BR112017022233B1 - Uso de plantas e método de redução da população de nematoides - Google Patents

Abstract

“uso de plantas, método de redução da população de nematoides e população de plantas. a presente invenção refere-se ao uso de plantas de daucus carota que não pertencem à subespécie de cenouras cultivadas daucus carota subsp. sativus para desinfetar meios de cultivo infestados por nematoides heterodera carotae, utilizando o poder nematicida das plantas. o presente pedido também se refere a plantas de daucus carota que são resistentes ao nematoide heterodera carotae e a métodos de cultivo dessas plantas que permitam a redução da população de nematoides heterodera carotae presentes em meio de cultivo.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma planta da família de Daucus carota que apresenta atividade nematicida contra o nematoide do cisto Heterodera carotae, preferencialmente não pertencente à subespécie de cenoura cultivada Daucus carota subsp. sativus. A presente invenção também se refere aos usos dessa planta Daucus carota nematicida, particularmente para reduzir o nível de infestação de campos de cultivo infestados pelo o nematoide do cisto Heterodera carotae.

[0002] As cenouras pertencem à família das apiáceas, conhecida anteriormente pelo nome de umbelíferas. Esta planta herbácea bianual é cultivada para obter sua raiz carnuda e comestível que, isoladamente, é denominada cenoura.

[0003] Segundo as estatísticas da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), a produção mundial de cenouras em 2007 foi de mais de 26 milhões de toneladas, em que a metade vem de três países: China, Estados Unidos e Rússia.

[0004] A produção francesa é de cerca de 600.000 toneladas, das quais uma grande parte, 350.000 toneladas, destina-se ao mercado de produtos frescos (frescos e em conserva) e o restante é alocado à produção de cenouras destinadas à indústria.

[0005] Embora a produção de cenouras cubra todo o território francês, ela se concentra especialmente em quatro zonas principais, o oeste da França (Normandia e Bretanha), Aquitânia (Landes), a bacia do Mediterrâneo e a região do norte da Picardia. As duas primeiras zonas são particularmente favoráveis, principalmente devido ao terreno arenoso que é propício para o desenvolvimento equilibrado das raízes e para a mecanização da colheita.

[0006] Isoladamente, a produção francesa destinada ao mercado de produtos frescos representa extensão de mais de 8500 hectares.

[0007] O cultivo de cenouras é um cultivo em campo aberto que enfrenta muitos desafios. A proteção fitossanitária do cultivo de cenouras é de grande interesse para os produtores. As principais dificuldades devem-se, dentre as doenças e pragas que habitam o solo, aos nematoides, Pythium, Rhizoctonia solani e à mosca da cenoura (Psila rosae) e, com relação às pragas aéreas, o pulgão Cavalriella aegopodii e Alternaria dauci.

[0008] O nematoide do cisto das cenouras Heterodera carotae é responsável por grandes perdas de produção, relacionadas à redução da velocidade de produção ou à redução do tamanho da raiz combinada com alta produção de radículas laterais, o que gera aparência peluda bastante característica, mas desvaloriza muito o produto, que não pode ser mais comercializado. Em zonas de produção com terrenos arenosos, as perdas relacionadas a Heterodera carotae podem atingir cerca de 90%.

[0009] Os métodos de controle químico são atualmente os métodos mais eficazes para desinfetar os campos. Desta forma, 1,3-dicloropropeno causa reduções da população de nematoides em solos tratados, em média, de 80%. Em um contexto no qual as condições de cultivo necessitam respeitar cada vez mais o meio ambiente, entretanto, esses tratamentos químicos de fumigação e/ou nematicidas, no caso de nematoides, apresentam problemas ambientais e seu uso é decrescente; 1,3-dicloropropeno foi recentemente banido na Europa, deixando os agricultores sem soluções de controle químico eficaz para os próximos plantios.

[0010] Além disso, observou-se que, embora esses tratamentos químicos permitam o cultivo de cenouras em terrenos infestados, eles não causam redução estável das populações de nematoides. De fato, após o tratamento, ainda restam indivíduos, principalmente na forma de cisto, suficientes para gerar nova população de infestação assim que começa o novo cultivo. É, portanto, necessário renovar continuamente esses tratamentos químicos, o que é oneroso e também causa problemas ambientais.

[0011] Diversos outros meios protetores são disponíveis, como a desinfecção dos solos com irradiação solar ou vapor. Com as reduções verificadas de 50% da população de nematoides, esses métodos não são ideais e sua implementação é difícil.

[0012] A rotação de cultivos é uma possibilidade que pode ser idealizada para combater certos patógenos, mas não é apropriada no caso de nematoides do cisto que, na ausência de cenouras, possuem a capacidade de permanecer por vários anos no solo em estado suspenso na forma de cisto que eclode assim que uma nova safra de cenouras é cultivada, após o surgimento dos exsudados da raiz. Considera-se que são necessários pelo menos oito anos sem cultivo de cenouras em um canteiro infestado antes de atingir-se um limite aceitável para um novo cultivo que, por si próprio, acionará infestação para os anos seguintes.

[0013] Métodos de cultivo como o método de captura de cenoura podem permitir a redução da população de nematoides em campos infectados. Os exsudados de raízes de cenouras plantadas nos campos cuja população de nematoides deve ser reduzida permitirão a eclosão das larvas. Estas últimas migrarão para as raízes e a destruição mecânica do cultivo antes do final de um ciclo de cultivo completo permitirá a suspensão do desenvolvimento das larvas. Este método de cultivo sofre, entretanto, de limitações porque nem todos os cistos que infectam um campo eclodem ao mesmo tempo. Se o cultivo for destruído cedo demais, quantidades suficientes de cistos permanecem no campo e causam perdas da produção seguinte. Caso o cultivo seja destruído tarde demais, novas larvas ou mesmo novos cistos são produzidos, o que novamente causará perdas de produção que se seguem ao uso da armadilha. É extremamente difícil, portanto, determinar o momento ideal em que o cultivo deverá ser destruído e, mesmo quando a destruição for conduzida naquele momento, como nem todos os cistos eclodem ao mesmo tempo, dificilmente é possível obter nível de desinfecção similar ao obtido com produtos químicos.

[0014] Dentre as variedades de cenoura que são resistentes ao nematoide do cisto, Heterodera carotae poderá ser uma solução interessante, mas, atualmente, apesar dos esforços de pesquisa realizados neste setor, essas variedades não existem.

[0015] Não existe, portanto, método não químico eficaz de controle do nematoide do cisto, Heterodera carotae. Os inventores do presente desenvolveram com sucesso um método original que utiliza plantas de Daucus carota nematicidas que permitem redução suficiente do nível de infestação de uma safra de campo de cultivo pelo nematoide do cisto Heterodera carotae, a fim de permitir o cultivo de cenouras.

[0016] A classe dos nematoides compreende mais de 15000 espécies que são encontradas no solo e corpos d’água, alguns dos quais adotaram estilo de vida específico, o parasitismo, dependendo de animais ou plantas.

[0017] A espécie Heterodera carotae foi identificada por Jones em 1950 na Inglaterra e, desde então, vem sendo encontrada na maior parte dos países europeus, onde causa grandes perdas de produção. É um endoparasita sedentário que se desenvolve no interior dos tecidos vegetais da cenoura. Os sintomas no campo são zonas de vegetação irregular, perda de vitalidade da folhagem e alteração de cor para vermelho amarelado com regiões necróticas. As plantas não são muito vigorosas. O tamanho da raiz é reduzido, além de intensa produção de radículas que fornecem aparência peluda à raiz. A lignificação ocorre mais rapidamente e o crescimento é irregular, o que causa distorções e deformação da raiz primária. O ápice necrotiza-se. Ataque de nematoides causa alta tensão hídrica na planta; as perdas de rendimento podem ser eventualmente limitadas por meio de irrigação do cultivo e fornecimento de fertilizante.

[0018] O ciclo biológico do nematoide do cisto da cenoura Heterodera carotae é caracterizado por quatro fases, a partir da eclosão dos cistos na presença de exsudados de raiz emitidos pela safra de cenouras. As larvas de infestação consideradas larvas em segundo estágio, “J2”, dirigem-se às raízes, nelas penetram, migram para o cilindro central, formam um sincício e começam a desenvolver-se, passando pelos estágios J3 e J4 até atingirem a forma adulta. A forma juvenil de “J3”, terceiro estágio, desenvolve-se no interior da cutícula do estágio J2. Machos jovens em terceiro estágio surgem formados no 15° dia após a penetração dos tecidos, enquanto as fêmeas surgem entre o 11° e o 16° dia. Jovens em estágio 4, "J4", exibem notável dimorfismo sexual entre machos e fêmeas. Observar-se-á que o desenvolvimento para o estágio adulto passa por um estágio de determinismo sexual específico, epigenético, em que 25% das larvas tornam-se machos, 25% tornam-se fêmeas e os 50% restantes determinam o sexo em função das condições de recursos alimentícios disponíveis, em que o sexo feminino é preferencialmente selecionado se as condições alimentícias forem satisfatórias. Os machos filiformes deixarão as raízes, enquanto as fêmeas permanecem a elas fixadas, aparecendo através de tecidos inchados e arrancados, cheios com ovos e são fertilizadas assim que atingem a maturidade. Considera-se que a fêmea adulta aparece cerca de 24 dias após a penetração. As fêmeas produzem dois tipos de ovos, ovos externos nos quais são formados jovens do primeiro estágio “J1”, que amadurecem em larvas da segunda geração “J2” para rápida eclosão, infestando novamente o cultivo e os ovos internos. Quando a fêmea morre, a sua cutícula torna-se marrom, endurece e o seu corpo forma um novo cisto que abriga os ovos internos. Esse cisto poderá permanecer no solo por cerca de uma década na ausência de nova safra de cenoura.

[0019] O limite de surgimento de danos no cultivo geralmente é considerado atingido quando é detectada a presença de uma larva de nematoide J2 por grama de solo.

[0020] A cenoura é uma espécie com variabilidade muito ampla, não apenas na cenoura cultivada Daucus carota subsp. sativus, mas também nas doze subespécies selvagens de Daucus carota. A cenoura silvestre é uma planta espontânea em muitas regiões do mundo (América, África, Austrália etc.), mas é principalmente encontrada em toda a Europa e em grande parte da Ásia.

[0021] As cenouras cultivadas pertencem à subespécie sativus (Daucus carota subsp. sativus). Destas, dois tipos importantes são geralmente reconhecidos, nomeadamente as cenouras orientais, conhecidas como cenouras asiáticas, que têm cor vermelho púrpura, violeta (com antocianinas) ou são amareladas, e cenouras que contêm caroteno, conhecidas como cenouras ocidentais ou cenouras europeias, que têm coloração laranja, amarela ou branca. As cenouras atualmente cultivadas são provavelmente originárias do Afeganistão, onde são conhecidas desde o Século IX. Daquele ponto de origem, a sua expansão se realizou, por um lado, para o Oriente Próximo e a China e, por outro lado, para o restante da Europa ocidental. A cenoura foi introduzida na França a partir da Itália no Século XIV. Cenouras contendo caroteno surgiram no Século XVII nos Países Baixos.

[0022] Cenouras silvestres podem ser cruzadas com bastante facilidade com cenouras cultivadas e produzir híbridos férteis. Embora essa variabilidade pareça disponível, ela está longe de ser explorada atualmente, pois retornar a uma tipologia de cenoura cultivada, ou seja, a uma planta Daucus carota subsp. sativus, é extremamente difícil e demorado.

[0023] Os inventores desenvolveram uma estratégia inédita de desinfecção ou desinfestação de solo contaminado pelo nematoide do cisto Heterodera carotae, que permite a obtenção de níveis de desinfecção substancialmente idênticos ou até superiores aos obtidos por meio de desinfecção química. Para isso, os inventores desenvolveram novas plantas de Daucus carota, resistentes ao nematoide do cisto Heterodera carotae; eles também demonstraram que, cultivando-se as mencionadas plantas, é possível explorar a sua resistência para desinfetar um campo contaminado com Heterodera carotae; de fato, de forma perfeitamente inovadora, os inventores utilizaram plantas resistentes não com vistas à sua colheita, nem à introgressão da característica ligada à resistência, mas para restringir a multiplicação do nematoide do cisto Heterodera carotae, ou seja, eles exploraram o efeito nematicida subjacente à resistência dessas plantas, que não são plantas comerciais, ou seja, não se destinam à colheita para comercialização subsequente como alimento, particularmente para alimentação humana. Esta abordagem vai ao encontro dos métodos comuns dos cultivadores, que geralmente buscam identificar, no germoplasma selvagem, plantas resistentes a uma dada praga e, em seguida, realizar introgressão dessa resistência no patrimônio genético de plantas comerciais, a fim de obter variedades comerciais resistentes. Ao contrário desses métodos, os inventores do presente não buscaram realizar introgressão da resistência identificada, mas sim estabilizá-la e explorá-la para desinfetar solos ou meios de cultivo, de acordo com os vários usos ou métodos de acordo com a presente invenção. Inesperadamente, os inventores demonstraram, portanto, que plantas resistentes não comerciais, ou seja, que não se destinam a colheita para comercialização subsequente como alimento, particularmente humano, podem ser consideradas produtos fitossanitários não químicos que permitem a desinfecção ou descontaminação de solos infestados pelo nematoide Heterodera carotae.

[0024] As plantas resistentes obtidas pelos inventores, de fato, aparentemente causam bloqueio do ciclo do nematoide e, portanto, ao longo do tempo, reduzem a infestação dos campos. Sem desejar restrições à teoria, aparentemente o Daucus carota nematicida de acordo com a presente invenção possui ação dupla, não apenas em nível de sincício, causando bloqueio do seu desenvolvimento, mas também em machos e larvas J2 de Heterodera carotae, que aparentemente são bloqueados nas raízes (necroses).

[0025] Como a determinação sexual é epigenética no nematoide do cisto Heterodera carotae, bloqueio do sincício favorecerá o surgimento de nematoides machos em detrimento do surgimento de nematoides fêmeas. Com a forte diminuição da população de fêmeas, a possibilidade de formação de novos cistos ao longo das gerações será, portanto, reduzida de forma similar. Adicional e ainda mais surpreendentemente, os inventores constataram que os nematoides machos e J2 também são aparentemente bloqueados na raiz. Se eles não conseguirem deixar a raiz, não podem fertilizar as fêmeas, que não produzirão ovos. O ciclo reprodutivo do nematoide é novamente interrompido.

[0026] Por isso, ao longo do tempo, os cistos que infestam um canteiro de cultivo eclodem devido aos exsudados da raiz produzidos pelas plantas resistentes e liberam suas larvas, que são bloqueadas em seguida no seu ciclo de multiplicação e, portanto, não podem produzir novos cistos. Ao longo de várias gerações de nematoides, por exemplo ao longo de uma estação de cultivo, o nível de infestação do canteiro é reduzido até nível aceitável para receber em seguida um cultivo de Daucus carota sativus.

DEFINIÇÕES

[0027] O termo “desinfecção” ou “desinfestação” de solo ou meio, no contexto da presente invenção, indica a redução da população de pragas ou patógenos, mais especificamente de nematoides, particularmente de nematoide do cisto e, mais especificamente, Heterodera carotae, no solo ou meio ou, alternativamente, a redução da sua capacidade de reprodução. Os termos “desinfecção” e “desinfestação”, com relação a Heterodera carotae, são utilizados de forma intercambiável no presente relatório descritivo.

[0028] As noções de “resistência” e “susceptibilidade” são definidas, de forma geral, pela ISF (Federação Internacional de Sementes).

[0029] O termo “resistência” indica, portanto, a capacidade de uma planta ou variedade de restringir o crescimento e o desenvolvimento de um dado patógeno ou praga e/ou os danos causados por ele em comparação com variedades sensíveis e sob condições ambientais e de pressão similares para aquele patógeno ou praga. Plantas ou variedades resistentes podem exibir alguns sintomas de doenças ou danos em caso de alta pressão de pragas ou patógenos. Preferencialmente, no contexto da presente invenção, “resistência” indica a capacidade de restringir o crescimento e o desenvolvimento de um dado patógeno ou praga.

[0030] O termo “sensibilidade” indica a incapacidade da planta ou uma variedade de restringir o crescimento e o desenvolvimento de um dado patógeno ou praga.

[0031] No contexto da presente invenção, a resistência de plantas ao nematoide Heterodera carotae indica a capacidade dessa planta de restringir o crescimento e o desenvolvimento do mencionado nematoide. Um exemplo de planta sensível a esse nematoide é a variedade de cenoura Nanco, comercializada pela empresa Vilmorin.

[0032] Uma planta será considerada resistente quando exibir ausência de multiplicação de nematoides e/ou redução da multiplicação de nematoides, possivelmente acompanhada pela produção amplamente majoritária de indivíduos machos. No primeiro caso, os nematoides são bloqueados no início do sincício nutricional: as larvas não chegam a “desviar" o metabolismo celular para seu proveito e, portanto, não podem completar o seu ciclo. No segundo caso, certas larvas chegam a iniciar e manter sincício alimentar de baixa qualidade e, portanto, transformam-se principalmente em machos, que exigem menos aporte de energia.

[0033] A expressão “efeito nematicida de plantas”, ação nematicida ou poder nematicida de plantas indica principalmente a capacidade daquela planta de reduzir a população de nematoides presentes no meio ou, alternativamente, a capacidade de reduzir a população correspondente a um estágio de desenvolvimento do mencionado nematoide, tal como a redução da quantidade de larvas no estágio J2, ou, alternativamente, a redução da quantidade de cistos. O efeito nematicida de acordo com a presente invenção refere-se especificamente ao nematoide do cisto Heterodera carotae. O efeito ou poder nematicida também indica a capacidade de masculinização de mais de 50% das larvas de nematoides. Planta com efeito nematicida é, portanto, uma planta que restringe o crescimento ou o desenvolvimento do nematoide em comparação com uma planta Daucus carota subsp. sativus sob condições de cultivo similares. Deve-se observar que o efeito nematicida de acordo com a presente invenção não é derivado do próprio método de cultivo, mas sim da capacidade da planta de restringir a multiplicação e o desenvolvimento do nematoide, ao contrário do cultivo de captura de cenoura, em que a cenoura serve apenas para atrair e canalizar os nematoides, de forma que eles possam ser eliminados mais facilmente em seguida, arrancando-se a cenoura. O efeito ou poder nematicida de acordo com a presente invenção é obtido, portanto, por meio de um mecanismo de resistência das mencionadas plantas ao nematoide do cisto Heterodera carotae.

[0034] O efeito ou poder nematicida de uma planta contra Heterodera carotae pode, por exemplo, ser testado in vitro conforme descrito no Exemplo 1B, por meio da inoculação de larvas de Heterodera carotae diretamente sobre o ápice de sementes germinadas e contando-se a quantidade de larvas ou a proporção entre fêmeas e machos após quinze a vinte dias.

[0035] Preferencialmente, o poder nematicida de plantas é demonstrado por meio de plantio das sementes em um vaso cheio com terra, com quantidade média de quinze larvas por grama de solo; a planta será considerada resistente a Heterodera carotae ou, alternativamente, possuidora de poder nematicida contra Heterodera carotae se, em noventa dias após o plantio, apresentar menos de dez fêmeas, larvas e/ou cistos nas raízes. A implementação deste teste é especialmente detalhada no Exemplo 2 do capítulo experimental.

[0036] Em uma população, uma população de plantas é considerada geralmente resistente a Heterodera carotae ou possuindo poder nematicida global contra Heterodera carotae se pelo menos 70% das plantas que constituem a população forem resistentes ou possuírem poder nematicida conforme definido acima, preferencialmente pelo menos 75% e, de maior preferência, pelo menos 80%. Uma população de plantas resistente ou que possui poder nematicida preferencialmente não inclui plantas reprodutoras, particularmente nenhuma planta que apresente mais de cem larvas nas raízes em noventa dias após o plantio em solo que compreende, em média, quinze larvas ou cistos por grama de solo.

[0037] A expressão “redução suficiente do nível de infestação” de um campo de cultivo pelo nematoide do cisto Heterodera carotae a fim de permitir o cultivo de cenouras indica a redução do nível de infestação de Heterodera carotae abaixo da quantidade de larvas J2 que causa o surgimento de danos ao cultivo. Esse limite é geralmente de uma larva J2 de nematoide por grama de solo ou, alternativamente, um cisto de nematoide por grama de solo.

[0038] Em primeiro aspecto, a presente invenção refere-se, portanto, ao uso de plantas da espécie Daucus carota para tratar solo ou meio de cultivo infestado ou susceptível de infestação por nematoides, mais especificamente nematoides do cisto e, de maior preferência, Heterodera carotae, com vistas à sua desinfecção. A planta utilizada de acordo com a presente invenção é uma planta que apresenta efeito ou poder nematicida, particularmente contra o nematoide Heterodera carotae. Segundo uma realização particularmente preferida da presente invenção, a mencionada planta é uma cenoura Daucus carota que não pertence à subespécie de cenouras cultivadas Daucus carota subsp. sativus.

[0039] A expressão “efeito nematicida da planta”, conforme as definições acima, indica particularmente a capacidade de redução da quantidade de larvas J2 juvenis que infestam um meio ou a capacidade de reduzir a quantidade de cistos ou, alternativamente, a capacidade de causar masculinização de mais de 50% das larvas do nematoide Heterodera carotae que infestam um meio. Ela pode também definir uma combinação dessas propriedades, tal como a capacidade de reduzir a quantidade de larvas J2 e o número de cistos ou, alternativamente, a capacidade de reduzir a quantidade de J2 e causar a masculinização; ou, por fim, a combinação dessas três propriedades.

[0040] Preferencialmente, a masculinização causada pelo uso de acordo com este aspecto da presente invenção é a masculinização de mais de 60%, preferencialmente mais de 70% ou até mais de 80% da população de larvas de Heterodera carotae infestantes.

[0041] Deve-se observar que o poder ou efeito nematicida é próprio da planta ou semente e não é o resultado do método de cultivo; particularmente, ele não é causado por arrancar precocemente as plantas ou, alternativamente, pelo cultivo sob condições de irrigação insuficientes, que, como se sabe, causam redução da população de nematoides que infestam o solo ou, alternativamente, o meio de cultivo.

[0042] Esta capacidade nematicida é preferencialmente observada durante um período de cultivo das mencionadas cenouras de pelo menos três meses, preferencialmente pelo menos quatro meses, por exemplo cinco meses ou, na verdade, seis meses, ou até mais de seis meses.

[0043] Conforme mencionado, de acordo com uma realização particularmente preferida da presente invenção, a planta utilizada é uma cenoura Daucus carota que não pertence à subespécie Daucus carota subsp. sativus; a cenoura utilizada para desinfecção não é, portanto, cenoura comercial, não se destina a ser colhida para comercialização como alimento, particularmente humano e, portanto, não se destina a consumo. A cenoura nematicida utilizada no contexto da presente invenção deve ser considerada produto desinfetante ou fitossanitário, utilizado para desinfetar solo ou meio de cultivo infestado com nematoides Heterodera carotae ou susceptível a infestação com eles.

[0044] Particularmente, pode ser uma planta pertencente à subespécie Daucus carota dentatus ou uma planta obtida dessa subespécie ou de outra subespécie selvagem. Particularmente, pode ser uma planta híbrida em que pelo menos um dos dois pais é uma cenoura denominada silvestre, que não pertence à subespécie cultivada Daucus carota subsp. sativus; ela pode ser, por exemplo, uma planta nematicida em que pelo menos um dos dois pais é uma cenoura Daucus carota dentatus.

[0045] Segundo uma realização mais especificamente preferida, as cenouras utilizadas no contexto deste uso são plantas obtidas de sementes depositadas no NCIMB com o número de acesso NCIMB 42351.

[0046] Os inventores do presente obtiveram, de fato, plantas que apresentam resistência muito alta ao nematoide do cisto Heterodera carotae, conforme ilustrado no capítulo experimental. As mencionadas plantas possuem ação nematicida dupla, não apenas em nível de desenvolvimento do sincício, mas também de machos e larvas J2 que aparentemente são bloqueados no nível das raízes (necroses). Em Heterodera carotae, bloqueio do sincício favorece o surgimento de nematoides machos, em detrimento do surgimento de nematoides fêmeas. A população de fêmeas é reduzida drasticamente e a possibilidade de formação de novos cistos ao longo das gerações é, portanto, reduzida de forma similar. Adicional e ainda mais surpreendentemente, os inventores constataram que os nematoides machos e J2 também são aparentemente bloqueados na raiz (necroses). Se eles não conseguirem sair da raiz, não podem fertilizar as fêmeas e estas não produzirão ovos. O ciclo é novamente interrompido, de forma que a ação nematicida dupla das plantas seja conforme descrito no capítulo experimental.

[0047] Sementes que permitem a obtenção de plantas de Daucus carota que possuem as mencionadas propriedades nematicidas foram depositadas pela empresa Vilmorin, Route Le Manoir, 49250 La Ménitré, França, de acordo com as exigências do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-Organismos para Fins de Processamento de Patentes em 20 de janeiro de 2015, na Coleção Nacional de Bactérias Industriais, Alimentícias e Marinhas (NCIMB) (NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Reino Unido), sob o número de acesso NCIMB 42351, com a referência Daucus carota DCHR1.

[0048] Segundo uma realização particularmente preferida, as plantas utilizadas para desinfecção de acordo com a presente invenção são plantas desenvolvidas a partir de sementes NCIMB 42351 ou, alternativamente, plantas obtidas ou derivadas dessas sementes, após propagação ou cruzamento e seleção. As plantas utilizadas podem ser particularmente plantas Daucus carota derivadas de plantas originárias de sementes depositadas com o número NCIMB 42351. O presente relatório descritivo fornece todas as informações necessárias para a seleção de plantas que possuem o poder nematicida no contexto de um programa de seleção.

[0049] O presente pedido também não é limitado, de nenhuma forma, a plantas obtidas de sementes como as depositadas. De fato, conforme descrito no Exemplo 1 do presente pedido, muitos genótipos selvagens são susceptíveis a também apresentar resistência ao nematoide Heterodera carotae, em que essa resistência pode ser utilizada, de acordo com o ensinamento da presente invenção, para desinfetar solo ou meio de cultivo.

[0050] As plantas utilizadas no contexto da presente invenção podem ser uma população de plantas nematicidas, ou seja, pelo menos 70% das plantas da mencionada população realmente possuem essa capacidade nematicida e, preferencialmente, pelo menos 80 a 90% das plantas ou até mais. Não se exclui, portanto, que certas plantas entre a população não possuam sua própria capacidade nematicida. Preferencialmente, entretanto, a população compreende apenas percentual muito pequeno, menos de 5%, menos de 2 ou 1% de plantas que são reprodutoras do nematoide.

[0051] O solo ou meio de cultivo infestado ou susceptível de infestação pode ser qualquer meio apropriado para o cultivo de cenouras. Ele pode ser particularmente terra, areia ou um terreno que compreende mistura de terra e areia. Meio de cultivo é considerado infestado se compreender cistos do nematoide Heterodera carotae, ou se compreender esses nematoides em qualquer outro estágio de desenvolvimento, tal como se compreender jovens J2. Um campo ou meio de cultivo é geralmente considerado infestado quando o mencionado campo ou meio de cultivo compreender pelo menos uma larva J2 de nematoide por grama de solo ou, alternativamente, um cisto. Além desse limite, considera-se realmente necessário desinfetar antes do cultivo de cenouras comerciais destinadas a alimentação.

[0052] O uso de acordo com a presente invenção também é aplicável, entretanto, a qualquer solo ou meio de cultivo que seja susceptível a infestação. Pode-se idealizar, por exemplo, a operação de um ciclo de desinfecção com plantas nematicidas no contexto de um plano de rotação de cultivos. Pode-se também idealizar a condução dessa desinfecção sistematicamente antes de qualquer cultivo de cenoura comercial ou com vistas à comercialização do próprio meio de cultivo.

[0053] Para implementar o uso conforme descrito acima, portanto, é possível conduzir desinfecção ou desinfestação de meio de cultivo infestado pelo nematoide e, portanto, reduzir a população de nematoides no mencionado meio de cultivo em pelo menos 40%, preferencialmente pelo menos 50%, de maior preferência pelo menos 60% e, mais especificamente, pelo menos 75%. Dever-se- á observar, entretanto, que o nível de redução da população de nematoides conduzida por meio do uso de plantas nematicidas de acordo com a presente invenção é função do nível de infestação inicial do meio de cultivo, do tempo de cultivo das plantas nematicidas e também da densidade das plantas nematicidas.

[0054] Preferencialmente, conforme detalhado acima, as plantas nematicidas de acordo com a presente invenção são cultivadas por um período de cultivo de pelo menos três meses, a fim de gerar o maior poder nematicida e preferencialmente pelo menos quatro meses, até cinco meses ou até seis meses. É importante observar que esse período de cultivo é diferente do período de cultivo geralmente empregado no contexto do uso de armadilhas de cenouras. De fato, nessa situação, a cenoura cultivada deve ser removida do solo após acionar a eclosão dos cistos presentes no meio de cultivo, mas antes da formação de novos cistos ou da saída de muitos nematoides machos das raízes. O uso de plantas nematicidas conforme descrito no contexto da presente invenção é, por outro lado, mais eficaz se a cenoura nematicida permanecer no meio por muito tempo, preferencialmente até que a maturação completa das raízes, ao longo de várias gerações de nematoides.

[0055] De forma similar, as plantas nematicidas são plantadas em densidade de sementes comparável ou superior à utilizada para variedades de cenouras cultivadas para consumo. Densidades particularmente apropriadas no contexto da presente invenção encontram-se especialmente na faixa de 0,8 a 4 milhões de sementes por hectare, preferencialmente de 0,8 a 2,5 milhões de sementes por hectare. Densidades deste tipo podem, de fato, gerar desinfecção ideal do meio de cultivo.

[0056] Segundo uma realização preferida da presente invenção, o uso de plantas nematicidas conforme descrito permite a redução do de cistos ou, alternativamente, de fêmeas de nematoides no meio de cultivo em pelo menos 50%. De fato, as plantas nematicidas de acordo com a presente invenção podem também ser utilizadas para causar masculinização importante da população de larvas, sem necessariamente causar redução da sua quantidade, pelo menos em primeiro lugar. A redução da quantidade de fêmeas para ganho das larvas machos, entretanto, causa redução importante da quantidade de cistos no meio de cultivo.

[0057] Preferencialmente, o uso conforme descrito permite redução do nível de infestação do meio de cultivo para menos de uma larva J2 fêmea de Heterodera carotae por grama de meio ou menos de um cisto de Heterodera carotae por grama de meio. Essa redução indica claramente que um meio de cultivo compreende inicialmente, antes da implementação do uso de acordo com a presente invenção, meio de cultivo que compreende mais de uma larva J2 fêmea ou mais de um cisto de Heterodera carotae por grama de meio, tal como pelo menos cinco larvas J2 fêmeas e/ou cistos de Heterodera carotae por grama de meio, por exemplo cerca de dez larvas J2 e/ou cistos por grama de meio ou até mais de dez larvas J2 e/ou cistos por grama. Solos infestados podem, na verdade, conter mais de 30 ou até mais de 50 larvas J2 e/ou cistos por grama.

[0058] As cenouras obtidas de sementes depositadas com número NCIMB 42351 permitem especialmente a obtenção das realizações preferidas descritas acima e, mais especificamente, a redução da quantidade de larvas J2 jovens e/ou a redução da quantidade de cistos e/ou masculinização de mais de 50% das larvas do nematoide Heterodera carotae durante período de cultivo de pelo menos quatro meses, bem como redução da população de nematoides Heterodera carotae no meio de cultivo de pelo menos 60%, de maior preferência pelo menos 75%, redução de pelo menos 50% da quantidade de cistos ou fêmeas de nematoides no meio de cultivo, bem como a redução do nível de infestação do meio de cultivo para menos de uma larva J2 fêmea de Heterodera carotae por grama de meio, conforme descrito acima. Essas plantas são, por exemplo, plantas obtidas por meio de germinação das sementes depositadas NCIMB 42351 ou, na verdade, por meio de seleção de plantas com as propriedades esperadas de plantas obtidas das sementes depositadas após um ou mais cruzamentos.

[0059] O uso de plantas nematicidas conforme descrito na presente invenção permite garantir desinfecção que não só é apropriada do ponto de vista ecológico e ambiental, mas também é reproduzível, específica e de fácil implementação. De fato, o uso, por exemplo, de certas armadilhas dificilmente oferece desinfecção reproduzível. Além disso, se, sob algumas condições, o cultivo de cenouras comerciais puder reduzir o nível de infestação (vide o Exemplo 9), esta redução não é reproduzível de nenhuma forma (vide o Exemplo 7, com a mesma variedade comercial).

[0060] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção também se refere a um método que permite a desinfecção de solo ou meio de cultivo ou a redução da população de nematoides, mais especificamente nematoides de cistos, especificamente Heterodera carotae em solo ou meio de cultivo infestado, ou susceptível de infestação pelo nematoide do cisto Heterodera carotae. O mencionado método de desinfecção ou desinfestação é baseado originalmente no cultivo de plantas Daucus carota, em que as mencionadas plantas possuem efeito nematicida sobre esses nematoides.

[0061] Segundo uma realização mais especificamente preferida, o mencionado método de desinfecção não inclui uma etapa de aplicação de produto químico com efeito nematicida, tal como 1,3-dicloropropeno ou seus derivados, em qualquer de suas formas. Consequentemente, a desinfecção é unicamente o resultado da ação nematicida das plantas cultivadas.

[0062] Segundo outra realização, o método de desinfecção ou desinfestação de acordo com a presente invenção pode ser acompanhado, precedido, seguido ou completado pela aplicação de um produto químico nematicida. Neste caso, a principal etapa de cultivo de plantas nematicidas permite a redução da dose de produto químico nematicida que teria sido necessária para uso a fim de obter nível de desinfecção comparável na ausência do cultivo de plantas nematicidas. No contexto da presente realização, o cultivo de plantas de acordo com a presente invenção e a aplicação de produto químico nematicida podem ser simultâneos, sucessivos ou, de fato, total ou parcialmente sobrepostos; a ordem das etapas não é um fator determinante.

[0063] A redução da população de nematoides Heterodera carotae em solo ou meio de cultivo infestado ou susceptível a infestação pelo nematoide indica preferencialmente redução da quantidade de cistos do mencionado nematoide no solo ou meio de cultivo, redução de jovens J2 ou redução cumulativa da quantidade de cistos e da quantidade de jovens J2 no meio de cultivo.

[0064] Preferencialmente, as plantas cultivadas no contexto do presente método de desinfecção não pertencem à subespécie de cenouras cultivadas Daucus carota subsp. sativus.

[0065] Realizações preferidas detalhadas no contexto dos vários usos segundo o primeiro aspecto da presente invenção também são aplicáveis aos métodos de acordo com este segundo aspecto da presente invenção. Particularmente, o método é preferencialmente conduzido com plantas nematicidas da subespécie Daucus carota dentatus ou plantas derivadas de cenouras da subespécie Daucus carota dentatus derivadas, por exemplo, de cruzamento inicial entre uma planta Daucus carota dentatus e uma planta Daucus carota sativus.

[0066] Com relação aos diversos usos da presente invenção, os métodos também são preferencialmente conduzidos com cenouras que são obtidas ou derivadas de sementes depositadas pela Vilmorin junto ao NCIMB em 20 de janeiro de 2015 com o número de acesso NCIMB 42351. Plantas deste tipo são obtidas, por exemplo, por meio de germinação direta das mencionadas sementes depositadas. Elas podem também referir-se a plantas que são obtidas por meio da propagação de cenouras derivadas da germinação de sementes depositadas junto ao NCIMB ou obtidas por meio de cruzamento com outras plantas, preferencialmente da espécie Daucus carota. Plantas deste tipo são descritas no capítulo experimental do presente pedido. Plantas nematicidas úteis nos métodos de acordo com a presente invenção também são plantas regeneradas, opcionalmente in vitro, a partir de células de plantas obtidas por meio de germinação das sementes depositadas com o número NCIMB 42351.

[0067] Os métodos de acordo com a presente invenção não se limitam, de nenhuma forma, a plantas nematicidas derivadas de sementes depositadas com o número de acesso; podem ser utilizadas outras plantas de Daucus carota com poder nematicida, que não são Daucus carota sativus e são particularmente identificáveis conduzindo-se os testes descritos nos exemplos do capítulo experimental.

[0068] Como já mencionado, as plantas utilizadas no contexto da presente invenção podem ser uma população de plantas nematicidas.

[0069] O solo ou meio de cultivo infestado ou susceptível de infestação é o descrito para os usos de acordo com a presente invenção. Ele é preferencialmente um campo e pode ser terra, areia, uma mistura de ambos ou um terreno arenoso.

[0070] Conduzindo-se o método de acordo com a presente invenção, portanto, é possível conduzir desinfecção ou desinfestação de solo ou meio de cultivo infestado pelo nematoide e, portanto, reduzir a população de nematoides no mencionado meio de cultivo em pelo menos 40%, preferencialmente pelo menos 50%, de maior preferência pelo menos 60% e, mais especificamente, pelo menos 75%. Por meio deste método, portanto, é possível reduzir o nível de infestação do solo ou meio de cultivo para menos de uma larva J2 fêmea e/ou cisto de Heterodera carotae por grama de meio, ou seja, abaixo do limite correspondente a um meio que se afirma ser “infestado”. O método é preferencialmente conduzido sobre um meio de cultivo que compreende mais de uma larva J2 e/ou cisto por grama de meio, preferencialmente pelo menos cinco larvas J2 e/ou cistos por grama de meio, cerca de 10 ou mais larvas J2 e/ou cistos por grama de meio ou até 20, 25, 50 ou mais.

[0071] Segundo uma realização preferida da presente invenção, o método permite a redução da quantidade de cistos ou, alternativamente, de fêmeas de nematoides no meio de cultivo em pelo menos 50%. A redução da quantidade de fêmeas pode dever-se à redução geral da quantidade de nematoides ou à proporção reduzida de fêmeas com relação aos machos. De fato, as plantas nematicidas de acordo com a presente invenção podem causar masculinização importante da população de larvas sem necessariamente causar redução imediata das suas quantidades, pelo menos inicialmente. A redução da quantidade de fêmeas para ganho da quantidade das larvas machos causa, entretanto, redução drástica da quantidade de cistos no solo ou meio de cultivo.

[0072] O método de acordo com a presente invenção compreende o cultivo de plantas nematicidas por pelo menos três meses e, preferencialmente, por um período de pelo menos quatro meses, preferencialmente pelo menos cinco meses e, de maior preferência, pelo menos seis meses. Conforme descrito com relação aos usos de acordo com a presente invenção, este período de cultivo é muito diferente dos períodos de cultivo aplicáveis no contexto de cultivo de armadilhas de cenouras, em que a manutenção das armadilhas de cenouras por mais de três meses resulta na multiplicação da quantidade de cistos ou larvas infestantes em vez de reduzi-los. O método de acordo com a presente invenção, por outro lado, é de implementação muito mais fácil porque as cenouras nematicidas podem ser removidas a qualquer momento, preferencialmente após quatro meses, sem efeito prejudicial sobre o nível de infestação. Na verdade, independentemente do momento em que elas são arrancadas, mas preferencialmente após três meses, será sempre obtida redução do nível de infestação do meio de cultivo. O efeito nematicida ideal é obtido quando houver sido conduzido período de cultivo aproximado correspondente a um ciclo de cultivo completo para uma variedade comercial de cenoura D. carotae, ou seja, cerca de seis meses. Bom efeito nematicida já é observado, entretanto, após três meses de cultivo, preferencialmente após quatro meses. O momento de colheita ideal, considerando, por um lado, a ausência de produção comercial durante o período de cultivo das cenouras nematicidas e, por outro lado, o efeito nematicida ideal, aparentemente é de quatro a seis meses. Claramente, esse período ideal necessita ser determinado considerando também a probabilidade de infestação do meio de cultivo e seu nível de infestação.

[0073] Segundo o presente método, as plantas nematicidas são plantadas em densidade de sementes comparável ou superior à utilizada para cenouras denominadas comerciais, cultivadas para consumo. Densidades particularmente apropriadas no contexto da presente invenção, quando realizada nos campos, são particularmente de 0,8 a 4 milhões de sementes por hectare, preferencialmente de 0,8 a 2,5 milhões de sementes por hectare. Densidades deste tipo permitem, de fato, gerar desinfecção ideal do meio de cultivo. Outras densidades podem ser idealizadas, entretanto, particularmente quando forem utilizadas pequenas quantidades de meio de cultivo ou, na verdade, quando o nível de infestação for particularmente alto ou, alternativamente, particularmente baixo. A densidade pode também ser adaptada em função da composição do meio de cultivo.

[0074] Durante a condução da presente invenção, o cultivo das cenouras nematicidas pode ser iniciado em qualquer momento oportuno, dependendo dos cultivos anteriores e posteriores ao cultivo das cenouras nematicidas. Segundo realizações preferidas, o mencionado cultivo é, por exemplo, iniciado no outono ou no inverno, a fim de fornecer o melhor rendimento nematicida e/ou o menor impacto sobre a rentabilidade. Dependendo do clima ou de outras restrições, tais como restrições econômicas, o cultivo pode, entretanto, ser iniciado em outros momentos caso resulte apropriado, necessário ou desejável. O cultivo é preferencialmente iniciado pelo plantio das sementes, embora se possa também idealizar o repique das plantas.

[0075] O método de acordo com a presente invenção permite a obtenção de redução da população de nematoides, particularmente fêmeas, de Heterodera carotae em meio de cultivo infestado essencialmente graças às propriedades nematicidas das plantas cultivadas. Conforme detalhado mais acima, esta característica do método é particularmente diferenciada do cultivo de armadilhas de cenoura, em que a redução da população de nematoides é relacionada ao método de cultivo e, mais especificamente, ao tempo de colheita, mas não às plantas cultivadas.

[0076] Certas medidas podem, entretanto, ser consideradas no contexto da presente invenção, a fim de amplificar a redução da população de nematoides; particularmente, certas condições de cultivo ou, alternativamente, certos fertilizantes ou outros podem ser aplicados, a fim de amplificar o efeito nematicida causado pelas plantas nematicidas de acordo com a presente invenção. Particularmente, as plantas podem ser opcionalmente cultivadas sob condições higrométricas insuficientes, pois sabe-se que certo ressecamento do meio de cultivo contribui para reduzir a população de nematoides Heterodera carotae.

[0077] Alternativamente, o método pode ser conduzido sob condições higrométricas que são satisfatórias para o cultivo de cenouras comerciais.

[0078] Cenouras obtidas de sementes depositadas com o número NCIMB 42351 permitem particularmente a obtenção de realizações preferidas descritas acima para os vários métodos de acordo com a presente invenção, particularmente plantas obtidas por meio de germinação das sementes depositadas.

[0079] Segundo outro aspecto, a presente invenção também se refere a uma população de plantas de Daucus carota ou uma população de sementes de cenoura Daucus carota derivadas ou obtidas de sementes depositadas com o número de acesso NCIMB 42351, em que a mencionada população ou as mencionadas cenouras apresenta(m) efeito nematicida sobre os nematoides, particularmente nematoides do cisto, especificamente Heterodera carotae. O efeito nematicida é conforme descrito no presente pedido. Plantas provenientes de sementes depositadas são particularmente plantas obtidas por meio de germinação das mencionadas sementes. Plantas ou sementes derivadas ou obtidas de sementes depositadas também englobam plantas ou sementes obtidas por meio de cruzamento ou propagação de plantas obtidas por meio da germinação de plantas depositadas, bem como todas as plantas derivadas de plantas obtidas por meio de germinação de sementes depositadas, com a condição, entretanto, de que elas possuam poder nematicida e, particularmente, o poder nematicida descrito para as plantas correspondentes às sementes depositadas e ilustradas no capítulo experimental do presente pedido.

[0080] A presente invenção também se refere a fragmentos dessas plantas, germens, material reprodutivo e células dessas plantas, que podem ser regenerados para obter plantas resistentes ou nematicidas de acordo com a presente invenção.

[0081] Realizações preferidas da presente invenção já foram descritas no contexto dos aspectos acima da presente invenção; elas são também aplicáveis a este aspecto da presente invenção. Particularmente, o efeito nematicida das plantas de acordo com a presente invenção é preferencialmente redução da quantidade de jovens J2 e/ou redução da quantidade de cistos e/ou masculinização de mais de 50% das larvas do nematoide Heterodera carotae, preferencialmente ao longo de um período de cultivo para as mencionadas cenouras de pelo menos três meses.

[0082] A mencionada população compreende pelo menos 70% das plantas que possuem individualmente poder nematicida conforme descrito ou 70% de sementes que geram essas plantas. Preferencialmente, a proporção é de mais de 70%, por exemplo pelo menos 80% ou até pelo menos 90% ou mais.

[0083] Preferencialmente, entretanto, a população compreende apenas percentual muito pequeno de menos de 5%, menos de 2% ou 1% de plantas reprodutoras do nematoide ou sementes que geram essas plantas.

[0084] Conforme detalhado acima, a presente invenção é ilustrada pelas plantas Daucus carota identificadas pelos inventores e apresentam resistência ao nematoide, particularmente ao nematoide do cisto Heterodera carotae; a presente invenção não se limita, entretanto, ao genótipo identificado pelos inventores. De fato, outras plantas que também apresentam poder nematicida podem ser facilmente identificadas pelos técnicos no assunto. Com este propósito, um teste apropriado para determinar o poder nematicida de uma planta ou população, ou para selecionar plantas que possuam esse poder é o seguinte:- plantio das sementes a serem testadas em um vaso cheiocom terra infestada com cerca de 10 a 15 larvas de Heterodera carotae por grama de solo;- manutenção do cultivo por 70 a 90 dias sob condiçõesnormais de cultivo normais; e- 70 a 90 dias após o plantio, retirada das plantas e contagemda quantidade de fêmeas J2 nas raízes.

[0085] Plantas que possuem poder nematicida de acordo com a presente invenção são preferencialmente plantas com 0 a 10 fêmeas nas raízes no final desse teste. Por outro lado, plantas com mais de cem fêmeas nas raízes serão consideradas plantas reprodutoras.

[0086] Utilizando este protocolo, é fácil identificar plantas nematicidas ou selecionar plantas nematicidas, particularmente em um programa de seleção.

[0087] A presente invenção também se refere a um produto fitossanitário que permite a desinfecção ou desinfestação de solo ou meio de cultivo, em que o mencionado produto compreende plantas nematicidas ou resistentes conforme descrito no contexto da presente invenção. Todas as características descritas acima podem ser aplicadas a este aspecto da presente invenção.

[0088] Particularmente, o produto fitossanitário mencionado pode compreender uma população de plantas ou sementes de D. carota e, preferencialmente, que não seja da subespécie Daucus carota sativus, pelo menos 70% das quais possuem capacidade ou poder nematicida.

[0089] É particularmente vantajoso que o produto fitossanitário não compreenda plantas reprodutoras conforme descrito acima.

[0090] A presente invenção é, portanto, caracterizada, entre outros, pelo fato de cultivar ou utilizar plantas de D. carota não comerciais, ou seja, elas não se destinam a ser colhidas para alimentação, particularmente para alimentação humana, e explorar a resistência dessas plantas a Heterodera carotae para obter efeito nematicida, o que permite a desinfecção de campos infestados por esse nematoide.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0091] Fig. 1: o gráfico ilustra, para diversas combinações híbridas obtidas de genótipos identificados no Exemplo 1, bem como para a variedade sensível Nanco, a distribuição da quantidade de fêmeas de Heterodera carotae por planta, a quantidade média de fêmeas por planta e o percentual de plantas com menos de dez fêmeas de Heterodera carotae.

[0092] Fig. 2: a tabela indica, para as duas linhagens F2 obtidas por meio do genótipo de HCR10, a distribuição da quantidade média de fêmeas por planta ao longo de dois anos de cultivo.

[0093] Figs. 3 e 4: estas figuras descrevem a quantidade média de fêmeas presentes nas raízes, cerca de 80 a 90 dias após o plantio em meio de cultivo infestado retirado de cinco zonas geográficas distintas em campos de produção infestados por Heterodera carotae em Créance, na Mancha, Plouhinec, em Morbihan, Machecoul, em Vendée, Carpentras, em Vaucluse, e Lambesc, em Bocas do Ródano. O seu nível de contaminação variou de 4,46 a 13,86 larvas J2 por grama de solo.

[0094] A Figura 3 refere-se a plantios no dia 3 de maio com leitura em 19 de julho, enquanto a Figura 4 refere-se a plantios no dia 28 de maio com leitura no dia 24 de agosto.

[0095] Fig. 5: a Figura 5 ilustra os resultados exibidos na Tabela 2. Ao longo da abscissa, encontram-se os diversos genótipos A a I testados. Na ordenada, encontra-se o percentual de plantas em um genótipo pertencente a cada uma das nove classes a seguir: 0; 1 a 5 fêmeas; 5 a 10 fêmeas; 10 a 20 fêmeas; 20 a 30 fêmeas; 30 a 40 fêmeas; 40 a 50 fêmeas; 50 a 100 fêmeas e 100 a 1000 fêmeas.

[0096] Fig. 6: a Figura 6 ilustra o grau de multiplicação de cistos no solo de vasos em que diversos lotes de sementes, susceptíveis e resistentes, foram cultivados, após quatro meses e seis meses de cultivo. O nível de infestação no momento do plantio é idêntico em cada vaso. “% Tm” indica o nível de multiplicação dos cistos no solo.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS RESISTENTES A HETERODERA CAROTAE

[0097] Os inventores procederam em três etapas sucessivas.

[0098] Em primeiro lugar, eles testaram mais de 3700 plantas diferentes de diversas origens genéticas e geográficas, por meio de um teste de inoculação de raízes. Apenas as plantas que não apresentam nematoide fêmea de Heterodera carotae, particularmente que não apresentam cistos, foram retidas para a segunda análise (teste de confirmação da resistência in vivo).

a. OBTENÇÃO DE JOVENS DE HETERODERA CAROTAE (J2)

[099] Os cistos foram recolhidos em canteiros infectados na baixa Normandia e multiplicados em estufas antes de serem armazenados a 4 °C até o uso. Os cistos foram umedecidos em seguida em água por 24 horas antes de serem transferidos para exsudado de raízes de cenouras e depositados em câmara climatizada a 20 °C. As larvas, no máximo com uma semana de idade, foram recuperadas e armazenadas a 4 °C em água.

b. DESCONTAMINAÇÃO DE SEMENTES DE CENOURA E INOCULAÇÃO DE LARVAS DE HETERODERA CAROTAE (ETAPA 1)

[0100] Conduziu-se descontaminação de sementes de cenoura a 52 °C em banho-maria por 18 minutos em água estéril com adição de 10% de SDS. As sementes foram enxaguadas em seguida em água estéril e depositadas sobre meio de gelose a 1,5%.

[0101] As sementes germinadas foram transferidas individualmente para uma placa de Petri sobre meio de gelose suplementado com microelementos, meio MS (Murashige, T. e Skoog, F. (1962)). Jovens em estágio J2 de Heterodera carotae foram inoculados sobre as plantículas com comprimento de raízes de 1 a 2 cm.

[0102] Sete J2 foram depositados sobre o ápice da raiz utilizando um pincel fino. As placas foram mantidas em laboratório por 48 horas antes de serem depositadas em uma câmara climatizada a 20 °C com período de luz de 16 horas.

[0103] Para cada genótipo (planta) testado, 60 sementes foram germinadas. A quantidade de plantas realmente avaliadas (inoculadas) para determinar sua resistência dependeu, portanto, do grau de germinação obtido nas placas de Petri.

[0104] Daucus carota sativus híbrido comercial sensível ao nematoide de cisto foi utilizado como controle sensível. A variedade Nanco foi selecionada para este propósito como controle sensível.

[0105] A leitura das placas foi realizada em 15 a 20 dias após a inoculação com os jovens em segundo estágio (J2). Foram retidas todas as plantas que não haviam permitido o desenvolvimento de nematoides ou que haviam permitido apenas o desenvolvimento de machos. As plantas com fêmeas foram eliminadas.

c. TESTES DE CONFIRMAÇÃO DA RESISTÊNCIA (ETAPAS 2 E 3): ETAPA 2

[0106] As plantas retidas ao final do teste in vitro foram replantadas em vasos com uma mistura de terra e areia para serem testadas por segunda vez in vivo em solo natural contaminado com cistos de Heterodera carotae.

[0107] O dispositivo foi constituído por um tubo de PVC com 20 cm de altura e 4,5 cm de diâmetro contendo solo arenoso (70% de areia e 30% de terra). O conjunto foi colocado sobre um leito de areia de Fontainebleau e mantido úmido para garantir umidade constante. As plantas foram arrancadas em contato com um pacote de dez cistos de Heterodera carotae obtido da mesma população do teste in vitro. O pacote pode ser convenientemente substituído por meio da adição direta de larvas em solução à base de cada planta. O teste foi conduzido em estufa, sob condições de temperatura controlada de 20 °C ± 5 °C e período de luz de 16 horas.

[0108] Dois meses após o plantio, as plantas foram verificadas uma a uma para determinar sua resistência a Heterodera carotae observando as raízes, o que permite identificar a presença ou ausência de fêmeas, particularmente a presença ou ausência de cistos. As plantas com fêmeas desenvolvidas, particularmente cistos, foram automaticamente eliminadas porque eram susceptíveis; as demais foram retidas por serem potencialmente resistentes.

[0109] De 3720 plantas diferentes testadas, apenas 32 foram retidas nesta etapa.

ETAPA 3

[0110] Em terceiro lugar, as 32 plantas retidas foram inicialmente multiplicadas in vitro, segundo protocolos de embriogênese somática bem conhecidos dos técnicos no assunto; vide, por exemplo, Steward, F. C. et al (1958); e, em seguida, quatro clones de cada genótipo foram novamente colocados em vasos com uma mistura de terra e areia que contém cistos de Heterodera carotae de acordo com o teste da etapa 2. Apenas foram retidos os genótipos que não apresentaram nematoide de Heterodera carotae fêmea, particularmente nenhum cisto, sobre nenhuma das quatro plantas clonadas: 11 genótipos foram finalmente retidos ao final dessas três etapas sucessivas. Eles são apresentados na Tabela 1 abaixo.

TABELA 1

[0111] Genótipos testados que apresentam resistência a Heterodera carotae (HCR = resistência a Heterodera carotae):

[0112] Os inventores retiveram e multiplicaram esses 11 genótipos in vitro.

EXEMPLO 2 VALIDAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS RESISTENTES A HETERODERA CAROTAE

[0113] As 11 plantas retidas na etapa anterior foram cruzadas com plantas da cenoura cultivada Daucus carota sativus sensíveis a Heterodera carotae, a fim de estudar a capacidade de herança da resistência.

[0114] As plantas híbridas de primeira geração obtidas do cruzamento de genótipos resistentes com plantas de plantas de Daucus carota sativus sensíveis foram semeadas em vasos com terra removida de campos naturalmente infestados por Heterodera carotae. O nível médio de infestação de Heterodera carotae para essa terra foi de 16 larvas por grama de solo. Antes do plantio, as sementes foram descontaminadas em água a 51 °C por doze minutos. Os vasos foram colocados em estufa sob temperatura de 20 °C. Foram empregadas cem sementes por combinação híbrida produzida.

[0115] As plantas foram analisadas em 70 a 90 dias após o plantio; o sistema de raízes de cada planta foi cuidadosamente lavado e seguido por jato de água aplicado às raízes, a fim de separar as fêmeas adultas e em estágio J4.

[0116] Observou-se que 70% das plantas híbridas com o genótipo HCR10 como planta parental continham menos de dez fêmeas nas raízes. Os resultados são exibidos na Figura 1 para algumas combinações híbridas, bem como Nanco, a variedade sensível selecionada como controle: a tabela demonstra, para cada combinação híbrida, a distribuição da quantidade de fêmeas de Heterodera carotae por planta, a quantidade média de fêmeas de Heterodera carotae por planta e o percentual de plantas com menos de dez fêmeas de Heterodera carotae.

[0117] Somente plantas com quantidade reduzida de 0 a 5 larvas fêmeas de Heterodera carotae foram retidas e autopolinizadas para produzir plantas de segunda geração.

[0118] A segunda geração foi testada sob condições idênticas às dos testes da primeira geração, cultivada em vasos, em terra removida dos campos naturalmente infestados por Heterodera carotae. O nível médio de infestação de Heterodera carotae para essa terra foi de 55 larvas por grama de solo. O Nanco controle comportou-se como esperado, com mais de 97% das plantas controle testadas apresentando mais de 200 fêmeas de Heterodera carotae. A análise de plantas de segunda geração obtidas do genótipo de HCR10 exibiu altos níveis de resistência, em que mais de 80% das plantas contêm menos de cem fêmeas de Heterodera carotae. A análise foi repetida por dois anos, em que os resultados são substancialmente idênticos e apresentados na Figura 2. Esta figura ilustra, para duas linhagens F2 obtidas do genótipo HCR10, a distribuição da quantidade de fêmeas ao longo de dois anos.

[0119] Novamente, apenas as plantas que apresentam quantidade reduzida de larvas, mas, desta vez, 0 a 10 larvas fêmeas de Heterodera carotae foram retidas e autopolinizadas para produzir plantas de terceira geração.

[0120] De forma similar, as plantas de terceira geração foram cultivadas em vasos com terra removida de campos naturalmente infestados por Heterodera carotae. Somente foram retidas as plantas com quantidade reduzida de 0 a 10 fêmeas por planta de fêmeas de larvas de Heterodera carotae.

[0121] Durante os testes e gerações, os inventores identificaram o genótipo HCR10 como sendo fonte potencial de resistência a Heterodera carotae. A multiplicação de nematoides é muito restrita neste genótipo: não apenas as larvas são bloqueadas no estágio J2, mas também são altamente masculinizadas, o que demonstra ação nematicida das mencionadas plantas. As plantas de terceira geração com o genótipo HCR10 novamente foram fenotipicamente muito próximas do tipo selvagem; elas apresentam raízes brancas muito pouco tuberizadas com folhagem cerosa e brilhante, um hábito estabelecido.

EXEMPLO 3 ESTABILIDADE DA RESISTÊNCIA EM COMPARAÇÃO COM POPULAÇÕES DIFERENTES DE HETERODERA CAROTAE

[0122] As plantas de segunda geração obtidas a partir do genótipo HCR10 (F2.HCR10) foram utilizadas para esta análise: elas foram cultivadas em vasos com terra removida de campos naturalmente infestados, mas com diversas origens geográficas que representam várias zonas de cultivo francesas nas quais Heterodera carotae está presente. A variedade sensível Nanco foi utilizada como controle sensível.

[0123] As cinco populações de Heterodera carotae foram retiradas de campos de cultivo infestados com Heterodera carotae de Créance, na Mancha, de Plouhinec, em Morbihan, de Machecoul, em Vendée, de Carpentras, em Vaucluse, e de Lambesc, em Bocas do Ródano. O seu nível de contaminação variou de 4,46 a 13,86 larvas J2 por grama de solo.

[0124] As Figuras 3 e 4 descrevem a quantidade média de fêmeas presentes nas raízes. As plantas foram analisadas em cerca de 80 a 90 dias após o plantio. As plantas foram cuidadosamente arrancadas e, em seguida, o sistema de raízes de cada planta foi cuidadosamente lavado. Por fim, os cistos foram contados utilizando óculos amplificadores.

[0125] Este experimento demonstra que as plantas de segunda geração obtidas do genótipo HCR10 apresentam resistência contra as diferentes populações de Heterodera carotae testadas.

EXEMPLO 4 IDENTIFICAÇÃO DO MECANISMO DE RESISTÊNCIA

[0126] Clones de plantas resistentes foram arrancados em solo contaminado por cistos de Heterodera carotae. Os clones de um controle sensível serviram para monitorar a dinâmica de penetração do nematoide por meio de inspeção, em microscópio, dos raízes em diferentes momentos após o início do experimento. Os inventores constataram que as larvas foram bloqueadas no estágio J2 e também que elas foram fortemente masculinizadas.

EXEMPLO 5 TESTES DE ESTUFA E VALIDAÇÃO

[0127] O objeto desse experimento foi testar o nível de resistência de diferentes plantas:- plantas de segunda (F2.HCR10), terceira (F3.HCR10) equarta (F4.HCR10) geração descritas ou obtidas conforme descrito nos Exemplos 1 a 3 (genótipos A, B e E, respectivamente);- plantas de terceira geração provenientes de cruzamentosentre irmãos obtidas por meio de cruzamento de plantas de segunda geração com o genótipo HCR10, selecionadas pelo seu alto grau de resistência, com outra planta de segunda geração com o genótipo HCR10 selecionado pelo seu alto nível de resistência (genótipos C e D, correspondentes a AxA);- plantas híbridas obtidas por meio de cruzamento de planta desegunda geração com o genótipo HCR10 selecionado pelo seu alto nível de resistência com linhagens de machos de cenoura Daucus carota sativus férteis e sensíveis ao nematoide Heterodera carotae (genótipos F, G e H); e- o genótipo I, correspondente ao controle sensível Nanco.

[0128] As plantas foram semeadas em três séries distintas (com exceção de genótipos D e E, que foram cultivados em duas séries de três) em quantidade de cerca de vinte plantas por série para cada genótipo, em vasos de plástico (8*8*8) contendo cerca de 380 g de solo previamente homogeneizados em uma betoneira. O solo era naturalmente infestado, proveniente de Créance, na Mancha. A medida média do nível de infestação foi de 15 larvas J2 por grama de solo. Conduziu-se rega vaso a vaso, a partir de cima.

[0129] A leitura do teste foi realizada em 70 a 90 dias após o plantio, utilizando um método rápido de leitura: contagem de todas as fêmeas (incluindo cistos) de plantas com menos de cem fêmeas. A contagem foi suspensa acima desse valor de cem fêmeas e foi atribuído o valor “mais de 100” às plantas correspondentes.

[0130] Plantas que obtêm avaliação de menos de cinco fêmeas foram retidas e repicadas em uma mistura de terra e areia livre de contaminação.

[0131] As séries foram cultivadas em momentos distintos, de setembro a novembro.

[0132] Os resultados são exibidos na Tabela 2 que reúne, para cada série, as plantas em função do seu nível de infestação (“classes” de plantas com 0 fêmeas, 1 a 5 fêmeas, 5 a 10 fêmeas etc.). Desta forma, para o genótipo A, quatro plantas de 63 plantas testadas não continham fêmeas, 17 plantas continham de 1 a 5 fêmeas etc.

[0133] O genótipo A correspondeu ao genótipo resistente (planta de segunda geração resistente obtida do genótipo HCR10), enquanto o genótipo I correspondeu ao controle sensível.

[0134] Para as três séries, o nível de controle foi suficientemente alto para que o teste seja considerado discriminatório.

[0135] A média M representa a quantidade total de cistos contada para cada planta de cada série, dividida pela quantidade de plantas analisadas por genótipo.

[0136] A distribuição média entre as diferentes classes é ilustrada na Figura 5 para cada um dos genótipos testados.

TABELA 2

[0137] Quantidade de cistos por planta para diferentes genótipos:

[0138] Os resultados foram conforme segue, para cada genótipo testado: A: (F2.HCR10) genótipo controle resistente. Os resultados estavam de acordo com os obtidos nos testes anteriores, com alto nível de resistência (média geral ao longo das três séries de 21,4) e a presença de pequeno percentual de plantas reprodutoras (cerca de 10%) ao final da distribuição.B: (F3.HCR10, F3 derivada por meio de autofertilização dapopulação de F2.HCR10) genótipo de interesse para as três séries, em que cerca de 50% das plantas possuem menos de dez fêmeas. Será observada, entretanto, a presença de pequeno percentual de plantas reprodutoras (cerca de 10%) ao final da distribuição.E: (F4.HCR10, F4 derivado por meio de autofertilização dapopulação F3.HCR10) genótipo muito resistente (média geral das duas séries de 12,5). Observe-se a ausência total de plantas reprodutoras ao final da distribuição.

[0139] Observou-se, de uma geração para outra (F2, F3 e F4), aumento da resistência e redução da quantidade de plantas reprodutoras.C: perfil atípico com percentual de plantas praticamenteequivalente em todas as classes. Este tipo de perfil tende a indicar caráter oligogênico da resistência.D: genótipo muito resistente (média geral ao longo de duas sériesde 12,5). Observa-se ausência quase total de plantas reprodutoras ao final da distribuição.F, G e H: perfil idêntico ao do controle sensível I.

[0140] Esses três genótipos (F, G e H) foram obtidos a partir de cruzamento com linhagem de elite comercial susceptível a Heterodera carotae; os resultados demonstram que a resistência é recessiva.

[0141] Consequentemente, o cruzamento entre indivíduos obtidos a partir do genótipo HCR10 permitiu a obtenção de indivíduos homozigóticos para a característica de resistência no caso de resistência monogênica. Como a resistência é mais provavelmente oligogênica, entretanto, os inventores conduziram cruzamentos a fim de estabilizar descendência resistente.

EXEMPLO 6 TESTES DE RECIPIENTES

[0142] O objeto do presente experimento foi testar o poder nematicida de plantas de terceira geração com o genótipo HCR10.

[0143] Trinta plantas F3 foram plantadas em cinco linhas de plantio em recipientes (32*28*20 cm), que compreendem 18 cm de solo naturalmente infestado (proveniente de Créance). A infestação foi medida no início e no final do experimento, depois de arrancado, para cada recipiente. O experimento foi conduzido duas vezes.

[0144] Genótipo susceptível I (Nanco): seguindo as expectativas, observou-se aumento do nível de população de Heterodera carotae no solo depois de arrancar as cenouras. Este aumento foi ainda maior quando o tempo de presença do cultivo era mais longo (+32% e +159%), o que correspondeu à realização de geração adicional no caso da segunda data de colheita.

[0145] Genótipo B: nos dois casos, o nível da população foi reduzido em cerca de 50%. A redução foi mais notável com tempo de presença mais longo. Os resultados poderiam haver sido melhores se o genótipo utilizado houvesse sido geneticamente mais homogêneo: o teste do Exemplo 5 demonstra que cerca de 10% das plantas foram reprodutoras para este genótipo. Esses resultados são, entretanto, extremamente encorajadores e estão no nível dos obtidos no caso de cultivo de captura bem-sucedido, conduzido com uma variedade convencional. Com uma variedade convencional, entretanto, destruir a produção tarde demais causa efeito oposto ao pesquisado, ou seja, mantém ou aumenta a população, conforme confirmado com o genótipo sensível I.

[0146] Com outros genótipos (particularmente, os genótipos E ou D, livres de plantas reprodutoras), valores próximos aos obtidos no caso de desinfecção química (80-90%) devem poder ser obtidos neste teste.

EXEMPLO 7 VALIDAÇÃO DO PODER NEMATICIDA

[0147] Conduziu-se teste artificial em estufa, a fim de medir o nível do poder nematicida de cultivo de cenoura resistente a Heterodera carotae, identificado nos exemplos anteriores.

PROTOCOLO

[0148] Este teste foi conduzido em jardineiras contendo solo naturalmente contaminado da região de Créance (Normandia). O critério medido foi o nível de infestação do solo (número de cistos) no momento do plantio em diversas datas após o cultivo, o que permitiu a medição da taxa de multiplicação do nematoide Heterodera carotae ao longo do cultivo.

[0149] O dispositivo empregado foi do tipo aleatorização em blocos completos com duas repetições por genótipo.

[0150] Material vegetal testado:

[0151] Controle sensível: Nanco.

[0152] Plantas resistentes:- dois lotes diferentes de F3.HCR10 (genótipo B no Exemplo5): F3.HCR10a e F3.HCR10b; e- dois lotes diferentes de plantas obtidas de F3.HCR10 pormeio de multiplicação: F3.HCR10.Ma e F3.HCR10.Mb.

RESULTADOS

[0153] Os inventores observaram germinação muito ruim durante a realização deste teste: 33-34% para Nanco e 0-14% para as quatro linhagens F3 resistentes, incluindo 0% para a linhagem F3.HCR10b. Este baixo nível de germinação, observado para todas as plantas testadas, foi provavelmente relacionado às más condições durante a germinação.

[0154] Os inventores observaram que, com Nanco, o controle sensível, o aumento da população de nematoides foi de 430% após seis meses de cultivo, apesar das más condições de germinação.

[0155] Para as linhagens F3.HCR10a e F3.HCR10.Ma, observou- se redução do nível de infestação do solo de cerca de 20% (F3.HCR10.Ma) para cerca de 40% (F3.HCR10a) após seis meses de cultivo, apesar das más condições de germinação.

CONCLUSÃO

[0156] A capacidade nematicida é confirmada por este teste.

[0157] Considerando a germinação muito ruim durante este teste, entretanto, não foi possível traçar nenhuma conclusão precisa com relação ao nível do poder nematicida desse material resistente a Heterodera carotae.

EXEMPLO 8 CRIAÇÃO DE LOTES DE SEMENTES COM OS GENÓTIPOS MAIS RESISTENTES:

[0158] Conduziu-se multiplicação dos melhores F3s identificados em caixotes grandes e em um túnel de plástico (a fertilização é conduzida aleatoriamente pelos insetos), com vistas ao depósito de sementes, para obter:- uma população sintética criada por meio de intercruzamentodas plantas F3 mais resistentes; e- uma população F4.HCR10.M, correspondente àmultiplicação da linhagem F4.HCR10 descrita no Exemplo 5 para a qual foi confirmado o poder nematicida.

[0159] As sementes depositadas em 20 de janeiro de 2015 no NCIMB, com número de acesso NCIMB 42351 e a referência Daucus carota DCHR1, corresponderam à multiplicação da população F4.HCR10.M, denominada F4.HCR10.MM.

EXEMPLO 9 NOVA VALIDAÇÃO DO PODER NEMATICIDA EM JARDINEIRAS

[0160] Este teste foi conduzido a fim de testar o efeito nematicida de uma população de cenouras sobre Heterodera carotae. Ele foi conduzido em jardineiras, em que cada genótipo é testado em uma jardineira ao longo de duas fileiras. A fim de garantir a robustez do teste, foram realizadas duas repetições.

[0161] Realizou-se monitoramento do efeito nematicida por meio de contagem da quantidade de cistos na terra infectada por meio de amostragem antes do plantio, a meio caminho ao longo do teste em quatro meses após o plantio e ao final do teste, seis meses após o plantio, o que permitiu medir o grau de multiplicação do nematoide Heterodera carotae durante o cultivo.

[0162] Inoculado: inoculado natural: terra proveniente de campo infestado com nematoides Heterodera carotae. Este inoculado foi bem homogeneizado em uma betoneira.

[0163] Preparação das jardineiras: jardineiras com abertura de 29 litros; altura: 20 cm, comprimento: 98 cm, largura: 25 cm (uma jardineira por genótipo e por repetição) foram cheias com exatamente a mesma quantidade de terra.

[0164] Material vegetal testado:

[0165] Lote 1. Nanco: controle sensível.

[0166] Lote 2. Linhagem F4 resistente (F4.HCR10.M, vide o Exemplo 8).

[0167] Lote 3. População sintética conforme descrito no Exemplo 8.

[0168] Lote 4. Linhagem F3 pseudorresistente.

[0169] Lote 5. Linhagem F3 pseudorresistente.

[0170] Plantio: as sementes foram plantadas deixando um espaço de 5 cm entre as sementes e a extremidade, a fim de evitar efeito de fronteira. O plantio foi conduzido em duas fileiras paralelas de 70 cm com 60 sementes por fileira distribuídas de forma homogênea ao longo de todo o comprimento.

[0171] Amostras: ao longo da duração do teste, foram retiradas três amostras com três espécimes em cada jardineira. A amostra n° 1 correspondeu à amostragem antes do plantio, a n° 2 correspondeu à amostragem quatro meses após o plantio e a n° 3 correspondeu à amostragem seis meses após o plantio.

RESULTADOS

[0172] Os inventores observaram boa germinação para todos os lotes testados, exceto para o lote 4 (25%), mas desenvolvimento muito ruim das plantas para o controle sensível Nanco (atraso muito significativo do crescimento). Devido ao atraso do crescimento do controle sensível, os resultados de multiplicação de nematoides não estão de acordo com os resultados obtidos nos anos anteriores neste tipo de teste. Na verdade, o atraso do crescimento leva à introdução de orientação nos resultados: enquanto, em todos os testes anteriores, observou-se multiplicação do nematoide no solo (de 159 a 430% para os controles sensíveis), observou-se aqui redução de 52% dos nematoides. O mau desenvolvimento das raízes provavelmente apresentou impacto sobre o ciclo do nematoide.

[0173] Três dos genótipos testados apresentaram redução do nível de infestação do solo de 62% a 87% após seis meses de cultivo.

[0174] Para um dos genótipos (batelada 5, F3 pseudorresistente), houve aumento da população de nematoides de 60% após seis meses de cultivo, o que foi inesperado.

[0175] Os resultados são ilustrados na Figura 6. As tabelas abaixo registram a análise da variação e os resultados de teste de Newman-Keuls com limite de 5%. ANÁLISE DE VARIAÇÃO

TESTE DE NEWMAN-KEULS, LIMITE DE 5%

CONCLUSÕES

[0176] O poder nematicida relacionado a esta resistência é novamente confirmado por meio do teste que foi conduzido.

[0177] O genótipo F4.HCR10.M que é resistente a Heterodera carotae, com poder nematicida da ordem de 80% após quatro a seis meses de cultivo, permite a obtenção de efeito comparável a tratamento químico (com eficácia de 80-90%).

[0178] Este genótipo já havia demonstrado o melhor poder nematicida no teste anterior; sementes obtidas por meio de multiplicação desse genótipo foram depositadas junto ao NCIMB com o número NCIMB 42351.

BIBLIOGRAFIA

[0179] Murashige, T. e Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15 (3): 473-497.

[0180] Steward, F. C., Mapes, M. O. e Smith, J. (1958). Growth and organized development of cultured cells. I, II & III. Growth and division of freely suspended cells. Am. J. Bot. 45.

Claims (13)

1. USO DE PLANTAS de Daucus carota que não pertencem àsubespécie de cenouras cultivadas Daucus carota sp. sativus, caracterizado por ser para desinfetar um meio de cultivo infestado por nematoides Heterodera carotae, em que as mencionadas plantas exibem efeito nematicida.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peloefeito nematicida ser uma redução da quantidade de larvas jovens J2 e/ou uma redução da quantidade de cistos e/ou uma masculinização de mais de 50% de larvas do nematoide Heterodera carotae durante o cultivo das mencionadas plantas por pelo menos quatro meses.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pormencionadas plantas serem obtidas a partir de sementes depositadas junto ao NCIMB com o número de acesso NCIMB 42351.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo meio de cultivo infestado ser terra ou areia.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado por permitir a redução da população de nematoides Heterodera carotae no meio de cultivo em pelo menos 40%.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado porpermitir a redução da população de nematoides Heterodera carotae no meio de cultivo em pelo menos 50%.

7. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado porpermitir a redução da população de nematoides Heterodera carotae no meio de cultivo em pelo menos 60%.

8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado por permitir a redução da quantidade de cistos ou fêmeas de nematoides no meio de cultivo em pelo menos 50%.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por permitir a redução do nível de infestação do meio de cultivo em até menos de uma larva J2 fêmea de Heterodera carotae por grama de meio.

10. MÉTODO DE REDUÇÃO DA POPULAÇÃO DE NEMATOIDES Heterodera carotae em um meio de cultivo infestado, caracterizado por compreender o cultivo de plantas de Daucus carota, que não pertencem à subespécie de cenouras cultivadas Daucus carota subsp. sativus, durante pelo menos quatro meses, em que as mencionadas plantas apresentam efeito nematicida sobre os mencionados nematoides.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por mencionado cultivo possuir duração de pelo menos cinco meses.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por mencionado cultivo possuir uma duração de pelo menos seis meses.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado por mencionado cultivo ser conduzido em uma densidade de 0,8 a 1,4 milhões de sementes por hectare.

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