BR112017002083B1

BR112017002083B1 - Sistema de bioprocessamento para a fabricação de proteína de sangue

Info

Publication number: BR112017002083B1
Application number: BR112017002083-1A
Authority: BR
Inventors: Govind Rao; Yordan Kostov; Leah Tolosa; Kevin Tran; Manohar PILLI; Michael TOLOSA; Chandrashekar Gurramkonda
Original assignee: Govind Rao; Yordan KOSTOV; Leah Tolosa; Kevin TRAN; Manohar Pilli; Michael TOLOSA; Chandrashekar GURRAMKONDA
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2022-04-05
Also published as: EP3186355A2; WO2016019350A2; CA2956924C; EP3186355A4; CA2956924A1; US20170226467A1; WO2016019350A3; CN107406816B; CN107406816A; BR112017002083A2; MX2017001433A

Abstract

A presente invenção refere-se a um sistema de bioprocessamento para fabricar proteína de sangue humano que é compacto, integrado e adequado para produção sob demanda e aplicação de pro-teínas terapêuticas a pacientes. O sangue do próprio paciente pode ser utilizado como a fonte de extratos de célula para a produção das proteínas terapêuticas.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] Este pedido é uma continuação em parte do Pedido de Patente U.S. Número 13/823.911, depositado em 15 de março de 2013, o qual era o Estágio Nacional de Pedido Internacional Número PCT/US2012/028358, depositado em 08 de março de 2012, o qual reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. Número de Série 61/450.191, depositado em 08 de março de 2011. Este pedido também reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. Número de Série 62/031.484, depositado em 31 de julho de 2014. As descrições inteiras dos pedidos acima mencionados estão aqui incorporadas por referência.

1. CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se à fabricação de proteína e, mais especificamente, a um sistema de bioprocessamento integrado e compacto para a produção ou fabricação de proteínas terapêuticas utilizando sangue humano.

2. ANTECEDENTES DA TÉCNICA RELATIVA

[0003] O tempo que leva para um novo fármaco chegar ao mercado é de 8-10 anos a um custo que se aproxima de $12 bilhões. Muitas destas novas entidades de fármaco são referidas como biológicas (por exemplo, uma proteína utilizada como um fármaco ou terapêutico). Estas são moléculas produzidas por células vivas in vitro utilizando tecnologias de cultura de cédulas e fermentação. Um controle de processo estringente é requerido já que mudanças em condições de cultura podem levar a, por exemplo, perfis de glicosilação alterados, os quais podem então drasticamente mudar a farmacocinética, eficácia e imunogenicidade do fármaco. Portanto, muito esforço na direção de aprovação da FDA é devotado ao desenvolvimento de processos de fabricação documentados e robustos que produzirão biológicos seguros e eficazes de qualidade consistente. Estes são coletivamente referidos como bons processos de fabricação (GMP). O objetivo é chegar a um processo que seja bem definido e reprodutível, e que leva a produtos que atendem características predeterminadas de qualidade, identidade, pureza, segurança e eficácia.

[0004] Correntemente, as companhias estão desenvolvendo 907 biológicos que estão direcionados para mais de 100 doenças. Todos estes biológicos compartilham uma coisa em comum - estes são produzidos em uma instalação de fabricação centralizada com culturas de células vivas em grande escala (>10.000 litros), e com a necessária infraestrutura de grande volume de separação, purificação, formulação, embalagem, e distribuição (por exemplo, uma instalação típica da Merck, Pfizer ou Genentech). O período de tempo de um banco de células para o fornecimento final do frasco terapêutico está na ordem de 6-8 semanas sob condições ideais e produz lotes de aproximadamente 10 Kg de proteína bruta.

[0005] Como mostrado nas Figuras 1A e 1B, o próprio processo é complexo. A Figura 1A é um diagrama esquemático de um típico paradigma de fabricação utilizado por uma típica instalação de fabricação de biológico. Uma instalação de fabricação tal como esta é tipicamente encontrada em qualquer grande companhia farmacêutica / de biotecnologia e é correntemente o único meio de fazer proteínas terapêuticas. Tal instalação de fabricação custa diversas centenas de milhões de dólares para construir e leva aproximadamente dois anos para concessão.

[0006] A Figura 1B mostra um fluxograma típico para a fabricação de biológicos de proteína - tanto para proteínas que são expressas intracelularmente quanto proteínas expressas extracelularmente. Cada etapa precisa ser individualmente desenvolvida, escalada, otimizada, e validada em um ambiente de fabricação. O produto final também terá uma data de expiração e é despachado liofilizado ou através de uma cadeia fria, o que deve também ser documentado. É fácil ver porque a fabricação de proteína terapêutica não é uma tarefa trivial e ir da bancada para a clínica é um longo processo. A situação é pior se a doença for uma rara para a qual fármacos estão disponíveis, mas simplesmente não são aproveitáveis. Estes tipos de fármacos são designados como "fármacos órfãos" e carregam incentivos de modo que o setor privado as produzirá.

[0007] Consequentemente, existe uma necessidade crítica para uma tecnologia que possa rapidamente produzir anticorpos neutralizantes para doenças infecciosas. O sistema corrente para produzir tais anticorpos neutralizantes requer diversos meses, o que é insustentável, como os recentes surgimentos de H1N1, SARS e Ebola ilustraram. Além disso, a proposta corrente é inadequada para terapêuticos personalizados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] Um objetivo da invenção é resolver pelo menos os problemas e/ou desvantagens acima e prover pelo menos as vantagens daqui em diante descritas.

[0009] Portanto, um objetivo da presente invenção é prover um sistema de bioprocessamento integrado e compacto para a produção de proteínas.

[0010] Outro objetivo da presente invenção é prover um sistema de bioprocessamento integrado e compacto para a produção de proteínas do sangue humano.

[0011] Outro objetivo da presente invenção é prover um sistema de bioprocessamento integrado e portátil para a produção de proteínas.

[0012] Outro objetivo da presente invenção é prover um sistema de bioprocessamento integrado e portátil para a produção de proteínas do sangue humano.

[0013] Outro objetivo da presente invenção é prover um sistema de bioprocessamento integrado e compacto para expressão e purificação de proteína.

[0014] Outro objetivo da presente invenção é prover um sistema de bioprocessamento integrado e compacto para expressão e purificação de proteína do sangue humano.

[0015] Outro objetivo da presente invenção é prover um método para produção sob demanda e fornecimento de uma proteína terapêutica a um paciente.

[0016] Outro objetivo da presente invenção é prover um método para produção sob demanda de uma proteína terapêutica do sangue humano e fornecimento da proteína terapêutica a um paciente.

[0017] Outro objetivo da presente invenção é prover um método para produção sob demanda de uma proteína terapêutica do sangue de um paciente e fornecimento da proteína terapêutica para o paciente.

[0018] Para conseguir pelo menos os objetos acima, em todo ou em parte, está provido um sistema de bioprocessamento, que compreende um módulo de produção para produzir uma proteína de células extraídas do sangue e um módulo de purificação para receber a proteína do módulo de produção e para purificar a proteína de reagentes.

[0019] Para conseguir pelo menos os objetos acima, em todo ou em parte, está também provido um sistema para aplicar uma proteína terapêutica a um paciente, que compreende um módulo de extração de célula para extrair células do sangue obtido do paciente, um reator para expressão de proteína terapêutica utilizando as células extraídas do sangue do paciente e um módulo de purificação para receber a proteína do módulo de produção e para purificar a proteína de reagentes.

[0020] Vantagens, objetivos, e características adicionais da invenção serão apresentados em parte na descrição a qual segue e em parte ficarão aparentes para aqueles versados na técnica quando do exame do seguinte ou pode ser aprendida da prática da invenção. Os objetos e vantagens da invenção podem ser realizados e atingidos como especificamente destacado nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A invenção será descrita em detalhes com referência aos desenhos seguintes nos quais números de referência iguais referem- se a elementos iguais em que:

[0022] Figura 1A é um diagrama esquemático de um paradigma de fabricação típico utilizado por uma instalação de fabricação de biológico típica;

[0023] Figura 1B mostra um fluxograma típico para a fabricação de biológicos de proteína, tanto para proteínas que são expressas intracelularmente quanto para proteínas expressas extracelularmente;

[0024] Figura 2 é um diagrama de blocos que ilustra os princípios de operação de uma modalidade preferida da presente invenção;

[0025] Figura 3 é um diagrama esquemático de um sistema de bioprocessamento, de acordo com outra modalidade preferida da presente invenção;

[0026] Figura 4 é um diagrama esquemático de um sistema de bioprocessamento de microescala, de acordo com outra modalidade da presente invenção;

[0027] Figura 5 é uma vista esquemática lateral de um componente de cromatografia de membrana que pode ser utilizado nos sistemas das Figuras 3 e 4, de acordo com uma modalidade da presente invenção;

[0028] Figura 6A vista plana de topo de um componente de diafiltração microfluídico que pode ser utilizado nos sistemas das Figuras. 3 e 4, de acordo com uma modalidade da presente invenção;

[0029] Figura 6B vista em seção transversal esquemática da câmara de equilíbrio da Figura 6A olhando ao longo da linha de seção transversal A-A da Figura 6A;

[0030] Figura 6C é uma vista plana de fundo da câmara de equilíbrio da Figura 6A; e

[0031] Figura 7 é uma vista esquemática em perspectiva de outro componente de diafiltração microfluídico que pode ser utilizado em sistemas das Figuras 3 e 4, de acordo com uma modalidade da presente invenção;

[0032] Figura 8 é um diagrama que mostra as etapas principais em expressão de proteína in vivo, de acordo com uma modalidade da presente invenção;

[0033] Figura 9 é um diagrama de blocos de um módulo de extração de célula for extrair de células do sangue humano, de acordo com uma modalidade da presente invenção;

[0034] Figura 10 é um diagrama esquemático de um sistema de bioprocessamento para fabricar uma proteína terapêutica para um paciente diretamente do próprio sangue do paciente, de acordo com uma modalidade da presente invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES PREFERIDAS

[0035] A presente invenção está especificamente adequada para a fabricação sob demanda de proteínas terapêuticas (ou baseada em células ou livre de células) que são adequadas para aplicação direta a um paciente. Portanto, a presente invenção será primariamente descrita e ilustrada em conexão com a fabricação de proteínas terapêuticas. No entanto, a presente invenção pode também ser utilizada para fabricar qualquer tipo de proteína. Ainda, a presente invenção está especificamente adequada para a fabricação sob demanda de proteínas utilizando uma expressão livre de células, e assim a presente invenção será descrita primariamente no contexto de expressão de proteína livre de células. No entanto, a presente invenção pode ser utilizada em conexão com expressão de proteína baseado em células.

[0036] A Figura 2 é um diagrama de blocos que ilustra os princípios de operação de uma modalidade preferida da presente invenção. O sistema de bioprocessamento 100 inclui um módulo de produção 200, um módulo de purificação 300 e um módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 que estão fluidamente acoplados através componentes de acoplamento 500. Um processador 600 pode estar em comunicação elétrica com um ou mais do módulo de produção 200, módulo de purificação 300, componentes de acoplamento 500 e módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 para controlar e monitorar a operação do sistema 100.

[0037] O módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 está adaptado para armazenar as soluções necessárias para a produção de uma proteína. O módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 pode também incluir contentores para armazenar qualquer produto de refugo produzido durante a produção da proteína. O módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 pode ser de temperatura controlada, se necessário, para manter as soluções em uma temperatura requerida.

[0038] O módulo de produção 200 está adaptado para receber as soluções requeridas para a produção de uma proteína, tal como a proteína terapêutica, da câmara de armazenamento ; distribuição de fluido através dos componentes de acoplamento 500. O módulo de produção 200 pode adequadamente incluir um biorreator adaptado para manter células vivas que incorpora uma tecnologia de detecção ótica química não invasiva para monitorar os parâmetros de cultura (por exemplo, pH, oxigênio, densidade ótica, fluorescência, absorvência, redox, temperatura, etc.), tal como biorreatores e tecnologia de detecção ótica química ilustrados e descritos nas comumente atribuídas e relativas Patentes U.S. Números 6.673.532 e 7.041.493, as assim como a comumente atribuído e relativo Pedido de Patente Copendente Número 12/991.947, cujas descrições estão aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Estes tipos de biorreatores estão especificamente adequados para produção baseada em células de proteínas terapêuticas. Alternativamente, o módulo de produção 200 pode adequadamente incluir um minirreator agitado tal como, por exemplo, o BioGenie Minibioreactor vendido pela Scientific Bioprocessing, Inc., que está adaptado para a produção livre de células de uma proteína, e que também está equipado com sensores para monitorar os parâmetros de reação (por exemplo, pH, oxigênio, densidade ótica, fluorescência, absorvência, redox, temperatura, etc.).

[0039] Após a reação está completa, o produto bruto é então transferido para o módulo de purificação 300 através dos componentes de acoplamento 500. O módulo de purificação 300 contém os componentes de purificação necessários para purificar a proteína dos reagentes. O módulo de purificação 300 pode incluir, por exemplo, componentes de cromatografia e componentes de diálise para purificar o biológico. Os componentes de cromatografia podem ser qualquer tipo de componentes de cromatografia conhecidos na técnica, incluindo componentes de cromatografia de membrana e componentes de cromatografia de coluna.

[0040] O módulo de produção 200 e o módulo de purificação 300 podem cada um incluir sensores para monitorar os parâmetros de reação e/ou parâmetros de qualidade de produto. Os parâmetros monitorados podem incluir, mas não estão limitados a, condutividade, temperatura, pH, oxigênio e CO2. Os sensores podem ser qualquer tipo de sensor invasivo conhecido na técnica para monitorar estes parâmetros, onde os sensores estão em contado com o fluido de processo. Além disso, os sensores podem ser sensores óticos químicos não invasivos, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Números 6.673.532 e 7.041.493, e Pedido de Patente U.S. Número 12/991.947. Além disso, espectrômetros conhecido na técnica podem ser utilizados no módulo de produção 200 e/ou no módulo de purificação 300 para monitorar o fluxo de produto e/ou as entradas para cada módulo. Os parâmetros medidos por tais espectrômetros podem incluir, mas não estão limitados a, absorvência, fluorescência, dispersão de Raman, dicroísmo circular e características espectrais de infravermelho.

[0041] A Figura 3 é um diagrama esquemático de um sistema de bioprocessamento 700, de acordo com outra modalidade preferida da presente invenção. O sistema 700 está especificamente adequado para a produção livre de células de proteínas e será descrito neste contexto.

[0042] O sistema 700 inclui um reator 210, dentro do qual a expressão de proteína acontece, um componente de cromatografia 310, um componente de diafiltração 320 e um módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400. O reator 210 de preferência inclui um elemento de aquecimento e resfriamento 220, adequadamente um resfriador termoelétrico, para controlar a temperatura da solução 230 dentro do reator 210. O reator também de preferência inclui sensores 240 e 250 para monitorar os parâmetros na solução de reator 230, tal como pH, oxigênio, redox, condutividade ou qualquer outro parâmetro que possa ser medido com sensores existentes. Os sensores 240 e 250 podem ser implementados com qualquer tipo de sensor conhecido na técnica para medir os parâmetros desejados. No entanto, os sensores 240 e 250 são de preferência sensores óticos químicos não invasivos. Os componentes de cromatografia podem ser qualquer tipo de componentes de cromatografia conhecido na técnica, incluindo componentes de cromatografia de membrana e componentes de cromatografia de coluna.

[0043] O sistema 700 também inclui um processador 600 que está em comunicação com um ou mais do reator 210, optoeletrônica 270, componente de cromatografia de membrana 310, componente de diafiltração 320, módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 e bombas 520A e 520B para controlar e/ou monitorar a operação do sistema 700.

[0044] A optoeletrônica 270 está provida para excitar os sensores óticos químicos 240 e 250 com luz de excitação 242 e 244, respectivamente, e para receber e detectar luz de emissão 246 e 248 dos sensores óticos químicos 240 e 250, respectivamente. Como acima discutido, as comumente atribuídas e relativas Patentes U.S. Números 6.673.532 e 7.041.493, assim como comumente atribuído e relativo Pedido de Patente Copendente U.S. Número 12/991.947 descrevem em mais detalhes como a tecnologia de detecção ótica química não invasiva pode ser utilizada para monitor os parâmetros.

[0045] Na Figura 3, dois sensores óticos químicos 240 e 250 estão mostrados, e estão de preferência adaptados para medir pH e oxigênio dissolvido, respectivamente. No entanto qualquer número sensores óticos químicos (incluindo somente um) pode ser utilizado dependendo do número e tipo de parâmetros sendo medidos. A optoeletrônica 270 inclui fontes de excitação ótica (não mostradas) para gerar a luz de excitação 242 e 244, assim como fotodetectores (não mostrados) para detectar a luz de emissão 246 e 248 dos sensores óticos químicos 240 e 250. O tipo de fonte ou fontes de excitação ótica utilizadas na optoeletrônica 270 são casados com os tipos de sensores óticos químicos 240 e 250 utilizados no reator 210. Qualquer combinação de fontes de excitação ótica e sensores óticos químicos pode ser utilizada, dependendo do número e tipos de parâmetros sendo medidos. Exemplos de fontes de excitação ótica que podem ser utilizadas incluídas na optoeletrônica 270 incluem, mas não estão limitados a, diodos de emissão de luz e diodos de laser. Alternativamente, a optoeletrônica 270 pode apenas ser utilizada para medir as propriedades óticas do conteúdo de reator na sua totalidade ausente de quaisquer sensores.

[0046] Ainda, para cada sensor ótico químico 240 e 250, duas possíveis colocações no reator 210 estão mostradas. As duas possíveis colocações para o sensor ótico químico 240 estão mostradas como 240A e 240B. As duas possíveis colocações para o sensor ótico químico 250 estão mostradas como 250A e 250B.

[0047] Na colocação "A" (240A e 250A), os sensores óticos químicos 240A e 250A estão posicionados dentro do reator 210 sobre uma parede de reator 260. Com esta colocação, os sensores óticos químicos 240A e 250A estão em contato físico com a solução 230, e a parede de reator 260 sobre a qual os sensores óticos químicos 240A e 250A estão colocados é oticamente transparente para a luz de excitação 242 e 244, de modo que a luz de excitação possa alcançar os sensores óticos químicos 240A e 250A.

[0048] Na colocação "B" (240B e 250B), os sensores óticos químicos 240B e 250B estão posicionados fora do reator 210 sobre a parede de reator 260. Com esta colocação, a espessura da parede de reator 260 é suficientemente pequena de modo a permitir que os analitos que estão sendo medidos difundam através da parede de reator 260 e contactem os sensores óticos químicos 240B e 250B. Alternativamente, as porções da parede de reator 260 sobre a qual os sensores óticos químicos 240B e 250B estão presos podem ser substituídas por membranas de barreira 249A e 249B que estão adaptadas para permitir que os analitos sendo medidos difundam através destas de modo que estes entrem em contato com os sensores óticos químicos 240B e 250B. A utilização de membranas de barreira e paredes de reator finas para efetuar a difusão dos analitos de interesse através de uma parede de contentor para os sensores óticos químicos está descrita em mais detalhes no comumente atribuído e relativo Pedido de Patente U.S. Número 13/378.033, o qual está aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0049] Na modalidade da Figura 3, o módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 de preferência inclui um contentor de solução de tamponamento 410 para conter uma solução de tamponamento, um contentor de solução de mRNA/DNA 420 para conter uma solução de mRNA/DNA, um contentor de solução de reação 430 para conter uma solução de reação, um contentor de armazenamento de refugo 440 para conter uma solução de refugo e um contentor de armazenamento de produto 450 para conter a proteína purificada. Em operação, a solução de reação, a solução mRNA/DNA e a solução de tamponamento são direcionadas para reator 210 através de condutos 510A, 510B, 510C e bomba 520A.

[0050] Após a reação dentro do reator 210, o produto bruto é direcionado para o componente de cromatografia de membrana 310 através do conduto 510E e bomba 520B para purificação da proteína dos reagentes. O componente de cromatografia de membrana 310 pode adequadamente incluir um alojamento cilindricamente formado o qual contém camadas de membrana porosa (de preferência pelo menos 10 camadas de membrana porosa), onde as membranas individuais consistem em um polímero apropriado, tal como polimetacrilato, que foi quimicamente funcionalizado com um ligante, tal como um ligante de dietilaminoetila (DEAE), uma amina quaternária (Q), ou um carboximetila (CM) para o caso de cromatografia de troca de íons, ou um ligante de fenila ou butila para o caso de cromatografia de interação hidrofóbica, ou um ligante mercaptoetilpiridina (MEP) para o caso de cromatografia de modo misturado. Uma modalidade preferida do componente de cromatografia de membrana 310 será abaixo discutida em mais detalhes em conexão com a Figura 5. O refugo do processo de cromatografia de membrana é direcionado para o contentor de armazenamento de refugo 440 através do conduto 510F. O produto purificado é direcionado para o componente de diafiltração 320 para diálise através do conduto 510G e bomba 520C.

[0051] O componente de cromatografia de membrana 310 pode também incluir um ou mais sensores 312 para monitorar parâmetros de qualidade de produto, tal como condutividade, temperatura, pH, oxigênio, CO2, absorvência, fluorescência, Raman, dicroísmo circular e características espectrais de infravermelho. Os sensores 312 podem ser qualquer tipo de sensor invasivo ou não invasivo conhecido na técnica for para medir estes parâmetros incluindo mas não limitado a espectrômetros. Além disso, os sensores podem ser sensores óticos químicos não invasivos, tal como aqueles descritos nas Patentes U.S. Números 6.673.532 e 7.041.493, e Pedido de Patente U.S. Número 12/991.947. Além disso, o componente de cromatografia de membrana 310 de preferência inclui um elemento de aquecimento e resfriamento 314, adequadamente um resfriador termoelétrico, para controlar a temperatura da solução (produto bruto) dentro do componente de cromatografia de membrana 310.

[0052] O componente de diafiltração 320 pode adequadamente incluir uma membrana polimérica hidrofílica, tal como uma membrana de polietersulfona, celulósica, ou fluoreto de polivinilideno (PVDF) com uma estrutura de poros bem definida que gera um valor de corte de peso molecular desejado (MWCO) na faixa de 10k a 200k Da como apropriado para uma dada aplicação. A proteína final que sai do componente de diafiltração 320 é direcionada para o contentor de armazenamento de produto 450 através do conduto 510H. O produto de refugo produzido do processo de diálise no componente de diafiltração 320 é direcionado para o contentor de armazenamento de refugo 440 através do conduto 510I.

[0053] O componente de diafiltração 320 pode também incluir um ou mais sensores 322 para monitorar parâmetros de qualidade de produto, tal como condutividade, temperatura, pH, oxigênio, CO2, absorvência, fluorescência, Raman, dicroísmo circular e características espectrais de infravermelho. Os sensores 322 podem ser qualquer tipo de sensor invasivo ou não invasivo conhecido na técnica para medir estes parâmetros incluindo, mas não limitado a, espectrômetros. Além disso, os sensores podem ser sensores óticos químicos não invasivos, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Números 6.673.532 e 7.041.493, e Pedido de Patente U.S. Número 12/991.947.

[0054] Além disso, o componente de diafiltração 320 de preferência inclui um elemento de aquecimento e resfriamento 316, adequadamente um resfriador termoelétrico, para controlar a temperatura da solução (produto bruto) dentro do componente de cromatografia de membrana 320.

[0055] Além das bombas 520A, 520B e 520C, qualquer número de válvulas ou outros componentes hidráulicos, tal como bombas adicionais, podem ser utilizados através de todo o sistema 700 para ajudar a controlar o fluxo solução / produto entre os vários componentes do sistema 700.

[0056] A presente invenção está especificamente adequada para miniaturização utilizando microbombas e tecnologia microfluídica. A Figura 4 é um diagrama esquemático de um sistema de bioprocessamento de microescala 800, de acordo com outra modalidade da presente invenção. O sistema 800 inclui muitos dos mesmos componentes do sistema 700 da Figura 3, e elementos comuns estão identificados com números de elemento comuns.

[0057] O sistema 800 contém um módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 que inclui um contentor de solução de tamponamento 410 para conter uma solução de tamponamento, um contentor de solução de mRNA/DNA 420 para conter uma solução de mRNA/DNA, um reação contentor de solução de reação 430 para conter uma solução de reação, um contentor de armazenamento de refugo 440 para conter uma solução de refugo e um contentor de armazenamento de produto 450 para conter a proteína purificada. O sistema 800 também inclui um reator 210, um componente de cromatografia de membrana 310, um componente de diafiltração 820, um processador 600, sensores óticos químicos 840 escolhidos e posicionados para monitorar os parâmetros de qualidade de produto acabado, tal como, por exemplo, condutividade, redox, pH, espectro UV e concentração de proteína, e optoeletrônica 830 para prover luz de excitação ótica e for detectar luz de emissão dos sensores óticos químicos 840. A optoeletrônica 830 pode também apenas ser utilizada para medir as propriedades óticas do produto acabado ausente de quaisquer sensores.

[0058] O reator 210 pode ser de qualquer tamanho, mas na modalidade de microescala da Figura 4, este de preferência tem uma capacidade de volume menor do que aproximadamente 50 mililitros, e mais de preferência aproximadamente 20 mililitros ou menos, de modo a manter o sistema 800 relativamente compacto. O reator 210 pode ser implementado, por exemplo, com o sistema de minibiorreator BioGenie fabricado pela Scientific Bioprocessing, Inc.

[0059] Microbombas 850A e 850B e condutos 510A-510I direcionam a solução para os vários componentes em um modo similar às bombas 520A, 520B e condutos 510A-510I no sistema 700 da Figura 3. Apesar de não mostrado na Figura 4, o reator 210 contém sensores óticos químicos e optoeletrônica para monitorar parâmetros na solução de reator 230 em um modo similar ao sistema 700 da Figura 3. As microbombas 850A e 850B podem ser implementadas com qualquer tipo de microbomba conhecida na técnica tal como, por exemplo, a microbomba mp5 ou a microbomba mp6 fabricadas pela Bartels Mikrotechnik.

[0060] A tampa de alojamento 850 pode conter um display, tal como um display LCD 860, que conecta no processador 600 e que pode prover informações sobre o sistema 800, tal como, por exemplo, informações de diagnóstico, parâmetros de reação e/ou parâmetros de qualidade de produto acabado, tal como, por exemplo, condutividade, redox, pH, espectro UV e concentração de proteína.

[0061] O processador 600 nas Figuras 2, 3 e 4 pode ser implementado com um computador desktop de uso geral ou um computador laptop de uso geral. Além disso, o processador pode ser implementado com um computador tablet ou smartphone, tal como tablets e smartphones baseados em iOS Android. No entanto, o processador 600 pode também ser implementado com um computador de uso especial, microprocessador ou microcontrolador programado e elementos de circuito integrado periféricos, ASICs ou outros circuitos integrados, eletrônica ou circuitos lógicos com fio tal como circuitos de elemento discreto, dispositivos lógicos programáveis tais como FPGA, PLD, PLA ou PAL ou similares. Em geral, qualquer dispositivo sobre o qual uma máquina de estado finito capaz de executar um código para implementar a funcionalidade aqui descrita pode ser utilizado para implementar o processador 600.

[0062] A Figura 5 mostra um componente de cromatografia de membrana 310 que pode ser utilizado nos sistemas 700 e 800, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção. O componente de cromatografia de membrana 310 inclui um alojamento 2000 e camadas de membrana porosa 2010 (de preferência pelo menos 10 camadas de membrana porosa). Como acima discutido, as camadas de membrana porosa individuais 2010 de preferência consistem em um polímero apropriado, tal como polimetacrilato, que foi quimicamente funcionalizado com um ligante, tal como um ligante de dietilaminoetila (DEAE), amina quaternária (Q), ou carboximetila (CM) para o caso de cromatografia de troca de íons, ou um ligante de fenila ou butila para o caso de cromatografia de interação hidrofóbica, ou um ligante mercaptoetilpiridina (MEP) para o caso de cromatografia de modo misturado.

[0063] O componente de cromatografia de membrana 310 pode ser de qualquer tamanho, mas na modalidade de microescala da Figura 4, este de preferência tem uma capacidade de volume menor do que aproximadamente 100 mililitros, e mais de preferência menor do que aproximadamente 5 mililitros, de modo a manter o sistema 800 relativamente compacto. O componente de cromatografia de membrana 310 pode ser implementado, por exemplo, com um Sartobind® Q SingelSep Nano fabricado pela Sartorius Stedim Biotech, o qual tem um volume de leito de 1 ml e uma área de membrana de 36 cm2.

[0064] O produto bruto do reator 210 é misturado com uma solução de tamponamento de eluição através de uma válvula de três vias 2015, e a mistura entra no componente de cromatografia de membrana 310 através da entrada 2020. O produto purificado e refugo saem através da saída 2030. Uma válvula de três vias 2040 direciona o produto purificado para o componente de diafiltração 320/900/1100 e direciona o refugo para armazenamento de refugo 440.

[0065] As Figuras 6A-6C mostram um componente de diafiltração 900 que pode ser utilizado nos sistemas 700 e 800, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção. O componente de diafiltração 900 inclui seções de produto e tamponamento em forma de serpentina 910 e 920, respectivamente. O componente de diafiltração 900 das Figuras 6A-6C incluem uma seção de produto 910 que é um canal em forma de serpentina formado sobre um primeiro substrato 1000. Similarmente, a seção de tamponamento 920 é um canal formado sobre um segundo substrato 1010 com a mesma forma de serpentina que a seção de produto 910. Uma membrana de diafiltração 930 está sanduichada entre o primeiro e segundo substratos 1000 e 1010, de modo que os canais em forma de serpentina que formam as seções de produto e tamponamentos 910 e 920 substancialmente sobrepõem à outra. Os substratos 1000 e 1010 estão presos um no outro, com a membrana de diafiltração 930 sanduichada entre estes, como qualquer adesivo conhecido na técnica.

[0066] No componente de diafiltração 900 das Figuras 6A-6C, a solução de tamponamento de diafiltração flui através da seção de produto em forma de serpentina 920 e o produto purificado do componente de cromatografia de membrana 310 flui através da seção de produto em forma de serpentina 910. Uma difusão acontece da seção de produto 910 para a contraparte, seção de tamponamento 920 similarmente formada através da membrana de diafiltração 930.

[0067] O produto purificado do componente de cromatografia de membrana 310 entra na seção de produto 910 através do reservatório de tamponamento de entrada 1020 e da entrada 1030. O produto diafiltrado sai da seção de produto 910 através da saída 1040 e reservatório de tamponamento de saída 1050. O tamponamento de diafiltração entra na seção de tamponamento 920 através da entrada 1060 e sai da seção de tamponamento através da saída 1070. O tamponamento de diafiltração é escolhido para facilitar a transferência de componentes através da membrana de diafiltração 930, e poderia ser, por exemplo, ácido fosfórico 25 milimolar titulado para pH 7 com hidróxido de sódio, ou ácido cítrico 25 milimolar titulado para pH 5 com hidróxido de sódio.

[0068] Os reservatórios de tamponamento de entrada e saída 1020 e 1050 são opcionalmente utilizados de modo a amortecer o fluxo de oscilação para trás e para frente, se necessário. Uma solução de tamponamento simulada é de preferência adicionada ao produto diafiltrado através do reservatório de tamponamento de saída 1050 de modo a substituir o fluido que foi passado através da membrana de diafiltração 930 por um volume equivalente de um diferente tipo de tamponamento, por meio disto transferindo a proteína de interesse para o tamponamento simulado. Alternativamente, o volume do tamponamento simulado adicionado através do reservatório de tamponamento de saída 1050 pode ser menor do que o volume de fluido que passou através da membrana de diafiltração 930, em cujo caso o componente de diafiltração 900 executa tanto a troca de tamponamento quanto a concentração de proteína.

[0069] Como acima discutido, a membrana de diafiltração 930 pode adequadamente ser uma membrana polimérica hidrofílica, tal como uma membrana de polietersulfona, celulósica, ou fluoreto de polivinilideno (PVDF) com uma estrutura de poros bem definida que gera um valor de corte de peso molecular desejado (MWCO) na faixa de 10k a 200k Da como apropriado para uma dada aplicação.

[0070] A Figura 7 mostra um componente de diafiltração 1100 de acordo com outra modalidade da presente invenção. O componente de diafiltração 1100 pode ser utilizado no sistema 700 ou sistema 800 das Figuras 3 e 4, respectivamente. O componente de diafiltração 1100 inclui uma seção de tamponamento 1120, e uma seção de produto 1110 que compreende uma tubulação 1112 que é passada através da seção de tamponamento 1120. A tubulação 1112 que compõe a seção de produto 1110 pode ser qualquer tipo de tubulação conhecido na técnica que possa funcionar como uma membrana de diálise 1140 entre o produto 1115 na seção de produto 1110 e o tamponamento 1130 na seção de tamponamento 1120.

[0071] A tubulação 1112 é de preferência flexível de modo que uma maior quantidade de tubulação pode ser colocada dentro da seção de solvente 1120. Quando mais tubulação 1112 estiver presente dentro da seção de tamponamento 1120, mais difusão acontece entre a tubulação 1112 e o tamponamento 1130 devido á maior área de superfície de tubulação em contato com o tamponamento 1130. As porções de extremidade 1140 e 1150 do componente de diafiltração 1100 contêm aberturas 1160 para a tubulação 1112 entrar e sair do componente de diafiltração 1100. As porções de extremidade 1140 e 1150 também contêm uma entrada 1170 para receber a solução de tamponamento de diafiltração, e uma saída 1180 para expelir a solução de tamponamento de diafiltração usada (refugo). Apesar do componente de diafiltração 1100 ser mostrado como retangularmente formado, este pode ser de qualquer outra forma, tal como cilindricamente formado. Ainda, o componente de diafiltração 1100 pode adequadamente ser uma célula de fluxo que foi modificada para passar a tubulação 1112 através da seção de tamponamento 1120.

EXPRESSÃO LIVRE DE CÉLULAS DE PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE GLICOSE

[0072] Os sistemas e métodos da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, para a expressão e purificação livre de células de proteína de ligação de glicose (GBP). A glicose é uma principal fonte de carbono e energia no metabolismo celular do corpo animal e na indústria de bioprocesso. A glicose não é sempre benéfica em bioprocessos, está poderia também ser prejudicial em cultura bacteriana levando à autodestruição de células pela formação de acetato no ciclo Krebs e reduzindo o pH da cultura. Assim, uma rápida e eficiente de detecção de concentração de glicose é desejada.

[0073] A proteína de ligação de glicose é uma proteína a qual poderia ligar na glicose e servir este propósito atuando como um biossensor. A GBP é uma proteína periplásmica monomérica com peso molecular de 34 kD (quilo Dalton) e é sintetizada no citoplasma de E. coli. A GBP liga na glicose com alta afinidade e poderia ser utilizada como um biossensor de glicose. A expressão in vivo de GBP, a qual é também um método convencional de produção de proteína, é incômoda, dispendiosa e demorada. A presente invenção pode prover um sistema de expressão e purificação livre de células em uma pequena escala o qual poderia gerar miligramas de quantidade em poucas horas.

[0074] Um biossensor é um dispositivo analítico utilizado para a detecção de um analito que combina um componente biológico com um componente detector físico-químico. A GBP é tal biossensor, onde a GBP liga com glicose e a ligação é analisada utilizando intensidade de fluorescência e o sinal correspondente é comparado com o sinal de glicose padrão para estimar a concentração de amostras desconhecia. Utilizando os métodos in vivo convencionais, a GBP é expressa em E. coli (L255C), seguido por choque osmótico, purificada por coluna DEAE Sephadex A-50 e diálise utilizando uma membrana de 10 kD. Um método alternativo é a expressão livre de células, em que o maquinário celular é utilizado para a expressão de proteína e um número relativamente menor de operações de purificação a jusante é requerido para rapidamente produzir proteína desejada.

[0075] Em anos recentes, numerosas proteínas (12 a 135 kD) foram expressas em sistemas livres de células de E. coli e germe de trigo com o nível de expressão variando de poucas microgramas para poucas miligramas por mililitro em fluxo contínuo de modo de expressão livre de célula. Uma combinação de métodos de lote e troca contínua produziu a proteína até 6 mg/ml em extrato de E. coli S30 em uma pequena escala. Para todas estas expressões de proteína, reatores operando em diferentes modos foram estudados com uma membrana como uma parte integral do sistema, separando a mistura de reação e a solução de alimentação. Os reatores de fluxo contínuo são vantajosos em termos de pureza mais alta de proteínas, produtividade mais alta, expressão de proteína tóxica, computadorização e fácil controle da reação devido à ausência de uma barreira de parede de célula. Por outro lado, estes reatores também apresentam os desafios de complexidade e custos de reator mais altos, assim como um gerenciamento de solubilidade de produto de proteína.

[0076] Em outro estudo, a expressão de uma proteína de fusão que consiste em murina GM-CSF (fator estimulante de colônia macrofágica de granulocito) e um anticorpo scFv, em sistemas de reator tal como um filme fino, coluna de bolha e tubo Eppendorf sem membrana, foram estudados, produzindo proteína até >500 μg/ml de proteína com uma quantidade significativa de proteína precipitada (~50%). Recentemente, rhGM-CF foi expresso em um reator de tanque agitado de 100 L expressando proteína até 700 mg/L a qual foi subsequentemente purificada com resina DEAE, membrana de filtração de fluxo tangencial (corte de 3kD) e cromatografia de exclusão de tamanho Sephacryl S-100 com 99% de pureza e 65% de recuperação. A expressão livre de células não somente teve sucesso na expressão de proteínas bacterianas, mas também produziu com sucesso glicoproteínas como coriogonadotropina humana (hCG) e glicoproteína de envelope (gp 120) de vírus de imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) em extrato de célula hibridoma (HF10B4).

[0077] Para purificação de proteína, as pessoas se basearam em cromatografia de coluna tradicionalmente, mas em anos recentes a cromatografia de membrana emergiu como uma ajuda adicional neste campo, eliminando a cromatografia de coluna em etapas específicas como captura e polimento de proteína na etapa final com uma redução de custo total de até 65%. A cromatografia de coluna é ainda útil para purificação gradiente de proteínas, mas a cromatografia de membrana poderia também ser estudada confiando no fato que a etapa de eluição de proteína e remoção das impurezas poderia ser feita em diferentes condições de tamponamento.

[0078] A tabela abaixo compara os sistemas de expressão de proteína livre de células e in vivo.

BIOMOLÉCULAS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA

[0079] As seguintes biomoléculas são de preferência utilizadas para expressão de proteína. Para executar uma reação de expressão de proteína, componentes de energia e aminoácidos são supridos externamente: Um gabarito genético para a expressão de proteína alvo (mRNA ou DNA). Polimerases T7 RNA para transcrição de mRNA.

[0080] 9 Fatores de Translação (iniciação, elongação e terminação).

[0081] 20 Sintetases de aminoacil-tRNA (ARSes) para esterificação de um aminoácido específico para formar um aminoacil- tRNA.

[0082] Transformilase de metionil-tRNA transfere grupos de hidroximetila, formila.

[0083] Quinase de creatina converte ATP para ADP.

[0084] Mioquinase catalisa a interconversão de nucleotídeos de adenina.

[0085] Pirofosfatase são hidrolases de anidreto ácido que atuam sobre ligações de difosfato.

[0086] 4 Trifosfatos nucleosídeo (ATP,GTP,CTP,TTP) para formação de DNA.

[0087] Fosfato Creatina serve como uma reserva rapidamente mobilizável de fosfatos de alta energia.

[0088] 10-formil-5,6,7,8-tetra-hidrofolato importante na formilação de iniciador de metionila tRNA (fMet-tRNA).

[0089] 20 Aminoácidos para síntese de proteína.

[0090] Ribossomos para translação de polipeptídio.

[0091] 46 tRNAs em síntese de proteína.

[0092] Componentes Celulares os quais ajudam no dobramento de proteína apropriado.

MECANISMO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA EM SISTEMAS IN VIVO E LIVRE DE CÉLULAS

[0093] A proteína é expressa em três etapas principais que envolvem replicação, transcrição e translação, como mostrado na Figura 8. Com referência à etapa de replicação, os esquemas para as proteínas estão armazenados no DNA da célula. O DNA multiplica para fazer múltiplas cópias por um processo denominado replicação. A polimerase de DNA é uma enzima que sintetiza um novo DNA adicionando novos nucleotídeos juntamente com outras proteínas as quais estão associadas com a bifurcação e ajudam na continuação de síntese de DNA.

[0094] A transcrição ocorre em três etapas tanto em procariotas e eucariotas: Iniciação, Elongação e Terminação. A iniciação de transcrição ocorre quando o DNA de cordão duplo é desenrolado para permitir a ligação de polimerase de RNA. Uma vez que a transcrição é iniciada a polimerase de RNA é liberada do DNA. A transcrição é regulada em vários níveis por ativadores e repressores, e também por estrutura de cromatina em eucariotas.

[0095] Em procariotas, nenhuma modificação pós-transcricional especial de mRNA é requerida. No entanto, em eucariotas, o mRNA é adicionalmente processado para remover íntrons (divisão), para adicionar uma 'capa' (M7 metil-guanosina) na extremidade 5' e adicionar múltiplos ribonucleotídeos de adenosina na extremidade 3' de mRNA para gerar uma cauda poli(A) tail. O mRNA modificado é então transladado.

[0096] A translação ou síntese de proteína é também um processo de múltiplas etapas com etapas de Iniciação, Elongação e Terminação e é similar em tanto procariotas e eucariotas. O processo requer componentes celulares tal como ribossomos, RNAs de transferência (tRNA), mRNA e fatores de proteína assim como pequenas moléculas como aminoácidos, ATP, GTP e outros cofatores.

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA LIVRE DE CÉLULAS DA PERSPECTIVA DE UM ENGENHEIRO

[0097] Um extrato de célula é preparado após a dissolução de célula e remoção da parede de célula. A proteína poderia ser sintetizada utilizando um gabarito de DNA ou mRNA adicionando no extrato de célula. Quando o DNA é utilizado como gabarito (isto é, reação ligada), este primeiro transcreve para mRNA na presença de mistura de translação e a proteína é expressa. Alternativamente o mRNA poderia também ser utilizado para este propósito. Outro modo de expressão de proteína é a reação acoplada onde as reações de transcrição e translação são executada no mesmo tubo com todos os componentes necessários para ambas as reações. Em cada caso, o mRNA é finalmente transladado nos extratos de célula sem a necessidade para purificação da mensagem.

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE GBP CONVENCIONAL E NÃO CONVENCIONAL

[0098] No método convencional, a GBP é produzida em múltiplas etapas como pré-inoculação de mutantes de E. coli (L225C) em caldo Luria Bertani (LB), cultivação, colheita, lavagem de célula, choque osmótico, identificação, cromatografia líquida e diálise. Todas estas etapas são demoradas (aproximadamente 4 dias) e incômodas. A presente invenção permite uma expressão livre de células não convencional de GBP onde a expressão é mais rápida e a proteína resultante é relativamente pura. Esta proteína seria de preferência identificada utilizando um fluoróforo denominado acrilodan (6-Acriloil- 2dimetilaminonaftaleno) e purificada por membrana de cromatografia D15 (DEAE). A proteína de preferência seria adicionalmente concentrada e dialisada contra 5mM tris-HCl, pH 7,5.

SANGUE HUMANO COMO A FONTE DE EXTRATOS DE CÉLULA

[0099] Em uma modalidade da presente invenção, o sangue humano é utilizado como a fonte de extratos de célula para a fabricação de proteínas terapêuticas utilizando os sistemas acima descritos e ilustrados nas Figuras 2-7. O coletamento / deposição / transfusão de sangue é uma prática bem estabelecida, segura. Uma estimativa de 5 milhões de Americanos recebem transfusões de sangue cada ano e existe uma vasta infraestrutura instalada para colher, processar, armazenar e distribuir sangue. Esta infraestrutura pode ser alavancada e utilizada como uma fonte de extratos de célula para fabricação de proteína terapêutica.

[00100] A maior parte das células no sangue são eritrócitos, os quais convenientemente não têm núcleo. Aproximadamente 0,5-2% de todas as células são reticulócitos, os quais são células de sangue imaturas que são ricas em RNA ribossomal. Outras células (isto é., linfócitos) podem também ser utilizadas para a produção de extratos de célula. A fonte de sangue pode ser um sangue de doador classificado que é rotineiramente utilizado para transfusões. No entanto, os extratos de célula são de preferência obtidos do sangue do paciente que estará recebendo a proteína terapêutica produzida. O sangue extraído do paciente é de preferência combinado com a proteína terapêutica que é produzida do sangue extraído, o qual é então injetado de volta no paciente com pouca ou nenhuma resposta imune.

[00101] Como os extratos de célula utilizados para fabricar a proteína terapêutica vêm do paciente, as aprovações regulatórias para injetar as proteínas terapêuticas de volta no paciente serão muito mais simples de obter. Mais ainda, as transfusões de sangue são correntemente consideradas como uma prática extremamente segura devido ao sucesso de classificação e processamento de componentes de sangue. O sangue é continuamente reciclado dentro do corpo e partido, assim a reintrodução de componentes de sangue fracionados de volta no corpo deve ser segura.

[00102] Tal proposta remove completamente a economia da equação já que o medicamento específico de paciente pode ser produzido ao mesmo custo, independentemente se, por exemplo, o produto final for insulina, um fator de coagulação ou um fármaco órfão. Tudo o que é necessário é o cDNA para proteína terapêutica desejada. O cDNA de genoma humano inteiro é prontamente disponível.

[00103] Possibilidades excitantes podem ser prontamente tentadas com muito pouco risco de segurança. Por exemplo, documentos recentes sugerem que o sangue de rato jovem tem proteínas que aliviam os sintomas de envelhecimento e do mal de Alzheimer quando injetado em ratos mais velhos. Uma única proteína, GDF11 aparece para aumentar a resistência. Com os sistemas e métodos da presente invenção, pode-se agora simplesmente utilizar o extrato de sangue de um paciente mais velho e produzir proteínas de "fonte da juventude" neste e avaliar a eficácia. Este é apenas um exemplo de várias tentativas clínicas que podem ser tentadas, e está em contraste pronunciado com as células tronco e outros medicamentos regenerativos e propostas de terapia de genes onde tem-se limitações em controlar o destino das células transplantadas.

[00104] No caso de um desastre natural ou criado pelo homem, confiar em um paradigma de fabricação de fármaco / vacina centralizado é uma séria vulnerabilidade para a saúde pública. A presente invenção permitirá hospitais, clínicas e eventualmente os próprios pacientes fazer seus próprios medicamentos.

[00105] A Figura 9 é um diagrama de blocos de um módulo de extração de célula 3000 para extrair de células do sangue humano. As células extraídas podem então ser utilizadas pelo sistema 100 (Figura 2), sistema 700 e/ou sistema 800 para fabricar uma proteína terapêutica utilizando células extraídas do sangue humano. As células extraídas podem ser adequadamente alojadas no módulo de armazenamento / distribuição de fluido 400 em qualquer dos sistemas 100/700/800.

[00106] O módulo de extração de célula 3000 inclui um separador de sangue integral 3100 e um módulo de dissolução de célula de sangue 3200. O separador de sangue integral pode ser adequadamente implementado com a utilização de um simples tubo de coletamento (quando deixado parado dentro de um tubo, o sangue separará por gravidade) ou com a utilização de uma centrífuga para acelerar o processo. Geralmente, quaisquer técnicas conhecidas para fracionamento de sangue podem ser utilizadas e implementadas pelo separador de sangue integral 3100. O módulo de dissolução de célula de sangue integral pode ser adequadamente implementado utilizando dispositivos que aplicam um choque mecânico, osmótico ou de alta pressão nas células, eletroporação, ou utilização de tamponamentos de dissolução ou outros métodos para destruir a parede de célula sem afetar as proteínas dentro da célula. Geralmente, quaisquer técnicas conhecidas para dissolução das células do sangue podem ser implementadas pelo módulo de dissolução de célula de sangue integral 3200.

[00107] Em operação, o separador de sangue integral recebe o sangue integral 3150 e fraciona o sangue. Uma ou mais frações de célula de sangue que serão utilizadas para fabricar a proteína terapêutica 3300 (por exemplo, eritrócitos, reticulócitos e/ou linfócitos) são coletadas enviadas para o módulo de dissolução de célula de sangue 3200. É importante coletar células que sejam altamente metabolicamente ativas, já que isto aumentará a produtividade do lisado de célula. O plasma separado e frações não utilizadas 3400 (isto é, células vermelhas do sangue) são de preferência armazenados para recombinar com a proteína terapêutica que é fabricada pelo sistema 100/700/800 antes de injetar em um paciente. O retorno do plasma e das células vermelhas do sangue prevenirá a necessidade de transfusões do sangue, as quais podem ser requeridas para completar o sangue retirado no caso onde um grande número de células metabolicamente ativas precisam ser cultivadas.

[00108] O módulo de dissolução de célula de sangue 3200 utiliza um reagente de dissolução 3500, adequadamente um reagente de dissolução EDTA para dissolver as uma ou mais frações de sangue que serão utilizadas pelo sistema 100/700/800 para fabricar a proteína terapêutica. O lisado 3600 produzido pelo módulo de dissolução de célula de sangue 3200 é sujeito à remoção dos núcleos das células e todas as outras etapas requeridas na produção de um lisado livre de células, e então enviado para o sistema 100/700/800 para utilização na fabricação de uma proteína terapêutica utilizando os métodos acima descritos. O sangue utilizado para extrair as células necessárias para a fabricação de proteína terapêutica é de preferência obtido do paciente no qual a proteína fabricada será utilizada. Deste modo, todo o DNA e proteínas celulares remanescentes no lisado estão vindo do paciente, o que remove a possibilidade de reações imunes e grandemente simplifica os procedimentos de purificação.

[00109] A Figura 10 é um diagrama esquemático do sistema de bioprocessamento 4000 para fabricar uma proteína terapêutica para um paciente diretamente do próprio sangue do paciente. A produção de proteína terapêutica é executada pelo módulo de produção de proteína 4500 em um modo similar aos sistemas 100, 700 e 800 acima, exceto que a fonte de extratos de célula para a produção de proteína vem do próprio sangue do paciente utilizando um separador de sangue integral 3100 e o módulo de dissolução de célula de sangue 3200, os quais estão acima descritos em conexão com a Figura 9.

[00110] O sistema 4000 também inclui uma bolsa / reservatório de coletamento 4400 para o sangue, o qual atua como um contentor de contenção para o sangue integral que chega, assim como um contentor de solução de lavagem 4310 para conter uma solução de lavagem utilizada pelo separador de sangue integral 3100, um contentor de plasma 4320 para conter plasma e frações de sangue não utilizadas 3400 emitidas pelo separador de sangue integral 3100, um contentor de reagente de dissolução 4330 para conter o reagente de dissolução utilizado pelo módulo de dissolução de célula de sangue 3200, um contentor de solução de reação 4340 para conter a solução de reação utilizada pelo módulo de produção de proteína 4500 e um contentor de tamponamento 4350 para conter uma solução de tamponamento utilizada pelo módulo de produção de proteína 4500. O módulo de produção de proteína 4500 também inclui uma porta de DNA 4600 para introdução da sequência de DNA que codifica a proteína terapêutica a ser produzida.

[00111] Múltiplas bombas 4100A-4100G e condutos 4200 são utilizados para fluidamente conectar os vários componentes do sistema 4000 como mostrado na Figura 10. Em operação, o sangue integral de um paciente é transportado para o separador de sangue integral 3100, o qual fraciona o sangue. As uma ou mais frações de sangue que serão utilizadas para a produção de proteína são enviadas para o módulo de dissolução de célula de sangue 3200 para dissolver as uma ou mais frações de sangue que serão utilizadas pelo módulo de produção de proteína 4500 para fabricar a proteína terapêutica. O reagente de dissolução utilizado pelo módulo de dissolução de célula de sangue 3200 é adequadamente um reagente de dissolução EDTA que é retirado do contentor de reagente de dissolução 4330. O plasma e as frações de sangue não utilizadas são armazenados no contentor de plasma 4320.

[00112] A proteína terapêutica que é produzida pelo módulo de produção de proteína 4500 é misturada com o plasma e frações de sangue na utilizadas armazenados no contentor de plasma 4320 através do acoplador 4700, e então reinjetada no paciente. Apesar do sistema 4000 ser apresentado e descrito como conectado a um paciente de modo a colher o sangue integral diretamente do paciente e injetar o paciente com a proteína terapêutica produzida pelo módulo de produção de proteína 4500 (misturada com plasma e frações não utilizadas do contentor de plasma 4320), deve ser apreciado que o sistema 4000 não precisa estar conectado no paciente. O sangue integral poderia ser obtido do paciente e colocado dentro de um contentor, o qual é então enviado para o separador de sangue integral 3100 para iniciar o processo. Similarmente, a proteína terapêutica produzida pelo módulo de produção de proteína 4500 poderia ser armazenada em um contentor antes de sua utilização no paciente que proveu o sangue integral, ou outro paciente.

[00113] Além das bombas 4100A-4100G, qualquer número de outros componentes hidráulicos, tal como bombas adicionais, válvulas, acopladores, etc. podem ser utilizados através do sistema 4000 para ajudar a controlar o fluxo de solução / produto entre os vários componentes do sistema 4000. As várias bombas 4100A-4100G podem adequadamente ser implementadas com uma bomba MP-6 (uma bomba piezoelétrica, disponível da Bartels Mikrotechnik, Germany), uma bomba N-1000 (uma bomba de seringa, disponível da New Era Pump Systems, NY, USA), no entanto qualquer tipo de bomba adequada conhecida na técnica pode ser utilizado. Os condutos 4200 são adequadamente implementados com uma tubulação feita de Tygon ou outro material plástico adequado.

[00114] As modalidades e vantagens acima são meramente exemplares, e não devem ser consideradas como limitando a presente invenção. O presente ensinamento pode ser prontamente aplicado a outros tipos de aparelho. A descrição da presente invenção pretende ser ilustrativa, e não limitar o escopo das reivindicações. Muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles versados na técnica. Várias mudanças podem ser feitas sem afastar do espírito e escopo da invenção, como definidos nas reivindicações seguintes.

Claims

1. Sistema de bioprocessamento para a fabricação de proteína de sangue, caracterizado pelo fato de que compreende: um separador de sangue integral (3100) para receber sangue integral e produzir pelo menos uma fração de sangue (3300), em que a pelo menos uma fração de sangue (3300) compreende pelo menos um dentre eritrócitos, reticulócitos e linfócitos; um módulo de dissolução de célula de sangue (3200) para receber e dissolver a pelo menos uma fração de sangue (3300) do separador de sangue integral (3100) e produzir um lisado (3600); um biorreator (210) adaptado para manter células vivas, para receber o lisado (3600) e produzir uma proteína desejada do lisado por meio de expressão de proteína utilizando cDNA para a proteína desejada; e um componente de cromatografia (310) para receber a proteína do reator e produzir a proteína purificada.

2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o reator (210) tem uma capacidade de 20 ml ou menos.

3. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: um componente de diafiltração (900, 1100) para receber a proteína purificada do componente de cromatografia (310) e para produzir proteína purificada adicional.

4. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de cromatografia (310) compreende um componente de cromatografia de membrana.

5. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de cromatografia (310) compreende um componente de cromatografia de coluna.

6. Sistema de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o componente de diafiltração (900) compreende: um primeiro substrato (1000); um primeiro canal em forma de serpentina (910) formado no primeiro substrato (1000); um segundo substrato (1010); um segundo canal em forma de serpentina (920) formado no segundo substrato (1010); e uma membrana de diafiltração (930) posicionada entre o primeiro (1000) e segundo (1010) substratos, em que o primeiro (1000) e segundo (1010) substratos são alinhados de tal forma que o primeiro (910) e segundo (920) canais em forma de serpentina substancialmente se sobrepõem um ao outro.

7. Sistema de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o componente de diafiltração (1100) compreende: uma célula de fluxo (1100); e uma tubulação (1112) posicionada dentro da célula de fluxo (1100), em que o material da tubulação (1112) funciona como uma membrana de diafiltração.

8. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende uma proteína terapêutica e em que o sangue total é obtido do paciente no qual a proteína terapêutica será utilizada.