form of HMB supplementation results in approximately doubling of plasma HMB levels in about a quarter of the time after administration when compared to the currently available form, calcium HMB. Furthermore, HMB-FA, administered 30 minutes before an acute episode of high-volume resistance training, was able to mitigate rates of muscle damage and improve perceived recovery in resistance-trained athletes. Furthermore, acute ingestion of 2.4 grams of HMB-FA increases skeletal muscle protein synthesis and decreases protein reduction by +70% and -56%, respectively.

[0012] Os efeitos do HMB no músculo estão bem documentados. Sabe-se que a suplementação de HMB leva ao aumento da massa e força muscular e pode resultar em melhorias aeróbicas. Embora os aumentos na massa muscular magra alterem a composição corporal geral, assumiu-se que HMB só afeta células musculares para aumentar a massa muscular, que por sua vez altera a composição corporal. Antes das descobertas descritas na presente invenção, não se sabia que a HMB teve efeito direto sobre adipócitos e tecido adiposo.[0012] The effects of HMB on muscle are well documented. HMB supplementation is known to lead to increased muscle mass and strength and can result in aerobic improvements. Although increases in lean muscle mass alter overall body composition, it has been assumed that HMB only affects muscle cells to increase muscle mass, which in turn alters body composition. Prior to the discoveries described in the present invention, it was not known that HMB had a direct effect on adipocytes and adipose tissue.

[0013] A maioria das perdas de peso é iniciada por dietas hipocalóricas. Esta perda de peso compreende perdas em massa gorda e massa corporal magra (isto é, músculo esquelético), em uma proporção estimada em 2: 1. Exercício resulta em perda de peso que é explicada principalmente por perdas de massa de gordura, com aumento menor ou significativo na massa muscular. Um número significativo de mudanças de massa corporal que ocorrem no exercício agora é pensado para ser mediado pela via clássica (benéfica) da IL-6. Surpreendentemente, o HMB tem um efeito semelhante ao do exercício, mas sem que o exercício seja uma variável; A perda de massa gorda é vista mesmo na ausência de exercício.[0013] Most weight loss is initiated by low-calorie diets. This weight loss comprises losses in fat mass and lean body mass (i.e., skeletal muscle), in an estimated 2:1 ratio. Exercise results in weight loss that is primarily explained by losses in fat mass, with smaller increases or significant in muscle mass. A significant number of body mass changes that occur in exercise are now thought to be mediated by the classical (beneficial) IL-6 pathway. Surprisingly, HMB has a similar effect to exercise, but without exercise being a variable; Loss of fat mass is seen even in the absence of exercise.

[0014] A presente invenção compreende uma composição de HMB e métodos de utilização de HMB para resultar em lipólise intensificada, aumento da oxidação da gordura de adipócitos, adipócitos induzidos e biogénese mitocondrial muscular, aumento do gasto de energia, reduções no peso corporal e aumento da perda de gordura corporal. HMB pode assim ser usado para melhorar o contorno corporal, conforme definido pela massa corporal magra intensificada em conjunto com a diminuição da massa gorda. Isso pode resultar em uma redução do peso corporal total. Estes efeitos são observados com ou sem restrição calórica e sem necessidade de exercício.[0014] The present invention comprises a composition of HMB and methods of using HMB to result in enhanced lipolysis, increased adipocyte fat oxidation, induced adipocyte and muscle mitochondrial biogenesis, increased energy expenditure, reductions in body weight and increased of body fat loss. HMB can thus be used to improve body contouring, as defined by increased lean body mass in conjunction with decreased fat mass. This can result in a reduction in overall body weight. These effects are observed with or without calorie restriction and without the need for exercise.

[0015] O uso de HMB para aumentar a lipólise e/ou diminuir a massa gorda também diminui as morbidades associadas à obesidade, tais como diabetes tipo 2, doença cardiovascular, inflamação crônica, câncer e outras comorbidades associadas.[0015] The use of HMB to increase lipolysis and/or decrease fat mass also reduces morbidities associated with obesity, such as type 2 diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation, cancer and other associated comorbidities.

[0016] Além de administrar HMB a seres humanos para resultar nos efeitos acima descritos em adipócitos, tecido adiposo e perda de gordura, a presente invenção inclui também a administração de uma composição de HMB a animais com os mesmos efeitos sobre adipócitos, tecido adiposo e perda de gordura. Existe uma alta taxa de obesidade entre os animais de companhia; cerca de 54% dos gatos e cães nos Estados Unidos estão acima do peso ou obesos. Assim, existe uma necessidade por composições e métodos de utilização destas composições para resultar em perda de gordura em animais.[0016] In addition to administering HMB to humans to result in the above-described effects on adipocytes, adipose tissue and fat loss, the present invention also includes administering an HMB composition to animals with the same effects on adipocytes, adipose tissue and fat loss. There is a high rate of obesity among companion animals; About 54% of cats and dogs in the United States are overweight or obese. Thus, there is a need for compositions and methods of using these compositions to result in fat loss in animals.

Summary of the Invention

[0017] Um dos objetivos da presente invenção é prover uma composição para utilização na perda de gordura e/ou reduções no peso corporal.[0017] One of the objectives of the present invention is to provide a composition for use in fat loss and/or reductions in body weight.

[0018] Um outro objetivo da presente invenção é prover uma composição para utilização no aumento da oxidação de gordura de tecido adipócito e/ou adiposo.[0018] Another objective of the present invention is to provide a composition for use in increasing fat oxidation of adipocyte and/or adipose tissue.

[0019] Outro objetivo da presente invenção é prover uma composição para induzir adipócitos e biogênise mitocondrial muscular.[0019] Another objective of the present invention is to provide a composition for inducing adipocytes and muscle mitochondrial biogenesis.

[0020] Um objetivo adicional da presente invenção é prover uma composição para aumentar o gasto de energia.[0020] An additional objective of the present invention is to provide a composition to increase energy expenditure.

[0021] Adicionalmente, um objetivo da presente invenção é prover uma composição para utilização na melhoria da lipólise.[0021] Additionally, an objective of the present invention is to provide a composition for use in improving lipolysis.

[0022] Outro objetivo da presente invenção é prover métodos de administração de uma composição para utilização na perda de gordura.[0022] Another objective of the present invention is to provide methods of administering a composition for use in fat loss.

[0023] Um objetivo adicional da presente invenção é prover métodos para administrar uma composição para aumentar a oxidação de adipócitos e gorduras musculares.[0023] A further objective of the present invention is to provide methods for administering a composition to increase the oxidation of adipocytes and muscle fats.

[0024] Outro objetivo da presente invenção é prover métodos para administrar uma composição para utilização na indução de adipócitos e biogênise mitocondrial muscular.[0024] Another object of the present invention is to provide methods for administering a composition for use in inducing adipocytes and muscle mitochondrial biogenesis.

[0025] Um outro objetivo da presente invenção é prover métodos de administração de uma composição para utilização no aumento do gasto de energia.[0025] Another objective of the present invention is to provide methods of administering a composition for use in increasing energy expenditure.

[0026] Adicionalmente, um objetivo da presente invenção é prover métodos de administração de uma composição para utilização na perda de gordura.[0026] Additionally, an object of the present invention is to provide methods of administering a composition for use in fat loss.

[0027] Outro objetivo da presente invenção é prover métodos de administração de uma composição para utilização em reduções no peso corporal.[0027] Another objective of the present invention is to provide methods of administering a composition for use in reducing body weight.

[0028] Um outro objetivo da presente invenção é prover métodos de administração de uma composição para utilização na melhoria da lipólise.[0028] Another objective of the present invention is to provide methods of administering a composition for use in improving lipolysis.

[0029] Um objetivo adicional da presente invenção é prover métodos para administrar uma composição para utilização na diminuição das morbidades associadas à obesidade, incluindo diabetes tipo 2, doença cardiovascular, inflamação crônica, câncer e outras comorbidades associadas.[0029] An additional objective of the present invention is to provide methods for administering a composition for use in decreasing morbidities associated with obesity, including type 2 diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation, cancer and other associated comorbidities.

[0030] Estes e outros objetivos da presente invenção tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica com referência à seguinte descrição, desenhos e reivindicações.[0030] These and other objects of the present invention will become apparent to those skilled in the art with reference to the following description, drawings and claims.

[0031] A presente invenção pretende superar as dificuldades encontradas até agora. Para esse fim, é fornecida uma composição que compreende HMB. A composição é administrada a um indivíduo que dela necessite. Todos os métodos compreendem administração de HMB ao animal. Os sujeitos incluídos nesta invenção incluem seres humanos e mamíferos não humanos.[0031] The present invention aims to overcome the difficulties encountered so far. For this purpose, a composition comprising HMB is provided. The composition is administered to an individual in need thereof. All methods comprise administration of HMB to the animal. Subjects included in this invention include humans and non-human mammals.

Brief Description of the Drawings

[0032] A Figura 1 é um gráfico que mostra lipólise em adipócitos 3T3-F442A.[0032] Figure 1 is a graph showing lipolysis in 3T3-F442A adipocytes.

[0033] A Figura 2 é um gráfico que mostra lipólise em Adipócitos Subcutâneos Humanos.[0033] Figure 2 is a graph showing lipolysis in Human Subcutaneous Adipocytes.

[0034] A Figura 3 mostra a expressão gênica.[0034] Figure 3 shows gene expression.

[0035] A Figura 4 é um gráfico que mostra lipólise em Adipócitos OP9.[0035] Figure 4 is a graph showing lipolysis in OP9 adipocytes.

[0036] A Figura 5 é um gráfico que mostra a lipólise basal[0036] Figure 5 is a graph showing basal lipolysis

Detailed Description of the Invention

[0037] Foi surpreendentemente e inesperadamente descoberto que HMB afeta adipócitos e tecido adiposo. A presente invenção compreende uma composição de HMB e métodos de utilização de HMB para resultar em aumento de lipólise intensificada, oxidação de gordura de adipócitos, adipócitos induzidos e biogênise mitocondrial muscular, aumento do gasto energético, redução do peso corporal e aumento da perda de gordura. Estes efeitos são observados com ou sem restrição calórica e sem necessidade de exercício, embora o exercício possa ser conduzido em conjunto com a suplementação com a composição e os métodos da presente invenção.[0037] It was surprisingly and unexpectedly discovered that HMB affects adipocytes and adipose tissue. The present invention comprises a composition of HMB and methods of utilizing HMB to result in increased enhanced lipolysis, adipocyte fat oxidation, induced adipocyte and muscle mitochondrial biogenesis, increased energy expenditure, reduced body weight and increased fat loss. . These effects are observed with or without calorie restriction and without the need for exercise, although exercise can be conducted in conjunction with supplementation with the composition and methods of the present invention.

[0038] Esta composição pode ser utilizada em todos os grupos etários que procuram perda de gordura. Esta composição também pode ser utilizada em seres humanos e em mamíferos não humanos, incluindo, mas não limitado a, animais de companhia. HMB[0038] This composition can be used in all age groups seeking fat loss. This composition can also be used in humans and non-human mammals, including, but not limited to, companion animals. HMB

[0039] O ácido ß-hidroxi-ß-metilbutirico ou o ácido p-hidroxi- isovalérico podem ser representados na sua forma de ácido livre como (CH3) 2 (OH) CCH2COOH. O termo "HMB" refere-se ao composto possuindo a fórmula química anterior, tanto nas suas formas de ácido livre tal como de sal, e seus derivados. Embora qualquer forma de HMB possa ser utilizada no contexto da presente invenção, de preferência, o HMB é selecionado do grupo que compreende um ácido livre, um sal, um éster e uma lactona. Os ésteres de HMB incluem ésteres de metila e etila. HMB lactonas incluem isovalaril lactona. Os sais de HMB incluem sal de sódio, sal de potássio, sal de crômio, sal de cálcio, sal de magnésio, sais de metal alcalino e sais de metal terroso.[0039] ß-hydroxy-ß-methylbutyric acid or p-hydroxyisovaleric acid can be represented in its free acid form as (CH3) 2 (OH) CCH2COOH. The term "HMB" refers to the compound having the above chemical formula, both in its free acid and salt forms, and its derivatives. Although any form of HMB may be used in the context of the present invention, preferably, HMB is selected from the group comprising a free acid, a salt, an ester and a lactone. HMB esters include methyl and ethyl esters. HMB lactones include isovalaryl lactone. HMB salts include sodium salt, potassium salt, chromium salt, calcium salt, magnesium salt, alkali metal salts and earth metal salts.

[0040] Os métodos para produzir HMB e os seus derivados são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o HMB pode ser sintetizado por oxidação do álcool diacetônico. Um procedimento adequado é descrito por Coffman et al., J. Am. Chem. Soc. 80: 2882-2887 (1958). Conforme descrito nele, o HMB é sintetizado por uma oxidação alcalina de hipoclorito de sódio de álcool diacetônico. O produto é recuperado em forma de ácido livre, que pode ser convertido em um sal. Por exemplo, o HMB pode ser preparado como seu sal de cálcio por um procedimento semelhante ao de Coffman et al. (1958) em que o ácido livre de HMB é neutralizado com hidróxido de cálcio e recuperado por cristalização a partir de uma solução aquosa de etanol. As formas de sal de cálcio e ácido livre de HMB estão comercialmente disponíveis pela Metabolic Technologies, Ames, Iowa.[0040] Methods for producing HMB and its derivatives are well known in the art. For example, HMB can be synthesized by oxidation of diacetone alcohol. A suitable procedure is described by Coffman et al., J. Am. Chem. Soc. 80: 2882-2887 (1958). As described therein, HMB is synthesized by an alkaline oxidation of sodium hypochlorite from diacetone alcohol. The product is recovered in free acid form, which can be converted into a salt. For example, HMB can be prepared as its calcium salt by a procedure similar to that of Coffman et al. (1958) in which the free acid of HMB is neutralized with calcium hydroxide and recovered by crystallization from an aqueous ethanol solution. Calcium salt and free acid forms of HMB are commercially available from Metabolic Technologies, Ames, Iowa.

Calcium ß-hydroxy-ß-methylbutyrate (HMB) supplementation

[0041] Mais de 2 décadas atrás, o sal de cálcio de HMB foi desenvolvido como um suplemento nutricional para humanos.[0041] More than 2 decades ago, HMB calcium salt was developed as a nutritional supplement for humans.

[0042] Numerosos estudos mostraram que a suplementação de CaHMB melhora a massa muscular e os ganhos de força em conjunto com treinamento de resistência e exercício, e atenua a perda de massa muscular em condições como câncer e AIDS. Nissen e Sharp realizaram uma meta-análise de suplementos utilizados em conjunto com treinamento de resistência e descobriram que o HMB era um dos dois únicos suplementos que apresentavam estudos clínicos que mostravam aumentos significativos de força e massa magra com treinamento de resistência. Estudos mostraram que 38 mg de CaHMB por kg de peso corporal por dia parece ser uma dosagem eficaz para uma pessoa comum.[0042] Numerous studies have shown that CaHMB supplementation improves muscle mass and strength gains in conjunction with resistance training and exercise, and mitigates muscle mass loss in conditions such as cancer and AIDS. Nissen and Sharp performed a meta-analysis of supplements used in conjunction with resistance training and found that HMB was one of only two supplements that had clinical studies showing significant increases in strength and lean mass with resistance training. Studies have shown that 38 mg of CaHMB per kg of body weight per day appears to be an effective dosage for the average person.

[0043] Além da força e dos ganhos de massa muscular, a suplementação de CaHMB também diminui os indicadores de dano muscular e degradação da proteína muscular. Estudos humanos mostraram que o dano muscular após o exercício intenso, medido por CPK de plasma elevado (creatina fosfoquinase), é reduzido com suplementação de HMB. O efeito protetor do HMB mostrou que ele se manifesta durante pelo menos três semanas com o uso diário continuado. Estudos in vitro em músculos de ratos isolados mostram que o HMB é um potente inibidor da proteólise muscular especialmente durante os períodos de estresse. Esses achados foram confirmados em seres humanos; por exemplo, HMB inibe a proteólise muscular em indivíduos envolvidos em treinamento de resistência.[0043] In addition to strength and muscle mass gains, CaHMB supplementation also reduces indicators of muscle damage and muscle protein degradation. Human studies have shown that muscle damage after intense exercise, as measured by elevated plasma CPK (creatine phosphokinase), is reduced with HMB supplementation. The protective effect of HMB has been shown to last for at least three weeks with continued daily use. In vitro studies on isolated rat muscles show that HMB is a potent inhibitor of muscle proteolysis especially during periods of stress. These findings have been confirmed in humans; for example, HMB inhibits muscle proteolysis in individuals involved in resistance training.

[0044] Os mecanismos moleculares pelos quais o HMB diminui a degradação da proteína e aumenta a síntese proteica foram relatados. Eley et al realizaram estudos in vitro que demonstraram que o HMB estimula a síntese proteica através da fosforilação do mTOR. Outros estudos mostraram que o HMB diminui a proteólise através da atenuação da indução da via proteolítica da ubiquitina-proteosoma quando o catabolismo da proteína muscular é estimulado pelo fator indutor de proteólise (PIF), lipopolissacarídeo (LPS) e angiotensina II. Ainda outros estudos demonstraram que HMB também atenua a ativação de proteases de caspases- 3 e -8. Em conjunto, esses estudos indicam que a suplementação com HMB resulta em aumento da massa magra e os ganhos de força que o acompanham através de uma combinação de redução da proteólise e aumento da síntese proteica.[0044] The molecular mechanisms by which HMB decreases protein degradation and increases protein synthesis have been reported. Eley et al performed in vitro studies that demonstrated that HMB stimulates protein synthesis through the phosphorylation of mTOR. Other studies have shown that HMB decreases proteolysis by attenuating the induction of the ubiquitin-proteasome proteolytic pathway when muscle protein catabolism is stimulated by proteolysis-inducing factor (PIF), lipopolysaccharide (LPS) and angiotensin II. Still other studies have demonstrated that HMB also attenuates the activation of caspase-3 and -8 proteases. Taken together, these studies indicate that HMB supplementation results in increased lean mass and the accompanying strength gains through a combination of reduced proteolysis and increased protein synthesis.

Free acid form HMB

[0045] Na maioria dos casos, o HMB utilizado em estudos clínicos e comercializado como um auxiliar ergogênica tem ocorrido na forma de sal de cálcio. Avanços recentes permitiram que o HMB fosse fabricado em forma de ácido livre para uso como suplemento nutricional. Recentemente, desenvolveu-se uma nova forma de ácido livre de HMB, que mostrou ser mais rapidamente absorvida do que o CaHMB, resultando em níveis de pico mais rápido e mais alto e melhora a depuração sérica para os tecidos.[0045] In most cases, the HMB used in clinical studies and marketed as an ergogenic aid has been in the form of calcium salt. Recent advances have allowed HMB to be manufactured in free acid form for use as a nutritional supplement. Recently, a new free acid form of HMB has been developed, which has been shown to be more rapidly absorbed than CaHMB, resulting in faster and higher peak levels and improved serum clearance to tissues.

[0046] O ácido livre de HMB pode, portanto, ser um método mais eficaz de administração de HMB do que a forma de sal de cálcio, particularmente quando administrado diretamente antes do exercício intenso. O ácido livre de HMB iniciado 30 minutos antes de um ataque agudo de exercício foi mais eficaz na atenuação do dano muscular e na melhora da resposta inflamatória do que o CaHMB. Um versado na técnica, no entanto, reconhecerá que esta invenção atual engloba HMB em qualquer forma.[0046] Free acid HMB may therefore be a more effective method of administering HMB than the calcium salt form, particularly when administered directly before intense exercise. HMB free acid initiated 30 minutes before an acute bout of exercise was more effective in attenuating muscle damage and improving the inflammatory response than CaHMB. One skilled in the art, however, will recognize that this current invention encompasses HMB in any form.

[0047] O HMB em qualquer forma pode ser incorporado na administração e/ou na forma de administração de modo a resultar em uma faixa de dosagem típica de cerca de 0,5 gramas de HMB a cerca de 30 gramas de HMB.[0047] HMB in any form can be incorporated into the administration and/or form of administration so as to result in a typical dosage range of about 0.5 grams of HMB to about 30 grams of HMB.

[0048] Quando a composição é administrada oralmente em uma forma comestível, a composição está preferivelmente na forma de um suplemento dietético, produto alimentar ou meio farmacêutico, mais preferivelmente na forma de um suplemento dietético ou produto alimentar. Qualquer suplemento dietético adequado ou produto alimentar que compreende a composição pode ser utilizado dentro do contexto da presente invenção. Um versado na técnica compreenderá que a composição, independentemente da forma (tal como um suplemento dietético, produto alimentar ou um meio farmacêutico), pode incluir aminoácidos, proteínas, peptídeos, carboidratos, gorduras, açúcares, minerais e/ou elementos- vestigiais.[0048] When the composition is administered orally in an edible form, the composition is preferably in the form of a dietary supplement, food product or pharmaceutical medium, more preferably in the form of a dietary supplement or food product. Any suitable dietary supplement or food product comprising the composition can be used within the context of the present invention. One skilled in the art will understand that the composition, regardless of form (such as a dietary supplement, food product or a pharmaceutical medium), may include amino acids, proteins, peptides, carbohydrates, fats, sugars, minerals and/or trace elements.

[0049] Para preparar a composição como um suplemento dietético ou produto alimentar, a composição será normalmente combinada ou misturada de tal modo que a composição seja distribuída substancialmente uniformemente no suplemento dietético ou produto alimentar. Alternativamente, a composição pode ser dissolvida em um líquido, tal como água.[0049] To prepare the composition as a dietary supplement or food product, the composition will normally be combined or mixed such that the composition is distributed substantially evenly in the dietary supplement or food product. Alternatively, the composition may be dissolved in a liquid, such as water.

[0050] A composição do suplemento dietético pode ser um pó, um gel, um líquido ou pode ser prensada em comprimidos ou encapsulada.[0050] The composition of the dietary supplement can be a powder, a gel, a liquid or can be pressed into tablets or encapsulated.

[0051] Embora qualquer meio farmacêutico adequado compreendendo a composição possa ser utilizado dentro do contexto da presente invenção, de preferência, a composição é combinada com um veículo farmacêutico adequado, tal como dextrose ou sacarose.[0051] Although any suitable pharmaceutical medium comprising the composition can be used within the context of the present invention, preferably, the composition is combined with a suitable pharmaceutical carrier, such as dextrose or sucrose.

[0052] A composição pode ser administrada oralmente como um comprimido, cápsula, gel macio, pílula, gel sublingual ou como um líquido. A composição pode ser administrada com outros componentes, tais como proteínas, ácidos aminados de forma livre, carboidratos, açúcares, vitaminas (como vitamina D, vitamina C, vitamina B12, vitamina B6, vitamina E e/ou vitamina K) e/ou minerais.[0052] The composition can be administered orally as a tablet, capsule, soft gel, pill, sublingual gel or as a liquid. The composition may be administered with other components, such as proteins, free-form amino acids, carbohydrates, sugars, vitamins (such as vitamin D, vitamin C, vitamin B12, vitamin B6, vitamin E and/or vitamin K) and/or minerals .

[0053] Além disso, a composição do meio farmacêutico pode ser administrada por via intravenosa de qualquer maneira adequada. Para administração por infusão intravenosa, a composição se encontra de preferência em uma forma não tóxica solúvel em água. A administração intravenosa é particularmente adequada para pacientes hospitalizados que estão passando por terapia intravenosa (IV). Por exemplo, a composição pode ser dissolvida em uma solução IV (por exemplo, uma solução salina ou de glucose) a ser administrada ao doente. Além disso, a composição pode ser adicionada a soluções IV nutricionais, que podem incluir aminoácidos, peptídeos, proteínas e/ou lipídeos. As quantidades da composição a ser administrada por via intravenosa podem ser semelhantes aos níveis utilizados na administração oral. A infusão intravenosa pode ser mais controlada e precisa do que a administração oral.[0053] Furthermore, the pharmaceutical medium composition can be administered intravenously in any suitable manner. For administration by intravenous infusion, the composition is preferably in a non-toxic, water-soluble form. Intravenous administration is particularly suitable for hospitalized patients who are undergoing intravenous (IV) therapy. For example, the composition may be dissolved in an IV solution (e.g., a saline or glucose solution) to be administered to the patient. Furthermore, the composition may be added to nutritional IV solutions, which may include amino acids, peptides, proteins and/or lipids. The amounts of the composition to be administered intravenously may be similar to the levels used for oral administration. Intravenous infusion can be more controlled and precise than oral administration.

[0054] Os métodos de cálculo da frequência através dos quais a composição é administrada são bem conhecidos no estado da técnica anterior e qualquer frequência de administração adequada pode ser utilizada dentro do contexto da presente invenção (por exemplo, uma dose de 6 g por dia ou duas de 3 g doses por dia) e ao longo de qualquer período de tempo adequado (por exemplo, uma dose única pode ser administrada durante um período de tempo de cinco minutos ou durante um período de tempo de uma hora ou, em alternativa, doses múltiplas podem ser administradas durante um período de tempo prolongado). HMB pode ser administrado durante um longo período de tempo, como semanas, meses ou anos.[0054] Methods of calculating the frequency by which the composition is administered are well known in the prior art and any suitable administration frequency can be used within the context of the present invention (for example, a dose of 6 g per day or two 3 g doses per day) and over any suitable period of time (for example, a single dose may be administered over a period of time of five minutes or over a period of time of one hour or, alternatively, multiple doses may be administered over an extended period of time). HMB can be administered over a long period of time, such as weeks, months or years.

[0055] Qualquer dose adequada de HMB pode ser utilizada no contexto da presente invenção. Os métodos de cálculo de doses apropriados são bem conhecidos na técnica anterior.[0055] Any suitable dose of HMB can be used in the context of the present invention. Appropriate dose calculation methods are well known in the prior art.

[0056] Em geral, uma quantidade de HMB nos níveis é suficiente para resultar em lipólise intensificada, aumento da oxidação da gordura de adipócitos, adipócitos induzidos e biogênise mitocondrial muscular, aumento do gasto de energia e aumento da perda de gordura. Estes efeitos são observados com ou sem restrição calórica e sem requerer exercício.[0056] In general, an amount of HMB levels is sufficient to result in enhanced lipolysis, increased adipocyte fat oxidation, induced adipocytes and muscle mitochondrial biogenesis, increased energy expenditure and increased fat loss. These effects are observed with or without calorie restriction and without requiring exercise.

Experimental Examples

[0057] Os exemplos seguintes irão ilustrar a invenção com mais detalhes. Será facilmente compreendido que a composição da presente invenção, tal como geralmente descrita e ilustrada nos exemplos aqui, pode ser sintetizada em uma variedade de formulações e formas de dosagem. Assim, a descrição mais detalhada a seguir das modalidades atualmente preferidas dos métodos, formulações e composições da presente invenção não pretende limitar o âmbito da invenção, como reivindicado, mas é meramente representativa das modalidades atualmente preferidas da invenção.[0057] The following examples will illustrate the invention in more detail. It will be readily understood that the composition of the present invention, as generally described and illustrated in the examples herein, can be synthesized into a variety of formulations and dosage forms. Accordingly, the following more detailed description of the currently preferred embodiments of the methods, formulations and compositions of the present invention is not intended to limit the scope of the invention as claimed, but is merely representative of the currently preferred embodiments of the invention.

Lipolysis in 3T3-F442A adipocytes

[0058] Métodos. Os préadipócitos murinos 3T3-F442A cresceram até a confluência. Após a confluência, as células 3T3-F442A foram permitidas a se diferenciar em adipócitos e se encherem com triglicerídeos. A lipólise foi avaliada como liberação de glicerol a partir de adipócitos 3T3-F442A em placas de cavidade. As monocamadas de adipócitos foram incubadas com tampão de Krebs-Ringer contendo Hepes (KRH), suplementado com 2% de BSA sem ácidos graxos, 5 mM de glicose, ADA e PIA. Além disso, as células foram tratadas com ß-hidroxi-ß-metilbutirato (HMB) em concentrações 0 (controle), 0,1, 1 ou 6 mM. As células foram incubadas na ausência (Basal) ou na presença de isoproterenol 0,1 uM durante 1 hora. Alíquotas do meio de incubação foram removidas e congeladas até a determinação de glicerol. O glicerol foi medido por um método enzimático comercial. Os dados foram apresentados como o aumento de vezes em relação ao controle.[0058] Methods. Murine 3T3-F442A preadipocytes grew to confluence. After confluence, 3T3-F442A cells were allowed to differentiate into adipocytes and fill with triglycerides. Lipolysis was assessed as glycerol release from 3T3-F442A adipocytes in well plates. Adipocyte monolayers were incubated with Krebs-Ringer buffer containing Hepes (KRH), supplemented with 2% fatty acid-free BSA, 5 mM glucose, ADA, and PIA. Furthermore, cells were treated with ß-hydroxy-ß-methylbutyrate (HMB) at concentrations 0 (control), 0.1, 1 or 6 mM. Cells were incubated in the absence (Basal) or presence of 0.1 uM isoproterenol for 1 hour. Aliquots of the incubation medium were removed and frozen until glycerol determination. Glycerol was measured by a commercial enzymatic method. Data were presented as fold increase relative to control.

[0059] Resultados. O efeito do HMB na lipólise em adipócitos 3T3- F442A diferenciados é mostrado na figura 1. Em condições basais, as concentrações de HMB a 0,1 e 1 mM aumentaram a lipólise acima do controle, mas o HMB diminuiu a lipólise no nível incluído de 6,0 mM. Em resposta à estimulação do isoproterenol, o HMB 0,1 mM aumentou a lipólise, mas o HMB diminuiu a lipólise no nível incluído de 6,0 mM. Esses dados indicam que o HMB pode regular o teor de triglicerídeos de adipócitos, aumentando a atividade lipolítica de forma responsiva à dose em ambas as condições basais e quando estimulado.[0059] Results. The effect of HMB on lipolysis in differentiated 3T3-F442A adipocytes is shown in Figure 1. Under basal conditions, HMB concentrations at 0.1 and 1 mM increased lipolysis above control, but HMB decreased lipolysis at the included level of 6.0mM. In response to isoproterenol stimulation, 0.1 mM HMB increased lipolysis, but HMB decreased lipolysis at the included level of 6.0 mM. These data indicate that HMB can regulate the triglyceride content of adipocytes by increasing lipolytic activity in a dose-responsive manner in both basal conditions and when stimulated.

Lipolysis in Human Subcutaneous Adipocytes

[0060] Métodos. Os adipócitos subcutâneos humanos foram obtidos a partir de doadores e incubados in vitro. A lipólise foi avaliada como liberação de glicerol em placas de cavidade. Os adipócitos foram incubados com tampão Krebs-Ringer contendo Hepes (KRH), suplementado com 4% de BSA sem ácidos graxos, glicose 5 mM, ADA e PIA. Além disso, as células foram tratadas com ß-hidroxi-p-metilbutirato (HMB) nas concentrações 0 (controle), 0,1 ou 1 mM na presença de isoproterenol 1,0 uM durante 2 horas. Alíquotas do meio de incubação foram removidas e congeladas até a determinação de glicerol. O glicerol foi medido por um método enzimático comercial. Os dados foram apresentados como o aumento de vezes em relação ao controle.[0060] Methods. Human subcutaneous adipocytes were obtained from donors and incubated in vitro. Lipolysis was evaluated as release of glycerol in well plates. Adipocytes were incubated with Krebs-Ringer buffer containing Hepes (KRH), supplemented with 4% fatty acid-free BSA, 5 mM glucose, ADA, and PIA. Furthermore, cells were treated with ß-hydroxy-p-methylbutyrate (HMB) at concentrations 0 (control), 0.1 or 1 mM in the presence of 1.0 uM isoproterenol for 2 hours. Aliquots of the incubation medium were removed and frozen until glycerol determination. Glycerol was measured by a commercial enzymatic method. Data were presented as fold increase relative to control.

[0061] Resultados. O efeito da HMB na lipólise em adipócitos subcutâneos humanos é mostrado na figura 2. Em resposta à estimulação com isoproterenol, 0,1 e 1 mM de HMB aumentaram a lipólise acima da dos adipócitos suplementados com controle. Estes dados indicam que HMB pode regular o teor de triglicerídeos de adipócitos aumentando a atividade lipolítica. Esses achados demonstram que HMB pode ser usado para reduzir o teor de gordura em seres humanos e pode acelerar a perda de peso em humanos obesos[0061] Results. The effect of HMB on lipolysis in human subcutaneous adipocytes is shown in Figure 2. In response to isoproterenol stimulation, 0.1 and 1 mM HMB increased lipolysis above that in control-supplemented adipocytes. These data indicate that HMB can regulate the triglyceride content of adipocytes by increasing lipolytic activity. These findings demonstrate that HMB can be used to reduce fat content in humans and can accelerate weight loss in obese humans.

Effect of HMB on gene expression in differentiated adipocytes

[0062] Pré-adipócitos humanos de SGBS foram diferenciados em adipócitos e tratados com HMB 1 mM por 4 dias. As células de cepa celular de pré-adipócitos da síndrome de Simpson-Golabi-Behmel humana (SGBS) originam-se de uma amostra de tecido adiposo de um paciente com GSBS. Foram realizados microarranjos (mRNAs). Os dados mostram elevação significativa (2,53 vezes) na via de sinalização de IL6 (clássica) canônica, que recentemente demonstrou ser anti-inflamatória e protetora. Da mesma forma, a interação do receptor de citocinas e as vias de sinalização de cálcio também são elevadas, conforme medido por mRNAs. A Tabela 1 descreve os resultados. Tabela 1 [0062] Human SGBS preadipocytes were differentiated into adipocytes and treated with 1 mM HMB for 4 days. Human Simpson-Golabi-Behmel Syndrome (SGBS) preadipocyte cell strain cells originate from an adipose tissue sample from a patient with GSBS. Microarrays (mRNAs) were performed. Data show significant elevation (2.53-fold) in the canonical (classical) IL6 signaling pathway, which has recently been shown to be anti-inflammatory and protective. Likewise, cytokine receptor interaction and calcium signaling pathways are also elevated, as measured by mRNAs. Table 1 describes the results. Table 1

Gene expression

[0063] Os adipócitos diferenciados foram incubados durante 4 dias com 1 mM de HMB. O ARN foi extraído e a expressão gênica foi determinada por qPCR. A expressão gênica para ATGL, ACOX, PGC1a, ATG7 e BNIP3 foi analisada. ATGL é uma lipase de triglicerídeos adiposa (ATGL) e verificou-se que desempenha um papel importante na catalisação da etapa inicial na hidrólise de triglicerídeos. ATGL é altamente expressa em tecido adiposo de humanos e camundongos. ACOX1 ou acil-CoA oxidase 1 é a primeira enzima envolvida na oxidação de ácidos graxos peroxisômicos. Isso ocorre quando as cadeias de ácidos graxos são muito longas para serem manipuladas pelas mitocôndrias. Os elétrons de alto potencial gerados são transferidos para O2 ^ H2O2 (+ calor) que, na presença de catalase ^ H2O e O2. PGC1a é um regulador chave do metabolismo energético e é considerado muito importante no desenvolvimento do tecido adiposo marrom, que é o tecido adiposo de alta produção de energia. A proteína 7 relacionada à autofagia (ATG7) regula a massa gorda. Ao derrubar ATG7 isso resultará em tecido adiposo anormal não funcional. Níveis elevados aumentam a reciclagem de tecidos. O BNIP3 é outra proteína relacionada à autofagia como ATG7 que parece ser significativa. Os resultados da expressão gênica aparecem na Figura 3. Fosfoquinase Arranjo de proteína de adipócitos SGBS tratados com HMB[0063] Differentiated adipocytes were incubated for 4 days with 1 mM HMB. RNA was extracted and gene expression was determined by qPCR. Gene expression for ATGL, ACOX, PGC1a, ATG7 and BNIP3 was analyzed. ATGL is an adipose triglyceride lipase (ATGL) and has been found to play an important role in catalyzing the initial step in triglyceride hydrolysis. ATGL is highly expressed in adipose tissue of humans and mice. ACOX1 or acyl-CoA oxidase 1 is the first enzyme involved in the oxidation of peroxisomal fatty acids. This occurs when the fatty acid chains are too long for the mitochondria to handle. The generated high potential electrons are transferred to O2^H2O2 (+heat) which in the presence of catalase^H2O and O2. PGC1a is a key regulator of energy metabolism and is considered very important in the development of brown adipose tissue, which is high energy-producing adipose tissue. Autophagy-related protein 7 (ATG7) regulates fat mass. By knocking down ATG7 this will result in abnormal non-functional adipose tissue. High levels increase tissue recycling. BNIP3 is another autophagy-related protein like ATG7 that appears to be significant. Gene expression results appear in Figure 3. Phosphokinase Protein Arrangement of HMB-treated SGBS Adipocytes

[0064] Esta abordagem foi utilizada para determinar em modo não tendencioso na fosforilação de proteínas que são conhecidas por influenciar a atividade de proteínas de sinalização importantes. Os adipócitos humanos diferenciados foram tratados durante 4 dias com ou sem HMB (1 mM).[0064] This approach was used to determine in an unbiased manner the phosphorylation of proteins that are known to influence the activity of important signaling proteins. Differentiated human adipocytes were treated for 4 days with or without HMB (1 mM).

[0065] São apresentados apenas os aumentos significativos acima das células não tratadas na fosforilação da proteína listada no(s) sítio(s) de fosforilação indicado(s). Foram realizadas arranjos de proteínas e a Tabela 2 mostra que as proteínas fosforiladas que foram reguladas após a incubação de adipócitos diferenciados com HMB e Tabela 3 mostram as proteínas que foram reguladas para baixo. Tabela 2 Tabela 3 [0065] Only significant increases above untreated cells in phosphorylation of the listed protein at the indicated phosphorylation site(s) are shown. Protein arrays were performed and Table 2 shows that the phosphorylated proteins that were upregulated after incubation of differentiated adipocytes with HMB and Table 3 shows the proteins that were downregulated. Table 2 Table 3

[0066] Um achado notável é o de uma diminuição no Stat 3 que está envolvida na via benéfica da IL-6. Além disso, foi observada uma diminuição na transcrição AKT 1/2/3, uma proteína que é fosforilada na serina 473 e está intimamente envolvida com a via mTOR. Isso contrasta com nenhuma mudança em AKT 1/2/3 que está em Threonine 308 e está envolvida na via de sinalização de insulina. As quinases SRC, Fyn, yes e lyn estão envolvidas no metabolismo de ácidos graxos.[0066] A notable finding is a decrease in Stat 3 which is involved in the beneficial IL-6 pathway. Furthermore, a decrease in AKT 1/2/3 transcription, a protein that is phosphorylated at serine 473 and is intimately involved with the mTOR pathway, was observed. This contrasts with no change in AKT 1/2/3 which is in Threonine 308 and is involved in the insulin signaling pathway. The kinases SRC, Fyn, yes and lyn are involved in fatty acid metabolism.

[0067] Estes estudos foram conduzidos na ausência de estímulos elétricos que simulam o exercício, demonstrando que a suplementação de HMB é eficaz para a perda de gordura mesmo na ausência de exercício.[0067] These studies were conducted in the absence of electrical stimuli that simulate exercise, demonstrating that HMB supplementation is effective for fat loss even in the absence of exercise.

HMB regulation of basal lipolysis and isoproterenol stimulated in differentiated adipocytes

[0068] Como observado acima, observou-se um aumento na expressão de ATGL em células tratadas com HMB, de modo que o efeito do tratamento com HMB sobre a lipólise basal e isoproterenol estimulada foi determinado diretamente em adipócitos cultivados. O protocolo de Viswanadha e Londos foi utilizado para otimização de condições para a medição de lipólise em adipócitos primários murinos (J. Lipid Res. 2006. 47: 1859-1864) que incluem tratamento com adenosina desaminase (ADA) para remover a adenosina endógena e depois a adição de PIA resistente à ADA (fenil-isopropil-adenosina).[0068] As noted above, an increase in ATGL expression was observed in HMB-treated cells, so the effect of HMB treatment on basal and isoproterenol-stimulated lipolysis was determined directly in cultured adipocytes. The Viswanadha and Londos protocol was used to optimize conditions for measuring lipolysis in murine primary adipocytes (J. Lipid Res. 2006. 47: 1859-1864) that include treatment with adenosine deaminase (ADA) to remove endogenous adenosine and then the addition of ADA-resistant PIA (phenyl-isopropyl-adenosine).

[0069] As seguintes estratégias de tratamento foram testadas: doses de HMB de 0,1, 1 e 6 mM; 2 concentrações do agonista beta-adrenérgico isoproterenol 0,1 e 1 uM e curto prazo (imediatamente antes do teste de lipólise) versus tratamento HMB a longo prazo (48 h) (n = 4 por tratamento). Os adipócitos Op9 foram usados como células SGBS, que levam muito tempo (várias semanas) para se diferenciar, tornando-os inconvenientes para o uso.[0069] The following treatment strategies were tested: HMB doses of 0.1, 1 and 6 mM; 2 concentrations of the beta-adrenergic agonist isoproterenol 0.1 and 1 uM and short-term (immediately before the lipolysis test) versus long-term (48 h) HMB treatment (n = 4 per treatment). Op9 adipocytes were used as SGBS cells, which take a long time (several weeks) to differentiate, making them inconvenient to use.

[0070] As células foram pré-tratadas com concentrações variáveis de HMB em meio de crescimento OP9 durante 48 horas. Após o pré-tratamento, as células foram lavadas e incubadas com Isoproterenol (0,1 ou 1,0 uM) em tampão de lipólise: Bicarbonato de Krebs (KRB) com BSA a 4%. O meio também continha adenosina desaminase (ADA) e fenil-isopropil-adenosina (PIA) durante 2 horas a 37 ° C. Adicionou-se ADA para remover adenosina endógena e a PIA, que é resistente à ADA, foi utilizada para ter lipólise basal de baixa padronização. Após o tratamento, a mídia foi testada quanto ao teor de glicerol e as células foram lisadas com tampão RIPA para determinar a concentração de proteína, *p <0,05, **p <0,01. N = 4.[0070] The cells were pretreated with varying concentrations of HMB in OP9 growth medium for 48 hours. After pretreatment, cells were washed and incubated with Isoproterenol (0.1 or 1.0 uM) in lipolysis buffer: Krebs Bicarbonate (KRB) with 4% BSA. The medium also contained adenosine deaminase (ADA) and phenyl-isopropyl-adenosine (PIA) for 2 hours at 37°C. ADA was added to remove endogenous adenosine and PIA, which is resistant to ADA, was used to have basal lipolysis. low standardization. After treatment, media was tested for glycerol content and cells were lysed with RIPA buffer to determine protein concentration, *p < 0.05, **p < 0.01. N = 4.

[0071] Os resultados são apresentados nas Figuras 4 e 5: a) Pré-tratamento com HMB durante 48 h (2-4 vezes) intensificou a lipólise estimulada por isoproterenol dramaticamente em adipócitos OP9 diferenciados (Figura 4). b) Em HMB 0,1 mM, a lipólise foi intensificada em 2 vezes em resposta a isoproterenol 0,1 uM (Figura 4 e 5). c) Em 1 MB de HM, observou-se um aumento de 4 vezes em relação a nenhum HMB a 0,1 uM de isoproterenol (Figura 4 e 5). d) Em 6 mM, a resposta ao isoproterenol 0,1 uM foi intensificada 3 vezes, de modo que a dose de HMB 1 mM parece ideal (Figura 4). e) Concentrações mais elevadas de isoproterenol reduziram a lipólise máxima como seria previsto pela dessensibilização de receptores adrenérgicos (Figura 5). f) Sob condições acima utilizadas para o ensaio de lipólise, isto é, adição de ADA seguida de PIA para fixar a lipólise basal a baixo nível, o pré-tratamento HMB também aumentou a lipólise basal cerca de 2 vezes (Figura 4).[0071] The results are presented in Figures 4 and 5: a) Pretreatment with HMB for 48 h (2-4 times) dramatically intensified isoproterenol-stimulated lipolysis in differentiated OP9 adipocytes (Figure 4). b) In 0.1 mM HMB, lipolysis was enhanced 2-fold in response to 0.1 uM isoproterenol (Figure 4 and 5). c) At 1 MB of HM, a 4-fold increase was observed relative to no HMB at 0.1 uM isoproterenol (Figure 4 and 5). d) At 6 mM, the response to 0.1 uM isoproterenol was enhanced 3-fold, so the 1 mM HMB dose appears optimal (Figure 4). e) Higher concentrations of isoproterenol reduced maximum lipolysis as would be predicted by the desensitization of adrenergic receptors (Figure 5). f) Under conditions used above for the lipolysis assay, i.e., addition of ADA followed by PIA to set basal lipolysis at a low level, HMB pretreatment also increased basal lipolysis by about 2-fold (Figure 4).

[0072] Esses exemplos experimentais demonstram que o HMB tem um efeito direto sobre adipócitos e tecido adiposo e mostra que a suplementação com HMB pode ser usada para perda de gordura.[0072] These experimental examples demonstrate that HMB has a direct effect on adipocytes and adipose tissue and show that HMB supplementation can be used for fat loss.

[0073] A descrição e os desenhos anteriores compreendem formas de realização ilustrativas das presentes invenções. As modalidades anteriores e os métodos aqui descritos podem variar com base na capacidade, experiência e preferência dos versados na técnica. Apenas listar as etapas do método em uma determinada ordem não constitui qualquer limitação na ordem das etapas do método. A descrição anterior e os desenhos apenas explicam e ilustram a invenção, e a invenção não está limitada a ela, exceto na medida em que as reivindicações sejam assim limitadas. Os versados na técnica que lerem a descrição serão capazes de fazer modificações e variações na mesma sem assim afastar o escopo da invenção.[0073] The above description and drawings comprise illustrative embodiments of the present inventions. The foregoing embodiments and methods described herein may vary based on the ability, experience and preference of those skilled in the art. Merely listing the method steps in a certain order does not constitute any limitation on the order of the method steps. The foregoing description and drawings only explain and illustrate the invention, and the invention is not limited thereto, except to the extent that the claims are so limited. Those skilled in the art who read the description will be able to make modifications and variations therein without thereby departing from the scope of the invention.

Claims

1. Use of a composition of about 0.5g to about 30g of ß-hydroxy-ß-methylbutyric acid (HMB), characterized in that it is in the manufacture of a composition for increasing intracellular lipolysis in adipose tissue of an animal in need thereof, wherein the composition is directed to treat or prevent at least one of the comorbidities associated with obesity selected from the group consisting of Type 2 diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation and cancer.

2. Use according to claim 1, characterized by the fact that said HMB is selected from the group consisting of its free acid form, its salt, its ester and its lactone.

3. Use according to claim 2, characterized in that said salt is selected from the group consisting of a sodium salt, a potassium salt, a magnesium salt, a chromium salt and a calcium salt .

4. Use according to claim 1, characterized by the fact that the animal is not participating in an exercise program.

5. Use of a composition of about 0.5g to about 30g of ß-hydroxy-ß-methylbutric acid (HMB), characterized by the fact that it is in the manufacture of a composition to induce fat loss by increasing intracellular lipolysis in an animal in need thereof, wherein the composition is directed to treat or prevent at least one of the comorbidities associated with obesity selected from the group consisting of Type 2 diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation and cancer.

6. Use according to claim 5, characterized in that said HMB is selected from the group consisting of its free acid form, its salt, its ester and its lactone.

7. Use according to claim 6, characterized in that said salt is selected from the group consisting of a sodium salt, a potassium salt, a magnesium salt, a chromium salt and a calcium salt .

8. Use according to claim 5, characterized by the fact that administration of the HMB composition increases muscle mass.

9. Use of a composition of about 0.5g to about 30g of ß-hydroxy-ß-methylbutric acid (HMB), characterized by the fact that it is in the manufacture of a composition to promote the export of glycerol from adipocytes by increasing intracellular lipolysis in an animal in need thereof, wherein the composition is directed to treat or prevent at least one of the comorbidities associated with obesity selected from the group consisting of Type 2 diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation and cancer.

10. Use according to claim 9, characterized in that said HMB is selected from the group consisting of its free acid form, its salt, its ester and its lactone.

11. Use according to claim 9, characterized in that said salt is selected from the group consisting of a sodium salt, a potassium salt, a magnesium salt, a chromium salt and a calcium salt .

12. Use of a composition of about 0.5 g to about 30 g of ß-hydroxy-ß-methylbutric acid (HMB), characterized by the fact that it is in the manufacture of a composition to treat or prevent at least one of the associated comorbidities with obesity selected from the group consisting of Type 2 diabetes, cardiovascular disease, chronic inflammation and cancer, in an animal in need of the same.

13. Use according to claim 1, characterized by the fact that the composition is administered to an obese or overweight animal.

14. Use according to claim 1, characterized by the fact that the composition is administered with a low-calorie diet.

15. Use according to claim 1, characterized in that the composition is administered without caloric restriction.