BR112017019774B1

BR112017019774B1 - SAMPLE ANALYSIS METHOD THROUGH THE USE OF A POROUS CAPILLARY MEMBRANE TO DETERMINE THE QUANTITY OF AMPLIFICATION PRODUCTS PER ROLLING CIRCLE

Info

Publication number: BR112017019774B1
Application number: BR112017019774-0A
Authority: BR
Inventors: Ove Öhman; Frederik Persson; Mathias Howell
Original assignee: Vanadis Diagnostics
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2024-05-14

Abstract

A presente invenção refere-se a um método de análise de amostra. Em certas modalidades, o método pode compreender: (a) filtrar uma amostra líquida contendo produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) usando uma membrana capilar porosa, produzindo assim uma matriz de produtos de RCA na membrana; em que a amostra contém pelo menos uma primeira população de produtos de RCA e uma segunda população de produtos de RCA, em que as primeira e segunda populações de produtos de RCA marcados são marcadas de forma distinta; e (b) determinar a quantidade da primeira população marcada de produtos de RCA e a quantidade da segunda população marcada de produtos de RCA em uma área da membrana.The present invention relates to a sample analysis method. In certain embodiments, the method may comprise: (a) filtering a liquid sample containing rolling circle amplification (RCA) products using a porous capillary membrane, thereby producing an array of RCA products on the membrane; wherein the sample contains at least a first population of RCA products and a second population of RCA products, wherein the first and second populations of labeled RCA products are marked differently; and (b) determining the amount of the first labeled population of RCA products and the amount of the second labeled population of RCA products in an area of the membrane.

Description

CROSS REFERENCE

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente do Reino Unido n° 1507376.0, depositado em 30 de abril de 2015, cujo pedido é incorporado neste documento para todas as finalidades.[0001] This application claims the benefit of United Kingdom Patent Application No. 1507376.0, filed on April 30, 2015, which application is incorporated herein for all purposes.

BACKGROUND

[0002] O teste pré-natal não invasivo provê informações sobre a condição ou a saúde de um feto usando uma amostra de sangue materno ou outra amostra obtida de forma não invasiva a partir de uma gestante do sexo feminino. A detecção precoce da condição ou da saúde do feto permite intervenções e tratamentos médicos direcionados.[0002] Non-invasive prenatal testing provides information about the condition or health of a fetus using a maternal blood sample or other sample obtained non-invasively from a pregnant female. Early detection of the condition or health of the fetus allows for targeted medical interventions and treatments.

[0003] A amplificação por círculo rolante (RCA) é útil para analisar as células livres de DNA no sangue materno. No entanto, quantificar produtos de RCA com robustez estatística pode ser um desafio. Em um nível prático, embora os números absolutos de produtos em uma reação de RCA possam ser suficientemente altos para fornecer robustez estatística, a concentração molar de amplicons de RCA específicos na reação pode ser bastante baixa, o que limita os tipos de métodos que podem ser usados para quantificá-los. Por exemplo, os produtos de RCA em uma amostra podem, em teoria, ser detectados por meio da identificação dos produtos de RCA, através do depósito da amostra na superfície de uma lâmina de vidro e contando o número de produtos marcados na lâmina. No entanto, basta colocar uma solução contendo produtos de RCA marcados em uma lâmina de vidro, permitindo que os produtos de RCA marcados se espalhem para a superfície e, em seguida, contando o número de produtos de RCA marcados que fixaram na lâmina leva várias horas e nem todos os produtos de RCA marcados alcançam a lâmina e são contados.[0003] Rolling circle amplification (RCA) is useful for analyzing DNA-free cells in maternal blood. However, quantifying RCA products with statistical robustness can be challenging. On a practical level, although the absolute numbers of products in an RCA reaction may be sufficiently high to provide statistical robustness, the molar concentration of specific RCA amplicons in the reaction may be quite low, which limits the types of methods that can be used. used to quantify them. For example, RCA products in a sample can, in theory, be detected by identifying the RCA products by depositing the sample on the surface of a glass slide and counting the number of products marked on the slide. However, simply placing a solution containing labeled RCA products on a glass slide, allowing the labeled RCA products to spread to the surface, and then counting the number of labeled RCA products that have fixed to the slide takes several hours. and not all marked RCA products reach the slide and are counted.

[0004] O uso de filtração sobre um suporte sólido para quantificar os produtos de RCA marcados é descrito neste documento. Como será descrito em mais detalhes abaixo, os métodos podem facilitar a análise das amostras contendo os produtos de RCA.[0004] The use of filtration on a solid support to quantify labeled RCA products is described in this document. As will be described in more detail below, the methods can facilitate the analysis of samples containing RCA products.

SUMMARY

[0005] A invenção provê um método de análise de amostra. Em certas modalidades, o método pode compreender: (a) filtrar uma amostra líquida contendo produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) usando uma membrana capilar porosa, produzindo assim uma matriz de produtos de RCA na membrana; em que a amostra contém pelo menos uma primeira população de produtos de RCA e uma segunda população de produtos de RCA, em que a primeira e segunda populações de produtos de RCA marcados são marcadas de forma distinta; e (b) determinar a quantidade da primeira população marcada de produtos de RCA e a quantidade da segunda população marcada de produtos de RCA em uma área da membrana. Em algumas modalidades, a etapa determinante pode incluir a contagem do número dos primeiros e segundos produtos de RCA marcados na área. Em outras modalidades, a etapa de determinação pode incluir a detecção de um sinal agregado a partir da área. De qualquer forma, o método pode prover uma estimativa do número das primeiras e segundas populações de produtos de RCA na amostra.[0005] The invention provides a sample analysis method. In certain embodiments, the method may comprise: (a) filtering a liquid sample containing rolling circle amplification (RCA) products using a porous capillary membrane, thereby producing an array of RCA products on the membrane; wherein the sample contains at least a first population of RCA products and a second population of RCA products, wherein the first and second populations of labeled RCA products are marked differently; and (b) determining the amount of the first labeled population of RCA products and the amount of the second labeled population of RCA products in an area of the membrane. In some embodiments, the determining step may include counting the number of first and second RCA products marked in the area. In other embodiments, the determination step may include detecting an aggregated signal from the area. In any case, the method can provide an estimate of the number of first and second populations of RCA products in the sample.

[0006] Dependendo de como o método é implementado, o uso da membrana capilar porosa pode permitir a quantificação de substancialmente todos os produtos de RCA em uma amostra (não apenas aqueles que se difundem na direção da superfície da lâmina de vidro) e isso, por sua vez, aumenta a precisão, sensibilidade e reprodutibilidade do ensaio. Além disso, o uso da membrana capilar porosa permite que o ensaio seja feito em minutos, em vez de horas, em comparação com alguns métodos alternativos, os quais, conforme observado acima, podem depender da pipetagem de uma amostra em uma lâmina de vidro e, em seguida, incubar a lâmina por um período de tempo extenso, na esperança de que os produtos de RCA se espalhem e adiram à superfície da lâmina. De acordo com isso, a seção experimental do presente pedido informa que a prática do presente método pode resultar em pelo menos 2,5 vezes mais produtos de RCA sendo contados após 90 segundos (o que equivale ao tempo necessário para colocar a amostra em cima da membrana e em seguida desenhar a amostra através da membrana) em comparação com uma incubação de 16 horas em uma lâmina de vidro. Além disso, o uso da membrana pode reduzir o fundo, permitindo que as fontes potenciais de fundo (por exemplo, moléculas de oligonucleotídeos fluorescentes que não hibridizaram com um produto de RCA ou similar) passem através da membrana (particularmente se a membrana é lavada depois que os produtos de RCA foram aplicados).[0006] Depending on how the method is implemented, the use of the porous capillary membrane may allow the quantification of substantially all RCA products in a sample (not just those that diffuse towards the surface of the glass slide) and this, in turn, it increases the precision, sensitivity and reproducibility of the assay. Furthermore, the use of the porous capillary membrane allows the assay to be done in minutes rather than hours, compared to some alternative methods, which, as noted above, may rely on pipetting a sample onto a glass slide and , then incubate the slide for an extended period of time in hopes that the RCA products will spread and adhere to the surface of the slide. Accordingly, the experimental section of the present application states that practice of the present method can result in at least 2.5 times more RCA products being counted after 90 seconds (which is equivalent to the time required to place the sample on top of the membrane and then drawing the sample through the membrane) compared to a 16-hour incubation on a glass slide. Additionally, use of the membrane can reduce background by allowing potential sources of background (e.g., fluorescent oligonucleotide molecules that have not hybridized to an RCA product or similar) to pass through the membrane (particularly if the membrane is washed after that RCA products were applied).

[0007] O método encontra um uso particular na análise de amostras que possuem uma faixa relativamente ampla de concentrações de produtos de RCA (por exemplo, de 10 a 10M produtos de RCA em um volume de 50 μl a 200 μl ou mais) que em muitos casos podem ter uma concentração relativamente baixa pois, como mencionado acima, a membrana serve para concentrar os produtos de RCA na superfície da membrana. Dito de outra forma, sem usar a membrana e em vez disso usar uma abordagem alternativa, uma amostra de 50 μL se espalharia sobre a superfície de uma lâmina de microscópio de vidro e, mesmo que todos os produtos de RCA pudessem ser induzidos a se ligar a lâmina, os produtos de RCA se separariam tão espacialmente uns dos outros na lâmina que um único campo de visão poderia conter apenas um número insuficiente de produtos de RCA, tornando-o demorado e ineficiente para quantificá-los por microscopia ou outros meios com qualquer precisão razoável. Dependendo de como o método é implementado, a membrana pode servir para concentrar e suportar os produtos de RCA, ao mesmo tempo em que fornece um meio pelo qual os produtos de RCA podem ser lavados com o intuito de diminuir o fundo. Além disso, a membrana pode servir como uma lâmina de microscopia, particularmente se for transparente ou puder ser feita transparente por meio da adição de um agente umectante.[0007] The method finds particular use in the analysis of samples that have a relatively wide range of concentrations of RCA products (e.g., from 10 to 10M RCA products in a volume of 50 μl to 200 μl or more) that in many cases may have a relatively low concentration because, as mentioned above, the membrane serves to concentrate the RCA products on the surface of the membrane. Put another way, without using the membrane and instead using an alternative approach, a 50 μL sample would spread over the surface of a glass microscope slide and even if all of the RCA products could be induced to bind the slide, the RCA products would become so spatially separated from each other on the slide that a single field of view could contain only an insufficient number of RCA products, making it time-consuming and inefficient to quantify them by microscopy or other means with any reasonable accuracy. Depending on how the method is implemented, the membrane can serve to concentrate and support the RCA products while also providing a means by which the RCA products can be washed to reduce background. Additionally, the membrane can serve as a microscope slide, particularly if it is transparent or can be made transparent by adding a wetting agent.

[0008] Em suma, acredita-se que o presente método forneça uma maneira rápida, altamente precisa, sensível e reprodutível para determinar a quantidade de produtos de RCA - um produto que por si só já é feito sem seleção no sentido de que cada molécula alvo é representada por apenas um produto de RCA (em contraste com a PCR em que cada molécula alvo é amplificada em um número desconhecido de cópias e as diferentes moléculas alvo são amplificadas por quantidades diferentes) - em uma amostra. Como tal, o presente método deve se revelar inestimável para aplicações em que as medições rápidas, precisas e exatas da abundância de moléculas de DNA em uma amostra são essenciais. Particularmente, o presente método deve se revelar valioso para o teste pré-natal não invasivo, onde medições rápidas, precisas e exatas da abundância de moléculas de DNA de concentração relativamente baixa que estão na fração livre de células da corrente sanguínea materna são críticas.[0008] In summary, the present method is believed to provide a rapid, highly accurate, sensitive and reproducible way to determine the quantity of RCA products - a product that itself is already made without selection in the sense that each molecule target is represented by just one RCA product (in contrast to PCR in which each target molecule is amplified by an unknown number of copies and different target molecules are amplified by different amounts) - in one sample. As such, the present method should prove invaluable for applications where rapid, precise, and accurate measurements of the abundance of DNA molecules in a sample are essential. Particularly, the present method should prove valuable for non-invasive prenatal testing, where rapid, precise, and accurate measurements of the abundance of relatively low-concentration DNA molecules that are in the cell-free fraction of the maternal bloodstream are critical.

[0009] Estes e outros recursos e vantagens potenciais podem se tornar evidentes na vista da descrição a seguir.[0009] These and other potential features and advantages may become apparent from the following description.

BRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

[00010] Os versados na técnica compreenderão que as figuras, descritas a seguir, são apenas para fins ilustrativos. As figuras não se destinam a limitar o escopo dos presentes ensinamento de maneira alguma.[00010] Those skilled in the art will understand that the figures, described below, are for illustrative purposes only. The figures are not intended to limit the scope of the present teaching in any way.

[00011] A Fig.1 ilustra esquematicamente algumas das etapas do presente método.[00011] Fig.1 schematically illustrates some of the steps of the present method.

[00012] A Fig.2 ilustra esquematicamente alguns dos princípios do presente método.[00012] Fig.2 schematically illustrates some of the principles of the present method.

[00013] A Fig.3 é um gráfico que representa o número de contagens por imagem no eixo y, e as amostras, os tempos de incubação e o tipo de placa de vidro ou óxido de alumínio no eixo x.[00013] Fig. 3 is a graph that represents the number of counts per image on the y-axis, and the samples, incubation times and the type of glass plate or aluminum oxide on the x-axis.

[00014] A Fig.4 é um histograma que mostra alguns dos resultados dos experimentos descritos no Exemplo 2.[00014] Fig.4 is a histogram showing some of the results of the experiments described in Example 2.

[00015] A Fig.5 é um gráfico das proporções entre as contagens para dois canais em relação à composição de mistura da linha celular.[00015] Fig.5 is a graph of the ratios between the counts for two channels in relation to the cell line mixture composition.

DETAILED DESCRIPTION

[00016] Antes de serem descritas as várias modalidades, deve entender-se que os ensinamentos desta divulgação não estão limitados às modalidades particulares descritas e, como tal, podem, evidentemente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo dos presentes ensinamentos será limitado somente pelas reivindicações anexas.[00016] Before the various embodiments are described, it should be understood that the teachings of this disclosure are not limited to the particular embodiments described and, as such, may, of course, vary. It should also be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting, as the scope of the present teachings will be limited only by the appended claims.

[00017] Os títulos de seção utilizados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretadas como limitando, de qualquer maneira, o assunto descrito. Enquanto os presentes ensinamentos são descritos em conjunto com várias modalidades, não se pretende que os presentes ensinamentos sejam limitados a tais modalidades. Pelo contrário, os presentes ensinamentos abrangem várias alternativas, modificações e equivalentes, como serão apreciados por aqueles versados na técnica.[00017] The section titles used in this document are for organizational purposes only and should not be interpreted as limiting, in any way, the subject matter described. While the present teachings are described in conjunction with various embodiments, the present teachings are not intended to be limited to such embodiments. Rather, the present teachings encompass various alternatives, modifications and equivalents, as will be appreciated by those skilled in the art.

[00018] A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por um versado na técnica ao qual pertence esta divulgação. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento também possam ser utilizados na prática ou teste dos presentes ensinamentos, alguns dos métodos e materiais exemplares são descritos neste documento.[00018] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which this disclosure belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may also be used in practicing or testing the present teachings, some of the exemplary methods and materials are described herein.

[00019] A menção de qualquer publicação é para a sua divulgação antes da data de depósito e não deve ser interpretada como uma admissão de que as presentes reivindicações não estão no direito de anteceder tal publicação em virtude de invenção prévia. Adicionalmente, as datas de publicação providas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem ser confirmadas de forma independente.[00019] The mention of any publication is for its disclosure before the filing date and should not be interpreted as an admission that the present claims are not entitled to precede such publication by virtue of prior invention. Additionally, the publication dates provided may differ from actual publication dates which can be independently confirmed.

[00020] Assim como pode ser aparente aos versados na técnica ao ler esta divulgação, cada uma das modalidades individuais descrita e ilustrada neste documento tem componentes discretos e recursos que podem ser prontamente separados ou combinados com as características de qualquer uma das outras várias modalidades sem partir do escopo ou o sentido dos presentes ensinamentos. Pode efetuar-se qualquer método recitado na ordem dos eventos recitados ou em qualquer outra ordem que é logicamente possível.[00020] As may be apparent to those skilled in the art upon reading this disclosure, each of the individual embodiments described and illustrated herein has discrete components and features that can be readily separated or combined with the features of any of the other various embodiments without from the scope or meaning of the present teachings. Any recited method can be carried out in the order of the recited events or in any other order that is logically possible.

[00021] Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências reveladas dentro dessas patentes e publicações, referidas neste documento são expressamente incorporadas por referência.[00021] All patents and publications, including all sequences disclosed within these patents and publications, referred to in this document are expressly incorporated by reference.

[00022] Antes de descrever modalidades exemplares com maior detalhe, os seguintes significados são apresentados para ilustrar o significado e alcance dos termos utilizados na descrição.[00022] Before describing exemplary embodiments in greater detail, the following meanings are presented to illustrate the meaning and scope of the terms used in the description.

[00023] Deve ser observado que conforme utilizado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Por exemplo, o termo "um iniciador" diz respeito a um ou mais iniciadores, isto é, um único iniciador e múltiplos iniciadores. É observado, adicionalmente, que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração destina-se a servir como base antecedente para a utilização de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou utilização de uma limitação "negativa".[00023] It should be noted that as used herein and in the appended claims, the singular forms "a", "an", and "the" include plural referents, unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term "an initiator" refers to one or more initiators, i.e., a single initiator and multiple initiators. It is further noted that claims may be written to exclude any optional elements. As such, this statement is intended to serve as the antecedent basis for the use of such exclusive terminology as "solely," "only" and the like in connection with the recitation of claim elements, or use of a "negative" limitation.

[00024] Tal como utilizado neste documento, o termo "filtragem" inclui o ato de mover um líquido que contém analitos (por exemplo, produtos de amplificação do círculo rolante) através de um filtro de modo que alguns dos analitos sejam retidos por meio do filtro. Na filtragem, pelo menos parte do líquido é transferida de um lado do filtro para o outro.[00024] As used herein, the term "filtration" includes the act of moving a liquid containing analytes (e.g., rolling circle amplification products) through a filter so that some of the analytes are retained through the filter. In filtration, at least part of the liquid is transferred from one side of the filter to the other.

[00025] Tal como utilizado neste documento, o termo "amplificação do círculo rolante" ou "RCA" inclui uma amplificação isotérmica que gera cópias concaternizadas lineares de um molde de ácido nucleico circular usando uma polimerase de deslocamento de cadeias. O RCA é bem conhecido nas técnicas de biologia molecular e é descrita em uma variedade de publicações incluindo, mas não se limitando a Lizardi et al. (Nat.Genet.1998 19: 225-232), Schweitzer et al (Proc.Natl.Acad.Sci.2000 97: 10113-10119), Wiltshire et al (Clin.Chem.2000 46: 1990-1993) e Schweitzer et al (Curr. Opin. Biotech 2001 12: 21-27), os quais são incorporados como referência neste documento.[00025] As used herein, the term "rolling circle amplification" or "RCA" includes an isothermal amplification that generates linear concaternized copies of a circular nucleic acid template using a strand displacement polymerase. RCA is well known in molecular biology techniques and is described in a variety of publications including, but not limited to, Lizardi et al. (Nat.Genet.1998 19: 225-232), Schweitzer et al (Proc.Natl.Acad.Sci.2000 97: 10113-10119), Wiltshire et al (Clin.Chem.2000 46: 1990-1993) and Schweitzer et al (Curr. Opin. Biotech 2001 12: 21-27), which are incorporated by reference in this document.

[00026] Tal como utilizado neste documento, o termo "produtos de amplificação do círculo rolante" inclui os produtos concatamerizados de uma reação de amplificação do círculo rolante. Tal como utilizado neste documento, o termo "produtos de amplificação do círculo rolante marcado de forma fluorescente" diz respeito a produtos de amplificação do círculo rolante que foram marcados de forma fluorescente, por exemplo, hibridizando um oligonucleotídeo marcado de forma fluorescente aos produtos de amplificação do círculo rolante ou outros meios (por exemplo, por meio da incorporação de um nucleotídeo fluorescente no produto durante a amplificação).[00026] As used herein, the term "rolling circle amplification products" includes the concatamerized products of a rolling circle amplification reaction. As used herein, the term "fluorescently labeled rolling circle amplification products" refers to rolling circle amplification products that have been fluorescently labeled, e.g., by hybridizing a fluorescently labeled oligonucleotide to the amplification products. rolling circle or other means (e.g., by incorporating a fluorescent nucleotide into the product during amplification).

[00027] Tal como utilizado neste documento, o termo "membrana capilar porosa" inclui membranas que possuem capilares individuais embalados de maneira relativamente densa que abrangem a espessura da membrana, ou seja, que vão de um lado a outro da membrana, permitindo assim a passagem de líquido, mas não partículas, de um lado a outro da membrana. Exemplos de membranas capilares porosas incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, membranas de óxido de alumínio anódico (ver abaixo), membranas de vidro de nanocanal, membranas gravadas por faixa e politetrafluoroetileno. As membranas de vidro de nanocanal são feitas de vidro e possuem uma alta densidade de canais uniformes com diâmetros de 15 micra a 15 nanômetros (ver, por exemplo, Tonucci et al., Advances in Nanophotonics II, AIP Conference Proceedings, 2007 959:59-71; Pearson et al, Science 1995 270:68-70 e Tonucci et al., Science 1992 258:783-785, bem como as patentes US 5,306,661; 5,332,681; 5.976.444; 6.087.274; 6,376,096; 6,483,640; e 6.599.616, as quais são incorporadas neste documento por referência).As membranas gravadas por faixa são feitas de um polímero transparente (por exemplo, policarbonato, tereftalato de polietileno ou poli-imida e semelhantes) que contém poros com um diâmetro na faixa de 0,01 um a 30 um que foram feitos por meio de uma combinação de bombardeamento de partículas carregadas (ou irradiação) e gravura química. Outras membranas porosas de interesse incluem, mas não estão limitadas a, fluoropolímeros amorfos tais como NAFION™, TEFLON AF™, FEFLON FEIP™ e CYTOP™ (DuPont Fluoroproducts, Fayetteville, NC). Como será reconhecido, uma membrana capilar porosa pode ter uma superfície (por exemplo, um revestimento ou uma superfície quimicamente modificada) que é diferente do material a partir do qual a membrana é feita. Por exemplo, a superfície de uma membrana capilar porosa pode ter características de carga alteradas ou hidrofobicidade alterada ou características hidrofílicas. Em algumas modalidades, a superfície pode ser revestida com amino silano, poli- lisina ou outro composto para prover uma carga positiva que ajuda a reter os produtos de RCA na superfície. Alternativa ou adicionalmente, a superfície pode ter camadas finas de um metal (por exemplo, titânio, ouro) depositado no mesmo, o qual pode ser ligado a outros agentes que modificam as propriedades de superfície do filtro.[00027] As used herein, the term "porous capillary membrane" includes membranes that have relatively densely packed individual capillaries that span the thickness of the membrane, i.e., that run from one side of the membrane to the other, thus allowing the passage of liquid, but not particles, from one side of the membrane to the other. Examples of porous capillary membranes include, but are not limited to, for example, anodic aluminum oxide membranes (see below), nanochannel glass membranes, stripe-etched membranes, and polytetrafluoroethylene. Nanochannel glass membranes are made of glass and have a high density of uniform channels with diameters from 15 microns to 15 nanometers (see, for example, Tonucci et al., Advances in Nanophotonics II, AIP Conference Proceedings, 2007 959:59 -71; Pearson et al, Science 1995 270:68-70 and Tonucci et al., Science 1992 258:783-785, as well as US patents 6,376,096; .640; 6,599,616, which are incorporated herein by reference). Stripe etched membranes are made of a transparent polymer (e.g., polycarbonate, polyethylene terephthalate, or polyimide, and the like) that contains pores with a diameter in the range of 0.01 um to 30 um that were made through a combination of charged particle bombardment (or irradiation) and chemical etching. Other porous membranes of interest include, but are not limited to, amorphous fluoropolymers such as NAFION™, TEFLON AF™, FEFLON FEIP™ and CYTOP™ (DuPont Fluoroproducts, Fayetteville, NC). As will be recognized, a porous capillary membrane may have a surface (e.g., a coating or a chemically modified surface) that is different from the material from which the membrane is made. For example, the surface of a porous capillary membrane may have altered charge characteristics or altered hydrophobicity or hydrophilic characteristics. In some embodiments, the surface may be coated with amino silane, polylysine, or another compound to provide a positive charge that helps retain RCA products on the surface. Alternatively or additionally, the surface may have thin layers of a metal (e.g., titanium, gold) deposited thereon, which may be bonded to other agents that modify the surface properties of the filter.

[00028] Tal como utilizado neste documento, o termo "membrana de óxido de alumínio anódico" inclui uma estrutura membranosa nanoporosa regular e auto-organizada que é produzida quando o Al é anodizado em certos meios ácidos. O diâmetro interior dos poros na membrana, a distância entre os centros dos poros adjacentes na membrana e a distância entre as bordas dos poros adjacentes na membrana podem ser controlados por meio da tensão da deposição, do tipo de ácido e outros parâmetros. Uma membrana de óxido de alumínio anódico é praticamente transparente quando umidificada. A membrana de óxido de alumínio anódico, suas propriedades e como fazer essas membranas são revisadas em detalhes em uma variedade de publicações, incluindo, mas não limitadas a: Li et al (Chem. Mater 1998 10:2470-2480), Santos et al (Trends on Analytical Chemistry 2013 44:25-38), Ingham et al (Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099) e Poinern et al. (Materials 2011 4:487-526), os quais são incorporados por referência neste documento para esses ensinamentos. As membranas de óxido de alumínio anódico são disponíveis comercialmente sob o nome comercial ANOPORE™ a partir de, por exemplo, SPI Supplies (West Chester, PA) e a partir de outros fornecedores, como Sykera Technolgoies Inc (Longmont, CO) e Signma-Aldrich (St.Louis, MO) e podem ser comprados com um anel de suporte.[00028] As used herein, the term "anodic aluminum oxide membrane" includes a regular, self-organized nanoporous membranous structure that is produced when Al is anodized in certain acidic media. The inner diameter of the pores in the membrane, the distance between the centers of adjacent pores in the membrane, and the distance between the edges of adjacent pores in the membrane can be controlled through the deposition voltage, the type of acid, and other parameters. An anodic aluminum oxide membrane is practically transparent when humidified. The anodic aluminum oxide membrane, its properties, and how to make such membranes are reviewed in detail in a variety of publications, including but not limited to: Li et al (Chem. Mater 1998 10:2470-2480), Santos et al (Trends on Analytical Chemistry 2013 44:25-38), Ingham et al (Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099) and Poinern et al. (Materials 2011 4:487-526), which are incorporated by reference herein into these teachings. Anodic aluminum oxide membranes are commercially available under the trade name ANOPORE™ from, for example, SPI Supplies (West Chester, PA) and from other suppliers such as Sykera Technolgoies Inc (Longmont, CO) and Signma- Aldrich (St.Louis, MO) and can be purchased with a support ring.

[00029] Tal como utilizado neste documento, o termo "área", no contexto de uma área de uma membrana ou uma área de uma imagem, inclui uma área contígua ou não contígua. Por exemplo, se um método envolver a determinação da quantidade de produtos de RCA marcados em uma área, por exemplo, por meio da contagem do número de produtos de RCA marcados em uma área, a área na qual os produtos de RCA são quantificados pode ser um único espaço contíguo ou espaços múltiplos não contíguos.[00029] As used herein, the term "area", in the context of an area of a membrane or an area of an image, includes a contiguous or non-contiguous area. For example, if a method involves determining the quantity of marked RCA products in an area, e.g., by counting the number of marked RCA products in an area, the area in which the RCA products are quantified may be a single contiguous space or multiple non-contiguous spaces.

[00030] Tal como utilizado neste documento, o termo "imagem" inclui um processo por meio do qual os sinais ópticos a partir da superfície de um objeto são detectados e armazenados como dados em associação com uma localização (isto é, um "pixel"). Uma imagem digital do objeto pode ser reconstruída a partir desses dados. Uma área de uma membrana pode ser transformada usando uma única imagem ou uma ou mais imagens.[00030] As used herein, the term "imaging" includes a process by which optical signals from the surface of an object are detected and stored as data in association with a location (i.e., a "pixel"). ). A digital image of the object can be reconstructed from this data. An area of a membrane can be transformed using a single image or one or more images.

[00031] Tal como utilizado neste documento, o termo "produtos de RCA marcados individualmente" inclui moléculas de RCA individuais que são marcadas.[00031] As used herein, the term "individually labeled RCA products" includes individual RCA molecules that are labeled.

[00032] Tal como utilizado neste documento, o termo "determinar a quantidade" inclui métodos em que os produtos de RCA resolvidos individualmente são contados, bem como os métodos que incluem a medição de um sinal agregado a partir de vários produtos de RCA Canos métodos que envolvem medir a intensidade de um sinal agregado, os produtos de RCA individuais não precisam ser resolvidos. A quantidade de produtos de RCA pode ser expressa usando qualquer unidade adequada. Em alguns casos, a quantidade de produtos de RCA pode ser expressa como o número de produtos de RCA resolvidos individualmente que foram contados.[00032] As used herein, the term "determining quantity" includes methods in which individually resolved RCA products are counted, as well as methods that include measuring an aggregated signal from multiple RCA products. which involve measuring the strength of an aggregated signal, the individual RCA products do not need to be resolved. The quantity of RCA products can be expressed using any suitable unit. In some cases, the quantity of RCA products may be expressed as the number of individually resolved RCA products that were counted.

[00033] Tal como utilizado neste documento, o termo "contagem" inclui a determinação do número de objetos individuais em uma coleção maior. Nas modalidades, a "contagem" requer a detecção de sinais separados a partir de objetos individuais em uma pluralidade (não um sinal coletivo a partir da pluralidade de objetos) e, em seguida, determinando quantos objetos existem na pluralidade por meio da contagem dos sinais individuais. No contexto dos métodos presentes, a "contagem" pode ser realizada por meio da determinação do número de sinais individuais em uma série de sinais.[00033] As used herein, the term "count" includes determining the number of individual objects in a larger collection. In embodiments, "counting" requires detecting separate signals from individual objects in a plurality (not a collective signal from the plurality of objects) and then determining how many objects there are in the plurality by counting the signals individual. In the context of the present methods, "counting" can be accomplished by determining the number of individual signals in a series of signals.

[00034] Tal como utilizado neste documento, o termo "transparente" inclui um estado no qual um objeto é oticamente transparente ao comprimento de onda que está sendo usado. Para microscopia de fluorescência, "transparente" significa que o objeto será transparente para um ou ambos os espectros de excitação e emissão de um fluoróforo. Como será descrito mais detalhadamente abaixo, certas membranas são transparentes apenas quando são umedecidas. Tais membranas são consideradas membranas transparentes, mesmo quando a forma seca dessas membranas possa não ser transparente.[00034] As used herein, the term "transparent" includes a state in which an object is optically transparent to the wavelength being used. For fluorescence microscopy, "transparent" means that the object will be transparent to one or both of the excitation and emission spectra of a fluorophore. As will be described in more detail below, certain membranes are only transparent when they are moistened. Such membranes are considered transparent membranes, even though the dry form of such membranes may not be transparent.

[00035] Tal como utilizado neste documento, o termo "matriz" com referência a uma série de produtos de RCA inclui uma coleção de produtos de RCA simples em uma superfície plana, onde os produtos de RCA são separados uns dos outros de maneira espacial no plano da superfície (que é verdadeiramente aleatória, na medida do permitido pela distribuição de Poisson da matriz). Uma matriz "aleatória" inclui uma matriz em que os elementos, por exemplo, Produtos de RCA, são distribuídos na superfície de um substrato em posições que não são predeterminadas. Em alguns casos, a distribuição dos produtos de RCA em uma matriz aleatória pode ser descrita por meio das estatísticas de Poisson, de modo que, por exemplo, a distribuição de distâncias entre produtos de RCA de uma matriz aleatória possa ser aproximada usando uma distribuição de Poisson. Em outras palavras, os produtos de RCA podem ser distribuídos aleatoriamente, ou seja, em locais não determinados previamente, em uma membrana.[00035] As used herein, the term "array" with reference to a series of RCA products includes a collection of single RCA products on a flat surface, where the RCA products are spatially separated from each other in the plane of the surface (which is truly random, as far as the Poisson distribution of the matrix allows). A "random" array includes an array in which elements, e.g., RCA Products, are distributed on the surface of a substrate in positions that are not predetermined. In some cases, the distribution of RCA products in a random matrix can be described using Poisson statistics, so that, for example, the distribution of distances between RCA products of a random matrix can be approximated using a distribution of Poisson. In other words, RCA products can be distributed randomly, i.e., in previously undetermined locations, on a membrane.

[00036] Outros significados destes e outros termos podem aparecer ao longo da especificação.[00036] Other meanings of these and other terms may appear throughout the specification.

[00037] Antes de descrever o presente método com mais detalhes, reconhece-se que o presente método pode ser implementado usando qualquer tipo de suporte de captura que possa atuar como um filtro para produtos de RCA. Tais suportes de captura devem ter um baixo sinal de fundo nos comprimentos de onda usados na análise e um tamanho de poro suficiente para permitir o fluxo rápido de líquidos e capturar os produtos de RCA. Os suportes de captura adequados podem ser feitos a partir de materiais orgânicos ou inorgânicos porosos incluindo sólidos tais como metais porososcerâmicas, películas homogêneas (por exemplo, polímeros) e sólidos heterogêneos (misturas poliméricas, vidros mistos). Membranas de cerâmica porosa podem ser feitos a partir de materiais inorgânicos (tais como alumina, titânia, óxidos de zircônia, carboneto de silício recristalizado). Ver, por exemplo, o PamChip vendido sob a Pamgene (Países Baixos), Wu et al., Nucleic Acids Res.2004 32:e123 e Anthony et al Biotechniques.(2003) 34: 1082-6, 1088-9.As membranas de polímero poroso exemplares podem ser feitas a partir de acetato de celulose, nitrocelulose, ésteres de celulose (CA, CN e CE), polissulfona (PS), poliéter sulfona (PES), poliacrilonitrila (PAN), poliamida, poli-imida, polietileno e polipropileno (PE e PP), politetrafluoroetileno (PTFE), fluoreto de polivinilideno (PVDF) e cloreto de polivinila (PVC). Como tal, em algumas modalidades, o método pode compreender: (a) filtrar uma amostra líquida contendo produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) usando um suporte de captura que atua como filtro para os produtos de RCA, produzindo assim uma matriz dos produtos de RCA no suporte; em que a amostra contém pelo menos uma primeira população de produtos de RCA e uma segunda população de produtos de RCA, em que as primeira e segunda populações de produtos de RCA marcados são marcados de forma distinta; e (b) determinar a quantidade da primeira população marcada de produtos de RCA e a quantidade da segunda população marcada de produtos de RCA em uma área da membrana.[00037] Before describing the present method in more detail, it is recognized that the present method can be implemented using any type of capture support that can act as a filter for RCA products. Such capture supports must have a low background signal at the wavelengths used in the analysis and a sufficient pore size to allow rapid flow of liquids and capture the RCA products. Suitable capture supports can be made from porous organic or inorganic materials including solids such as porous metals, ceramics, homogeneous films (e.g., polymers) and heterogeneous solids (polymer mixtures, mixed glasses). Porous ceramic membranes can be made from inorganic materials (such as alumina, titania, zirconia oxides, recrystallized silicon carbide). See, for example, the PamChip sold under Pamgene (Netherlands), Wu et al., Nucleic Acids Res.2004 32:e123 and Anthony et al Biotechniques.(2003) 34:1082-6, 1088-9. Membranes Exemplary porous polymer materials may be made from cellulose acetate, nitrocellulose, cellulose esters (CA, CN and CE), polysulfone (PS), polyether sulfone (PES), polyacrylonitrile (PAN), polyamide, polyimide, polyethylene and polypropylene (PE and PP), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylidene fluoride (PVDF) and polyvinyl chloride (PVC). As such, in some embodiments, the method may comprise: (a) filtering a liquid sample containing rolling circle amplification (RCA) products using a capture holder that acts as a filter for the RCA products, thereby producing an array of the products of RCA on the support; wherein the sample contains at least a first population of RCA products and a second population of RCA products, wherein the first and second populations of labeled RCA products are marked differently; and (b) determining the amount of the first labeled population of RCA products and the amount of the second labeled population of RCA products in an area of the membrane.

[00038] A descrição que se segue abaixo ilustra uma implementação na qual uma membrana capilar porosa é usada. As membranas capilares porosas são um exemplo de um suporte de captura que poderia ser usado. A descrição a seguir ilustra o presente método, por exemplo.[00038] The description below illustrates an implementation in which a porous capillary membrane is used. Porous capillary membranes are an example of a capture support that could be used. The following description illustrates the present method, for example.

[00039] Conforme resumido acima, é provido um método de análise de amostra. Em certas modalidades, o método pode compreender: (a) filtrar uma amostra líquida contendo produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) através de uma membrana capilar porosa, produzindo assim uma matriz de produtos de RCA na membrana; (b) rotular de maneira fluorescente os produtos de RCA antes ou após a etapa (a); e (c) determinar a quantidade de produtos de RCA marcados individualmente em uma área da membrana, provendo assim uma estimativa do número de produtos de RCA marcados na amostra. O método pode ser realizado de várias maneiras diferentes, uma implementação de cujo método é ilustrado esquematicamente na Fig.1.Com referência à Fig.1, certas modalidades do método envolvem: filtrar uma amostra líquida 2 contendo produtos de amplificação por círculo rolante marcados fluorescentemente (RCA) 4 através de uma membrana capilar porosa 6 (por exemplo, uma membrana de óxido de alumínio anódico).A etapa de filtragem concentra as partículas e resulta em uma variedade de produtos de RCA 8 na membrana 6.Na modalidade ilustrada, a próxima etapa envolve a detecção das partículas enquanto elas estão na membrana. Em algumas modalidades, esta etapa pode produzir a imagem 10 da matriz 8. Como será aparente, a detecção pode ser realizada com qualquer detector de fluorescência adequado, por exemplo, um microscópio de fluorescência, um scanner, usando um CMOS de alta resolução ou detector CCD ou usando um PMT ou similar. Finalmente, a quantidade de produtos de RCA marcados na área da membrana é determinada, por exemplo, por meio da contagem de produtos de RCA resolvidos individualmente, ou por meio da medição de um sinal agregado, etc. Esta determinação provê uma estimativa do número de produtos de RCA marcados 12 na amostra 2. Em certas modalidades e dependendo de como o método é realizado, o filtro pode ser umidificado, por exemplo, com um agente umectante (por exemplo, um óleo de imersão ou glicerol) para umidificar a membrana e torná-la transparente. Nestas modalidades, a membrana capilar porosa pode ser feita transparente usando um agente umectante após a filtragem dos produtos de RCA e antes da determinação das quantidades de produtos de RCA Caem algumas modalidades, os produtos de RCA podem ser marcados após a etapa de filtragem. Além disso, em alguns casos, uma imagem da matriz não precisa ser produzida e armazenada. Nessas modalidades, a análise da matriz pode ser feita durante ou imediatamente após a transformação em imagem. Em algumas modalidades nas quais a análise inclui a contagem, o detector de fluorescência utilizado deve ser suficiente para resolver os diferentes produtos de RCA na membrana. Em algumas modalidades, o detector de fluorescência pode ter uma resolução inferior a 10 um, por exemplo, inferior a 5 um ou inferior a 1 um. Em modalidades que envolvem a medição de um sinal agregado, o detector de fluorescência não precisa ter tal resolução.[00039] As summarized above, a sample analysis method is provided. In certain embodiments, the method may comprise: (a) filtering a liquid sample containing rolling circle amplification (RCA) products through a porous capillary membrane, thereby producing an array of RCA products in the membrane; (b) fluorescently label the RCA products before or after step (a); and (c) determining the amount of individually labeled RCA products in an area of the membrane, thereby providing an estimate of the number of labeled RCA products in the sample. The method can be carried out in several different ways, an implementation of which method is illustrated schematically in Fig. 1. With reference to Fig. 1, certain embodiments of the method involve: filtering a liquid sample 2 containing fluorescently labeled rolling circle amplification products (RCA) 4 through a porous capillary membrane 6 (e.g., an anodic aluminum oxide membrane). The filtration step concentrates the particles and results in a variety of RCA products 8 on the membrane 6. In the illustrated embodiment, the The next step involves detecting the particles while they are on the membrane. In some embodiments, this step may produce image 10 of array 8. As will be apparent, detection may be performed with any suitable fluorescence detector, e.g., a fluorescence microscope, a scanner, using a high-resolution CMOS or detector. CCD or using a PMT or similar. Finally, the amount of RCA products labeled in the membrane area is determined, for example, by counting individually resolved RCA products, or by measuring an aggregate signal, etc. This determination provides an estimate of the number of RCA products labeled 12 in sample 2. In certain embodiments and depending on how the method is performed, the filter may be humidified, for example, with a wetting agent (e.g., an immersion oil). or glycerol) to moisten the membrane and make it transparent. In these embodiments, the porous capillary membrane can be made transparent using a wetting agent after filtering the RCA products and before determining the amounts of RCA products. In some embodiments, the RCA products can be marked after the filtering step. Additionally, in some cases, an image of the matrix does not need to be produced and stored. In these embodiments, analysis of the matrix can be done during or immediately after transformation into an image. In some embodiments in which the analysis includes counting, the fluorescence detector used must be sufficient to resolve the different RCA products on the membrane. In some embodiments, the fluorescence detector may have a resolution of less than 10 µm, for example, less than 5 µm or less than 1 µm. In embodiments that involve measuring an aggregated signal, the fluorescence detector does not need to have such resolution.

[00040] Em qualquer modalidade, os poros da membrana capilar devem ter um tamanho suficiente para evitar que os produtos de RCA passem através dos poros. Por exemplo, nas modalidades, o diâmetro dos poros da membrana capilar pode não ser superior a 50% do diâmetro médio dos produtos de RCA, enquanto que em modalidades não pode ser superior a 20% do diâmetro médio dos produtos de RCA, e em algumas modalidades não pode ser superior a 10% do diâmetro médio dos produtos de RCA. Como tal, na filtragem da amostra usando a membrana capilar porosa, os produtos de RCA devem permanecer no topo da membrana e não devem entrar ou passar pelos poros completamente.[00040] In any embodiment, the pores of the capillary membrane must be of sufficient size to prevent RCA products from passing through the pores. For example, in embodiments, the pore diameter of the capillary membrane may be no more than 50% of the average diameter of the RCA products, while in some embodiments it may not be more than 20% of the average diameter of the RCA products, and in some embodiments modalities cannot be greater than 10% of the average diameter of the RCA products. As such, when filtering the sample using the porous capillary membrane, the RCA products must remain on top of the membrane and must not enter or pass through the pores completely.

[00041] Em certas modalidades, a membrana capilar porosa não compreende um agente de captura preso (por exemplo, um oligonucleotídeo preso, um anticorpo ou estreptavidina ou semelhante) que hibridiza especificamente com ou se ligando aos produtos de RCA. Nestas modalidades, os produtos de RCA não se ligam à membrana capilar porosa através de uma interação específica (por exemplo, uma sequência específica). Em tais modalidades, a membrana capilar porosa não compreende uma pluralidade de diferentes agentes de captura específicos de sequência presa (por exemplo, oligonucleotídeos) que estão ligados à membrana em locais que podem ser endereçados espacialmente na forma de um micromatriz, conforme descrito na US2006022813.[00041] In certain embodiments, the porous capillary membrane does not comprise a tethered capture agent (e.g., a tethered oligonucleotide, an antibody or streptavidin, or the like) that specifically hybridizes with or binds to the RCA products. In these embodiments, the RCA products do not bind to the porous capillary membrane through a specific interaction (e.g., a specific sequence). In such embodiments, the porous capillary membrane does not comprise a plurality of different trapped sequence-specific capture agents (e.g., oligonucleotides) that are bound to the membrane at locations that can be spatially addressed in the form of a microarray, as described in US2006022813.

[00042] Em certas modalidades, para além da produção de um sinal de luz, não é necessário realizar as reações bioquímicas na membrana (por exemplo, uma reação que resulta na ruptura ou formação de uma ligação covalente) depois que os produtos de RCA são filtrados através da membrana.[00042] In certain embodiments, other than producing a light signal, it is not necessary to carry out biochemical reactions in the membrane (e.g., a reaction that results in the rupture or formation of a covalent bond) after the RCA products are filtered through the membrane.

[00043] Como será evidente, os produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) não são desnaturados antes de serem filtrados através da membrana (por exemplo, não são expostos a uma temperatura de pelo menos 90 oC durante pelo menos 2 minutos).[00043] As will be evident, rolling circle amplification (RCA) products are not denatured before being filtered through the membrane (for example, they are not exposed to a temperature of at least 90 oC for at least 2 minutes).

[00044] A Fig.2 mostra alguns dos princípios de uma modalidade exemplar do método. Na primeira etapa, uma amostra contendo os produtos de RCA marcados fluorescentemente é colocada em um recipiente, por exemplo, um poço que contém a membrana, por exemplo, como a superfície inferior. A amostra é concentrada pela aplicação de pressão que desenha a fase líquida da amostra através da membrana. Os Produtos de RCA são retidos na superfície da membrana na forma de uma matriz a uma densidade de, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 5.000 ou pelo menos 10.000 / mm2. Se a membrana já não é transparente, então, após a adição de um agente umectante a membrana torna-se transparente e os produtos de RCA podem ser detectados, por exemplo, transformados em imagens. Os produtos de RCA também podem ser fixados no lugar usando um fixador, de modo que a membrana possa ser transportada e/ou armazenada de modo que os produtos de RCA possam ser relidos se for obtido um resultado positivo. Em algumas modalidades, o agente umectante, além de tornar a membrana transparente, também atua como um fixador. A matriz pode ser analisada de ambos os lados da membrana, por exemplo, através da membrana (como mostrado na Fig.2). Como será aparente, se a membrana é lida a partir de "acima", ou seja, a partir do mesmo lado que os produtos de RCA, a membrana não precisa ser transparente. Em algumas modalidades, a membrana pode ser secada antes do transporte e da análise. A área analisada pode conter pelo menos 10, pelo menos, 100, pelo menos 1000, pelo menos 5000, pelo menos 10.000, pelo menos 20.000, pelo menos 50.000, pelo menos 100.000 ou pelo menos 200.000 ou mais de produtos de RCA.[00044] Fig.2 shows some of the principles of an exemplary embodiment of the method. In the first step, a sample containing the fluorescently labeled RCA products is placed in a container, e.g. a well containing the membrane, e.g. as the bottom surface. The sample is concentrated by applying pressure that draws the liquid phase of the sample through the membrane. The RCA Products are retained on the surface of the membrane in the form of a matrix at a density of, for example, at least 10, at least 50, at least 100, at least 500, at least 1,000, at least 5,000 or at least 10,000 /mm2. If the membrane is not already transparent, then after the addition of a wetting agent the membrane becomes transparent and the RCA products can be detected, for example transformed into images. The RCA products can also be secured in place using a fixative so that the membrane can be transported and/or stored so that the RCA products can be re-read if a positive result is obtained. In some embodiments, the wetting agent, in addition to making the membrane transparent, also acts as a fixative. The matrix can be analyzed from both sides of the membrane, for example through the membrane (as shown in Fig.2). As will be apparent, if the membrane is read from "above", that is, from the same side as the RCA products, the membrane does not need to be transparent. In some embodiments, the membrane may be dried prior to transport and analysis. The analyzed area may contain at least 10, at least 100, at least 1000, at least 5000, at least 10,000, at least 20,000, at least 50,000, at least 100,000, or at least 200,000 or more RCA products.

[00045] Se desejado, os produtos de RCA podem ser marcados enquanto estão ligados à membrana e, em certas modalidades, a membrana pode ser lavada, por exemplo, com água ou um tampão aquoso que contém sal, depois que a matriz de produtos de RCA marcados foi produzida e antes da análise. Esta etapa de lavagem pode reduzir o fundo porque as potenciais fontes de fundo (por exemplo, nucleotídeos marcados ou oligonucleotídeos marcados que não são hibridizados com um produto de RCA) podem ser lavadas através do filtro e não são associadas ao filtro no momento em que o filtro é analisado. Se necessário, outros reagentes, por exemplo, antidesbotamento ou reagentes que melhoram a fluorescência ou semelhantes, podem ser adicionados à membrana antes da análise a fim de diminuir o fundo ou aumentar o sinal ou similar. Do mesmo modo, se necessário, os produtos de RCA marcados podem ser ligados (por ligação covalente ou não covalente) à superfície da membrana antes da análise, se necessário. As químicas para ligar biomoléculas a uma superfície são bem conhecidas e, em certos casos, os produtos de RCA podem ser feitos utilizando um nucleotídeo modificado ou um iniciador que possua um grupo que seja especificamente reativo com a superfície da membrana, garantindo assim que apenas os produtos de RCA se tornem fixados à superfície.[00045] If desired, the RCA products can be labeled while they are bound to the membrane and, in certain embodiments, the membrane can be washed, for example, with water or an aqueous buffer containing salt, after the matrix of RCA products has been removed. Labeled RCA was produced and prior to analysis. This washing step can reduce background because potential sources of background (e.g., labeled nucleotides or labeled oligonucleotides that are not hybridized to an RCA product) can be washed through the filter and are not associated with the filter by the time the filter is analyzed. If necessary, other reagents, for example, antifade or fluorescence enhancing reagents or the like, can be added to the membrane before analysis in order to decrease the background or increase the signal or the like. Likewise, if necessary, labeled RCA products can be attached (by covalent or non-covalent bonding) to the membrane surface prior to analysis, if necessary. The chemistries for binding biomolecules to a surface are well known and, in certain cases, RCA products can be made using a modified nucleotide or primer that has a group that is specifically reactive with the membrane surface, thus ensuring that only the RCA products become fixed to the surface.

[00046] Em certas modalidades, a etapa de filtração é realizada por (i) colocar a amostra na membrana porosa; e (ii) aplicar uma força que move a amostra através da membrana. A força aplicada à amostra pode ser uma força ativa (por exemplo, uma força centrífuga, uma pressão negativa ou uma pressão positiva) ou uma força passiva (por exemplo, através de ação capilar (usando papel mata-borrão, por exemplo) ou evaporação).[00046] In certain embodiments, the filtration step is performed by (i) placing the sample on the porous membrane; and (ii) apply a force that moves the sample through the membrane. The force applied to the sample can be an active force (e.g., a centrifugal force, negative pressure, or positive pressure) or a passive force (e.g., through capillary action (using blotting paper, for example) or evaporation ).

[00047] Como notado acima, o diâmetro interior dos poros na membrana, a distância entre os centros dos poros adjacentes na membrana e a distância entre as bordas dos poros adjacentes na membrana podem ser controlados por meio da tensão da deposição, do tipo de ácido e outros parâmetros (ver, geralmente, Poinern, supra). Em algumas modalidades, o diâmetro interior dos poros na membrana pode estar na faixa de 5 nm a 500nm, por exemplo, de 4 nm a 250 nm, de 4 nm a 50 nm, de 50 nm a 100 nm, de 100 nm a 200 nm ou de 200 nm a 500 nm. Independentemente, a distância média entre os centros dos poros adjacentes na membrana pode estar na faixa de 50 nm a 1000 nm, por exemplo, de 50 nm a 420 nm, de 50 nm a 100 nm, de 100 nm a 250 nm, de 250 nm a 500 nm ou de 500 nm a 1000 nm. A distância média entre os bordos dos poros adjacentes na membrana pode estar na faixa de 10 nm a 500 nm, de 10 nm a 50 nm, de 50 nm a 200 nm, ou de 200 nm a 500 nm. Pode entender-se que o diâmetro e os valores de distância média entre os poros providos neste documento são exemplificativos, e tais valores podem variar com base na modalidade.[00047] As noted above, the interior diameter of the pores in the membrane, the distance between the centers of adjacent pores in the membrane, and the distance between the edges of adjacent pores in the membrane can be controlled by means of the deposition voltage, the type of acid and other parameters (see, generally, Poinern, supra). In some embodiments, the interior diameter of the pores in the membrane may be in the range of 5 nm to 500 nm, e.g., 4 nm to 250 nm, 4 nm to 50 nm, 50 nm to 100 nm, 100 nm to 200 nm. nm or from 200 nm to 500 nm. Independently, the average distance between the centers of adjacent pores in the membrane may be in the range of 50 nm to 1000 nm, e.g., 50 nm to 420 nm, 50 nm to 100 nm, 100 nm to 250 nm, 250 nm to 500 nm or from 500 nm to 1000 nm. The average distance between the edges of adjacent pores in the membrane may be in the range of 10 nm to 500 nm, 10 nm to 50 nm, 50 nm to 200 nm, or 200 nm to 500 nm. It can be understood that the diameter and average distance values between pores provided herein are exemplary, and such values may vary based on the embodiment.

[00048] Em algumas modalidades, o diâmetro dos poros e a distância entre os centros de poros adjacentes podem ser otimizados para prover os produtos de RCA marcados que são resolvidos individualmente por meio do sistema de detecção usado. Especificamente, em certos casos, os poros na membrana podem ter um diâmetro relativamente grande (por exemplo, um diâmetro na faixa de 100 nm a 500 nm) e a distância média entre os centros dos poros adjacentes na membrana pode ser relativamente grande (por exemplo, na faixa de 200 nm a 1000 nm, por exemplo, de 200 nm a 420 nm), de modo que cada um dos produtos de RCA marcados seja puxado para a entrada de um poro (efetivamente "bloqueando" o poro) e a distância entre produtos de RCA marcados de maneira adjacente é resolvível por meio da microscopia de fluorescência. Essas distâncias ideais podem ser diminuídas se for usada a microscopia de fluorescência de super- resolução (Huang et al, Annu.Rev.Biochem.2009 78:993-1016).[00048] In some embodiments, the diameter of the pores and the distance between adjacent pore centers can be optimized to provide labeled RCA products that are individually resolved through the detection system used. Specifically, in certain cases, the pores in the membrane may have a relatively large diameter (e.g., a diameter in the range of 100 nm to 500 nm) and the average distance between the centers of adjacent pores in the membrane may be relatively large (e.g. , in the range 200 nm to 1000 nm, e.g., 200 nm to 420 nm), so that each of the labeled RCA products is pulled into the entrance of a pore (effectively "blocking" the pore) and away between adjacently labeled RCA products is resolvable using fluorescence microscopy. These ideal distances can be decreased if super-resolution fluorescence microscopy is used (Huang et al, Annu.Rev.Biochem.2009 78:993-1016).

[00049] A membrana usada pode ser de qualquer espessura adequada, por exemplo, na faixa de 20 μm a 500 μm ou de 50 μm a 200 μm, conforme desejado e, como mencionado acima, pode conter uma ou mais estruturas de suporte (por exemplo, um anel de suporte) de modo a manter a integridade da membrana durante o uso.[00049] The membrane used may be of any suitable thickness, for example, in the range of 20 μm to 500 μm or of 50 μm to 200 μm, as desired, and, as mentioned above, may contain one or more support structures (e.g. example, a support ring) in order to maintain the integrity of the membrane during use.

[00050] Conforme mencionado acima, o presente método pode ser usado em protocolos que requerem uma quantificação precisa do número de produtos de RCA em uma amostra, particularmente uma amostra que possui uma concentração variável de produtos de RCA (por exemplo, de 10 a 10M que podem estar em uma concentração relativamente baixa, por exemplo, de 5.000 a 1M de produtos de RCA em um volume de 50 μl a 200 μl ou mais) e a resolução estatística necessária para identificar uma diferença pode ser alcançada apenas por meio da contagem de pelo menos 1.000, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, pelo menos 50.000, pelo menos 100.000 ou pelo menos 200.000 ou mais dos produtos de RCA. Como será descrito mais detalhadamente abaixo, o método possui um uso particular na análise do número de cópias e nas aplicações de testes pré-natal não-invasivos.[00050] As mentioned above, the present method can be used in protocols that require an accurate quantification of the number of RCA products in a sample, particularly a sample that has a varying concentration of RCA products (e.g., from 10 to 10M which may be at a relatively low concentration, e.g. 5,000 to 1M RCA products in a volume of 50 μl to 200 μl or more) and the statistical resolution required to identify a difference can be achieved only by counting at least 1,000, at least 5,000, at least 10,000, at least 50,000, at least 100,000 or at least 200,000 or more of the RCA products. As will be described in more detail below, the method has particular use in copy number analysis and non-invasive prenatal testing applications.

[00051] Em algumas modalidades, a amostra pode conter várias populações de produtos de RCA (por exemplo, duas, três ou quatro ou mais populações de produtos de RCA, como uma primeira população de produtos de RCA marcados e uma segunda população de produtos de RCA), onde as diferentes populações dos produtos de RCA são marcadas de forma distinta, o que significa que os membros individuais de cada uma das populações de produtos de RCA marcados possam ser detectados e contados de maneira independente, mesmo quando as populações são misturadas. Os pares de marcadores fluorescentes distinguíveis adequados úteis nos presentes métodos incluem Cy-3 e Cy-5 (Amersham Inc., Piscataway, NJ), Quasar 570 e Quasar 670 (Biosearch Technology, Novato CA), Alexafluor555 e Alexafluor647 (Molecular Probes, Eugene, OR), BODIPY V-1002 e BODIPY V1005 (Molecular Probes, Eugene, OR), POPO-3 e TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR) e POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Eugene, OR).Outros marcadores distinguíveis detectáveis adequados podem ser encontrados em Kricka et al. (Ann Clin Biochem.39:114-29, 2002).Por exemplo, os produtos de RCA podem ser marcados com qualquer combinação de ATTO, ALEXA, CY ou corantes diméricos de cianina, como YOYO, TOTO, etc. Outras marcações também podem ser incluídas. Métodos exemplares para fazer as populações passíveis de distinção a partir de produtos de RCA marcados estão descritos, por exemplo, na PCT/US2014/06771, depositado em 26 de novembro de 2014 e na PCT/US2014/067719, depositado em 26 de novembro de 2014, os quais são incorporados por referência neste documento para esses ensinamentos. Em alguns casos, uma população de produtos de RCA pode ser marcada de forma distinta por meio da marcação com vários rótulos, aumentando assim as possibilidades de multiplexação. Por exemplo, em alguns casos, os produtos de RCA de uma população podem ser marcados individualmente com dois corantes passíveis de distinção (por exemplo, Cy3 e Cy5). Quando lidos, tais produtos de RCA com rótulos duplos serão distinguíveis a partir dos produtos de RCA que são marcados com um corante individual (por exemplo, Cy3 ou Cy5).[00051] In some embodiments, the sample may contain multiple populations of RCA products (e.g., two, three, or four or more populations of RCA products, such as a first population of labeled RCA products and a second population of labeled RCA products). RCA), where the different populations of RCA products are marked differently, meaning that individual members of each of the labeled RCA product populations can be detected and counted independently, even when the populations are mixed. Suitable distinguishable fluorescent label pairs useful in the present methods include Cy-3 and Cy-5 (Amersham Inc., Piscataway, NJ), Quasar 570 and Quasar 670 (Biosearch Technology, Novato CA), Alexafluor555 and Alexafluor647 (Molecular Probes, Eugene , OR), BODIPY V-1002 and BODIPY V1005 (Molecular Probes, Eugene, OR), POPO-3 and TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR), and POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Eugene, OR).Other distinguishable markers Suitable detectables can be found in Kricka et al. (Ann Clin Biochem.39:114-29, 2002).For example, RCA products can be marked with any combination of ATTO, ALEXA, CY, or dimeric cyanine dyes such as YOYO, TOTO, etc. Other markings may also be included. Exemplary methods for making populations distinguishable from labeled RCA products are described, for example, in PCT/US2014/06771, deposited November 26, 2014, and PCT/US2014/067719, deposited November 26, 2014. 2014, which are incorporated by reference herein for these teachings. In some cases, a population of RCA products can be marked differently through marking with multiple labels, thus increasing multiplexing possibilities. For example, in some cases, RCA products from a population can be individually labeled with two distinguishable dyes (e.g., Cy3 and Cy5). When read, such dual-labeled RCA products will be distinguishable from RCA products that are labeled with an individual dye (e.g., Cy3 or Cy5).

[00052] Em algumas modalidades, uma primeira população de produtos de RCA pode representar uma população "teste" de produtos de RCA marcados e uma segunda população de produtos de RCA pode representar uma população "de referência" dos produtos de RCA, com a qual o número dos primeiros produtos de RCA pode ser comparado. Por exemplo, em algumas modalidades, a primeira população de produtos de RCA pode corresponder a uma primeira região cromossômica (por exemplo, um primeiro cromossomo tal como o cromossomo 21) e a segunda população de produtos de RCA pode corresponder a uma segunda região cromossômica (por exemplo, um segundo cromossomo tal como o cromossomo 13 ou 18 ou uma região diferente do primeiro cromossomo) e o número da primeira população de produtos de RCA e a segunda população de produtos de RCA podem ser contados e comparados para determinar se há uma diferença no número de cópias das regiões (indicando que há duplicação ou exclusão da região de teste). Em algumas modalidades, a amostra contém pelo menos uma primeira população de produtos de RCA e uma segunda população de produtos de RCA, em que a primeira e segunda populações de produtos de RCA marcados são marcados de forma distinta na etapa de marcação. Nestas modalidades, os métodos compreendem a determinação da quantidade de (por exemplo, por meio da contagem do número de) dos primeiros produtos de RCA marcados em uma área da membrana e determinação da quantidade de (por exemplo, por meio da contagem do número de) dos segundos produtos de RCA marcados em uma área (a mesma área ou uma área diferente) da membrana, fornecendo assim uma estimativa da quantidade das primeiras e segundas populações de produtos de RCA na amostra. Esta modalidade pode envolver, adicionalmente, a comparação do número dos primeiros produtos de RCA na amostra com o número dos segundos produtos de RCA na amostra.[00052] In some embodiments, a first population of RCA products may represent a "test" population of labeled RCA products and a second population of RCA products may represent a "reference" population of RCA products, with which the number of early RCA products can be compared. For example, in some embodiments, the first population of RCA products may correspond to a first chromosomal region (e.g., a first chromosome such as chromosome 21) and the second population of RCA products may correspond to a second chromosomal region ( for example, a second chromosome such as chromosome 13 or 18 or a different region of the first chromosome) and the number of the first population of RCA products and the second population of RCA products can be counted and compared to determine whether there is a difference in the number of copies of the regions (indicating that there is duplication or deletion of the test region). In some embodiments, the sample contains at least a first population of RCA products and a second population of RCA products, wherein the first and second populations of labeled RCA products are marked differently in the labeling step. In these embodiments, the methods comprise determining the amount of (e.g., by counting the number of) the first labeled RCA products in an area of the membrane and determining the amount of (e.g., by counting the number of ) of the second RCA products labeled in an area (the same area or a different area) of the membrane, thus providing an estimate of the amount of the first and second populations of RCA products in the sample. This embodiment may additionally involve comparing the number of first RCA products in the sample with the number of second RCA products in the sample.

[00053] Em algumas destas modalidades dos métodos, os métodos podem compreender a transformação em imagem das primeiras e segundas populações de produtos de RCA marcados para produzir uma ou mais imagens (por exemplo, uma imagem ou uma primeira imagem e uma segunda imagem, respectivamente) e, opcionalmente, (i) determinar a quantidade de produtos de RCA marcados na uma ou mais imagens, fornecendo assim uma estimativa da quantidade das primeiras e segundas populações de produtos de RCA marcados na amostra. As primeiras e segundas populações de produtos de RCA marcados podem ser detectadas separadamente por meio do uso de métodos conhecidos (por exemplo, usando filtros apropriados, etc.). A detecção dos produtos de RCA pode ser feita sequencialmente (em cujas modalidades, por exemplo, as imagens separadas para cada etiqueta podem ser produzidas e os produtos de RCA a partir de cada população podem ser analisados sequencialmente. A detecção dos produtos de RCA também pode ser realizada substancialmente de maneira simultânea (em cujas modalidades, por exemplo, uma única imagem que mostra as duas populações de produtos de RCA podem ser produzidas e os produtos de RCA de cada população podem ser analisados substancialmente ao mesmo tempo, ou seja, substancialmente de maneira simultânea. Estas modalidades dos métodos podem, adicionalmente, compreender a comparação da quantidade dos primeiros produtos de RCA marcados na amostra até à quantidade dos segundos produtos de RCA marcados na amostra. Essa etapa dos métodos pode envolver a contagem de pelo menos 1.000 (por exemplo, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, pelo menos 20.000, pelo menos 50.000, pelo menos 100.000, pelo menos 500.000 até 1M ou mais) produtos de RCA marcados na primeira população e contando pelo menos 1.000 (por exemplo, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, pelo 20.000 ou pelo menos 50.000, pelo menos 100.000, pelo menos 500.000 até 1M ou mais) produtos de RCA marcados em uma área da membrana, garantindo assim que uma diferença no número de cópias pode ser designado com rigor estatístico.[00053] In some of these embodiments of the methods, the methods may comprise imaging the first and second populations of labeled RCA products to produce one or more images (e.g., an image or a first image and a second image, respectively ) and, optionally, (i) determine the quantity of RCA products marked in the one or more images, thus providing an estimate of the quantity of the first and second populations of RCA products marked in the sample. The first and second populations of labeled RCA products can be detected separately using known methods (e.g., using appropriate filters, etc.). Detection of RCA products can be done sequentially (in which embodiments, for example, separate images for each tag can be produced and RCA products from each population can be analyzed sequentially. Detection of RCA products can also be done sequentially. be performed substantially simultaneously (in which embodiments, for example, a single image showing both populations of RCA products can be produced and the RCA products from each population can be analyzed substantially simultaneously, i.e., substantially in simultaneously. These embodiments of the methods may additionally comprise comparing the amount of the first RCA products marked in the sample to the amount of the second RCA products marked in the sample. This step of the methods may involve counting at least 1,000 (per. example, at least 5,000, at least 10,000, at least 20,000, at least 50,000, at least 100,000, at least 500,000 up to 1M or more) RCA products marked in the first population and counting at least 1,000 (e.g., at least 5,000, at least 10,000, at least 20,000 or at least 50,000, at least 100,000, at least 500,000 up to 1M or more) RCA products labeled in an area of the membrane, thus ensuring that a difference in copy number can be designated with statistical rigor.

[00054] Em modalidades, os métodos podem compreender, adicionalmente, a detecção de uma diferença entre a quantidade dos primeiros produtos de RCA na amostra em relação à quantidade de segundos produtos de RCA na amostra, onde a diferença tem um valor P de pelo menos 0,95, pelo menos 0,98 ou pelo menos 0,99. Em algumas modalidades, o método pode ser usado para detectar pelo menos uma diferença de 1%, pelo menos uma diferença de 2%, pelo menos uma diferença de 3%, ou pelo menos uma diferença de 5%, com um valor P de mais do que 0,95, 0,98 ou 0,99. Por exemplo, em modalidades envolvendo uma amostra materna a partir de uma gestante do sexo feminino, a fração fetal da amostra pode ser incluída neste cálculo.[00054] In embodiments, the methods may further comprise detecting a difference between the amount of first RCA products in the sample relative to the amount of second RCA products in the sample, where the difference has a P value of at least 0.95, at least 0.98 or at least 0.99. In some embodiments, the method can be used to detect at least a 1% difference, at least a 2% difference, at least a 3% difference, or at least a 5% difference, with a P value of more than 0.95, 0.98 or 0.99. For example, in embodiments involving a maternal sample from a pregnant female, the fetal fraction of the sample may be included in this calculation.

[00055] Conforme observado acima, em alguns casos a amostra que está sendo analisada usando este método pode ser uma amostra de DNA livre de células obtida, por exemplo, a partir do sangue de uma gestante do sexo feminino. Nestas modalidades, o método pode ser usado para detectar anormalidades cromossômicas no feto em desenvolvimento (como descrito acima) ou para calcular a fração de DNA fetal na amostra, por exemplo. As anormalidades do número de cópias que podem ser detectadas usando o método incluem, mas não estão limitadas a, trissomia do 21, trissomia do 13, trissomia do 18, trissomia do 16, XXY, XYY, XXX, monossomia do X, monossomia do 21, monossomia do 22, monossomia do 16 e monossomia do 15. Outras anormalidades de número de cópias que podem ser detectadas usando o presente método são listadas na tabela a seguir. [00055] As noted above, in some cases the sample being analyzed using this method may be a cell-free DNA sample obtained, for example, from the blood of a pregnant female. In these embodiments, the method can be used to detect chromosomal abnormalities in the developing fetus (as described above) or to calculate the fraction of fetal DNA in the sample, for example. Copy number abnormalities that can be detected using the method include, but are not limited to, trisomy 21, trisomy 13, trisomy 18, trisomy 16, XXY, XYY, XXX, monosomy X, monosomy 21 , monosomy 22, monosomy 16, and monosomy 15. Other copy number abnormalities that can be detected using the present method are listed in the following table.

[00056] Métodos exemplares para a produção de produtos de RCA e marcação do mesmo são descritos, por exemplo, na PCT/US2014/ 06771, depositado em 26 de novembro de 2014 e na PCT/US2014/ 067719, depositado em 26 de novembro de 2014, os quais são incorporados por referência para a divulgação destes métodos.[00056] Exemplary methods for producing RCA products and marking the same are described, for example, in PCT/US2014/06771, filed on November 26, 2014 and in PCT/US2014/067719, filed on November 26, 2014. 2014, which are incorporated by reference for the disclosure of these methods.

Composition

[00057] Uma composição também é provida. Em algumas modalidades, a composição pode compreender: a) uma membrana capilar porosa, por exemplo, uma membrana porosa de óxido de alumínio anódico; e b) uma matriz de produtos de RCA marcados de maneira fluorescente em uma superfície da membrana. A matriz pode compreender pelo menos 1.000 produtos de RCA marcados (por exemplo, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, pelo menos 20.000, pelo menos 50.000, pelo menos 100.000, pelo menos 500.000 ou pelo menos 1M de produtos de RCA marcados) e os produtos de RCA marcados podem ser distribuídos através da superfície da membrana de uma forma aleatória a uma densidade de, por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 5.000 ou pelo menos 10.000/mm2. Conforme descrito acima, a composição pode compreender uma membrana capilar porosa; e pelo menos duas populações de produtos de RCA marcados de maneira fluorescente em uma superfície da membrana, onde as diferentes populações de produtos de RCA marcados de maneira fluorescente são marcadas de forma distinta. Detalhes adicionais e variações desta composição podem ser encontrados na seção de métodos desta divulgação.[00057] A composition is also provided. In some embodiments, the composition may comprise: a) a porous capillary membrane, for example, a porous anodic aluminum oxide membrane; and b) an array of fluorescently labeled RCA products on a membrane surface. The array may comprise at least 1,000 labeled RCA products (e.g., at least 5,000, at least 10,000, at least 20,000, at least 50,000, at least 100,000, at least 500,000, or at least 1M labeled RCA products) and the Labeled RCA products may be distributed across the surface of the membrane in a random manner at a density of, for example, at least 10, at least 50, at least 100, at least 500, at least 1,000, at least 5,000 or at least 10,000/mm2. As described above, the composition may comprise a porous capillary membrane; and at least two populations of fluorescently labeled RCA products on a membrane surface, wherein the different populations of fluorescently labeled RCA products are marked differently. Additional details and variations of this composition can be found in the methods section of this disclosure.

Kits

[00058] Também providos por meio desta divulgação são kits para praticar os métodos do objeto, conforme descrito acima. Em algumas modalidades, um kit pode conter pelo menos: reagentes para circularizar o fragmento selecionado de uma maneira específica de sequência e, então, realizando a amplificação por círculo rolante dos produtos circularizados. Por exemplo, uma ou mais enzimas de restrição, uma ligase e um ou mais oligonucleotídeos que podem atuar como uma tala para circularizar os produtos, uma polimerase de deslocamento por fita para amplificar os produtos circularizados por meio de RCA, um ou mais oligonucleotídeos marcados para marcação dos produtos de RCA e uma membrana capilar porosa, por exemplo, uma membrana porosa de óxido de alumínio anódico, como descrito acima. Os diversos componentes do kit podem estar presentes em recipientes separados ou certos componentes compatíveis podem ser pré-combinados em um único recipiente, conforme desejado. Detalhes adicionais e variações dos componentes desse kit podem ser encontrados na seção de métodos desta divulgação.[00058] Also provided through this disclosure are kits for practicing the methods of the object, as described above. In some embodiments, a kit may contain at least: reagents for circularizing the selected fragment in a sequence-specific manner and then performing rolling circle amplification of the circularized products. For example, one or more restriction enzymes, a ligase, and one or more oligonucleotides that can act as a splint to circularize the products, a strand displacement polymerase to amplify the circularized products through RCA, one or more oligonucleotides labeled to marking of the RCA products and a porous capillary membrane, for example, a porous anodic aluminum oxide membrane, as described above. The various components of the kit may be present in separate containers or certain compatible components may be pre-combined into a single container as desired. Additional details and variations of the components of this kit can be found in the methods section of this disclosure.

[00059] Além dos componentes mencionados acima, os kits sujeitos podem incluir, adicionalmente, as instruções para uso dos componentes do kit para praticar os métodos sujeitos, ou seja, as instruções para análise de amostras. Geralmente, as instruções para a prática de um método sujeito são gravadas em uma mídia de gravação adequada. Por exemplo, as instruções podem ser impressas em um substrato, como papel ou plástico, etc. Como tal, as instruções podem estar presentes nos kits como uma bula, na marcação do recipiente do kit ou seus componentes (isto é, associadas à embalagem ou embalagem interna) etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um arquivo de dados de armazenamento eletrônico presente em um meio de armazenamento de leitura por computador adequado, por exemplo, CD-ROM, disquete, etc. Em ainda outras modalidades, as instruções reais não estão presentes no kit, mas meios para obtenção das instruções a partir de uma fonte remota, por exemplo, através da internet, são providos. Um exemplo desta modalidade é um kit que inclui um endereço web onde as instruções podem ser visualizadas e/ou a partir do qual as instruções podem ser baixadas. Como com as instruções, este meio para obtenção das instruções é gravado em um substrato adequado.[00059] In addition to the components mentioned above, the subject kits may additionally include instructions for using the kit components to practice the subject methods, that is, instructions for analyzing samples. Generally, instructions for practicing a subject method are recorded on suitable recording media. For example, instructions can be printed on a substrate such as paper or plastic, etc. As such, instructions may be present in kits as a leaflet, in the marking of the kit container or its components (i.e. associated with the packaging or internal packaging), etc. In other embodiments, the instructions are present as an electronic storage data file present on a suitable computer-readable storage medium, e.g., CD-ROM, floppy disk, etc. In still other embodiments, the actual instructions are not present in the kit, but means for obtaining the instructions from a remote source, e.g., via the internet, are provided. An example of this embodiment is a kit that includes a web address where instructions can be viewed and/or from which instructions can be downloaded. As with the instructions, this means for obtaining the instructions is recorded on a suitable substrate.

Modalities

[00060] O parágrafo seguinte descreve uma implementação exemplar do método.[00060] The following paragraph describes an exemplary implementation of the method.

[00061] Em algumas modalidades, o método pode compreender: (a) filtrar uma amostra líquida contendo produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) marcados de maneira fluorescente através do uso de uma membrana porosa de óxido de alumínio anódico, produzindo assim uma matriz de produtos de RCA na membrana; (b) determinar a quantidade de produtos de RCA marcados na área da membrana, provendo assim uma estimativa da quantidade dos produtos de RCA marcados na amostra. Em algumas modalidades, a etapa determinante pode incluir a contagem do número dos primeiros e segundos produtos de RCA marcados na área. Em outras modalidades, a etapa de determinação pode incluir a detecção de um sinal agregado a partir da área.[00061] In some embodiments, the method may comprise: (a) filtering a liquid sample containing fluorescently labeled rolling circle amplification (RCA) products through the use of a porous anodic aluminum oxide membrane, thereby producing a matrix of RCA products in the membrane; (b) determine the amount of RCA products labeled in the membrane area, thus providing an estimate of the amount of RCA products labeled in the sample. In some embodiments, the determining step may include counting the number of first and second RCA products marked in the area. In other embodiments, the determination step may include detecting an aggregated signal from the area.

[00062] Nas modalidades, a etapa (a) do método pode ser realizada por meio de: (i) colocar a amostra na membrana porosa de óxido de alumínio anódico; e (ii) aplicar uma força que move a amostra através da membrana. Nestas modalidades, a força pode ser uma força ativa (uma força centrífuga, pressão negativa ou pressão positiva) ou uma força passiva (que pode ser aplicada por ação capilar ou evaporação). Em algumas modalidades, o método pode compreender a lavagem da membrana porosa de óxido de alumínio anódico entre as etapas (a) e (b). Em algumas modalidades, a etapa determinante pode compreender a contagem de pelo menos 1.000 produtos de RCA marcados na área da imagem.[00062] In embodiments, step (a) of the method can be carried out by: (i) placing the sample on the porous anodic aluminum oxide membrane; and (ii) apply a force that moves the sample through the membrane. In these embodiments, the force may be an active force (a centrifugal force, negative pressure, or positive pressure) or a passive force (which may be applied by capillary action or evaporation). In some embodiments, the method may comprise washing the porous anodic aluminum oxide membrane between steps (a) and (b). In some embodiments, the determining step may comprise counting at least 1,000 RCA products marked in the image area.

[00063] Nas modalidades, o diâmetro interior dos poros na membrana pode na faixa de 5 nm a 500 nm e, independentemente, a distância média entre os centros de poros adjacentes na membrana pode estar na faixa de 50 nm a 1000 nm. Nas modalidades, a distância média entre as bordas dos poros adjacentes na membrana pode estar na faixa de 10 nm a 500 nm. Em algumas modalidades, a amostra pode conter pelo menos uma primeira e uma segunda população de produtos de RCA marcados, em que as primeiras e segundas populações de produtos de RCA marcados são identificadas de forma distinta. Nestas modalidades, os métodos podem compreender, adicionalmente, a transformação em imagem das primeiras e segundas populações de produtos de RCA marcados para produzir uma ou mais imagens (por exemplo, uma primeira imagem e uma segunda imagem, respectivamente). Esses métodos podem compreender, adicionalmente, (i) contar o número de produtos de RCA marcados em uma área da primeira imagem e (ii) contar separadamente o número de produtos de RCA marcados em uma área, por exemplo, a mesma área, da segunda imagem, provendo assim uma estimativa do número das primeiras e segundas populações de produtos de RCA marcados na amostra. Estas modalidades podem compreender, adicionalmente, a comparação da quantidade dos primeiros produtos de RCA marcados na amostra até à quantidade dos segundos produtos de RCA marcados na amostra.[00063] In embodiments, the interior diameter of the pores in the membrane can be in the range of 5 nm to 500 nm and, independently, the average distance between the centers of adjacent pores in the membrane can be in the range of 50 nm to 1000 nm. In embodiments, the average distance between the edges of adjacent pores in the membrane may be in the range of 10 nm to 500 nm. In some embodiments, the sample may contain at least a first and a second population of labeled RCA products, wherein the first and second populations of labeled RCA products are distinctly identified. In these embodiments, the methods may further comprise imaging the first and second populations of labeled RCA products to produce one or more images (e.g., a first image and a second image, respectively). Such methods may further comprise (i) counting the number of RCA products marked in an area of the first image and (ii) separately counting the number of RCA products marked in an area, e.g. the same area, of the second image, thus providing an estimate of the number of first and second populations of RCA products marked in the sample. These embodiments may further comprise comparing the quantity of the first RCA products labeled in the sample to the quantity of the second RCA products labeled in the sample.

[00064] Também é provida uma composição compreendendo: a) uma membrana capilar porosa; e b) uma matriz de produtos de RCA marcados de maneira fluorescente em uma superfície da membrana. Em algumas destas modalidades, a membrana capilar porosa pode ser uma membrana porosa de óxido de alumínio anódico. Em algumas modalidades, a matriz pode compreender pelo menos 1.000 produtos de RCA Caem algumas modalidades, a composição pode compreender matrizes múltiplas de produtos de RCA marcados de maneira fluorescente, em que as matrizes múltiplas estão na superfície da membrana e marcadas de forma distinta. Uma descrição de cada um desses elementos, bem como os elementos opcionais que podem estar presentes na composição, pode ser encontrada na descrição anterior.[00064] Also provided is a composition comprising: a) a porous capillary membrane; and b) an array of fluorescently labeled RCA products on a membrane surface. In some of these embodiments, the porous capillary membrane may be a porous anodic aluminum oxide membrane. In some embodiments, the array may comprise at least 1,000 RCA products. In some embodiments, the composition may comprise multiple arrays of fluorescently labeled RCA products, wherein the multiple arrays are on the surface of the membrane and distinctly labeled. A description of each of these elements, as well as optional elements that may be present in the composition, can be found in the previous description.

[00065] Também é provido um kit que compreende: a) uma membrana capilar porosa; e b) reagentes para circularizar o DNA e realizar amplificação por círculo rolante (RCA); e c) reagentes para marcação dos produtos de RCA. Uma descrição de cada um desses elementos, bem como dos elementos opcionais que podem estar presentes no kit, podem ser encontrados na descrição anterior.[00065] A kit is also provided comprising: a) a porous capillary membrane; and b) reagents to circularize the DNA and perform rolling circle amplification (RCA); and c) reagents for labeling RCA products. A description of each of these elements, as well as optional elements that may be present in the kit, can be found in the previous description.

[00066] Modalidade 1, um método de análise de amostra, compreendendo:(a) filtrar uma amostra líquida contendo produtos de amplificação por círculo rolante (RCA) através de uma membrana capilar porosa, concentrando assim os produtos de RCA e produzindo uma matriz dos produtos de RCA na membrana; (b) rotular de maneira fluorescente os produtos de RCA antes ou após a etapa (a); e (c) contar o número dos produtos de RCA marcados individualmente em uma área da membrana, provendo assim uma estimativa do número de produtos de RCA marcados na amostra.[00066] Embodiment 1, a method of sample analysis, comprising: (a) filtering a liquid sample containing rolling circle amplification (RCA) products through a porous capillary membrane, thereby concentrating the RCA products and producing an array of RCA products in the membrane; (b) fluorescently label the RCA products before or after step (a); and (c) counting the number of individually labeled RCA products in an area of the membrane, thereby providing an estimate of the number of labeled RCA products in the sample.

[00067] Modalidade 2. O método da Modalidade 1, em que a membrana capilar transparente porosa é uma membrana porosa de óxido de alumínio anódico.[00067] Modality 2. The method of Modality 1, in which the porous transparent capillary membrane is a porous anodic aluminum oxide membrane.

[00068] Modalidade 3. O método da Modalidade 1 ou 2, em que a etapa (b) é realizada por meio da hibridação de oligonucleotídeos marcados de maneira fluorescente com os produtos de RCA, antes ou após a etapa (a).[00068] Modality 3. The method of Modality 1 or 2, in which step (b) is carried out through the hybridization of fluorescently labeled oligonucleotides with the RCA products, before or after step (a).

[00069] Modalidade 4. Método, de acordo com qualquer modalidade anterior, em que o método compreende realizar imagens uma área da membrana para produzir uma ou mais imagens e contar o número de produtos de RCA marcados individualmente na uma ou mais imagens.[00069] Embodiment 4. Method, according to any previous embodiment, wherein the method comprises imaging an area of the membrane to produce one or more images and counting the number of RCA products individually marked in the one or more images.

[00070] Modalidade 5. Método, de acordo com qualquer Modalidade anterior, em que a etapa (a) é realizada por meio de: (i) colocar a amostra na membrana capilar transparente porosa; e (ii) aplicar uma força que move a amostra através da membrana.[00070] Modality 5. Method, according to any previous Modality, in which step (a) is carried out by: (i) placing the sample on the porous transparent capillary membrane; and (ii) apply a force that moves the sample through the membrane.

[00071] Modalidade 6. Método, de acordo com a Modalidade 5, em que a força é uma força ativa ou uma força passiva.[00071] Modality 6. Method, according to Modality 5, in which the force is an active force or a passive force.

[00072] Modalidade 7. Método da Modalidade 6, em que a força ativa é uma força centrífuga, pressão negativa ou pressão positiva.[00072] Modality 7. Method of Modality 6, in which the active force is a centrifugal force, negative pressure or positive pressure.

[00073] Modalidade 8. Método da Modalidade 6, em que a força passiva é aplicada por ação capilar ou evaporação.[00073] Modality 8. Method of Modality 6, in which the passive force is applied by capillary action or evaporation.

[00074] Modalidade 9. O método, de acordo com qualquer Modalidade anterior, compreendendo ainda a lavagem da membrana porosa capilar transparente porosa entre as etapas (a) e (b).[00074] Modality 9. The method, according to any previous Modality, further comprising washing the porous transparent capillary porous membrane between steps (a) and (b).

[00075] Modalidade 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a etapa de contagem compreende a contagem de pelo menos 1000 produtos de RCA marcados na área da membrana.[00075] Embodiment 10. Method, according to any one of the preceding claims, wherein the counting step comprises counting at least 1000 RCA products marked in the membrane area.

[00076] Modalidade 11. Método, de acordo com qualquer Modalidade anterior, em que o diâmetro interior dos poros na membrana está na faixa de 2 nm a 500 nm.[00076] Embodiment 11. Method, according to any previous Embodiment, in which the inner diameter of the pores in the membrane is in the range of 2 nm to 500 nm.

[00077] Modalidade 12. Método, de acordo com qualquer Modalidade anterior, em que a distância média entre os centros de poros adjacentes na membrana está na faixa de 50 nm a 1000 nm.[00077] Embodiment 12. Method, according to any previous Embodiment, in which the average distance between the centers of adjacent pores in the membrane is in the range of 50 nm to 1000 nm.

[00078] Modalidade 13. Método, de acordo com qualquer Modalidade anterior, em que a distância média entre as bordas dos poros adjacentes na membrana está na faixa de 10 nm a 500 nm.[00078] Embodiment 13. Method, according to any previous Embodiment, wherein the average distance between the edges of adjacent pores in the membrane is in the range of 10 nm to 500 nm.

[00079] Modalidade 14. Método de qualquer Modalidade anterior, em que a amostra contém pelo menos uma primeira população de produtos de RCA e uma segunda população de produtos de RCA, em que as primeiras e as segundas populações de produtos de RCA marcados são marcadas de maneira distinta na etapa (b).[00079] Embodiment 14. Method of any previous Embodiment, wherein the sample contains at least a first population of RCA products and a second population of RCA products, in which the first and second populations of labeled RCA products are marked differently in step (b).

[00080] Modalidade 15. Método da Modalidade 11, em que o método compreende a contagem do número de primeiros produtos de RCA marcados em uma área da membrana e a contagem do número de segundos produtos de RCA marcados em uma área da membrana, provendo assim uma estimativa do número das primeiras e segundas populações de produtos de RCA na amostra.[00080] Embodiment 15. Method of Embodiment 11, wherein the method comprises counting the number of first RCA products labeled in an area of the membrane and counting the number of second RCA products labeled in an area of the membrane, thus providing an estimate of the number of first and second populations of RCA products in the sample.

[00081] Modalidade 16. Método da Modalidade 15 compreende, adicionalmente, a comparação do número dos primeiros produtos de RCA na amostra com o número dos segundos produtos de RCA na amostra.[00081] Embodiment 16. Method of Embodiment 15 further comprises comparing the number of first RCA products in the sample with the number of second RCA products in the sample.

EXAMPLES

[00082] Os exemplos seguintes são apresentados de modo a prover aqueles versados na técnica com uma divulgação e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção nem pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados.[00082] The following examples are presented in order to provide those skilled in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention and are not intended to limit the scope of what the inventors consider their invention nor are they intended to represent that the Experiments below are all or the only experiments performed.

Example 1 Using an AAO filter Introduction

[00083] A primeira etapa em muitas aplicações de diagnóstico molecular é converter o material biológico de um paciente, tal como DNA em um biomarcador eficaz. O DNA é extraído, muitas vezes purificado e convertido em moléculas de substituição, tais como produtos de círculo rolante (RCPs), que podem ser medidos ou quantificados. A detecção destas moléculas de substituição é assistida frequentemente por meio da ligação específica de corantes fluorescentes. Corantes diferentes podem ser anexados a diferentes marcadores de substituição, o que permite a detecção multiplexada, mesmo em misturas complexas. A deposição em superfícies planares, tais como placas de vidro ou lâminas, permite a contagem das moléculas marcadas por microscopia ou digitalização.[00083] The first step in many molecular diagnostic applications is to convert a patient's biological material, such as DNA, into an effective biomarker. DNA is extracted, often purified, and converted into replacement molecules, such as rolling circle products (RCPs), which can be measured or quantified. Detection of these replacement molecules is often assisted through the specific binding of fluorescent dyes. Different dyes can be attached to different substitution markers, which allows multiplexed detection, even in complex mixtures. Deposition on planar surfaces, such as glass plates or slides, allows the counting of labeled molecules by microscopy or scanning.

[00084] Um desafio particular surge quando as amostras estão reduzidas na concentração em uma solução e é difícil depositar números suficientes de moléculas para uma enumeração precisa. O revestimento das lâminas de vidro com agentes como a poli l-lisina (PLL), os aminossilanos ou similares tem provado ser um meio eficaz de melhoria da deposição para marcadores de substituição compostos principalmente por DNA (ver, por exemplo, a PCT/US2014/06771, depositada em 26 de novembro de 2014 e a PCT/US2014/067719, depositada em 26 de novembro de 2014). Isso melhora a eficiência da deposição em algum grau, no entanto, muitas moléculas permanecem em solução e não são incluídas na análise subsequente. Em um esforço para aumentar o rendimento da deposição de biomarcadores marcados de forma fluorescente a uma superfície plana, o seguinte método de filtração foi implementado.[00084] A particular challenge arises when samples are reduced in concentration in a solution and it is difficult to deposit sufficient numbers of molecules for accurate enumeration. Coating glass slides with agents such as poly l-lysine (PLL), aminosilanes or similar has proven to be an effective means of improving deposition for substitution markers composed mainly of DNA (see, for example, PCT/US2014 /06771, deposited on November 26, 2014 and PCT/US2014/067719, deposited on November 26, 2014). This improves deposition efficiency to some degree, however, many molecules remain in solution and are not included in subsequent analysis. In an effort to increase the yield of deposition of fluorescently labeled biomarkers to a flat surface, the following filtration method was implemented.

Materials and methods

[00085] Dispositivos: As membranas de óxido de alumínio foram ligadas a superestruturas de placa de poço que foram criadas internamente ou adquiridas a partir de Ibidi (peça# 81201).[00085] Devices: Aluminum oxide membranes were attached to well plate superstructures that were created in-house or purchased from Ibidi (part# 81201).

[00086] Placas revestidas de amino silano (96-Well Glass Bottom Plates SuperAmine, peça# M96M) foram adquiridas a partir da ArrayIt Corporation.[00086] Amino silane coated plates (96-Well Glass Bottom Plates SuperAmine, part# M96M) were purchased from ArrayIt Corporation.

[00087] Foram criados dois produtos separados de amplificação por círculo rolante usando os métodos descritos anteriormente (PCT/ US2014/06771). Uma reação de RCA foi marcada por meio da hibridação de um oligonucleotídeo de detecção complementar contendo um marcador 5’ Atto 550, a outra reação de RCA foi marcada de uma maneira semelhante com 5’ Atto 647N.As reações de RCA foram misturadas em uma mistura de 50:50 a 50 fM de concentração.[00087] Two separate rolling circle amplification products were created using the methods described previously (PCT/US2014/06771). One RCA reaction was labeled by hybridization to a complementary detection oligonucleotide containing a 5' Atto 550 tag, the other RCA reaction was labeled in a similar manner with 5' Atto 647N. The RCA reactions were mixed in a mixture of 50:50 at 50 fM concentration.

[00088] Para as placas de vidro, 100 ul da reação foram aliquotados em 3 poços da placa e deixados para incubação à temperatura ambiente por 16 horas. Outra série de 3 poços foi incubada por 90 segundos. Após as incubações, os poços foram lavados duas vezes com 2x SSC e deixados para secar.[00088] For the glass plates, 100 ul of the reaction was aliquoted into 3 wells of the plate and left to incubate at room temperature for 16 hours. Another series of 3 wells was incubated for 90 seconds. After incubations, the wells were washed twice with 2x SSC and left to dry.

[00089] Para as membranas, foram adicionados 100 ul de amostras às placas de fundo de membrana, e as placas foram então colocadas em papel mata-borrão (VWR peça# 28298-022). As amostras passaram através da membrana de óxido de alumínio em aproximadamente 90 segundos. A placa de fundo de membrana foi removida do partir do papel mata-borrão e foram adicionadas 2 gotas de reagente antidesbotamento prolongado (Life Technologies) a cada poço para torná-las transparentes.[00089] For membranes, 100 ul of samples were added to the membrane bottom plates, and the plates were then placed on blotting paper (VWR part # 28298-022). Samples passed through the aluminum oxide membrane in approximately 90 seconds. The membrane bottom plate was removed from the blotting paper and 2 drops of extended anti-fade reagent (Life Technologies) were added to each well to make them transparent.

[00090] A imagem foi feita para ambos os formatos em um microscópio Olympus X81 com uma objetiva de 20X e uma câmera Hamamatsu Orca 4.0lt.A imagem foi realizada por meio de telas de imagens de 9x9 para cobrir todo o fundo de cada poço. As imagens foram analisadas e os produtos de RCA contados usando um software desenvolvido especificamente para essa finalidade.[00090] Imaging was done for both formats on an Olympus X81 microscope with a 20X objective and a Hamamatsu Orca 4.0lt camera. Imaging was performed using 9x9 imaging screens to cover the entire bottom of each well. Images were analyzed and RCA products counted using software developed specifically for this purpose.

Results

[00091] Os resultados são resumidos na Fig.3. Quando incubada por 16 horas, a deposição nas placas de vidro resultou em uma média por imagem de 2.000 a 4.000 contagens para os produtos de RCA marcados com Atto 550. Para o Atto 647N, a contagem média por imagem estava entre 2.000 a 3.000 contagens. A incubação por 90 segundos nas placas de vidro resultou em uma contagem média por imagem de entre 500 a 2.500 contagens para ambos os canais. Em contraste, a incubação/deposição na placa de óxido de alumínio resultou em uma média por imagem de 6.000 a 10.000 contagens para os RCPs marcados com Atto 550 e entre 6.000 a 9.000 contagens para os produtos de RCA marcados com 647N.[00091] The results are summarized in Fig.3. When incubated for 16 hours, deposition on the glass plates resulted in an average per image of 2,000 to 4,000 counts for RCA products labeled with Atto 550. For Atto 647N, the average count per image was between 2,000 to 3,000 counts. Incubation for 90 seconds on the glass plates resulted in an average count per image of between 500 and 2,500 counts for both channels. In contrast, incubation/deposition on the aluminum oxide plate resulted in an average per image of 6,000 to 10,000 counts for the Atto 550-labeled RCPs and between 6,000 to 9,000 counts for the 647N-labeled RCA products.

[00092] Os dados demonstram que a deposição na membrana de óxido de alumínio resulta em contagens aproximadamente 4 vezes maiores do que quando depositado na placa de vidro pelo mesmo intervalo de tempo de 90 segundos. Se o tempo de incubação for aumentado para 16 horas para a placa de vidro, o resultado é um aumento nos produtos de RCA sendo detectados na placa de vidro, no entanto ainda 2,5 vezes menor que observado a 90 segundos no óxido de alumínio.[00092] The data demonstrates that deposition on the aluminum oxide membrane results in counts approximately 4 times higher than when deposited on the glass plate for the same time interval of 90 seconds. If the incubation time is increased to 16 hours for the glass plate, the result is an increase in RCA products being detected on the glass plate, however still 2.5 times less than that observed at 90 seconds on the aluminum oxide.

Example 2 Multiplex detection methods Materials and methods

[00093] Dispositivos: As membranas de óxido de alumínio com poros de 20 nm foram ligadas a 96 superestruturas de placas de poços, produzidas pela 4titude Ltd, Reino Unido.[00093] Devices: Aluminum oxide membranes with 20 nm pores were attached to 96 well plate superstructures, produced by 4titude Ltd, United Kingdom.

[00094] Neste experimento multiplexo, as misturas de DNA de 2 linhas celulares foram usadas como material de partida genético. O DNA da linha celular continha 2 cópias do cromossomo 21 (composição genética normal) ou linhas celulares contendo 3 cópias do cromossomo (trissomia 21).O DNA extraído a partir das linhas celulares foi misturado nas seguintes proporções 100:0, 95:5, 90:10, 0:100. Cada mistura de DNA foi primeiro assimilada usando enzimas de restrição, hibridizadas e ligadas a um conjunto de sonda, e subsequentemente amplificada de maneira enzimática por meio de RCA conforme descrito anteriormente (ver a WO2015083001 e WO2015083002). Foram adicionados dois oligonucleotídeos de detecção específica de cromossomos (Atto 550 para o cromossomo 18, Atto 647 para o cromossomo 21) a cada amostra e permitidos hibridizar assim por meio da marcação de forma fluorescente os produtos de RCA específicos do cromossomo em cada amostra.[00094] In this multiplex experiment, DNA mixtures from 2 cell lines were used as genetic starting material. The DNA from the cell line contained 2 copies of chromosome 21 (normal genetic makeup) or cell lines containing 3 copies of the chromosome (trisomy 21). The DNA extracted from the cell lines was mixed in the following proportions 100:0, 95:5, 90:10, 0:100. Each DNA mixture was first assimilated using restriction enzymes, hybridized and ligated to a probe set, and subsequently enzymatically amplified using RCA as previously described (see WO2015083001 and WO2015083002). Two chromosome-specific detection oligonucleotides (Atto 550 for chromosome 18, Atto 647 for chromosome 21) were added to each sample and allowed to hybridize by fluorescently labeling the chromosome-specific RCA products in each sample.

[00095] Após a marcação, foram adicionadas amostras de 100 ul a placas com fundo de membrana, e as placas foram então colocadas em um coletor a vácuo (Supleco part #66879-U). As amostras passaram através da membrana de óxido de alumínio em aproximadamente 90 segundos. A placa de fundo de membrana foi lavada duas vezes com 400ul de 0,5X SSC, e depois deixada secar. Foram então adicionados trezentos microlitros de agente umectante/fixador a cada poço para torná-los transparentes e para fixar os produtos de RCA na membrana.[00095] After labeling, 100 ul samples were added to membrane-bottom plates, and the plates were then placed in a vacuum collector (Supleco part #66879-U). Samples passed through the aluminum oxide membrane in approximately 90 seconds. The membrane bottom plate was washed twice with 400ul of 0.5X SSC, and then allowed to dry. Three hundred microliters of wetting/fixing agent were then added to each well to make them transparent and to fix the RCA products to the membrane.

[00096] A imagem foi feita em um microscópio Olympus X81 com uma objetiva de 20X e uma câmera Hamamatsu Orca 4.0lt. A imagem foi realizada por meio de telas de imagens de 10x10 para cobrir todo o fundo de cada poço. As imagens foram analisadas e os produtos de RCA contados usando um software desenvolvido especificamente para essa finalidade.[00096] The image was taken on an Olympus X81 microscope with a 20X objective and a Hamamatsu Orca 4.0lt camera. Imaging was performed using 10x10 imaging screens to cover the entire bottom of each well. Images were analyzed and RCA products counted using software developed specifically for this purpose.

Results

[00097] Os resultados são resumidos na Fig.4. As contagens médias por imagem para todas as 91 amostras incluídas no experimento variaram de 3000 a pouco mais de 5000 contagens por imagem. Os histogramas mostram claramente uma diferença na proporção de contagens entre os canais 550 e 647 na mistura de proporção 0:100 (as 22 últimas amplificações), porém é mais difícil discernir, a partir da figura isolada, as diferenças de proporção nas amostras de 0, 5 & 10%. A Figura 5 é um gráfico da relação entre as contagens para os dois canais contra a composição da mistura de linha celular. Neste gráfico, a tendência é claramente representada, exemplificando o deslocamento da razão relativa nas contagens que segue a proporção de amostras de DNA da linha celular de entrada.[00097] The results are summarized in Fig.4. The average counts per image for all 91 samples included in the experiment ranged from 3000 to just over 5000 counts per image. The histograms clearly show a difference in the proportion of counts between channels 550 and 647 in the 0:100 mixture (the last 22 amplifications), but it is more difficult to discern, from the isolated figure, the differences in proportion in the 0 samples. , 5 & 10%. Figure 5 is a plot of the relationship between the counts for the two channels against the composition of the cell line mixture. In this graph, the trend is clearly represented, exemplifying the shift in the relative ratio in counts that follows the proportion of DNA samples from the input cell line.

[00098] Os dados demonstram que a deposição na membrana de óxido de alumínio resulta em contagens aproximadamente 4 vezes maiores do que quando depositado na placa de vidro pelo mesmo intervalo de tempo de 90 segundos. Se aumentarmos o tempo de incubação para 16 horas para a placa de vidro, o resultado é um aumento nos produtos de RCA sendo detectados na placa de vidro, no entanto ainda 2,5 vezes menor que observado a 90 segundos no óxido de alumínio.[00098] The data demonstrates that deposition on the aluminum oxide membrane results in counts approximately 4 times higher than when deposited on the glass plate for the same time interval of 90 seconds. If we increase the incubation time to 16 hours for the glass plate, the result is an increase in RCA products being detected on the glass plate, however still 2.5 times less than that observed at 90 seconds on the aluminum oxide.

Claims

1. Sample analysis method, characterized by: (a) filtering a liquid sample containing rolling circle amplification (RCA) products using a porous capillary membrane, thereby producing an array of RCA products on the membrane; wherein the sample contains at least a first population of labeled RCA products and a second population of labeled RCA products, wherein the first and second populations of labeled RCA products are marked differently; and (b) determining the amount of the first labeled population of RCA products and the amount of the second labeled population of RCA products in an area of the membrane; wherein the determination step (b) includes counting the numbers of the first and second RCA products marked in the area.

2. Method according to claim 1, characterized by the fact that the determination step (b) further includes detecting an aggregate signal from the area.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the porous capillary membrane is a porous anodic aluminum oxide membrane.

4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized by the fact that the RCA products are distinctly labeled through hybridization of fluorescently labeled oligonucleotides to the RCA products, before the step ( The).

5. Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the method comprises imaging an area of the membrane to produce one or more images and determining the number of individually labeled RCA products in the one or more images.

6. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized by the fact that step (a) is carried out by: (i) placing the sample in the porous capillary membrane; and (ii) apply a force that moves the sample through the membrane.

7. Method according to claim 6, characterized by the fact that the force is an active force or a passive force.

8. Method according to claim 7, characterized by the fact that the active force is a centrifugal force, negative pressure or positive pressure.

9. Method according to claim 7, characterized by the fact that the passive force is applied by capillary action or evaporation.

10. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it further comprises washing the porous capillary membrane between steps (a) and (b).

11. Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the counting step comprises counting at least 1,000 RCA products marked in the membrane area.

12. Method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the inner diameter of the pores in the membrane is in the range of 2 nm to 500 nm.

13. Method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the average distance between the centers of adjacent pores in the membrane is in the range of 50 nm to 1000 nm.

14. Method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the average distance between the edges of adjacent pores in the membrane is in the range of 10 nm to 500 nm.

15. Method according to any one of claims 1 to 14, characterized by the fact that it further comprises comparing the number of first RCA products marked in the sample in relation to the number of second RCA products marked in the sample.

16. Method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the porous capillary membrane is made transparent using a wetting agent between steps (a) and (b).

17. Method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the liquid sample is a cell-free DNA sample obtained from the blood of a pregnant female.