BR112017005279B1 - Métodos para detectar um neoplasma neuroendócrino gastroenteropancreático (gep-nen), para diferenciar gep-nen estável de um gep-nen progressivo e para determinar uma resposta a uma terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo de um gep-nen - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E KITS PARA DIAGNÓSTICO DE UM NEOPLASMA NEUROENDÓCRINO GASTROENTEROPANCREÁTICO. Métodos são fornecidos para diagnosticar, detectar ou prognosticar um GEP-NEN com base na pontuação do nível de expressão de biomarcadores exibindo expressão diferencial em sujeitos tendo um GEP-NEN em relação a uma amostra de referência ou controle. A invenção também fornece composições e kits compreendendo estes biomarcadores e métodos de usar estes biomarcadores em subgrupos ou grupos destes para diagnosticar, classificar e monitorar GEP-NEN e tipos de GEP-NEN. Os métodos e composições fornecidos aqui podem ser usados para diagnosticar ou classificar um sujeito como tendo um GEP- NEN, para distinguir entre estágios diferentes de GEP-NENs, por exemplo, estáveis ou progressivos, para fornecer uma medida de risco de desenvolver um GEP-NEN progressivo, e para medir a integridade de tratamentos para GEP-NEN incluindo, mas não limitados a cirurgia e terapia com somatostatina.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

[001]A presente invenção reivindica o benefício de, e prioridade a, U.S.S.N. 62/050.465, depositado em 15 de setembro de 2014, o conteúdo do qual está aqui incorporado em sua totalidade.

Fundamentos da Invenção

[002]Neoplasma neuroendócrino (GEP-NEN) gastroenteropancreático (GEP), também referido como Tumor Neuroendócrino Gastroenteropancreático e Tumor Neuroendócrino (NET), é o segundo tumor maligno mais prevalente no trato gastrointestinal (GI) na Incidência nos EUA e a prevalência aumentou entre 100 e 600 por cento nos EUA nos últimos trinta anos, sem nenhum aumento significante em sobrevivência.

[003]Heterogeneidade e complexidade de GEP-NENs fez o diagnóstico, tratamento e classificação difícil. Estes neoplasmas carecem de várias mutações comumente associadas com outros cânceres e instabilidade de microssatélite está em grande parte ausente. Veja, Tannapfel A, Vomschloss S, Karhoff D, et al., “BRAF gene mutations are rare events in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors”, Am J Clin Pathol 2005; 123(2):256-60; Banck M, Kanwar R, Kulkarni AA, et al., “The genomic landscape of small intestine neuroendocrine tumors”, J Clin Invest 2013; 123(6):2502-8; Zikusoka MN, Kidd M, Eick G, et al., Molecular genetics of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancer 2005; 104:2292-309; Kidd M, Eick G, Shapiro MD, et al. Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors”, Cancer 2005; 103(2):229-36.

[004]Subtipos histopatológicos individuais como determinados de recursos de tecido, por exemplo, biópsia, associada com comportamento clínico distinto, ainda não há esquema definitivo de classificação ou previsão patológica geralmente aceito, impedindo a avaliação e acompanhamento do tratamento.

[005]As abordagens diagnósticas e prognósticas existentes para GEP-NENs incluem imageamrento (por exemplo, CT ou MRI), histologia, medições de hormônios circulantes e proteínas associadas com NENs, por exemplo, cromogranina A e detecção de alguns produtos genéticos. Métodos disponíveis são limitados, por exemplo, por sensibilidade e/ou especificidade baixa, incapacidade para detectar doença em estágio inicial, ou exposição ao risco de radiação. GEP- NENs frequentemente não são diagnosticados até que eles sejam metastáticos e frequentemente intratáveis. Além disso, o acompanhamento é difícil, particularmente em pacientes com carga de doença residual.

[006]Existe uma necessidade para métodos e agentes específicos e sensíveis para a detecção de GEP-NEN, incluindo GEP-NEN estável e progressivo, por exemplo, para o uso em diagnóstico, prognóstico, predição, estadiantamento, classificação, tratamento, monitoramento, e avaliação de risco, e para investigar e compreender fatores moleculares de patogênese, malignidade, e agressividade desta doença. Por exemplo, tais métodos e agentes são necessários que podem ser repetidamente e diretamente coletados com exposição de risco baixo, por exemplo, teste de sangue periférico não-invasivo, ser realizados simplesmente, rapidamente e em custo relativamente baixo.

[007]O presente pedido supera os problemas observados acima fornecendo- se novas composições, métodos, e kits para precisamente diagnosticar, detectar e monitorar a presença de GEP-NENs e/ou os tipos ou estágio de GEP-NEN em amostras de sangue periférico circulantes. Além disso, as formas de realização descritas podem ser usadas para identificar um nível de risco para um paciente desenvolver um GEP-NEN progressivo, e/ou para determinar o risco de GEP-NEN progressivo residual ou recorrente em um paciente humano tratado pós-cirurgia ou pós-somatostatina. Além disso, pode ser usado como um prognóstico para prognosticar resposta à terapia, por exemplo, radioterapia de receptor de peptídeo (PRRT).

Sumário da Invenção

[008]Em um aspecto, a presente invenção refere-se a biomarcadores de neoplasma neuroendócrino gastroenteropancreático (GEP-NEN) medidos em sangue circulante, a detecção do qual pode ser usada em métodos de diagnóstico, prognóstico e preditivos. Entre os objetos fornecidos são biomarcadores de GEP- NEN, subgrupos característicos e painéis do biomarcadores, agentes para ligar e detectar os biomarcadores, kits e sistemas contendo tais agentes, e métodos e composições para detectar os biomarcadores, por exemplo, em amostras biológicas, por exemplo, sangue, assim como usos prognósticos, preditivos, diagnósticos e terapêuticos destes.

[009]São fornecidos agentes, conjuntos de agentes, e sistemas contendo os agentes para prognóstico, detecção e diagnóstico de GEP-NEN. Tipicamente, os sistemas incluem uma pluralidade de agentes (por exemplo, conjunto de agentes), onde a pluralidade especificamente se liga a e/ou detecta uma pluralidade de biomarcadores de GEP-NEN em um painel de biomarcadores de GEP-NEN. Os agentes podem ser polipeptídeos ou polinucleotídeos isolados que especificamente se ligam a um ou mais biomarcadores de GEP-NEN. Por exemplo, são fornecidos conjuntos de polinucleotídeos e polipeptídeos isolados que se ligam a um painel de biomarcadores de GEP-NEN, e métodos e usos dos mesmos.

[010]Também são fornecidos métodos prognósticos, diagnósticos e preditivos e usos dos agentes, composições, sistemas e kits para GEP-NEN e condições, síndromes e sintomas associados. Por exemplo, são fornecidos métodos e usos para detecção, diagnóstico, classificação, predição, monitoramento terapêutico, prognóstico, ou outra avaliação de GEP-NEN ou um resultado, estágio ou nível de agressividade ou risco destes, ou condição associada. Em algumas formas de realização, os métodos são realizados determinando-se a presença, ausência, níveis de expressão, ou perfil de expressão de um biomarcador de GEP- NEN, mais tipicamente uma pluralidade de biomarcadores de GEP-NEN, tal como um subconjunto característico escolhido de um painel de biomarcadores, e/ou comparando tal informação sem níveis ou perfis ou padrões de expressão normais ou de referência. Assim, em algumas formas de realização, os métodos são realizados obtendo-se uma amostra de teste biológico e detectando-se a presença, ausência, pontuação de nível de expressão, ou perfil de expressão de um biomarcador de GEP-NEN como descrito aqui. Por exemplo, os métodos podem ser realizados com qualquer um dos sistemas de agentes, por exemplo, polinucleotídeos ou polipeptídeos, fornecidos aqui. Por exemplo, os métodos geralmente são realizados usando um ou mais dos sistemas fornecidos.

[011]São fornecidos métodos, agentes e composições para detecção de e distinguir entre vários tipos ou estágios de GEP-NEN diferentes. Tipos e estágios de GEP-NEN exemplares incluem doença estável (SD) e doença progressiva (PD) (altamente ativa).

[012]Em um aspecto, os métodos e composições fornecidos podem ser usados para especificamente e sensivelmente detectar estágios diferentes de GEP- NENs, tais como GEP-NENs em estados de doença estável (SD) ou doença progressiva (PD); em alguns aspectos, os métodos e composições podem ser usados para prever progressão da doença, resposta ao tratamento e metástase. Métodos e composições fornecidos aqui são úteis para o diagnóstico, prognóstico, predição, estadiantamento, classificação, tratamento, monitoramento, avaliação do risco e investigação de fatores moleculares associados com doença de GEP-NEN.

[013]São fornecidos tais métodos capazes de ser realizados prontamente, simplesmente, e em custo relativamente baixo, como comparado a outros métodos de diagnóstico e prognóstico.

[014]São fornecidos métodos e composições que são úteis para definir classificação à base de expressão de gene de GEP-NENs, e assim são úteis para permitir a predição de malignidade e metástase, tal como em doença de estágio inicial ou usando amostras histologicamente negativas, fornecendo estadiantamento exato, facilitando terapia racional, e em desenvolvimento de grandes conjuntos de dados clínicos validados para a terapêutica específica para GEP-NEN.

[015]Os biomarcadores de GEP-NEN podem incluir um subconjunto de biomarcadores, a expressão de que é diferente em ou é associada com a presença ou ausência de GEP-NEN, ou é diferente em ou é associada com uma classificação, estágio, agressividade, severidade, grau, metástase, sintoma, risco, resposta ou eficácia ao tratamento ou síndrome associada particular. O subconjunto de biomarcadores de GEP-NEN tipicamente inclui pelo menos 22 biomarcadores de GEP-NEN. Em algumas formas de realização, o subconjunto de biomarcadores inclui pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 biomarcadores de GEP-NEN, ou inclui ou cerca de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 biomarcadores de GEP-NEN.

[016]Por exemplo, em alguns aspectos, o subconjunto de biomarcadores inclui pelo menos 22, ou pelo menos 38, ou pelo menos 51 biomarcadores. Em um exemplo particular, o subconjunto contém pelo menos 22 biomarcadores, ou cerca de 22 biomarcadores ou 22 biomarcadores, escolhidos de um painel de 38 biomarcadores. Em algumas formas de realização, o subconjunto de biomarcadores inclui pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38 biomarcadores escolhidos de um painel de 38 biomarcadores.

[017]Pelo fato que os sistemas, métodos, e kits contêm uma pluralidade de agentes que especificamente se ligam a ou hibridizam os biomarcadores no painel, o número de biomarcadores geralmente refere-se ao número de agentes em um sistema particular. Por exemplo, entre os métodos fornecidos é um método que contém pelo menos 22 agentes de ligação, que especificamente hibridizam ou se ligam a um subconjunto de pelo menos 22 biomarcadores de GEP-NEN, respectivamente.

[018]Em alguns aspectos, o subconjunto de biomarcadores inclui pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, e/ou todo o grupo seguinte de produtos genéticos, incluindo polinucleotídeos (por exemplo, 38 transcrições) e polipeptídeos: produtos genéticos PNMA2, NAP1L1, FZD7, SLC18A2/VMAT2, NOL3, SSTR5, TPH1, RAF1, RSF1, SSTR3, SSTR1, CD59, ARAF, APLP2, KRAS, MORF4L2, TRMT112, MKI67/KI67, SSTR4, CTGF, SPATA7, ZFHX3, PHF21A, SLC18A1/VMAT1, ZZZ3, TECPR2, ATP6V1H, OAZ2, PANK2, PLD3, PQBP1, RNF41, SMARCD3, BNIP3L, WDFY3, COMMD9, BRAF e/ou GLT8D1.

[019]Em um exemplo particular, o subconjunto de 22 biomarcadores inclui produtos genéticos PNMA2, NAP1L1, FZD7, SLC18A2, NOL3, SSTR5, TPH1, RAF1, RSF1, SSTR3, SSTR1, CD59, ARAF, APLP2, KRAS, MORF4L2, TRMT112, MKI67, SSTR4, CTGF, SPATA7 e ZFHX3.

[020]Entre os métodos, agentes e sistemas fornecidos são aqueles que são capazes de classificar ou detectar um GEP-NEN em uma amostra de sangue humano. Em algumas formas de realização, os sistemas e métodos fornecidos podem identificar ou classificar um GEP-NEN em uma amostra de sangue humano. Em alguns exemplos, os sistemas podem fornecer tal informação com uma especificidade, sensibilidade, e/ou precisão de pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %, por exemplo, pelo menos 80 %.

[021]Em algumas formas de realização, o sistema pode prever respostas ao tratamento a, ou determinar se um paciente se tornou clinicamente estável seguindo, ou é responsivo ou não responsivo a, um tratamento de GEP-NEN, tal como uma intervenção cirúrgica ou terapia medicamentosa (por exemplo, terapia com análogo de somatostatina). Em alguns casos, os métodos e sistemas fazem isso com uma especificidade, sensibilidade e/ou precisão de pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %, por exemplo, com pelo menos 90 % de precisão. Em alguns casos, pode diferenciar entre GEP- NEN tratado e não tratado com uma especificidade, sensibilidade e/ou precisão de pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %, por exemplo, com uma sensibilidade e especificidade de pelo menos 85 %.

[022]Em alguns casos, o sistema pode determinar a informação de diagnóstico ou prognóstico com respeito a um sujeito previamente diagnosticado com GEP-NEN, por exemplo, se o sujeito tem um estado de doença estável (SD) ou doença progressiva (PD) de GEP-NEN, ou está em remissão completa, por exemplo, seria clinicamente categorizado como tendo doença estável, doença progressiva ou estando em remissão completa.

[023]Em algumas formas de realização, os agentes para detectar os biomarcadores, por exemplo, os conjuntos de agentes de polinucleotídeo ou polipeptídeo, e usos destes, são capazes de distinguir entre a presença e ausência de GEP-NEN em uma amostra biológica, entre amostras de GEP-NEN e mucosa e amostras de GEP-NEN, e/ou entre classes ou subtipos específicos de GEP-NENs, por exemplo, entre amostras de GEP-NEN agressivas (alta atividade) e benigna (baixa atividade).

[024]Em um aspecto, o sistema é capaz de classificar ou detectar um GEP- NEN em uma amostra de sangue humano ou amostra de saliva humana. Em um aspecto, a amostra humana é sangue total ou ácido nucleico ou proteína preparada de sangue total, sem primeiro classificar ou enriquecer qualquer população particular de células. Em um aspecto, o sistema inclui agentes que se ligam a biomarcadores em um subconjunto de pelo menos 22 biomarcadores de GEP-NEN.

[025]Em algumas formas de realização, além dos agentes que se ligam a biomarcadores de GEP-NEN, os sistemas fornecidos contêm um ou mais agentes que se ligam a produtos genéticos para o uso em normalização ou como controles, por exemplo, produtos genéticos de limpeza incluem produtos genéticos ALG9;

[026]Em algumas formas de realização, os métodos incluem selecionar um subconjunto de pelo menos 22 biomarcadores escolhidos de um painel de 38 biomarcadores úteis em gerar um classificador para GEP-NEN e estágios diferentes de GEP-NEN.

[027]Em algumas formas de realização, os métodos incluem ainda contatar uma amostra de teste a partir do paciente humano com uma pluralidade de agentes específicos aos biomarcadores no subconjunto.

[028]A amostra de teste biológica usada com os métodos pode ser qualquer amostra biológica, tal como tecido, fluido biológico, ou outra amostra, incluindo amostras de sangue, tais como plasma, soro, sangue total, buffy coat ou outra amostra de sangue, amostra de tecido, saliva, soro, urina ou sêmen. Em alguns aspectos, a amostra é obtida a partir do sangue. Frequentemente, a amostra de teste é tomada de um paciente com GEP- NEN.

[029]Os agentes podem ser quaisquer agentes para detecção de biomarcadores, e tipicamente são polinucleotídeos isolados ou polipeptídeos ou proteínas isoladas, tais como anticorpos, por exemplo, aqueles que especificamente hibridizam ou se ligam a um subconjunto ou painel de biomarcadores de GEP-NEN incluindo pelo menos 22 biomarcadores de GEP-NEN.

[030]Em algumas formas de realização, os métodos são realizados contatando-se a amostra de teste com um dos agentes fornecidos, mais tipicamente com uma pluralidade dos agentes fornecidos, por exemplo, um dos sistemas fornecidos, tal como um conjunto de polinucleotídeos que especificamente se liga ao subconjunto de biomarcadores de GEP-NEN. Em algumas formas de realização, o conjunto de polinucleotídeos inclui DNA, RNA, cDNA, PNA, DNA genômico ou oligonucleotídeos sintéticos. Em algumas formas de realização, os métodos incluem a etapa de isolar RNA a partir da amostra de teste antes de detecção, tal como por RT-PCR, por exemplo, QPCR. Assim, em algumas formas de realização, detecção dos biomarcadores de GEP-NEN, tal como níveis de expressão destes, inclui detectar a presença, ausência ou quantidade de RNA. Em um exemplo, o RNA é detectado por PCR ou por hibridização.

[031]Em um aspecto, os polinucleotídeos incluem iniciadores sentido e antessentido, tais como um par de iniciadores que é específico para cada um dos biomarcadores de GEP-NEN no subconjunto de biomarcadores. Em um aspecto desta forma de realização, a detecção dos biomarcadores de GEP-NEN é realizada por PCR, tipicamente PCR quantitativa ou tempo real. Por exemplo, em um aspecto, detecção é realizada produzindo-se cDNA a partir da amostra de teste por transcrição reversa; então amplificando o cDNA usando os pares de iniciadores sentido e antessentido que especificamente hibridizam o painel de biomarcadores de GEP-NEN, e detectando produtos da amplificação. Em algumas formas de realização, os biomarcadores de GEP-NEN incluem mRNA, cDNA ou proteína.

[032]Em algumas formas de realização, os métodos incluem ainda determinar uma pontuação de nível de expressão derivada matematicamente de biomarcadores selecionados no subconjunto na amostra de teste. Isto é a pontuação MAARC-NET (Classificação de Risco Multi-Analito para NETs). Tem duas escalas 0 a 8 e os derivados percentuais escalados para 100 %, isto é, 0 a 100 %.

[033]A pontuação MAARC-NET derivada matematicamente é o produto de um classificador construído de algoritmos de classificação preditiva, por exemplo, máquinas de vetores de suporte (SVM), análise discriminante linear (LDA), K-nearest neighbor (KNN) e/ou Bayes ingênuo (NB). Em alguns exemplos, o classificador é gerado de uma combinação de algoritmos de classificação SVM, LDA, KNN e NB e um projeto de validação cruzada de 10 vezes.

[034]Em algumas formas de realização, os métodos incluem ainda uma etapa de determinar uma pontuação de nível de expressão derivada matematicamente de biomarcadores no subconjunto em uma amostra normal ou de referência, tipicamente realizada antes das etapas de normalização e comparação.

[035]A amostra normal ou de referência pode ser de um paciente saudável ou um paciente que tem GEP-NEN. Onde a amostra de teste é de um paciente com GEP-NEN, a amostra normal ou de referência ou nível pode ser a partir da mesma ou um paciente diferente. Por exemplo, a amostra normal ou de referência pode ser a partir do paciente com GEP-NEN de um tecido, fluido ou célula não esperada conter GEP-NEN ou células de GEP-NEN. Em um outro aspecto, a amostra normal ou controle é a partir de paciente com GEP-NEN antes ou depois de intervenção terapêutica, tal como depois de cirurgia ou intervenção química. Em um outro aspecto, a amostra de referência ou normal é de um tecido ou fluido que corresponde a GEP-NEN ou metástase da amostra de teste, de um indivíduo saudável, tal como preparação de célula enterocromafina (EC) normal ou amostra de intestino delgado (SI), ou amostra de fígado, pulmão, osso, sangue, saliva, ou outro fluido corporal, tecido ou biológica normal. Em uma outra forma de realização, a amostra de teste é de uma metástase, plasma, ou sangue total ou outro fluido de um paciente com GEP-NEN e a amostra de referência é de tumor primário ou células tumorais classificadas por célula ativadas por fluorescência (FAC).

[036]Em outros aspectos, a amostra de teste é de sangue e a amostra biológica de teste é do paciente com GEP-NEN depois do tratamento e a amostra de referência é do mesmo paciente com GEP-NEN como a amostra biológica de teste, antes do tratamento; a amostra de referência é de um tecido ou fluido não contendo células de GEP-NEN; a amostra de referência é de um indivíduo saudável; a amostra de referência é de um câncer exceto GEP-NEN; a amostra de referência é de uma célula EC ou tecido de SI; a amostra biológica de teste é de um GEP-NEN metastático e a amostra de referência é de um GEP-NEN não-metastático; ou a amostra de referência é de um GEP-NEN de uma classificação diferente comparada ao paciente com GEP-NEN de que a amostra biológica de teste é obtida.

[037]Em um aspecto, a amostra biológica de teste é de um paciente com GEP-NEN antes do tratamento e a amostra normal ou de referência é do paciente com GEP-NEN depois do tratamento. Em um outro aspecto, a amostra normal ou de referência é de um tecido não-metastático do paciente com GEP-NEN.

[038]Em alguns casos, uma etapa de normalização é realizada para normalizar o nível de pontuação de expressão dos biomarcadores no subconjunto na amostra de teste ao nível de pontuação de expressão dos biomarcadores no subconjunto na amostra de referência.

[039]Em alguns casos, uma etapa de comparação é realizada para determinar se existe uma diferença, tal como uma diferença significante, entre o nível de pontuação de expressão normalizada e um valor de corte ou limite de pontuação pré-determinado. Certos valores de corte ou limites de pontuação pré- determinados são indicativos de estágios diferentes de GEP-NEN, enquanto que outros são indicativos de níveis de risco diferentes, isto é, baixos, intermediários ou altos, para desenvolver um GEP-NEN progressivo.

[040]Em um aspecto, os métodos incluem comparar o nível de pontuação de expressão normalizada com um valor de corte pré-determinado escolhido para excluir um controle ou amostra de referência, em que um nível de expressão normalizado acima do valor de corte pré-determinado é indicativo de um GEP-NEN, em que o valor de corte é cerca de 2 (em uma escala de 0 a 8, ou 13,4 % em uma escala de 0 a 100 %).

[041]Em um outro aspecto, os métodos incluem comparar o nível de pontuação de expressão normalizada com um valor de corte pré-determinado escolhido para excluir um GEP-NEN não-progressivo, em que um nível de expressão normalizado acima do valor de corte pré-determinado de 5 (em uma escala de 0 a 8, ou 43,4 % em uma escala de 0 a 100 %) é indicativo de GEP-NEN progressivo.

[042]Em um outro aspecto, os métodos incluem ainda identificar o nível de risco para um paciente humano desenvolver GEP-NEN progressivo, em que um nível de pontuação de expressão normalizada abaixo de cerca de 5 (ou 43,4 %) é indicativo de um nível baixo de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo, um nível de pontuação de expressão normalizada entre cerca de 5 e 7 (43,4 % a 63,4 %) é indicativo de um nível intermediário de risco para desenvolver GEP-NEN progressivo, e um nível de pontuação de expressão normalizada entre cerca de 7 e 8 (>63,4 %) é indicativo de um nível alto de risco para desenvolver GEP-NEN progressivo.

[043]Em alguns casos, uma determinação subsequente é realizada para o nível de expressão real (nenhuma pontuação de nível de expressão derivada matematicamente) de genes individuais, onde identificar o nível intermediário de risco para desenvolver GEP-NEN progressivo inclui ainda determinar um primeiro estado de risco intermediário, em que o nível de pontuação de expressão normalizada entre uma amostra de referência não-progressiva e a amostra de teste é cerca de 5 (43,4 %), o nível de expressão normalizado de SMARCD3 é abaixo de um primeiro valor limite, e o nível de expressão de TPH1 é abaixo de um segundo valor limite.

[044]Em outros casos, identificar o nível intermediário de risco para desenvolver GEP-NEN progressivo inclui ainda determinar um segundo estado de risco intermediário, em que o nível de pontuação de expressão normalizada entre uma amostra de referência não-progressiva e a amostra de teste é cerca de 6 (52,7 %), o nível de expressão normalizado de VMAT1 é igual a ou acima de 0, e o nível de expressão de PHF21A é igual a ou acima de um primeiro valor limite.

[045]Em alguns casos, identificar o nível intermediário de risco para desenvolver GEP-NEN progressivo inclui ainda determinar um terceiro estado de risco intermediário, em que o nível de pontuação de expressão normalizada entre uma amostra de referência não-progressiva e a amostra de teste é cerca de 7 (63,4 %), o nível de expressão de VMAT1 é igual a ou acima de 0, e o nível de expressão de PHF21A é igual a ou abaixo de um primeiro valor limite.

[046]Em outros casos, identificar o nível alto de risco para desenvolver GEP- NEN progressivo inclui ainda determinar o nível de pontuação de expressão normalizada de ZZZ3, em que a pontuação do nível de expressão de ZZZ3 é igual a ou menor do que 14.

[047]Também são fornecidos métodos e usos dos biomarcadores fornecidos, agentes, sistemas e métodos de detecção para o uso em determinar o risco de GEP-NEN progressivo residual ou recorrente em um paciente humano pós-cirurgia. Em tais casos, o nível de risco para GEP-NEN progressivo residual ou recorrente na amostra de teste pós-cirurgia é identificado, em que um nível de pontuação de expressão normalizada abaixo de cerca de 5 (43,4 %) é indicativo de um nível baixo de risco, um nível de pontuação de expressão normalizada entre cerca de 5 e 7 (43,4 a 63,4 %) é indicativo de um nível intermediário de risco, e um nível de pontuação de expressão normalizada entre cerca de 7 e 8 >63,4 %) é indicativo de um nível alto de risco.

[048]Em alguns casos, identificar o nível de risco para GEP-NEN progressivo residual ou recorrente inclui ainda determinar uma pontuação de nível de expressão elevada de produtos genéticos em pelo menos um cluster de gene como determinado entre uma amostra de teste pré-cirurgia a partir de paciente e da amostra de teste pós-cirurgia.

[049]Em algumas formas de realização, o pelo menos um cluster de gene inclui a proliferoma, signaloma, secretoma I e II, pluroma, epigenoma, pluroma, SSTRoma, e combinações destes.

[050]Em outras formas de realização, o pelo menos um cluster de gene inclui o cluster PD, o cluster ND, o cluster TD e o cluster ID. O cluster PD inclui a proliferoma, signaloma, secretoma II, pluroma e epigenoma. O cluster ND inclui o ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, Ki67, NAP1L1, NOL3, GLT8D1, PLD3, PNMA2, VMAT2, TPH1, FZD7, MORF4L2 e ZFHX3. O cluster TD inclui a Secretoma (I), a Pluroma e a SSTRoma. O cluster ID inclui a Proliferoma, secretoma (II), pluroma e epigenoma.

[051]Em outras formas de realização, determinar a expressão de produtos genéticos elevada em pelo menos um cluster de gene inclui avaliar uma pluralidade de algoritmos de cluster de gene incluindo os algoritmos PDA, NDA, TDA e IDA.

[052]Em algumas formas de realização, os métodos incluem ainda tratar o paciente com base na indicação de intermediário ou nível alto de risco para GEP- NEN progressivo residual ou recorrente por um de cirurgia ou terapia.

[053]Também são fornecidos métodos e usos dos biomarcadores fornecidos, agentes, sistemas e métodos de detecção para o uso em determinar o risco de GEP-NEN progressivo residual ou recorrente em um paciente tratado com análogo pós-somatostatina. Em tais casos, o nível de risco para falha de tratamento com somatostatina é identificado, em que um nível de pontuação de expressão normalizada abaixo de cerca de 5 (43,4 %) é indicativo de um nível baixo de risco, um nível de pontuação de expressão normalizada entre cerca de 5 e 7 (43,4 a 63,4 %) é indicativo de um nível intermediário de risco, e um nível de pontuação de expressão normalizada entre cerca de 7 e 8 (>63,4 %) é indicativo de um nível alto de risco.

[054]Os métodos podem incluir ainda determinar a diferença em pontuação de nível de expressão em pelo menos um de clusters de gene SSTRoma e Proliferoma entre uma amostra de teste pré-terapia a partir de paciente humano e a amostra de teste pós-terapia, em que um nível aumentado de pontuação de expressão é indicativo de risco aumentado para GEP-NEN progressivo residual ou recorrente.

[055]Em alguns casos, um análogo de somatostatina é administrado ao paciente humano com base na indicação de intermediário ou nível alto de risco para GEP-NEN progressivo residual ou recorrente e um nível aumentado de expressão em pelo menos um dos clusters de gene SSTRoma e Proliferoma.

[056]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta invenção pertence. Na especificação, as formas singulares também incluem os plurais a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência. As referências citadas aqui não são admitidas ser técnica anterior à invenção reivindicada. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não são intencionados a ser limitantes.

[057]Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

[058]As FIGURAS 1A a 1E são gráficos que mostram expressão de éxon diferencial em um painel de gene marcador inferido de um limiar Affymetrix Human Exon 1.0 ST em tecido de tumor neuroendócrino (NET) em relação a controles da mucosa intestinal normal. Expressões de éxon normalizadas com RMA de (a) Tph1, (B) VMAT2, (C) SCG5, (D) CgA e (E) PTPRN2 foram visualizadas em normal (verde) e tumor (amostras).

[059]As FIGURAS 2A a 2E são gráficos que mostram a validação de splicing alternativo em genes marcadores por reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR). Genes marcadores A) Tph1, (B) VMAT2, (C) SCG5, (D) CgA e (E) PTPRN2 foram diferencialmente expressados em amostras de NET em relação a controles da mucosa normal.

[060]A FIGURA 3 é um gráfico de linha que mostra a precisão de predição de quatro algoritmos de classificação (SVM, LDA, KNN e Bayes) usando adição sequencial de até 22 genes significantemente supra-regulados (p < 0,05) em amostras de GEP-NET obtidas usando os resultados de validação cruzada de 10 vezes.

[061]As FIGURAS 4A a 4C são gráficos que mostram pontuações de MAARC-NET derivadas matematicamente no conjunto de teste. A) Distribuição de frequência para a pontuação de 0 a 4 nos controles, SD e PD; B) Distribuição de frequência usando uma pontuação de 0 a 8 no mesmo conjunto de amostra; C) Avaliação de correlação para cada uma das duas pontuações em A) e B).

[062]As FIGURAS 5A a 5B são gráficos que mostram pontuações de MAARC-NET no conjunto de teste e uma análise de Características Operacionais do Receptor (ROC). Na FIGURA 5A, NETs tiveram uma pontuação significantemente elevada comparada aos controles, onde valores para PD foram mais altos do que SD. Na FIGURA 5B, uma curva ROC de controles versus GEP-NETS é mostrada, em que a AUC foi > 0,98, p < 0,0001. *p < 0,05 vs. controles, #p < 0,05 vs. SD (2tailed Mann-Whitney U-test).

[063]As FIGURAS 6A a 6B são A) um gráfico de pontuações de MAARC- NET no conjunto independente, em que NETs de doença progressiva (PD) tiveram uma pontuação elevada significantemente mais alta em comparação com doença estável (SD); e B) um gráfico de distribuição de frequência para a pontuação de 0 a 8 em SD e PD. #p<0,0001 vs. SD (2-tailed Mann-Whitney U-test).

[064]As FIGURAS 7A a 7B são A) um gráfico de ROC de NETs SD versus PD com uma AUC de > 0,93, p < 0,0001 e B) um gráfico da porcentagem de NETs SD e PD corretamente chamados usando uma pontuação de corte de > 7.

[065]A FIGURA 8 é um nomograma para NETest 1 que demonstra como a pontuação é obtida e categoriza pacientes em classes de doença diferentes.

[066]A FIGURA 9 é um gráfico da utilidade do nomograma de FIG. 8. As porcentagens de NETs SD e PD corretamente prognosticados, incluindo o nível de atividade de doença, usando o nomograma de FIG. 8 são mostradas.

[067]As FIGURAS 10A a 10B são gráficos que mostram a distribuição de frequência para a pontuação de 0 a 8 em tumores NET SD e PD em A) o conjunto de teste e B) o conjunto independente.

[068]As FIGURAS 11A a 11B são gráficos de a) a distribuição de frequência para a pontuação de 0 a 8 em SD e PD nos conjuntos combinados e B) a probabilidade de risco para uma pontuação sendo SD ou PD vs. Pontuação NETest.

[069]A FIGURA 12 é um nomograma de NETest 2a com a inclusão de categorizações de pontuação e risco. Figura do topo inclui MAARC-NET como pontuações de 0 a 8; figura do fundo é a versão escalada de 0 a 100 %.

[070]A FIGURA 13 é um nomograma de NETest 2 com a inclusão de delineação de categoria de risco.

[071]As FIGURAS 14A a 14B são ilustrações que representam Hallmarks de Neoplasia reorientadas em NETs. A FIGURA 14A mostra uma hallmarks derivada de delineação de tumor (adenocarcinoma) a partir de Hanahan D, Weinberg RA: Hallmarks de câncer: a próxima geração. Cell 2011, 144(5):646-674. A FIGURA 14B mostra hallmark de NET com base na classificação Hanahan e Weinberg.

[072]As FIGURAS 15A a 15B são gráficos que mostram expressão de gene normalizada de clusters de gene em A) mucosa normal e B) NETs.

[073]As FIGURAS 16 é um gráfico de expressão de gene normalizada como avaliada pelos algoritmos PDA e NDA em mucosa normal (NM) e NET.

[074]As FIGURAS 17A a 17C são gráficos de expressão de gene normalizada em A) mucosa normal, B) um cluster de gene relacionado com SD, e C) um cluster de gene relacionado com PD.

[075]A FIGURA 18 é um gráfico de expressão de gene normalizada em um conjunto de teste independente, onde os genes em tumores PD e SD foram avaliados.

[076]As FIGURAS 19A a 19B são gráficos que mostram expressão de gene normalizada de algoritmos de cluster de gene PDA e NDA em A) o conjunto de teste e B) o conjunto independente.

[077]As FIGURAS 20A a 20B são gráficos que mostram A) expressão de gene normalizada de algoritmos de cluster de gene PDA e NDA no conjunto combinado, e B) uma curva de análise ROC de PDA e NDA para diferenciar SD de PD, onde *p < 0,05 vs. SD.

[078]As FIGURAS 21A a 21B são gráficos que mostram expressão de gene normalizada como avaliada por algoritmos de cluster de gene TDA e IDA em A) o conjunto de teste, e B) o conjunto independente.

[079]As FIGURAS 22A a 22B são gráficos que mostram uma análise ROC de a) TDA e IDA para diferenciar SD de PD, e B) para cada um dos clusters de gene individuais.

[080]As FIGURAS 23A a 23B são gráficos que mostram a alternação em A) Pontuação de NETest em condições de Pré- e Pós-Cirurgia e B) níveis de Cromogranina A (CgA) circulantes em condições de Pré- e Pós-Cirurgia.

[081]As FIGURAS 24A a 24B são ilustrações que mostram diferenças no nomograma de NETest em A) condições de terapia pré-cirúrgica e B) condições de terapia pós-cirúrgica.

[082]As FIGURAS 25A a 25B são gráficos que mostram a mudança de porcentagem em A) pontuação derivada matematicamente e B) Cromogranina A tanto em condições de R0 (resseções completas) quanto de R1/2 (seções incompletas).

[083]As FIGURAS 26A a 26D são gráficos que mostram a diferença em pontuação de NETest para algoritmos derivados de gene, A) PDA, B) NDA, C) TDA e D) IDA, em condições pré- e pós-cirurgia.

[084]As FIGURAS 27A a 27I são gráficos que mostram as diferenças em pontuação de NETest para clusters derivados de gene, A) SSTRoma, B) Proliferoma, C) Signaloma, D) Metaboloma, E) Secretoma, F) Secretoma, G) Pluroma, H) Epigenoma, e I) ApopToma, em condições de pré- e pós-cirurgia.

[085]A FIGURA 28 é um nomograma de NETest 3 com a inclusão de algoritmos cirurgicamente relevantes e clusters de gene.

[086]As FIGURAS 29A a 29B são gráficos que mostram as diferenças em A) pontuação de NETest e B) níveis de CgA circulantes, cada um em condições de doença estável (SD) e falha de tratamento (equivalente de condições de PD) com análogo de somatostatina (SSA).

[087]As FIGURAS 30A a 30D são gráficos que mostram as diferenças em algoritmos derivados de gene, A) PDA, B) NDA, C) TDA e D) IDA, em pacientes estavelmente tratados (SD) e falha de tratamento (PD).

[088]As FIGURAS 31A a 31I são gráficos que mostram as diferenças em clusters derivados de gene, especificamente A) SSTRoma, B) Proliferoma, C) Signaloma, D) Metaboloma, E) Secretoma, F) Secretoma, G) Pluroma, H) Epigenoma e I) ApopToma, em pacientes estavelmente tratados (SD) e falha de tratamento com SSA (equivalente de condições PD).

[089]As FIGURAS 32A a B são gráficos que mostram uma análise ROC de acordo com A) algoritmos de cluster derivados de gene e B) clusters de gene para diferenciar falha de tratamento (equivalente de condições de PD) a partir de controles.

[090]As FIGURAS 33A a B são gráficos que mostram a porcentagem de chamadas corretas para cada um de A) os algoritmos de cluster derivados de gene e clusters para definir falha de tratamento em pacientes categorizados como SD e B) um melhor de 3 superado por uma combinação de SSTRoma e Proliferoma.

[091]A FIGURA 34 é um nomograma para pacientes tratados com análogo de somatostatina incluindo a pontuação derivada matematicamente assim como a SSTRoma, Proliferoma e sua combinação.

[092]As FIGURAS 35A a 35B são gráficos que demonstram eficácia terapêutica de SSAs e a proporção de pacientes com pontuações de NETest baixas/altas que desenvolveram recidiva de doença.

[093]As FIGURAS 36A a 36B são gráficos que demonstram o ponto no tempo quando o NETest foi elevado (>80 %) ou CgA foi anormal antes do desenvolvimento de recidiva de doença de imagem positiva assim como os tempos que estes eventos ocorreram antes de recidiva de doença de imagem-positiva.

[094]As FIGURAS 37A a 37D são gráficos que demonstram as pontuações de NETest antes do seguimento a longo prazo (a), e os tempos de recaída em pacientes com pontuações elevadas (B,D) ou tempo livre de doença (D).

[095]As FIGURAS 38A a 38F são gráficos incluindo índice de Ki67 prognosticado versus índice de Ki67 em A-B) SSTRoma, C-E) Todos os genes, e DF) genes altamente relevantes (KRAS, SSTR4 e VPS13C).

[096]As FIGURAS 39A a 39F são gráficos que mostram as correlações (regressão linear) entre clusters de gene ou algoritmos, A) SSTRoma e Ki67, B) TDA e Ki67, C) Proliferoma e Ki67, D) PDA e Ki67, E) IDA e Ki67, e F) PDA e Ki67, cada um versus o índice de Ki-67.

[097]As FIGURAS 40A a 40D são gráficos que modelam SUVmax prognosticado (captação tumoral - uma medida de densidade de receptor/disponibilidade de alvo) para SSTRoma (Grupo I: (a) e (C)) e todos os genes (Grupo II: (B) e (D)).

[098]As FIGURAS 41A a 41F são gráficos que modelam MTV (volume tumoral molecular - uma medida da carga tumoral) em genes individuais (A-B), SSTRoma (C-E), e todos os genes (D-F).

[099]As FIGURAS 42A a 42C são gráficos que mostram expressão de ZFHX3 em pacientes identificados com (a) novas lesões por imageamento, com (B) doença progressiva por RECIST, e (C) após a cirurgia.

[0100]As FIGURAS 43A a 43B são gráficos que mostram expressão de ZFHX3 em (a) pacientes que permanecem em um estado de doença estável de GEP-NEN versus (B) aqueles que desenvolvem um estado de doença progressiva de GEP-NEN.

[0101]As FIGURAS 44A a 44C são gráficos que representam A) a efetividade de terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo (PRRT), B) (B) mudanças em Pontuação de NETest versus estados clínicos em Acompanhamento 6M (FuP) em respondedores (R) e não-respondedores (NR); e (C) mudança em nível de CgA versus estados clínicos em FuP 6M.

[0102]As FIGURAS 45 são gráficos que mostram concordância entre o NETest em respondedores e não-respondedores antes e depois de terapia e em adição à comparação com CgA.

[0103]As FIGURAS 46A a 46B mostram a precisão da Pontuação NETest versus CgA para respostas ao tratamento.

[0104]As FIGURAS 47A a 47D mostram expressão de dois subgrupos de genes de NETest, a signaloma e metaboloma em amostras de sangue antes da terapia e as diferenças entre respondedores (R) e não-respondedores (NR), a utilidade preditiva de cada um assim como quando combinados em um índice biológico (47B), a utilidade para prognosticar resposta ao tratamento sozinho (Quociente) ou como uma combinação com grau (Combinação) (47C) e as métricas da combinação para prognosticar o resultado de terapia PRRT (47D).

Descrição Detalhada da Invenção

[0105]Três quartos de todos genes humanos passam por splicing alternativo. Identificando e definindo variantes de emenda específicas para câncer é, portanto, vantajoso para o desenvolvimento de ensaios de bio-marcador. As formas de realização descritas derivam de descoberta surpreendente que variantes de emenda específicas para câncer particulares de genes marcadores de NET podem ser usados para maximizar a diferença entre amostras de neoplasia e normais em métodos de diagnóstico de biomarcador.

[0106]A presente invenção fornece um método para detectar um neoplasma neuroendócrino gastroenteropancreático (GEP-NEN) em um sujeito em necessidade deste, incluindo determinar o nível de expressão de pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito contatando-se a amostra de teste com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores, em que os 22 biomarcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em APLP2, ARAF, ATP6V1H, BNIP3L, BRAF, CD59, COMMD9, CTGF, FZD7, GLT8D1, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, OAZ2, PANK2, PHF21A, PLD3, PNMA2, PQBP1, RAF1, RNF41, RSF1, SLC18A1/VMAT1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TECPR2, TPH1, TRMT112, WDFY3, ZFHX3 e ZZZ3; determinar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores; normalizar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste para o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; determinar a presença de um GEP-NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que o valor de corte pré-determinado ou determinar a ausência de um GEP-NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é abaixo do valor de corte pré- determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 2 em uma escala do sistema de pontuação MAARC-NET de 0 a 8, ou 0 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0107]A pontuação é fundamentada em uma estratégia de “voto majoritário” e foi desenvolvida a partir de um sistema de classificação binário pelo qual uma amostra será chamada “normal” e fornece uma pontuação de 0 ou “tumor” e será registrado “1”. A pontuação pode variar de 0 (quatro chamadas todas “normais”) a 4 (quatro chamadas todas “tumorais”). Cada “chamada” é o resultado binário (“0” para normal ou “1” para tumor) de um de quatro algoritmos de aprendizagem diferentes: Máquina de Vetores de Suporte (SVM), Análise de Discriminação Linear (LDA), K- Nearest Neighbor (KNN), e Bayes Ingênuos (Bayes). Cada um destes quatro algoritmos de aprendizagem foi treinado em um conjunto de treinamento interno incluindo 67 controles e 63 GEP-NEN. Neste conjunto de treinamento, genes diferencialmente expressados (controle versus GEP-NEN) foram identificados como significantes usando um t-teste. Com base no conjunto de treinamento, cada um dos algoritmos de aprendizagem foi treinado para diferenciar entre expressão de gene normal e de tumor para dentro de um nível de significância de pelo menos p < 0,05. De acordo com a estratégia de voto majoritário, aquelas amostras com menos do que 2 chamadas “normais” são classificadas como GEP-NEN.

[0108]O pelo menos 22 biomarcadores podem incluir APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3.

[0109]Os métodos podem incluir ainda determinar a presença de um GEP- NEN progressivo no sujeito quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou mais alto do que o valor de corte pré-determinado, em que o valor de corte pré- determinado é 5 em uma escala de 0 a 8, ou menor do que 55 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0110]Os métodos podem incluir ainda identificar um nível de risco para o sujeito desenvolver um GEP-NEN progressivo, o método incluindo ainda identificar um nível baixo de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo quando o nível de expressão normalizado é menor do que um valor de corte pré-determinado de 5 em uma escala de 0 a 8, ou menor do que 55 % em uma escala de 0 a 100 %; identificar um nível intermediário de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 5 e menor do que um valor de corte pré- determinado de 7 em uma escala de 0 a 8, ou igual a ou maior do que 55 % e menor do que 75 % em uma escala de 0 a 100 %; ou identificar um nível alto de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 7 em uma escala de 0 a 8, ou igual a ou maior do que 75 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0111]O biomarcador pode ser RNA, cDNA ou proteína. Quando o biomarcador é RNA, o RNA pode ser transcrito reverso para produzir cDNA (tal como por RT-PCR, e o nível de expressão de cDNO produzido é detectado. O nível de expressão do biomarcador pode ser detectado formando-se um complexo entre o biomarcador e uma sonda ou iniciador rotulado. Quando o biomarcador é RNA ou cDNA, o RNA ou cDNA detectado forma-se um complexo entre o RNA ou cDNA e uma sonda ou iniciador de ácido nucleico marcado. O complexo entre o RNA ou cDNA e a sonda ou iniciador de ácido nucleico rotulado pode ser um complexo de hibridização. Quando o biomarcador é proteína, a proteína pode ser detectada formando-se um complexo entre a proteína e um anticorpo rotulado. O rótulo pode ser qualquer rótulo, por exemplo, um rótulo fluorescente, rótulo de quimioluminescência, rótulo radioativo, etc.

[0112]A amostra de teste pode ser qualquer fluido biológico obtido a partir do sujeito. Preferivelmente, a amostra de teste é sangue, soro, plasma ou tecido neoplástico. A amostra de referência pode ser qualquer fluido biológico obtido a partir de um sujeito não tendo, mostrando sintomas de ou diagnosticado com uma doença neoplástica. Preferivelmente, a amostra de referência é sangue, soro, plasma ou tecido não-neoplástico.

[0113]O sujeito em necessidade deste pode ser um sujeito diagnosticado com um GEP-NEN, um sujeito tendo pelo menos um sintoma de GEP-NEN ou um sujeito tendo uma pré-disposição ou histórico familiar para desenvolver um GEP- NEN. O sujeito pode ser qualquer mamífero. Preferivelmente, o sujeito é ser humano. Os termos sujeito e paciente são usados permutavelmente aqui.

[0114]Os métodos podem incluir ainda tratar um sujeito identificado como tendo um nível intermediário ou nível alto de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo com cirurgia ou terapia medicamentosa. A terapia medicamentosa pode ser tratamento com análogo de somatostatina ou terapia com radioterapia de receptor de peptídeo (PRRT). Os métodos podem incluir ainda tratar um sujeito identificado como tendo um nível baixo de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo com monitoramento regular ou periódico durante pelo menos um período de seis meses, um período de doze meses, um período de dezoito meses ou período de vinte e quatro meses.

[0115]A presente invenção também fornece um método para diferenciar GEP-NEN estável e progressivo em um sujeito compreendendo determinar que o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores a partir da amostra de teste a partir do sujeito é igual ao ou maior do que um valor de corte pré- determinado de 5 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 6, de acordo com os métodos da presente invenção; detectar um nível de expressão de SMARCD3 e TPH1 a partir da amostra de teste e a partir de uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de SMARCD3 e a expressão de TPH1; normalizar o nível de expressão de SMARCD3 e TPH1 na amostra de teste para o nível de expressão de SMARCD3 e TPH1 na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de SMARCD3 e TPH1 na amostra de teste com um primeiro e um segundo valor de corte pré-determinado, respectivamente; e determinar a presença de GEP-NEN estável no sujeito quando o nível de expressão normalizado de SMARCD3 é maior do que o primeiro valor de corte pré-determinado e o nível de expressão de TPH1 é igual ao ou maior do que o segundo valor de corte pré-determinado, ou determinar a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito quando o nível de expressão normalizado de SMARCD3 é igual ao ou menor do que o primeiro valor de corte pré-determinado e o nível de expressão de TPH1 é menor do que o segundo valor de corte pré-determinado em que o primeiro valor de corte pré-determinado é 1,3 em uma escala de 0 a 8 e em que o segundo valor de corte pré-determinado é 4 em uma escala de 0 a 8.

[0116]O primeiro valor de corte pré-determinado de 1,3 corresponde a 12 % em uma escala de 0 a 100 % e em que o segundo valor de corte pré-determinado de 4 corresponde a 41 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0117]A presente invenção também fornece um método para diferenciar GEP-NEN estável e progressivo em um sujeito compreendendo determinar que o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores a partir da amostra de teste a partir do sujeito é igual ao ou maior do que um valor de corte pré- determinado de 6 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 7, de acordo com os métodos da presente invenção; detectar um nível de expressão de VMAT1 e PHF21A a partir da amostra de teste e a partir de uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de VMAT1 e a expressão de PHF21A, normalizar o nível de expressão de VMAT1 e PHF21A na amostra de teste para o nível de expressão de VMAT1 e PHF21A na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de VMAT1 e PHF21A na amostra de teste com um primeiro e um segundo valor de corte pré-determinado, respectivamente; e determinar a presença de GEP-NEN estável no sujeito quando o nível de expressão normalizado de VMAT1 é igual ao ou maior do que o primeiro valor de corte pré-determinado e o nível de expressão de PHF21A é menor do que o segundo valor de corte pré-determinado, ou determinar a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito quando o nível de expressão normalizado de VMAT1 é igual ao ou maior do que o primeiro valor de corte pré-determinado e o nível de expressão de PHF21A é igual ao ou maior do que o segundo valor de corte pré-determinado em que o primeiro valor de corte pré-determinado é 0 em uma escala de 0 a 8 e em que o segundo valor de corte pré-determinado é 1,2 em uma escala de 0 a 8.

[0118]O primeiro valor de corte pré-determinado de 0 corresponde a 0 % em uma escala de 0 a 100 % e em que o segundo valor de corte pré-determinado de 1,2 corresponde a 8 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0119]A presente invenção também fornece um método para diferenciar GEP-NEN estável e progressivo em um sujeito compreendendo determinar que o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores a partir da amostra de teste a partir do sujeito é igual ao ou maior do que um valor de corte pré- determinado de 7 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 8, de acordo com os métodos da presente invenção; detectar um nível de expressão de VMAT1 e PHF21A a partir da amostra de teste e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de VMAT1 e a expressão de PHF21A; normalizar o nível de expressão de VMAT1 e PHF21A na amostra de teste para o nível de expressão de VMAT1 e PHF21A na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de VMAT1 e PHF21A na amostra de teste com um primeiro e um segundo valor de corte pré-determinado, respectivamente; e determinar a presença de GEP-NEN estável no sujeito quando o nível de expressão normalizado de VMAT1 é igual ao ou maior do que o primeiro valor de corte pré- determinado e o nível de expressão de PHF21A é maior do que o segundo valor de corte pré-determinado, ou determinar a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito quando o nível de expressão normalizado de VMAT1 é igual ao ou maior do que o primeiro valor de corte pré-determinado e o nível de expressão de PHF21A é igual ao ou menor do que o segundo valor de corte pré-determinado em que o primeiro valor de corte pré-determinado é 0 em uma escala de 0 a 8 e em que o segundo valor de corte pré-determinado é 1 em uma escala de 0 a 8.

[0120]O primeiro valor de corte pré-determinado de 0 corresponde a 0 % em uma escala de 0 a 100 % e em que o segundo valor de corte pré-determinado de 1 corresponde a 7 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0121]A presente invenção também fornece um método para diferenciar GEP-NEN estável e progressivo em um sujeito compreendendo determinar que o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores a partir da amostra de teste a partir do sujeito é igual a um valor de corte pré-determinado de 8, de acordo com os métodos da presente invenção; detectar um nível de expressão de ZZZ3 a partir da amostra de teste e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com pelo menos um agente específico para detectar a expressão de ZZZ3; normalizar o nível de expressão de ZZZ3 na amostra de teste para o nível de expressão de ZZZ3 na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de ZZZ3 na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; e determinar a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito quando o nível de expressão normalizado de ZZZ3 é igual ao ou menor do que o valor de corte pré-determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 1 em uma escala de 0 a 8.

[0122]O valor de corte pré-determinado de 1 corresponde a 18 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0123]Os métodos da presente invenção incluem ainda determinar o nível de expressão de cada um de 16 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 16 biomarcadores, em que os 16 biomarcadores compreendem Ki67, NAP1L1, NOL3, TECPR2, ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, PQBP1, TPH1, COMMD9, MORF4L2, RNF41, RSF1, SMARCD3 e ZFHX3; somar o nível de expressão de cada um dos 16 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo I e somar o nível de expressão de cada um dos 16 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo I, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo I comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo I indica a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito.

[0124]Os métodos da presente invenção incluem ainda determinar o nível de expressão de cada um de 15 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a quantidade de cada um dos 15 biomarcadores, em que os 15 biomarcadores compreendem ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, Ki67, NAP1L1, NOL3, GLT8D1, PLD3, PNMA2, VMAT2, TPH1, FZD7, MORF4L2 e ZFHX3; calcular a média do nível de expressão de cada um dos 15 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste de diagnóstico progressivo II e calcular a média do nível de expressão de cada um dos 15 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência de diagnóstico progressivo II, em que um valor aumentado do valor de teste de diagnóstico progressivo II comparado ao valor de referência de diagnóstico progressivo II indica a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito.

[0125]Os métodos da presente invenção incluem ainda determinar o nível de expressão de cada um de 7 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a quantidade de cada um dos 7 biomarcadores, em que os 7 biomarcadores compreendem PNMA2, VMAT2, COMMD9, SSTR1, SSTR3, SSTR4 e SSTR5; somar o nível de expressão de cada um dos 7 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo III e somar o nível de expressão de cada um dos 7 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo III, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo III comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo III indica a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito.

[0126]Os métodos da presente invenção incluem ainda determinar o nível de expressão de cada um de 11 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a quantidade de cada um dos 11 biomarcadores, em que os 11 biomarcadores compreendem Ki67, NAP1L1, NOL3, TECPR2, PQBP1, TPH1, MORF4L2, RNF41, RSF1, SMARCD3 e ZFHX3; somar o nível de expressão de cada um dos 11 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo IV e somar o nível de expressão de cada um dos 11 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo IV, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo IV comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo IV indica a presença de GEP-NEN progressivo no sujeito.

[0127]A presente invenção também fornece um método para determinar o risco de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo em um sujeito pós- cirurgia, incluindo determinar o nível de expressão de pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito contatando-se a amostra de teste com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores, em que os 22 biomarcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em APLP2, ARAF, ATP6V1H, BNIP3L, BRAF, CD59, COMMD9, CTGF, FZD7, GLT8D1, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, OAZ2, PANK2, PHF21A, PLD3, PNMA2, PQBP1, RAF1, RNF41, RSF1, SLC18A1/VMAT1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TECPR2, TPH1, TRMT112, WDFY3, ZFHX3 e ZZZ3; determinar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores; normalizar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste para o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; identificar uma ausência de risco de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo pós-cirurgia quando o nível de expressão normalizado é menor do que um valor de corte pré-determinado de 2 em uma escala de 0 a 8, ou menor do que 0 % em uma escala de 0 a 100 %; identificar um nível baixo de risco de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo pós-cirurgia quando o nível de expressão normalizado é menor do que um valor de corte pré- determinado de 5 em uma escala de 0 a 8, ou menor do que 55 % em uma escala de 0 a 100 %; identificar um nível intermediário de risco de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo pós-cirurgia quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 5 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 7 em uma escala de 0 a 8, ou igual a ou maior do que 55 % e menor do que 75 % em uma escala de 0 a 100 %; ou identificar um nível alto de risco de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo pós-cirurgia quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 7 em uma escala de 0 a 8, ou igual a ou maior do que 75 % em uma escala de 0 a 100 %.

[0128]A presente invenção também fornece um método para determinar o risco de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo em um sujeito tratado com somatostatina, incluindo determinar o nível de expressão de pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito contatando-se a amostra de teste com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores, em que os 22 biomarcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em APLP2, ARAF, ATP6V1H, BNIP3L, BRAF, CD59, COMMD9, CTGF, FZD7, GLT8D1, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, OAZ2, PANK2, PHF21A, PLD3, PNMA2, PQBP1, RAF1, RNF41, RSF1, SLC18A1/VMAT1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TECPR2, TPH1, TRMT112, WDFY3, ZFHX3 e ZZZ3; determinar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores; normalizar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste para o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; determinar a presença de um GEP- NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que o valor de corte pré-determinado ou determinar a ausência de um GEP-NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é abaixo do valor de corte pré- determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 2 em uma escala do sistema de pontuação MAARC-NET de 0 a 8, ou 0 % em uma escala de 0 a 100 %; quando um GEP-NEN está presente, determinar o nível de expressão de cada um de 8 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 8 biomarcadores, em que os 8 biomarcadores compreendem Ki67, NAP1L1, NOL3, TECPR2, SSTR1, SSTR2, SSTR4 e SSTR5; somar o nível de expressão de cada um dos 8 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo V e somar o nível de expressão de cada um dos 8 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo V, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo V comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo V indica a presença de reincidir ou ocorrer novamente GEP-NEN progressivo no sujeito.

[0129]A presente invenção também fornece um método para determinar uma resposta de uma terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo (PRRT) de um GEP-NEN em um sujeito em necessidade desta, incluindo determinar o nível de expressão de cada um de 8 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 8 biomarcadores, em que os 8 biomarcadores compreendem ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, ATP6V1H, OAZ2, PANK2, PLD3; normalizar o nível de expressão dos 8 biomarcadores na amostra de teste para o nível de expressão dos 8 biomarcadores na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado dos 8 biomarcadores na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; determinar a presença de um GEP-NEN responsivo à PRRT no sujeito quando o nível de expressão normalizado dos 8 biomarcadores é maior do que um valor de corte pré-determinado, em que o valor de corte pré- determinado é 5,9 em uma escala de 0 a 8.

[0130]A presente invenção também fornece um método para determinar uma resposta de uma terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo (PRRT) de um GEP-NEN em um sujeito em necessidade deste, incluindo (a) após um primeiro ciclo de terapia PRRT: determinar o nível de expressão de pelo menos 22 biomarcadores a partir de uma primeira amostra de teste de ciclo a partir do sujeito contatando-se a primeira amostra de teste de ciclo com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores, em que os 22 biomarcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em APLP2, ARAF, ATP6V1H, BNIP3L, BRAF, CD59, COMMD9, CTGF, FZD7, GLT8D1, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, OAZ2, PANK2, PHF21A, PLD3, PNMA2, PQBP1, RAF1, RNF41, RSF1, SLC18A1/VMAT1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TECPR2, TPH1, TRMT112, WDFY3, ZFHX3 e ZZZ3; determinar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores; normalizar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores em a primeira amostra de teste de ciclo para o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de referência; (b) após um segundo ciclo de terapia PRRT, determinar o nível de expressão de pelo menos 22 biomarcadores a partir de uma segunda amostra de teste de ciclo a partir do sujeito contatando-se a amostra de teste com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores, em que os 22 biomarcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em APLP2, ARAF, ATP6V1H, BNIP3L, BRAF, CD59, COMMD9, CTGF, FZD7, GLT8D1, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, OAZ2, PANK2, PHF21A, PLD3, PNMA2, PQBP1, RAF1, RNF41, RSF1, SLC18A1/VMAT1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TECPR2, TPH1, TRMT112, WDFY3, ZFHX3 e ZZZ3; determinar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores; normalizar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores no segundo ciclo amostra de teste para o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de referência; (c) determinar uma razão de mudança dos níveis de expressão normalizados de (a) para os níveis de expressão normalizados de (b); (d) determinar a presença de um GEP-NEN responsivo à PRRT quando a razão de mudança é maior do que um valor de corte de pré-terapia PRRT, em que o valor de corte de pré-terapia PRRT é 1 em uma escala de 0 a 8.

[0131]A presente invenção também fornece um método para determinar uma progressão de um GEP-NEN em um sujeito em necessidade deste, incluindo determinar o nível de expressão de ZFHX3 de uma amostra de teste a partir do sujeito contatando-se a amostra de teste com um agente específico para detectar a expressão de ZFHX3; determinar o nível de expressão de ZFHX3 de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com um agente específico para detectar a expressão de ZFHX3; normalizar o nível de expressão de ZFHX3 na amostra de teste para o nível de expressão de ZFHX3 na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de ZFHX3 na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; determinar a progressão de um GEP-NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que o valor de corte pré-determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 0,5 em uma escala de 0 a 8.

[0132]A presente invenção também fornece um método para prognosticar proliferação de tumor de um GEP-NEN em um sujeito em necessidade deste, incluindo (a) determinar o nível de expressão de pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito contatando-se a amostra de teste com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores, em que os 22 biomarcadores são selecionados a partir do grupo consistindo em APLP2, ARAF, ATP6V1H, BNIP3L, BRAF, CD59, COMMD9, CTGF, FZD7, GLT8D1, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, OAZ2, PANK2, PHF21A, PLD3, PNMA2, PQBP1, RAF1, RNF41, RSF1, SLC18A1/VMAT1, SLC18A2/VMAT2, SMARCD3, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TECPR2, TPH1, TRMT112, WDFY3, ZFHX3 e ZZZ3; determinar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores de uma amostra de referência contatando-se a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de o pelo menos 22 biomarcadores; normalizar o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste para o nível de expressão de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de referência; comparar o nível de expressão normalizado de o pelo menos 22 biomarcadores na amostra de teste com um valor de corte pré-determinado; determinar a presença de um GEP-NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é igual ao ou maior do que o valor de corte pré-determinado ou determinar a ausência de um GEP-NEN no sujeito quando o nível de expressão normalizado é abaixo do valor de corte pré- determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 2 em uma escala do sistema de pontuação MAARC-NET de 0 a 8, ou 0 % em uma escala de 0 a 100 %; (b) quando um GEP-NEN está presente, determinar o nível de expressão de cada um de 3 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 3 biomarcadores, em que os 3 biomarcadores compreendem KRAS, SSTR4 e VPS13C; somar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo VI e somar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo VI, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo VI comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo VI indica a presença de proliferação de tumor de um GEP-NEN no sujeito.

[0133]O método em que (b) inclui ainda determinar o nível de expressão de cada um de 3 biomarcadores de uma amostra de teste a partir do sujeito e uma amostra de referência contatando-se a amostra de teste e a amostra de referência com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 3 biomarcadores, em que os 3 biomarcadores compreendem SSTR1, SSTR2 e SSTR5; somar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores da amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo VII e somar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores da amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo VII, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo VII comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo VII indica a presença de proliferação de tumor de um GEP-NEN no sujeito.

[0134]Como usado aqui, o termo “biomarcador de GEP-NEN” e “biomarcador de NET” refere-se sinonimamente a uma molécula biológica, tal como um produto genético, a expressão ou presença do qual (por exemplo, o nível de expressão ou perfil de expressão) por si só ou em comparação com um ou mais outros biomarcadores (por exemplo, expressão relativa) difere (isto é, é aumentada ou diminuída) dependendo da presença, ausência, tipo, classe, severidade, metástase, localização, estágio, prognóstico, sintoma associado, resultado, risco, probabilidade ou resposta ao tratamento, ou prognóstico de doença de GEP-NEN, ou é associado positivamente ou negativamente com tais fatores da predição destes.

[0135]Como usado aqui, o termo “polinucleotídeo” ou molécula de ácido nucleico significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases ou pares de base em comprimento, ribonucleotídeos ou deoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeos, e é significado incluir formas de filamento único e duplo de DNA. Como usado aqui, uma molécula de ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico que serve como uma sonda em uma análise de microarranjo preferivelmente compreende uma cadeia de nucleotídeos, mais preferivelmente DNA e/ou RNA. Em outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico compreende outros tipos de estruturas de ácido nucleico tais como, por exemplo, uma hélice de DNA/RNA, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico fechado (LNA) e/ou uma ribozima. Consequentemente, como usado aqui, o termo “molécula de ácido nucleico” também abrange uma cadeia compreendendo nucleotídeos não-naturais, nucleotídeos modificados e/ou blocos de construção de não-nucleotídeo que exibem a mesma função como nucleotídeos naturais.

[0136]Como usado aqui, os termos “hibridizar”, “hibridizando”, “hibridiza”, e semelhantes, usados no contexto de polinucleotídeos, são significados a referir-se a condições de hibridização convencional, preferivelmente tais como hibridização em formamida a 50 %/6XSSC/SDS a 0,1 %/100 μg/ml de ssDNA, em que temperaturas para hibridizar são acima de 37 graus e temperaturas para lavar em XSSC a 0,1/SDS a 0,1 % são acima de 55 graus C, e o mais preferivelmente para condições de hibridização severas.

[0137]O termo “biópsia de sangue” refere-se a um estudo de diagnóstico do sangue para determinar se um paciente apresentando com sintomas tem uma condição que pode ser classificada como benigna (baixa atividade) ou maligna (alta atividade/metastática).

[0138]O termo “classificação”, como usado aqui, com respeito a tipos ou estágios diferentes de GEP-NEN refere-se ao ato de compilar e analisar os dados de expressão para usar técnicas estatísticas para fornecer uma classificação para ajudar em diagnóstico de um estágio ou tipo de GEP-NEN.

[0139]O termo “classificador”, como usado aqui, refere-se a um algoritmo que discrimina entre estados de doença com um nível pré-determinado de significância estatística. Um classificador de duas classes é um algoritmo que usa pontos de dados a partir de medições de uma amostra e classifica os dados em um de dois grupos. Um classificador de multi-classe é um algoritmo que usa pontos de dados a partir de medições de uma amostra e classifica os dados em um de múltiplos grupos. O “classificador” maximiza a probabilidade de distinguir uma amostra de câncer aleatoriamente selecionada a partir de uma amostra benigna aleatoriamente selecionada, isto é, a área sob uma curva (AUC) de curva característica operacional do receptor (ROC).

[0140]O termo “normalização” ou “normalizador”, como usado aqui, refere-se à expressão de um valor diferencial em termos de um valor padrão para ajustar os efeitos que surgem de variação técnica devido ao manejo de amostra, preparação de amostra e medição de espectrometria de massas em vez de variação biológica de concentração de proteína em uma amostra. Por exemplo, ao medir a expressão de uma proteína diferencialmente expressada, o valor absoluto para a expressão da proteína pode ser expressado em termos de um valor absoluto para a expressão de uma proteína padrão que é substancialmente constante em expressão.

[0141]O termo “condição”, como usado aqui, refere-se geralmente a uma doença, evento ou mudança em estado de saúde.

[0142]Os termos “diagnóstico” e “diagnósticos” também abrangem os termos “prognóstico” e “prognósticos”, respectivamente, assim como as aplicações de tais procedimentos sobre dois ou mais pontos no tempo para monitorar o diagnóstico e/ou prognóstico com o passar do tempo, e modelo estatístico com base nestes. Além disso, o termo diagnóstico inclui: a. predição (determinar se um paciente provavelmente irá desenvolver doença agressiva (hiperproliferativa/invasiva)), b. prognóstico (prognosticar se um paciente provavelmente irá ter um resultado melhor ou pior em um tempo pré-selecionado no futuro), c. seleção de terapia, d. monitoramento de fármaco terapêutico, e e. monitoramento de recidiva.

[0143]O termo “fornecendo”, como usado aqui, com respeito a uma amostra biológica refere-se à obtenção direta ou indiretamente da amostra biológica de um sujeito. Por exemplo, “fornecendo” pode referir-se ao ato de obter diretamente a amostra biológica de um sujeito (por exemplo, por uma extração de sangue, biópsia de tecido, lavagem interna e semelhantes). Do mesmo modo, “fornecendo” pode referir-se ao ato de obter indiretamente a amostra biológica. Por exemplo, fornecendo pode referir-se ao ato de um laboratório receber a amostra a partir do participante que diretamente obteve a amostra, ou ao ato de obter a amostra de um arquivo.

[0144]“Precisão” refere-se ao grau de conformidade de uma quantidade medida ou calculada (um valor de teste relatado) para seu valor real (ou verdadeiro). Precisão clínica refere-se à proporção de resultados verdadeiros (positivos verdadeiros (TP) ou negativos verdadeiros (TN) versus resultados classificados incorretamente (positivos falsos (FP) ou negativos falsos (FN)), e podem ser estabelecidos como uma sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos (PPV) ou valores preditivos negativos (NPV), ou como uma probabilidade, razão de probabilidades, entre outras medições.

[0145]O termo “amostra biológica”, como usado aqui, refere-se a qualquer amostra de origem biológica potencialmente contendo uma ou mais proteínas biomarcadoras. Exemplos de amostras biológicas incluem tecido, órgãos, ou fluidos corporais tais como sangue total, plasma, soro, tecido, lavagem interna ou qualquer outro espécime usado para detecção de doença.

[0146]O termo “sujeito”, como usado aqui, refere-se a um mamífero, preferivelmente um ser humano.

[0147]“Tratar” ou “tratamento”, como usado aqui, com respeito a uma condição pode referir-se a prevenir a condição, abrandar o início ou taxa de desenvolvimento da condição, reduzir o risco de desenvolvimento da condição, prevenir ou atrasar o desenvolvimento de sintomas associados com a condição, reduzir ou terminar sintomas associados com a condição, gerar uma regressão completa ou parcial da condição, ou alguma combinação destes.

[0148]Níveis de biomarcador podem mudar devido ao tratamento da doença. As mudanças em níveis de biomarcador podem ser medidas pela presente invenção. Mudanças em níveis de biomarcador podem ser usadas para monitorar a progressão de doença ou terapia.

[0149]“Alterado”, “mudado” ou “significantemente diferente” refere-se a uma mudança ou diferença detectável de um estado, perfil, medição razoavelmente comparável ou semelhantes. Tais mudanças podem ser todas ou nenhuma. Elas podem ser incrementais e não precisam ser lineares. Elas podem ser por ordens de magnitude. Uma mudança pode ser um aumento ou diminuição por 1 %, 5 %, 10 %, 20 %,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 100 % ou mais, ou qualquer valor em entre 0 % e 100 %. Alternativamente, a mudança pode ser 1 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou mais, ou quaisquer valores em entre 1 vez e cinco vezes. A mudança pode ser estatisticamente significante com um valor p de 0,1, 0,05, 0,001 ou 0,0001.

[0150]O termo “prevalência de doença” refere-se a o número de todos novos e velhos casos de uma doença ou ocorrências de um evento durante um período particular. Prevalência é expressada como uma razão em que o número de eventos é o numerador e a população em risco é o denominador.

[0151]O termo “incidência de doença” refere-se a uma medida do risco de desenvolver alguma nova condição dentro de um período de tempo específico; o número de novos casos durante algum período de tempo, é melhor expressado como uma proporção ou uma taxacom um denominador.

[0152]O termo “doença estável” refere-se a um diagnóstico para a presença de GEP-NEN, entretanto GEP-NEN foi tratado e permanece em uma condição estável, isto é, uma que não é progressiva, como determinada por dados de imagem e/ou melhor julgamento clínico.

[0153]O termo “doença progressiva” refere-se a um diagnóstico para a presença de um estado altamente ativo de GEP-NEN, isto é, um não foi tratado e não é estável ou foi tratado e não respondeu à terapia, ou foi tratado e doença ativa permanece, como determinado por dados de imagem e/ou melhor julgamento clínico.

[0154]O termo “pontuação de nível de expressão” ou “pontuação NETest” refere-se à saída de um algoritmo classificador derivado matematicamente gerado a partir da combinação de algoritmos de classificação, isto é, SVM, LDA, KNN e Bayes. Esta pontuação varia entre 0 e 100 %. A pontuação do nível de expressão de uma amostra de teste, uma vez comparada com a pontuação do nível de expressão para uma amostra de referência ou controle, pode ser usada para diagnosticar a presença de GEP-NEN, os estágios diferentes de GEP-NEN, prever o risco de contrair um estágio de GEP-NEN, ou determinar o risco de recorrência de GEP-NEN em pacientes humanos pós-terapia. Distinções entre estados de doença de GEP- NEN são fundamentadas em limiares e/ou faixas de pontuação de nível de expressão pré-determinados como definidos no presente pedido.

[0155]Diagnóstico e prognóstico de GEP-NEN foi difícil, em parte devido aos sintomas prosaicos e síndromes da doença, tais como síndrome carcinoide, diarreia, rubor, sudorese, broncoconstrição, sangramento gastrointestinal, doença cardíaca, dor abdominal intermitente, que frequentemente permanece silenciosa por anos. Métodos de diagnóstico disponíveis incluem localização anatômica, tal como por imagem, por exemplo, raio X, endoscopia gastrointestinal, tomografia computadorizada abdominal (CT), radiocirurgia estereotáxica combinada (SRS)/CT, e MRI, e detecção de alguns produtos genéticos, por exemplo, cromogranina A. Métodos conhecidos são limitados, por exemplo, por especificidade e/ou sensibilidade baixa e/ou na capacidade para detectar doença em estágio inicial.

[0156]Detecção de biomarcadores únicos não foi inteiramente satisfatório, por exemplo, para identificar malignidade em amostras de sangue humano e para prever resultados complexos como fibrose e metástase. Veja, Michiels S, Koscielny S, Hill C, “Interpretation of microarray data in cancer,” Br J Cancer 2007;96(8): 11558. Limitações em métodos disponíveis contribuíram para as dificuldades em classificação patológica, estadiantamento e predição, efeitos terapêuticos de desenvolvimento e monitoramento de tratamento. Entre as formas de realização fornecidas aqui são métodos e composições que abordam estas limitações.

[0157]Em um aspecto, o presente pedido refere-se à detecção e identificação de biomarcadores de GEP-NEN e painéis de tais biomarcadores, por exemplo, em amostras biológicas. São fornecidos métodos e composições (por exemplo, agentes, tais como polinucleotídeos), para detectar, determinar níveis de expressão de, e reconhecimento ou ligação aos biomarcadores, em amostras biológicas, tipicamente amostras de sangue.

[0158]Também são fornecidos modelos e algoritmos biomatemáticos, por exemplo, algoritmos de aprendizagem supervisionados, e métodos usando os mesmos, para predição, classificação e avaliação de GEP-NEN e resultados associados, por exemplo, prognosticar grau de risco, resposta para tratamento, metástase ou agressividade, e para determinar subtipo de GEP-NEN.

[0159]Detecção dos biomarcadores usando as formas de realização fornecidas é útil para melhorar diagnósticos e prognósticos de GEP-NEN, e para informar protocolos de tratamento. Em alguns aspectos, detecção dos biomarcadores e/ou níveis de expressão pelas formas de realização fornecidas confirma ou indica a presença, ausência, estágio, classe, localização, subtipo, agressividade, malignidade, metástase, prognóstico, ou outro resultado de GEP- NEN, ou uma célula de GEP-NEN, tal como uma célula de GEP-NEN circulante (CNC). Os métodos e composições fornecidos podem ser usados para localização tumoral, e para prognosticar ou detectar metástases, micrometástases e lesões pequenas, e/ou para determinar grau de risco, probabilidade de recorrência, resposta ou remissão de tratamento, e informar cursos apropriados de tratamento. Por exemplo, detectar os biomarcadores, por exemplo, em circulação podem ser usados para detectar GEP-NENs de estágio inicial e primários (por exemplo, para identificar doença de GEP-NEN ou metástases em um paciente previamente considerado “negativo” por um outro método, tal como localização anatômica).

[0160]Os métodos e composições fornecidos podem ser usados para projetar, implementar e monitorar estratégias de tratamento, incluindo estratégias de tratamento específicas para paciente. Em um exemplo, níveis de expressão detectados dos biomarcadores de GEP-NEN servem como substitutos de marcador para eficácia de tratamento, por exemplo, para monitorar os efeitos de terapia cirúrgica, por exemplo, remoção de tumores, terapia médica direcionada, por exemplo, inibição de secreção/proliferação tumoral, e outras abordagens terapêuticas, detectando-se remissão ou recorrência de tumores, mesmo na forma de micrometástases pequenas. Os métodos também podem ser usados em avaliar sintomas e resultados clínicos, e para classificação histológica e caracterização molecular de GEP-NENs.

[0161]Os biomarcadores fornecidos incluindo biomarcadores de GEP-NEN, e subgrupos e painéis dos mesmos. Entre os biomarcadores fornecidos de GEP- NEN são produtos genéticos, tais como DNA, RNA, por exemplo, transcrições e proteína, que são diferencialmente expressadas em doença de GEP-NEN, e/ou em estágios diferentes ou subtipos de GEP-NEN, ou em tumores de GEP-NEN diferentes, tais como produtos genéticos diferencialmente expressados em tumores metastáticos versus não-metastáticos, tumores com graus diferentes de agressividade, tumores de risco alto versus baixo, tumores responsivos versus não- responsivos, tumores exibindo classificações patológicas diferentes e/ou probabilidade de resposta para cursos particulares de tratamento, assim como aqueles associados com características de doença de GEP-NEN, estágio ou tipo, ou com células neuroendócrinas ou tipos celulares relacionados.

[0162]Por exemplo, os biomarcadores incluem produtos genéticos cuja expressão é associada com ou implicada em tumorogenicidade, metástase ou produção de hormônio, ou um fenótipo de GEP-NEN primário ou metastático, tal como adesão, migração, proliferação, apoptose, metástase, e secreção hormonal, e aqueles associados com neoplasia ou malignidade em geral.

[0163]Entre os biomarcadores são produtos de secreção de célula de GEP- NEN, incluindo hormônios e aminas, por exemplo, gastrina, grelina, polipeptídeo pancreático, substância P, histamina e serotonina, e fatores de crescimento tal como fator-beta de crescimento tumoral (TGF-β) e fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF), que são detectáveis na circulação. Produtos de secreção podem variar com subtipo e origem tumoral.

[0164]Em um exemplo, os biomarcadores são produtos genéticos associados com genótipos regulatórios (isto é, adesão, migração, proliferação, apoptose, metástase e/ou secreção hormonal) que subjazem vários subtipos de GEP-NEN, estágios, graus de agressividade ou resposta ao tratamento.

[0165]Um total de 51 genes de biomarcador diferencialmente expressados foram descobertos para o diagnóstico, prognóstico e/ou monitoramento de GEP- NENs. Além disso, os detalhes com respeito a 51 biomarcadores de GEP-NEN diferencialmente expressados assim como o gene de manutenção, ALG9, são encontrados na Tabela 1. TABELA 1: Informação de Biomarcador de GEP-NEN/Sequência Houskeepor

[0166]Os 51 biomarcadores de GEP-NEN incluem: AKAP8L (semelhante a uma proteína cinase (PRKA) de ancoragem 8), APLP2 (proteína 2 semelhante ao precursor beta amiloide (A4)), ARAF1 (oncogene viral de sarcoma murino v-raf 3611 homólogo), ATP6V1H (ATPase, transportando H+, lisossomal 50/57kDa, VI subunidade H), BNIP3L (semelhante a proteína 3 que interage com BCL2/adenovírus E1B 19kDa), BRAF (oncogene viral de sarcoma murino v-raf homólogo Bl), C21ORF7 (cromossomo 21 quadro aberto de leitura 7), CD59 (molécula CD59, proteína reguladora de complemento), COMMD9 (domínio COMM contendo 9), CTGF (fator de crescimento de tecido conjuntivo), ENPP4 (ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 4), FAM131A (família com similaridade de sequência 131, membro A, variante de transcrição 2), FLJ 10357 (fator de troca de nucleotídeo guanina Rho (GEF) 40 (ARHGEF40), FZD7 (frizzled homologo 7 (Drosophila)), GLT8D1 (domínio glicosiltransferase 8 contendo 1, variante de transcrição 3), HDAC9 (histona deacetilase 9, variante de transcrição 6), HSF2 (fator de transcrição por choque térmico 2, variante de transcrição 1), Ki-67 (antígeno identificado por anticorpo monoclonal Ki-67), KRAS (oncogene viral de sarcoma de rato v-Ki-ras2 Kirsten homólogo), LEOl (componente de complexo Pafl/RNA polimerase II homólogo (S. cerevisiae)), MORF4L2 (fator de mortalidade 4 tipo 2, variante de transcrição 1), proteína de montagem de nucleossoma NAP1L1 1 tipo 1), NOL3 (proteína nucleolar 3 (repressor apoptose com domínio CARD), variante de transcrição 3), NUDT3 (motivo 3 do tipo nudix (porção X ligada a nucleosídeo difosfato)), OAZ2 (ornitina decarboxilase antizima 2), PANK2 (pantotenato cinase 2), PHF21A (proteína PHD finger 21A, variante de transcrição 1), PKD1 (doença renal policística 1 (dominante autossômico), variante de transcrição 2), PLD3 (família de fosfolipase D, membro 3, variante de transcrição 1), PNMA2 (antígeno paraneoplásico MA2), PQBP1 (proteína de ligação à poliglutamina 1, variante de transcrição 2), RAF1 (oncogene viral de leucemia murino v-raf-1 homólogo 1), RNF41 (proteína ring finger 41, variante de transcrição 4), RSFl (fator de remodelação e espaçamento 1), RTN2 (reticulon 2, variante de transcrição 1), SMARCD3 (relacionado a SWI/SNF, associado à matriz, regulador dependente de actina de cromatina, subfamília d, membro 3, variante de transcrição 3), SPATA7 (associado à espermatogenese 7, variante de transcrição 2), SSTl (receptor de somatostatina 1), SST3 (receptor de somatostatina 3), SST4 (receptor de somatostatina 4), SST5 (receptor de somatostatina 5, variante de transcrição 1), TECPR2 (repetidor de propulsor de beta tectonina contendo 2, variante de transcrição 2), TPH1 (triptofano hidroxilase 1), TRMT112 (tRNA metiltransferase 112 homóloga (S. cerevisiae)), VMAT1 (família portadora de soluto 18 (monoamina vesicular), membro 1), VMAT 2 (família portadora de soluto 18 (monoamina vesicular), membro 2), VPS13C (proteína vacuolar classificando 13 homólogo C (S. cerevisiae), variante de transcrição 2B), WDFY3 (repetidor WD e domínio FYVE contendo 3), ZFHX3 (zinc finger homeobox 3, variante de transcrição B), ZXDC (zinc finger C, variante de transcrição 2), e ZZZ3 (zinc finger, tipo ZZ contendo 3), incluindo produtos genéticos tipicamente produtos genéticos humanos, incluindo transcrições, mRNA, cDNA, sequências codificadoras, proteínas e polipeptídeos, assim como polinucleotídeos (ácidos nucleicos) codificando as proteínas e polipeptídeos, incluindo variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes alélicas, variantes de emenda, variantes de transcrição e variantes de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Por exemplo, os biomarcadores incluem polinucleotídeos, proteínas e polipeptídeos tendo as sequências divulgadas aqui, e variantes que ocorrem naturalmente destes.

[0167]O gene de manutenção usado para normalizar a expressão dos 51 genes marcadores é o ALG9 humano (glicosilação ligada à asparagina 9, alfa-1,2- mannosiltransferase homóloga).

[0168]Destes 51 genes de biomarcador diferencialmente expressados, 38 genes biomarcadores são úteis para a geração de pontuações de nível de expressão derivada matematicamente para diagnosticar, monitorar e/ou prognosticar a presença de GEP-NEN e/ou estados diferentes de GEP-NENs. Estes 38 biomarcadores de GEP-NEN incluem: PNMA2, NAP1L1, FZD7, SLC18A2/VMAT2, NOL3, SSTR5, TPH1, RAF1, RSF1, SSTR3, SSTR1, CD59, ARAF, APLP2, KRAS, MORF4L2, TRMT112, MKI67/KI67, SSTR4, CTGF, SPATA7, ZFHX3, PHF21A, SLC18A1/VMAT1, ZZZ3, TECPR2, ATP6V1H, OAZ2, PANK2, PLD3, PQBP1, RNF41, SMARCD3, BNIP3L, WDFY3, COMMD9, BRAF e GLT8D1.

[0169]Dos 38 genes biomarcadores úteis para a geração de uma pontuação de nível de expressão derivada matematicamente para diagnosticar, monitorar e/ou prognosticar a presença de GEP-NENs, pelo menos 22 genes biomarcadores podem ser necessários para gerar um classificador adequado. Estes pelo menos 22 genes biomarcadores incluem PNMA2, NAP1L1, FZD7, SLC18A2, NOL3, SSTR5, TPH1, RAF1, RSF1, SSTR3, SSTR1, CD59, ARAF, APLP2, KRAS, MORF4L2, TRMT112, MKI67, SSTR4, CTGF, SPATA7 e ZFHX3.

[0170]Os genes biomarcadores/manutenção ALG9 incluem produtos genéticos de ALG9 humano, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o gene biomarcador/manutenção ALG9 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1 (referenciada em NM_024740,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0171]Os biomarcadores AKAP8L incluem produtos genéticos de AKAP8L humano, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador AKAP8L é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 2 (referenciada em NM_014371,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0172]Os biomarcadores APLP2 incluem produtos genéticos de APLP2 humano, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador APLP2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 3 (referenciada em NM_001142276,1) ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0173]Os biomarcadores ARAF1 incluem produtos genéticos de ARAF1 humano, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador ARAF1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 4 (referenciada em NM_001654,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0174]Os biomarcadores ATP6V1H incluem produtos genéticos de ATP6V1H humano, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador ATP6V1H é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 5 (referenciada em NM_015941,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0175]Os biomarcadores BNIP3L incluem produtos genéticos de BNIP3L humano, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador BNIP3L é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 6 (referenciada em NM_004331,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0176]Os biomarcadores BRAF incluem produtos genéticos de BRAF, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador BRAF é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 7 (referenciada em NM_004333,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0177]Os biomarcadores C21ORF7 incluem produtos genéticos de C21ORF7, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador C21ORF7 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 8 (referenciada em NM_020152,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0178]Os biomarcadores CD59 incluem produtos genéticos de CD59, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador CD59 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 9 (referenciada em NM_203331,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0179]Os biomarcadores COMMD9 incluem produtos genéticos de COMMD9, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador COMMD9 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 10 (referenciada em NM_001101653,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0180]Os biomarcadores CTGF incluem produtos genéticos de CTGF, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador CTGF é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 11 (referenciada em NM_001901,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0181]Os biomarcadores ENPP4 incluem produtos genéticos de ENPP4, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador ENPP4 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 12 (referenciada em NM_014936,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0182]Os biomarcadores FAM131A incluem produtos genéticos de FAM131A, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador FAM131A é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 13 (referenciada em NM_001171093,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0183]Os biomarcadores FLJ1035 incluem produtos genéticos de FLJ1035, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador FLJ1035 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 14 (referenciada em NM_018071,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0184]Os biomarcadores FZD7 incluem produtos genéticos de FZD7, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador FZD7 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 15 (referenciada em NM_003507,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0185]Os biomarcadores GLT8D1 incluem produtos genéticos de GLT8D1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador GLT8D1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 16 (referenciada em NM_001010983,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0186]Os biomarcadores HDAC9 incluem produtos genéticos de HDAC9, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador HDAC9 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 17 (referenciada em NM_001204144,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0187]Os biomarcadores HSF2 incluem produtos genéticos de HSF2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador HSF2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 18 (referenciada em NM_004506,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0188]Os biomarcadores Ki-67 incluem produtos genéticos de Ki-67, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador Ki-67 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 19 (referenciada em NM_001145966,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0189]Os biomarcadores KRAS incluem produtos genéticos de KRAS, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador KRAS é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 20 (referenciada em NM_004985,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0190]Os biomarcadores LEO1 incluem produtos genéticos de LEO1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador LEO1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 21 (referenciada em NM_138792,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0191]Os biomarcadores MORF4L2 incluem produtos genéticos de MORF4L2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador MORF4L2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 22 (referenciada em NM_001142418,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0192]Os biomarcadores NAP1L1 incluem produtos genéticos de NAP1L1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador NAP1L1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 23 (referenciada em NM_139207,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0193]Os biomarcadores NOL3 incluem produtos genéticos NOL3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador NOL3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 24 (referenciada em NM_001185057,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0194]Os biomarcadores NUDT3 incluem produtos genéticos NUDT3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador NUDT3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 25 (referenciada em NM_006703,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0195]Os biomarcadores OAZ2 incluem produtos genéticos OAZ2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador OAZ2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 26 (referenciada em NM_002537,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0196]Os biomarcadores PANK2 incluem produtos genéticos de PANK2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador PANK2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 27 (referenciada em NM_024960,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0197]Os biomarcadores PHF21A incluem produtos genéticos PHF21A, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador PHF21A é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 28 (referenciada em NM_001101802,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0198]Os biomarcadores PKD1 incluem produtos genéticos PKD1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador PKD1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 29 (referenciada em NM_000296,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0199]Os biomarcadores PLD3 incluem produtos genéticos de PLD3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador PLD3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 30 (referenciada em NM_001031696,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0200]Os biomarcadores PNMA2 incluem produtos genéticos de PNMA2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador PNMA2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 31 (referenciada em NM_007257,5), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0201]Os biomarcadores PQBP1 incluem produtos genéticos de PQBP1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador PQBP1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 32 (referenciada em NM_001032381,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0202]Os biomarcadores RAF1 incluem produtos genéticos de RAF1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador RAF1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 33 (referenciada em NM_002880,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0203]Os biomarcadores RNF41 incluem produtos genéticos de RNF41, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador RNF41 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 34 (referenciada em NM_001242826,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0204]Os biomarcadores RSF1 incluem produtos genéticos de RSF1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador RSF1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 35 (referenciada em NM_016578,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0205]Os biomarcadores RTN2 incluem produtos genéticos RTN2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador RTN2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 36 (referenciada em NM_005619,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0206]Os biomarcadores SMARCD3 incluem produtos genéticos de SMARCD3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador SMARCD3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 37 (referenciada em NM_001003801,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0207]Os biomarcadores SPATA7 incluem produtos genéticos de SPATA7, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador SPATA7 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 38 (referenciada em NM_001040428,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0208]Os biomarcadores SSTR1 incluem produtos genéticos de SSTR1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador SSTR1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 39 (referenciada em NM_001049,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0209]Os biomarcadores SSTR3 incluem produtos genéticos de SSTR3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador SSTR3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 40 (referenciada em NM_001051,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0210]Os biomarcadores SST4 incluem produtos genéticos SST4, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador SST4 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 41 (referenciada em NM_001052,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0211]Os biomarcadores SST5 incluem produtos genéticos de SST5, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador SST5 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 42 (referenciada em NM_001053,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0212]Os biomarcadores TECPR2 incluem produtos genéticos de TECPR2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador TECPR2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 43 (referenciada em NM_001172631,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0213]Os biomarcadores TPH1 incluem produtos genéticos de TPH1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador TPH1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 44 (referenciada em NM_004179,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0214]Os biomarcadores TRMT112 incluem produtos genéticos TRMT112, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador TRMT112 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 45 (referenciada em NM_016404,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0215]Os biomarcadores VMAT1 incluem produtos genéticos de VMAT1, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador VMAT1 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 46 (referenciada em NM_003053,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0216]Os biomarcadores VMAT2 incluem produtos genéticos de VMAT2, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador VMAT2 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 47 (referenciada em NM_003054,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0217]Os biomarcadores VPS13C incluem produtos genéticos de VPS13C, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador VPS13C é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 48 (referenciada em NM_001018088,2), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0218]Os biomarcadores WDFY3 incluem produtos genéticos de WDFY3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador WDFY3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 49 (referenciada em NM_014991,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0219]Os biomarcadores ZFHX3 incluem produtos genéticos de ZFHX3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador ZFHX3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 50 (referenciada em NM_001164766,1), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0220]Os biomarcadores ZXDC incluem produtos genéticos ZXDC, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador ZXDC é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 51 (referenciada em NM_001040653,3), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0221]Os biomarcadores ZZZ3 incluem produtos genéticos ZZZ3, incluindo variantes naturais, por exemplo, variantes alélicas, e homólogos e análogos destes. Em um exemplo, o biomarcador ZZZ3 é um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 52 (referenciada em NM_015534,4), ou contendo uma porção codificadora de proteína deste, uma variante natural deste ou uma proteína codificada por tal um polinucleotídeo.

[0222]Em algumas formas de realização, o painel de polinucleotídeos inclui ainda um ou mais polinucleotídeo capazes de especificamente hibridizar “housekeeping”, ou genes de referência, por exemplo, genes para os quais a diferença em expressão é conhecida ou não esperada correlacionar com diferenças nas variáveis analisadas, por exemplo, com a presença ou ausência de GEP-NEN ou outra doença neoplástica, diferenciação de vários subtipos de GEP-NEN, metástase, mucosa ou outros tipos de tecido, indicações prognósticas, e/ou outro fenótipo, predição ou resultado. Em alguns aspectos, níveis de expressão de tais genes de manutenção são detectados e usados como um padrão do nível de expressão global, tal como normalizar dados de expressão obtidos de biomarcadores de GEP-NEN através de várias amostras.

[0223]Genes de manutenção são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, os genes de manutenção incluem um ou mais genes caracterizados como particularmente apropriados para analisar amostras de GEP-NEN, tais como ALG9. Veja, Kidd M, et al., “GeneChip, geNorm and Gastrointestinal tumors: novel reference genes for real-time PCR.” Physiol Genomics 2007;30:363-70. No pedido corrente, ALG9 é o gene de manutenção de escolha.

[0224]A presente invenção fornece métodos, composições e sistemas para a detecção dos biomarcadores de GEP-NEN e para identificar, isolar e enriquecer tumores e células que expressam os biomarcadores de GEP-NEN. Por exemplo, são fornecidos agentes, conjuntos de agentes, e sistemas para detectar os biomarcadores de GEP-NEN e métodos para o uso dos mesmos, incluindo para usos diagnósticos e prognósticos.

[0225]Em uma forma de realização, os agentes são proteínas, polinucleotídeos ou outras moléculas que especificamente se ligam a ou especificamente hibridizam os biomarcadores de GEP-NEN. Os agentes incluem polinucleotídeos, tais como sondas e iniciadores, por exemplo, iniciadores de PCR sentido e antessentido, tendo identidade ou complementaridade para os biomarcadores de polinucleotídeo, tais como mRNA, ou proteínas, tais como anticorpos, que especificamente se ligam a tais biomarcadores. Conjuntos e kits contendo os agentes, tais como agentes especificamente hibridizam ou ligam o painel de biomarcadores, também são fornecidos.

[0226]Assim, os sistemas, por exemplo, microarranjos, conjuntos de polinucleotídeos, e kits, fornecidos aqui incluem aqueles com moléculas de ácido nucleico, tipicamente oligonucleotídeos de DNA, tais como iniciadores e sondas, o comprimento do qual tipicamente varia entre 15 bases e várias quilobases, tais como entre 20 bases e 1 quilobase, entre 40 e 100 bases, e entre 50 e 80 nucleotídeos ou entre 20 e 80 nucleotídeos. Em um aspecto, mais (isto é, pelo menos 60 % de) moléculas de ácido nucleico de um microarranjo de nucleotídeo, kit, ou outro sistema, são capazes de hibridizar os biomarcadores de GEP-NEN.

[0227]Em um exemplo, sistemas contendo polinucleotídeos que especificamente hibridizam os biomarcadores, por exemplo, microarranjos de ácido nucleico, são fornecidos para detectar e medir as mudanças em níveis de expressão e determinar perfis de expressão dos biomarcadores de acordo com os métodos fornecidos. Entre tais sistemas, por exemplo, microarranjos, são aqueles compreendendo polinucleotídeos capazes de hibridizar pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ou mais biomarcadores, tais como pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, e/ou todos os conjuntos seguintes de biomarcadores: Produtos genéticos PNMA2, NAP1L1, FZD7, SLC18A2/VMAT2, NOL3, SSTR5, TPH1, RAF1, RSF1, SSTR3, SSTR1, CD59, ARAF, APLP2, KRAS, MORF4L2, TRMT112, MKI67/KI67, SSTR4, CTGF, SPATA7, ZFHX3, PHF21A, SLC18A1/VMAT1, ZZZ3, TECPR2, ATP6V1H, OAZ2, PANK2, PLD3, PQBP1, RNF41, SMARCD3, BNIP3L, WDFY3, COMMD9, BRAF e GLT8D1;

[0228]Em alguns aspectos, pelo menos 60 %, ou pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, ou mais, das moléculas de ácido nucleico do sistema, por exemplo, microarranjo, são capazes de hibridizar os biomarcadores no painel de biomarcadores. Em um exemplo, sondas imobilizadas em tais microarranjos de nucleotídeo compreendem pelo menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ou mais biomarcadores, tais como pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de hibridizar pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ou mais biomarcadores, tais como pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, ou mais dos biomarcadores, onde cada uma das moléculas de ácido nucleico é capaz de especificamente hibridizar um dos biomarcadores diferentes, de modo que pelo menos muitos dos biomarcadores diferentes podem ser ligados.

[0229]Em um exemplo, as moléculas de ácido nucleico remanescentes, tais como 40 % ou no máximo 40 % das moléculas de ácido nucleico no microarranjo ou no conjunto de polinucleotídeos são capazes de hibridizar um conjunto de genes de referência ou um conjunto de genes de normalização (tais como genes de manutenção), por exemplo, para normalização de modo a reduzir tendência sistêmica. Tendência sistêmica resulta em variação através de diferenças inter- matriz em desempenho global, que pode ser devido a, por exemplo, inconsistência em fabricação, coloração e varredura de matriz, e variação entre amostras de RNA rotuladas, que pode ser devido, por exemplo, às variações em pureza. Tendência sistêmica pode ser introduzida durante o manejo da amostra em um experimento de microarranjo. Para reduzir tendência sistêmica, os níveis de RNA determinados são preferivelmente corrigidos para os fundamentos de hibridização não-específica e normalizada.

[0230]O uso de tais sondas de referência é vantajoso, mas não obrigatório. Em uma forma de realização, um conjunto ou sistema de polinucleotídeos, por exemplo, microarranjo, é fornecido em que pelo menos 90 % da sequência de ácidos nucleicos é capaz de hibridizar os biomarcadores de GEP-NEN; outras formas de realização incluem tais sistemas e conjuntos em que pelo menos 95 % ou ainda 100 % dos polinucleotídeos hibridiza os biomarcadores.

[0231]São divulgados aqui polinucleotídeos adequados exemplares, tais como iniciadores de PCR. Outra sonda de ácidos nucleicos e iniciadores, capaz de hibridizar regiões diferentes dos biomarcadores também são certamente adequados para o uso em relação aos sistemas, kits e métodos fornecidos.

[0232]A presente invenção fornece métodos para detectar e quantificar os biomarcadores, incluindo detectar a presença, ausência, quantidade ou quantidade relativa, tal como níveis de expressão ou perfil de expressão dos biomarcadores. Tipicamente, os métodos são métodos à base de ácido nucleico, por exemplo, medir a presença, quantidade ou níveis de expressão de expressão de mRNA de biomarcador. Tais métodos tipicamente são realizados contatando-se agentes de polinucleotídeo às amostras biológicas, tais como amostras de teste e amostras normais e de referência, por exemplo, quantificar níveis de expressão de biomarcadores de ácido nucleico (por exemplo, mRNA) nas amostras.

[0233]Detecção e análise de biomarcadores de acordo com as formas de realização fornecidas pode ser realizada com qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, onde os biomarcadores são biomarcadores de RNA, métodos de detecção e quantificação de RNA são usados.

[0234]Métodos exemplares para quantificar ou detectar níveis de expressão de ácido nucleico, por exemplo, expressão de mRNA, são bem conhecidos, e incluem northern blotting e hibridização in situ (Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247 - 283, 1999); ensaios de proteção de RNAse (Hod, Biotechniques 13:852 - 854, 1992); e reação em cadeia de polimerase via transcrição reversa quantitativa ou semi-quantitativa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263 - 264, 1992), métodos representativos para análise de expressão de gene com base em sequenciamento incluem Análise Serial de Expressão de Gene (SAGE), e análise de expressão de gene por sequenciamento maciçamente paralelo de assinaturas (MPSS).

[0235]Portanto, em uma forma de realização, a expressão do biomarcador ou painel de biomarcador inclui expressão de RNA; os métodos incluem determinar níveis de RNA dos biomarcadores, tal como RNA obtido de e/ou presente em uma amostra de um paciente, e realizando análise, diagnóstico, ou determinações preditivas com base nos níveis de expressão de RNA determinados para os biomarcadores ou painel de biomarcadores.

[0236]Amostras de RNA podem ser processadas em numerosos modos, como é conhecido àqueles na técnica. Vários métodos são bem conhecidos para o isolamento de RNA das amostras, incluindo extração com tiocianato de guanidínio- fenol-clorofórmio, que pode ser realizada usando o reagente TRIZOL®, uma formulação patenteada (veja Chomczynski P, Sacchi N (2006). “The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty- something years on”. Nat Protoc 1 (2): 581 - 5). Neste método, TRIZOL® é usado para extrair RNA e DNA; clorofórmio e centrifugação são usados para separar o RNA de outros ácidos nucleicos, seguido por uma série de lavagens com etanol para a limpeza da amostra de RNA.

[0237]As amostras de RNA podem ser recentemente preparadas a partir de amostras, por exemplo, células ou tecidos no momento da colheita; alternativamente, elas podem ser preparadas a partir de amostras que são armazenadas a -70 °C até que sejam processadas para a preparação de amostra. Alternativamente, amostras de tecidos ou células podem ser armazenadas sob e/ou submetidas a outras condições conhecidas na técnica para preservar a qualidade do RNA, incluindo fixação, por exemplo, com formalina ou agente similar; e incubação com inibidores de RNase tais como RNAsin® (Pharmingen) ou RNasecure® (Ambion); soluções aquosas tais como RNAlater® (Assuragen), Efeito de Proteção de Solvente Orgânico mediado por tampão de Hepes-Ácido glutâmico (HOPE), e RCL2 (Alphelys); e soluções não aquosas tais como Universal Molecular Fixative (Sakura Finetek USA Inc.). Um tampão de lise de isolamento de tampão de lise de isolamento de ácido nucleico caotrópico (Boom method, Boom et al. J Clin Microbiol. 1990; 28:495 - 503) também pode ser usado para o isolamento de RNA.

[0238]Em uma forma de realização, RNA é isolado da camada leucocitária incubando-se as amostras com TRIZOL®, seguido por limpeza de RNA. RNA é dissolvido em água tratada com pirocarbonato de dietila e medido espectrofotometricamente, e uma alíquota analisada em um Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) para avaliar a qualidade do RNA (Kidd M, et al. “The paper of genetic markers — NAP 1L1, MAGE-D2, and MTA1 — in defining small- intestinal carcinoid neoplasia”, Ann Surg Oncol 2006;13(2):253 - 62). Em uma outra forma de realização, RNA é isolado do plasma usando o QIAamp RNA Blood Mini Kit; em alguns casos, este método permite melhor detecção por PCR em tempo real de significativamente mais genes de manutenção do plasma comparado ao método de TRIZOL®. Em uma outra forma de realização, RNA é isolado diretamente do sangue total, por exemplo, usando o QIAamp RNA Blood Mini Kit em uma maneira similar.

[0239]Métodos para isolar o RNA de tecidos embutidos em parafina, fixos como a fonte de RNA são bem conhecidos e geralmente incluem isolamento de mRNA, purificação, extensão de iniciador e amplificação (por exemplo: T. E. Godfrey et al, Molec. Diagnostics 2: 84 - 91 [2000]; K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419 - 29 [2001]). Em um exemplo, o RNA é extraído de uma amostra tal como uma amostra de sangue usando o RNA do QIAamp RNA Blood Mini Kit. Tipicamente, o RNA é extraído do tecido, seguido por remoção de proteína e DNA e análise da concentração de RNA. Uma etapa de reparo e/ou amplificação de RNA pode ser incluída, tal como uma etapa para transcrição reversa de RNA para RT-PCR.

[0240]Níveis de expressão ou quantidades dos biomarcadores de RNA podem ser determinados ou quantificados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, quantificando-se a expressão de RNA em relação ao gene de manutenção ou com relação a níveis de RNA de outros genes medidos ao mesmo tempo. Métodos para determinar níveis de RNA de genes são conhecidos a uma pessoa habilitada e incluem, mas não são limitados a Northern blotting, PCR (quantitativa), e análise de microarranjo.

[0241]Biomarcadores de RNA podem ser transcritos reversos para produzir cDNA e os métodos da presente invenção podem incluir detectar e quantificar este cDNA produzido. Em algumas formas de realização, o cDNA é detectado formando- se um complexo com uma sonda rotulada. Em algumas formas de realização, os biomarcadores de RNA são conduzidos detectados formando-se um complexo com uma sonda ou iniciador rotulado.

[0242]Northern blotting pode ser realizado para a quantificação de RNA de um gene biomarcador específico ou produto genético, hibridizando-se uma sonda rotulada que especificamente interage com o RNA, a seguir da separação de RNA por eletroforese em gel. Sondas são, por exemplo, rotuladas com isótopos radioativos ou substratos quimioluminescentes. A quantificação da sonda rotulada que interagiu com o dito produto de expressão de ácido nucleico serve como uma medida para determinar o nível de expressão. O nível de expressão determinado pode ser normalizado quanto a diferenças nas quantidades totais de produtos de expressão de ácido nucleico entre duas amostras separadas com, por exemplo, um calibrador interno ou externo comparando-se o nível de expressão de um gene que é conhecido não como diferindo no nível de expressão entre as amostras ou adicionando-se uma quantidade conhecida de RNA antes de determinar os níveis de expressão.

[0243]Para RT-PCR, o RNA biomarcador é transcrito reverso em cDNA. A reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) é, por exemplo, realizada usando iniciadores específicos que hibridizam a uma sequência de RNA de interesse e uma enzima transcriptase reversa. Além disso, RT-PCR pode ser realizada com iniciadores aleatórios, tais como, por exemplo, hexâmeros ou decâmeros aleatórios que hibridizam aleatoriamente ao longo do RNA, ou oligo d(T) que hibridiza à cauda poli(a) de mRNA, e enzima transcriptase reversa.

[0244]Em algumas formas de realização, níveis de expressão de RNA dos biomarcadores em uma amostra, tal como uma de um paciente sofrendo de ou suspeito de sofrer de GEP-NEN ou sintoma ou síndrome associados, são determinados usando métodos quantitativos tais como por RT-PCR em tempo real (qPCR) ou análise de microarranjo. Em algumas formas de realização, Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (QPCR) é usada para quantificar o nível de expressão de ácidos nucleicos. Em um aspecto, a detecção e determinação de níveis de expressão dos biomarcadores são realizadas usando RT-PCR, análise de GeneChip, PCR em tempo real quantitativa (Q RT-PCR), ou imunomanchamento/quantificação de microarranjo de tecido carcinoide (TMA), por exemplo, para comparar o RNA biomarcador, por exemplo, mRNA, ou outro produto de expressão, níveis em diferentes populações de amostra, caracterizar padrões de expressão de gene, para discriminar entre mRNAs intimamente relacionados, e para analisar a estrutura de RNA.

[0245]Em um exemplo, QPCR é realizada usando PCR em tempo real (RTPCR), onde a quantidade de produto é monitorada durante a reação de amplificação, ou por medições de ponto final, em que a quantidade de um produto final é determinada. Como é conhecido a uma pessoa habilitada, rtPCR é, por exemplo, realizada pelo uso de um intercalador de ácido nucleico, tal como, por exemplo, brometo de etídio ou corante Verde I SYBR®, que interage com todos os produtos de filamento duplo gerados resultando em um aumento na fluorescência durante a amplificação, ou por exemplo pelo uso de sondas rotuladas que reagem especificamente com o produto de filamento duplo gerado do gene de interesse. Métodos de detecção alternativos que podem ser usados são fornecidos por, entre outras coisas, amplificação de sinal de dendrímero, amplificação de sinal de hibridização, e balizas moleculares.

[0246]Em uma forma de realização, a transcrição reversa no RNA total é realizada usando o High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems (ABI), Foster City, CA) seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante (brevemente, usando 2 microgramas de RNA total em 50 microlitros de água, misturando com 50 uL de mistura 2XRT contendo Tampão de Transcrição Reversa, solução de trifosfato de desoxinucleotídeo, iniciadores aleatórios, e Transcriptase Reversa MultiScribe). Condições de reação de RT são bem conhecidas. Em um exemplo, a reação de RT é realizada usando as seguintes condições de termociclador: 10 min, 25 °C; 120 min., 37 °C {veja Kidd M, et al., “The paper of genetic markers — NAP 1 LI, MAGE- D2, and MTA1 — in defining small-intestinal carcinoid neoplasia”, Ann Surg Oncol 2006;13(2):253 - 62).

[0247]Para a medição de níveis de transcrito individuais, em uma forma de realização, produtos Assays-on-Demand™ são usados no Sistema de Detecção de Sequência ABI 7900 de acordo com as sugestões do fabricante {veja Kidd M, Eick G, Shapiro MD, et al. Microsatellite instability and gene mutations in transforming growth factor-beta type II receptor are absent in small bowel carcinoid tumors. Cancer 2005;103(2):229 - 36). Em um exemplo, a ciclagem é realizada sob condições padrão, usando o TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol, misturando-se o cDNA em 7,2 uL de água, 0,8 uL 20^ Iniciador Assays-under- demand e mistura de sonda e 8 uL de 2X TaqMan Universal Master mix, em uma placa de reação óptica de 384 reservatórios, sob as condições seguintes: 50 °C, 2 min.; 95 °C; 10 min.; 50 ciclos a 95 °C por 15 min., 60° por 1 min {veja Kidd M, et al, “The paper of genetic markers — NAP 1 LI, MAGE-D2, and MTA1 — in defining small-intestinal carcinoid neoplasia”, Ann Surg Oncol 2006;13(2):253 - 62).

[0248]Tipicamente, os resultados da PCR em tempo real são normalizados, usando padrões internos e/ou por comparação a níveis de expressão para genes de manutenção. Por exemplo, em uma forma de realização, dados de Raw AGE (delta CT = mudança no tempo de ciclo como uma função de amplificação) de QPCR como descrito acima são normalizados usando métodos bem conhecidos, tais como geNorm {veja Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 2002;3(7):RESEARCH0034). A normalização por níveis de expressão de gene de manutenção também é bem conhecida. Veja Kidd M, et al., “GeneChip, geNorm, and gastrointestinal tumors: novel reference genes for realtime PCR”, Physiol Genomics 2007;30(3):363 - 70.

[0249]A análise de microarranjo envolve o uso de moléculas de ácido nucleico selecionadas que são imobilizadas em uma superfície. Estas moléculas de ácido nucleico, denominadas sondas, são capazes de hibridizar a produtos de expressão de ácido nucleico. Em uma forma de realização preferida, as sondas são expostas a ácido nucleico de amostra rotulada, hibridizadas, lavadas e a quantidade (relativa) de produtos de expressão de ácido nucleico na amostra que são complementares a uma sonda é determinada. A análise de microarranjo permite a determinação simultânea de níveis de expressão de ácido nucleico de um número grande de genes. Em um método de acordo com a invenção, é preferido que pelo menos 5 genes de acordo com a invenção sejam medidos simultaneamente.

[0250]Correção de fundo pode ser realizada, por exemplo, de acordo com o método de “deslocamento” que evita valores de intensidade negativa depois da subtração de fundo. Além disso, a normalização pode ser realizada de modo a tornar os dois canais em cada arranjo único comparáveis, por exemplo, usando normalização de loess global, e normalização de escala que garante que as razões logarítmicas são escaladas para ter o mesmo desvio absoluto mediano (MAD) através dos arranjos.

[0251]Níveis de proteína podem, por exemplo, ser medidos usando ensaios de ligação à base de anticorpo. Anticorpos radioativamente rotulados ou fluorescentemente rotulados com enzima rotulada, podem ser usados para detecção de proteína. Ensaios exemplares incluem ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA), radioimunoensaios (RIA), ensaios Western Blot e ensaios de coloração imunohistoquímicos. Alternativamente, de modo a determinar o nível de expressão de proteínas múltiplas simultaneamente matrizes de proteína, tais como, matrizes de anticorpo são usadas.

[0252]Tipicamente, os biomarcadores e marcadores housekeeping são detectados em uma amostra biológica, tais como uma amostra de tecido ou fluido, tal como um sangue, tal como amostra de sangue total, plasma, soro, fezes, urina, saliva, lágrimas, soro ou sêmen, ou uma amostra preparada de um tal tecido ou fluido, tal como uma preparação celular, incluindo de células de sangue, saliva ou tecido, tal como mucosa intestinal, tecido tumoral, e tecidos contendo e/ou suspeitos de conter metástases de GEP-NEN ou células tumorais vertidas, tais como fígado, osso e sangue. Em uma forma de realização, uma preparação celular específica é obtida por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de suspensões celulares ou fluido de tecido ou fluido, tais como mucosa, por exemplo, amostras de mucosa intestinal, sangue ou camadas leucocitárias.

[0253]Em algumas formas de realização, a amostra é tomada de um paciente com GEP-NEN, um paciente suspeito de ter GEP-NEN, um paciente tendo e/ou suspeito de ter câncer geralmente, um paciente exibindo um ou mais sintomas de GEP-NEN ou síndromes ou determinado a estar em risco para GEP-NEN, ou um paciente com GEP-NEN sofrendo tratamento ou tendo concluído tratamento, incluindo pacientes cuja doença é e/ou é considerada a estar em remissão.

[0254]Em outras formas de realização, a amostra é tomada de um ser humano sem doença GEP-NEN, tal como um indivíduo saudável ou um indivíduo com um tipo de câncer diferente, tal como um adenocarcinoma, por exemplo, um adenocarcinoma gastrointestinal ou um da mama, próstata, ou pâncreas, ou um câncer gástrico ou hepático, tal como esofágico, pancreático, vesícula biliar, cólon ou câncer de reto.

[0255]Em algumas formas de realização, a amostra é tomada do tumor ou metástase de GEP-NEN. Em outras formas de realização, a amostra é tomada do paciente com GEP-NEN, mas de um tecido ou fluido não esperada conter GEP-NEN ou células de GEP-NEN; tais amostras podem ser usadas como amostras de referência ou normais. Alternativamente, a amostra normal ou de referência pode ser um tecido ou fluido ou outra amostra biológica de um paciente sem doença de GEP- NEN, tal como um tecido, fluido ou outra amostra correspondente, tal como uma amostra de sangue normal, uma amostra de mucosa do intestino delgado normal (SI), uma preparação celular enterocromafina normal (EC).

[0256]Em algumas formas de realização, a amostra é uma amostra de sangue total. Como metástase de tumores neuroendócrinos, células tipicamente vertidas no sangue. Consequentemente, detecção dos painéis de biomarcadores de GEP-NEN fornecidos aqui em plasma e amostras de sangue podem ser usados para identificação de GEP-NENs em um ponto de tempo inicial e para prognosticar a presença de metástases tumorais, por exemplo, mesmo se estudos de localização anatômicos são negativos. Consequentemente, os agentes e métodos fornecidos são úteis para diagnóstico inicial.

[0257]Além disso, em algumas formas de realização, os métodos podem identificar uma assinatura molecular GEP-NEN ou perfil de expressão em 1 mL ou cerca de 1 mL de sangue total. Em alguns aspectos, a assinatura molecular ou perfil de expressão é estável para até quatro horas (por exemplo, quando amostras são refrigeradas 4 a 8 °C após flebotomia) antes de congelamento. Em um aspecto, a abordagem capaz de diagnosticar, prognosticar ou prever um determinado resultado associado a GEP-NEN usando uma amostra obtida de tecido tumoral também é capaz de marcar o mesmo diagnóstico, prognóstico ou predição usando uma amostra de sangue.

[0258]Várias metodologias de detecção e diagnóstico existentes requerem de 7 a 10 dias para produzir um resultado positivo possível, e pode ser caro. Assim, em um aspecto, os métodos e composições fornecidos são úteis em melhorar simplicidade e reduzir custos associados com diagnóstico de GEP-NEN, e fazer possível diagnóstico de estágio inicial.

[0259]Além disso, em um exemplo, os biomarcadores são detectados em circulação, por exemplo, por detecção em uma amostra de sangue, tal como um soro, plasma, células, por exemplo, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), obtidas de camadas leucocitárias ou amostra de sangue total.

[0260]Transcrições específicas tumorais foram detectadas em sangue total em alguns cânceres. Veja, Sieuwerts AM, et al., “Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR”, Breast Cancer Res Treat 2009;118(3):455-68 e Mimori K, et al, “A large-scale study of MT1-MMP as a marker for isolated tumor cells in peripheral blood and bone marrow in gastric cancer cases”, Ann Surg Oncol 2008;15(10):2934- 42.

[0261]O Teste CTC CellSearch™ (Veridex LLC) (descrito por Kahan L., “Medical devices; immunology and microbiology devices; classification of the immunomagnetic circulating cancer cell selection and enumeration system. Final rule”, Fed Regist 2004;69:26036-8) usa pérolas magnéticas revestidas com anticorpos específicos para EpCAM que detectam células epiteliais (CK- 8/18/19) e leucócitos (CD45), como descrito por Sieuwerts AM, Kraan J, Bolt-de Vries J, et al., “Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR”, Breast Cancer Res Treat 2009;118(3):455-68. Este método foi usado para detectar células tumorais circulantes (CTCs), e monitorar progressão da doença e eficácia de terapia em próstata metastática (Danila DC, Heller G, Gignac GA, et al. Circulating tumor cell number and prognosis in progressive castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res 2007;13(23):7053-8), colorretal (Cohen SJ, Alpaugh RK, Gross S, et al.

[0262]Isolamento e caracterização de células tumorais circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático. Clin Colorectal Cancer 2006;6(2): 12532., e mama (Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, et al., Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 2004;351(8):781-91).

[0263]Esta e outras abordagens existentes não foram inteiramente satisfatórias para detecção de células de GEP-NEN, que podem exibir expressão variável e/ou não expressar citoqueratina (Veja, Van Eeden S, et al, “Classification of low-grade neuroendocrine tumors of midgut and unknown origin”, Hum Pathol 2002;33(11): 1126-32; Cai YC, et al., “Cytokeratin 7 and 20 and thyroid transcription factor 1 can help distinguish pulmonary from gastrointestinal carcinoid and pancreatic endocrine tumors”, Hum Pathol 2001;32(10): 1087-93, e estudos descritos aqui, detectando expressão de transcrição de EpCAM em duas de vinte e nove amostras de GEP-NEN).

[0264]Fatores a considerar nos métodos de detecção disponíveis para células tumorais circulantes são números relativamente baixos das células em sangue periférico, tipicamente cerca de 1 por 106 células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) (Veja, Ross AA, et al. “Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques”, Blood 1993;82(9):2605-10), e o potencial para contaminação de leucócito. Veja, Sieuwerts AM, et al. “Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR”, Breast Cancer Res Treat 2009;118(3):455- 68; Mimori K; et al) e complexidade técnica de abordagens disponíveis. Estes fatores podem tornar métodos disponíveis não inteiramente satisfatórios para o uso no laboratório clínico.

[0265]Em algumas formas de realização, células Neuroendócrinas são classificadas por FACS para heterogeneidade, usando métodos conhecido, após coloração e captação de laranja de acridina (AO), como descrito Kidd M, et al., “Isolation, Purification and Functional Characterization of the Mastomys EC cell”, Am J Physiol 2006;291: G778-91; Modlin EVI, et al., “The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells”, Clin Endocrinol Metab 2006;91(6):2340-8.

[0266]Em algumas formas de realização, os métodos de detecção fornecidos são usados para detectar, isolar ou enriquecer para as células de GEP-NEN e/ou biomarcadores em dois a três mL de sangue ou menos. Os métodos são realizados usando aparelhos de laboratório padrão e assim, são facilmente realizados no ajuste de laboratório clínico. Em um exemplo, uma leitura é obtida dentro de 12 horas, em um custo médio de aproximadamente 20 a 30 por amostra.

[0267]A presente invenção fornece uso de diagnóstico, prognóstico e preditivo para os agentes e métodos de detecção fornecidos aqui, tal como para o diagnóstico, prognóstico e predição de GEP-NEN, resultados associados, e resposta ao tratamento. Por exemplo, métodos de classificação de GEP-NEN disponíveis são limitados, em parte devido às classificações incorretas e que lesões ou tumores individuais podem evoluir em diferentes subtipos ou padrões de GEP-NEN, e/ou contêm mais do que um subtipo de GEP-NEN. Estruturas de classificação conhecidas são limitadas, por exemplo, na capacidade para prever resposta para tratamento ou discriminar com previsão entre tumores com características histopatológicas similares que podem variar substancialmente no curso clínico e resposta ao tratamento, e para prever resposta ao tratamento.

[0268]Existe, portanto, uma necessidade para esquemas de classificação à base de gene ou molecular. Os métodos e sistemas fornecidos, incluindo modelos à base de gene preditivo específico para GEP-NEN, abordam estes problemas, e podem ser usados para identificar e analisar parâmetros moleculares que são preditivos de comportamento biológico e predição com base em tais parâmetros.

[0269]Entre os métodos diagnósticos, prognósticos e preditivos fornecidos são aqueles que utilizam algoritmos de análise estatística e biomatemática e modelos preditivos para analisar a informação detectada cerca de expressão de biomarcadores de GEP-NEN e outros marcadores tais como genes housekeeping. Em algumas formas de realização, níveis de expressão, ligação detectada ou outra informação é normalizada e avaliada contra valor (s) de referência (s), tais como níveis de expressão em amostras ou padrões normais. Formas de realização fornecidas incluem métodos e sistemas para classificação e predição de GEP-NENs usando a informação detectada e medida cerca da expressão dos biomarcadores de GEP-NEN, por exemplo, em classificação, estadiantamento, prognóstico, projeto de tratamento, avaliação de opções de tratamento, e predição de resultados de doença GEP-NEN, por exemplo, prognosticar desenvolvimento de metástases.

[0270]Em algumas formas de realização, os métodos são usados para estabelecer diagnóstico de GEP-NEN, tal como diagnóstico ou detecção de doença em estágio inicial ou metástase, definir ou prever a extensão de doença, identificar propagação inicial ou metástase, prever resultado ou prognóstico, prever progressão, classificar atividade de doença, monitorar resposta ao tratamento, detectar ou monitorar para recorrência, e facilitar intervenção terapêutica inicial. Por exemplo, entre os métodos fornecidos e algoritmos são aqueles para o uso em classificação, estadiantamento, prognóstico, projeto de tratamento, avaliação de opções de tratamento, e predição de resultados de doença de GEP-NEN, por exemplo, prognosticar desenvolvimento de metástases.

[0271]Em uma forma de realização, os métodos, algoritmos e modelos são úteis para vigilância de diagnóstico, tal como vigilância de rotina e acompanhamento de paciente. Em algumas formas de realização, os métodos, algoritmos e modelos fornecem para diagnóstico inicial; em um aspecto, os métodos são capazes de detecção de tumores de baixo volume, e detecção de células tumorais circulantes, incluindo em estágios iniciais de doença, tais como detecção de tão poucas quanto em ou cerca de 3 células circulantes de GEP-NEN por mililitro de sangue. Em algumas formas de realização, evidência inicial de doença permite intervenção terapêutica inicial, em um tempo quando terapias são mais eficazes, que podem melhorar taxas de sobrevivência e resultados de doença.

[0272]Por exemplo, em uma forma de realização, os métodos úteis para detecção inicial da recorrência e/ou metástase de GEP-NEN, tal como depois do tratamento, por exemplo, após intervenção cirúrgica ou química. Em algum aspecto, os métodos são realizados semanal ou mensalmente após intervenção terapêutica, por exemplo, em amostras de sangue humano. Em alguns aspectos, os métodos são capazes de detectar micrometástases que são demasiadas pequenas para serem detectadas por meios convencionais, tais como por métodos de imageamento. Por exemplo, em um aspecto os métodos são capazes de detectar menos metástases do que um centímetro (cm), tais como a ou cerca de metástases de 1 cm, 0,9 cm, 0,8 cm, 0,7 cm, 0,6 cm, 0,5 cm, 0,4 cm, 0,3 cm, 0,2 cm, ou 0,1 cm, tal como no fígado.

[0273]Por exemplo, entre os métodos e sistemas fornecidos são aqueles que determinam a presença ou ausência (ou ambas) de um GEP-NEN em um sujeito ou amostra com uma taxa chamada correta entre 56 e 92 %, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de uma taxa chamada correta de 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %. Em alguns casos, os métodos são úteis para diagnóstico com uma especificidade ou sensibilidade de pelo menos ou pelo menos cerca de 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %.

[0274]Em outros aspectos, os métodos são capazes de detectar a recorrência, metástase, ou propagação de GEP-NEN após tratamento ou durante progressão da doença inicial em um estágio inicial como comparado com outros métodos de diagnóstico, tais como imageamento e detecção de biomarcadores disponíveis. Em alguns aspectos, os níveis detectados de expressão e/ou assinatura de expressão do correlato de biomarcadores significantemente com a progressão de doença, severidade ou agressividade da doença, carecem da sensibilidade de tratamento, redução em eficácia de tratamento, - eventos associados a GEP-NEN, risco, prognóstico, tipo ou classe de GEP-NEN ou estágio de doença.

[0275]Entre as formas de realização fornecidas são métodos que usam os biomarcadores fornecidos e detecção destes em desenvolvimento de tratamento, estratégia, e monitoramento, incluindo avaliação de resposta para tratamento e estratégias de tratamento individualizado ou específico para paciente que leva em consideração a provável história natural do tumor e em geral saúde do paciente.

[0276]Estratégias de gestão GEP-NEN incluem cirurgia— para cura (raramente obtida) ou citorredução - intervenção radiológica - por exemplo, por quimioembolização ou ablação por radiofrequência - quimioterapia, crioablação, e tratamento com somatostatina e análogos de somatostatina (tal como, Sandostatin LAR® (injeção de acetato de octreotida)) controle de sintomas causados por peptídeos e neuroaminas liberados. Agentes biológicos, incluindo interferon, e terapia hormonal, e radionucleotídeos alvejados com somatostatina estão sob investigação.

[0277]Em um exemplo, Crioablação libera tecido GEP-NEN para entrar no sangue, que por sua vez induz sintomas, como descrito por Mazzaglia PJ, et al, “Laparoscopic radiofrequency ablation of neuroendocrine liver metástases: a 10-year experience evaluating predictors of survival”, Surgery 2007;142(l): 10-9. Agentes quimioterapêuticos, por exemplo, agentes quimioterapêuticos citotóxicos sistêmicos, incluem etoposídeo, cisplatina, 5-fluorouracila, estreptozotocina, doxorrubicina; inibidores de fator de crescimento endotelial vascular, inibidores de receptor tirosina cinase (por exemplo, Sunitinibe, Sorafenibe e Vatalanibe), e mamífero alvo de inibidores derrapamicina (mTOR) (por exemplo, Temsirolimus e Everolimus), e combinações destes, por exemplo para tratar doença disseminada e/ou deficientemente diferenciada/agressiva. Outras abordagens de tratamento são bem conhecidas.

[0278]Em algumas formas de realização, a detecção e métodos de diagnóstico são usados em conjunção com tratamento, por exemplo, realizando-se os métodos semanal ou mensalmente antes de e/ou depois do tratamento. Em alguns aspectos, os níveis de expressão e perfis correlacionam com a progressão de doença, inefetividade ou efetividade de tratamento, e/ou a recorrência ou ausência desta doença. Em alguns aspectos, a informação de expressão indica que uma estratégia de tratamento diferente é preferível. Assim, são fornecidos aqui métodos terapêuticos, em que os métodos de detecção de biomarcador de GEP- NEN são realizados antes do tratamento, e em seguida, usados para monitorar efeitos terapêuticos.

[0279]Em vários pontos no tempo depois de iniciar ou resumir tratamento, alterações significantes em níveis de expressão ou perfis de expressão dos biomarcadores (por exemplo, em comparação com expressão ou perfis de expressão antes de tratamento, ou em algum outro ponto depois do tratamento, e/ou em uma amostra normal ou de referência) indica que uma estratégia terapêutica é, ou não é bem-sucedida, que doença é recorrente, ou que uma abordagem terapêutica diferente deve ser usada. Em algumas formas de realização, a estratégia terapêutica é alterada após a realização dos métodos de detecção, tais como adicionando-se uma intervenção terapêutica diferente, além de ou em lugar do método atual, aumentando-se ou diminuindo-se a agressividade ou frequência do método atual, ou parando ou restituindo o regime de tratamento.

[0280]Em um outro aspecto, níveis de expressão detectados ou perfil de expressão dos biomarcadores identificam a doença de GEP-NEN pela primeira vez ou fornece o primeiro diagnóstico ou classificação definitiva de doença de GEP- NEN. Em alguns aspectos desta forma de realização, uma abordagem de tratamento é designada com base nos níveis de expressão ou perfis de expressão, e/ou a classificação determinada. Os métodos incluem abordagens interativas, em que métodos de detecção de biomarcador são seguidos por iniciação ou mudança na intervenção terapêutica, seguido por monitoramento periódico contínuo, reavaliação, e mudança, cessação, ou adição de uma nova abordagem terapêutica, opcionalmente com monitoramento continuado.

[0281]Em alguns aspectos, os métodos e sistemas determinam se o sujeito avaliado é ou não responsivo ao tratamento, tal como um sujeito que é clinicamente categorizado como em remissão completa ou exibindo doença estável. Em alguns aspectos, os métodos e sistemas determinam se o sujeito é ou não tratado (ou tratamento-I, isto é, não recebeu tratamento) ou não é responsivo (isto é, clinicamente categorizado como “progressivo”, por exemplo, métodos são fornecidos para distinguir pacientes responsivos e não responsivos ao tratamento, e para distinguir pacientes com doença estável ou aqueles em remissão completa, e aqueles com doença progressiva. Em vários aspectos, os métodos e sistemas de fazer tais chamadas com pelo menos a ou cerca de 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % de taxa de chamada correta (isto é, precisão), especificidade ou sensibilidade.

[0282]Em alguns aspectos, a sensibilidade ou taxa de chamada correta para o resultado de diagnóstico ou preditivo ou prognóstico é maior do que, por exemplo, significantemente maior do que, obtido usando um método de diagnóstico ou prognóstico conhecido, tal como detecção e medição de CgA circulante ou outra proteína única.

[0283]Tipicamente, os métodos diagnósticos, prognósticos e preditivos, frequentemente em uma etapa inicial, seleciona um subconjunto de biomarcadores com base em sua capacidade de construir um classificador que pode com previsão prever e classificar GEP-NEN e/ou estágios diferentes de GEP-NEN.

[0284]Qualquer um de vários métodos bem conhecidos para avaliar diferenças em expressão de gene pode ser usado para selecionar o subconjunto de biomarcadores. Por exemplo, um classificador exato pode ser à base de protocolos topográficos, à base de reconhecimento padrão, por exemplo, máquinas de vetores de suporte (SVM) (Noble WS. What is a support vector machine? Nat Biotechnol. 2006;24(12): 1565 - 7). Técnicas à base de aprendizagem de máquina são tipicamente desejáveis para desenvolver algoritmos sofisticados, automáticos, e/ou objetivos para analisar dados biomédicos multimodais e alta dimensão. Em alguns exemplos, SVM— uma variante do algoritmo de aprendizagem supervisonado— é usado em relação aos métodos e sistemas fornecidos. SVMs foram usados para predizer a classificação de astrocitomas com uma precisão > 90, e carcinomas prostáticos com uma precisão de 74 a 80 % (Glotsos D, Tohka J, Ravazoula P, Cavouras D, Nikiforidis G. Automated diagnosis of brain tumours astrocytomas using probabilistic neural network clustering and support vector machines. Int J Neural Syst 2005;15(l-2): 1-11; Glotsos D, Tohka J, Ravazoula P, Cavouras D, Nikiforidis G. Automated diagnosis of brain tumours astrocytomas using probabilistic neural network clustering and support vector machines. Int J Neural Syst 2005; 15(1-2): 111)

[0285]Outros algoritmos para construir um classificador exato incluem protocolos de análise discriminante linear (LDA), Bayes ingênuo (NB) e vizinhos mais próximos de K (KNN). Tais abordagens são úteis para identificar alterações individuais ou multi-variáveis em condições neoplásticas ((Drozdov I, Tsoka S, Ouzounis CA, Shah AM. Genome-wide expression patterns in physiological cardiac hypertrophy. BMC Genomics. 2010;11: 55; Freeman TC, Goldovsky L, Brosch M, et al. Construction, visualization, and clustering of transcription networks from microarray expression data. PLoS Comput Biol 2007;3(10): 2032-42; Zampetaki A, Kiechl S, Drozdov I, et al. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR- 126 and other microRNAs in type 2 diabetes. Circ Res. 2010;107(6): 810-7. Epub 2010 Jul 22; Dhawan M, Selvaraja S, Duan ZH. Application of committee kNN classifiers for gene expression profile classification. Int J Bioinform Res Appl. 2010;6(4): 344-52; Kawarazaki S, Taniguchi K, Shirahata M, et al. Conversion of a molecular classifier obtained by gene expression profiling into a classifier based on real-time PCR: a prognosis predictor for gliomas. BMC Med Genomics. 2010;3: 52; Vandebriel RJ, Van Loveren H, Meredith C. Altered cytokine (receptor) mRNA expression as a tool in immunotoxicology. Toxicology. 1998; 130(1): 43-67; Urgard E, Vooder T, Vosa U, et al. Metagenes associated with survival in non-small cell lung cancer. Cancer Inform. 2011;10: 175-83. Epub 2011 Jun 2; Pimentel M, Amichai M, Chua K, Braham L. Validating a New Genomic Test for Irritable Bowel Syndrome Gastroenterology 2011; 140 (Suppl 1): S-798; Lawlor G, Rosenberg L, Ahmed A, et al. Increased Peripheral Blood GATA-3 Expression in Asymptomatic Patients With Active Ulcerative Colitis at Colonoscopy. Gastroenterology 2011;140 (Suppl 1)).

[0286]Em algumas formas de realização, um classificador exato para GEP- NEN e/ou estágios diferentes de GEP-NEN é fundamentado em uma combinação dos protocolos SVM, LDA, NB e KNN. Isto é denominado o Classificador de Risco de Algoritmo Multi-Analílico para NETs (MAARC-NET).

[0287]Métodos usando os algoritmos e modelos predizíveis usam métodos de análise estatística e compressão de dados, tais como aqueles bem conhecidos na técnica. Por exemplo, dados de expressão podem ser transformados, por exemplo, transformado, e importado em um programa de análise estatística, tal como Partek® Genomic Suite (“Partek”, Partek® Genomics SuiteTM, ed. Revisão 6.3 St. Louis: Partek Inc, 2008) ou programa similar, por exemplo. Dados são comprimidos e analisados por comparação.

[0288]Se diferenças em pontuação de nível de expressão ou valores são considerados significantes podem ser determinados por abordagens estatísticas bem conhecidas, e tipicamente é feita indicando-se um limiar por um parâmetro estatístico particular, tal como um valor p limiar (por exemplo, p < 0,05), valor S limiar (por exemplo, + 0,4, com S < - 0,4 ou S > 0,4), ou outro valor, em que diferenças são consideradas significantes, por exemplo, onde expressão de um biomarcador é considerada significantemente regulada para baixo ou para cima, respectivamente, entre duas amostras diferentes, por exemplo, representando dois subtipos GEP-NEN diferentes, tumores, estágios, localizações, agressividade, ou outro aspecto de GEP-NEN ou amostra normal ou de referência.

[0289]Em um aspecto, os algoritmos, modelos e métodos predizíveis são fundamentados em biomarcadores expressados de genes associados com clusters do gene regulador (isto é, SSTRoma, Proliferoma, Signaloma, Metaboloma, Secretoma, Secretoma, Pluroma, EpiGenoma e Apoptoma) subjacente a vários subtipos GEP-NEN.

[0290]Em um aspecto, os métodos aplicam-se às formulações matemáticas, algoritmos ou modelos identificam pontos de corte específicos, por exemplo, pontuações de nível de expressão pré-determinados, que distinguem entre amostras normais e GEP-NEN, entre GEP-NEN e outros cânceres, e entre vários subtipos, estágios, e outros aspectos de doença ou resultado da doença. Em um outro aspecto, os métodos são usados por previsão, classificação, prognóstico, e monitoramento e projeto de tratamento. Em um aspecto, as formas de realização predizíveis são úteis para identificar parâmetros moleculares predizíveis de comportamento biológico, e previsão de vários resultados associados com GEP- NEN usando os parâmetros. Em um aspecto destas formas de realização, abordagens de aprendizagem de máquina são usadas, por exemplo, desenvolver algoritmos sofisticados, automáticos e objetivos para a análise de dados biomédicos multimodais e alta dimensão.

[0291]Uma “curva ROC” como usado aqui refere-se a um gráfico da taxa positiva verdadeira (sensitividade) contra a taxa positiva falsa (especificidade) para um sistema classificador binário como seu limiar de discriminação é variado. Uma curva ROC pode ser representada equivalentemente plotando-se a fração de verdadeiros positivos dentre os positivos (TPR = taxa positiva verdadeira) versus a fração de falsos positivos dentre os negativos (FPR = taxa positiva falsa). Cada ponto na curva ROC representa um par de sensitividade/especificidade correspondendo a um limiar de decisão particular.

[0292]AUC representa a área na curva ROC. A AUC é uma indicação global da precisão de diagnóstico de 1) um subconjunto ou painel de biomarcadores GEP- NEN e 2) uma curva ROC. AUC é determinada pela “regra trapezoidal”. Para uma determinada curva, os pontos de dados são conectados por segmentos de linha reta, perpendiculares são erguidos a partir da abscissa para cada ponto de dados, e a soma das áreas dos triângulos e trapezoides assim construídos é computado. Em certas formas de realização dos métodos fornecidos aqui, um subconjunto ou painel de GEP-NEN tem uma AUC na faixa de cerca de 0,75 a 1,0. Em certas destas formas de realização, a AUC é na faixa de cerca de 0,50 a 0,85, 0,85 a 0,9, 0,9 a 0,95, ou 0,95 a 1,0.

[0293]Para a comparação de pontuações de nível de expressão ou outros valores, e identificar perfis de expressão (assinaturas de expressão) ou assinaturas reguladoras à base de expressão de biomarcador GEP-NEN, dados são comprimidos. Compressão tipicamente é por Análise de Componente Principal (PCA) ou técnica similar para descrever e visualizar a estrutura de dados de alta dimensão. PCA permite a visualização e comparação de expressão de biomarcador GEP-NEN e determinar e comparar perfis de expressão (assinaturas de expressão, padrões de expressão) entre amostras diferentes, tais como entre amostras normais ou referência e de testes e entre tipos de tumores diferentes.

[0294]Em algumas formas de realização, dados de nível de expressão são adquiridos, por exemplo, por PCR em tempo real e reduzidos ou comprimidos, por exemplo, para componentes principais.

[0295]PCA é usada para reduzir dimensionalidade dos dados (por exemplo, valores de expressão medidos) em componentes principais não correlacionados (PCs) que explicam ou representam uma maioria da variância nos dados, tais como cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % da variância.

[0296]Em um exemplo, para PCA é PCA de 3 componentes, em que três PCs são usados que coletivamente representam a maioria da variância, por exemplo, cerca de 75 %, 80 %, 85 % 90 %, ou mais variância dos dados (Jolliffe IT, “Principle Component Analysis”, Springer, 1986).

[0297]Mapeamento de PCA, por exemplo, mapeamento de PCA de 3 componentes é usado para mapear dados a um espaço tridimensional para visualização, tal como atribuindo-se primeiro (1°), segundo (2°) e terceiro (3°) PCs aos eixos X-, Y-, e Z, respectivamente.

[0298]PCA pode ser usada para determinar perfis de expressão para os biomarcadores em várias amostras. Por exemplo, dados de expressão reduzidos para tipos de amostra individuais (por exemplo, cada tipo de tumor, subtipo ou grau, ou tipo de amostra normal) são localizados em um sistema de coordenadas PCA e dados localizados usados para determinar perfis ou assinaturas de expressão de transcrição individuais.

[0299]Em um aspecto, o perfil de expressão é determinado para cada amostra plotando-se ou definindo-se um centroide (centro de massa; expressão média), correspondendo a ou representando o perfil de expressão de transcrição individual da amostra (assinatura reguladora), como determinado pelo vetor de componente principal, como determinado por PCA para o painel de biomarcadores.

[0300]Geralmente, dois centroides ou pontos de localização separados por uma distância relativamente grande neste sistema de coordenadas representam dois perfis de expressão de transcrição relativamente distintos. Do mesmo modo, centroides relativamente próximos representam perfis relativamente similares. Nesta representação, a distância entre centroides é inversamente equivalente à medida de similaridade (maior distância = menor similaridade) para as amostras diferentes, tal que distâncias grandes ou separação entre centroides indicam amostras tendo assinaturas de expressão de transcrição distintas. Proximidade de centroides indicam similaridade entre amostras. Por exemplo, a distância relativa entre centroides para diferentes amostras de tumor GEP-NEN representa a similaridade relativa de suas assinaturas reguladoras ou perfis de expressão de transcrição.

[0301]Em um aspecto, a análise estatística e comparativa inclui determinar a correlação inversa entre níveis ou valores de expressão para dois biomarcadores. Em um exemplo, esta correlação e o cosseno do ângulo entre vetores de expressão individual (maior ângulo = menor similaridade), é usado para identificar clusters de expressão do gene relacionados (Gabriel KR, “The biplot graphic display of matrices with application to principal component analysis”, Biometrika 1971;58(3):453).

[0302]Em algumas formas de realização, existe uma correlação linear entre níveis de expressão de dois ou mais biomarcadores, e/ou a presença ou ausência de GEP-NEN, subtipo, estágio, ou outro resultado. Em um aspecto, existe uma correlação dependente de expressão entre os biomarcadores GEP-NEN fornecidos e características das amostras biológicas, tais como entre biomarcadores (e níveis de expressão destes) e vários subtipos GEP-NEN (por exemplo, doença benigna versus ativa).

[0303]Coeficientes de Correlação de Pearson (PC) (R2) podem ser usados para avaliar relações lineares (correlações) entre pares de valores, tais como entre níveis de expressão de um biomarcador para amostras biológicas diferentes (por exemplo, subtipos de tumor) e entre pares de biomarcadores. Esta análise pode ser usada para separar linearmente distribuição em padrões de expressão, calculando- se coeficientes PC para pares individuais dos biomarcadores (plotados em eixos x- e y de Matrizes de Similaridade individuais). Limiares podem ser ajustados para variar graus de correlação linear, tais como um limiar para correlação altamente linear de (R > 0,50 ou 0,40). Classificadores lineares podem ser aplicados aos conjuntos de dados. Em um exemplo, o coeficiente de correlação é 1,0.

[0304]Em uma forma de realização, clusters reguladores são determinados construindo-se redes de comunicação de correlações usando análises estatísticas, por exemplo, para identificar clusters reguladores compostos de subconjuntos do painel de biomarcadores. Em um exemplo, coeficientes de correlação PC são determinados e usados para construir tais redes de comunicação de correlações. Em um exemplo, as redes de comunicação são identificadas desenhando-se bordas entre pares de transcrição tendo R acima do limite pré-definido. Grau de correlação pode fornecer informação em reprodutibilidade e robustez.

[0305]Também fornecido aqui são algoritmos objetivos, modelos predizíveis, e métodos analíticos topográficos, e métodos usando o mesmo, para analisar dados biomédicos multimodais e alta dimensão, tais como os dados obtidos usando os métodos fornecidos para detectar expressão dos painéis de biomarcador GEP-NEN. Como debatido acima, os algoritmos objetivos, modelos, e métodos analíticos incluem análises matemáticas à base de protocolos topográficos à base de reconhecimentos de padrões, por exemplo, máquinas de vetores de suporte (SVM) (Noble WS. What is a support vector machine? Nat Biotechnol. 2006;24(12): 1565 - 7), protocolos de análise discriminante linear (LDA), Bayes ingênuo (NB) e vizinhos mais próximos de K (KNN), assim como outros algoritmos e modelos de aprendizagem supervisionados, tais como Árvore de Decisão, Perceptron, e análise discriminante regularizada (RDA), e modelos e algoritmos similares bem conhecidos na técnica (Gallant SI, “Perceptron-based learning algorithms,” Perceptron-based learning algorithms 1990; 1(2): 179 - 91).

[0306]Em algumas formas de realização, Seleção de Característica (FS) é aplicada para remover as características mais abundantes de um conjunto de dados, tais como um conjunto de dados de expressão de biomarcador GEP-NEN, e gerar um subconjunto de biomarcadores GEP-NEN relevante. FS melhora a capacidade de generalização, acelera o processo de aprendizagem, e melhora interpretabilidade de modelo. Em um aspecto, FS é utilizada usando uma abordagem de seleção “greedy forward”, selecionar o subconjunto de características mais relevantes para os modelos de aprendizagem mais robustos. (Peng H, Long F, Ding C, “Feature selection based on mutual information: criteria of max-dependency, max- relevance, and min-redundancy,” IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, 2005;27(8): 1226 - 38).

[0307]Em algumas formas de realização, algoritmos de Máquinas de vetores de suporte (SVM) são usados para classificação de dados aumentando-se a margem entre os conjuntos de dados n (Cristianini N, Shawe-Taylor J. An Introduction to Support Vector Machines and other kernel-based learning methods. Cambridge: Cambridge University Press, 2000).

[0308]Em algumas formas de realização, os modelos predizíveis incluem Árvore de Decisão, que mapeia observações cerca de um item a uma conclusão cerca de seu valor alvo (Zhang H, Singer B. “Recursive Partitioning in the Health Sciences,” (Statistics for Biology and Health): Springer, 1999.). As folhas da árvore representam classificações e ramificações representam conjunções de características que devolvem nas classificações individuais. Foi usado eficazmente (70 a 90 %) para predizer prognóstico de câncer de mama metastático (Yu L et al “TGF-beta receptor- activated p38 MAP kinase mediates Smad-independent TGF- beta responses,” Embo J 2002;21(14):3749-59), assim como câncer de cólon (Zhang H et al “Recursive partitioning for tumor classification with gene expression microarray data.,” Proc Natl Acad Sci USA 2001;98(12):6730-5), para predizer a classificação de astrocitomas (Glotsos D et al “Automated diagnosis of brain tumours astrocytomas using probabilistic neural network clustering and support vector machines,” Int J Neural Syst 2005; 15(1-2): 1-11) com uma precisão > 90 %, e carcinomas prostáticos com uma precisão de 74 a 80 % (Mattfeldt T et al. “Classification of prostatic carcinoma with artificial neural networks using comparative genomic hybridization and quantitative stereological data,” Pathol Res Pract 2003;199(12):773-84). A eficiência desta técnica foi medida por validação cruzada 10 vezes (Pirooznia M et al “A comparative study of different machine learning methods on microarray gene expression data,” BMC Genomics 2008;9 Suppl 1:S13).

[0309]Os modelos e algoritmos predizíveis ainda incluem Perceptron, um classificador linear que forma uma rede de comunicações neural de alimentação direta e mapeia uma variável de entrada a um classificador binário (Gallant SI. “Perceptron-based learning algorithms,” Perceptron-based learning algorithms 1990; 1(2): 179-91). Foi usado para predizer malignidade de câncer de mama (Markey MK et al. “Perceptron error surface analysis: a case study in breast cancer diagnosis,” Comput Biol Med 2002;32(2):99-109”, Comput Biol Med 2002;32(2):99 - 109). Neste modelo, a taxa de aprendizagem é uma constante que regula a velocidade de aprendizagem. Uma taxa de aprendizagem mais baixa melhora a classificação modelo, enquanto aumenta o tempo para processar a variável (Markey MK et al. “Perceptron error surface analysis: a case study in breast cancer diagnosis,” Comput Biol Med 2002;32(2):99-109). Em um exemplo, uma taxa de aprendizagem de 0,05 é usada. Em um aspecto, um algoritmo Perceptron é usado para distinguir entre tumores localizados ou primários e tumores metastáticos correspondentes. Em um aspecto, três varreduras de dados são usadas para gerar limites de decisão que explicitamente separam dados em classes.

[0310]Os modelos e algoritmos predizíveis ainda incluem Análise Discriminante Regularizada (RDA), que pode ser usada como uma alternativa flexível a outras técnicas de extração de dados, incluindo Análise Discriminante Linear e Quadrática (LDA, QDA) (Lilien RH, Farid H, Donald BR. “Probabilistic disease classification of expression-dependent proteomic data from mass spectrometry of human serum.,” J Comput Biol 2003;10(6):925-46.; Cappellen D, Luong- Nguyen NH, Bongiovanni S, et al. “Transcriptional program of mouse osteoclast differentiation governed by the macrophage colony- stimulating factor and the ligand for the receptor activator of NFkappa B.” J Biol Chem 2002;277(24):21971- 82.). Parâmetros de regularização de RDA, Y e \ são usados para projetar um classificador intermediário entre LDA e QDA. QDA é realizada quando Y=0 e ÀAO enquanto LDA é realizada quando Y=0 e À=1 (Picon A, Gold LI, Wang J, Cohen A, Friedman E. A subset of metastatic human colon cancers expresses elevated levels of transforming growth factor beta 1. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1998;7(6):497-504).

[0311]Para reduzir o encaixe excessivo, parâmetros de RDA são selecionados para minimizar erros de validação cruzada enquanto não sendo igual a 0,0001, assim forçando RDA para produzir um classificador entre LDA, QDA e L2 (Pima I, Aladjem M., “Regularized discriminant analysis for face recognition,” Pattern Recognition 2003;37(9): 1945-48). Finalmente, sua regularização foi usada amplamente para superar o encaixe excessivo em aprendizagem de máquina (Evgeniou T, Pontil M, Poggio T. “Regularization Networks and Support Vector Machines.,” Advances in Computational Math 2000;13(l): l-50.; Ji S, Ye J. Kernel “Uncorrelated and Regularized Discriminant Analysis: A Theoretical and Computational Study.,” IEEE Transactions on Knowledge and Data Engineering 2000;20(10): 1311-21.).

[0312]Em um exemplo, parâmetros de regularização são definidos como Y = 0,002 e À = 0. Em um exemplo, para cada par de classe, valores S são atribuídos a todos os transcritos que são assim, arranjados por um valor S decrescente. RDA é realizada, por exemplo, 21 vezes, tal que a iteração Nth consiste de transcritos de pontuação N superior. Estimativa de erro pode ser realizada por uma validação cruzada de 10 vezes do classificador de RDA. Isto pode ser feito dividindo-se o conjunto de dados de tecido em subconjuntos complementares, que realizam a análise em um subconjunto (chamado de conjunto de treinamento), e validando a análise no outro subconjunto (chamado de conjunto de validação ou conjunto de teste).

[0313]Em um exemplo, erro de misclassificação é calculado para reduzir variabilidade na avaliação predizível global, que pode fornecer um método mais exato para estimativa de erro em comparação com outras abordagens, incluindo validação cruzada bootstrapping e leave-one-out (Kohavi R. “A study of crossvalidation and bootstrap for accuracy estimation and model selection.,” Proceedings of the Fourteenth International Joint Conference on Artificial Intelligence, 1995;2(12): 1137-43.).

[0314]Em um exemplo, seleção para classificação de tecido é realizada, por exemplo, computando-se a pontuação de classificação (S) para cada gene e para cada par de classe como: onde μci e μc2 representam meios de primeira e segunda classe respectivamente e αci e oc2 são desvios padrão inter-classe. Um valor S grande é indicativo de uma expressão diferencial substancial (“Mudança de Vezes”) e um desvio padrão baixo (“estabilidade de transcrição”) dentro de cada classe. Genes podem ser sortidos por um valor S decrescente e usado como entradas para o algoritmo de análise discriminante regularizada (RDA).

[0315]Os algoritmos e modelos podem ser avaliados, validados e validados de forma cruzada, por exemplo, para validar as capacidades predizíveis e classificação dos modelos, e avaliar especificidade e sensitividade. Em um exemplo, função de base radial é usada como um kernel, e uma validação cruzada i0 vezes usada para medir a sensitividade de classificação (cristianini N, Shawe- Taylor J. “An Introduction to Support Vector Machines and other kernel-based learning methods.,” cambridge: cambridge University Press, 2000). Vários modelos e algoritmos de classificação podem ser comparados pelos métodos fornecidos, por exemplo, usando validação e treinamento cruzado, como fornecido aqui, para comparar desempenho dos modelos predizíveis para prognosticar resultados particulares.

[0316]Formas de realização dos métodos fornecidos, sistemas, e modelos predizíveis são reproduzíveis, com faixa dinâmica alta, pode detectar mudanças pequenas em dados, e são realizadas usando métodos simples, a custo baixo, por exemplo, para implementação em um laboratório clínico.

[0317]Kits e outros artigos de fabricação são fornecidos para o uso nas aplicações de diagnóstico, prognóstico, preditivas, e terapêuticas descritas aqui. Em algumas formas de realização, os kits incluem um portador, pacote, ou empacotamento, compartimentalizados para receber um ou mais recipientes tais como frascos, tubos, placas e poços, em que cada um dos recipientes inclui um dos elementos separados para o uso nos métodos fornecidos aqui, e em alguns aspectos ainda incluem um marcador ou inserto com instruções para o uso, tais como o uso descrito aqui. Em um exemplo, os recipientes individuais incluem agentes individuais para detecção dos biomarcadores GEP-NEN como fornecido aqui; em alguns exemplos, recipientes individuais incluem agentes para detecção de genes de administração interna e/ou normalização.

[0318]Por exemplo, o (s) recipiente (s) pode (m) compreender um agente, tal como uma sonda ou iniciador, que é ou pode ser detectavelmente marcado. Onde o método utiliza hibridização de ácido nucleico por detecção, o kit também pode ter recipientes contendo nucleotídeo (s) para amplificação da sequência de ácido nucleico alvo. Kits podem compreender um recipiente compreendendo um repórter, tal como uma proteína de ligação a biotina, tal como avidina ou estreptavidina, ligada a uma molécula repórter, tal como um rótulo enzimático, fluorescente ou radioisótopo; um tal repórter pode ser usado com, por exemplo, um ácido nucleico ou anticorpo.

[0319]Os kits tipicamente compreenderão o (s) recipiente (s) descrito (s) acima e um ou mais outros recipientes associados com isso que compreendem materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas; portadores, embalagens, recipientes, frascos e/ou marcadores de tubo de listagem de conteúdos e/ou instruções para o uso, e inserção de pacote com instruções para o uso.

[0320]Um rótulo pode estar presente em ou com o recipiente para indicar que a composição é usada para uma aplicação terapêutica ou não terapêutica específica, tal como um prognóstico, profilático, diagnóstico ou aplicação laboratorial, e também pode indicar direções para uso in vivo ou in vitro, tal como aquele descrito aqui. Direções e ou outra informação também podem ser incluídas em um inserto (s) ou rótulo (s) que é incluída com ou no kit. O rótulo pode ser em ou associado com o recipiente. Um rótulo um pode ser em um recipiente quando letras, números ou outros caracteres formando o rótulo são moldados ou gravados no seu recipiente; um rótulo pode ser associado com um recipiente quando está presente dentro de um receptáculo ou portador que também mantém o recipiente, por exemplo, como um inserto de pacote. O rótulo pode indicar que a composição é usada para diagnosticar, tratar, profilaxizar ou prognosticar uma condição, tal como GEP-NEN.

[0321]Em uma outra forma de realização, um artigo (s) de fabricação contendo composições, tais como sequência (s) de aminoácido, molécula (s) pequena (s), sequência (s) de ácido nucleico, e/ou anticorpo (s), por exemplo, materiais úteis para os diagnósticos, prognósticos, ou terapias de GEP-NEN é fornecido. O artigo de fabricação tipicamente compreende pelo menos um recipiente e pelo menos um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro, metal ou plástico. O recipiente pode manter sequência (s) de aminoácido, molécula (s) pequena (s), sequência (s) de ácido nucleico, população (s) celular (s) e/ou anticorpo (s). Em uma forma de realização, o recipiente mantém um polinucleotídeo para o uso em examinar o perfil de expressão de mRNA de uma célula, junto com reagentes usados para este propósito. Em uma outra forma de realização um recipiente compreende um anticorpo, fragmento de ligação deste ou proteína de ligação específica para o uso em avaliar expressão de proteína de biomarcadores GEP-NEN em amostras biológicas, por exemplo, sangue ou células e tecidos ou para propósitos de laboratório, prognóstico, diagnóstico, profiláticos e terapêuticos relevantes; indicações e/ou direções para tais usos podem ser incluídas em ou com tal recipiente, como os reagentes e outras composições ou ferramentas usadas para estes propósitos.

[0322]O artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e/ou solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agitadores, agulhas, seringas, e/ou inserção de pacote com indicações e/ou instruções para o uso.

[0323]Expressão diferencial de NET Marker GENESIN Primary NETs - Uma tela a nível de exón de NETs localizada no intestino delgado usando arranjos Affymetrix Human Exon 1,0 ST foi realizada para definir eventos de recomposição alternativos em tecido tumoral neuroendócrino em comparação a um controle (mucosa intestinal normal). Análise de expressão de exón identificou 1287 genes diferencialmente expressados entre mucosa intestinal normal e tecidos tumorais NET. Quinhentos e vinte nove genes foram supra-regulados e 758 foram infra- regulados. Como um exemplo, um subconjunto de genes marcadores NET foi focado em, em particular CgA, Tph1, VMAT2, SCG5 e PTPRN2. A expressão de exón normalizada com RMA dos genes marcadores NET neste subconjunto é mostrada na FIGURA 1 em amostras normais (verde) e tumorais (vermelho). Destes genes, Tph1 foi o único gene onde todos os exóns foram diferencialmente expressados em tumor (FC>1,5, p<0,05), enquanto CgA foi o único gene onde todas as expressões de exón permaneceram constantes entre amostras tumorais e normais.

[0324]Dois de 17 exóns diferencialmente expressados foram identificados em VMAT2 e oito de 9 em SCG5. Em PTPRN2, seis de 30 exóns foram diferencialmente expressados. Estes resultados demonstraram que conjuntos de iniciador/sonda específicos são necessários para maximizar diferenças entre neoplasia e expressão de gene normal.

[0325]Validando a Recomposição Alternativa em Genes Marcadores NET por RT-PCR com referência à FIGURA 2, as descobertas de níveis de transcrição de exón diferenciais foram validadas usando reação de cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR). Todos os exóns de gene marcador, incluindo Tph11- 2, VMAT29-10, SCG52-3 e PTPRN212-13, foram confirmados ser diferencialmente expressados em amostras de tumor versus mucosa normal, com exceção de CgA4-5.

[0326]Dados genômicos e RT-PCR das FIGURAS 1 e 2, respectivamente, identificam que recomposição diferencial ocorre em NETs e que biomarcadores candidatos, por exemplo, VMAT2, requerem o uso de conjuntos de iniciador/sonda específicos para capturar eficazmente diferenças em expressão de transcritos alvo.

[0327]Para avaliar a relevância em sangue, uma análise de microarranjo de amostras de sangue NET periférico foi realizada. Genes supra-regulados (n=1,397) incluíram termos GO-Fat tais como “Splicing de RNA”, “transporte mediado por Vesícula” e “modificação de Cromatina” que é compatível com funções conhecidas para estes processos em patobiologia NET. Comparações do transcriptoma do sangue com transcriptomas GEP-NET identificaram 236 genes supra-regulados, 72 dos quais foram examinados para utilidade como biomarcadores. Uma tela preliminar identificou 51 genes como supra-regulados em amostras de sangue tumorais em comparação aos controles. Quarenta e dois genes (83 %) foram transcritos de múltiplos exóns. Um mínimo de dois conjuntos de iniciadores/sondas foi testado para estes genes em sangue para definir as combinações mais relevantes para amplificação alvo. O gene de manutenção e 51 alvos validados e exóns de interesse para conjuntos de iniciador/sonda são descritos na Tabela 2. As posições de amplicon identificadas para cada biomarcador GEN-NEN na Tabela 2 são identificadas como sequências sublinhadas na Tabela 1. TABELA 2: Detalhes do Iniciador

[0328]Delineação de Conjunto de Gene Mínimo para Sistema de Pontuação Derivado Matematicamente (MAARC-NET) - Quatro algoritmos de classificação (SVM, LDA, KNN e Bayes) e um projeto de validação cruzada de 10 vezes foram usados para construir um classificador para a identificação de GEP-NETs no sangue. Veja, Modlin I, Drozdov I, Kidd M: The Identification of gut neuroendocrine tumor disease by multiple synchronous transcript analysis in blood. Plos One 2013, e63364 Estes classificadores foram construídos em um conjunto de treinamento e características significantemente supra-reguladas entre controle e casos tumorais foram calculados por teste t. Com referência à FIGURA 3, um exame dos 51 genes apresentados na Tabela 2 identificaram que a inclusão de pelo menos 22 genes foi suficiente para construir um classificador exato (> 0,85). FIGURA 3 mostra a precisão de previsão de cada algoritmo classificador usando adição sequencial de até 27 genes significantemente supra-regulados (p<0,05) nas amostras GEP-NET obtidas usando resultados da validação cruzada 10 vezes. A precisão média dos algoritmos SVM, LDA, KNN e Bayes para distinguir GEP-NET de amostras de sangue controle usando a adição sequencialmente de 27 genes foi comparável a 0,89 (0,85 a 1,0), 0,89 (0,86 a 0,93), 0,88 (0,85 a 0,93) e 0,86 (0,85 a 0,93) respectivamente. A combinação “voto majoritário” dos quatro classificadores alcançou uma precisão de 0,88. O pelo menos 22 genes suficientes para construir um classificador exato foram usados para desenvolver o sistema de pontuação MAARC-NET, e são apresentados na Tabela 3. TABELA 3: Vinte Dois Genes Incluídos no Sistema de Pontuação MAARC- NET Derivado Matematicamente

[0329]Refinamento de Sistema de Pontuação MAARC-NET Derivado Matematicamente - Expressões de gene à base de PCR individuais são incluídas em uma pontuação. Veja, Modlin I, Drozdov I, Kidd M, Plos One 2013. A pontuação é fundamentada em uma estratégia de “voto majoritário” e foi desenvolvida de um sistema de classificação binário de forma que uma amostra será chamada “normal” e dada uma pontuação de 0 ou “tumoral” e será pontuada “1”. A pontuação pode variar de 0 (quatro chamadas todas “normal”) à 4 (quatro chamadas todas “tumorais”). Cada “chamada” é o resultado binário (“0” para normal ou “1” para tumoral) de um de quatro algoritmos aprendizagem diferentes: Máquina de Vetor de Suporte (SVM), Análise Discriminação Linear (LDA), Vizinhos mais próximos de K (KNN), e Bayes Ingênuo (Bayes). Cada um destes quatro algoritmos de aprendizagem foi treinado em um conjunto de treinamento interno incluindo 67 controles e 63 GEP-NEN. Neste conjunto de treinamento, genes expressados diferencialmente (controle versus GEP- NEN) foram identificados como significante usando um teste t. Com base no conjunto de treinamento, cada um dos algoritmos de aprendizagem foi treinado para diferenciar entre expressão de gene normal e tumoral para dentro de um nível de significância de pelo menos p < 0,05. De acordo com a estratégia de voto majoritário, aquelas amostras com menos do que 2 chamadas “normal” são classificadas como GEP-NEN. Com referência à FIGURA 4A, uma auditoria de amostras identificou que 85 % de controles exibiram uma pontuação de “0’. Sem tumores pontuados “0’. Análises ROC identificaram que uma pontuação de 2 foi o corte para amostras normais (controles) versus tumorais (pontuação >2). Esta abordagem exibiu taxas chamadas corretas de 91 a 97 % com sensibilidades e especificidades de 85 a 98 % e 93 a 97 % para a identificação de GEP-NETs em dois conjuntos independentes. Veja, Modlin I, Drozdov I, Kidd M, Plos One 2013.

[0330]Estes dados foram inicialmente derivados de um conjunto de dados de teste de 130 amostras (n=67 controles, n=63 NETs). Inerente no conjunto de teste são duas classes de NETs - clinicamente definidas como doença estável tratada (SD: n=35) e doença progressiva não tratada (PD: n=28). O algoritmo de classificação também segregou o tumor chamado em duas unidades “tratado” e “não tratado’. A classificação 0 a 4 binária foi, portanto alterada para representar 3 possíveis chamadas para cada amostra particular: “normal”, “tumor (tratado)” e “tumor (não tratado)”.

[0331]Várias regras foram implementadas para gerar uma estratégia de voto majoritário alterada. Uma chamada de “normal” foi atribuída um valor de 0; uma chamada de tumor “tratado” foi atribuída um valor de 1; uma chamada de tumor “não tratado” foi atribuída um valor de 2. Por via de exemplo, se um resultado de amostra em quatro chamadas de “normal”, um valor de 0 foi atribuído para cada chamada, desse modo totalizando uma pontuação de 0. Se um resultado de amostra em quatro chamadas de tumor “tratado”, um valor de 1 foi atribuído para chamada, desse modo totalizando uma pontuação de 4. Se um resultado de amostra em quatro chamadas de tumor “não tratado”, um “2” é atribuído para cada, desse modo totalizando uma pontuação de 8. Pontuações na estratégia de voto majoritário alterada pode, portanto, variar entre 0 e 8.

[0332]Exame do conjunto de teste de dados (n=130) foi usado para estabelecer se a pontuação derivada de voto majoritário alterada pode servir como uma medida de resposta de “tratamento”. Similarmente à pontuação 0 a 4 publicada mostrada na FIGURA 4A, a maioria de pacientes NET exibiram uma pontuação de voto majoritário alterada >2 como mostrada na FIGURA 4B. Com referência à FIGURA 4C, voto majoritário e pontuações de voto majoritário alteradas foram significantemente relacionadas (R2=0,89, p<0,0001).

[0333]Com referência à FIGURA 5A, análise dos dados no conjunto de teste identificou que uma pontuação derivada matematicamente alterada (0 a 8) foi significantemente elevada em tumores em comparação aos controles e foi mais alta em PD em relação a SD.

[0334]Com referência à FIGURA 5B, uma curva característica operando receptor (ROC) foi gerada de controles versus GEP-NETs (SD e PD combinados). Uma curva ROC é uma generalização do conjunto de combinações potenciais de sensitividade e especificidade possível para preditores. Uma curva ROC é um gráfico da taxa positiva verdadeira (sensitividade) contra a taxa positiva falsa (1- especificidade) para os diferentes pontos de corte possíveis de um teste de diagnóstico. FIGURA 5B é uma representação gráfica do relacionamento funcional entre a distribuição dos valores de sensitividade e especificidade no conjunto de teste e em um coorte de amostras de controle. A área na curva (AUC) é uma indicação global da precisão de diagnóstico das (1) pontuações derivadas matermaticamente alteradas e (2) uma curva característica operando receptor (ROC). AUC pode ser determinada pela “regra trapezoidal. Para uma dada curva ROC, os pontos de dados são conectados por segmentos de linha reta, perpendiculares são erguidas a partir da abscissa para cada ponto de dados, e a soma das áreas dos triângulos e trapezoides, assim construídos é computada.

[0335]A curva ROC na FIGURA 5B identifica que a pontuação derivada matematicamente alterada pode ser utilizada para diferenciar entre controles e GEP- NETs - exibindo uma AUC de > 0,98, e um p < 0,0001; *p < 0,05 vs. controles; #p < 0,05 vs. SD (2-tailed Mann-Whitney U-test).

[0336]Pontuações derivadas matermaticamente alteradas foram subsequentemente examinadas em um conjunto independente (SD: n = 111, PD: n = 48). Com referência à FIGURA 6A, as pontuações foram significantemente elevadas no conjunto independente, exibindo um p < 0,0001. Com referência à FIGURA 6B, um gráfico de distribuição de frequência de pontuações derivadas matematicamente alteradas em pacientes com SD e PD confirmaram que amostras PD exibiram pontuações mais altas, com #p < 0,0001 vs. SD (2-tailed Mann-Whitney U-test).

[0337]Com referência à FIG. 7A, uma segunda curva ROC foi gerada para determinar se a pontuação derivada matematicamente alterada pode ser utilizada para diferenciar SD de PD. No conjunto de teste (SD: n = 35, PD: n = 28), a análise ROC identificou que a pontuação pode ser usada para diferenciar tumores PD de SD com uma AUC de 0,93. Um corte de pontuação de > 6,5 (isto é, uma pontuação de > 7) tem uma sensitividade de 85 % e 83 % de especificidade para detectar PDs (Razão de probabilidade: 4,97).

[0338]Com referência à FIG. 7B, a utilidade do sistema de pontuação derivado matematicamente alterado para diferenciar entre SD e PD no conjunto independente (n=111 SD, n=48 PD) foi avaliada. A porcentagem corretamente chamada varia entre 70 a 90 % usando um corte de > 7. Para SD, 89 % de NETs foram corretamente previstos usando o corte de > 7 enquanto 67 % de PD foram corretamente previstos. As métricas de desempenho foram: sensitividade = 67 %, especificidade = 89 %, PPV = 73 % e NPV = 86 %. Consequentemente, os dados indicaram que uma pontuação MAARC-NET derivada matematicamente variando de 0 a 8 tem utilidade para discriminar entre controles e GEP-NETs.

[0339]Aplicação de Sistema de Pontuação e Desenvolvimento de um Nomograma para “NETEST 1” - para diferenciar entre controles e NETs, um corte de >3 tem uma sensitividade de 95 % e especificidade de 94 %. A sensitividade pode ser melhorada para 98 % usando um corte de >2. Para diferenciar entre SD e PD, um corte de >7 pode ser usado (sensitividade de 85 % e especificidade de 83 %). A sensitividade pode ser melhorada para 96 % usando um corte de >5.

[0340]As pontuações MAARC-NET derivadas matematicamente, portanto, variam de 0 a 2 (controle); 2 a 5 (SD); e 5 a 8 (PD). Estas pontuações podem ser convertidas para uma porcentagem como exibida na Tabela 4. TABELA 4: Porcentagem de Pontuação Derivada Matematicamente

[0341]Com referência à FIGURA 8, as porcentagens de pontuação da TABELA 4 podem ser exibidas dentro de um Nomograma representando “NETest 1’. O Nomograma NETest 1 demonstra como a pontuação derivada matematicamente alterada é obtida e como categoriza pacientes em classes diferentes de GEP-NEN (sem doença, doença estável ou doença progressiva).

[0342]Com referência à FIGURA 9, a utilidade do Nomograma NETest 1 foi avaliada. Valores para as predições corretas de SD e PD usando o Nomograma NETest 1 da FIGURA 8 são mostrados. Em geral, o Nomograma NETest 1 identificou 80 % de pacientes com SD como exibindo atividade de doença baixa ou moderada e 84 % de pacientes com PD como exibindo atividade de doença alta.

[0343] Aplicação de Sistema de Pontuação e Desenvolvimento de um Nomograma para “NETEST 2” - Pontuações NETest derivadas de MAARC-NET (0 a 8) em pacientes clinicamente definidos como doença estável ou progressiva (melhor julgamento clínico e/ou dados de imagem) foram examinados. A distribuição de frequência de pontuações para cada subtipo tanto no conjunto de teste (FIGURA 10A) quanto no conjunto independente (FIGURA 10B) demonstraram que pacientes com SD têm um valor de NETest médio de 4 e pacientes com PD variam de 7 a 8. Entretanto, pacientes com SD podem exibir pontuações derivadas de MAARC-NET >4 enquanto PD pode exibir pontuações <7.

[0344]Uma avaliação do grupo de paciente completo (conjunto de teste + conjunto independente) demonstrou que a pontuação SD de frequência mais alta foi 4 (30 % - FIGURA 11A), enquanto 46 % de PD tem uma pontuação de 8 (FIGURA 11A). Uma avaliação de probabilidade de risco identificou que pontuações NETest variando entre 0 a 5 foram associadas com SD com uma certeza >90 % (FIGURA 11B). Uma pontuação de 8 foi mais provavél para PD (> 90 %). Entretanto, pontuações de 6 e 7 podem não diferenciar corretamente SD versus PD.

[0345]Com base nestes resultados das FIGURAS 11A e 11B, o nomograma NETest 1 da FIGURA 8 pode ser atualizado para incluir valores de risco. O Nomograma NETest 2a da FIGURA 12 inclui o NETest com a inclusão de pontuação e categorizações de risco.

[0346]Para atualizar o nomograma NETest 2a de avaliação de risco, expressão de gene individual em SD e amostras PD pode ser avaliada. Os genes que foram mais diferencialmente expressados em amostras SD e PD foram identificados e usados em árvores de decisão para gerar as regras para definir se uma pontuação NETest foi SD ou PD. Esta abordagem fornece a base para NETest 2.

[0347]Uma pontuação NETest de 5 tem uma mudança > 90 % de identificar uma amostra SD (como mostrado nas FIGURAS 11 - 12). Comparações dos perfis de expressão de gene 51 individuais entre pacientes pontuados como 5 (SD versus PD) identificaram expressão de SMARCD3 e TPH1 como marcadores de diferenciação candidatos. Usando a regra: Se SMARCD3 <0,13 e TPH1 <4 assim chamada PD.

[0348]Isto permitiu uma precisão 100 % em definir doença progressiva.

[0349]Uma pontuação NETest de 6 tem uma mudança ~50 % de diferenciar SD de amostras PD. Análise de perfil de expressão de gene identificaram VMAT1 e PHF21A como candidatos. Uma análise ROC definiu as AUCs para cada um diferenciar PD de SD para ser: VMAT1: ROC = 0,835 PHF21A: ROC = 0,733

[0350]Usando a regra: Se VMAT1>0 e PHF21A<1,2 assim, SD Se VMAT1>0 e PHF21A^1,2 assim, PD

[0351]Isto permitiu uma precisão 100 % em definir doença progressiva e precisão 90 % em definir SD. A precisão global foi 93 %.

[0352]Uma pontuação NETest de 7 tem uma mudança ~50 % de diferenciar SD de amostras PD. Como para pontuações NETest de 6, análise de perfil de expressão de gene identificaram ambos VMAT1 e PHF21A como candidatos. Uma análise ROC definiu as AUCs para cada um diferenciar PD de SD para ser: VMAT1: ROC = 0,835 PHF21A: ROC = 0,733

[0353]Usando a regra: Se VMAT1>0 e PHF21A>1, assim SD Se VMAT1>0 e PHF21A<1, assim PD

[0354]Isto permitiu uma precisão 100 % para definir doença progressiva e precisão 95 % para SD. A precisão global foi 97,5 %.

[0355]Uma pontuação NETest de 8 tem uma mudança >90 % de identificar uma amostra como PD. Expressão de ZZZ3 foi identificada como um candidato. Uma análise ROC definiu a AUC para este gene para ser 1,0.

[0356]Usando a regra: Se ZZZ3<14, assim PD

[0357]Isto permitiu uma precisão 100 % para definir doença progressiva e diferenciar de SD.

[0358]Com referência à FIGURA 13, esta informação de expressão de gene individual foi usada para finalizar o nomograma “NETest 2”, que fornece um perfil de categorização de doença preciso para o paciente. A combinação de pontuações NETest e informação de expressão de gene individual usada no nomograma NETest 2 da FIGURA 13 é mais detalhada na Tabela 5. TABELA 5: Informação de Nomograma NETEST 2

[0359]Definindo Genes Clinicamente Relevantes - Para ainda refinar o sistema de pontuação, expressão de cluster de gene foi examinada e algoritmos foram desenvolvidos para capturar a informação. Clusters de Gene individuais incorporam informação biológica que pode aumentar os sistemas de pontuação MAARC-NET derivados matematicamente. Um foco pode ser determinado aos clusters de gene curados na literatura que são incluídos na Tabela 6. TABELA 6: Genes incluídos em cada Cluster

[0360]Com referência à FIGURA 14A, as Características de Neoplasia são ilustradas, incluindo a delineação de características derivadas de tumor (adenocarcinoma). Com referência à FIGURA 14B, as características NET com base nas classificações Hanahan e Weinberg são ilustradas.

[0361]Valores para os nove clusters representados na FIGURA 14 foram derivados de adição de gene. Além dos clusters de gene, dois algoritmos foram também avaliados: 1) o algoritmo “PDA”, que incluiu uma soma da proliferoma, signaloma, Secretoma II, Pluroma e Epigenoma (o algoritmo PDA também é referido como Diagnóstico Progressivo I); 2) o algoritmo “NDA”, que incluiu expressão de 15 genes associados com doença: estes incluíram ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, Ki67, NAP1L1, NOL3, GLT8D1, PLD3, PNMA2, VMAT2, TPH1, FZD7, MORF4L2 e ZFHX3 (o algoritmo NDA também é referido como Diagnóstico Progressivo II). Genes foram somados e um valor calculado foi derivado.

[0362]Antes de avaliar o valor dos nove clusters de gene e dois algoritmos em amostras de sangue, sua expressão em tecido tumoral NET foi avaliada para confirmar que estes foram relevantes para NET. Com referência às FIGURAS 15B e 15A, respectivamente, expressão em 22 NETs podem ser em comparação à expressão em mucosa normal (n=10). Avaliação identificou que sete dos nove clusters foram específicos para NETs (em comparação à mucosa normal). Em particular, expressão da signaloma, Metaboloma, Secretoma (I) e (II), Epigenoma, Apoptoma e SSTRoma foram elevadas em NETs (p<0,05). Genes na Apoptoma foram diminuídos em NETs, enquanto a proliferoma foi não diferente entre NETs e mucosa normal. Com respeito aos algoritmos, FIGURA 16 mostra que cada uma das PDA e NDA foram significantemente aumentadas (p < 0,05) em tecido tumoral NET em comparação à mucosa normal.

[0363]Depois disso, a expressão de cada um dos clusters foi avaliada em amostras de sangue. Examinamos o conjunto de teste (n=130) e avaliamos se a expressão foi relacionada a SD ou PD. Diferenças significantes foram observadas em expressão de gene entre controles e SD/PD, como mostradas nas FIGURA 17 e TABELA 7. TABELA 7: Clusters de Gene e Resultado Clínico ns = não significante Two-tailed Mann-Whitney U-test

[0364]Estes dados demonstram que clusters de gene podem ser usados para diferenciar SD e PD de controles assim como identificam diferenças entre SD e PD.

[0365]Com referência à FIGURA 18, resultados de cluster de gene foram examinados no conjunto independente (n=159), avaliando cada um dos clusters em SD vs PD. No conjunto independente, a proliferoma, secretoma (II), pluroma e epigenoma foram significantemente aumentadas.

[0366]Em seguida, as PDA e NDA foram avaliadas em cada um dos dois conjuntos de dados (conjunto independente e de testes). Com referência à FIGURA 19A, nenhuma diferença significante foi identificada entre SD e PD para qualquer um dos dois algoritmos no conjunto de teste. Com referência à FIGURA 19B, cada uma das PDA e NDA foram elevadas no conjunto independente.

[0367]Em seguida, cada um dos algoritmos foi incluído em um conjunto combinado (teste + independente: n = 222) e sua utilidade para predizer SD versus PD foi avaliada. Com referência à FIGURA 20A, tanto PDA quanto NDA foram elevadas em PD em comparação à SD nos conjuntos combinados. Com referência à FIGURA 20B, uma análise ROC identificou os seguintes parâmetros para PDA e NDA listadas na Tabela 8. TABELA 8: Parâmetros de Análise ROC, PDA e NDA em Conjunto Combinado

[0368]Dois algoritmos adicionais à base de diferenças de expressão de cluster de gene no teste (TDA) e conjunto independente (IDA) foram avaliados. TDA incluiu uma soma de clusters de gene significantemente diferentes entre SD e PD no conjunto de teste.

[0369]Estes incluíram TDA: Secretoma (I), Pluroma e SSTRoma (o algoritmo TDA também é referido como Diagnóstico Progressivo III); e

[0370]IDA: Proliferoma, Secretoma (II), Pluroma e Epigenoma (o algoritmo IDA também é referido como Diagnóstico Progressivo IV).

[0371]Cada um dos algoritmos no conjunto de teste e conjunto independente foram avaliados. Com referência à FIGURA 21A, TDA foi significantemente elevada em PD em comparação à SD no conjunto de teste. Com referência à FIGURA 21B, ambos algoritmos TDA e IDA foram significantemente elevados no conjunto independente.

[0372]Em seguida, uma análise ROC com ambos algoritmos no conjunto de dados combinados foi realizada. A análise ROC identificou os seguintes parâmetros para TDA e IDA listados na Tabela 9. TABELA 9: Parâmetros de Análise ROC, TDA e IDA em Conjunto Combinado

[0373]Curvas ROC geradas por algorítmo de TDA e IDA para diferenciar entre SD e PD são mostradas na FIGURA 22A. Curvas ROC geradas por algorítmo para cada um dos conjuntos para diferenciar entre SD e PD são mostradas na FIGURA 22B. As curvas ROC nas FIGURAS 22A e 22B demonstram que AUCs variam de 0,51 (signaloma GF) para 0,72 (Pluroma) para a diferenciação de SD e PD.

[0374]Consequentemente, expressão de cluster de gene individual e algoritmos que capturam esta informação contêm informação biologicamente relevante que se correlaciona com observações clínicas. Estes fornecem a base para definir sistemas de pontuação MAARC-NET clinicamente relevantes.

[0375]Demonstrações de Utilidade Clínica de Genes NETEST - A utilidade clínica de pontuações NETest, assim como as pontuações de clusters de gene e algoritmos pertinentes, será agora definida. Um exame de como a remoção cirúrgica de um NET alterou a assinatura de gene circulante foi realizada para demonstrar como o teste terá utilidade como uma medida da integralidade de terapia cirúrgica.

[0376]Parâmetros em 29 pacientes cirurgicamente tratados antes de cirurgia e >1 mês pós-cirurgia foram examinados. Como um grupo, pontuações MAARC- NET foram significantemente diminuídas (p<0,0001) de uma média de 6,58 ± 1,48 a 3,65 ± 1,6, como mostrado na FIGURA 23A. Cromogranina A (CgA), um gene usado em um ensaio biomarcador único anteriormente conhecido para NETs, não foi significantemente diminuída (58,5 ± 137,9 ng/ml vs. 55,25 ± 154,8), como mostrado na FIGURA 23B.

[0377]Um exame de como NETest 1 realizado, isto é, mudanças em terapia pré- e pós cirúrgica de pontuação NETest, é incluída na FIGURA 24. Antes de cirurgia, 62 % de pacientes foram incluídos na categoria de doença alta; depois de cirurgia este foi 0 % (%2 = 24, p=5x10 - 8).

[0378]Uma avaliação alternativa de como cirurgia afetou estado da doença é fornecida pelas mudanças de porcentagem em abordagens cirúrgicas - sem evidência de doença residual (R0) versus evidência de doença residual incluindo metastases. Com referência à FIGURA 25A, níveis para a pontuação MAARC-NET foram significantemente diminuídos (p<0,003) no grupo R0 (recessão completa) comparado ao grupo R1/R2 (recessão incompleta).

[0379]Para melhor definir o papel de cirurgia cada um dos quatro algoritmos foi examinado. Diminuições significantes foram identificadas (pós-cirurgia) em PDA (99,3 ± 21 vs. 41,1 ± 7,5, p<0,0001; FIGURA 26A), NDA (45,8 ± 10,3 vs. 29,6 ± 7,8, p<0,01; FIGURA 26B), TDA (133,3 ± 32,3 vs. 43,8 ± 9,3, p<0,0001; FIGURA 26C) e IDA (86,1 ± 19,3 vs. 34,1 ± 7,2, p<0,0001; FIGURA 26D).

[0380]Com referência à FIGURA 27, um exame de clusters individuais identificaram diminuições significantes na SSTRoma, proliferoma, signaloma GF, Metaboloma, Secretoma I/II e na Epigenoma pré- e pós-cirurgia.

[0381]Com referência à TABELA 10, remoção cirúrgica do tecido tumoral foi associada com diminuições em expressão de gene circulante à níveis não diferentes para ou abaixo de valores de corte ROC para SD para cada um dos quatro algoritmos e para 6 dos 9 clusters de gene. TABELA 10: Relacionamento Entre Excisão Cirúrgica, Clusters de Gene e Cada um dos Algoritmos

[0382]Todos os pacientes que sofreram cirurgia podem ser considerados como exibindo doença progressiva/ativa. Após cirurgia, as pontuações ou algoritmos foram indicativos de doença progressiva em 3 a 7 dos vinte e nove pacientes (10 a 24 %) dependendo do algoritmo usado.

[0383]Cirurgia reduziu significantemente a assinatura tumoral circulante e pode fornecer evidência para o grau de remoção tumoral assim como para evidência de doença residual ativa.

[0384]A utilidade clínica do teste, portanto, é definida pelo exame de pontuações, algoritmos e clusters e avaliação em comparação ao sangue pré- cirúrgico. Evidência de expressão elevada de, por exemplo, PDA ou proliferoma em amostras pós-cirúrgicas é indicativa de progressiva residual (doença altamente ativa).

[0385]Com referência à FIGURA 28, um Nomograma NETest 3 é ilustrado com a inclusão de algoritmos e clusters de gene cirurgicamente relevantes. Uma pontuação de combinação, assim como alterações em clusters de genes, por exemplo, um aumento significante na proliferoma, serão indicativas de recrescimento de doença após cirurgia. É de se notar, é que enquanto imagem pós- operatória identificou doença em n = 1 (10 %) dos pacientes R0, pontuações de gene elevadas foram evidentes em 6 (60 %) a 1 mês. Subsequentemente, dois indivíduos R0 desenvolveram imagem positiva em 6 meses.

[0386]Efeito de Terapias de Fármaco Padrão em Assinatura NET Circulante - A eficácia de uma terapia farmacológica padrão para NETs, somatostatina (usada para tratar >80 % de pacientes), foi avaliada na Assinatura NET circulante. Assinaturas foram avaliadas em pacientes tratados com um análogo de somatostatina que foram considerados como SD (n = 63) ou PD (n = 26) por imagem e julgamento clínico melhor. Aqueles pacientes que foram SD em análogo de somatostatinas foram considerados a ser pacientes tratados como estáveis, enquanto aqueles pacientes que foram PD em análogo de somatostatinas foram considerados como falha terapêutica.

[0387]Com referência à FIGURA 29A, pontuações MAARC-NET foram significantemente mais baixas no grupo SD do que aquelas da falha terapêutica: 3,33 ± 0,21 vs 5,77 ± 0,3 (p<0,001). Com referência à FIGURA 29B, Cromogranina A não foi significantemente diferente nos dois grupos (44,7 ± 17,2 ng/ml vs. 102,4 ± 58,7).

[0388]Uma avaliação dos algoritmos demonstrou diferenças significantes em cada um deles em SD em comparação com a PD. Especificamente, PDA (62,8 ± 11,4 vs. 153,9 ± 36,2, p<0,002; FIGURA 30A), NDA (6 ± 0,6 vs. 13,5 ± 3, p<0,03; FIGURA 30B), TDA (56,8 ± 7,4 vs. 154 ± 37,2, p<0,02; FIGURA 30C) e IDA (51,7 ± 11,1 vs. 140,5 ± 36, p<0,0005; FIGURA 30D).

[0389]Com referência à FIGURA 31, exame de clusters individuais identificou que a SSTRoma, proliferoma, Secretoma II, Pluroma e a Epigenoma foram significantemente mais baixas no grupo SD em relação ao grupo PD.

[0390]Estes dados demonstram que pacientes que exibiram doença progressiva apesar de terapia análoga de somatostatina (SSA) exibiram aumento na pontuação MAARC-NET, assim como cada um dos quatro algoritmos e clusters de gene específico incluindo um aumento em proliferação, assim como a Epigenoma. Um mecanismo para avaliar se o tratamento SSA é eficaz, portanto, é para avaliar se pontuações para estes parâmetros alteram. Entretanto, dada a sobreposição em cada um destes parâmetros entre os grupos SD e PD, seria útil definir melhor o grupo PD. Para fazer isto, a expressão pode ser em comparação com a da assinatura circulante naquela falha terapêutica àquelas em controles. As hipóteses atrás desta abordagem foi que uma terapia eficaz (isto é, SD) normalizaria as assinaturas. O corolário é que PD será significantemente diferente ao normal. Para estabelecer isto, análises ROC foram usadas para examinar transcrições circulantes normais e em comparação com a PD. Todos os quatro algoritmos foram examinados assim como os clusters de gene.

[0391]Com referência à FIGURA 32, análise dos dados identificou que algoritmos (FIGURA 32A) e clusters selecionados (FIGURA 32B) diferenciaram controles de PD tratados com SSAs. Dados para os clusters individuais são incluídos na Tabela 11. TABELA 11: Relacionamento entre Clusters de Gene e Cada um dos Algoritmos para Aqueles Falhando T Ferapia SSA e Controle

[0392]Com base nos dados na Tabela 11, NDA e TDA foram examinados assim como a SSTRoma, Proliferoma e Secretoma (I) nos casos SD para avaliar se estes parâmetros correlacionam com avaliações clínicas de eficácia terapêutica.

[0393]Uma avaliação de algoritmos individuais ou clusters de gene identificou que amostras seriam categorizadas como exibindo doença em 33 a 75 % de casos (FIGURA 33A). Em comparação com um melhor de pontuação 3 (56 %), uma combinação de elevações no resultado de SSTRoma e Proliferoma no número mais baixo de casos (28 %) previstos como exibindo doença progressiva (FIGURA 33B). Com referência à FIGURA 34, o Nomograma para pacientes tratados com análogo de somatostatina, nomeado “NETest 4”, portanto, inclui a pontuação MAARC-NET assim como a SSTRoma, proliferoma e sua combinação.

[0394]Utilidade de NETEST e Expressão de Gene para a Previsão de Eficácia de Análogo de Somatostatina - Para avaliar a utilidade do NETest em terapia, o relacionamento entre SSAs e resultados clinicamente definidos (por critérios RECIST) foram avaliados. Amostras foram coletadas tanto em pré-terapia quanto mensalmente em vinte e oito pacientes. Imageamento estava disponível para definir e categorizar padrões de doença pré- e durante terapia (até 12 meses de acompanhamento). Neste conjunto de amostra prospectivo, SSA resultou em uma redução significante no número de pacientes com doença progressiva (FIGURA 35A).

[0395]Pontuações também foram determinadas em amostras de sangue coletadas antes de, assim como mensalmente durante tratamento com SSA para avaliar se alterações iniciais foram predizíveis de resultado, isto é, resposta à terapia.

[0396]Com referência à FIGURA 35B, os resultados identificam que pontuações NETest elevadas (80 a 100 % de atividade) medidas a qualquer ponto de tempo durante terapia foram predizíveis de sensibilidade terapêutica. Com referência à FIGURA 36A, um aumento significante no NETest (80 a 100 %) ocorreu de 48 a 252 dias (média = 105 dias) antes da detecção de doença clinicamente significante (PD). O tempo médio para CgA foi 70 dias (faixa: 0 a 196 dias). O NETest foi mais informativo, ocorrendo em um tempo inicial (p=0,04), e em mais pacientes (atividade alta foi observada em 100 %) do que CgA (57 % exibiram >25 % de elevação, p=0,016).

[0397]Com referência à FIGURA 36B, a elevação em NETest (80 a 100 % de pontuação) ocorreu em um tempo significantemente mais cedo (94,5 dias) do que progressão da doença identificável pela imagem (241 dias) nos 14 pacientes (*p<0,0001, Chi2=19). Uma análise similar para CgA identificou que isto não foi diferente para avaliação à base de imagem (FIGURA 36B, 185,5 dias vs. 241 dias). Alterações de CgA ocorreram significantemente mais tarde do que o NETest (p=0,002, Chi2=13,6).

[0398]Utilidade de NETEST e Expressão de Gene para a Previsão de Recorrência de Doença - Utilidade de NETEST para avaliar a utilidade da recorrência de doença de NETest, o relacionamento entre o NETest e resultados clinicamente definidos (por critérios RECIST) foi avaliado em um estudo prospectivo de longo prazo. Amostras foram coletadas tanto em pré-terapia quanto em intervalos de até cinco anos em trinta e quatro pacientes. Imageamento estava disponível para definir e categorizar padrões de doença pré- e durante terapia (até 65 meses de acompanhamento).

[0399]Neste conjunto de amostra prospectiva, as pontuações NETest iniciais foram significantemente elevadas nos pacientes com PD (média: 75 %, faixa 53 a 94 %) comparado aos pacientes com SD (média: 26 %, faixa 7 a 94 %; p=0,01) (FIGURA 37A). Oito pacientes com SD tiveram níveis >40 %. Destes, 7 desenvolveram recorrênca de doença em uma média de 12,2 meses (faixa 3,6 a 57,7; FIGURA 37B). Com referência à FIGURA 37C, sete dos pacientes iniciais com SD (com pontuações NETest baixas) não desenvolveram doença recorrente. O tempo de acompanhamento médio foi 58 meses (faixa: 32 a 64).

[0400]Dezesseis eventos de doença progressiva foram identificados durante o tempo de curso. Cada um foi associado com NETest elevado (pontuações >80 %). Com referência à FIGURA 37D, o tempo médio de progressão para pacientes com pontuações elevadas foi 13,4 meses (faixa: 3,6 a 57).

[0401]Em geral, 23/24 eventos onde o NETest foi elevado foi associado com desenvolvimento de recorrência de doença em média ~13 meses. Sete de sete com pontuações consistentemente baixas foram livres de doença (até 5 anos). A precisão do teste foi 97 %.

[0402]Utilidade de Genes NET como Medida Substituta de Proliferação e Imageamento de Tumor - A utilidade de genes NETest assim como clusters de genes para funcionar como marcadores substitutos de parâmetros histopatológicos e imageamento foi avaliado. Um foco particular foi colocado no índice de Ki-67 (um marcador de proliferação de tumor) e em imageamento a base de somatostatina, por exemplo, 68Ga-PET. Isto foi realizado para demonstrar que o NETest e elementos deste poderia ter utilidade clínica como adjuntos para medidas clínicas padrão. Como um exemplo, medições de Ki-67 são à base de tecido e, portanto, são invasivas. Demonstrando que uma correlação derivada de sangue forneceria uma medida em tempo real de crescimento tumoral sem a necessidade de uma biópsia.

[0403]Estas análises foram conduzidas em dois conjuntos de dados separados: Conjunto de dados 1 (n = 28) e Conjunto de dados 2 (n = 22). Conjunto de dados 1 incluiu pacientes que foram coletados para intervenção terapêutica, isto é, terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo (PRRT). Conjunto de dados 2 incluiu pacientes que exibiram doença estável e foram submetidos a acompanhamento de rotina.

[0404]Um Substituto para o Índice de Ki-67: Análise de regressão multivariada não identificou qualquer correlação significante entre expressão de gene individual e o índice de Ki-67 (um marcador de proliferação tumoral) em qualquer dos dois grupos. Com referência às FIGURAS 38A e 38B, exame de expressão de receptor de somatostatina identificou correlações significantes (R=0,9, p=2x10 - 8) com Ki-67 em cada um dos grupos tumorais.

[0405]Um exame de todos os genes no NETest identificou correlações significantemente mais altas com Ki-67 (R=0,93 - 98, p=10-9 - 10-13, FIGURA 38C-E). O único gene mais informativo foi SSTR4 (FIGURA 38D-F). Estes dados demonstraram primeiramente, que o NETest como um todo pode ser usado como uma biópsia líquida para determinar o índice proliferativo do tumor, isto é, fornece um marcador substituto para uma medição histopatológica à base de tecido. Em segundo lugar, expressão de genes receptores de somatostatina circulantes também pode ser usada como uma medida de proliferação tumoral.

[0406]Algoritmo de Proliferoma + SSTRoma também é referido como Diagnóstico Progressivo V; o algoritmo de genes altamente relevantes (KRAS, SSTR4 e VPS13C) também é referido como Diagnóstico Progressivo VI; o algoritmo de genes + SSTRoma altamente relevante também é referido como Diagnóstico Progressivo VII.

[0407]Com referência à FIGURA 39, correlações (regressão linear) entre clusters de gene (SSTRoma e proliferoma) ou cada um dos algoritmos e o índice de Ki-67, são mostrados. Exame de clusters de gene individuais confirmou que a SSTRoma e Proliferoma se correlacionam com o índice de Ki-67 (R=0,16 a 0,25, p<0,05, FIGURA 39A, C). Análise dos algoritmos identificou que os algoritmos NDA e TDA foram altamente correlacionados com o índice de Ki-67 (R=0,34 a 0,42, p<0,002, FIGURA 39B, F) enquanto que a PDA e IDA foram bem menos correlacionadas (R=0,14 a 0,17, p=0,06, FIGURA 39D, E). Estes resultados demonstraram que clusters de gene e algoritmos incluindo informação tumoral biologicamente relevante, por exemplo, SSTRoma pode ser utilizada como uma medida de proliferação de tecido tumoral.

[0408]Relacionamento com Imageamento à Base de Somatostatina: Em seguida foi examinado se genes no teste correlaciodo com duas variáveis de imageamento à base de somatostatina, o SUVbmax (captação tumoral - uma medida de densidade do receptor/disponibilidade do alvo) e o MTV (volume tumoral molecular - uma medida da carga tumoral). Análise de regressão multivariada não identifica qualquer gene único para correlacionar com o SUVmax. Entretanto, tanto a SSTRoma quanto os genes NETest como um grupo foram bem correlaciodos com o SUVmax. Correlações em ambos grupos variam entre R=0,88 a 0,94 (p < 10 a 7) para a SSTRoma (FIGURA 40A-B) e R=0,97 a 0,98, p<10-13 para conjunto de gene NET (FIGURA 40C-D).

[0409]Análise de regressão multivariada identificou ZFHX3 como um marcador de MTV no Grupo 1 (R=0,98, FIGURA 41A) enquanto que TPH1 foi correlacionado com MTV no Grupo 2 (R=0,76, FIGURA 41B).

[0410]Similarmente ao SUVmax, tanto a SSTRoma quanto os genes NETest como um grupo foram bem correlacionados com o MTV. Correlações em ambos grupos variaram entre R=0,72 a 0,77 (p<10 - 4) para a SSTRoma (FIGURA 41C-E) e R=0,91 a 0,95, p<10- 12 para o conjunto de gene NET (FIGURA 41D-F).

[0411]Estes dados demonstram que genes no NETest correlacionam e podem ser usados para estimar tanto a disponibilidade do alvo para terapias à base de análogo de somatostatina quanto fornecer uma medida da carga tumoral. Ambos estes aspectos são críticos para dirigir a terapia assim como medir a eficácia de terapia.

[0412]ZFHX3 como um Marcador para Avaliação de Doença: A identificação de ZFHX3 como o melhor marcador para MTV, como mostrado na FIGURA 41A, sugere que expressão deste gene pode ter utilidade clínica como uma medida de carga tumoral e mudanças deste. ZFHX3 é uma proteína de zinc finger envolvida na regulação de diferenciação neuronal através do controle de apreensão de ciclo celular. Perda de expressão ZFHX3 com uma perda subsequente de apreensão de ciclo celular, portanto é relacionada a proliferação tumoral e o desenvolvimento de novas lesões e/ou progressão de doença.

[0413]Foi examinado se medições de ZFHX3 podem fornecer um rótulo de novo crescimento/progressão em NETs e se que alteração em ZFHX3 pode refletir resposta à terapia ou falha terapêutica (progressão). Expressão deste gene foi inicialmente avaliada em pacientes que tiveram evidência de novas lesões.

[0414]Com referência à FIGURA 42A, pacientes que desenvolveram novas lesões (identificadas por imagem) expressaram significantemente ZFHX3 diminuídos. Com referência à FIGURA 42B, àqueles pacientes que foram determinados como SD também têm níveis significantemente mais altos do que aqueles que foram progressivos. Além disso, com referência à FIGURA 42C, expressão do gene foi aumentada após cirurgia.

[0415]Com referência à FIGURA 43, acompanhamento a longo prazo (> 3 anos) em um grupo identificou que pacientes que permaneceram estáveis não exibiram mudanças em expressão ZFHX3 durante este período de tempo, enquanto pacientes que desenvolveram doença progressiva tinham níveis de expressão significantemente mais baixos.

[0416]Estes dados demonstraram que expressão ZFHX3 correlaciona com o desenvolvimento de novas lesões e uma diminuição em expressão pode ser usada para definir progressão da doença.

[0417]Utilidade de NETEST e Expressão de Gene para a Previsão de Eficácia Terapêutica - Para ainda avaliar a utilidade do NETest em terapia, o relacionamento entre PRRT e resultados clinicamente definidos (por critérios RECIST) foram avaliados. Amostras foram coletadas tanto pré-terapia quanto o acompanhamento em cinquenta e quatro pacientes. Imageamento estava disponível para dirigir e categorizar padrões de doença pré- e pós-terapia (de 3 e 6 meses de acompanhamento).

[0418]Neste conjunto de amostra prospectiva, radioterapia resultou significantemente em uma redução no número de pacientes com doença progressiva (FIGURA 44A). Pacientes que não responderam à terapia, isto é, categorizadas como doença progressiva em 6 meses de período de acompanhamento exibiram um aumento na pontuação NETest. A pontuação foi significantemente reduzida em pacientes com SD neste ponto de tempo (FIGURA 44B). Nenhuma alteração significante foi observada por CgA (FIGURA 44C). Alterações em NETest acompanharam mudanças em resposta terapêutica (FIGURA 45). As métricas para biomarcadores e resultados identificaram que o NETest tem uma precisão de 89 %, sensitividade de 75 %, especificidade de 100 %, PPV de 100 % e NPV de 83 % (FIGURA 46A). Com referência à FIGURA 46B, CgA tem uma precisão de 24 %, sensitividade de 17 %, especificidade de 40 %, PPV de 40 % e NPV 17 %. O NETest superou significantemente CgA (Qui-Quadrado = 27,4; p=1,2x10 - 7).

[0419]Pontuações NETest de pré-tratamento assim como classificação foram disponíveis e usadas para identificar se uma combinação de expressão de gene e parâmetros clínicos foram predizíveis de resultado, isto é, resposta à terapia.

[0420]Com referência à FIGURA 47A, um subconjunto foi de níveis de expressão de gene NETest significantemente diferentes entre respondedores e não- respondedores antes de terapia. Estes incluíram genes ligados à sinalização fator de crescimento (signaloma GF: ARAF1, BRAF, KRAS e RAF1) assim como genes ligados ao metabolismo (incluindo ATP6V1H, OAZ2, PANK2, PLD3). Especificamente, respondedores de PRRT exibiram sinalização de fator de crescimento significantemente elevada (9,4 ± 1,3 vs. 5,3 ± 0,7, p=0,05) e expressão de gene metabolomica significantemente elevada (4,37 vs. 2,3 ± 0,6, p=0,03) antes de PRRT. Uma integração dos dois “conjuntos” (signaloma GF + Metaboloma) em um “Índice Biológico” através da soma de expressão de gene permitiu previsão de respondedores de PRRT futuros de não-respondedores. Um corte de 5,9 (expressão de gene normalizada) exibiram >85 % de especificidade para prognosticar resposta (>5,9 de respondedores de PRRT previsto) e resultado em uma AUC de 0,74 ± 0,08 (estatística z =2,915, p=0,0036) (FIGURA 47B).

[0421]Nenhum parâmetro clínico foi predizível de resposta PRRT exceto grau tumoral. Tumores de baixo grau responderam (77 %) à terapia enquanto que ~50 % de lesões de grau alto foram associados com resposta. Classificação sozinha foi única 65 % de precisão (p=0,1). Em contraste, um “Quociente de Previsão” que compreendia a combinação do Índice Biológico (“signaloma GF” + “Metaboloma”) e o grau tumoral foi significantemente (92 %) mais preciso. O Quociente de Previsão teve uma AUC significantemente melhor (0,90 ± 0,07) do que grau histológico sozinho para prognosticar resposta ao tratamento (AUC=0,66, diferença entre áreas 0,23, estatística z 2,25, p=0,024) (FIGURA 47C).

[0422]O Quociente de Previsão também foi clinicamente útil. Pacientes podem ser segregados em grupos Grau Baixo/Ome Alto e Grau Alto/Ome Baixo. O último teve um PFS significantemente mais baixo (17 meses) do que o grupo grau baixo/Ome alto (PFS não atingido, classificação de Log: 26,8; p<0,0001: FIGURA 47D). A Razão Hazard foi 53,3.

[0423]Estes resultados demonstraram que alterações em correlação de pontuação com resposta ao tratamento e que medições de transcrição NET circulante antes de terapia são predizíveis de resultado ao PRRT.

Claims (14)

1. Método para detectar um neoplasma neuroendócrino gastroenteropancreá- tico (GEP-NEN) em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar os níveis de expressão de pelo menos 22 biomarcadores e de um gene housekeeping, ALG9, de uma amostra de teste a partir do indivíduo colocando a amostra de teste em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão dos pelo menos 22 biomarcadores e o gene housekeeping, ALG9, em que os pelo menos 22 biomarcadores compreendem APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/VMAT2, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3; normalizar os níveis de expressão de APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/VMAT2, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3 para o nível de expressão de ALG9 para obter níveis de expressão normalizados; classificar o risco da amostra de teste com relação à presença ou desenvolvimento de um GEP-NEN usando os níveis de expressão normalizados em um sistema de classificação, em que o sistema de classificação é um sistema de aprendizado de máquina que compreende quatro algoritmos diferentes: Máquina de Vetor de Suporte, Análise de Discriminação Linear, K-vizinho mais próximo e Naive Bayes; atribuir uma pontuação de Classificação de Risco Multi-analito para NETs (MAARC-NET) com base em um resultado de cada um dos quatro algoritmos diferentes; comparar a pontuação MAARC-NET com um valor de corte pré-determinado; e determinar a presença de um GEP-NEN no indivíduo quando a pontuação MAARC-NET é igual a ou maior que o valor de corte pré-determinado ou determinar a ausência de um GEP-NEN no indivíduo quando a pontuação MAARC-NET está abaixo do valor de corte pré-determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 2 em uma escala do sistema de pontuação MAARC-NET de 0 a 8, ou 0% em uma escala de 0 a 100%.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende: (a) determinar a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo quando a pontuação MAARC-NET é igual a ou mais alta do que o valor de corte pré-determinado, em que o valor de corte pré-determinado é 5 em uma escala de 0 a 8, ou menor do que 55% em uma escala de 0 a 100%; (b) identificar um nível de risco para o indivíduo desenvolver um GEP-NEN progressivo compreendendo: identificar um nível baixo de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo quando a pontuação MAARC-NET é menor do que um valor de corte pré-determinado de 5 em uma escala de 0 a 8, ou menor do que 55% em uma escala de 0 a 100%; identificar um nível intermediário de risco para desenvolver um GEP-NEN pro-gressivo quando a pontuação MAARC-NET é igual a ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 5 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 7 em uma escala de 0 a 8, ou igual a ou maior do que 55% e menor do que 75% em uma escala de 0 a 100%; ou identificar um nível alto de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo quando a pontuação MAARC-NET é igual ao ou maior do que um valor de corte pré- determinado de 7 em uma escala de 0 a 8, ou igual a ou maior do que 75% em uma escala de 0 a 100%.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o biomarcador é RNA, cDNA ou proteína, de preferência, em que o biomarcador: (a) é RNA, o RNA é transcrito reversamente para produzir cDNA, e o nível de expressão de cDNA produzido é detectado; (b) é proteína, a proteína detectada formando um complexo entre a proteína e um anticorpo marcado, de preferência, em que quando a marcação é uma marcação fluorescente; ou (c) é RNA ou cDNA, o RNA ou cDNA detectado formando um complexo entre o RNA ou cDNA e uma sonda ou iniciador de ácido nucleico marcado, de preferência, (i) a marcação é uma marcação fluorescente; ou (ii) o complexo entre o RNA ou cDNA e a sonda ou iniciador de ácido nucleico marcado é um complexo de hibridização.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão do biomarcador é detectado formando um complexo entre o biomarcador e uma sonda ou iniciador marcado.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de teste é sangue, soro, plasma ou tecido neoplástico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda tratar um indivíduo identificado como: (a) tendo um nível intermediário ou nível alto de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo com cirurgia ou terapia medicamentosa; ou (b) tendo um nível baixo de risco para desenvolver um GEP-NEN progressivo com monitoramento durante pelo menos um período de seis meses.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que um indivíduo em necessidade do mesmo é um indivíduo diagnosticado com um GEP-NEN, um indivíduo tendo pelo menos um sintoma de GEP-NEN ou um indivíduo que tem uma pré-disposição ou histórico familiar para desenvolver um GEP-NEN.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

9. Método para diferenciar GEP-NEN estável de um GEP-NEN progressivo em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: determinar que a pontuação da amostra de teste do indivíduo é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 5 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 6, conforme o método como definido na reivindicação 1; detectar níveis de expressão de SMARCD3 e TPH1 da amostra de teste colocando a amostra de teste em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de SMARCD3 e a expressão de TPH1; normalizar os níveis de expressão de SMARCD3 e TPH1 na amostra de teste para o nível de expressão de ALG9 para obter níveis de expressão normalizados de SMARCD3 e TPH1; atribuir uma segunda pontuação com base no nível de expressão normalizado de SMARCD3; atribuir uma terceira pontuação com base no nível de expressão normalizado de TPH1; comparar a segunda pontuação e a terceira pontuação com um segundo e um terceiro valor de corte pré-determinado, respectivamente; e determinar a presença de um GEP-NEN estável no indivíduo, quando a segunda pontuação é maior do que o segundo valor de corte pré- determinado e a terceira pontuação é igual ao ou maior do que o terceiro valor de corte pré-determinado, ou determinar a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo, quando a segunda pontuação é igual ao ou menor do que o segundo valor de corte pré-determinado e a terceira pontuação é menor do que o terceiro valor de corte pré-determinado, em que o segundo valor de corte pré-determinado é 1,3 em uma escala de 0 a 8, e em que o terceiro valor de corte pré-determinado é 4 em uma escala de 0 a 8, de preferência, em que o segundo valor de corte pré-determinado de 1,3 corresponde a 12% em uma escala de 0 a 100% e em que o terceiro valor de corte pré-determinado de 4 corresponde a 41% em uma escala de 0 a 100%; (b) determinar que a pontuação da amostra de teste do indivíduo é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 6 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 7, conforme o método como definido na reivindicação 1; detectar níveis de expressão de VMAT1 e PHF21A da amostra de teste colocando a amostra de teste em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de VMAT1 e a expressão de PHF21A, normalizar os níveis de expressão de VMAT1 e PHF21A na amostra de teste para o nível de expressão ALG9 para obter níveis de expressão normalizados de VMAT1 e PHF21A; atribuir uma segunda pontuação com base no nível de expressão normalizado de VMAT1; atribuir uma terceira pontuação com base no nível de expressão normalizado de PHF21A; comparar a segunda pontuação e a terceira pontuação com um segundo e um terceiro valor de corte pré-determinado, respectivamente; e determinar a presença de um GEP-NEN estável no indivíduo, quando a segunda pontuação é igual ao ou maior do que o segundo valor de corte pré-determinado e a terceira pontuação é menor do que o terceiro valor de corte pré-determinado, ou determinar a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo, quando a segunda pontuação é igual ao ou maior do que o segundo valor de corte pré-determinado e a terceira pontuação é igual ao ou maior do que o terceiro valor de corte pré-determinado, em que o segundo valor de corte pré-determinado é 0 em uma escala de 0 a 8, e em que o terceiro valor de corte pré-determinado é 1,2 em uma escala de 0 a 8; de preferência, em que o segundo valor de corte pré-determinado de 0 corresponde a 0% em uma escala de 0 a 100%, e em que o terceiro valor de corte pré-determinado de 1,2 corresponde a 8% em uma escala de 0 a 100%; (c) determinar que a pontuação da amostra de teste do indivíduo é igual ao ou maior do que um valor de corte pré-determinado de 7 e menor do que um valor de corte pré-determinado de 8, conforme o método como definido na reivindicação 1; detectar níveis de expressão de VMAT1 e PHF21A da amostra de teste colocando a amostra de teste em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de VMAT1 e a expressão de PHF21A, normalizar os níveis de expressão de VMAT1 e PHF21A na amostra de teste para o nível de expressão ALG9 para obter níveis de expressão normalizados de VMAT1 e PHF21A; atribuir uma segunda pontuação com base no nível de expressão normalizado de VMAT1; atribuir uma terceira pontuação com base no nível de expressão normalizado de PHF21A; comparar a segunda pontuação e a terceira pontuação com um segundo e um terceiro valor de corte pré-determinado, respectivamente; e determinar a presença de um GEP-NEN estável no indivíduo, quando a segunda pontuação é igual ao ou maior do que o segundo valor de corte pré-determinado e a terceira pontuação é maior do que o terceiro valor de corte pré-determinado, ou determinar a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo, quando a segunda pontuação é igual ao ou maior do que o segundo valor de corte pré-determinado e a terceira pontuação é igual ao ou menor do que o terceiro valor de corte pré-determinado, em que o segundo valor de corte pré-determinado é 0 em uma escala de 0 a 8, e em que o terceiro valor de corte pré-determinado é 1 em uma escala de 0 a 8; de preferência, em que o segundo valor de corte pré-determinado de 0 corresponde a 0% em uma escala de 0 a 100% e em que o terceiro valor de corte pré-determinado de 1 corresponde a 7% em uma escala de 0 a 100 %; ou (d) determinar que a pontuação da amostra de teste do indivíduo é igual a um valor de corte pré-determinado de 8, conforme o método definido na reivindicação 1; detectar um nível de expressão de ZZZ3 da amostra de teste colocando a amostra de teste em contato com pelo menos um agente específico para detectar a expressão de ZZZ3, normalizar o nível de expressão de ZZZ3 para o nível de expressão de ALG9 para obter um nível de expressão normalizado de ZZZ3; atribuir uma segunda pontuação com base no nível de expressão normalizado de ZZZ3; comparar a segunda pontuação com um valor de corte pré-determinado de 1 em uma escala de 0 a 8; e determinar a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo, quando a segunda pontuação é igual ao ou menor do que o valor de corte pré- determinado, de preferência, em que o valor de corte pré-determinado de 1 corresponde a 18% em uma escala de 0 a 100%.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende: (a) determinar o nível de expressão de cada um dos 16 biomarcadores de uma amostra de teste do indivíduo e de uma amostra de referência colocando a amostra de teste e a amostra de referência em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 16 biomarcadores, em que os 16 biomarcadores compreendem Ki67, NAP1L1, NOL3, TECPR2, ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, PQBP1, TPH1, COMMD9, MORF4L2, RNF41, RSF1, SMARCD3 e ZFHX3; somar o nível de expressão de cada um dos 16 biomarcadores na amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo I, e somar o nível de expressão de cada um dos 16 biomarcadores na amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo I, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo I comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo I indica a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo; (b) determinar o nível de expressão de cada um dos 15 biomarcadores a partir de uma amostra de teste do indivíduo e uma amostra de referência colocando a amostra de teste e a amostra de referência em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 15 biomarcadores, em que os 15 biomarcadores compreendem ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, Ki67, NAP1L1, NOL3, GLT8D1, PLD3, PNMA2, VMAT2, TPH1, FZD7, MORF4L2 e ZFHX3; calcular a média do nível de expressão de cada um dos 15 biomarcadores na amostra de teste para gerar um valor de teste de diagnóstico progressivo II, e calcular a média do nível de expressão de cada um dos 15 biomarcadores na amostra de referência para gerar um valor de referência de diagnóstico progressivo II, em que um valor aumentado do valor de teste de diagnóstico progressivo II comparado ao valor de referência de diagnóstico progressivo II indica a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo; (c) determinar o nível de expressão de cada um dos 7 biomarcadores de uma amostra de teste do indivíduo e uma amostra de referência colocando a amostra de teste e a amostra de referência em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a quantidade de cada um dos 7 biomarcadores, em que os 7 bio- marcadores compreendem PNMA2, VMAT2, COMMD9, SSTR1, SSTR3, SSTR4 e SSTR5; somar o nível de expressão de cada um dos 7 biomarcadores na amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo III, e somar o nível de expressão de cada um dos 7 biomarcadores na amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo III, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo III comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo III indica a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo; ou (d) determinar o nível de expressão de cada um dos 11 biomarcadores de uma amostra de teste do indivíduo e uma amostra de referência colocando a amostra de teste e a amostra de referência em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a quantidade de cada um dos 11 biomarcadores, em que os 11 biomarcadores compreendem Ki67, NAP1L1, NOL3, TECPR2, PQBP1, TPH1, MORF4L2, RNF41, RSF1, SMARCD3 e ZFHX3; somar o nível de expressão de cada um dos 11 biomarcadores na amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo IV, e somar o nível de expressão de cada um dos 11 biomarcadores na amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo IV, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo IV comparado ao valor de referência total de diagnóstico progressivo IV indica a presença de um GEP-NEN progressivo no indivíduo.

11. Método para determinar uma resposta a uma terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo (PRRT) de um GEP-NEN em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (I) determinar o nível de expressão de cada um dos 8 biomarcadores e de um gene housekeeping, ALG9, de uma amostra de teste do indivíduo colocando a amostra de teste em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 8 biomarcadores e um gene housekeeping, ALG9, em que os 8 biomarcadores compreendem ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, ATP6V1H, OAZ2, PANK2 e PLD3; normalizar os níveis de expressão de ARAF1, BRAF, KRAS, RAF1, ATP6V1H, OAZ2, PANK2 e PLD3 para o nível de expressão de ALG9 para obter níveis de expressão normalizados; classificar o risco da amostra de teste usando os níveis de expressão normalizados em um sistema de classificação, em que o sistema de classificação é um sistema de aprendizado de máquina que compreende quatro algoritmos diferentes: Máquina de Vetor de Suporte, Análise de Discriminação Linear, K-Vizinho Mais Próximo e Naive Bayes; e atribuir uma pontuação de Classificação de Risco Multi-analito para NETs (MAARC-NET) com base em um resultado de cada um dos quatro algoritmos diferentes; comparar a pontuação com um valor de corte pré-determinado de 5,9 em uma escala de 0 a 8; e determinar a presença de um GEP-NEN responsivo à PRRT no indivíduo, quando a pontuação é maior do que o valor de corte pré-determinado.

12. Método para determinar uma resposta a uma terapia com radionucleotídeo para receptor de peptídeo (PRRT) de um GEP-NEN em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) após um primeiro ciclo da terapia PRRT: determinar os níveis de expressão de pelo menos 22 biomarcadores e o gene housekeeping, ALG9, de uma amostra de teste de primeiro ciclo do indivíduo colocando a amostra de teste de primeiro ciclo em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão dos pelo menos 22 biomarcadores e o gene housekeeping, ALG9, em que os 22 biomarcadores compreendem APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/VMAT2, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3; normalizar os níveis de expressão de APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/ VMAT2, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3 na amostra de teste de primeiro ciclo para o nível de expressão de ALG9 na amostra de teste de primeiro ciclo; (b) após um segundo ciclo de terapia PRRT: determinar os níveis de expressão de pelo menos 22 biomarcadores e o gene de housekeeping, ALG9, a partir de uma amostra de teste de segundo ciclo do indivíduo colocando a amostra de teste de segundo ciclo em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão dos pelo menos 22 biomarcadores e o gene housekeeping, ALG9, em que os 22 biomarcadores compreendem APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/VMAT2, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3; normalizar os níveis de expressão de APLP2, ARAF, CD59, CTGF, FZD7, KRAS, MKI67/KI67, MORF4L2, NAP1L1, NOL3, PNMA2, RAF1, RSF1, SLC18A2/ VMAT2, SPATA7, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TPH1, TRMT112 e ZFHX3 na amostra de teste do segundo ciclo para o nível de expressão de ALG9 na amostra de teste do segundo ciclo; (c) determinar uma razão de mudança dos níveis de expressão normalizados de (a) para os níveis de expressão normalizados de (b); e (d) determinar a presença de um GEP-NEN responsivo a PRRT quando a razão de mudança é maior do que um valor de corte de terapia pré-PRRT de 1 em uma escala de 0 a 8.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: determinar um primeiro nível de expressão de ZFHX3 de uma primeira amostra de teste coletada do indivíduo em um primeiro ponto no tempo colocando a primeira amostra de teste em contato com um agente específico para detectar a expressão de ZFHX3; determinar um segundo nível de expressão de ZFHX3 de uma segunda amostra de teste coletada do indivíduo em um segundo ponto no tempo colocando a segunda amostra de teste com contato com um agente específico para detectar a expressão de ZFHX3, em que o segundo ponto no tempo é posterior ao primeiro ponto no tempo; comparar o primeiro nível de expressão com o segundo nível de expressão; e determinar que o GEP-NEN no indivíduo é progressivo quando o segundo nível de expressão é significativamente menor do que o primeiro nível de expressão.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que (b) compreende ainda: determinar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores de uma amostra de teste do indivíduo e uma amostra de referência, colocando a amostra de teste e a amostra de referência em contato com uma pluralidade de agentes específicos para detectar a expressão de cada um dos 3 biomarcadores, em que os 3 biomarcadores compreendem SSTR1, SSTR2 e SSTR5; somar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores na amostra de teste para gerar um valor de teste total de diagnóstico progressivo VII, e somar o nível de expressão de cada um dos 3 biomarcadores na amostra de referência para gerar um valor de referência total de diagnóstico progressivo VII, em que um valor aumentado do valor de teste total de diagnóstico progressivo VII em comparação com o valor de referência total de diagnóstico progressivo VII indica a presença de proliferação tumoral de um GEP-NEN no indivíduo.