BR112017005141B1

BR112017005141B1 - APTAMERS FOR PURIFICATION AND QUANTIFICATION OF GELSOLINE AND ITS VARIANTS

Info

Publication number: BR112017005141B1
Application number: BR112017005141-9A
Authority: BR
Inventors: Ashish; Renu GARG; Nagesh PEDDADA
Original assignee: Council Of Scientific & Industrial Research
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2015-10-05
Publication date: 2023-07-25

Abstract

APTÂMEROS PARA PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE GELSOLINA E SUAS VARIANTES, a presente invenção refere-se a novos aptâmeros de DNA que podem ligar-se forte e especificamente à gelsolina. A presente invenção refere-se ainda à utilização destes aptâmeros para estimar os níveis de gelsolina em uma determinada amostra e purificar grandes quantidades de gelsolina sem marcação e suas variantes. A presente invenção elimina, portanto, o uso de diferentes animais/seus tecidos para a produção de proteínas de ligação à gelsolina, que são métodos muito mais caros e socialmente inaceitáveis, em oposição à síntese de uma molécula de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) in vitro. Por meio do uso desta estratégia, a produção em massa da matriz de ligação à gelsolina pode ser realizada a um custo muito mais baixo. Além disso, os aptâmeros podem ser utilizados para bloquear a ligação da gelsolina aos seus parceiros de ligação, para aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas.APTAMERS FOR PURIFICATION AND QUANTIFICATION OF GELSOLIN AND ITS VARIANTS, the present invention relates to new DNA aptamers that can bind strongly and specifically to gelsolin. The present invention further relates to the use of these aptamers to estimate gelsolin levels in a given sample and purify large quantities of unlabeled gelsolin and its variants. The present invention therefore eliminates the use of different animals/their tissues for the production of gelsolin binding proteins, which are much more expensive and socially unacceptable methods, as opposed to the synthesis of a DNA molecule by polymerase chain reaction. (PCR) in vitro. Through the use of this strategy, mass production of the gelsolin binding matrix can be accomplished at a much lower cost. Furthermore, aptamers can be used to block the binding of gelsolin to its binding partners for diagnostic and/or therapeutic applications.

Description

FIELD OF THE INVENTION:

[001] A presente invenção refere-se a novos aptâmeros de DNA que podem ligar-se, especificamente, à gelsolina com alta afinidade, e ao uso desta propriedade destes aptâmeros para estimar os níveis de gelsolina em uma determinada amostra e purificar grandes quantidades de gelsolina sem marcação e suas variantes. Atualmente, a estimativa de níveis de gelsolina em uma amostra utiliza actina como uma proteína de ligação à gelsolina ou anticorpos anti-gelsolina. A actina é extraída principalmente do tecido muscular de coelho ou de galinha. Similarmente, a produção de anticorpos também envolve a cultura de células de mamíferos ou o uso de animais, incluindo coelho, rato, cabra, lhama, cavalo, galinha, etc.. Portanto, a presente invenção busca diagnosticar e purificar os níveis plasmáticos de gelsolina, por meio do uso de pequenas moléculas de DNA, eliminando, assim, a utilização de diferentes animais/seus tecidos, para a produção de proteínas de ligação à gelsolina, que são métodos muito mais caros e socialmente inaceitáveis, em oposição à síntese de uma molécula de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) in vitro. Estes aptâmeros podem ser quimicamente sintetizados e/ou bioquimicamente gerados, por meio do uso de reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou produzidos por bactérias, por meio do emprego de protocolos e ferramentas simples de biologia molecular. Por meio do uso desta estratégia, a produção em massa da matriz de ligação à gelsolina pode ser realizada a um custo muito mais baixo.[001] The present invention relates to new DNA aptamers that can specifically bind to gelsolin with high affinity, and to the use of this property of these aptamers to estimate gelsolin levels in a given sample and purify large amounts of unmarked gelsolin and its variants. Currently, estimation of gelsolin levels in a sample uses actin as a gelsolin-binding protein or anti-gelsolin antibodies. Actin is mainly extracted from rabbit or chicken muscle tissue. Similarly, the production of antibodies also involves the culture of mammalian cells or the use of animals, including rabbit, rat, goat, llama, horse, chicken, etc. Therefore, the present invention seeks to diagnose and purify plasma levels of gelsolin , through the use of small DNA molecules, thus eliminating the use of different animals/their tissues, for the production of gelsolin-binding proteins, which are much more expensive and socially unacceptable methods, as opposed to the synthesis of a DNA molecule by polymerase chain reaction (PCR) in vitro. These aptamers can be chemically synthesized and/or biochemically generated, through the use of polymerase chain reaction (PCR) and/or produced by bacteria, through the use of simple molecular biology protocols and tools. Through the use of this strategy, mass production of the gelsolin binding matrix can be accomplished at a much lower cost.

BASICS OF THE INVENTION AND DESCRIPTION OF THE PRIOR ART:

[002] A gelsolina é uma proteína multifuncional reguladora da agregação dos filamentos de actina de seis domínios (G1-G6). Existe como três isoformas em seres humanos, que incluem duas isoformas citoplasmáticas e uma isoforma extracelular secretada no plasma. Todas estas isoformas são codificadas por um único gene localizado no cromossoma 9 em seres humanos. As principais funções da gelsolina citoplasmática envolve a despolimerização da actina, bem como a nucleação regulada principalmente pelo cálcio, pH e fosfoinositídeos (Ashish e outros, 2007; Garg e outros, 2011; Peddada e outros, 2013). Para iniciar a polimerização, a gelsolina liga-se a dois monômeros globulares de actina (G-actina) e para afetar a função de despolimerização da actina, a gelsolina liga-se à actina filamentosa (actina F), corta o filamento por meio do enfraquecimento das ligações não covalentes entre os monômeros de actina e permanece ligada à extremidade farpada do filamento como um tampão, para evitar subsequente alongamento (Yin & Stull, 1999).[002] Gelsolin is a multifunctional protein that regulates the aggregation of six-domain actin filaments (G1-G6). It exists as three isoforms in humans, which include two cytoplasmic isoforms and one extracellular isoform secreted into plasma. All of these isoforms are encoded by a single gene located on chromosome 9 in humans. The main functions of cytoplasmic gelsolin involve actin depolymerization as well as nucleation regulated mainly by calcium, pH and phosphoinositides (Ashish et al., 2007; Garg et al., 2011; Peddada et al., 2013). To initiate polymerization, gelsolin binds to two globular actin monomers (G-actin) and to affect the depolymerization function of actin, gelsolin binds to filamentous actin (F-actin), severs the filament via the weakening of the non-covalent bonds between the actin monomers and remains attached to the barbed end of the filament as a plug, to prevent subsequent elongation (Yin & Stull, 1999).

[003] No plasma, a gelsolina é primariamente envolvida na rápida separação e remoção dos filamentos de actina liberados das células mortas na corrente sanguínea. A gelsolina plasmática [pGSN] desempenha, assim, um papel protetor, limpando a actina filamentosa-tóxica circulante liberada no sangue devido à necrose celular (Lee & Galbraith, 1992). Além disso, a gelsolina plasmática também tem a capacidade de se ligar a uma variedade de moléculas bioativas e pró-inflamatórias, incluindo ácido lisofosfatídico, esfingosina-1-fosfato, fibronectina e fator de ativação plaquetária, no corpo que atua como mediadores de muitas funções fisiológicas, incluindo cicatrização, desenvolvimento neurológico, progressão do câncer e angiogênese (Bucki e outros, 2010; Lind & Janmey, 1984; Lind e outros, 1988; Osborn e outros, 2007). Foi sugerido, então, que a gelsolina plasmática [pGSN] sequestra estes mediadores bioativos de inflamação e localiza reações inflamatórias e imunes aos locais da lesão. Além destas moléculas bioativas, a gelsolina plasmática [pGSN] tem a capacidade de se ligar aos lipídios da superfície bacteriana, ao ácido lipoteicóico (LTA) e ao lipopolissacarídeo (LPS), que pertencem às bactérias Gram-positivas e às bactérias Gram-negativas, respectivamente, (Bucki e outros, 2008; Bucki e outros, 2005). Essa interação compromete a capacidade do ácido lipoteicóico (LTA) e do lipopolissacarídeo (LPS) de mediar as respostas imunes inatas no hospedeiro (Bucki e outros, 2008).[003] In plasma, gelsolin is primarily involved in the rapid separation and removal of actin filaments released from dead cells in the bloodstream. Plasma gelsolin [pGSN] thus plays a protective role by clearing circulating filamentous-toxic actin released into the blood due to cellular necrosis (Lee & Galbraith, 1992). In addition, plasma gelsolin also has the ability to bind to a variety of bioactive and pro-inflammatory molecules, including lysophosphatidic acid, sphingosine-1-phosphate, fibronectin and platelet activating factor, in the body that act as mediators of many functions. physiological, including wound healing, neurological development, cancer progression, and angiogenesis (Bucki et al., 2010; Lind & Janmey, 1984; Lind et al., 1988; Osborn et al., 2007). It has therefore been suggested that plasma gelsolin [pGSN] sequesters these bioactive mediators of inflammation and localizes inflammatory and immune reactions to sites of injury. In addition to these bioactive molecules, plasma gelsolin [pGSN] has the ability to bind to lipids on the bacterial surface, lipoteichoic acid (LTA) and lipopolysaccharide (LPS), which belong to Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, respectively, (Bucki et al., 2008; Bucki et al., 2005). This interaction compromises the ability of lipoteichoic acid (LTA) and lipopolysaccharide (LPS) to mediate innate immune responses in the host (Bucki et al., 2008).

[004] A gelsolina plasmática humana circula no sangue a uma concentração de aproximadamente 200 μg/ml (Osborn e outros, 2008). O significado clínico e a importância terapêutica desta proteína têm sido bem ilustrados em modelos animais, bem como em pacientes com várias doenças. Um decréscimo significativo (20-50%) nos níveis de gelsolina plasmática foi documentado em uma variedade de doenças ou complicações de saúde, que incluem desde trauma principal a trauma menor, queimadura, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), lesão pulmonar aguda, lesão hepática aguda, cirurgia, sepse, hepatite, malária, síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (MODS, incluindo infarto do miocárdio, choque séptico e mionecrose), transplante alogênico de células-tronco e esclerose múltipla (Peddada e outros, 2012). Além disso, observou-se que os níveis de gelsolina plasmática aumentaram em pacientes em recuperação de doenças. Além disso, foi confirmado que a repleção com gelsolina recombinante exógena aumenta significativamente a taxa de sobrevivência em modelos animais de diferentes insultos agudos (Lee e outros, 2007).[004] Human plasma gelsolin circulates in the blood at a concentration of approximately 200 μg/ml (Osborn et al., 2008). The clinical significance and therapeutic importance of this protein have been well illustrated in animal models as well as in patients with various diseases. A significant decrease (20-50%) in plasma gelsolin levels has been documented in a variety of illnesses or health complications, which include major trauma, minor trauma, burns, acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute lung injury, acute liver injury, surgery, sepsis, hepatitis, malaria, multiple organ dysfunction syndrome (MODS, including myocardial infarction, septic shock, and myonecrosis), allogeneic stem cell transplantation, and multiple sclerosis (Peddada et al., 2012). Furthermore, plasma gelsolin levels were observed to increase in patients recovering from illness. Furthermore, it has been confirmed that repletion with exogenous recombinant gelsolin significantly increases the survival rate in animal models of different acute insults (Lee et al., 2007).

[005] De modo geral, todos esses estudos tiveram como objetivo investigar a correlação do nível de gelsolina plasmática [pGSN] com a gravidade do problema de saúde, bem como os resultados clínicos, que sugerem que: 1) o nível de gelsolina plasmática [pGSN] é reduzido após uma lesão celular, seja devido à cirurgia, inflamação ou infecção, e este declínio correlaciona-se muito bem com a extensão da lesão celular; 2) os níveis de gelsolina plasmática [pGSN] que diminuem abaixo de um nível crítico aumentam muito o risco de mortalidade, portanto, com base nos níveis de admissão de gelsolina plasmática [pGSN], a gelsolina exógena poderia ser administrada nos pacientes com níveis de gelsolina plasmática [pGSN] criticamente baixos, para melhorar suas chances de sobrevivência. Consequentemente, a gelsolina plasmática [pGSN] detém um imenso potencial como um excelente biomarcador prognóstico para várias condições de saúde, bem como uma proteína terapeuticamente relevante para melhorar o estado de saúde do paciente.[005] In general, all of these studies aimed to investigate the correlation of plasma gelsolin [pGSN] level with the severity of the health problem, as well as clinical results, which suggest that: 1) plasma gelsolin level [ pGSN] is reduced following cellular injury, whether due to surgery, inflammation, or infection, and this decline correlates very well with the extent of cellular injury; 2) plasma gelsolin [pGSN] levels that decrease below a critical level greatly increase the risk of mortality, therefore, based on admission plasma gelsolin [pGSN] levels, exogenous gelsolin could be administered to those patients with levels of critically low plasma gelsolin [pGSN] to improve their chances of survival. Consequently, plasma gelsolin [pGSN] holds immense potential as an excellent prognostic biomarker for various health conditions as well as a therapeutically relevant protein for improving patient health status.

[006] No entanto, sem saber os níveis exatos de gelsolina plasmática de indivíduos saudáveis, bem como do paciente, a terapia de reposição de gelsolina não pode ser uma realidade. Os kits comerciais existentes para a estimativa dos níveis de gelsolina em uma determinada amostra utilizam o método ELISA sanduíche [ensaio de imunoadsorção ligado a enzimas]. Resumidamente, os anticorpos específicos para gelsolina são revestidos sobre as placas ELISA, estas são então utilizadas para a ligação de gelsolina presente em amostras de teste e padrões. A gelsolina ligada é então detectada por meio do uso de um anticorpo anti-gelsolina marcado com biotina e um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rabanete. No entanto, todos estes kits são destinados apenas para fins de investigação e não para fins de diagnóstico.[006] However, without knowing the exact plasma gelsolin levels of healthy individuals as well as the patient, gelsolin replacement therapy cannot be a reality. Existing commercial kits for estimating gelsolin levels in a given sample use the sandwich ELISA [enzyme-linked immunosorbent assay] method. Briefly, gelsolin-specific antibodies are coated onto ELISA plates, which are then used to bind gelsolin present in test samples and standards. Bound gelsolin is then detected using a biotin-labeled anti-gelsolin antibody and a streptavidin-horseradish peroxidase conjugate. However, all these kits are intended for research purposes only and not for diagnostic purposes.

[007] Em suma, pode-se resumir que, até agora, não existe um método de diagnóstico acessível, preciso e rápido na literatura, que possa ser utilizado de forma confiável para a determinação de níveis de gelsolina plasmática em seres humanos e em outros animais. Considerando a necessidade emergente de medir os níveis de gelsolina plasmática em diferentes condições de doença ou estresse e o potencial terapêutico da injeção de gelsolina exógena e/ou de suas formas, para melhorar a condição do paciente, a função dos aptâmeros na quantificação e na purificação de gelsolina e das suas variantes tem um grande potencial de tradução e não foi relatada até a presente data.[007] In summary, it can be summarized that, until now, there is no accessible, accurate and rapid diagnostic method in the literature, which can be reliably used to determine plasma gelsolin levels in humans and others. animals. Considering the emerging need to measure plasma gelsolin levels in different disease or stress conditions and the therapeutic potential of injecting exogenous gelsolin and/or its forms to improve patient condition, the role of aptamers in quantification and purification gelsolin and its variants have great translation potential and have not been reported to date.

OBJECTIVES OF THE INVENTION

[008] O principal objetivo da presente invenção consiste, portanto, em apresentar novos aptâmeros de DNA específicos, que exibem propriedades de ligação à gelsolina e que são úteis para o desenvolvimento de protocolos de quantificação e/ou purificação de gelsolina e suas variantes.[008] The main objective of the present invention is, therefore, to present new specific DNA aptamers, which exhibit gelsolin binding properties and which are useful for the development of protocols for quantification and/or purification of gelsolin and its variants.

[009] Outro objetivo da presente invenção consiste em oferecer um processo para a estimativa dos níveis de gelsolina em uma amostra, por meio do uso dos novos aptâmeros de DNA da presente invenção e suas versões modificadas.[009] Another objective of the present invention is to offer a process for estimating gelsolin levels in a sample, through the use of the new DNA aptamers of the present invention and their modified versions.

[0010] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste em apresentar kits de diagnóstico para a estimativa dos níveis de gelsolina em uma amostra.[0010] Yet another objective of the present invention is to present diagnostic kits for estimating gelsolin levels in a sample.

[0011] Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste em apresentar novos aptâmeros de DNA e as suas versões modificadas úteis para o desenvolvimento e/ou geração de matriz de afinidade para a purificação da gelsolina e de suas variantes, incluindo aquelas sem marcação.[0011] Yet another objective of the present invention is to present new DNA aptamers and their modified versions useful for the development and/or generation of affinity matrix for the purification of gelsolin and its variants, including those without labeling.

[0012] Um outro objetivo da presente invenção consiste em oferecer um processo, por meio do qual os aptâmeros de DNA reivindicados podem ligar-se especifica e firmemente à gelsolina, bloqueando, assim, a capacidade da gelsolina de se ligar a outras proteínas.[0012] Another object of the present invention is to provide a process by which the claimed DNA aptamers can bind specifically and firmly to gelsolin, thus blocking the ability of gelsolin to bind to other proteins.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0013] A presente invenção refere-se à identificação e à utilização de aptâmeros de DNA de ligação à gelsolina, para estimar os níveis de gelsolina em uma determinada amostra e purificar a gelsolina marcada ou sem marcação, bem como as suas variantes.[0013] The present invention relates to the identification and use of gelsolin-binding DNA aptamers to estimate gelsolin levels in a given sample and purify labeled or unlabeled gelsolin, as well as its variants.

[0014] Superando as limitações da variação entre lotes em amostras de anticorpos e actina úteis para a preparação de protocolo(s) ou kit(s) de identificação de gelsolina, uma biblioteca de aptâmeros de DNA aleatória foi rastreada para identificar os aptâmeros que podem ligar-se à gelsolina [Sequências de Referência NCBI: NP_000168.1] (SEQ ID NO: 1) ou as suas metades N- e C- terminais, isto é, G1-G3 e G4-G6 (SEQ ID NO: 2 e 3, respectivamente). Os oligonucleotídeos [aptâmeros] foram sintetizados por reação em cadeia da polimerase (PCR), purificados e a sua capacidade de ligar-se à gelsolina e às suas variantes foi testada experimentalmente. Os resultados revelaram que alguns aptâmeros de DNA ligam-se à gelsolina e às suas variantes com especificidade e sensibilidade comparáveis aos anticorpos anti-gelsolina (IgG ou IgY) e actina. O ponto alto deste processo é que os aptâmeros de DNA podem ser produzidos facilmente por protocolos de reação em cadeia da polimerase (PCR) e extraídos com um elevado grau de pureza. Além disso, a concentração de aptâmeros de DNA, que são relativamente mais estáveis do que as proteínas, pode ser regulada com alta precisão. Esta característica será benéfica na utilização de aptâmeros de DNA como um material de revestimento ou de ligação em kit(s) de diagnóstico de gelsolina, e/ou geração de matriz de afinidade para purificar em massa a gelsolina sem marcação e as suas versões. Considerando a necessidade emergente de medir os níveis de gelsolina plasmática em diferentes condições de doença ou de estresse, e potencial terapêutico de injeção de gelsolina exógena e/ou as suas formas, para melhorar a condição do paciente, a função dos aptâmeros na quantificação e na purificação de gelsolina e das suas variantes tem um grande potencial de tradução e não foi relatada até a presente data.[0014] Overcoming the limitations of batch-to-batch variation in antibody and actin samples useful for preparing gelsolin identification protocol(s) or kit(s), a random DNA aptamer library was screened to identify aptamers that can bind to gelsolin [NCBI Reference Sequences: NP_000168.1] (SEQ ID NO: 1) or its N- and C-terminal halves, i.e., G1-G3 and G4-G6 (SEQ ID NO: 2 and 3, respectively). The oligonucleotides [aptamers] were synthesized by polymerase chain reaction (PCR), purified and their ability to bind to gelsolin and its variants was experimentally tested. The results revealed that some DNA aptamers bind to gelsolin and its variants with specificity and sensitivity comparable to anti-gelsolin antibodies (IgG or IgY) and actin. The highlight of this process is that DNA aptamers can be easily produced by polymerase chain reaction (PCR) protocols and extracted with a high degree of purity. Furthermore, the concentration of DNA aptamers, which are relatively more stable than proteins, can be regulated with high precision. This feature will be beneficial in the use of DNA aptamers as a coating or binding material in gelsolin diagnostic kit(s), and/or generation of affinity matrix to mass purify unlabeled gelsolin and its versions. Considering the emerging need to measure plasma gelsolin levels in different disease or stress conditions, and therapeutic potential of injection of exogenous gelsolin and/or its forms, to improve patient condition, the role of aptamers in quantification and Purification of gelsolin and its variants has great translational potential and has not been reported to date.

[0015] Em uma modalidade da presente invenção, a propriedade de ligação dos aptâmeros de DNA à gelsolina é utilizada como uma ferramenta para o desenvolvimento de aplicações, para a quantificação dos níveis de gelsolina em amostras, incluindo as de seres humanos e/ou animais. Esta propriedade também pode ser estendida para o desenvolvimento de kit(s) de diagnóstico relacionado à gelsolina.[0015] In one embodiment of the present invention, the binding property of DNA aptamers to gelsolin is used as a tool for developing applications for quantifying gelsolin levels in samples, including those from humans and/or animals. . This property can also be extended to the development of gelsolin-related diagnostic kit(s).

[0016] Em outra modalidade da presente invenção, a propriedade de ligação de aptâmeros à gelsolina é utilizada como uma ferramenta para o desenvolvimento de aplicações, para a purificação de gelsolina e das suas variantes a partir de uma mistura.[0016] In another embodiment of the present invention, the property of aptamer binding to gelsolin is used as a tool for developing applications, for purifying gelsolin and its variants from a mixture.

[0017] Ainda em outra modalidade da presente invenção, a propriedade de ligação de aptâmeros à gelsolina é utilizada para funcionalizar uma matriz de fase estacionária utilizada em cromatografia, para o desenvolvimento de um protocolo de cromatografia de afinidade, para a purificação de grandes quantidades de gelsolina e suas variantes.[0017] In yet another embodiment of the present invention, the aptamer binding property of gelsolin is used to functionalize a stationary phase matrix used in chromatography, for the development of an affinity chromatography protocol, for the purification of large amounts of gelsolin and its variants.

[0018] Ainda em outra modalidade da presente invenção, a propriedade de aptâmeros de se ligarem especifica e firmemente à gelsolina tem sido utilizada para bloquear o funcionamento da gelsolina em vias indesejáveis, levando a um potencial terapêutico destes aptâmeros.[0018] In yet another embodiment of the present invention, the property of aptamers to bind specifically and firmly to gelsolin has been used to block the functioning of gelsolin in undesirable pathways, leading to a therapeutic potential of these aptamers.

[0019] As sequências de diferentes aptâmeros de DNA que podem ligar-se à gelsolina estão apresentadas na listagem de sequências SEQUENCE LISTING.txt e são mencionadas na Tabela abaixo, juntamente com outras sequências utilizadas na presente invenção: [0019] The sequences of different DNA aptamers that can bind to gelsolin are presented in the sequence listing SEQUENCE LISTING.txt and are mentioned in the Table below, together with other sequences used in the present invention:

BRIEF DESCRIPTION OF THE ATTACHED DRAWINGS

[0020] A Figura 1 ilustra o fluxograma que descreve a estratégia de seleção da biblioteca de aptâmeros, para identificar os aptâmeros específicos com capacidade de ligação à gelsolina. Este protocolo foi seguido para enriquecer os aptâmeros que podem ligar-se à gelsolina.[0020] Figure 1 illustrates the flowchart that describes the aptamer library selection strategy, to identify specific aptamers with gelsolin binding capacity. This protocol was followed to enrich aptamers that can bind to gelsolin.

[0021] A Figura 2 ilustra a capacidade de ligação de diferentes aptâmeros com gelsolina (GSN) e as suas duas variantes/metades (G1 - G3 e G4 - G6) (SEQ ID NO: 1, 2 e 3, respectivamente). São mostradas as capacidades de ligação de diferentes aptâmeros revestidos sobre uma placa ELISA de 96 poços com gelsolina recombinante, conforme determinado pelo ensaio de ligação por microtitulação. O resultado principal transmitido por esta figura é que a gelsolina (GSN), G1-G3 e G4-G6 podem ligar-se a todos os aptâmeros reivindicados.[0021] Figure 2 illustrates the binding capacity of different aptamers with gelsolin (GSN) and its two variants/halves (G1 - G3 and G4 - G6) (SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively). The binding capabilities of different aptamers coated on a 96-well ELISA plate with recombinant gelsolin as determined by microtiter binding assay are shown. The main result conveyed by this figure is that gelsolin (GSN), G1-G3 and G4-G6 can bind to all claimed aptamers.

[0022] A Figura 3 ilustra a afinidade de ligação de aptâmeros à gelsolina. As afinidades de ligação de aptâmeros à gelsolina foram calculadas a partir da curva de ligação de aptâmeros revestidos a diferentes concentrações com uma concentração fixa de gelsolina, conforme determinado pelo ensaio de ligação por microtitulação. O eixo X indica a concentração dos aptâmeros reivindicados em nM (nanomolares) e o eixo Y é a absorbância da mistura de reação observada experimentalmente a 450 nm (nanômetros). As legendas €, Δ, O e V denotam o ponto de dados referentes à concentração do aptâmero utilizado. O valor numérico ao lado do aptâmero indica a constante de ligação (Kd) do aptâmero à gelsolina (GSN). Assim sendo, os resultados são: L26F, 10.10R, L16F e L24F ligam-se individualmente à gelsolina com uma constante de ligação (Kd) estimada de 15,3, 7,2, 12,7 e 15,7 nM.[0022] Figure 3 illustrates the binding affinity of aptamers to gelsolin. Aptamer binding affinities for gelsolin were calculated from the binding curve of aptamers coated at different concentrations with a fixed concentration of gelsolin, as determined by microtiter binding assay. The X-axis indicates the concentration of the claimed aptamers in nM (nanomolars) and the Y-axis is the absorbance of the reaction mixture observed experimentally at 450 nm (nanometers). The labels €, Δ, O and V denote the data point referring to the concentration of the aptamer used. The numerical value next to the aptamer indicates the binding constant (Kd) of the aptamer to gelsolin (GSN). Therefore, the results are: L26F, 10.10R, L16F and L24F bind individually to gelsolin with an estimated binding constant (Kd) of 15.3, 7.2, 12.7 and 15.7 nM.

[0023] A Figura 4 ilustra a ligação de aptâmeros à gelsolina imobilizada. A gelsolina recombinante foi revestida sobre a placa de ELISA e deixou-se ligar a aptâmeros marcados com biotina. Os aptâmeros ligados foram então detectados por meio do uso de conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano. O gráfico mostra a ligação de aptâmeros selecionados à gelsolina imobilizada. É evidente que os aptâmeros reivindicados podem ligar-se à gelsolina imobilizada, sendo que L26F, L24F ligam-se com eficácia semelhante e 10.10R é melhor em relação à ligação com L16F, tendo uma capacidade relativa intermediária. Estes resultados estão em correlação com os resultados da constante de ligação fornecidos na Figura 3.[0023] Figure 4 illustrates the binding of aptamers to immobilized gelsolin. Recombinant gelsolin was coated onto the ELISA plate and allowed to bind to biotin-labeled aptamers. Bound aptamers were then detected using streptavidin-horseradish peroxidase conjugate. The graph shows the binding of selected aptamers to immobilized gelsolin. It is clear that the claimed aptamers can bind to immobilized gelsolin, with L26F, L24F binding with similar efficacy and 10.10R being better in relation to binding with L16F, having an intermediate relative capacity. These results correlate with the binding constant results provided in Figure 3.

[0024] A Figura 5 ilustra a purificação da gelsolina por meio do uso de aptâmeros selecionados ligados à sefarose. Os resultados confirmam que a utilização dos aptâmeros reivindicados e do protocolo descrito em detalhe, pode-se purificar a gelsolina (GSN) com 95% de pureza ou ainda mais.[0024] Figure 5 illustrates the purification of gelsolin through the use of selected aptamers linked to sepharose. The results confirm that using the claimed aptamers and the protocol described in detail, gelsolin (GSN) can be purified to 95% purity or even higher.

[0025] A Figura 6 ilustra que os aptâmeros selecionados ligam-se à gelsolina imobilizada (GSN) e não permite que ela se ligue à proteína PrP causadora de príons. GSN + Prp indica a adição da proteína Prp príon (Prp) à gelsolina (GSN) imobilizada em placa ELISA através do anticorpo monoclonal anti-gelsolina revestido; GSN + Apt/Prp indica a adição de uma mistura de Prp e um dos aptâmeros reivindicados à gelsolina imobilizada; GSN + Apt->Prp indica a adição de Prp em primeiro lugar, seguida por um dos aptâmeros reivindicados à gelsolina imobilizada. A detecção de Prp ligada foi feita por meio do uso de anticorpos de coelho anti-Prp seguida por anticorpos secundários aos anticorpos de coelho. LISTA DAS ABREVIATURAS UTILIZADAS: [0025] Figure 6 illustrates that the selected aptamers bind to immobilized gelsolin (GSN) and do not allow it to bind to the prion-causing PrP protein. GSN + Prp indicates the addition of the Prp prion protein (Prp) to gelsolin (GSN) immobilized on an ELISA plate via the coated anti-gelsolin monoclonal antibody; GSN + Apt/Prp indicates the addition of a mixture of Prp and one of the claimed aptamers to the immobilized gelsolin; GSN + Apt->Prp indicates the addition of Prp first, followed by one of the claimed aptamers to the immobilized gelsolin. Detection of bound Prp was done through the use of rabbit anti-Prp antibodies followed by antibodies secondary to the rabbit antibodies. LIST OF ABBREVIATIONS USED:

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0026] Níveis reduzidos de gelsolina plasmática foram registrados em várias doenças e a repleção de gelsolina exógena demonstrou melhoria em modelos animais de queimadura e septicemia. Prevê-se que, no futuro, os níveis de gelsolina serão examinados em um certo número de casos médicos. Possivelmente, a gelsolina recombinante e as suas variantes funcionais serão utilizadas para fins terapêuticos. Consequentemente, é imperativo apresentar novas entidades que possam ligar-se à gelsolina, bem como desenvolver kit(s) diagnóstico(s) de gelsolina plasmática e meios para expressar e purificar a gelsolina e suas versões. Os novos aptâmeros de DNA que podem se ligar forte e especificamente à gelsolina ajudarão no desenvolvimento de formas de quantificar e purificar a gelsolina e suas variantes, bem como bloquear o funcionamento da gelsolina em vias indesejáveis, projetando, assim, um potencial papel terapêutico destes aptâmeros. Aqui, demonstramos que estes aptâmeros se ligam à gelsolina e param a associação da proteína príon mediada pela gelsolina.[0026] Reduced plasma gelsolin levels have been recorded in several diseases and repletion of exogenous gelsolin has demonstrated improvement in animal models of burns and septicemia. It is anticipated that in the future, gelsolin levels will be examined in a number of medical cases. Possibly, recombinant gelsolin and its functional variants will be used for therapeutic purposes. Consequently, it is imperative to introduce new entities that can bind to gelsolin, as well as to develop plasma gelsolin diagnostic kit(s) and means to express and purify gelsolin and its versions. New DNA aptamers that can bind tightly and specifically to gelsolin will help in the development of ways to quantify and purify gelsolin and its variants, as well as block the functioning of gelsolin in undesirable pathways, thus projecting a potential therapeutic role for these aptamers. . Here, we demonstrate that these aptamers bind to gelsolin and stop gelsolin-mediated prion protein association.

[0027] A presente invenção descreve novos aptâmeros de DNA e a sua utilização como moléculas de ligação de gelsolina. A presente invenção descreve, pela primeira vez, aptâmeros específicos que podem ligar-se à gelsolina.[0027] The present invention describes new DNA aptamers and their use as gelsolin binding molecules. The present invention describes, for the first time, specific aptamers that can bind to gelsolin.

[0028] Os aptâmeros são moléculas curtas de DNA/RNA/peptídeo que podem ligar-se especificamente a uma molécula alvo (Pan & Clawson, 2009). Estes são normalmente identificados pelo método de Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX). O método SELEX envolve a exposição de uma biblioteca de sequência aleatória a um alvo específico e a amplificação das moléculas ligadas, que são então submetidas a ciclos adicionais de seleção. Após vários ciclos de seleção, os aptâmeros específicos identificados para ligação à molécula alvo são submetidos a diferentes modificações para melhorar a sua afinidade de ligação e estabilidade.[0028] Aptamers are short DNA/RNA/peptide molecules that can specifically bind to a target molecule (Pan & Clawson, 2009). These are typically identified by the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) method. The SELEX method involves exposing a random sequence library to a specific target and amplifying the bound molecules, which are then subjected to additional cycles of selection. After several cycles of selection, specific aptamers identified for binding to the target molecule are subjected to different modifications to improve their binding affinity and stability.

[0029] A gelsolina é uma proteína multifuncional reguladora de actina dependente de cálcio composta por seis domínios (G1-G6), que parece ter surgido de um evento de triplicação seguido de uma duplicação de um gene ancestral codificando um único domínio (Kwiatkowski e outros, 1986; Osborn e outros, 2008). A gelsolina existe como três isoformas, duas isoformas plasmáticas extracelulares secretadas e citoplasmáticas, sendo todas codificadas por um único gene localizado no cromossomo 9 em seres humanos. Este único gene é submetido a uma iniciação transcricional alternativa e à seleção do sítio de junção (splice-site) em diferentes tecidos, resultando em diferenças nos amino-terminais das isoformas (Kwiatkowski e outros, 1988; Yin e outros, 1984). A gelsolina plasmática (secretada) madura (GSN plasmática formada após a clivagem da sequência sinal nos amino-terminais de 27 resíduos) difere da sua contraparte citoplasmática por um único peptídeo líder adicional (24 aminoácidos) no seu N- terminal (Kwiatkowski e outros, 1986) e a presença de uma ligação dissulfeto, que oferece uma estabilidade adicional (Wen e outros, 1996). O restante dos polipeptídeos é idêntico em sequência à forma citoplasmática (Kwiatkowski e outros, 1986). A terceira isoforma menor denominada gelsolina-3 é uma forma não secretada contendo 11 aminoácidos adicionais no N-terminal, em comparação com a contraparte citoplasmática. Embora a gelsolina citoplasmática seja expressa em uma grande variedade de tecidos, a gelsolina-3 expressa predominantemente nos oligodendrócitos no cérebro, nos pulmões e nos testículos e está envolvida na remodelação da mielina durante a espiralização em torno do axônio (Vouyiouklis & Brophy, 1997). A gelsolina plasmática é produzida e secretada principalmente no sangue por células musculares (Kwiatkowski e outros, 1988).[0029] Gelsolin is a multifunctional calcium-dependent actin-regulating protein composed of six domains (G1-G6), which appears to have arisen from a triplication event followed by a duplication of an ancestral gene encoding a single domain (Kwiatkowski et al. , 1986; Osborn et al., 2008). Gelsolin exists as three isoforms, two extracellular plasma secreted and cytoplasmic isoforms, all of which are encoded by a single gene located on chromosome 9 in humans. This single gene is subjected to alternative transcriptional initiation and splice-site selection in different tissues, resulting in differences in the amino termini of the isoforms (Kwiatkowski et al., 1988; Yin et al., 1984). Mature (secreted) plasma gelsolin (plasma GSN formed after cleavage of the signal sequence at the amino-terminal 27 residues) differs from its cytoplasmic counterpart by a single additional leader peptide (24 amino acids) at its N-terminus (Kwiatkowski et al., 1986) and the presence of a disulfide bond, which offers additional stability (Wen et al., 1996). The remainder of the polypeptides are identical in sequence to the cytoplasmic form (Kwiatkowski et al., 1986). The third smaller isoform called gelsolin-3 is a non-secreted form containing an additional 11 amino acids at the N-terminus compared to the cytoplasmic counterpart. Although cytoplasmic gelsolin is expressed in a wide variety of tissues, gelsolin-3 is predominantly expressed in oligodendrocytes in the brain, lungs, and testis and is involved in myelin remodeling during coiling around the axon (Vouyiouklis & Brophy, 1997). . Plasma gelsolin is produced and secreted mainly into the blood by muscle cells (Kwiatkowski et al., 1988).

[0030] O significado clínico e a importância terapêutica da gelsolina plasmática têm sido bem ilustrados em modelos animais, bem como em pacientes com várias doenças. Um decréscimo significativo nos níveis de gelsolina plasmática [pGSN] foi documentado em uma variedade de doenças, desde trauma menor/maior, infecções até inflamação crônica (Peddada e outros, 2012). Observou-se que pacientes com níveis baixos de gelsolina plasmática [pGSN] apresentaram maior taxa de mortalidade, maior permanência hospitalar e maior tempo de ventilação em unidades de terapia intensiva, em comparação com controles saudáveis. Observou-se que os níveis de gelsolina plasmática [pGSN] aumentaram em doentes em recuperação de doenças. Além disso, confirmou-se que a repleção com gelsolina plasmática recombinante exógena aumenta significativamente a taxa de sobrevivência em modelos animais de diferentes insultos agudos (Lee e outros, 2007). No entanto, sem saber os níveis exatos de gelsolina plasmática de indivíduos saudáveis, bem como do paciente, a terapia de reposição de gelsolina não pode se tornar uma realidade. Até o presente momento, não existe um "método de diagnóstico" na literatura e kits/protocolos baseados nestes aptâmeros podem ser utilizados de forma confiável para a determinação dos níveis de gelsolina plasmática de seres humanos e de outros animais para usos clínicos.[0030] The clinical significance and therapeutic importance of plasma gelsolin have been well illustrated in animal models, as well as in patients with various diseases. A significant decrease in plasma gelsolin [pGSN] levels has been documented in a variety of diseases, from minor/major trauma, infections to chronic inflammation (Peddada et al., 2012). It was observed that patients with low plasma gelsolin [pGSN] levels had a higher mortality rate, longer hospital stay and longer ventilation time in intensive care units, compared to healthy controls. Plasma gelsolin [pGSN] levels were observed to increase in patients recovering from illness. Furthermore, repletion with exogenous recombinant plasma gelsolin has been confirmed to significantly increase the survival rate in animal models of different acute insults (Lee et al., 2007). However, without knowing the exact plasma gelsolin levels of healthy individuals as well as the patient, gelsolin replacement therapy cannot become a reality. To date, there is no "diagnostic method" in the literature and kits/protocols based on these aptamers can be used reliably to determine plasma gelsolin levels in humans and other animals for clinical use.

[0031] O termo "diagnóstico", conforme utilizado na modalidade acima, refere-se ao processo/método de determinação do valor de uma determinada entidade, que poderia ajudar a descobrir a razão/extensão de uma condição clínica e, portanto, é de uso clínico, bem como para fins de investigação.[0031] The term "diagnosis", as used in the above embodiment, refers to the process/method of determining the value of a certain entity, which could help discover the reason/extent of a clinical condition and is therefore of clinical use as well as for research purposes.

[0032] A expressão "determinada amostra", conforme utilizada na modalidade acima, refere-se a qualquer amostra biológica que inclui, mas não se limita a sangue, soro, plasma, urina ou saliva obtida de seres humanos ou de outros animais.[0032] The expression "certain sample", as used in the above embodiment, refers to any biological sample that includes, but is not limited to, blood, serum, plasma, urine or saliva obtained from humans or other animals.

[0033] A expressão "gelsolina plasmática", conforme utilizada na modalidade acima, refere-se à gelsolina presente na amostra de plasma de seres humanos ou de outros animais.[0033] The expression "plasma gelsolin", as used in the above embodiment, refers to gelsolin present in the plasma sample of humans or other animals.

[0034] A expressão "gelsolina plasmática", conforme utilizada na modalidade acima, refere-se à gelsolina presente no plasma humano/animal, que pode ser uma mistura de isoforma plasmática e outras isoformas de gelsolina liberadas no sangue devido à necrose celular.[0034] The expression "plasma gelsolin", as used in the above embodiment, refers to gelsolin present in human/animal plasma, which may be a mixture of plasma isoform and other gelsolin isoforms released into the blood due to cellular necrosis.

[0035] A isoforma plasmática da gelsolina é a isoforma da gelsolina (proteína) que é secretada no sangue, principalmente a partir de células musculares.[0035] The plasma gelsolin isoform is the gelsolin isoform (protein) that is secreted into the blood, mainly from muscle cells.

[0036] A expressão "uso clínico" refere-se à finalidade de conhecer os níveis de gelsolina em uma determinada amostra humana/animal, para determinar a melhor estratégia de tratamento para o humano/animal a partir do qual a "amostra" foi obtida.[0036] The expression "clinical use" refers to the purpose of knowing the levels of gelsolin in a given human/animal sample, to determine the best treatment strategy for the human/animal from which the "sample" was obtained .

[0037] O termo "tratamento", conforme aqui utilizado, refere- se a uma abordagem para a obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não se limitam ao alívio ou à melhora de um ou mais sintomas ou condições, extensão diminuída da doença, estabilização do estado da doença, retardamento da progressão da doença e também prolongamento da sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada na ausência de tratamento.[0037] The term "treatment", as used herein, refers to an approach to obtaining beneficial or desired results, including clinical results. Beneficial or desired clinical results may include, but are not limited to, relief or improvement of one or more symptoms or conditions, decreased extent of disease, stabilization of the disease state, delay of disease progression, and also prolongation of survival compared to with expected survival in the absence of treatment.

[0038] O termo "funcionalizar", conforme aqui utilizado, refere-se à ligação covalente de aptâmeros de DNA sobre esferas de sílica/sílica modificada/agarose/sefarose por reação química.[0038] The term "functionalize", as used herein, refers to the covalent attachment of DNA aptamers onto silica/modified silica/agarose/sepharose beads by chemical reaction.

[0039] A expressão "cromatografia de afinidade", conforme aqui utilizada refere-se à ligação e, portanto, à retenção de gelsolina em fase móvel nos aptâmeros na fase estacionária do protocolo de cromatografia.[0039] The term "affinity chromatography" as used herein refers to the binding and, therefore, retention of gelsolin in the mobile phase in the aptamers in the stationary phase of the chromatography protocol.

[0040] Por conseguinte, a principal modalidade da presente invenção apresenta novos aptâmeros de DNA representados pelas sequências SEQ ID Nos. 6-9.[0040] Therefore, the main embodiment of the present invention presents new DNA aptamers represented by the sequences SEQ ID Nos. 6-9.

[0041] Outra modalidade da presente invenção apresenta aptâmeros de DNA, conforme aqui descrito, que podem ligar-se à proteína gelsolina representada pela sequência SEQ ID No. 1 ou suas variantes representadas pelas sequências SEQ ID No. 2 e 3.[0041] Another embodiment of the present invention presents DNA aptamers, as described herein, that can bind to the gelsolin protein represented by the sequence SEQ ID No. 1 or its variants represented by the sequences SEQ ID No. 2 and 3.

[0042] Outra modalidade da presente invenção apresenta aptâmeros de DNA, conforme aqui descritos, que são úteis para a quantificação dos níveis de gelsolina em uma amostra.[0042] Another embodiment of the present invention features DNA aptamers, as described herein, which are useful for quantifying gelsolin levels in a sample.

[0043] Outra modalidade da presente invenção apresenta um método para a quantificação de gelsolina em uma amostra, por meio do uso dos aptâmeros, conforme aqui descritos, sendo que o referido método compreende as seguintes etapas: [a] revestir 1 ug de estreptavidina sobre um suporte, por meio do uso da solução tampão constituída de 100 mM de NaHCO3 com pH 9,2 durante 10 a 12 horas a uma temperatura de 4 graus C; [b] lavar o suporte revestido da etapa [a] com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloquear com albumina de soro bovino (BSA) a 3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 2 horas seguida por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS); [c] imobilizar 2 uM do aptâmero marcado com biotina selecionado das sequências SEQ ID Nos. 6 a 9 no suporte da etapa [b], por meio do uso de tampão TE com pH 8 suplementado com 2M de NaCl durante 2 horas à temperatura ambiente; [d] lavar o suporte revestido da etapa [c] duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de Tween-20; [e] adicionar gelsolina entre 0,2 uM e 5 nM ou uma amostra diluída em tampão de seleção contendo albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% ao suporte da etapa [d] e deixar repousar durante 2 horas [f] lavar o suporte revestido da etapa [e] quatro vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 a 0,1% seguida pela adição de anticorpos anti-gelsolina e incubar durante 10 a 12 horas a 4°C; [g] lavar o suporte obtido na etapa [f] quatro vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 a 0,1% seguida pela adição de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e incubar durante 1 hora e depois adicionar o substrato à peroxidase de rábano; [h] terminar a reação da etapa [g] com 2M de H2SO4 após o desenvolvimento da cor azul e medir a absorbância a 450 nm, de modo a determinar a quantidade de gelsolina presente na amostra.[0043] Another embodiment of the present invention presents a method for quantifying gelsolin in a sample, through the use of aptamers, as described herein, and said method comprises the following steps: [a] coating 1 ug of streptavidin on a support, using a buffer solution consisting of 100 mM NaHCO3 with pH 9.2 for 10 to 12 hours at a temperature of 4 degrees C; [b] wash the coated support from step [a] with phosphate-buffered saline (PBS) and block with 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours followed by washing with phosphate buffered saline (PBS); [c] immobilize 2 uM of the biotin-labeled aptamer selected from the sequences SEQ ID Nos. 6 to 9 in the support of step [b], using TE buffer with pH 8 supplemented with 2M NaCl for 2 hours at room temperature; [d] wash the coated support from step [c] twice with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20; [e] add gelsolin between 0.2 uM and 5 nM or a sample diluted in selection buffer containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) to the support from step [d] and let it rest for 2 hours [f] washing the coated support from step [e] four times with phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 followed by the addition of anti-gelsolin antibodies and incubating for 10 to 12 hours at 4°C; [g] wash the support obtained in step [f] four times with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 followed by the addition of horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies and incubate for 1 hour and then add the substrate to horseradish peroxidase; [h] finish the reaction from step [g] with 2M H2SO4 after the development of the blue color and measure the absorbance at 450 nm, in order to determine the amount of gelsolin present in the sample.

[0044] Ainda em outra modalidade, a presente invenção apresenta um método para a quantificação de gelsolina em uma amostra, por meio do uso dos aptâmeros, conforme aqui descritos, compreende as seguintes etapas: [a] revestir anticorpos anti-gelsolina sobre um suporte, por meio do uso da solução tampão constituída de 100 mM de NaHCO3 com pH 9,2 durante 10 a 12 horas a uma temperatura de 4 graus C; [b] lavar o suporte revestido da etapa [a] com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloquear com albumina de soro bovino (BSA) a 3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 2 horas seguida por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS); [c] adicionar gelsolina entre 0,2 uM e 5 nM ou uma amostra diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% e Tween-20 a 0,01% ao suporte da etapa [b] e deixar repousar durante 2 horas à temperatura ambiente; [d] lavar o suporte revestido da etapa [c] três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 a 0,1%; [e] adicionar 1 uM de aptâmero marcado com biotina selecionado das sequências SEQ ID Nos. 6 a 9 diluído em tampão de seleção contendo albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% ao suporte da etapa [d] e deixar em repouso durante 2 horas. [f] lavar o suporte revestido da etapa [e] quatro vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween-20 a 0,1% seguida pela adição de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano e incubar durante uma hora e depois adicionar o substrato ao peroxidase de rábano; [g] terminar a reação da etapa [f] com 2M de H2SO4 após o desenvolvimento da cor azul e medir a absorbância a 450 nm, de modo a determinar a quantidade de gelsolina presente na amostra.[0044] In yet another embodiment, the present invention presents a method for quantifying gelsolin in a sample, through the use of aptamers, as described herein, comprising the following steps: [a] coating anti-gelsolin antibodies on a support , through the use of a buffer solution consisting of 100 mM NaHCO3 with pH 9.2 for 10 to 12 hours at a temperature of 4 degrees C; [b] wash the coated support from step [a] with phosphate-buffered saline (PBS) and block with 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours followed by washing with phosphate buffered saline (PBS); [c] add gelsolin between 0.2 uM and 5 nM or a sample diluted in phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) and 0.01% Tween-20 to the support from step [b] and leave to rest for 2 hours at room temperature; [d] wash the coated support from step [c] three times with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20; [and] add 1 uM biotin-labeled aptamer selected from the sequences SEQ ID Nos. 6 to 9 diluted in selection buffer containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) to support step [d] and leave to rest for 2 hours. [f] wash the coated support from step [e] four times with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 followed by the addition of horseradish peroxidase-conjugated streptavidin and incubate for one hour and then add the substrate to horseradish peroxidase; [g] finish the reaction from step [f] with 2M H2SO4 after the development of the blue color and measure the absorbance at 450 nm, in order to determine the amount of gelsolin present in the sample.

[0045] Ainda outra modalidade da presente invenção apresenta aptâmeros de DNA, conforme aqui descritos, que são úteis para a purificação de gelsolina a partir de uma mistura.[0045] Yet another embodiment of the present invention features DNA aptamers, as described herein, which are useful for purifying gelsolin from a mixture.

[0046] Um método para a purificação de gelsolina a partir de uma mistura, por meio do uso dos aptâmeros, conforme aqui descritos, compreende as seguintes etapas: [a] lavar as esferas de sefarose ativadas com brometo de cianogênio (CNBr) com água gelada duplamente destilada e adicionar 10 mM de fosfato de potássio (pH 8) e oligos 5'-fosforilados para produzir uma pasta espessa das esferas ativadas; [b] agitar a pasta obtida na etapa [a] à temperatura ambiente durante 14 horas e lavar com 1 M de fosfato de potássio (pH 8) contendo 1 M de cloreto de potássio (KCl); [c] lavar as esferas obtidas na etapa [b] com água, seguida por ressuspensão em 10 mM de Tris-HCl (pH 8) contendo 300 mM de NaCl e 1 mM de EDTA; [d] verter a pasta de esferas obtida na etapa [c] em uma coluna PD-10 e lavar com três volumes de coluna de tampão de 40 mM de Tris com pH 8 contendo 100 mM de NaCl e 2 mM de EGTA; [e] adicionar à coluna obtida na etapa [d] o lisado celular contendo gelsolina com pH ajustado a pH 8 e contendo 2 mM de EGTA; [f] lavar a coluna da etapa [e] obtida após carregamento inicial com três volumes de coluna de tampão de 40 mM de Tris com pH 8 contendo 100 mM de NaCl e 3 mM de CaCl2; [g] eluir a gelsolina ligada da coluna da etapa [f], por meio da adição de tampão de 40 mM de Tris com pH 8, contendo 300 mM de NaCl e 20 mM de CaCl2.[0046] A method for purifying gelsolin from a mixture, through the use of aptamers, as described herein, comprises the following steps: [a] washing the sepharose beads activated with cyanogen bromide (CNBr) with water ice-cold double distillate and add 10 mM potassium phosphate (pH 8) and 5'-phosphorylated oligos to produce a thick slurry of the activated beads; [b] stir the paste obtained in step [a] at room temperature for 14 hours and wash with 1 M potassium phosphate (pH 8) containing 1 M potassium chloride (KCl); [c] wash the spheres obtained in step [b] with water, followed by resuspension in 10 mM Tris-HCl (pH 8) containing 300 mM NaCl and 1 mM EDTA; [d] pour the bead slurry obtained in step [c] onto a PD-10 column and wash with three column volumes of 40 mM Tris pH 8 buffer containing 100 mM NaCl and 2 mM EGTA; [e] add to the column obtained in step [d] the cell lysate containing gelsolin with pH adjusted to pH 8 and containing 2 mM EGTA; [f] wash the column from step [e] obtained after initial loading with three column volumes of 40 mM Tris buffer with pH 8 containing 100 mM NaCl and 3 mM CaCl2; [g] elute the bound gelsolin from the column in step [f], by adding 40 mM Tris buffer with pH 8, containing 300 mM NaCl and 20 mM CaCl2.

[0047] Outra modalidade da presente invenção apresenta um kit para a detecção de gelsolina, por meio do uso dos aptâmeros, conforme aqui descritos, sendo que o referido kit compreende: [a] uma fase sólida tendo nela imobilizado o aptâmero selecionado das sequências SEQ ID Nos. 6 a 9; [b] amostra contendo gelsolina; [c] reagentes de detecção contendo anticorpos anti-gelsolina e anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, que são capazes de detectar a presença de gelsolina.[0047] Another embodiment of the present invention presents a kit for the detection of gelsolin, through the use of aptamers, as described herein, and said kit comprises: [a] a solid phase having immobilized in it the aptamer selected from the SEQ sequences ID Nos. 6 to 9; [b] sample containing gelsolin; [c] detection reagents containing anti-gelsolin antibodies and secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase, which are capable of detecting the presence of gelsolin.

EXAMPLES

Os exemplos abaixo são fornecidos a título de ilustração e, portanto, não devem ser interpretados de forma a limitar o âmbito da presente invenção.The examples below are provided by way of illustration and therefore should not be construed to limit the scope of the present invention.

EXAMPLE 1: Identification of gelsolin-binding DNA aptamers Production of recombinant gelsolin and its variants:

[0048] O produto amplificado do clone de cDNA obtido a partir de NIH Mammalian Gene Collection - clone do gene humano ID 4661084 foi digerido com XbaI e XhoI e subclonado no esqueleto do vetor de pET303/CT-His (Invitrogen, NY, EUA). As variantes de gelsolina foram geradas por mutagênese sítio-dirigida ou por deleção, conforme descrição anterior (Peddada e outros, 2013). As sequências de DNA de gelsolina subclonado foram verificadas por sequenciamento automático de DNA (Applied Biosystems, EUA). Os plasmídeos assim criados foram utilizados para transformar E. coli BL21 (DE3), que foi comercialmente obtido a partir de M/s Invitrogen, EUA, vide número de catálogo C6000-03, para a expressão de proteínas heterólogas. As bactérias transformadas transportando pET303/gelsolina e seus mutantes foram depositados com MTCC, Chandigarh, Índia, uma Autoridade Depositária Internacional reconhecida sob o Tratado de Budapeste, vide número de acesso MTCC5885 em 09/01/2014. As bactérias MTCC 5885 foram cultivadas em um caldo Luria-Bertani LB (Merck, Alemanha) até uma densidade de OD600 = 0,5 seguido por indução da expressão da proteína recombinante com 1 mM de isopropil-e-D-tiogalactósido (IPTG) durante 4-5 horas adicionais. As proteínas expressas foram purificadas por cromatografia de troca aniônica fraca (DE-52). A proteína alvo foi imobilizada em esferas de sefarose ativadas com brometo de cianogênio (CNBr), como segue. Acoplamento do material de afinidade às esferas de sefarose:[0048] The amplified product of the cDNA clone obtained from the NIH Mammalian Gene Collection - human gene clone ID 4661084 was digested with XbaI and XhoI and subcloned into the pET303/CT-His vector backbone (Invitrogen, NY, USA) . The gelsolin variants were generated by site-directed mutagenesis or by deletion, as previously described (Peddada et al., 2013). Subcloned gelsolin DNA sequences were verified by automated DNA sequencing (Applied Biosystems, USA). The plasmids thus created were used to transform E. coli BL21 (DE3), which was commercially obtained from M/s Invitrogen, USA, vide catalog number C6000-03, for expression of heterologous proteins. The transformed bacteria carrying pET303/gelsolin and its mutants were deposited with MTCC, Chandigarh, India, an International Depository Authority recognized under the Budapest Treaty, vide accession number MTCC5885 on 01/09/2014. MTCC 5885 bacteria were grown in Luria-Bertani LB broth (Merck, Germany) to a density of OD600 = 0.5 followed by induction of recombinant protein expression with 1 mM isopropyl-e-D-thiogalactoside (IPTG) for 4- 5 additional hours. The expressed proteins were purified by weak anion exchange chromatography (DE-52). The target protein was immobilized on cyanogen bromide (CNBr)-activated sepharose beads as follows. Coupling the affinity material to the sepharose beads:

[0049] As proteínas (albumina de soro bovino (BSA) e gelsolina) foram dialisadas contra a solução tampão de 100mM de NaHCO3, pH 9,0, e a concentração foi estimada por medição da absorbância a 280 nm. A resina ativada com brometo de cianogênio (CNBr) foi deixada inchar em 1 mM de HCl durante 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, equilibrada com tampão de acoplamento (100 mM de NaHCO3, pH 9,0). Após o equilíbrio, a resina foi imediatamente transferida para a solução de proteína e incubada com agitação durante a noite a 4°C. As esferas foram recolhidas por centrifugação a 2000 x g durante 1 minuto e a concentração de proteína do sobrenadante foi determinada (deveria ser 10 vezes menor do que a observada na etapa 1). As esferas foram lavadas 3-4 vezes com tampão de acoplamento e, em seguida, incubadas com tampão de bloqueio contendo 1 M de etanolamina no tampão de acoplamento durante 2 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, as esferas foram lavadas 4 vezes com uma combinação de pH baixo e pH alto e, finalmente, com solução salina tamponada com fosfato 1XPBS contendo 0,01% de azida de sódio. Seleção para identificar os aptâmeros da gelsolina recombinante e suas variantes:[0049] The proteins (bovine serum albumin (BSA) and gelsolin) were dialyzed against the buffer solution of 100mM NaHCO3, pH 9.0, and the concentration was estimated by measuring the absorbance at 280 nm. The cyanogen bromide (CNBr) activated resin was allowed to swell in 1 mM HCl for 15 minutes at room temperature and then equilibrated with coupling buffer (100 mM NaHCO3, pH 9.0). After equilibration, the resin was immediately transferred to the protein solution and incubated with shaking overnight at 4°C. The beads were collected by centrifugation at 2000 x g for 1 minute and the protein concentration of the supernatant was determined (should be 10-fold lower than that observed in step 1). The beads were washed 3-4 times with coupling buffer and then incubated with blocking buffer containing 1 M ethanolamine in the coupling buffer for 2 hours at room temperature. After incubation, the beads were washed 4 times with a combination of low pH and high pH and finally with 1XPBS phosphate buffered saline containing 0.01% sodium azide. Selection to identify recombinant gelsolin aptamers and their variants:

[0050] Resumidamente, uma biblioteca 2 nmol de 76 oligonucleotídeos b incluindo uma região de nucleotídeos aleatórios centrais de 30-mer (TriLink Biotechnologies, CA, EUA), o que representa 1018 sequências únicas, foi diluída em tampão de seleção (25 mM de Tris-HCl, pH 8, 150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 5 mM de MgCl2 e 10 mM de KCl e 0,01% de Tween 20) e incubada a 94°C durante 5 minutos e mantida em gelo durante 10 minutos, seguida por uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. O DNA foi, então, deixado para ligar-se à proteína alvo (GSN) conjugada a esferas de sefarose durante 1 hora à temperatura ambiente. O DNA resultante eluiu após a seleção ter sido purificada por extração com fenol-clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em 10 ul de TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8, 1 mM de EDTA). O DNA foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) em duas misturas de reação de 50 uL contendo 2,5 U de Taq DNA polimerase, 1X Taq tampão com (NH4)2SO4, 0,5 uM de ambos os iniciadores de seleção (SEQ ID Nos. 4 e 5), 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP e 2,5 ul de molde (template). As condições de amplificação foram de 2 minutos a 94°C; 15 ciclos de 10 segundos a 94°C, 10 segundos a 62°C, 10 segundos a 72°C; 2 minutos a 72°C. 90 uL de DNA amplificado foram submetidos primeiramente à seleção negativa por meio do uso de esferas de sefarose conjugadas com albumina de soro bovino (BSA) e depois incubados com esferas de conjugado de gelsolina, como anteriormente. Depois de dez ciclos deste método SELEX (Figura 1), a biblioteca enriquecida de aptâmeros foi subclonada por meio do uso de um kit de clonagem TOPO-TA (Invitrogen, Nova Iorque, EUA). Os aptâmeros subclonados foram submetidos a sequenciamento automático de DNA e os aptâmeros individuais foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR), como acima, para verificação da capacidade de ligação à gelsolina e suas variantes por meio de ensaios de ligação por microtitulação. EXEMPLO 2: Ensaio de ligação por microtitulação[0050] Briefly, a 2 nmol library of 76 b oligonucleotides including a 30-mer central random nucleotide region (TriLink Biotechnologies, CA, USA), representing 1018 unique sequences, was diluted in selection buffer (25 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 and 10 mM KCl and 0.01% Tween 20) and incubated at 94°C for 5 minutes and kept on ice for 10 minutes, followed by a 20-minute incubation at room temperature. The DNA was then left to bind to the target protein (GSN) conjugated to sepharose beads for 1 hour at room temperature. The resulting DNA eluted after selection was purified by phenol-chloroform extraction, ethanol precipitated, and resuspended in 10 μl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA). DNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) in two 50 uL reaction mixtures containing 2.5 U of Taq DNA polymerase, 1X Taq buffer with (NH4)2SO4, 0.5 uM of both selection primers (SEQ ID Nos. 4 and 5), 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP and 2.5 ul template. Amplification conditions were 2 minutes at 94°C; 15 cycles of 10 seconds at 94°C, 10 seconds at 62°C, 10 seconds at 72°C; 2 minutes at 72°C. 90 uL of amplified DNA was first subjected to negative selection using bovine serum albumin (BSA)-conjugated sepharose beads and then incubated with gelsolin-conjugated beads as before. After ten cycles of this SELEX method (Figure 1), the enriched aptamer library was subcloned using a TOPO-TA cloning kit (Invitrogen, New York, USA). The subcloned aptamers were subjected to automated DNA sequencing and individual aptamers were amplified by polymerase chain reaction (PCR), as above, to verify the binding capacity to gelsolin and its variants via microtiter binding assays. EXAMPLE 2: Microtiter binding assay

[0051] A capacidade de ligação dos aptâmeros aqui descritos (L26F, 10.10R, L16F e L24F) à gelsolina recombinante e suas metades N- e C-terminais [representadas pela SEQ ID No. 2 e 3, respectivamente] foi estimada por meio do uso do ensaio de ligação por microtitulação (Figura 2). (As sequências de ligação de aptâmeros à gelsolina são representadas pelas sequências SEQ ID Nos. 6 - 9.) Resumidamente, diferentes aptâmeros (100 nm) ou actina (100 nM) extraídos dos músculos de galinha (Peddada e outros, 2013) foram utilizados para revestir placas de ELISA de 96 poços em TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8, 1 mM de EDTA) suplementado com sulfato de amônio a 30% e 100 mM de tampão de NaHCO3, pH 9,2, respectivamente, durante a noite a 4°C. Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloqueados com 300 uL por poço de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente. Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e foram deixados para ligar-se a 100 nM de gelsolina diluída em tampão de seleção durante 2 horas à temperatura ambiente. Os poços foram então lavados quatro vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Tween 20 (PBS-T) a 0,1% e incubados com anticorpos anti-gelsolina durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-T e incubados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por detecção, por meio do uso de um substrato Ultra-TMB em uma etapa (Pierce, Rockford, EUA). As reações foram paradas com solução de parada (2 M de H2SO4), depois de a cor azul ter sido desenvolvida e a absorbância foi lida a 450 nm, por meio do uso de um leitor de microplacas. EXEMPLO 3: Determinação da afinidade dos aptâmeros para gelsolina[0051] The binding capacity of the aptamers described here (L26F, 10.10R, L16F and L24F) to recombinant gelsolin and its N- and C-terminal halves [represented by SEQ ID No. 2 and 3, respectively] was estimated using using the microtiter binding assay (Figure 2). (Aptamer binding sequences to gelsolin are represented by sequences SEQ ID Nos. 6 - 9.) Briefly, different aptamers (100 nm) or actin (100 nM) extracted from chicken muscles (Peddada et al., 2013) were used to coat 96-well ELISA plates in TE (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) supplemented with 30% ammonium sulfate and 100 mM NaHCO3 buffer, pH 9.2, respectively, for at night at 4°C. Wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and blocked with 300 uL per well of 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours at room temperature. The wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and were allowed to bind to 100 nM gelsolin diluted in selection buffer for 2 hours at room temperature. The wells were then washed four times with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween 20 (PBS-T) and incubated with anti-gelsolin antibodies overnight at 4°C. Plates were washed four times with PBS-T and incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies at room temperature for 30 minutes, followed by detection through the use of a one-step Ultra-TMB substrate (Pierce, Rockford, USA ). The reactions were stopped with stop solution (2 M H2SO4) after the blue color had developed and the absorbance was read at 450 nm using a microplate reader. EXAMPLE 3: Determination of the affinity of aptamers for gelsolin

[0052] Para determinar a afinidade de diferentes aptâmeros para gelsolina, 1 ug de estreptavidina foi revestida sobre um suporte por meio do uso de 100 mM de tampão NaHCO3 com um pH de 9,2 durante 10 a 12 horas a uma temperatura de 4 graus C. Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloqueados com albumina de soro bovino BSA) a 3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 2 horas, seguido por lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os aptâmeros, L26F (SEQ ID NO: 6), 10.10R (SEQ ID NO: 7), L16F (SEQ ID NO: 8) e L24F (SEQ ID NO: 9) foram imobilizados em uma variedade de concentrações de 100 nM-1,56 nM em placas ELISA com Tris-EDTA, pH 8 suplementado com 2M de NaCl durante 2 horas. Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de Tween 20 e foram deixados para ligar-se a 100 nM de gelsolina diluída em tampão de seleção durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de lavar, a gelsolina ligada foi detectada por meio do uso de anticorpos anti-gelsolina e anticorpos secundários por meio do uso de procedimentos padrão, conforme descrição acima. Usando o ajuste de curva não linear dos gráficos (Figura 3), a constante de dissociação, Kd, os valores de L26F, 10.10R, L16F e L24F para a ligação à gelsolina foram calculados como sendo 15,3, 7,2, 12,7 e 15,7 nM, respectivamente. Foram obtidos resultados semelhantes ao utilizar placas ELISA contendo superfície hidrófoba e/ou hidrófila, confirmando igual eficácia dos aptâmeros imobilizados para se ligarem à gelsolina e às suas variantes a partir da solução. EXEMPLO 4: Ligação de aptâmeros com gelsolina imobilizada[0052] To determine the affinity of different aptamers for gelsolin, 1 ug of streptavidin was coated on a support using 100 mM NaHCO3 buffer with a pH of 9.2 for 10 to 12 hours at a temperature of 4 degrees C. Wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours, followed by washing with phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours, followed by washing with phosphate-buffered saline (PBS). PBS). The aptamers, L26F (SEQ ID NO: 6), 10.10R (SEQ ID NO: 7), L16F (SEQ ID NO: 8) and L24F (SEQ ID NO: 9) were immobilized at a range of concentrations from 100 nM- 1.56 nM on ELISA plates with Tris-EDTA, pH 8 supplemented with 2M NaCl for 2 hours. The wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween 20 and were allowed to bind to 100 nM gelsolin diluted in selection buffer for 2 hours at room temperature. After washing, bound gelsolin was detected using anti-gelsolin antibodies and secondary antibodies using standard procedures as described above. Using nonlinear curve fitting of the graphs (Figure 3), the dissociation constant, Kd, L26F, 10.10R, L16F, and L24F values for gelsolin binding were calculated to be 15.3, 7.2, 12 .7 and 15.7 nM, respectively. Similar results were obtained when using ELISA plates containing a hydrophobic and/or hydrophilic surface, confirming equal effectiveness of the immobilized aptamers to bind to gelsolin and its variants from solution. EXAMPLE 4: Binding of aptamers with immobilized gelsolin

[0053] A gelsolina recombinante foi revestida a uma concentração de 1,56 nM sobre a placa ELISA em 100 mM de tampão NaHCO3, com pH 9,2 a 4°C, durante a noite. Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloqueados com 300 ul por poço de albumina de soro bovino (BSA) a 3% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente. Os poços foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e foram incubados com 50 nM de aptâmeros marcados com biotina e diluídos em tampão de seleção durante 2 horas à temperatura ambiente. Após a lavagem, os aptâmeros ligados foram detectados por meio do uso de estreptavidina-peroxidase de rábano, através de procedimentos padrão (Figura 4). EXEMPLO 5: Ligação de aptâmeros selecionados à sefarose e purificação de gelsolina[0053] Recombinant gelsolin was coated at a concentration of 1.56 nM on the ELISA plate in 100 mM NaHCO3 buffer, pH 9.2 at 4°C, overnight. Wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and blocked with 300 μl per well of 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours at room temperature. Wells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with 50 nM biotin-labeled aptamers diluted in selection buffer for 2 hours at room temperature. After washing, bound aptamers were detected using streptavidin-horseradish peroxidase using standard procedures (Figure 4). EXAMPLE 5: Binding of selected aptamers to sepharose and purification of gelsolin

[0054] Os aptâmeros selecionados foram ligados a esferas de sefarose CL-2B por meio do emprego de protocolos de acoplamento e ativação com brometo de cianogênio (CNBr) descritos anteriormente (Arndt-Jovin e outros, 1975; Kadonaga e Tjian, 1986). Resumidamente, as esferas de sefarose foram ativadas ou derivatizadas por meio do uso de brometo de cianogênio (CNBr) e depois lavadas com água gelada duplamente destilada e 10 mM de fosfato de potássio (pH 8) e oligos 5'-fosforilados foram adicionados a uma pasta espessa das esferas ativadas. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 14 horas e lavada com 1 M de fosfato de potássio (pH 8), 1 M de cloreto de potássio (KCl). Em seguida, as esferas foram lavadas com água, seguida de 10 mM de Tris-HCl (pH 8) contendo 300 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e 0,02% de azida de sódio. As esferas funcionalizadas foram armazenadas a 10°C no último tampão.[0054] The selected aptamers were linked to CL-2B sepharose beads using previously described cyanogen bromide (CNBr) coupling and activation protocols (Arndt-Jovin et al., 1975; Kadonaga and Tjian, 1986). Briefly, sepharose beads were activated or derivatized through the use of cyanogen bromide (CNBr) and then washed with ice-cold double distilled water and 10 mM potassium phosphate (pH 8) and 5'-phosphorylated oligos were added to a thick paste of activated spheres. The mixture was stirred at room temperature for 14 hours and washed with 1 M potassium phosphate (pH 8), 1 M potassium chloride (KCl). Then, the beads were washed with water, followed by 10 mM Tris-HCl (pH 8) containing 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 0.02% sodium azide. The functionalized beads were stored at 10°C in the last buffer.

[0055] Para os experimentos de purificação de gelsolina, a pasta de esferas foi vertida em uma coluna PD-10 e lavada com três volumes de coluna de 40 mM de tampão Tris, pH 8, contendo 100 mM de NaCl e 2 mM de EGTA. A esta coluna, foi adicionado o lisado celular com o pH ajustado a pH 8 e contendo 2 mM de EGTA. Após o carregamento inicial, a coluna foi lavada com 40 mM de tampão Tris com pH 8, contendo 100 mM de NaCl e 3 mM de CaCl2 (três volumes de coluna).[0055] For the gelsolin purification experiments, the bead slurry was poured onto a PD-10 column and washed with three column volumes of 40 mM Tris buffer, pH 8, containing 100 mM NaCl and 2 mM EGTA . To this column, cell lysate was added, pH adjusted to pH 8 and containing 2 mM EGTA. After initial loading, the column was washed with 40 mM pH 8 Tris buffer containing 100 mM NaCl and 3 mM CaCl2 (three column volumes).

[0056] Finalmente, a eluição foi realizada por meio da adição de 40 mM de tampão Tris com pH 8, contendo 300 mM de NaCl e 20 mM de CaCl2. Cada fração foi analisada quanto à presença de gelsolina. Os resultados (Figura 5) indicam que a gelsolina se liga à coluna de DNA imobilizado de forma eficiente e elui ao detectar níveis mais elevados de íons de Ca2+. As condições de eluição e carga final ainda estão sendo trabalhadas para ligar e purificar níveis muito mais elevados de gelsolina. Após a eluição da gelsolina, o DNA-Sefarose foi lavado com 40 mM de tampão acetato de sódio com pH 4, contendo 300 mM de NaCl. A coluna foi regenerada por lavagem com 40 mM de Tris com pH 8, contendo 100 mM de NaCl e 2 mM de EGTA, e um segundo ciclo do processo de purificação foi tentado. Após a lavagem das colunas com 0,8 M de NaCl e da lavagem das colunas com 10 x o volume de 40 mM do tampão Tris com pH 8 contendo 100 mM de NaCl e 2 mM de EGTA, cinco ciclos de purificação foram efetuados com pouca perda na eficiência na purificação da gelsolina sem marcação.[0056] Finally, elution was carried out by adding 40 mM Tris buffer with pH 8, containing 300 mM NaCl and 20 mM CaCl2. Each fraction was analyzed for the presence of gelsolin. The results (Figure 5) indicate that gelsolin binds to the immobilized DNA column efficiently and elutes upon detecting higher levels of Ca2+ ions. Elution and final loading conditions are still being worked on to bind and purify much higher levels of gelsolin. After gelsolin elution, the DNA-Sepharose was washed with 40 mM sodium acetate buffer at pH 4, containing 300 mM NaCl. The column was regenerated by washing with 40 mM Tris pH 8, containing 100 mM NaCl and 2 mM EGTA, and a second round of the purification process was attempted. After washing the columns with 0.8 M NaCl and washing the columns with 10 x volume of 40 mM Tris buffer pH 8 containing 100 mM NaCl and 2 mM EGTA, five cycles of purification were performed with little loss. in the efficiency of purifying unlabeled gelsolin.

[0057] Perfis de purificação semelhantes foram obtidos após a funcionalização dos aptâmeros reivindicados em outras matrizes, conforme testes em fluxo rápido de Agarose, Superdex, Sephadex, Sephacryl, Sephacryl. Exemplo 6: Aptâmeros selecionados ligam-se à gelsolina e não permitem que se ligue à proteína PrP causadora de príon.[0057] Similar purification profiles were obtained after the functionalization of the claimed aptamers in other matrices, according to rapid flow tests of Agarose, Superdex, Sephadex, Sephacryl, Sephacryl. Example 6: Selected aptamers bind to gelsolin and do not allow it to bind to the prion-causing PrP protein.

[0058] A gelsolina se liga à proteína PrP e acelera a formação de príon (trabalho não publicado). Usando a análise de dados estruturais e imunotransferência enzimática (Western Blot), confirmamos que a gelsolina se liga diretamente à proteína PrP. Mais tarde, observamos que os aptâmeros ligam-se à gelsolina (Figura 6) e não permite que ela se ligue à proteína Prp, bloqueando, assim, o papel da gelsolina na progressão da doença do príon. Nestas experiências, o ensaio ELISA foi realizado para verificar se a ligação do aptâmero (10.10R) à gelsolina pode inibir a interação da gelsolina com a proteína Prp. O anticorpo monoclonal contra a gelsolina foi revestido primeiro nos poços para imobilizar a gelsolina (2 ug/poço). Após lavagens, adicionou-se Prp e Aptâmero + Prp (mistura). Além disso, em alguns poços, foi adicionado aptâmero seguido de PrP, de modo que o aptâmero e a Prp em solução podem inibir competitivamente a sua interação com a gelsolina. A proteína Prp ligada foi detectada por meio do uso de anticorpo anti-Prp (de coelho; diluições de 1:1000), o qual foi detectado por anticorpo anti-IgG de coelho (1:3000). Como mencionado anteriormente, os valores de absorbância a 450 nm indicaram a extensão de Prp ligada e os resultados mostraram que o aptâmero 10.10R pode inibir a interação de gelsolina e Prp.[0058] Gelsolin binds to the PrP protein and accelerates prion formation (unpublished work). Using structural data analysis and enzyme immunoblotting (Western Blot), we confirmed that gelsolin directly binds to the PrP protein. Later, we observed that the aptamers bind to gelsolin (Figure 6) and do not allow it to bind to the Prp protein, thus blocking the role of gelsolin in the progression of prion disease. In these experiments, the ELISA assay was performed to verify whether the binding of the aptamer (10.10R) to gelsolin can inhibit the interaction of gelsolin with the Prp protein. Monoclonal antibody against gelsolin was first coated onto the wells to immobilize gelsolin (2 ug/well). After washing, Prp and Aptamer + Prp (mixture) were added. Furthermore, in some wells, aptamer was added followed by PrP, so that aptamer and Prp in solution can competitively inhibit its interaction with gelsolin. Bound Prp protein was detected using anti-Prp antibody (rabbit; dilutions of 1:1000), which was detected by anti-rabbit IgG antibody (1:3000). As mentioned previously, the absorbance values at 450 nm indicated the extent of bound Prp and the results showed that the 10.10R aptamer could inhibit the interaction of gelsolin and Prp.

ADVANTAGES OF THE INVENTION

[0059] Embora o uso de administração de gelsolina recombinante/seus fragmentos tenha sido reportado anteriormente para fins terapêuticos em condições de doença/saúde acompanhadas por hipogelsolinemia, nenhum método de diagnóstico ou estimativa de gelsolina confiável e produzível em massa está disponível para fins terapêuticos. Além disso, um protocolo eficiente para a produção em massa de gelsolina (particularmente para construções que faltam quaisquer marcações ou grupos para purificação em etapa mínima) ainda permanece um desafio. • Os aptâmeros de DNA desenvolvidos podem substituir a necessidade de anticorpos ou actina - trazendo custo-benefício e melhor reprodutibilidade nas etapas de produção e protocolo, sem qualquer perda de sensibilidade e especificidade. • O uso de aptâmeros imobilizados em material cromatográfico para purificar gelsolina (ou suas variantes), particularmente após a superprodução de gelsolina ou de suas variantes, terá substancial vantagem na purificação de gelsolina, sem quaisquer marcações de afinidade como histidina (his-tag), GST, MBP, etc. Atualmente, a purificação em etapa mínima de gelsolina sem marcação é conseguida por colunas formadas de anticorpos anti-gelsolina imobilizada. Outra metodologia envolve a precipitação da gelsolina à base de sulfato de amônio seguida pela sua ligação por afinidade em coluna de DEAE, mas este método requer de 4 a 5 etapas e sofre de uma perda significativa de proteína e tempo, durante a recuperação do estado precipitado. REFERÊNCIAS - Arndt-Jovin DJ, Jovin TM, Bahr W, Frischauf AM, Marquardt M (1975) Covalent attachment of DNA to agarose. Improved synthesis and use in affinity chromatography. European journal of biochemistry / FEBS 54: 411-418 - Ashish, Paine MS, Perryman PB, Yang L, Yin HL, Krueger JK (2007) Global structure changes associated with Ca2+ activation of full-length human plasma gelsolin. J Biol Chem 282: 25884-25892 - Bucki R, Byfield FJ, Kulakowska A, McCormick ME, Drozdowski W, Namiot Z, Hartung T, Janmey PA (2008) Extracellular gelsolin binds lipoteichoic acid and modulates cellular response to proinflammatory bacterial wall components. Journal of immunology 181: 4936-4944 - Bucki R, Georges PC, Espinassous Q, Funaki M, Pastore JJ, Chaby R, Janmey PA (2005) Inactivation of endotoxin by human plasma gelsolin. Biochemistry 44: 9590-9597 - Bucki R, Kulakowska A, Byfield FJ, Zendzian-Piotrowska M, Baranowski M, Marzec M, Winer JP, Ciccarelli NJ, Gorski J, Drozdowski W, Bittman R, Janmey PA (2010) Plasma gelsolin modulates cellular response to sphingosine 1- phosphate. American journal of physiology Cell physiology 299: C1516-1523 - Garg R, Peddada N, Sagar A, Nihalani D, Ashish (2011) Visual insight into how low pH alone can induce actin-severing ability in gelsolin under calcium-free conditions. J Biol Chem 286: 20387-20397 - Ito H, Kambe H, Kimura Y, Nakamura H, Hayashi E, Kishimoto T, Kishimoto S, Yamamoto H (1992) Depression of plasma gelsolin level during acute liver injury. Gastroenterology 102: 1686-1692 - Kadonaga JT, Tjian R (1986) Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83: 5889-5893 - Kwiatkowski DJ, Mehl R, Izumo S, Nadal-Ginard B, Yin HL (1988) Muscle is the major source of plasma gelsolin. The Journal of biological chemistry 263: 82398243 - Kwiatkowski DJ, Stossel TP, Orkin SH, Mole JE, Colten HR, Yin HL (1986) Plasma and cytoplasmic gelsolins are encoded by a single gene and contain a duplicated actin-binding domain. Nature 323: 455-458 - Lee PS, Waxman AB, Cotich KL, Chung SW, Perrella MA, Stossel TP (2007) Plasma gelsolin is a marker and therapeutic agent in animal sepsis. Crit Care Med 35: 849-855 - Lee WM, Galbraith RM (1992) The extracellular actin-scavenger system and actin toxicity. N Engl J Med 326: 1335-1341 - Lind SE, Janmey PA (1984) Human plasma gelsolin binds to fibronectin. J Biol Chem 259: 13262-13266 - Lind SE, Smith DB, Janmey PA, Stossel TP (1988) Depression of gelsolin levels and detection of gelsolin-actin complexes in plasma of patients with acute lung injury. Am Rev Respir Dis 138: 429-434 - Lofberg M, Paunio T, Tahtela R, Kiuru S, Somer H (1998) Serum gelsolin and rhabdomyolysis. J Neurol Sci 157: 187-190 - Osborn TM, Dahlgren C, Hartwig JH, Stossel TP (2007) Modifications of cellular responses to lysophosphatidic acid and platelet-activating factor by plasma gelsolin. American journal of physiology Cell physiology 292: C1323-1330 - Osborn TM, Verdrengh M, Stossel TP, Tarkowski A, Bokarewa M (2008) Decreased levels of the gelsolin plasma isoform in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis research & therapy 10: R117 - Pan W, Clawson GA (2009) The shorter the better: reducing fixed primer regions of oligonucleotide libraries for aptamer selection. Molecules 14: 1353-1369 - Peddada N, Sagar A, Ashish, Garg R (2012) Plasma gelsolin: a general prognostic marker of health. Med Hypotheses 78: 203-210 - Peddada N, Sagar A, Rathore YS, Choudhary V, Pattnaik UB, Khatri N, Garg R, Ashish (2013) Global shapes of F-actin depolymerization-competent minimal gelsolins: insight into the role of g2-g3 linker in pH/Ca2+ insensitivity of the first half. J Biol Chem 288: 28266-28282 - Smith DB, Janmey PA, Sherwood JA, Howard RJ, Lind SE (1988) Decreased plasma gelsolin levels in patients with Plasmodium falciparum malaria: a consequence of hemolysis? Blood 72: 214-218 - Suhler E, Lin W, Yin HL, Lee WM (1997) Decreased plasma gelsolin concentrations in acute liver failure, myocardial infarction, septic shock, and myonecrosis. Crit Care Med 25: 594-598 - Sun HQ, Yamamoto M, Mejillano M, Yin HL (1999) Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. The Journal of biological chemistry 274: 33179-33182 - Vouyiouklis DA, Brophy PJ (1997) A novel gelsolin isoform expressed by oligodendrocytes in the central nervous system. Journal of neurochemistry 69: 995-1005 - Wen D, Corina K, Chow EP, Miller S, Janmey PA, Pepinsky RB (1996) The plasma and cytoplasmic forms of human gelsolin differ in disulfide structure. Biochemistry 35: 9700-9709 - Yin HL, Kwiatkowski DJ, Mole JE, Cole FS (1984) Structure and biosynthesis of cytoplasmic and secreted variants of gelsolin. J Biol Chem 259: 5271-5276 - Yin HL, Stull JT (1999) Proteins that regulate dynamic actin remodeling in response to membrane signaling minireview series. The Journal of biological chemistry 274: 32529-32530 - Yu FX, Zhou DM, Yin HL (1991) Chimeric and truncated gCap39 elucidate the requirements for actin filament severing and end capping by the gelsolin family of proteins. J Biol Chem 266: 19269-19275[0059] Although the use of administration of recombinant gelsolin/its fragments has been previously reported for therapeutic purposes in disease/health conditions accompanied by hypogelsolinemia, no reliable and mass-producible gelsolin diagnostic or estimation method is available for therapeutic purposes. Furthermore, an efficient protocol for mass production of gelsolin (particularly for constructs lacking any tags or groups for minimal step purification) still remains a challenge. • The developed DNA aptamers can replace the need for antibodies or actin - bringing cost-benefit and better reproducibility in the production and protocol stages, without any loss of sensitivity and specificity. • The use of aptamers immobilized on chromatographic material to purify gelsolin (or its variants), particularly after overproduction of gelsolin or its variants, will have a substantial advantage in purifying gelsolin, without any affinity tags such as histidine (his-tag), GST, MBP, etc. Currently, minimal step purification of label-free gelsolin is achieved by columns formed from immobilized anti-gelsolin antibodies. Another methodology involves the precipitation of ammonium sulfate-based gelsolin followed by its affinity binding on a DEAE column, but this method requires 4 to 5 steps and suffers from a significant loss of protein and time during recovery from the precipitated state. . REFERENCES - Arndt-Jovin DJ, Jovin TM, Bahr W, Frischauf AM, Marquardt M (1975) Covalent attachment of DNA to agarose. Improved synthesis and use in affinity chromatography. European journal of biochemistry / FEBS 54: 411-418 - Ashish, Paine MS, Perryman PB, Yang L, Yin HL, Krueger JK (2007) Global structure changes associated with Ca2+ activation of full-length human plasma gelsolin. J Biol Chem 282: 25884-25892 - Bucki R, Byfield FJ, Kulakowska A, McCormick ME, Drozdowski W, Namiot Z, Hartung T, Janmey PA (2008) Extracellular gelsolin binds lipoteichoic acid and modulates cellular response to proinflammatory bacterial wall components. Journal of immunology 181: 4936-4944 - Bucki R, Georges PC, Espinassous Q, Funaki M, Pastore JJ, Chaby R, Janmey PA (2005) Inactivation of endotoxin by human plasma gelsolin. Biochemistry 44: 9590-9597 - Bucki R, Kulakowska A, Byfield FJ, Zendzian-Piotrowska M, Baranowski M, Marzec M, Winer JP, Ciccarelli NJ, Gorski J, Drozdowski W, Bittman R, Janmey PA (2010) Plasma gelsolin modulates cellular response to sphingosine 1-phosphate. American journal of physiology Cell physiology 299: C1516-1523 - Garg R, Peddada N, Sagar A, Nihalani D, Ashish (2011) Visual insight into how low pH alone can induce actin-severing ability in gelsolin under calcium-free conditions. J Biol Chem 286: 20387-20397 - Ito H, Kambe H, Kimura Y, Nakamura H, Hayashi E, Kishimoto T, Kishimoto S, Yamamoto H (1992) Depression of plasma gelsolin level during acute liver injury. Gastroenterology 102: 1686-1692 - Kadonaga JT, Tjian R (1986) Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. 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J Biol Chem 259: 13262-13266 - Lind SE, Smith DB, Janmey PA, Stossel TP (1988) Depression of gelsolin levels and detection of gelsolin-actin complexes in plasma of patients with acute lung injury. Am Rev Respir Dis 138:429-434 - Lofberg M, Paunio T, Tahtela R, Kiuru S, Somer H (1998) Serum gelsolin and rhabdomyolysis. J Neurol Sci 157:187-190 - Osborn TM, Dahlgren C, Hartwig JH, Stossel TP (2007) Modifications of cellular responses to lysophosphatidic acid and platelet-activating factor by plasma gelsolin. American journal of physiology Cell physiology 292: C1323-1330 - Osborn TM, Verdrengh M, Stossel TP, Tarkowski A, Bokarewa M (2008) Decreased levels of the plasma gelsolin isoform in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis research & therapy 10: R117 - Pan W, Clawson GA (2009) The shorter the better: reducing fixed primer regions of oligonucleotide libraries for aptamer selection. Molecules 14:1353-1369 - Peddada N, Sagar A, Ashish, Garg R (2012) Plasma gelsolin: a general prognostic marker of health. Med Hypotheses 78:203-210 - Peddada N, Sagar A, Rathore YS, Choudhary V, Pattnaik UB, Khatri N, Garg R, Ashish (2013) Global shapes of F-actin depolymerization-competent minimal gelsolins: insight into the role of g2-g3 linker in pH/Ca2+ insensitivity of the first half. J Biol Chem 288: 28266-28282 - Smith DB, Janmey PA, Sherwood JA, Howard RJ, Lind SE (1988) Decreased plasma gelsolin levels in patients with Plasmodium falciparum malaria: a consequence of hemolysis? Blood 72: 214-218 - Suhler E, Lin W, Yin HL, Lee WM (1997) Decreased plasma gelsolin concentrations in acute liver failure, myocardial infarction, septic shock, and myonecrosis. Crit Care Med 25: 594-598 - Sun HQ, Yamamoto M, Mejillano M, Yin HL (1999) Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. The Journal of biological chemistry 274: 33179-33182 - Vouyiouklis DA, Brophy PJ (1997) A novel gelsolin isoform expressed by oligodendrocytes in the central nervous system. Journal of neurochemistry 69: 995-1005 - Wen D, Corina K, Chow EP, Miller S, Janmey PA, Pepinsky RB (1996) The plasma and cytoplasmic forms of human gelsolin differ in disulfide structure. Biochemistry 35: 9700-9709 - Yin HL, Kwiatkowski DJ, Mole JE, Cole FS (1984) Structure and biosynthesis of cytoplasmic and secreted variants of gelsolin. J Biol Chem 259:5271–5276 - Yin HL, Stull JT (1999) Proteins that regulate dynamic actin remodeling in response to membrane signaling minireview series. The Journal of biological chemistry 274: 32529-32530 - Yu FX, Zhou DM, Yin HL (1991) Chimeric and truncated gCap39 elucidate the requirements for actin filament severity and end capping by the gelsolin family of proteins. J Biol Chem 266:19269–19275

Claims

1. DNA APTAMERS, characterized by the fact that they are represented by the sequences SEQ ID No. 6 to 9, capable of binding to a gelsolin protein represented by the sequence SEQ ID No. 1 or its variants represented by the sequences SEQ ID No. 2 and 3.

2. METHOD FOR QUANTIFYING GELSOLIN IN A SAMPLE, through the use of DNA aptamers as defined in claim 1, characterized by the fact that the steps comprise: [a] coating 1ug of streptavidin on a support, through the use of buffer solution consisting of 100 mM NaHCO3 with pH 9.2 for 10 to 12 hours at a temperature of 4°C; [b] wash the coated support from step [a] with phosphate-buffered saline (PBS) and block with 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours followed by washing with phosphate buffered saline (PBS); [c] immobilize 2 uM of the biotin-labeled aptamer on the support from step [b], selected from the sequence SEQ ID No: 6 to 9, through the use of TE buffer with pH 8 supplemented with 2M NaCl for 2 hours at temperature environment; [d] wash the coated support from step [c] twice with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20; [e] add gelsolin between 0.2 uM and 5 nM or a sample diluted in selection buffer containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) to the support obtained from step [d] and let it rest for 2 hours; [f] wash the coated support from step [e] four times with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 followed by the addition of anti-gelsolin antibodies and incubate for 10 to 12 hours at 4 °C; [g] wash the support obtained in step [f] four times with phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 followed by the addition of secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase and incubate for 1 hour and then add the substrate to horseradish peroxidase; and [h] finish the reaction of step [g] with 2M H2SO4 after the development of the blue color and measure the absorbance at 450 nm, in order to determine the amount of gelsolin present in the sample.

3. METHOD FOR QUANTIFYING GELSOLIN IN A SAMPLE, through the use of the aptamers defined in claim 1, characterized by the fact that the steps comprise: [a] coating anti-gelsolin antibodies on a support, through the use of the solution buffer consisting of 100 mM NaHCO3 with pH 9.2 for 10 to 12 hours at a temperature of 4°C; [b] wash the coated support from step [a] with phosphate-buffered saline (PBS) and block with 3% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 hours followed by washing with phosphate buffered saline (PBS); [c] add gelsolin between 0.2 uM and 5 nM or a sample diluted in phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) and 0.01% Tween-20 to the support obtained according to step [b] and leave to rest for 2 hours at room temperature; [d] wash the coated support from step [c] three times with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20; [e] add 1 uM of biotin-labeled aptamer, selected from sequences SEQ ID No: 6 to 9, diluted in selection buffer containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) to the support obtained according to step [d] and leave to rest for 2 hours. [f] wash the support obtained from step [e] four times with phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 followed by the addition of streptavidin conjugated with horseradish peroxidase and incubate for one hour and then add the substrate to horseradish peroxidase; and [g] finish the reaction in step [f] with 2M H2SO4 after the development of the blue color and measure the absorbance at 450 nm, in order to determine the amount of gelsolin present in the sample.

4. METHOD FOR PURIFYING GELSOLIN FROM A MIXTURE, through the use of the aptamers defined in claim 1, characterized by the fact that the steps comprise: [a] washing the activated sepharose beads with cyanogen bromide (CNBr) with ice-cold double distilled water and add 10 mM potassium phosphate (pH 8) and 5'-phosphorylated oligo aptamers selected from the sequence SEQ ID No: 6 to 9, to produce a thick paste of the activated spheres; [b] stir the paste obtained in step [a] at room temperature for 14 hours and wash with 1 M potassium phosphate (pH 8) containing 1 M potassium chloride (KCl); [c] wash the spheres obtained in step [b] with water, followed by resuspension in 10 mM Tris-HCl (pH 8) containing 300 mM NaCl and 1 mM EDTA; [d] pour the bead slurry obtained in step [c] onto a PD-10 column and wash with three column volumes of 40 mM Tris pH 8 buffer containing 100 mM NaCl and 2 mM EGTA; [e] add to the column obtained in step [d] a cell lysate containing gelsolin with pH adjusted to pH 8 and containing 2 mM EGTA; [f] wash the column from step [e] obtained after initial loading with three column volumes of 40 mM Tris buffer with pH 8 containing 100 mM NaCl and 3 mM CaCl2; [g] elute the bound gelsolin from the column in step [f], by adding 40 mM Tris buffer with pH 8, containing 300 mM NaCl and 20 mM CaCl2.