BR112016023342B1

BR112016023342B1 - MICROORGANISM PRODUCING O-SUCCYNYLHOMOSERINE AND METHOD FOR PRODUCING O-SUCCYNYLHOMOSERINE USING THE SAME

Info

Publication number: BR112016023342B1
Application number: BR112016023342-5A
Authority: BR
Inventors: Su Jin Choi; Kuk Ki Hong; Young Lyeol Yang; Min Sun Kang; Hye Min Park; Gyuhyeon SONG; Jong Hyun Yoon
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2023-07-18

Abstract

O-SUCCINILHOMOSSERINA PRODUZINDO MICRORGANISMO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE O-SUCCINILHOMOSSERINA UTILIZANDO O MESMO São proporcionados microrganismos do gênero Escherichia para a produção de O-succinilhomosserina e um método para a produção de O-succinilhomosserina usando o mesmo.O-SUCCYNYLHOMOSERINE PRODUCING MICROORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING O-SUCCYNYLHOMOSERINE USING THE SAME Microorganisms of the genus Escherichia for producing O-succinylhomoserine and a method for producing O-succinylhomoserine using the same are provided.

Description

TECHNICAL FIELD

[001] A presente invenção refere-se a um microrganismo produzindo O-succinilhomosserina e um método para produção de O-succinilhomosserina usando o mesmo.[001] The present invention relates to a microorganism producing O-succinylhomoserine and a method for producing O-succinylhomoserine using the same.

PREVIOUS TECHNIQUE

[002] O-succinilhomosserina é produzida por ligação de homosserina e um grupo succinil de succinil CoA em uma via biossintética. Por conseguinte, no desenvolvimento de uma cepa produzindo O-succinilhomosserina com um alto rendimento, a produção de homosserina e succinil CoA é importante. Destes, succinil-CoA é produzido no ciclo de TCA, e, portanto, aumento do ciclo de TCA é necessário para a produção de alta concentração de succinil CoA.[002] O-succinylhomosserine is produced by linking homoserine and a succinyl group of succinyl CoA in a biosynthetic pathway. Therefore, in developing a strain producing O-succinylhomoserine in a high yield, the production of homoserine and succinyl CoA is important. Of these, succinyl-CoA is produced in the TCA cycle, and therefore, increased TCA cycle is necessary for the production of high concentration of succinyl CoA.

[003] A via de pentose fosfato (PPP) é bem conhecida como uma fonte principal de NADPH, e as vias biossintéticas de aminoácidos requerem um cofator NADPH. Portanto, para melhorar a via de pentose fosfato no desenvolvimento de cepas produzindo aminoácidos, gene zwf que codifica a glicose 6-fosfato-1-desidrogenase envolvida em uma etapa da via é geralmente aumentado, e estas cepas são descritas nas Publicações de Patente Coreana de Números 2008-0036608 e 2006-0129352.[003] The pentose phosphate pathway (PPP) is well known as a main source of NADPH, and amino acid biosynthetic pathways require an NADPH cofactor. Therefore, to improve the pentose phosphate pathway in developing strains producing amino acids, zwf gene encoding glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase involved in one step of the pathway is generally increased, and these strains are described in the Korean Patent Publications of Numbers 2008-0036608 and 2006-0129352.

[004] Quando a expressão do gene zwf ou a atividade de uma enzima codificada por esta é atenuada, via de pentose fosfato é atenuada, conduzindo a uma falta de fornecimento de NADPH. Neste caso, NADPH, pode ser parcialmente reposta por sobre-expressão de isocitrato de desidrogenase (icd) e malato de desidrogenase (mae) do ciclo de TCA (Appl Microbiol Biotechnol. 2004 64(1); 91-8, Metab Eng. 2004 6(2); 164-74, FEBS Letters 581 2007 3771-6).[004] When the expression of the zwf gene or the activity of an enzyme encoded by it is attenuated, the pentose phosphate pathway is attenuated, leading to a lack of supply of NADPH. In this case, NADPH can be partially replenished by overexpression of isocitrate dehydrogenase (icd) and malate dehydrogenase (mae) from the TCA cycle (Appl Microbiol Biotechnol. 2004 64(1); 91-8, Metab Eng. 2004 6(2); 164-74, FEBS Letters 581 2007 3771-6).

[005] Os presentes inventores estudaram o desenvolvimento de uma cepa capaz de produzir O- succinilhomosserina com alto rendimento e alta eficiência, e os mesmos desenvolveram uma cepa, na qual o gene zwf é atenuado e deletado, para a finalidade da produção de alta concentração de succinil CoA como um precursor de O- succinilhomosserina em E. coli tendo produtividade de O- succinilhomosserina. Como um resultado da cultura, os presentes inventores verificaram que a concentração de O- succinilhomosserina foi aumentada, completando assim a presente invenção.[005] The present inventors studied the development of a strain capable of producing O-succinylhomoserine with high yield and high efficiency, and they developed a strain, in which the zwf gene is attenuated and deleted, for the purpose of producing high concentration of succinyl CoA as a precursor of O-succinylhomoserine in E. coli having O-succinylhomoserine productivity. As a result of the culture, the present inventors found that the concentration of O-succinylhomoserine was increased, thus completing the present invention.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION TECHNICAL PROBLEM

[006] Um objetivo da presente invenção é o de proporcionar um microrganismo produzindo O- succinilhomosserina.[006] An objective of the present invention is to provide a microorganism producing O-succinylhomoserine.

[007] Outro objetivo da presente invenção é o de proporcionar um método para produção de O- succinilhomosserina, o método incluindo a etapa de cultura do microrganismo produzindo O-succinilhomosserina.[007] Another objective of the present invention is to provide a method for producing O-succinylhomoserine, the method including the step of culturing the microorganism producing O-succinylhomoserine.

TECHNICAL SOLUTION

[008] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um microrganismo produzindo O-succinilhomosserina.[008] In one aspect, the present invention provides a microorganism producing O-succinylhomoserine.

[009] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo produzindo O-succinilhomosserina pode ser um microrganismo do gênero Escherichia para a produção de O-succinilhomosserina, em que uma atividade de glicose 6-fosfato-1-desidrogenase é atenuada ou eliminada, em comparação com a sua atividade endógena.[009] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism producing O-succinylhomoserine can be a microorganism of the genus Escherichia for the production of O-succinylhomoserine, in which a glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase activity is attenuated or eliminated, compared to its endogenous activity.

[0010] O termo "microrganismo produzindo O- succinilhomosserina", tal como aqui utilizado, refere-se a um microrganismo procariótico ou eucariótico capaz de produzir O-succinilhomosserina em um organismo e acumulação de O-succinilhomosserina. Por exemplo, o microrganismo produzindo O-succinilhomosserina pode ser um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia, gênero Erwinia, gênero Serratia, gênero Providencia, gênero Corynebacteria, gênero Pseudomonas, gênero Leptospira, gênero Salmonella, gênero Brevibacteria, gênero Hyphomonas, gênero Chromobacterium, genus Norcardia, ou fungos ou leveduras. O microrganismo produzindo O-succinilhomosserina pode ser especificamente um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia, e mais especificamente, Escherichia coli (E. coli).[0010] The term "microorganism producing O-succinylhomoserine", as used herein, refers to a prokaryotic or eukaryotic microorganism capable of producing O-succinylhomoserine in an organism and accumulating O-succinylhomoserine. For example, the microorganism producing O-succinylhomosserine may be a microorganism belonging to the genus Escherichia, genus Erwinia, genus Serratia, genus Providencia, genus Corynebacteria, genus Pseudomonas, genus Leptospira, genus Salmonella, genus Brevibacteria, genus Hyphomonas, genus Chromobacterium, genus Norcardia , or fungi or yeast. The microorganism producing O-succinylhomoserine may specifically be a microorganism belonging to the genus Escherichia, and more specifically, Escherichia coli (E. coli).

[0011] Glicose 6-fosfato-1-desidrogenase atua na via da pentose fosfato, a qual é uma via metabólica fornecendo um poder de redução para células, mantendo os níveis de NADPH. Esta enzima catalisa a oxidação de glicose 6-fosfato para 6-fosfogluconolactona reduzindo NADP a NADPH em uma primeira etapa da via de pentose fosfato. Um gene que codifica esta enzima é vulgarmente chamado de zwf. Atenuação ou eliminação desta enzima conduz ao fluxo através do ciclo de TCA, o que resulta em aumento do ciclo de TCA.[0011] Glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase acts in the pentose phosphate pathway, which is a metabolic pathway providing reducing power to cells, maintaining NADPH levels. This enzyme catalyzes the oxidation of glucose 6-phosphate to 6-phosphogluconolactone reducing NADP to NADPH in a first step of the pentose phosphate pathway. A gene encoding this enzyme is commonly called zwf. Attenuation or elimination of this enzyme leads to flux through the TCA cycle, which results in increased TCA cycle.

[0012] A glicose 6-fosfato-1-desidrogenase pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23. Além disso, a glicose 6-fosfato-1-desidrogenase pode ter uma sequência de aminoácido tendo 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de homologia com a SEQ ID NO: 23.[0012] Glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase can have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. Furthermore, glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase can have an amino acid sequence having 80% or more, 90 % or more, or 95% or more homology with SEQ ID NO: 23.

[0013] O termo "homologia", tal como aqui utilizado em relação à sequência, refere-se a um grau de correspondência com uma determinada sequência de aminoácido amino ou sequência de base, e a homologia pode ser expressa como uma percentagem. Na presente invenção, uma sequência de homologia tendo uma atividade, a qual é idêntica ou similar à determinada sequência de aminoácido ou sequência de base é expressa como "% de homologia". Por exemplo, a sequência de aminoácido tendo 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de homologia com a SEQ ID NO: 23 representa uma sequência tendo a atividade de glicose 6-fosfato-1- desidrogenase.[0013] The term "homology", as used herein in relation to sequence, refers to a degree of correspondence with a particular amino acid sequence or base sequence, and homology can be expressed as a percentage. In the present invention, a homology sequence having an activity, which is identical or similar to the given amino acid sequence or base sequence is expressed as "% homology". For example, the amino acid sequence having 80% or more, 90% or more, or 95% or more homology to SEQ ID NO: 23 represents a sequence having glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase activity.

[0014] O termo enzima e atividade "endógena", tal como aqui utilizado, refere-se a uma enzima nativa naturalmente presente em um microrganismo ou uma célula e uma atividade da mesma, e em outras palavras, refere-se a uma enzima e uma atividade da mesma antes de modificação da enzima correspondente e atividade da mesma.[0014] The term "endogenous" enzyme and activity, as used herein, refers to a native enzyme naturally present in a microorganism or a cell and an activity thereof, and in other words, refers to an enzyme and an activity thereof before modification of the corresponding enzyme and activity thereof.

[0015] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Escherichia para a produção de O- succinilhomosserina, em que a atividade de uma ou mais de cistationina gama sintase e homosserina quinase são adicionalmente atenuadas ou eliminadas, em comparação com as suas atividades endógenas. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo para a produção de O-succinilhomosserina, em que as atividades de ambas cistationina gama sintase e homosserina quinase são atenuadas ou eliminadas, em comparação com as suas atividades endógenas.[0015] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism may be a microorganism of the genus Escherichia for the production of O-succinylhomoserine, in which the activity of one or more cystathionine gamma synthase and homoserine kinase are additionally attenuated or eliminated, in comparison with its endogenous activities. Specifically, the microorganism may be a microorganism for the production of O-succinylhomoserine, in which the activities of both cystathionine gamma synthase and homoserine kinase are attenuated or eliminated, compared to their endogenous activities.

[0016] A cistationina gama sintase tem uma atividade para converter O-succinilhomosserina em cistationina. A cistationina gama sintase é codificada pelo gene metB. Quando a atividade desta enzima é atenuada ou eliminada, O- succinilhomosserina pode ser acumulada sem ser convertida em cistationina.[0016] Cystathionine gamma synthase has an activity to convert O-succinylhomosserine into cystathionine. Cystathionine gamma synthase is encoded by the metB gene. When the activity of this enzyme is attenuated or eliminated, O-succinylhomoserine can be accumulated without being converted to cystathionine.

[0017] A homosserina quinase catalisa as sínteses de S- fosfohomosserina a partir de homosserina, e é codificada pelo gene thrB. Quando a atividade desta enzima é atenuada ou eliminada, homosserina pode não ser convertida em O- fosfohomosserina, e pode ser utilizada na produção de O- succinilhomosserina.[0017] Homoserine kinase catalyzes the synthesis of S-phosphohomoserine from homoserine, and is encoded by the thrB gene. When the activity of this enzyme is attenuated or eliminated, homoserine may not be converted to O-phosphohomoserine, and may be used in the production of O-succinylhomoserine.

[0018] Em uma modalidade específica da presente invenção, a cistationina gama sintase pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24, e a homosserina quinase pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25. Além disso, a cistationina gama sintase e homosserina quinase podem ter sequências de aminoácido tendo 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de homologia com SEQ ID NOS: 24 e 25, respectivamente.[0018] In a specific embodiment of the present invention, cystathionine gamma synthase may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and homoserine kinase may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In addition, cystathionine gamma synthase and homoserine kinase may have amino acid sequences having 80% or more, 90% or more, or 95% or more homology to SEQ ID NOS: 24 and 25, respectively.

[0019] O termo "atenuação" ou "eliminação" da atividade enzimática, tal como aqui utilizado, significa que a expressão de um gene que codifica a enzima correspondente ou uma atividade da enzima é reduzida, em comparação com a atividade endógena, ou não existe no todo, e pode ser causada por modificação do todo ou parte de uma sequência de base do gene que codifica a enzima correspondente, ou todo ou parte de uma sequência reguladora de expressão do gene por eliminação, substituição ou inserção, ou por uma combinação dos mesmos.[0019] The term "attenuation" or "elimination" of enzyme activity, as used herein, means that the expression of a gene encoding the corresponding enzyme or an activity of the enzyme is reduced, compared to the endogenous activity, or not exists in whole, and may be caused by modification of all or part of a base sequence of the gene encoding the corresponding enzyme, or all or part of an expression regulatory sequence of the gene by deletion, substitution or insertion, or by a combination of the same.

[0020] O termo "sequência reguladora de expressão", tal como aqui utilizado, é uma sequência de base que regula uma expressão de gene, e refere-se a um segmento capaz de aumentar ou diminuir a expressão de um gene particular em um indivíduo, e pode incluir um promotor, um fator de transcrição de ligação local, etc., mas não está limitado aos mesmos.[0020] The term "expression regulatory sequence", as used herein, is a base sequence that regulates a gene expression, and refers to a segment capable of increasing or decreasing the expression of a particular gene in an individual , and may include a promoter, a local binding transcription factor, etc., but is not limited to the same.

[0021] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser um microrganismo para a produção de O-succinilhomosserina, em que uma atividade de homosserina O-succiniltransferase é adicionalmente aumentada, em comparação com a sua atividade endógena.[0021] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism can be a microorganism for the production of O-succinylhomoserine, in which a homoserine O-succinyltransferase activity is additionally increased, compared to its endogenous activity.

[0022] Homosserina O-succiniltransferase é uma enzima que catalisa a produção de O-succinilhomosserina a partir de succinil CoA e homosserina, e está envolvida em uma primeira etapa de uma via de metionina biossintética. Um gene que codifica essa enzima é comumente chamado de metA, e sua expressão é suprimida pela retroação por metionina. Portanto, pode ser utilizado um mutante para expressar o gene em um alto nível através da remoção da retroação por metionina.[0022] Homoserine O-succinyltransferase is an enzyme that catalyzes the production of O-succinylhomosserine from succinyl CoA and homoserine, and is involved in a first step of a methionine biosynthetic pathway. A gene encoding this enzyme is commonly called metA, and its expression is suppressed by methionine feedback. Therefore, a mutant can be used to express the gene at a high level by removing methionine feedback.

[0023] Em uma modalidade específica da presente invenção, a homosserina O-succiniltransferase pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26. Além disso, a homosserina O-succiniltransferase pode ter uma sequência de aminoácido tendo 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de homologia com a SEQ ID NO: 26. Entretanto, a homosserina O-succiniltransferase, da qual retroação por metionina é removida, pode ter uma sequência de aminoácido tendo 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais de homologia com a SEQ ID NO: 27 (metA11: Publicação da Patente Coreana de No. 2009-0106365).[0023] In a specific embodiment of the present invention, the homoserine O-succinyltransferase may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26. Furthermore, the homoserine O-succinyltransferase may have an amino acid sequence having 80% or more, 90 % or more, or 95% or more homology to SEQ ID NO: 26. However, homoserine O-succinyltransferase, from which methionine feedback is removed, may have an amino acid sequence having 80% or more, 90% or more more, or 95% or more homology with SEQ ID NO: 27 (metA11: Korean Patent Publication No. 2009-0106365).

[0024] O termo "aumento" de atividade enzimática, tal como aqui utilizado, significa que a atividade da enzima correspondente é melhorada, comparada com a atividade dos mesmos antes da modificação. Especificamente, a atividade enzimática é aumentada por sobre-expressão de um gene que codifica para a enzima correspondente, em comparação com a sua atividade endógena, ou a atividade da enzima codificada pelo gene é aumentada por uma mutação do gene, em comparação com a sua atividade endógena, e o aumento pode ser causado pelo aumento do número de cópia do gene que codifica, substituindo um promotor do gene com um promotor mais forte do que o promotor endógeno, ou modificando todo ou parte de uma sequência de base do gene no cromossoma ou todo ou parte da sua sequência reguladora de expressão por eliminação, substituição ou inserção, ou por uma combinação dos mesmos.[0024] The term "increase" of enzyme activity, as used herein, means that the activity of the corresponding enzyme is improved, compared to their activity before the modification. Specifically, enzyme activity is increased by overexpression of a gene encoding the corresponding enzyme, compared to its endogenous activity, or the activity of the enzyme encoded by the gene is increased by a mutation of the gene, compared to its endogenous activity, and the increase may be caused by increasing the copy number of the gene it encodes, replacing a promoter of the gene with a stronger promoter than the endogenous promoter, or modifying all or part of a base sequence of the gene on the chromosome or all or part of its expression regulatory sequence by deletion, substitution or insertion, or by a combination thereof.

[0025] Em uma modalidade específica da presente invenção, a homosserina O-succiniltransferase pode ser codificada por um gene, em que um promotor do gene que codifica esta enzima é substituído com um promotor mais forte do que o promotor endógeno. Por exemplo, o promotor inclui um promotor forte conhecido, Ptac, Ptrc, Ppro, PR, PL, Prmf, PcysK, etc., mas não está limitado aos mesmos.[0025] In a specific embodiment of the present invention, homoserine O-succinyltransferase can be encoded by a gene, in which a promoter of the gene encoding this enzyme is replaced with a stronger promoter than the endogenous promoter. For example, the promoter includes a known strong promoter, Ptac, Ptrc, Ppro, PR, PL, Prmf, PcysK, etc., but is not limited to them.

[0026] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser E. coli. O microrganismo pode ser E. coli, em que a atividade de glicose 6-fosfato- 1-desidrogenase é atenuada ou eliminada, em comparação com a atividade endógena do mesmo, e as atividades de uma ou mais de cistationina gama sintase e homosserina quinase são atenuadas ou eliminadas, em comparação com as suas atividades endógenas, respectivamente, e a atividade de homosserina O-succiniltransferase é melhorada, em comparação com a atividade endógena da mesma.[0026] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism may be E. coli. The microorganism may be E. coli, in which the activity of glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase is attenuated or eliminated, compared to its endogenous activity, and the activities of one or more of cystathionine gamma synthase and homoserine kinase are attenuated or eliminated, compared to their endogenous activities, respectively, and homoserine O-succinyltransferase activity is improved, compared to its endogenous activity.

[0027] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser E. coli, em que metA no cromossoma de E. coli é substituído com metA11 (SEQ ID NO: 27), que é um mutante preparado por remoção de retroação por metionina, thrB e metB no cromossoma são deletados, e zwf é atenuado ou eliminado.[0027] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism can be E. coli, in which metA in the E. coli chromosome is replaced with metA11 (SEQ ID NO: 27), which is a mutant prepared by feedback removal by methionine, thrB, and metB on the chromosome are deleted, and zwf is attenuated or eliminated.

[0028] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser E. coli CC03-0156, o qual foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) em 22 de Novembro de 2013, com acesso NO: KCCM11487P.[0028] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism may be E. coli CC03-0156, which was deposited at the Korean Microorganism Culture Center (KCCM) on November 22, 2013, with accession NO: KCCM11487P.

[0029] Além disso, em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser um microrganismo fornecido com uma capacidade de assimilação de sacarose. A assimilação de sacarose significa uma capacidade de metabolizar a sacarose como uma fonte de carbono ou uma fonte metabólica. A capacidade de assimilação de sacarose pode ser proporcionada por meio da introdução de uma enzima metabólica de sacarose, por exemplo, frutoquinase, sacarose PTS permease, sacarose de hidrolase, ou invertase. Por exemplo, a capacidade de assimilação de sacarose pode ser fornecida por transformação com um vetor recombinante (pAscrSM, SEQ ID NO: 28) incluindo um gene que codifica a enzima de Scr-PTS derivada a partir de Streptococcus mutans, o qual é descrito na Publicação da Patente Coreana de No. 20100099572.[0029] Furthermore, in a specific embodiment of the present invention, the microorganism may be a microorganism provided with a sucrose assimilation capacity. Sucrose assimilation means an ability to metabolize sucrose as a carbon source or a metabolic source. The ability to assimilate sucrose can be provided by introducing a sucrose metabolic enzyme, e.g., fructokinase, sucrose PTS permease, sucrose hydrolase, or invertase. For example, sucrose assimilation capacity can be provided by transformation with a recombinant vector (pAscrSM, SEQ ID NO: 28) including a gene encoding the Scr-PTS enzyme derived from Streptococcus mutans, which is described in Korean Patent Publication No. 20100099572.

[0030] Em uma modalidade específica da presente invenção, o microrganismo pode ser E. coli, em que metA no cromossoma de E. coli é substituído com metA11 (SEQ ID NO: 27), o qual é um mutante preparado por remoção de retroação por metionina, thrB e metB sobre o cromossoma são deletados, e zwf é eliminado, e o qual é capaz de utilizar um açúcar bruto por transformação com um vetor recombinante incluindo frutoquinase codificando scrKYABR, sacarose PTS permease, sacarose de hidrolase, e regulador da transcrição de sacarose derivado a partir de Streptococcus mutans de assimilação de sacarose.[0030] In a specific embodiment of the present invention, the microorganism can be E. coli, in which metA in the E. coli chromosome is replaced with metA11 (SEQ ID NO: 27), which is a mutant prepared by feedback removal by methionine, thrB and metB on the chromosome are deleted, and zwf is eliminated, and which is capable of utilizing a raw sugar by transformation with a recombinant vector including fructokinase encoding scrKYABR, sucrose PTS permease, sucrose hydrolase, and transcription regulator of sucrose derived from sucrose-assimilating Streptococcus mutans.

[0031] Em um aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para produzir O- succinilhomosserina, o método incluindo as etapas de cultura de um microrganismo do gênero Escherichia para a produção de O-succinilhomosserina, em que a atividade da glicose 6-fosfato-1-desidrogenase é atenuada ou eliminada em comparação com a sua atividade endógena, em média, e recuperando O-succinilhomosserina a partir da cultura média ou da cultura de microrganismo.[0031] In one aspect of the present invention, there is provided a method for producing O-succinylhomosserine, the method including the steps of culturing a microorganism of the genus Escherichia for the production of O-succinylhomosserine, in which the activity of glucose 6-phosphate -1-dehydrogenase is attenuated or eliminated compared to its endogenous activity, on average, and recovering O-succinylhomoserine from the culture medium or the microorganism culture.

[0032] No método de produção de O-succinilhomosserina, de acordo com uma modalidade específica da presente invenção, a cultura da cepa produzindo O- succinilhomosserina pode ser realizada em um meio e condições adequadas conhecidos na técnica. Os procedimentos de cultura podem ser prontamente ajustados por aqueles versados na técnica, de acordo com a cepa selecionada. Exemplos dos procedimentos de cultura incluem maneiras do tipo batelada alimentador e tipo contínuo, tipo batelada, mas não são limitados aos mesmos. Vários procedimentos de cultura são descritos em, por exemplo, uma literatura ("Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176).[0032] In the method of producing O-succinylhomoserine, according to a specific embodiment of the present invention, the culture of the strain producing O-succinylhomoserine can be carried out in a suitable medium and conditions known in the art. Culture procedures can be readily adjusted by those skilled in the art according to the strain selected. Examples of culture procedures include, but are not limited to, feeder-batch-type and continuous-batch-type ways. Various culture procedures are described in, for example, literature ("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176).

[0033] Um meio utilizado para a cultura deve satisfazer os requisitos para a cultura de uma cepa específica. O meio de cultura para vários microrganismos é descrito em uma literatura ("Manual of Methods for General Bacteriology" pela Sociedade Americana de Bacteriologia, Washington D.C., EUA, 1981). Estes meios incluem uma variedade de fontes de carbono, fontes de nitrogênio e micronutrientes. A fonte de carbono inclui carbohidratos, tais como glicose, lactose, sacarose, frutose, maltose, amido e celulose; gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoléico; álcoois, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético. Estas fontes de carbono podem ser utilizadas sozinhas ou em combinação. A fonte de nitrogênio inclui fontes de nitrogênio orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de milho (CSL) e farinha de feijão, e fontes de nitrogênio inorgânicas, tais como uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação. Além disso, o meio pode incluir dihidrogenofosfato potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, e sais contendo sódio correspondente dos mesmos como uma fonte de fósforo. Além disso, o meio pode incluir um metal, tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Além disso, aminoácidos, vitaminas e precursores adequados podem também ser adicionados.[0033] A medium used for culture must meet the requirements for the culture of a specific strain. The culture medium for various microorganisms is described in literature ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society of Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). These media include a variety of carbon sources, nitrogen sources and micronutrients. The carbon source includes carbohydrates such as glucose, lactose, sucrose, fructose, maltose, starch and cellulose; fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil and coconut oil; fatty acids, such as palmitic acid, stearic acid, and linoleic acid; alcohols, such as glycerol and ethanol; and organic acids, such as acetic acid. These carbon sources can be used alone or in combination. The nitrogen source includes organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn liquor (CSL) and bean flour, and inorganic nitrogen sources such as urea, ammonium sulfate , ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources can be used alone or in combination. Furthermore, the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and corresponding sodium-containing salts thereof as a source of phosphorus. Furthermore, the medium may include a metal, such as magnesium sulfate or iron sulfate. Furthermore, suitable amino acids, vitamins and precursors can also be added.

[0034] Além disso, para manter a cultura sob condições aeróbicas, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado na cultura. Uma temperatura da cultura é geralmente de 20°C-45°C, e especialmente de 25°C- 40°C. A cultura pode ser continuada que a produção do precursor de L-metionina atingir um nível desejado, e o tempo de cultura pode ser de 10 horas a 160 horas.[0034] Furthermore, to maintain the culture under aerobic conditions, oxygen or oxygen-containing gas (e.g., air) can be injected into the culture. A culture temperature is generally 20°C-45°C, and especially 25°C-40°C. The culture can be continued until the production of the L-methionine precursor reaches a desired level, and the culture time can be from 10 hours to 160 hours.

ADVANTAGEOUS EFFECTS OF THE INVENTION

[0035] Uma cepa produzindo O-succinilhomosserina da presente invenção produz eficientemente O- succinilhomosserina, o qual pode ser utilizado na produção de L-metionina. L-metionina assim produzida pode ser amplamente utilizada na produção de alimentos para animais ou aditivos de alimentos para animais, bem como, alimentos humanos ou aditivos alimentares.[0035] A strain producing O-succinylhomoserine of the present invention efficiently produces O-succinylhomosserine, which can be used in the production of L-methionine. L-methionine thus produced can be widely used in the production of animal feed or feed additives, as well as, human food or food additives.

MODE OF THE INVENTION

[0036] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhe com referência aos Exemplos. No entanto, estes Exemplos são apenas para fins ilustrativos, e o escopo da presente invenção não é destinado a ser limitado por estes Exemplos.[0036] Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the Examples. However, these Examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not intended to be limited by these Examples.

Reference Example 1. Preparation of strain producing O-succinyl homoserine 1-1. Deletion of the metB gene

[0037] Para aumentar o acúmulo de O-succinil homosserina, uma cepa foi preparada deletando o gene metB que codifica a cistationina gama sintase, a qual está envolvida na degradação de O-succinil homosserina.[0037] To increase the accumulation of O-succinyl homoserine, a strain was prepared by deleting the metB gene encoding cystathionine gamma synthase, which is involved in the degradation of O-succinyl homoserine.

[0038] Em uma cepa W3110 E. coli (K12) de tipo selvagem, gene metB que codifica a cistationina gama sintase foi deletado. Sabe-se que a cistationina gama sintase liga-se com vários precursores de metionina em células, produzindo deste modo diversos subprodutos. Portanto, a sobre-expressão da cistationina sintase pode aumentar as reações laterais para reduzir a eficiência de reações intracelulares. Para a eliminação do gene metB, um método de eliminação de PCR de uma etapa de FRT foi realizado (PNAS (2000), Vol. L97, p6640-6645). Em primeiro lugar, PCR foi realizado utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 1 e 2 e um vetor pKD3 (PNAS (2000) Vol. l97, pP6640-6645) como uma amostra para preparar um cassete de eliminação. SEQ ID NO: 1: 5'-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' SEQ ID NO: 2: 5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCA TATGAATATCCTCCTTAG-3'[0038] In a wild-type W3110 E. coli (K12) strain, metB gene encoding cystathionine gamma synthase was deleted. It is known that cystathionine gamma synthase binds with several methionine precursors in cells, thus producing several byproducts. Therefore, overexpression of cystathionine synthase may increase side reactions to reduce the efficiency of intracellular reactions. For deletion of the metB gene, a one-step FRT PCR deletion method was performed (PNAS (2000), Vol. L97, p6640-6645). First, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 and a pKD3 vector (PNAS (2000) Vol. 197, pP6640-6645) as a sample to prepare a deletion cassette. SEQ ID NO: 1: 5'-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' SEQ ID NO: 2: 5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCA TATGAATATCCTCCTTAG-3'

[0039] As condições de PCR foram de 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 55°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 1 minuto. Um produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese em um gel de agarose a 1,0%, seguido por eluição e purificação de uma banda de 1,1 kb. Um fragmento de DNA assim obtido foi eletroporado em cepa W3110 E. coli (K12) previamente transformada com um vetor pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). Para a eletroporação, a cepa W3110 transformada com pKD46 foi cultivada a 30°C em meio LB contendo 200 μg/L de ampicilina e 5 mM de L-arabinose até OD600 atingir 0,5. Em seguida, a cepa foi lavada três vezes com 10% de glicerol. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi riscada sobre um meio de placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C durante 1 dia e 2 dias. Em seguida, uma cepa que exibe resistência foi selecionada.[0039] The PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 1 minute. A PCR product thus obtained was subjected to electrophoresis on a 1.0% agarose gel, followed by elution and purification of a 1.1 kb band. A DNA fragment thus obtained was electroporated into E. coli strain W3110 (K12) previously transformed with a pKD46 vector (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). For electroporation, strain W3110 transformed with pKD46 was grown at 30°C in LB medium containing 200 μg/L ampicillin and 5 mM L-arabinose until OD600 reached 0.5. Then, the strain was washed three times with 10% glycerol. Electroporation was performed at 2500 V. The recovered strain was streaked onto LB plate medium containing 30 μg/L chloramphenicol, followed by culture at 37°C for 1 day and 2 days. Next, a strain exhibiting resistance was selected.

[0040] PCR foi realizado utilizando a cepa selecionada como uma amostra e os iniciadores de SEQ ID NOS: 3 e 4 sob as condições acima descritas. A eliminação do gene metB foi confirmada através da identificação de um gene de 1,5 kb de tamanho sobre um gel de agarose a 1,0%. SEQ ID NO: 3: 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3' SEQ ID NO: 4: 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'[0040] PCR was performed using the selected strain as a sample and the primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 under the conditions described above. Deletion of the metB gene was confirmed by identifying a gene 1.5 kb in size on a 1.0% agarose gel. SEQ ID NO: 3: 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3' SEQ ID NO: 4: 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'

[0041] A cepa, em que a eliminação do gene metB foi confirmada, foi em seguida transformada com um vetor pCP20 (PNAS (2000) vol. 97, p6640-6645) e cultivada em meio LB contendo 100 μg/L de ampicilina. Em seguida, PCR foi realizado sob as mesmas condições, e a eliminação do marcador de cloranfenicol foi confirmada pela observação de um produto de PCR menor sobre um gel de agarose a 1,0%. Finalmente, uma cepa deletada pelo gene metB foi preparada. A cepa de metionina auxotrófica obtida foi nomeada a CC030132.[0041] The strain, in which the deletion of the metB gene was confirmed, was then transformed with a pCP20 vector (PNAS (2000) vol. 97, p6640-6645) and cultivated in LB medium containing 100 μg/L ampicillin. Then, PCR was performed under the same conditions, and the elimination of the chloramphenicol marker was confirmed by observing a smaller PCR product on a 1.0% agarose gel. Finally, a strain deleted for the metB gene was prepared. The auxotrophic methionine strain obtained was named CC030132.

1-2. Deletion of the thrB gene

[0042] Para aumentar a produção de O- succinilhomosserina a partir de homosserina, gene thrB o qual é um gene que codifica homosserina quinase foi deletado. Particularmente, quando uma cepa produzindo treonina é usada, eliminação do gene thrB é necessária porque a atividade de utilização de homosserina é muito forte. Para deletar o gene thrB na cepa CC03-0132 preparada no Exemplo de Referência 1-1, o método de eliminação de PCR de uma etapa de FRT foi realizado (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). Para a delção do gene thrB, PCR foi realizado utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6 e um vetor pKD3 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645) como uma amostra para preparar um cassete de eliminação. SEQ ID NO: 5: 5'-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' SEQ ID NO: 6: 5'-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTC ATATGAATATCCTCCTTAG-3'[0042] To increase the production of O-succinylhomoserine from homoserine, the thrB gene, which is a gene that encodes homoserine kinase, was deleted. Particularly, when a strain producing threonine is used, deletion of the thrB gene is necessary because the homoserine utilization activity is very strong. To delete the thrB gene in strain CC03-0132 prepared in Reference Example 1-1, the FRT one-step PCR deletion method was performed (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). For deletion of the thrB gene, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 5 and 6 and a pKD3 vector (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645) as a sample to prepare a deletion cassette. SEQ ID NO: 5: 5'-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

[0043] As condições de PCR foram de 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 55°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 1 minuto. Um produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese sobre um gel de agarose a 1,0%, seguido por eluição e purificação de uma banda de 1,1 kb. Um fragmento de DNA assim obtido foi eletroporado na cepa CC03-0132 previamente transformada com vetor pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). Para a eletroporação, a cepa CC03-0132 transformada com pKD46 foi cultivada a 30°C em um meio LB contendo 200 μg/L de ampicilina e 5 mM de L-arabinose até OD600 atingir 0,5. Em seguida, a cepa foi lavada três vezes com 10% de glicerol. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi riscada sobre um meio de placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C durante 1 dia a 2 dias. Em seguida, uma cepa que exibe resistência foi selecionada.[0043] The PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 1 minute. A PCR product thus obtained was subjected to electrophoresis on a 1.0% agarose gel, followed by elution and purification of a 1.1 kb band. A DNA fragment thus obtained was electroporated into strain CC03-0132 previously transformed with vector pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). For electroporation, strain CC03-0132 transformed with pKD46 was grown at 30°C in LB medium containing 200 μg/L ampicillin and 5 mM L-arabinose until OD600 reached 0.5. Then, the strain was washed three times with 10% glycerol. Electroporation was performed at 2500 V. The recovered strain was streaked onto LB plate medium containing 30 μg/L chloramphenicol, followed by culture at 37°C for 1 day to 2 days. Next, a strain exhibiting resistance was selected.

[0044] PCR foi realizado utilizando a cepa selecionada como uma amostra e os iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8 sob as condições acima descritas. A eliminação do gene thrB foi confirmada através da identificação de um gene de 1,5 kb de tamanho sobre um gel de agarose a 1,0%. SEQ ID NO: 7: 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3' SEQ ID NO: 8: 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'[0044] PCR was performed using the selected strain as a sample and the primers of SEQ ID NOS: 7 and 8 under the conditions described above. Deletion of the thrB gene was confirmed by identifying a 1.5 kb gene on a 1.0% agarose gel. SEQ ID NO: 7: 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3' SEQ ID NO: 8: 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'

[0045] A cepa assim confirmada foi, em seguida, transformada com um vetor pCP20 (PNAS (2000) vol. 97, p6640-6645) e cultivada em um meio LB contendo 100 μg/L de ampicilina. Em seguida, a PCR foi realizada sob as mesmas condições, e a eliminação do marcador de cloranfenicol foi confirmada pela observação de um produto de PCR menor sobre um gel de agarose a 1,0%. Finalmente, uma cepa deletada de gene thrB foi preparada. A cepa assim preparada foi nomeada a CC03-0133.[0045] The strain thus confirmed was then transformed with a pCP20 vector (PNAS (2000) vol. 97, p6640-6645) and cultivated in an LB medium containing 100 μg/L ampicillin. Then, PCR was performed under the same conditions, and the elimination of the chloramphenicol marker was confirmed by observing a smaller PCR product on a 1.0% agarose gel. Finally, a thrB gene-deleted strain was prepared. The strain thus prepared was named CC03-0133.

1-3. Deletion of the metA gene

[0046] Para introduzir um gene metA resistente à retroação no cromossoma, gene metA cromossomal autêntico foi deletado, com base na cepa CC03-0133, a qual foi preparada deletando os genes metB e thrB em cepa W3110 E. coli (K12). Para a eliminação do gene metA, o método de eliminação de PCR de uma etapa de FRT foi realizado (PNAS (2000), Vol. 197, p6640-6645). Para a eliminação do gene metA, PCR foi realizado utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10 e um vetor pKD3 (PNAS (2000) Vol. 197, pP6640- 6645) como uma amostra para preparar um cassete de eliminação. SEQ ID NO: 9: 5'-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' SEQ ID NO: 10: 5'-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCC ATATGAATATCCTCCTTAG-3'[0046] To introduce a feedback-resistant metA gene into the chromosome, authentic chromosomal metA gene was deleted, based on strain CC03-0133, which was prepared by deleting the metB and thrB genes in strain W3110 E. coli (K12). For the elimination of the metA gene, the FRT one-step PCR elimination method was performed (PNAS (2000), Vol. 197, p6640-6645). For deletion of the metA gene, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 9 and 10 and a pKD3 vector (PNAS (2000) Vol. 197, pP6640-6645) as a sample to prepare a deletion cassette. SEQ ID NO: 9: 5'-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

[0047] As condições de PCR foram de 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 55°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 1 minuto. Um produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese sobre um gel de agarose a 1,0%, seguido por eluição e purificação de uma banda de 1,1 kb. Um fragmento de DNA assim obtido foi eletroporado na cepa CC03-0133 previamente transformada com vetor pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). Durante eletroporação, a cepa CC03-0133 transformada com pKD46 foi cultivada a 30°C em um meio LB contendo 200 μg/L de ampicilina e 5 mM de L-arabinose até OD600 atingir 0,5. Em seguida, a cepa foi lavada três vezes com 10% de glicerol. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi riscada sobre um meio de placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C durante 1 dia a 2 dias. Em seguida, uma cepa que exibe resistência foi selecionada.[0047] The PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 1 minute. A PCR product thus obtained was subjected to electrophoresis on a 1.0% agarose gel, followed by elution and purification of a 1.1 kb band. A DNA fragment thus obtained was electroporated into strain CC03-0133 previously transformed with vector pKD46 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). During electroporation, strain CC03-0133 transformed with pKD46 was grown at 30°C in LB medium containing 200 μg/L ampicillin and 5 mM L-arabinose until OD600 reached 0.5. Then, the strain was washed three times with 10% glycerol. Electroporation was performed at 2500 V. The recovered strain was streaked onto LB plate medium containing 30 μg/L chloramphenicol, followed by culture at 37°C for 1 day to 2 days. Next, a strain exhibiting resistance was selected.

[0048] PCR foi realizado utilizando a cepa selecionada como uma amostra e os iniciadores de SEQ ID NOS: 11 e 12, nas condições acima descritas. A eliminação do gene metA foi confirmada através da identificação de um gene de 1,5 kb de tamanho sobre um gel de agarose a 1,0%. SEQ ID NO: 11: 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3' SEQ ID NO: 12" 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'[0048] PCR was performed using the selected strain as a sample and the primers of SEQ ID NOS: 11 and 12, under the conditions described above. Deletion of the metA gene was confirmed by identifying a gene 1.5 kb in size on a 1.0% agarose gel. SEQ ID NO: 11: 5'-CTCATTAACGTTTGGTTGTCA-3' SEQ ID NO: 12" 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'

[0049] A cepa assim confirmada foi, em seguida, transformada com um vetor pCP20 (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645) e cultivada em meio LB contendo 100 μg/L de ampicilina. Em seguida, PCR foi realizado sob as mesmas condições, e a eliminação do marcador de cloranfenicol foi confirmada pela observação de um produto de PCR menor sobre um gel de agarose a 1,0%. Finalmente, uma cepa deletada pelo gene metA foi preparada. A cepa assim preparada foi nomeada a CC03-0134.[0049] The strain thus confirmed was then transformed with a pCP20 vector (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645) and cultivated in LB medium containing 100 μg/L ampicillin. Then, PCR was performed under the same conditions, and the elimination of the chloramphenicol marker was confirmed by observing a smaller PCR product on a 1.0% agarose gel. Finally, a strain deleted for the metA gene was prepared. The strain thus prepared was named CC03-0134.

1-4. Insertion of the metA11 gene - Preparation of the pSG vector for metA11 insertion

[0050] Quase toda a atividade de homosserina succiniltransferase é regulada através de inibição da retroação por uma pequena quantidade de metionina adicionada a um meio, e por conseguinte, um mutante, em que a retroação por metionina foi removida, foi substituída por uma grande produção de um precursor de L-metionina, O- succinilhomosserina. Para substituir um gene metA cromossomal do tipo selvagem que codifica homosserina succiniltransferase de E.coli por metA11 (SEQ ID NO: 27) que codifica um mutante, em que a retroação por metionina foi removida, um vetor de pSG-metA11 para inserção foi preparado. De acordo com a Publicação da Patente Coreana de No. 2009-0106365, informação da sequência de base do gene metA11 foi obtida, e com base nesta sequência de base, os iniciadores (SEQ ID NOS: 13 e 14) incluindo a partir de ATG para ORF do gene metA11 e locais de reconhecimento para as enzimas de restrição EcoRI e SacI foram sintetizados. PCR foi realizado utilizando um plasmídeo de pMetA11-CL como uma amostra (Publicação da Patente Coreana de No. 2009- 0106365), o qual foi preparado por ligação do gene metA11 com um vetor de pLC1920, e iniciadores das seguintes SEQ ID NOS. SEQ ID NO: 13: 5'-ggccgaattcatgccgattcgtgtgccgga-3' SEQ ID NO: 14: 5'-ggccgagctcgttaatccagcgttggattca-3'[0050] Almost all homoserine succinyltransferase activity is regulated through inhibition of feedback by a small amount of methionine added to a medium, and therefore, a mutant, in which methionine feedback was removed, was replaced by a large production of a precursor of L-methionine, O-succinylhomosserine. To replace a wild-type chromosomal metA gene encoding E.coli homoserine succinyltransferase with metA11 (SEQ ID NO: 27) encoding a mutant, in which the methionine feedback was removed, a pSG-metA11 vector for insertion was prepared . According to Korean Patent Publication No. 2009-0106365, base sequence information of the metA11 gene was obtained, and based on this base sequence, the primers (SEQ ID NOS: 13 and 14) including from ATG for metA11 gene ORF and recognition sites for EcoRI and SacI restriction enzymes were synthesized. PCR was performed using a pMetA11-CL plasmid as a sample (Korean Patent Publication No. 2009-0106365), which was prepared by ligating the metA11 gene with a pLC1920 vector, and primers of the following SEQ ID NOS. SEQ ID NO: 13: 5'-ggccgaattcatgccgattcgtgtgccgga-3' SEQ ID NO: 14: 5'-ggccgagctcgttaatccagcgttggattca-3'

[0051] PCR foi realizado utilizando polimerase de DNA pfu-X (SolGent; SPX16-R250), e condições de PCR foram de 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 55°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 2 minutos. Como um resultado, um produto de PCR de ORF metA11 amplificado incluindo locais de reconhecimento para as enzimas de restrição EcoRI e SacI em ambas as extremidades foi obtido. O gene metA11 obtido por PCR foi tratado com as enzimas de restrição EcoRI e SacI, e ligado com um vetor de pSG76-C (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409-15), o qual foi tratado com as enzimas de restrição EcoRI e SacI para clonar o gene. Finalmente, um vetor recombinante pSG-metA11 clonado com gene metA11 foi preparado.[0051] PCR was performed using pfu-X DNA polymerase (SolGent; SPX16-R250), and PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 2 minutes. As a result, an amplified metA11 ORF PCR product including recognition sites for EcoRI and SacI restriction enzymes at both ends was obtained. The metA11 gene obtained by PCR was treated with the restriction enzymes EcoRI and SacI, and ligated with a pSG76-C vector (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409-15), which was treated with the restriction enzymes EcoRI and SacI to clone the gene. Finally, a recombinant vector pSG-metA11 cloned with metA11 gene was prepared.

- Preparation of a strain inserted into the metA11 gene

[0052] A cepa CC03-0134 obtida nos Exemplos de Referência 1-3 foi transformada com o pSG-metA11 preparado, o qual foi um vetor para inserção do gene metA11, e cultivada em um meio Cm de LB (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona, e 30 μg/L de cloranfenicol). Em seguida, uma colônia tendo resistência ao cloranfenicol foi selecionada. O transformante selecionado foi uma cepa, em que o vetor pSG-metA11 foi inserido principalmente no metA cromossomal. A cepa inserida no gene metA11 foi transformada com um vetor de pST76-ASceP (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409- 15) expressando I-Scel, o qual é uma enzima de restrição digerindo I-SceL no vetor pSG, e uma cepa crescendo em LB- Amp (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona, e 100 μg/L de cloranfenicol) foi selecionada. Esta cepa assim selecionada foi uma cepa em que o metA do tipo selvagem foi substituído por metA11 e vetor pSG76-C inserido foi removido. Esta cepa foi nomeada a E. coli CC03-0038.[0052] Strain CC03-0134 obtained in Reference Examples 1-3 was transformed with the prepared pSG-metA11, which was a vector for insertion of the metA11 gene, and cultivated in a Cm LB medium (10 g/L of yeast extract, 5 g/L NaCl, 10 g/L tryptone, and 30 μg/L chloramphenicol). Then, a colony having resistance to chloramphenicol was selected. The selected transformant was a strain, in which the pSG-metA11 vector was inserted mainly into chromosomal metA. The strain inserted in the metA11 gene was transformed with a pST76-ASceP vector (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409- 15) expressing I-Scel, which is a restriction enzyme digesting I-SceL in the vector pSG, and a strain growing in LB-Amp (10 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 10 g/L tryptone, and 100 μg/L chloramphenicol) was selected. This strain thus selected was a strain in which the wild-type metA was replaced by metA11 and inserted pSG76-C vector was removed. This strain was named E. coli CC03-0038.

Example 1. Attenuation and Elimination of the zwf gene 1-1. Attenuation of the zwf gene - Preparation of the pSG vector for replacement of the zwf gene initiation codon

[0053] Para atenuar gene zwf na cepa CC03-0038 preparada nos Exemplos de Referência 1-4, um método de substituição de um códon de iniciação ATG da região de ORF do gene zwf por GTG foi aplicado. PCR foi realizado utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, e SEQ ID NOS: 17 e 18 e o genoma de E. coli W3110 como uma amostra. SEQ ID NO: 15: 5'-ggccgaattcctgaaagaaatcgaaatgcag-3' SEQ ID NO: 16: 5'-cacgtcattctccttaagaattc-3' SEQ ID NO: 17: 5'-gaattcttaaggagaatgacgtg-3' SEQ ID NO: 18: 5'-ggccgagctcgggcatggcaaagtagttaatg-3'[0053] To attenuate zwf gene in strain CC03-0038 prepared in Reference Examples 1-4, a method of replacing an ATG initiation codon of the ORF region of the zwf gene with GTG was applied. PCR was performed using the primers SEQ ID NOS: 15 and 16, and SEQ ID NOS: 17 and 18 and the E. coli W3110 genome as a sample. SEQ ID NO: 15: 5'-ggccgaattcctgaaagaaatcgaaatgcag-3' SEQ ID NO: 16: 5'-cacgtcattctccttaagaattc-3' SEQ ID NO: 17: 5'-gaattcttaaggagaatgacgtg-3' SEQ ID NO: 18: 5'-ggccgagctcgggcatggcaaag tagttaatg- 3'

[0054] PCR foi realizado utilizando polimerase de DNA pfu-X (SolGent; SPX16-R250), e condições de PCR foram de 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos; emparelhamento a 55°C durante 30 segundos; e extensão a 72°C durante 1 minuto. PCR SOEing (Splicing by Overlap Extension) foi realizado utilizando os dois fragmentos assim obtidos como amostras. Como um resultado, uma região de zwf incluindo locais de reconhecimento para as enzimas de restrição EcoRI e SacI em ambas as extremidades e o códon de iniciação de GTG foram obtidos. As enzimas de restrição EcoRI e SacI foram tratadas nas extremidades do fragmento obtido incluindo os locais de reconhecimento para as enzimas, e clonadas em um vetor de pSG76-C (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409-15) tratado com as enzimas de restrição EcoRI e SacI por ligação. Finalmente, um vetor recombinante pSG-zwf(GTG) foi preparado.[0054] PCR was performed using pfu-X DNA polymerase (SolGent; SPX16-R250), and PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds; pairing at 55°C for 30 seconds; and extension at 72°C for 1 minute. PCR SOEing (Splicing by Overlap Extension) was performed using the two fragments thus obtained as samples. As a result, a region of zwf including recognition sites for the EcoRI and SacI restriction enzymes at both ends and the GTG initiation codon was obtained. The EcoRI and SacI restriction enzymes were treated at the ends of the fragment obtained, including the recognition sites for the enzymes, and cloned into a pSG76-C vector (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409-15) treated with the restriction enzymes EcoRI and SacI by ligation. Finally, a recombinant vector pSG-zwf(GTG) was prepared.

- Preparation of the strain with replacement of the initiation codon of the zwf gene

[0055] pSG-zwf (GTG), o qual foi preparado para substituição do códon de iniciação do gene zwf como descrito acima, foi transformado na cepa CC03-0038 preparada nos Exemplos de Referência 1-4, e cultivado em um meio de LB_Cm (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona, e 30 μg/L de cloranfenicol) . Em seguida, uma colônia tendo resistência ao cloranfenicol foi selecionada. O transformante selecionado foi uma cepa, o qual o vetor de pSG-zwf (GTG) foi inserido primeiramente no zwf cromossomal. A cepa selecionada foi transformada com um pST76-ASceP (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409- 15) expressando I-SceI que é uma enzima de restrição digerindo I-SceI no vetor pSG, e uma cepa crescendo em LB- Amp (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 10 g/L de triptona, e 100 μg/L de cloranfenicol) foi selecionada. Esta cepa assim selecionada foi uma cepa em que gene zwf foi atenuado por substituição do códon de iniciação ATG do gene zwf por GTG e, em seguida, vetor pSG76-C inserido foi removido. Esta cepa foi nomeada a CC03-0038zwfGTG.[0055] pSG-zwf (GTG), which was prepared to replace the initiation codon of the zwf gene as described above, was transformed into the CC03-0038 strain prepared in Reference Examples 1-4, and cultivated in an LB_Cm medium (10 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 10 g/L tryptone, and 30 μg/L chloramphenicol). Then, a colony having resistance to chloramphenicol was selected. The selected transformant was a strain in which the pSG-zwf vector (GTG) was first inserted into the chromosomal zwf. The selected strain was transformed with a pST76-ASceP (Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22):4409- 15) expressing I-SceI which is a restriction enzyme digesting I-SceI in the pSG vector, and a strain growing in LB-Amp (10 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl, 10 g/L tryptone, and 100 μg/L chloramphenicol) was selected. This strain thus selected was a strain in which zwf gene was attenuated by replacing the ATG initiation codon of zwf gene with GTG and then inserted pSG76-C vector was removed. This strain was named CC03-0038zwfGTG.

1-2. Deletion of the zwf gene

[0056] Para eliminar o gene zwf na cepa CC03-0038 preparada nos Exemplos de Referência 1-4, o método de eliminação PCR de uma etapa de FRT foi realizado (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). Para a eliminação do gene zwf, PCR foi realizado utilizando os iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 20 e o vetor pKD3 (PNAS (2000) Vol. 97 P6640-6645) como uma amostra para preparar um cassete de eliminação. SEQ ID NO: 19: 5'-CAAGTATACCCTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' SEQ ID NO: 20: 5'-CTGCGCAAGATCATGTTACCGGTAAAATAACCATAAAGGATAAGCGCAGATA CATATGAATATCCTCCTTAG-3'[0056] To eliminate the zwf gene in strain CC03-0038 prepared in Reference Examples 1-4, the FRT one-step PCR elimination method was performed (PNAS (2000) Vol. 97, p6640-6645). For deletion of the zwf gene, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 and the vector pKD3 (PNAS (2000) Vol. 97 P6640-6645) as a sample to prepare a deletion cassette. SEQ ID NO: 19: 5'-CAAGTATACCCTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACGT GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

[0057] As condições de PCR foram de 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, emparelhamento a 55°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 1 minuto. Um produto de PCR assim obtido foi submetido à eletroforese sobre um gel de agarose a 1,0%, seguido por eluição e purificação de uma banda de 1,1 kb. Um fragmento de DNA assim obtido foi eletroporado na cepa CC03-0038 previamente transformada com o vetor pKD46 (PNAS (2000), Vol. 97, p6640-6645). Para a eletroporação, a cepa CC030038 transformada com pKD46 foi cultivada a 30° em um meio de LB contendo 200 μg/L de ampicilina e 5 mM de arabinose até OD600 atingir 0,5. Em seguida, a cepa foi lavada três vezes com 10% de glicerol. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi riscada sobre um meio de placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C durante 1 dia a 2 dias. Em seguida, uma cepa que exibe resistência foi selecionada.[0057] The PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 1 minute. A PCR product thus obtained was subjected to electrophoresis on a 1.0% agarose gel, followed by elution and purification of a 1.1 kb band. A DNA fragment thus obtained was electroporated into the CC03-0038 strain previously transformed with the pKD46 vector (PNAS (2000), Vol. 97, p6640-6645). For electroporation, strain CC030038 transformed with pKD46 was grown at 30° in LB medium containing 200 μg/L ampicillin and 5 mM arabinose until OD600 reached 0.5. Then, the strain was washed three times with 10% glycerol. Electroporation was performed at 2500 V. The recovered strain was streaked onto LB plate medium containing 30 μg/L chloramphenicol, followed by culture at 37°C for 1 day to 2 days. Next, a strain exhibiting resistance was selected.

[0058] PCR foi realizado utilizando a cepa selecionada como uma amostra e os iniciadores de SEQ ID NOS: 21 e 22 sob as condições acima descritas. A eliminação do gene zwf foi confirmada através da identificação de um gene de 2 Kb de tamanho sobre um gel de agarose a 1,0%. SEQ ID NO: 21: 5'-CATAACATGATCAGTGTCAGAT-3' SEQ ID NO: 22: 5'-CGCGTAACAATTGTGGATTCAT-3'[0058] PCR was performed using the selected strain as a sample and the primers of SEQ ID NOS: 21 and 22 under the conditions described above. Deletion of the zwf gene was confirmed by identifying a gene of 2 Kb in size on a 1.0% agarose gel. SEQ ID NO: 21: 5'-CATAACATGATCAGTGTCAGAT-3' SEQ ID NO: 22: 5'-CGCGTAACAATTGTGGATTCAT-3'

[0059] A cepa assim identificada foi nomeada a CC03-0156.[0059] The strain thus identified was named CC03-0156.

1-3. Preparation of the strain producing O-succinyl homoserine based on the strain producing threonine

[0060] A cepa produzindo treonina, E. coli KCCM 10541P descrita na Patente Internacional WO 2005/075625 foi usada para eliminar os genes metB, thrB e metA da mesma maneira como descrito no Exemplo de Referência 1, e, em seguida gene, metA11 resistente à retroação foi introduzido para preparar uma cepa para a produção de O- succinilhomosserina, a qual foi nomeada a CJM2-A11. Além disso, uma cepa deletada do gene zwf foi preparada da mesma maneira como descrita nos Exemplos 1-2, e nomeada a CJM2- A11Z.[0060] The threonine producing strain, E. coli KCCM 10541P described in International Patent WO 2005/075625 was used to eliminate the metB, thrB and metA genes in the same way as described in Reference Example 1, and then gene, metA11 Resistant to feedback was introduced to prepare a strain for O-succinylhomoserine production, which was named CJM2-A11. Furthermore, a strain deleted of the zwf gene was prepared in the same way as described in Examples 1-2, and named CJM2-A11Z.

Example 2. Fermentation for the production of O-succinylhomosserine

[0061] Para examinar o efeito da eliminação do gene zwf na cepa preparada no Exemplo 1, a cultura em frasco de Erlenmeyer foi realizada. A composição de meio frasco é a mesma como na seguinte Tabela 1.[0061] To examine the effect of deleting the zwf gene in the strain prepared in Example 1, culture in an Erlenmeyer flask was performed. The composition of half a bottle is the same as in the following Table 1.

[0062] Além disso, um plasmídeo de pAscrSM (SEQ ID NO: 28) tendo uma sequência de scrKYABR (aqui a seguir, referido como "scrO") descrito na Publicação da Patente Coreana de No. 2009-0018128 foi introduzido para preparar uma cepa capaz de utilizar um açúcar bruto, seguido por cultura de frasco. Uma composição de meio frasco é a mesma como na seguinte Tabela 2. As cepas preparadas pelo método acima foram nomeadas a CC03-0038/pAscrSM, CC03- 0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM, CJM2-A11/pAscrSM e CJM2-A11Z/pAscrSM, respectivamente. Tabela 1. Composição de meio frasco Tabela 2. Composição de meio frasco [0062] Furthermore, a pAscrSM plasmid (SEQ ID NO: 28) having a sequence of scrKYABR (hereinafter referred to as "scrO") described in Korean Patent Publication No. 2009-0018128 was introduced to prepare a strain capable of utilizing a raw sugar, followed by flask culture. A half vial composition is the same as in the following Table 2. The strains prepared by the above method were named CC03-0038/pAscrSM, CC03-0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM, CJM2-A11/pAscrSM and CJM2-A11Z /pAscrSM, respectively. Table 1. Composition of half a bottle Table 2. Composition of half a bottle

[0063] Cada um dos CC03-0038, CC03-0038zwfGTG, CC03-0156, CJM2-A11, CJM2-A11Z, CC03-0038/pAscrSM, CC03- 0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM, CJM2-A11/pAscrSM e CJM2-A11Z/pAscrSM foi inoculado em meio de placa LB e cultivado a 33°C durante a noite. Uma colônia isolada foi inoculada em 2 mL de meio de LB, seguida de cultura a 33°C durante 2 horas. A cultura foi inoculada em um frasco de 250 mL de Erlenmeyer contendo 25 mL do meio do frasco a DO600 = 0,5, seguido por cultura a 33°C, 200 rpm durante 48 horas. O HPLC foi utilizado para comparar produções de O- succinilhomosserina. Os resultados são apresentados na seguinte Tabela 3. Tabela 3. Produção de O-succinil homosserina por cultura de frasco [0063] Cada um dos CC03-0038, CC03-0038zwfGTG, CC03-0156, CJM2-A11, CJM2-A11Z, CC03-0038/pAscrSM, CC03- 0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM, CJM2-A11/pAscrSM e CJM2-A11Z/pAscrSM was inoculated into LB plate medium and cultured at 33°C overnight. An isolated colony was inoculated into 2 mL of LB medium, followed by culture at 33°C for 2 hours. The culture was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 25 mL of the flask medium at OD600 = 0.5, followed by culture at 33°C, 200 rpm for 48 hours. HPLC was used to compare O-succinylhomoserine yields. The results are presented in the following Table 3. Table 3. Production of O-succinyl homoserine by flask culture

[0064] Os resultados da cultura de frasco mostraram que gene zwf atenuado ou eliminado das cepas CC03- 0038zwfGTG, CC03-0156, CJM2-A11Z, CC03-0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM e CJM2-A11Z/pAscrSM mostrou 8,9% a 40,0% de produções de O-succinilhomosserina maiores do que as respectivas cepas de controle. Além disso, observou-se uma redução na produção de homosserina, sugerindo que a produção de succinil-CoA foi aumentada pelo aumento do ciclo de TCA.[0064] Flask culture results showed that attenuated or deleted zwf gene of strains CC03-0038zwfGTG, CC03-0156, CJM2-A11Z, CC03-0038zwfGTG/pAscrSM, CC03-0156/pAscrSM and CJM2-A11Z/pAscrSM showed 8, 9% to 40.0% higher O-succinylhomoserine productions than respective control strains. Furthermore, a reduction in homoserine production was observed, suggesting that succinyl-CoA production was increased by increasing the TCA cycle.

[0065] Os presentes inventores confirmaram que O- succinilhomosserina pode ser produzida em um alto rendimento através da atenuação ou eliminação do gene zwf na cepa CC03-0038 e cepa CJM2-A11. A cepa CC03-0156 foi depositada sob o Tratado de Budapeste no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) em 22 de Novembro de 2013 com Número de Acesso: KCCM11487P.[0065] The present inventors have confirmed that O-succinylhomoserine can be produced in a high yield through attenuation or elimination of the zwf gene in strain CC03-0038 and strain CJM2-A11. Strain CC03-0156 was deposited under the Budapest Treaty at the Korean Microorganism Culture Center (KCCM) on November 22, 2013 with Accession Number: KCCM11487P.

[0066] Em termos de aplicação do gene zwf para aumento do ciclo de TCA, é para ser entendido que atenuação ou eliminação do gene zwf não está limitada a E. coli, mas igualmente aplicada a todos os microrganismos tendo o ciclo de TCA, incluindo gênero Escherichia, gênero Corynebacterium, levedura, etc., para a produção de alto rendimento de O-succinilhomosserina.[0066] In terms of application of the zwf gene to enhancing the TCA cycle, it is to be understood that attenuation or elimination of the zwf gene is not limited to E. coli, but equally applied to all microorganisms having the TCA cycle, including Escherichia genus, Corynebacterium genus, yeast, etc., for high-yield production of O-succinylhomosserine.

Claims

1. Microorganism of the genus Escherichia for the production of O-succinylhomosserine, characterized by the fact that the activity of glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase of SEQ ID NO: 23 in the microorganism is attenuated, compared to its endogenous activity by replacement of the ATG codon by the GTG codon, or eliminated by gene deletion, and the productivity of O-succinylhomoserine is increased compared to the wild-type microorganism, the activities of the enzymes cystathionine gamma synthase (metB) of SEQ ID NO: 24 and homoserine kinase (thrB) of SEQ ID NO: 25 in the microorganism are eliminated, and/or the homoserine succinyltransferase (metA) activity of SEQ ID NO: 26 is replaced by the metA11 activity encoded by SEQ ID NO: 27.

2. Microorganism of the genus Escherichia, according to claim 1, characterized by the fact that the microorganism is Escherichia coli (E. coli).

3. Method for producing O-succinylhomoserine, the method characterized by the fact that it comprises: culturing a microorganism of the genus Escherichia for the production of O-succinylhomoserine, in which the activity of glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase of SEQ ID NO: 23 in the microorganism is attenuated, compared to its endogenous activity by replacing the ATG codon with the GTG codon, or eliminated by gene deletion, and the productivity of O-succinylhomoserine is increased compared to the wild-type microorganism, the activities of the enzymes cystathionine gamma synthase (metB) of SEQ ID NO: 24 and homoserine kinase (thrB) of SEQ ID NO: 25 in the microorganism are eliminated and/or the activity of homoserine succinyltransferase (metA) of SEQ ID NO: 26 in the microorganism is replaced by the metA11 activity encoded by SEQ ID NO: 27 and recovery of O-succinylhomosserine from the medium culture or microorganism culture.

4. Method for producing O-succinylhomoserine, according to claim 3, characterized by the fact that the microorganism is E. coli.