BR112016022844B1

BR112016022844B1 - METHOD AND COMPOSITION FOR IMPROVING PROTEIN AND PEPTIDE SOLUBILITY IN AQUEOUS SOLUTION COMPRISING AN IMMUNOGLOBULIN FC FRAGMENT

Info

Publication number: BR112016022844B1
Application number: BR112016022844-8A
Authority: BR
Inventors: Hyung Kyu Lim; Jong Soo Lee; Dae Jin Kim; Sung Min Bae; Sung Youb Jung; Se Chang Kwon
Original assignee: Hanmi Pharm. Co., Ltd
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2024-03-19

Abstract

MÉTODO PARA APERFEIÇOAR A SOLUBILIDADE DE PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS UTILIZANDO-SE UMA LIGAÇÃO DE FRAGMENTO FC DE IMUNOGLOBULINAS. A presente invenção refere-se a um método para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos comparada àquela de uma pro-teína ou peptídeo fisiologicamente ativos que não é conjugada a um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que o método compreende conjugar a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos a um fragmento Fc de imunoglobulinas; e a uma composição para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, que compreende um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que a composição aperfeiçoa a solubilidade comparada a uma composição sem um fragmento Fc de imunoglobulinas.METHOD FOR IMPROVING THE SOLUBILITY OF PROTEINS AND PEPTIDES USING AN IMMUNOGLOBULIN FC FRAGMENT LINK. The present invention relates to a method for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide compared to that of a physiologically active protein or peptide that is not conjugated to an immunoglobulin Fc fragment, wherein the method comprises conjugating the protein or physiologically active peptides to an Fc fragment of immunoglobulins; and to a composition for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide, which comprises an immunoglobulin Fc fragment, wherein the composition improves solubility compared to a composition without an immunoglobulin Fc fragment.

Description

FIELD OF TECHNIQUE

[001] A presente invenção refere-se a um método para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos comparada àquela de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos que não seja conjugado a um fragmento Fc de imunoglobulinas, sendo que o método inclui a etapa de conjugar a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ao fragmento Fc de imunoglobulinas, e a uma composição para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fi- siologicamente ativos, incluindo um fragmento Fc de imunoglobulinas, no qual a composição aperfeiçoa a solubilidade comparada a uma composição sem um fragmento Fc de imunoglobulinas.[001] The present invention relates to a method for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide compared to that of a physiologically active protein or peptide that is not conjugated to an Fc fragment of immunoglobulins, the method including the step of conjugating the physiologically active protein or peptide to the Fc fragment of immunoglobulins, and to a composition for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide, including an Fc fragment of immunoglobulins, in which the composition improves the solubility compared to a composition without an Fc fragment of immunoglobulins.

FUNDAMENTALS OF THE TECHNIQUE

[002] Fármacos exibem ações farmacológicas somente quando forem dissolvidos, e, logo, a solubilidade de fármacos é estritamente relacionada à eficácia. Fármacos solúveis em água são facilmente preparados como formulações injetáveis, e são dissolvidos no trato gastrointestinal quando tomados como comprimidos. No entanto, fármacos fracamente solúveis em água estão presentes como agregados, tais como péletes no trato gastrointestinal quando tomados sem solubilização, e eles não são dissolvidos em moléculas únicas e dificilmente são absorvidos. Ademais, quando fármacos fracamente solúveis em água forem usados como formulações injetáveis sem solubilização, os vasos sanguíneos são obstruídos causando coagulação sanguínea. Portanto, os fármacos fracamente solúveis em água não podem ser usados como formulações injetáveis. A solubilidade de fármacos é um desafio principal em sua formulação.[002] Drugs exhibit pharmacological actions only when they are dissolved, and therefore, drug solubility is strictly related to effectiveness. Water-soluble drugs are easily prepared as injectable formulations, and are dissolved in the gastrointestinal tract when taken as tablets. However, poorly water-soluble drugs are present as aggregates such as pellets in the gastrointestinal tract when taken without solubilization, and they are not dissolved into single molecules and are difficult to absorb. Furthermore, when poorly water-soluble drugs are used as injectable formulations without solubilization, blood vessels are obstructed, causing blood clotting. Therefore, poorly water-soluble drugs cannot be used as injectable formulations. The solubility of drugs is a main challenge in their formulation.

[003] Um dos métodos de solubilização de fármacos conhecido consiste em usar um tensoativo como um solubilizante. Os tensoativos têm grupos hidrofóbicos e hidrofílicos em cada molécula. Em água, as cadeias de hidrocarboneto hidrofóbico são sequestradas e os grupos hidrofílicos são expostos à água para formar micelas esféricas. Os fármacos podem ser dissolvidos por encapsulação em micelas. No entanto, quando o tensoativo for usado em alta concentração nesse método, os fárma- cos podem não ser adequados para administração intravenosa. Ademais, a diluição de micro-emulsões abaixo da concentração crítica de micela dos tensoativos podem causar precipitação do fármaco nas micelas (Journal of Advanced Pharmacy Education & Research 2(1)32-67 (2012) ISSN 2249-3379). De modo correspondente, há uma demanda por um método de aumentar continuamente a solubilidade de fárma- cos independentemente da concentração da formulação sem usar tensoativos.[003] One of the known drug solubilization methods consists of using a surfactant as a solubilizer. Surfactants have hydrophobic and hydrophilic groups in each molecule. In water, hydrophobic hydrocarbon chains are sequestered and hydrophilic groups are exposed to water to form spherical micelles. Drugs can be dissolved by encapsulation in micelles. However, when the surfactant is used in high concentration in this method, the drugs may not be suitable for intravenous administration. Furthermore, the dilution of micro-emulsions below the critical micelle concentration of the surfactants can cause precipitation of the drug in the micelles (Journal of Advanced Pharmacy Education & Research 2(1)32-67 (2012) ISSN 2249-3379). Correspondingly, there is a demand for a method of continuously increasing the solubility of drugs regardless of formulation concentration without using surfactants.

REVELATION TECHNIQUE PROBLEM

[004] Fundamentando-se nesses antecedentes, os presentes inventores se esforçaram em desenvolver um método capaz de aperfeiçoar a solubilidade de um fármaco, tal como uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos. Como resultado, constatou-se que quando um fragmento Fc de imunoglobulinas for conjugado à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, a solubilidade da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é efetivamente aumentada para preparar facilmente uma formulação incluindo a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos em uma concentração farmaceuticamente eficaz, concluindo, assim, a presente invenção.[004] Based on this background, the present inventors endeavored to develop a method capable of improving the solubility of a drug, such as a physiologically active protein or peptide. As a result, it was found that when an Fc fragment of immunoglobulins is conjugated to the physiologically active protein or peptide, the solubility of the physiologically active protein or peptide is effectively increased to easily prepare a formulation including the physiologically active protein or peptide in a pharmaceutically effective concentration. , thus concluding the present invention.

TECHNIQUE SOLUTION

[005] Um objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um método para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos comparada àquela de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos que não seja conjugada a um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que o método compreende conjugar a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos a um fragmento Fc de imunoglobulinas.[005] An object of the present invention is to provide a method for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide compared to that of a physiologically active protein or peptide that is not conjugated to an immunoglobulin Fc fragment, wherein the method comprises conjugating the physiologically active protein or peptide to an Fc fragment of immunoglobulins.

[006] Outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma composição para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologi- camente ativos, que compreende um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que a composição aperfeiçoar a solubilidade comparada a uma composição sem um fragmento Fc de imunoglobulinas.[006] Another objective of the present invention is to provide a composition for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide, which comprises an Fc fragment of immunoglobulins, wherein the composition improves the solubility compared to a composition without an Fc fragment. of immunoglobulins.

ADVANTAGEOUS EFFECTS

[007] Quando uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos for conjugada a um fragmento Fc de imunoglobulinas de acordo com a presente invenção, a solubilidade da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos pode ser efetivamente aperfeiçoada, e, desse modo, é eficaz na formulação de vários fármacos.[007] When a physiologically active protein or peptide is conjugated to an Fc fragment of immunoglobulins according to the present invention, the solubility of the physiologically active protein or peptide can be effectively improved, and thus it is effective in the formulation of various drugs .

DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[008] A Figura 1 mostra curvas de calibração padrão de insulina e um conjugado de insulina de ação prolongada.[008] Figure 1 shows standard calibration curves of insulin and a long-acting insulin conjugate.

[009] A Figura 2 mostra um resultado do exame da solubilidade de insulina e do conjugado de insulina de ação prolongada de acordo com a composição da Tabela 1, em que a insulina mostra uma solubilidade de 0,628 mg/mL e a conjugado de insulina de ação prolongada mostra uma solubilidade de 15 mg/mL, com base em insulina.[009] Figure 2 shows a result of examining the solubility of insulin and the long-acting insulin conjugate according to the composition of Table 1, in which the insulin shows a solubility of 0.628 mg/mL and the insulin conjugate of Long-acting shows a solubility of 15 mg/mL, based on insulin.

[010] A Figura 3 mostra curvas de calibração padrão de um derivado de oxin- tomodulina de SEQ ID NO: 27 e um conjugado de derivado de oxintomodulina-PEG- fragmento Fc de imunoglobulinas.[010] Figure 3 shows standard calibration curves of an oxyntomodulin derivative of SEQ ID NO: 27 and an oxyntomodulin derivative-PEG-Immunoglobulin Fc fragment conjugate.

[011] A Figura 4 mostra um resultado do exame da solubilidade do derivado de oxintomodulina de SEQ ID NO: 27 e do conjugado de derivado de oxintomoduli- na-PEG-fragmento Fc de imunoglobulinas de acordo com a composição da Tabela 4, em que o derivado de oxintomodulina mostra uma solubilidade de 0,188 mg/mL e o conjugado mostra uma solubilidade de 11 mg/mL, com base em oxintomodulina.[011] Figure 4 shows a result of examining the solubility of the oxyntomodulin derivative of SEQ ID NO: 27 and the oxyntomodulin derivative-PEG-Fc fragment conjugate of immunoglobulins according to the composition of Table 4, in which the oxyntomodulin derivative shows a solubility of 0.188 mg/mL and the conjugate shows a solubility of 11 mg/mL, based on oxyntomodulin.

BEST WAY

[012] Um aspecto da presente invenção proporciona um método para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos comparada àquela de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos que não seja conjugada a um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que o método inclui conjugar a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos a um fragmento Fc de imunoglobulinas.[012] One aspect of the present invention provides a method for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide compared to that of a physiologically active protein or peptide that is not conjugated to an immunoglobulin Fc fragment, wherein the method includes conjugating the protein or physiologically active peptide to an Fc fragment of immunoglobulins.

[013] Em uma modalidade específica, o fragmento Fc de imunoglobulinas aplicado ao método de acordo com a presente invenção é um fragmento Fc derivado a partir de IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.[013] In a specific embodiment, the immunoglobulin Fc fragment applied to the method according to the present invention is an Fc fragment derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.

[014] Em outra modalidade específica, o fragmento Fc de imunoglobulinas aplicado ao método de acordo com a presente invenção é um híbrido de domínios em que cada domínio tem uma origem diferente derivada a partir da imunoglobulina selecionada a partir do grupo que consiste em IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.[014] In another specific embodiment, the immunoglobulin Fc fragment applied to the method according to the present invention is a hybrid of domains in which each domain has a different origin derived from the immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

[015] Em ainda outra modalidade específica, o fragmento Fc de imunoglobu- linas aplicado ao método de acordo com a presente invenção é um dímero ou um multímero que consiste em imunoglobulinas de cadeia única da mesma origem.[015] In yet another specific embodiment, the Fc fragment of immunoglobulins applied to the method according to the present invention is a dimer or a multimer consisting of single-chain immunoglobulins of the same origin.

[016] Em ainda outra modalidade específica, o fragmento Fc de imunoglobu- linas aplicado ao método de acordo com a presente invenção é um fragmento Fc de IgG4 aglicosilado humano.[016] In yet another specific embodiment, the immunoglobulin Fc fragment applied to the method according to the present invention is an aglycosylated human IgG4 Fc fragment.

[017] Em ainda outra modalidade específica, a etapa de conjugação de acordo com a presente invenção inclui ligar uma proteína ou peptídeo fisiologica- mente ativos a um fragmento Fc de imunoglobulinas através de um polímero de não- peptidila.[017] In yet another specific embodiment, the conjugation step according to the present invention includes linking a physiologically active protein or peptide to an Fc fragment of immunoglobulins through a non-peptidyl polymer.

[018] Em ainda outra modalidade específica, a proteína ou peptídeo fisiologi- camente ativos conjugada ao fragmento Fc de imunoglobulinas preparado pelo método de acordo com a presente invenção se encontra sob a forma de uma proteína de fusão.[018] In yet another specific embodiment, the physiologically active protein or peptide conjugated to the Fc fragment of immunoglobulins prepared by the method according to the present invention is in the form of a fusion protein.

[019] Em ainda outra modalidade específica, o polímero de não-peptidila aplicado ao método de acordo com a presente invenção é um polietileno glicol.[019] In yet another specific embodiment, the non-peptidyl polymer applied to the method according to the present invention is a polyethylene glycol.

[020] Em ainda outra modalidade específica, o polímero de não-peptidila aplicado ao método de acordo com a presente invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em polipropileno glicol, copolímero de etileno glicol e propileno glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, polivinil etil éter, um polímero biodegradável, tal como ácido polilático (PLA) e ácido polilático- glicólico (PLGA), um polímero lipídico, quitina, ácido hialurônico, e uma combinação dos mesmos.[020] In yet another specific embodiment, the non-peptidyl polymer applied to the method according to the present invention is selected from the group consisting of polypropylene glycol, ethylene glycol and propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, a biodegradable polymer, such as polylactic acid (PLA) and polylactic glycolic acid (PLGA), a lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and a combination thereof.

[021] Em ainda outra modalidade específica, o método de acordo com a presente invenção consiste em aperfeiçoar a solubilidade da proteína ou peptídeo fisio- logicamente ativos em uma solução aquosa.[021] In yet another specific embodiment, the method according to the present invention consists of improving the solubility of the physiologically active protein or peptide in an aqueous solution.

[022] Em ainda outra modalidade específica, a solução aquosa aplicada ao método de acordo com a presente invenção inclui uma solução tampão de ácido cítrico ou ácido acético, polissorbato como um tensoativo não-iônico, manitol como um álcool de açúcar, e cloreto de sólido ou metionina como um agente isotônico.[022] In yet another specific embodiment, the aqueous solution applied to the method according to the present invention includes a buffer solution of citric acid or acetic acid, polysorbate as a nonionic surfactant, mannitol as a sugar alcohol, and sodium chloride. solid or methionine as an isotonic agent.

[023] Em ainda outra modalidade específica, a solução aquosa aplicada ao método de acordo com a presente invenção tem um pH de 5,0 a 7,0.[023] In yet another specific embodiment, the aqueous solution applied to the method according to the present invention has a pH of 5.0 to 7.0.

[024] Em ainda outra modalidade específica, a proteína ou peptídeo fisiologi- camente ativos no método de acordo com a presente invenção é exendina-4, glucagon, peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1), peptídeo tipo glucagon 2 (GLP-2), hormônio da paratireoide (PTH), calcitonina, insulina ou oxintomodulina.[024] In yet another specific embodiment, the physiologically active protein or peptide in the method according to the present invention is exendin-4, glucagon, glucagon-like peptide 1 (GLP-1), glucagon-like peptide 2 (GLP-2 ), parathyroid hormone (PTH), calcitonin, insulin, or oxyntomodulin.

[025] Em ainda outra modalidade específica, a solução aquosa aplicada ao método de acordo com a presente invenção inclui, ainda, um tensoativo.[025] In yet another specific embodiment, the aqueous solution applied to the method according to the present invention also includes a surfactant.

[026] Outro aspecto proporciona uma composição para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, incluindo um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que a composição aperfeiçoa a solubilidade comparada uma composição sem um fragmento Fc de imunoglobulinas.[026] Another aspect provides a composition for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide, including an immunoglobulin Fc fragment, wherein the composition improves solubility compared to a composition without an immunoglobulin Fc fragment.

[027] Em uma modalidade específica, a composição inclui um conjugado de proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e um fragmento Fc de imunoglobulinas em que uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é ligada a um fragmento Fc de imunoglobulinas através de um ligante de peptidila ou um ligante de não- peptidila como um ingrediente ativo.[027] In a specific embodiment, the composition includes a physiologically active protein or peptide conjugate and an immunoglobulin Fc fragment in which a physiologically active protein or peptide is linked to an immunoglobulin Fc fragment through a peptidyl linker or a linker of non-peptidyl as an active ingredient.

MODE FOR INVENTION

[028] A presente invenção proporciona um método para aperfeiçoar a solubilidade de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos comparada àquela de uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos que não seja conjugada a um fragmento Fc de imunoglobulinas, em que o método inclui conjugar a proteína ou pep- tídeo fisiologicamente ativos a um fragmento Fc de imunoglobulinas. O método da presente invenção mostra um efeito de aperfeiçoamento da solubilidade da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos mesmo sem a adição de um tensoativo a um solvente. No caso da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, especificamente, insulina, oxintomodulina, etc., que consiste em um componente de fármacos de proteína conhecidos, a mesma mostra baixa solubilidade na faixa de pH de 5 a 7, que é a faixa de pH genérica de formulações para administração corpórea. De modo correspondente, há uma dificuldade em que a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é preparada em formulações em uma concentração desejada. Há também um problema no qual as formulações injetáveis das mesmas podem causar precipitação no corpo gerando efeitos colaterais indesejados. De modo surpreendente, a presente invenção confirmou que quando a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos for conjugada a um fragmento Fc de imunoglobulinas, a mesma mostra uma solubilidade aumentada na faixa de pH anterior. Ou seja, o método da presente invenção tem um efeito de aperfeiçoar a solubilidade do peptídeo ou proteína, tais como insulina ou oxintomodulina, que mostram baixa solubilidade na faixa de pH ácida fraca de 5 a 7.[028] The present invention provides a method for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide compared to that of a physiologically active protein or peptide that is not conjugated to an immunoglobulin Fc fragment, wherein the method includes conjugating the protein or pep - physiologically active compounds to an Fc fragment of immunoglobulins. The method of the present invention shows an effect of improving the solubility of the physiologically active protein or peptide even without the addition of a surfactant to a solvent. In the case of physiologically active protein or peptide, specifically, insulin, oxyntomodulin, etc., which consists of a component of known protein drugs, it shows low solubility in the pH range of 5 to 7, which is the generic pH range. of formulations for bodily administration. Correspondingly, there is a difficulty in which the physiologically active protein or peptide is prepared in formulations at a desired concentration. There is also a problem in which their injectable formulations can cause precipitation in the body, generating unwanted side effects. Surprisingly, the present invention has confirmed that when the physiologically active protein or peptide is conjugated to an Fc fragment of immunoglobulins, it shows increased solubility in the above pH range. That is, the method of the present invention has an effect of improving the solubility of the peptide or protein, such as insulin or oxyntomodulin, which show low solubility in the weak acidic pH range of 5 to 7.

[029] Conforme o uso em questão, o termo “solubilidade” se refere à extensão na qual a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é dissolvida em um solvente apropriado para administração no corpo humano. Em detalhes, o mesmo se refere a uma extensão de saturação do soluto em um dado solvente em uma temperatura específica. A solubilidade pode ser medida determinando-se uma concentração de soluto no ponto de saturação. Por exemplo, a concentração pode ser medida usando um espectrofotômetro de UV ou HPLC após adicionar uma quantidade em excesso do soluto a um solvente, e, então, agitando e filtrando a solução, mas não se limita a esses. Ao usar a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos para tratamento, é importante dissolver uma quantidade farmaceuticamente eficaz da mesma em um solvente, que é um fator importante que deve ser considerado ao determinar a concentração da formulação liofilizada mediante a reconstituição ou concentração de um ingrediente ativo de uma formulação líquida.[029] According to the use in question, the term “solubility” refers to the extent to which the physiologically active protein or peptide is dissolved in a solvent suitable for administration into the human body. In detail, it refers to an extent of saturation of the solute in a given solvent at a specific temperature. Solubility can be measured by determining a solute concentration at the saturation point. For example, concentration can be measured using a UV or HPLC spectrophotometer after adding an excess amount of the solute to a solvent, and then stirring and filtering the solution, but is not limited to these. When using the physiologically active protein or peptide for treatment, it is important to dissolve a pharmaceutically effective amount thereof in a solvent, which is an important factor that must be considered when determining the concentration of the lyophilized formulation upon reconstitution or concentration of an active ingredient of a liquid formulation.

[030] Confirmou-se que quando a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos for conjugada com um fragmento Fc de imunoglobulinas, sua solubilidade é consideravelmente aumentada comparada a uma proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos à qual o fragmento não é ligado. Tendo isso como base, a presente invenção é caracterizada pelo fato de que a solubilidade da proteína ou peptídeo fisiologica- mente ativos é aperfeiçoada em uma solução aquosa.[030] It has been confirmed that when the physiologically active protein or peptide is conjugated with an Fc fragment of immunoglobulins, its solubility is considerably increased compared to a physiologically active protein or peptide to which the fragment is not bound. Taking this as a basis, the present invention is characterized by the fact that the solubility of the physiologically active protein or peptide is improved in an aqueous solution.

[031] De acordo com uma modalidade da presente invenção, quando insulina ou oxintomodulina for usada como um peptídeo fisiologicamente ativo representativo e imunoglobulina Fc for conjugada ao mesmo, a solubilidade de insulina e oxin- tomodulina foi consideravelmente aumentada (Figuras 2 e 4).[031] According to an embodiment of the present invention, when insulin or oxyntomodulin was used as a representative physiologically active peptide and immunoglobulin Fc was conjugated to it, the solubility of insulin and oxyntomodulin was considerably increased (Figures 2 and 4).

[032] Conforme o uso em questão, o termo “solução aquosa” se refere a uma solução que é destinada a dissolver a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos. A solução aquosa é uma solução adequada para administração da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ao corpo humano. Em uma modalidade específica da presente invenção, a solução aquosa pode ter um pH neutro ou ácido fraco, por exemplo, um pH de 5,0 a 7,0. A solução aquosa aplicada ao método da presente invenção não se limita a um tipo particular, mas pode ter uma solução tampão de ácido cítrico ou ácido acético contendo polissorbato como um tensoativo não-iônico, manitol como um álcool de açúcar, e cloreto de sódio ou metionina como um agente isotônico.[032] Depending on the use in question, the term “aqueous solution” refers to a solution that is intended to dissolve the physiologically active protein or peptide. The aqueous solution is a suitable solution for administering the physiologically active protein or peptide to the human body. In a specific embodiment of the present invention, the aqueous solution may have a neutral or weak acidic pH, for example, a pH of 5.0 to 7.0. The aqueous solution applied to the method of the present invention is not limited to a particular type, but may have a buffer solution of citric acid or acetic acid containing polysorbate as a nonionic surfactant, mannitol as a sugar alcohol, and sodium chloride or methionine as an isotonic agent.

[033] No método de acordo com a presente invenção, o fragmento Fc de imunoglobulinas pode ser ligado à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos através de um polímero de não-peptidila. De modo específico, o fragmento Fc de imuno- globulinas pode ser ligado ao polímero de não-peptidila que é ligado à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, ou um fragmento Fc de imunoglobulinas-polímero de não-peptidila pode ser usado à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos.[033] In the method according to the present invention, the Fc fragment of immunoglobulins can be linked to the physiologically active protein or peptide through a non-peptidyl polymer. Specifically, the immunoglobulin Fc fragment can be linked to the non-peptidyl polymer that is linked to the physiologically active protein or peptide, or an immunoglobulin Fc fragment-non-peptidyl polymer can be used to the physiologically active protein or peptide. active.

[034] Conforme o uso em questão, o termo “polímero de não-peptidila” se refere a um polímero biocompatível incluindo uma ou mais unidades de repetição ligadas entre si por uma ligação covalente excluindo uma ligação peptídica.[034] According to the use in question, the term “non-peptidyl polymer” refers to a biocompatible polymer including one or more repeating units linked together by a covalent bond excluding a peptide bond.

[035] O polímero de não-peptidila que pode ser usado na presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, polipropile- no glicol, copolímero de etileno glicol e propileno glicol, poliois polioxietilados, álcool polivinílico, polissacarídeos, dextrano, polivinil etil éter, polímeros biodegradáveis, como PLA (ácido polilático) e PLGA (ácido polilático-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurônico, e combinações dos mesmos, e, de preferência, sem limitação, polietileno glicol. Da mesma forma, derivados desses que são notórios na técnica e facilmente preparados dentro das habilidades da técnica são incluídos no escopo da presente invenção.[035] The non-peptidyl polymer that can be used in the present invention can be selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol and propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymers such as PLA (polylactic acid) and PLGA (polylactic-glycolic acid), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid, and combinations thereof, and, preferably, without limitation, polyethylene glycol. Likewise, derivatives thereof which are well known in the art and readily prepared within the skill of the art are included within the scope of the present invention.

[036] Qualquer polímero de não-peptidila pode ser usado sem limitação, desde que seja um polímero que tenha resistência a enzimas proteolíticas in vivo, e, logo, não é facilmente clivado por enzimas proteolíticas para permitir que o fragmento Fc de imunoglobulinas funcione como um carreador. O polímero de não-peptidila tem um peso molecular na faixa de 1 kDa a 100 kDa, e, de modo específico, de 1 kDa a 20 kDa. Da mesma forma, o polímero de não-peptidila da presente invenção, ligado ao fragmento Fc de imunoglobulinas, pode ser um polímero ou uma combinação de diferentes tipos de polímeros.[036] Any non-peptidyl polymer can be used without limitation, as long as it is a polymer that has resistance to proteolytic enzymes in vivo, and therefore is not easily cleaved by proteolytic enzymes to allow the Fc fragment of immunoglobulins to function as a carrier. The non-peptidyl polymer has a molecular weight in the range of 1 kDa to 100 kDa, and specifically 1 kDa to 20 kDa. Likewise, the non-peptidyl polymer of the present invention, linked to the Fc fragment of immunoglobulins, can be a polymer or a combination of different types of polymers.

[037] O polímero de não-peptidila pode ter um grupo reativo capaz de se ligar ao fragmento Fc de imunoglobulinas e ao fármaco de proteína ou peptídeo, e, logo, funciona como um ligante para ligar o fragmento Fc de imunoglobulinas e a proteína ou peptídeo.[037] The non-peptidyl polymer may have a reactive group capable of binding to the Fc fragment of immunoglobulins and the protein or peptide drug, and therefore functions as a ligand to bind the Fc fragment of immunoglobulins and the protein or peptide.

[038] A ligação da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ao fragmento Fc de imunoglobulinas usando o polímero de não-peptidila como um ligante pode ser alcançada realizando-se (1) a reação do polímero de não-peptidila com qualquer um dentre a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o fragmento Fc de imunoglo- bulinas; e (2) a reação do produto de reação da etapa (1) com outro dentre a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o fragmento Fc de imunoglobulinas, sequencialmente.[038] Binding of the physiologically active protein or peptide to the Fc fragment of immunoglobulins using the non-peptidyl polymer as a linker can be achieved by carrying out (1) the reaction of the non-peptidyl polymer with any of the protein or physiologically active peptides and the Fc fragment of immunoglobulins; and (2) reacting the reaction product of step (1) with another of the physiologically active protein or peptide and the immunoglobulin Fc fragment, sequentially.

[039] No entanto, se o fragmento Fc de imunoglobulinas for ligado ao polímero de não-peptidila tendo um grupo reativo em ambas as extremidades na etapa (1), uma parte dos produtos da etapa (1) pode estar sob a forma de uma ponte na qual dois terminais N do fragmento Fc de imunoglobulinas são ligados a ambas as extremidades do polímero de não-peptidila sob condições de reação específicas. Os produtos da etapa (1) sob a forma de uma ponte podem evitar uma reação de aco-plamento secundária de ligação da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos à mesma ou podem reduzir consideravelmente um rendimento de acoplamento. Portanto, em uma modalidade, a fim de evitar a formação de ponte entre o fragmento Fc de imunoglobulinas e o fragmento Fc de imunoglobulinas, o polímero de não-peptidila e a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos pode ser primeiramente reagida, e, então, a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ligados ao polímero de não-peptidila pode ser reagida com o fragmento Fc de imunoglobulinas, sequencialmente. No entanto, não há necessidade de realizar o método de aperfeiçoar a solubilidade da presente invenção nessa ordem.[039] However, if the Fc fragment of immunoglobulins is linked to the non-peptidyl polymer having a reactive group at both ends in step (1), a part of the products of step (1) may be in the form of a bridge in which two N termini of the Fc fragment of immunoglobulins are linked to both ends of the non-peptidyl polymer under specific reaction conditions. The products of step (1) in the form of a bridge can prevent a secondary coupling reaction of binding the physiologically active protein or peptide to it or can considerably reduce a coupling yield. Therefore, in one embodiment, in order to avoid bridging between the immunoglobulin Fc fragment and the immunoglobulin Fc fragment, the non-peptidyl polymer and the physiologically active protein or peptide can be first reacted, and then the Physiologically active protein or peptide bound to the non-peptidyl polymer can be reacted with the Fc fragment of immunoglobulins sequentially. However, there is no need to carry out the method of improving the solubility of the present invention in that order.

[040] Na etapa (1), uma reação química para ligar o polímero de não- peptidila à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ou ao fragmento Fc de imu- noglobulinas pode ser realizada por um método conhecido. Por exemplo, o polímero de não-peptidila tendo um grupo reativo em ambas as extremidades pode ser reagido com a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ou o fragmento Fc de imuno- globulinas a 0°C a 25°C durante 1 hora a 16 horas. Através dessa reação, a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ou o fragmento Fc de imunoglobulinas podem ser covalentemente ligados a um polímero de não-peptidila através do grupo reativo.[040] In step (1), a chemical reaction to link the non-peptidyl polymer to the physiologically active protein or peptide or to the Fc fragment of immunoglobulins can be carried out by a known method. For example, the non-peptidyl polymer having a reactive group at both ends can be reacted with the physiologically active protein or peptide or the Fc fragment of immunoglobulins at 0°C to 25°C for 1 hour to 16 hours. Through this reaction, the physiologically active protein or peptide or the Fc fragment of immunoglobulins can be covalently linked to a non-peptidyl polymer through the reactive group.

[041] A reação de ligação da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ao polímero de não-peptidila na etapa (1) pode ser realizada em uma solução de reação contendo um solvente orgânico. Nesse sentido, o solvente orgânico pode ser qualquer solvente orgânico geralmente usado na técnica, mas não se limita a, especificamente a um álcool primário, secundário ou terciário, e um álcool tendo de 1 a 10 átomos de carbono. De modo mais específico, o álcool pode ser isopropanol, etanol ou metanol. O solvente orgânico pode ser livremente selecionado a partir de solventes orgânicos adequados para o tipo de proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos. Ademais, o solvente orgânico pode ser usado para ligação entre a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o polímero de não-peptidila, mas não se limita a, especificamente incluído em uma proporção de 10% a 60%, de modo mais específico, em uma proporção de 30% a 55 %, e de modo muito mais específico, em uma proporção de 45% a 55%, com base na proporção total da solução de reação. Ademais, o pH da solução de reação pode ser, sem limitação, especificamente 4,5 a 7,0 e, de modo mais específico, 5,0 a 6,5.[041] The reaction of binding the physiologically active protein or peptide to the non-peptidyl polymer in step (1) can be carried out in a reaction solution containing an organic solvent. In this sense, the organic solvent can be any organic solvent generally used in the art, but is not limited to, specifically a primary, secondary or tertiary alcohol, and an alcohol having from 1 to 10 carbon atoms. More specifically, the alcohol can be isopropanol, ethanol or methanol. The organic solvent can be freely selected from organic solvents suitable for the type of physiologically active protein or peptide. Furthermore, the organic solvent can be used for binding between the physiologically active protein or peptide and the non-peptidyl polymer, but is not limited to, specifically included in a proportion of 10% to 60%, more specifically, in a proportion of 30% to 55%, and much more specifically, in a proportion of 45% to 55%, based on the total proportion of the reaction solution. Furthermore, the pH of the reaction solution may be, without limitation, specifically 4.5 to 7.0 and, more specifically, 5.0 to 6.5.

[042] Ademais, de acordo com o tipo do grupo reativo que participa da reação, um agente redutor pode ser adicionalmente incluído para realizar as etapas anteriores.[042] Furthermore, depending on the type of reactive group participating in the reaction, a reducing agent can be additionally included to carry out the previous steps.

[043] De modo específico, o agente redutor da presente invenção se refere a qualquer agente redutor conhecido na técnica que funciona para reduzir uma ligação dupla de imina reversível produzida a partir da ligação entre o grupo aldeído do polímero de não-peptidila e um grupo amina do polipeptídeo (proteína ou peptídeo fi- siologicamente ativos, fragmento Fc de imunoglobulinas) para formar uma ligação covalente. Em relação aos objetivos da presente invenção, o agente redutor pode ser incluído na solução de reação a fim de permitir a ligação covalente entre o polímero de não-peptidila e a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ou o fragmento Fc de imunoglobulinas. O agente redutor da presente invenção pode ser qualquer agente redutor conhecido na técnica, sem limitação, de preferência, cianoboroidreto de sódio, complexo de piridina e borano, boroidreto de sódio, complexo de dimetila- mina e borano, complexo de trimetilamina e borano, ou triacetóxi boroidreto de sódio. Um agente redutor adequado pode ser selecionado dependendo dos tipos de polipeptídeo fisiologicamente ativo a região constante de imunoglobulina e o solvente de reação.[043] Specifically, the reducing agent of the present invention refers to any reducing agent known in the art that functions to reduce a reversible imine double bond produced from the bond between the aldehyde group of the non-peptidyl polymer and a group amine of the polypeptide (physiologically active protein or peptide, Fc fragment of immunoglobulins) to form a covalent bond. In relation to the objects of the present invention, the reducing agent can be included in the reaction solution in order to allow covalent bonding between the non-peptidyl polymer and the physiologically active protein or peptide or the Fc fragment of immunoglobulins. The reducing agent of the present invention may be any reducing agent known in the art, without limitation, preferably sodium cyanoborohydride, pyridine borane complex, sodium borohydride, dimethylamine borane complex, trimethylamine borane complex, or sodium triacetoxy borohydride. A suitable reducing agent can be selected depending on the types of physiologically active polypeptide, immunoglobulin constant region and the reaction solvent.

[044] Ademais, o agente redutor pode ser incluído em uma concentração final de 1 mM a 20 mM para uma reação de ligação (reação da etapa (1)) entre a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o polímero de não-peptidila, ou o fragmento Fc de imunoglobulinas e o polímero de não-peptidila, e em uma concentração final de 1 mM a 100 mM para a reação de acoplamento (reação da etapa (2)).[044] Furthermore, the reducing agent can be included in a final concentration of 1 mM to 20 mM for a binding reaction (reaction of step (1)) between the physiologically active protein or peptide and the non-peptidyl polymer, or the Fc fragment of immunoglobulins and the non-peptidyl polymer, and at a final concentration of 1 mM to 100 mM for the coupling reaction (reaction from step (2)).

[045] Entretanto, o polímero de não-peptidila pode ter um grupo reativo em ambas as extremidades, cada grupo reativo capaz de se ligar ao fragmento Fc de imunoglobulinas e à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, especificamente, cada grupo reativo capaz de se ligar a um grupo amina da terminação N ou lisina, ou um grupo tiol de cisteína da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos; ou o fragmento Fc de imunoglobulinas. O grupo reativo em ambas as extremidades é especificamente selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo de aldeído reativo, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo de maleimida, e um derivado de succinimida. Nesse sentido, o derivado de succinimida pode ser succi- nimidil carboximetil, valerato de succinimidila, metilbutanoato de succinimidila, metil- propionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, N-hidróxi succinimida, ou carbonato de succinimidila, mas não se limita a esses. Qualquer grupo reativo pode ser usado sem limitação, desde que se ligue ao grupo amina ou grupo tiol de um resíduo de aminoácido do fragmento Fc de imunoglobuli- nas e a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos.[045] However, the non-peptidyl polymer may have a reactive group at both ends, each reactive group capable of binding to the Fc fragment of immunoglobulins and the physiologically active protein or peptide, specifically, each reactive group capable of binding to an N-terminal amino group or lysine, or a cysteine thiol group of the physiologically active protein or peptide; or the Fc fragment of immunoglobulins. The reactive group at both ends is specifically selected from the group consisting of a reactive aldehyde group, a propionaldehyde group, a butyraldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative. In this sense, the succinimide derivative may be succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinimidyl propionate, N-hydroxy succinimide, or succinimidyl carbonate, but not limited to to these. Any reactive group can be used without limitation, as long as it binds to the amine group or thiol group of an amino acid residue of the Fc fragment of immunoglobulins and the physiologically active protein or peptide.

[046] Em particular, quando o polímero de não-peptidila tiver um grupo aldeído reativo em ambas as extremidades, o mesmo é eficaz em se ligar à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e à imunoglobulina em ambas as extremidades com reações não-específicas mínimas. Um produto final gerado por alquilação redutiva por uma ligação de aldeído é muito mais estável do que quando ligado por uma ligação de amida. O grupo aldeído reativo se liga seletivamente à terminação N em um pH baixo, e pode se ligar a um resíduo de lisina (Lys) para formar uma ligação covalente em um pH alto, por exemplo, em um pH de 9,0.[046] In particular, when the non-peptidyl polymer has a reactive aldehyde group at both ends, it is effective in binding to the physiologically active protein or peptide and immunoglobulin at both ends with minimal non-specific reactions. A final product generated by reductive alkylation by an aldehyde bond is much more stable than when bonded by an amide bond. The reactive aldehyde group selectively binds to the N-terminus at a low pH, and can bind to a lysine residue (Lys) to form a covalent bond at a high pH, for example at a pH of 9.0.

[047] Os grupos reativos em ambas as extremidades do ligante como o polímero de não-peptidila podem ser iguais ou diferentes entre si. Por exemplo, o ligan- te pode possuir um grupo maleimida em uma extremidade, e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído, ou um grupo butil aldeído na outra extremidade. Quando um polietileno glicol tendo um grupo hidroxila reativo em ambas as extremidades for usado como o polímero de não-peptidila, o grupo hidroxila pode ser ativado em vá-rios grupos reativos por reações químicas conhecidas, ou um polietileno glicol co- mercialmente disponível tendo um grupo reativo modificado pode ser usado para preparar um conjugado de proteína de ação prolongada da presente invenção.[047] The reactive groups at both ends of the linker such as the non-peptidyl polymer can be the same or different from each other. For example, the linker may have a maleimide group at one end, and an aldehyde group, a propionaldehyde group, or a butyl aldehyde group at the other end. When a polyethylene glycol having a reactive hydroxyl group at both ends is used as the non-peptidyl polymer, the hydroxyl group can be activated into several reactive groups by known chemical reactions, or a commercially available polyethylene glycol having a Modified reactive group can be used to prepare a long-acting protein conjugate of the present invention.

[048] Ademais, os grupos reativos do polímero de não-peptidila podem se ligar ao grupo amina N-terminal ou ao grupo amina de cadeia lateral do resíduo de lisina da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e do fragmento Fc de imuno- globulinas, respectivamente, mas não se limitam particularmente ao mesmo. Nesse sentido, o resíduo de lisina na proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e no fragmento Fc de imunoglobulinas não se limita a uma posição particular, e exemplos não-limitantes do resíduo de lisina também incluem aminoácidos não-naturais e derivados de Lys, desde que tenham o grupo amina capaz de se ligar ao grupo reativo do polímero de não-peptidila, bem como uma lisina natural.[048] Furthermore, the reactive groups of the non-peptidyl polymer can bind to the N-terminal amine group or the side-chain amine group of the lysine residue of the physiologically active protein or peptide and the Fc fragment of immunoglobulins, respectively. , but are not particularly limited to the same. In this sense, the lysine residue in the physiologically active protein or peptide and in the Fc fragment of immunoglobulins is not limited to a particular position, and non-limiting examples of the lysine residue also include non-natural amino acids and Lys derivatives, as long as they have the amine group capable of binding to the reactive group of the non-peptidyl polymer, as well as a natural lysine.

[049] Entretanto, quando a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos for primeiramente reagida com o polímero de não-peptidila na etapa (1), a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o polímero de não-peptidila são reagidos em uma razão molar de 1:1 a 1:20, e na etapa (2), o conjugado da proteína ou peptídeo fisio- logicamente ativos e do polímero de não-peptidila que é um produto da etapa (1) é reagido com o fragmento Fc de imunoglobulinas em uma razão molar de 1:0,5 a 1:10, mas não se limita à mesma.[049] However, when the physiologically active protein or peptide is first reacted with the non-peptidyl polymer in step (1), the physiologically active protein or peptide and the non-peptidyl polymer are reacted in a molar ratio of 1: 1 to 1:20, and in step (2), the conjugate of the physiologically active protein or peptide and the non-peptidyl polymer that is a product of step (1) is reacted with the Fc fragment of immunoglobulins in a ratio molar range from 1:0.5 to 1:10, but not limited to the same.

[050] Além disso, o método da presente invenção pode incluir um processo para separar e purificar o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero de não-peptidila ou o conjugado de fragmento Fc de imunoglobulinas-polímero de não-peptidila que é o produto da etapa (1) antes da etapa (2) após a etapa (1). Esse processo pode ser realizado usando vários métodos de separação, como cromato- grafia, conhecidos na técnica.[050] Furthermore, the method of the present invention may include a process for separating and purifying the physiologically active polypeptide-non-peptidyl polymer conjugate or the immunoglobulin Fc fragment-non-peptidyl polymer conjugate that is the product of step (1) before step (2) after step (1). This process can be carried out using various separation methods, such as chromatography, known in the art.

[051] Na etapa (2), quando o conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo-polímero de não-peptidila for reagido com o fragmento Fc de imunoglobulinas, uma condição de pH é, sem limitação, igual a um pH de 4,0 a 9,0.[051] In step (2), when the physiologically active polypeptide-non-peptidyl polymer conjugate is reacted with the Fc fragment of immunoglobulins, a pH condition is, without limitation, equal to a pH of 4.0 to 9 ,0.

[052] Entretanto, a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o fragmento Fc de imunoglobulinas podem ser conjugados entre si sob a forma de uma proteína de fusão.[052] However, the physiologically active protein or peptide and the Fc fragment of immunoglobulins can be conjugated to each other in the form of a fusion protein.

[053] Conforme o uso em questão, o termo “proteína de fusão” se refere a uma proteína criada através da união de dois ou mais genes que se codificaram originalmente para proteínas separadas. A proteína de fusão pode ser preparada artificialmente por tecnologia de DNA recombinante. Ademais, a proteína de fusão pode estar sob uma forma na qual a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e o fragmento Fc de imunoglobulinas são ligados entre si sem um ligante ou um ligante de peptidila.[053] According to the usage in question, the term “fusion protein” refers to a protein created through the union of two or more genes that were originally coded for separate proteins. The fusion protein can be prepared artificially by recombinant DNA technology. Furthermore, the fusion protein may be in a form in which the physiologically active protein or peptide and the immunoglobulin Fc fragment are linked together without a linker or a peptidyl linker.

[054] No presente documento, o ligante de peptidila se refere a um peptídeo que liga dois tipos de proteínas que constituem a proteína de fusão. O ligante de peptidila pode ser incluído a fim de enovelar independentemente as duas proteínas que constituem a proteína de fusão ou manter cada função de duas proteínas mesmo sob a forma da proteína de fusão, mas não se limita à mesma.[054] In this document, the peptidyl linker refers to a peptide that links two types of proteins that constitute the fusion protein. The peptidyl linker may be included in order to independently fold the two proteins constituting the fusion protein or maintain each function of the two proteins even in the form of the fusion protein, but is not limited thereto.

[055] Conforme o uso em questão, o termo “fragmento Fc de imunoglobuli- nas” se refere à região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e à região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e a região constante de cadeia leve 1 (CL1) de uma imunoglobulina, e pode incluir uma região de dobradiça na região constante de cadeia pesada. Ademais, o fragmento Fc de imunoglobulinas da presente invenção pode ser um fragmento Fc de imunoglobuli- nas estendido incluindo uma parte ou toda a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante de cadeia leve 1 (CL1), exceto pelas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de uma imunoglobulina, desde que tenha um efeito substancialmente similar ou melhor que ao da proteína nativa. Da mesma forma, a mesma pode ser uma região tendo uma exclusão em uma porção relativamente longa da sequência de aminoácido de CH2 e/ou CH3. Ou seja, o fragmento Fc de imunoglo- bulinas da presente invenção pode incluir (1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, (2) um domínio CH1 e um domínio CH2, (3) um domínio CH1 e um domínio CH3, (4) um domínio CH2 e um domínio CH3, (5) uma combinação de um ou mais domínios da região constante e uma região de dobradiça de imunoglobulina (ou uma porção da região de dobradiça), e (6) um dímero de cada domínio das regiões constantes de cadeia pesada e da região constante de cadeia leve.[055] According to the usage in question, the term “immunoglobulin Fc fragment” refers to the constant region of heavy chain 2 (CH2) and the constant region of heavy chain 3 (CH3) of an immunoglobulin, excluding the variable regions of the heavy and light chains, the heavy chain constant region 1 (CH1) and the light chain constant region 1 (CL1) of an immunoglobulin, and may include a hinge region in the heavy chain constant region. Furthermore, the immunoglobulin Fc fragment of the present invention may be an extended immunoglobulin Fc fragment including part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or the light chain constant region 1 (CL1), except by the variable regions of the heavy and light chains of an immunoglobulin, provided that it has an effect substantially similar to or better than that of the native protein. Likewise, it may be a region having a deletion in a relatively long portion of the CH2 and/or CH3 amino acid sequence. That is, the immunoglobulin Fc fragment of the present invention may include (1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, (2) a CH1 domain and a CH2 domain, (3) a CH1 and a CH3 domain, (4) a CH2 domain and a CH3 domain, (5) a combination of one or more constant region domains and an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), and (6 ) a dimer of each domain of the heavy chain constant regions and the light chain constant region.

[056] Em relação aos objetivos da presente invenção, o fragmento Fc de imunoglobulinas se refere a uma substância que tenha um efeito de aumentar a solubilidade do fármaco em ligação ao mesmo, ou seja, a proteína ou peptídeo fisiolo- gicamente ativos, e também pode se referir como um carreador de fármaco.[056] In relation to the objectives of the present invention, the Fc fragment of immunoglobulins refers to a substance that has an effect of increasing the solubility of the drug in connection with it, that is, the physiologically active protein or peptide, and also can be referred to as a drug carrier.

[057] Conforme o uso em questão, o termo “carreador” se refere a uma substância que se liga a um fármaco. Em geral, o carreador se liga a um fármaco para aumentar ou eliminar a atividade fisiológica do fármaco. No entanto, em relação ao objetivo da presente invenção, o carreador da presente invenção se refere a uma substância que minimiza uma redução em atividade fisiológica do fármaco e aumenta a estabilidade in vivo do fármaco e a duração de eficácia retardando-se a entrega do fármaco a partir do sítio de administração ao sangue mediante administração subcutânea, e também aperfeiçoar a solubilidade da proteína ou peptídeo ao mesmo tempo. Como o carreador de fármaco, várias substâncias como lipídeos, polímeros, etc. foram estudadas, mas a presente invenção proporciona o fragmento Fc de imu- noglobulinas como o carreador para aperfeiçoar a duração in vivo do fármaco ao qual o carreador é ligado, minimizando uma redução na atividade in vivo, e também maximizado a solubilidade. Ademais, o fragmento Fc de imunoglobulinas é um poli- peptídeo biodegradável que pode ser metabolizado in vivo, de modo que possa ser seguramente usado como um carreador de fármaco. Devido às características, o conjugado no qual o fragmento Fc de imunoglobulinas é ligado à proteína ou peptí- deo fisiologicamente ativos pode ser projetado como um conjugado de ação prolongada na presente invenção.[057] Depending on the use in question, the term “carrier” refers to a substance that binds to a drug. In general, the carrier binds to a drug to increase or eliminate the physiological activity of the drug. However, in relation to the object of the present invention, the carrier of the present invention refers to a substance that minimizes a reduction in physiological activity of the drug and increases the in vivo stability of the drug and the duration of effectiveness by delaying the delivery of the drug. from the administration site to the blood through subcutaneous administration, and also improve the solubility of the protein or peptide at the same time. As the drug carrier, various substances such as lipids, polymers, etc. have been studied, but the present invention provides the Fc fragment of immunoglobulins as the carrier to optimize the in vivo duration of the drug to which the carrier is bound, minimizing a reduction in in vivo activity, and also maximizing solubility. Furthermore, the Fc fragment of immunoglobulins is a biodegradable polypeptide that can be metabolized in vivo, so that it can be safely used as a drug carrier. Due to the characteristics, the conjugate in which the Fc fragment of immunoglobulins is linked to the physiologically active protein or peptide can be designed as a long-acting conjugate in the present invention.

[058] Ademais, o fragmento Fc de imunoglobulinas usando para aperfeiçoar a solubilidade da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos na presente invenção pode ser ligado à proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos através de ligante ou diretamente. Nesse sentido, o sítio da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos ao qual se liga o fragmento Fc de imunoglobulinas não é particularmente limitado, e qualquer sítio dentro da proteína ou peptídeo ou na terminação N ou na terminação C é possível. No entanto, para permitir que o conjugado da proteína ou peptídeo fisi- ologicamente ativos e do fragmento Fc de imunoglobulinas que é preparado pelo método da presente invenção exiba uma atividade fisiológica quando administrado ao corpo humano, o sítio que não inibe a atividade fisiológica é preferencialmente selecionado de acordo com o tipo da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos a ser aplicada, mas não se limita ao mesmo.[058] Furthermore, the Fc fragment of immunoglobulins used to improve the solubility of the physiologically active protein or peptide in the present invention can be linked to the physiologically active protein or peptide through a ligand or directly. In this sense, the site of the physiologically active protein or peptide to which the Fc fragment of immunoglobulins binds is not particularly limited, and any site within the protein or peptide or at the N-terminus or at the C-terminus is possible. However, to enable the conjugate of the physiologically active protein or peptide and the immunoglobulin Fc fragment that is prepared by the method of the present invention to exhibit physiological activity when administered to the human body, the site that does not inhibit physiological activity is preferably selected according to the type of physiologically active protein or peptide to be applied, but not limited to it.

[059] Além disso, o fragmento Fc de imunoglobulinas é mais vantajoso em termos de produção, purificação e rendimento do conjugado em relação a uma molécula de imunoglobulina completa, devido a seu peso molecular relativamente baixo. Ademais, visto que é desprovido de Fab, que exibe uma alta não- homogeneidade devido à diferença na sequência de aminoácido de um anticorpo para outro, espera-se que acentue significativamente a homogeneidade e reduza a possibilidade de induzir a antigenicidade sanguínea.[059] Furthermore, the Fc fragment of immunoglobulins is more advantageous in terms of production, purification and conjugate yield compared to a complete immunoglobulin molecule, due to its relatively low molecular weight. Furthermore, since it is devoid of Fab, which exhibits high inhomogeneity due to the difference in amino acid sequence from one antibody to another, it is expected to significantly accentuate homogeneity and reduce the possibility of inducing blood antigenicity.

[060] Ademais, o fragmento Fc de imunoglobulinas da presente invenção inclui não somente a sequência de aminoácido nativa, mas também derivados de sequência da mesma. O derivado de sequência de aminoácido significa que o mesmo tem um ou mais resíduos de aminoácido diferentes da sequência de aminoácido do tipo selvagem, e pode ocorrer naturalmente ou pode ser artificialmente gerado. O fragmento Fc de imunoglobulinas inclui derivados como resultado de exclusão, inserção, substituição conservada ou não-conservada, ou uma combinação dos mesmos. Uma inserção é geralmente feita pela adição de uma sequência de aminoácido consecutiva de cerca de 1 a 20 aminoácidos, ou pode ser feita com uma sequência mais longa. Uma exclusão está geralmente na faixa de cerca de 1 á 30 resíduos de aminoácidos. As técnicas de preparo dos derivados de sequência do fragmento Fc de imunoglobulinas são reveladas nas Publicações de Patente Internacional nos WO 97/34631 e WO 96/32478, que se encontram aqui incorporados a título de referência. As trocas de aminoácido em proteínas e peptídeos, que não alteram geralmente a atividade das moléculas, são conhecidas na técnica (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As trocas de ocorrência mais comum são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly, em ambas as direções. Além disso, o fragmento Fc de imunoglobulinas, caso seja desejado, pode ser modificado por fosforilação, sulfonação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesila- ção, acetilação, amidação, e similares.[060] Furthermore, the immunoglobulin Fc fragment of the present invention includes not only the native amino acid sequence, but also sequence derivatives thereof. Amino acid sequence derivative means that it has one or more amino acid residues different from the wild-type amino acid sequence, and may occur naturally or may be artificially generated. The Fc fragment of immunoglobulins includes derivatives as a result of deletion, insertion, conserved or non-conserved substitution, or a combination thereof. An insertion is usually made by adding a consecutive amino acid sequence of about 1 to 20 amino acids, or can be made with a longer sequence. A deletion is generally in the range of about 1 to 30 amino acid residues. Techniques for preparing immunoglobulin Fc fragment sequence derivatives are disclosed in International Patent Publications WO 97/34631 and WO 96/32478, which are incorporated herein by reference. Amino acid exchanges in proteins and peptides, which do not generally alter the activity of the molecules, are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro , Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly, in both directions. Furthermore, the Fc fragment of immunoglobulins, if desired, can be modified by phosphorylation, sulfonation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, and the like.

[061] O derivado de imunoglobulina Fc descrito anteriormente pode ser um derivado que tenha uma atividade biológica equivalente àquela do fragmento Fc de imunoglobulinas da presente invenção, mas tenha uma estabilidade estrutural aumentada do fragmento Fc de imunoglobulinas contra calor, pH, etc.[061] The immunoglobulin Fc derivative described above may be a derivative that has a biological activity equivalent to that of the immunoglobulin Fc fragment of the present invention, but has an increased structural stability of the immunoglobulin Fc fragment against heat, pH, etc.

[062] Ademais, o fragmento Fc de imunoglobulinas pode ser obtido a partir de um tipo nativo isolado de seres humanos ou animais, tais como vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos, porquinhos-da-Índia, etc., ou podem ser recombinantes ou derivados dos mesmos obtidos a partir de células animais transformadas ou microorganismos. No presente documento, os mesmos podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina nativa isolando-se as imunoglobulinas completas dos organismos humanos ou animais e o tratamento desses com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa em regiões Fab e Fc, e o tratamento de pepsina resulta na produção de fragmentos pF’c e F(ab)2. Esses fragmentos podem ser submetidos, por exemplo, à cromatografia por exclusão de tamanho para isolar Fc ou pF’c. De modo específico, o fragmento Fc de imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ser um fragmento Fc de imunoglobulinas derivado de humano recombinante que seja obtido a partir de um microrganismo.[062] Furthermore, the Fc fragment of immunoglobulins can be obtained from a native type isolated from humans or animals, such as cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc. , or may be recombinants or derivatives thereof obtained from transformed animal cells or microorganisms. In the present document, they can be obtained from a native immunoglobulin by isolating complete immunoglobulins from human or animal organisms and treating them with a proteolytic enzyme. Papain digests native immunoglobulin into Fab and Fc regions, and pepsin treatment results in the production of pF'c and F(ab)2 fragments. These fragments can be subjected, for example, to size exclusion chromatography to isolate Fc or pF’c. Specifically, the immunoglobulin Fc fragment according to the present invention can be a recombinant human-derived immunoglobulin Fc fragment that is obtained from a microorganism.

[063] Além disso, a região de imunoglobulina Fc da presente invenção pode estar sob a forma de cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas comparadas a uma forma nativa ou cadeias de açúcar reduzidas comparadas à forma nativa, ou podem estar em uma forma desglicosilada. A glicosilação ou desglico- silação aumentadas ou reduzidas da imunoglobulina Fc podem ser alcançadas por métodos típicos, por exemplo, utilizando-se um método químico, um método enzimá- tico, ou um método de engenharia genética usando microorganismos. No presente documento, quando desglicosilado, o complemento (C1q) que se liga a um fragmento Fc de imunoglobulinas se torna significativamente reduzido e a citotoxicidade dependente de anticorpo ou a citotoxicidade dependente de complemento é reduzida ou removida, não induzindo, assim, respostas imunes desnecessárias in vivo. Nesse contexto, os fragmentos Fc de imunoglobulinas desglicosilados ou aglicosilados são mais consistentes ao propósito de carreadores de fármacos.[063] Furthermore, the immunoglobulin Fc region of the present invention may be in the form of native sugar chains, increased sugar chains compared to a native form or reduced sugar chains compared to the native form, or may be in a form deglycosylated. Increased or reduced glycosylation or deglycosylation of immunoglobulin Fc can be achieved by typical methods, for example, using a chemical method, an enzymatic method, or a genetic engineering method using microorganisms. Herein, when deglycosylated, complement (C1q) that binds to an Fc fragment of immunoglobulins becomes significantly reduced and antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or removed, thereby not inducing unnecessary immune responses. in vivo. In this context, deglycosylated or aglycosylated Fc fragments of immunoglobulins are more consistent with the purpose of drug carriers.

[064] Conforme o uso em questão, o termo “desglicosilação” se refere à remoção enzimática de porções de açúcar a partir de um fragmento Fc de imunoglobu- linas, e o termo “aglicosilação” significa que um fragmento Fc de imunoglobulinas é produzido em uma forma não-glicosilada por um procariota, especificamente, E. coli.[064] According to the use in question, the term “deglycosylation” refers to the enzymatic removal of sugar moieties from an Fc fragment of immunoglobulins, and the term “aglycosylation” means that an Fc fragment of immunoglobulins is produced in a non-glycosylated form by a prokaryote, specifically, E. coli.

[065] Entretanto, o fragmento Fc de imunoglobulinas pode ser derivado de seres humanos ou de outros animais incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos, e porquinhos-da-Índia, e, de preferência, seres humanos. Além disso, o fragmento Fc de imunoglobulinas pode ser um fragmento Fc que seja derivado de IgG, IgA, IgD, IgE, e IgM, ou que seja feito por combinações ou híbridos desses. De modo específico, o mesmo é derivado a partir de IgG ou IgM, que estão dentre as proteínas mais abundantes no sangue humano, e, mais especificamente, a partir de IgG, que é conhecido por aumentar as meia-vidas de proteínas de ligação à ligante.[065] However, the Fc fragment of immunoglobulins can be derived from humans or other animals including cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, and guinea pigs, and, preferably, humans. Furthermore, the Fc fragment of immunoglobulins can be an Fc fragment that is derived from IgG, IgA, IgD, IgE, and IgM, or that is made by combinations or hybrids thereof. Specifically, it is derived from IgG or IgM, which are among the most abundant proteins in human blood, and, more specifically, from IgG, which is known to increase the half-lives of blood-binding proteins. binder.

[066] Entretanto, conforme o uso em questão, o termo “combinação” significa que os polipeptídeos que codificam os fragmentos Fc de imunoglobulinas de cadeia única da mesma origem são ligados a um polipeptídeo de cadeia única de uma origem diferente para formar um dímero ou um multímero. Ou seja, um dímero ou mul- tímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo que consiste em fragmentos IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, e IgE Fc.[066] However, depending on the use in question, the term “combination” means that the polypeptides encoding the Fc fragments of single-chain immunoglobulins of the same origin are linked to a single-chain polypeptide of a different origin to form a dimer or a multimer. That is, a dimer or multimer can be formed from two or more fragments selected from the group consisting of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, and IgE Fc fragments.

[067] O termo “híbrido”, conforme o uso em questão, significa que as sequências que codificam dois ou mais fragmentos Fc de imunoglobulina de origem diferente estão presentes em um fragmento Fc de imunoglobulinas de cadeia única. Na presente invenção, vários tipos de híbridos são possíveis. Ou seja, os híbridos de domínio podem ser compostos por um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em CH1, CH2, CH3, e CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc, e IgD Fc, e podem incluir a região de dobradiça.[067] The term “hybrid”, as used in question, means that sequences encoding two or more immunoglobulin Fc fragments of different origin are present in a single-chain immunoglobulin Fc fragment. In the present invention, several types of hybrids are possible. That is, domain hybrids may be composed of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3, and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc, and IgD Fc, and may include the hinge region.

[068] Entretanto, IgG é dividido em subclasses IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, e a presente invenção inclui combinações e híbridos dessas. Preferem-se as subclasses IgG2 e IgG4, e, com a máxima preferência, o fragmento Fc de IgG4 raramente tendo funções efetoras como citotoxicidade dependente de complemento (CDC).[068] However, IgG is divided into IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subclasses, and the present invention includes combinations and hybrids of these. The IgG2 and IgG4 subclasses are preferred, and, most preferably, the Fc fragment of IgG4 rarely has effector functions such as complement-dependent cytotoxicity (CDC).

[069] O fragmento Fc de imunoglobulinas da presente invenção pode estar sob a forma recombinante na qual uma região de dobradiça é ligada à terminação N do mesmo. Nesse caso, os fragmentos Fc de imunoglobulinas expressos como agregados não causam perda de atividade. Da mesma forma, esses são fragmentos Fc sob a forma de um dímero ativo ou monômero não tendo um resíduo de metioni- na de iniciação codificado por um códon de iniciação, e, portanto, existem vantagens de solubilização e re-enovelamento.[069] The immunoglobulin Fc fragment of the present invention can be in recombinant form in which a hinge region is linked to the N terminus thereof. In this case, immunoglobulin Fc fragments expressed as aggregates do not cause loss of activity. Likewise, these are Fc fragments in the form of an active dimer or monomer lacking an initiation methionine residue encoded by an initiation codon, and therefore there are solubilization and refolding advantages.

[070] O fragmento Fc de imunoglobulinas apropriado na presente invenção é descrito em detalhes nas Patentes Coreanas nos 755315, 775343, e 824505, que se encontram aqui incorporadas a título de referência.[070] The immunoglobulin Fc fragment appropriate in the present invention is described in detail in Korean Patent Nos. 755315, 775343, and 824505, which are incorporated herein by reference.

[071] Ou seja, o fragmento Fc de imunoglobulinas mais preferencial usado como o carreador de fármaco para proteína de fusão com insulina e oxintomodulina de acordo com a presente invenção é uma região Fc não-glicosilada derivada de IgG4 humano. O fragmento Fc derivado de humano é mais preferível que um fragmento Fc não-derivado de humano, que pode atuar como um antígeno no corpo humano e causar respostas imunes indesejáveis, como a produção de um novo anticorpo contra o antígeno.[071] That is, the most preferred immunoglobulin Fc fragment used as the drug carrier for insulin and oxyntomodulin fusion protein according to the present invention is a non-glycosylated Fc region derived from human IgG4. The human-derived Fc fragment is more preferable than a non-human-derived Fc fragment, which can act as an antigen in the human body and cause undesirable immune responses, such as the production of a new antibody against the antigen.

[072] Conforme o uso em questão, o termo “proteína ou peptídeo fisiologi- camente ativos” se refere a uma proteína ou peptídeo que regula a expressão genérica ou funções fisiológicas. Em relação aos objetivos da presente invenção, qualquer proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos pode ser incluída sem limitação, desde que aumente a solubilidade.[072] According to the use in question, the term “physiologically active protein or peptide” refers to a protein or peptide that regulates generic expression or physiological functions. In relation to the objectives of the present invention, any physiologically active protein or peptide can be included without limitation, as long as it increases solubility.

[073] Entretanto, os aminoácidos mencionados no presente documento são abreviados de acordo com as regras de nomenclatura de IUPAC-IUB da seguinte forma: Alanina: Ala ou A Arginina: Arg ou R Asparagina: Asn ou N Ácido aspártico: Asp ou D Cisteína: Cys ou C Ácido glutâmico: Glu ou E Glutamina: Gln ou Q Glicina: Gly ou G Histidina: His ou H Isoleucina: Ile ou I Leucina: Leu ou L Lisina: Lys ou K Metionina: Met ou M Fenilalanina: Phe ou F Prolina: Pro ou P Serina: Ser ou S Treonina: Thr ou T Triptofano: Trp ou W Tirosina: Tyr ou Y Valina: Val ou V[073] However, the amino acids mentioned in this document are abbreviated according to the IUPAC-IUB nomenclature rules as follows: Alanine: Ala or A Arginine: Arg or R Asparagine: Asn or N Aspartic acid: Asp or D Cysteine : Cys or C Glutamic acid: Glu or E Glutamine: Gln or Q Glycine: Gly or G Histidine: His or H Isoleucine: Ile or I Leucine: Leu or L Lysine: Lys or K Methionine: Met or M Phenylalanine: Phe or F Proline: Pro or P Serine: Ser or S Threonine: Thr or T Tryptophan: Trp or W Tyrosine: Tyr or Y Valine: Val or V

[074] Ademais, ao longo do presente relatório descritivo, códigos de uma letra ou de três letras podem ser usados para os aminoácidos.[074] Furthermore, throughout this specification, one-letter or three-letter codes can be used for amino acids.

[075] Ademais, a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é um conceito que abrange todos os derivados, variantes, e fragmentos da mesma, além da proteína ou peptídeo nativo fisiologicamente ativos.[075] Furthermore, physiologically active protein or peptide is a concept that encompasses all derivatives, variants, and fragments thereof, in addition to the physiologically active native protein or peptide.

[076] Conforme o uso em questão, o termo “derivado” se refere a um peptí- deo tendo substituição química (por exemplo, alfa-metilação, alfa-hidroxilação), exclusão (por exemplo, deaminação), ou modificação (por exemplo, N-metilação) de alguns grupos de resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido da proteína ou peptídeo nativo fisiologicamente ativos. O derivado pode incluir um mimético pep- tídico que retém a atividade do peptídeo nativo fisiologicamente ativo sem homologia de sequência com o peptídeo nativo fisiologicamente ativo.[076] Depending on the usage in question, the term “derivative” refers to a peptide having chemical substitution (e.g., alpha-methylation, alpha-hydroxylation), exclusion (e.g., deamination), or modification (e.g. , N-methylation) of some groups of amino acid residues in the amino acid sequence of the physiologically active native protein or peptide. The derivative may include a peptide mimetic that retains the activity of the physiologically active native peptide without sequence homology to the physiologically active native peptide.

[077] Conforme o uso em questão, o termo “mimético peptídico” se refere a uma cadeia tipo proteína que é projetada para imitar o peptídeo. O mimético peptídi- co pode ser exemplificador por um mimético peptídico D contendo um aminoácido D, mas não se limita ao mesmo. O mimético peptídico pode ser facilmente preparado utilizando-se uma técnica de preparar miméticos peptídicos conhecidos na técnica.[077] According to the use in question, the term “peptide mimetic” refers to a protein-like chain that is designed to imitate the peptide. The peptide mimetic can be exemplified by a D peptide mimetic containing a D amino acid, but is not limited to it. The peptide mimetic can be readily prepared using a technique for preparing peptide mimetics known in the art.

[078] Conforme o uso em questão, o termo “variante” se refere a uma proteína ou peptídeo tendo uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes daquelas da proteína ou peptídeo nativos, e se refere a um peptídeo que retém a atividade da proteína nativa. A variante pode ser preparada por qualquer um dentre substituição, adição, exclusão, e modificação ou por uma combinação dos mesmos em uma parte da sequência de aminoácidos da proteína ou peptídeo nativos. No presente documento, os aminoácidos adicionados podem ser aminoácidos de ocorrência não-natural (por exemplo, aminoácidos tipo D).[078] According to the use in question, the term “variant” refers to a protein or peptide having one or more amino acid sequences different from those of the native protein or peptide, and refers to a peptide that retains the activity of the native protein. The variant can be prepared by any of substitution, addition, deletion, and modification or by a combination thereof in a part of the amino acid sequence of the native protein or peptide. Herein, the added amino acids may be non-naturally occurring amino acids (e.g., D-type amino acids).

[079] Conforme o uso em questão, o termo “fragmento” se refere a um fragmento tendo um ou mais aminoácidos excluídos na terminação N ou na terminação C da proteína ou peptídeo nativos, e, de preferência, um fragmento tendo a atividade da proteína nativa.[079] According to the use in question, the term “fragment” refers to a fragment having one or more amino acids deleted at the N-terminus or at the C-terminus of the native protein or peptide, and, preferably, a fragment having the activity of the protein native.

[080] A proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos pode ser preparada por qualquer método derivado a partir de uma origem natural ou recombinante, e, por exemplo, pode ser uma proteína recombinante preparada utilizando-se uma célula procariótica, tal como E. coli como uma célula hospedeira, mas não se limita à mesma.[080] The physiologically active protein or peptide can be prepared by any method derived from a natural or recombinant source, and, for example, it can be a recombinant protein prepared using a prokaryotic cell, such as E. coli as a host cell, but not limited to it.

[081] Entretanto, a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos pode ser oxintomodulina, exendina-4, peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1), GLP-2, peptídeos insulinotrópicos, tais como peptídeo insulinotrópico glicose-dependente (GIP), insulina, glucagon, hormônio da paratireoide (PTH), ou calcitonina, mas não se limita aos mesmos. Conforme descrito anteriormente, a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é um conceito que abrange todos os derivados, variantes e fragmentos do mesmo, além da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos nativos.[081] However, the physiologically active protein or peptide can be oxyntomodulin, exendin-4, glucagon-like peptide 1 (GLP-1), GLP-2, insulinotropic peptides, such as glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP), insulin, glucagon , parathyroid hormone (PTH), or calcitonin, but not limited to them. As described previously, physiologically active protein or peptide is a concept that encompasses all derivatives, variants and fragments thereof, in addition to the native physiologically active protein or peptide.

[082] Conforme o uso em questão, o termo “insulina” se refere a um peptí- deo que é secretado pelo pâncreas em resposta aos níveis elevados de glicose no sangue para coletar glicose no fígado, músculos, ou tecido adiposo e transformá-la em glicogênio, e interromper o uso de gordura como uma fonte de energia, e, logo, controla o nível de glicose sanguínea. Esse peptídeo inclui a insulina nativa, insulina basal, agonistas de insulina, precursores, derivados, fragmentos das mesmas, e variantes.[082] According to the usage in question, the term “insulin” refers to a peptide that is secreted by the pancreas in response to high blood glucose levels to collect glucose in the liver, muscles, or adipose tissue and transform it into glycogen, and stops the use of fat as an energy source, and therefore controls blood glucose level. This peptide includes native insulin, basal insulin, insulin agonists, precursors, derivatives, fragments thereof, and variants.

[083] Conforme o uso em questão, o termo “insulina nativa” se refere a um hormônio que é secretado pelo pâncreas para promover a absorção de glicose e inibir a quebra de gordura, e, logo, funciona para controlar o nível de glicose sanguí- nea. A insulina é formada a partir de um precursor não tendo uma função de regular o nível de glicose sanguínea, conhecido como proinsulina, através de um processamento. A sequência de aminoácidos de insulina é a seguinte:[083] According to the usage in question, the term “native insulin” refers to a hormone that is secreted by the pancreas to promote the absorption of glucose and inhibit the breakdown of fat, and therefore functions to control the level of blood glucose. - ne. Insulin is formed from a precursor that does not have the function of regulating blood glucose levels, known as proinsulin, through processing. The amino acid sequence of insulin is as follows:

[084] Cadeia A:[084] Chain A:

[085] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu- Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1)[085] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1 )

[086] Cadeia B:[086] Chain B:

[087] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr- Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2)[087] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr- Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe -Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2)

[088] Conforme o uso em questão, o termo “insulina basal” se refere a um peptídeo que gerencia o nível normal diário de glicose sanguínea, por exemplo, levemir, lantus, deglude, etc.[088] According to the usage in question, the term “basal insulin” refers to a peptide that manages the normal daily level of blood glucose, for example, levemir, lantus, deglude, etc.

[089] Conforme o uso em questão, o termo “agonista de insulina” se refere a um composto que se liga ao receptor de insulina para mostrar a atividade biológica igual àquela de insulina, que é irrelevante à estrutura de insulina.[089] According to the use in question, the term “insulin agonist” refers to a compound that binds to the insulin receptor to show biological activity equal to that of insulin, which is irrelevant to the structure of insulin.

[090] O termo “variante de insulina” se refere a um peptídeo tendo uma ou mais sequências de aminoácidos diferentes daquelas de insulina nativa, e retendo a função de controlar o nível de glicose sanguínea no corpo.[090] The term “insulin variant” refers to a peptide having one or more amino acid sequences different from those of native insulin, and retaining the function of controlling the level of blood glucose in the body.

[091] O termo “derivado de insulina” se refere a um peptídeo tendo uma ho- mologia de sequência de aminoácido com a insulina nativa de pelo menos 80%, que pode ter alguns grupos no resíduo de aminoácido quimicamente substituído, excluído, ou modificado, e tem uma função de regular o nível de glicose sanguínea no corpo. O “fragmento de insulina” se refere a um fragmento tendo um ou mais amino- ácidos excluídos na terminação N ou na terminação C de insulina e tendo uma função de regular o nível de glicose sanguínea no corpo.[091] The term “insulin derivative” refers to a peptide having an amino acid sequence homology with native insulin of at least 80%, which may have some groups on the chemically substituted, deleted, or modified amino acid residue. , and has the function of regulating blood glucose levels in the body. The “insulin fragment” refers to a fragment having one or more amino acids deleted at the N-terminus or the C-terminus of insulin and having a function of regulating the level of blood glucose in the body.

[092] Cada um dos métodos de preparação para os agonistas, derivados, fragmentos, e variantes de insulina pode ser usado individualmente ou em combina- ção. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que tenha um ou mais aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo e deaminação do resíduo de aminoácido N-terminal, e tenha uma função de regular o nível de glicose sanguínea no corpo. A insulina usada na presente invenção pode ser produzida por uma tecnologia de recombinação, e também pode ser sintetizada usando um método de síntese de fase sólida.[092] Each of the preparation methods for insulin agonists, derivatives, fragments, and variants can be used individually or in combination. For example, the present invention includes a peptide that has one or more amino acids different from those of the native peptide and deamination of the N-terminal amino acid residue, and has a function of regulating the level of blood glucose in the body. The insulin used in the present invention can be produced by a recombination technology, and can also be synthesized using a solid phase synthesis method.

[093] Ademais, a insulina usada na presente invenção pode ser ligada a um polímero de não-peptidila. Esse polímero de não-peptidila pode ser usado como um ligante na presente invenção. O polímero de não-peptidila é usado como um ligante para ligar o fragmento Fc de imunoglobulinas, mantendo, assim, a atividade de insulina e aperfeiçoando a solubilidade, e também aperfeiçoando a estabilidade. A aplicação de um ligante de peptídeo usando uma tecnologia de recombinação genética é possível.[093] Furthermore, the insulin used in the present invention can be linked to a non-peptidyl polymer. Such a non-peptidyl polymer can be used as a linker in the present invention. The non-peptidyl polymer is used as a linker to bind the Fc fragment of immunoglobulins, thereby maintaining insulin activity and improving solubility, and also improving stability. Application of a peptide linker using a genetic recombination technology is possible.

[094] Ademais, a presente invenção é caracterizada pelo fato de que a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é conjugada a um fragmento Fc de imuno- globulinas para aperfeiçoar a solubilidade da proteína ou peptídeo. Não há limitação particular no sítio de ligação. No entanto, a modificação da cadeia A de insulina pode reduzir a atividade e a estabilidade, e, portanto, o fragmento Fc de imunoglobulinas pode ser ligado à cadeia B através de um ligante ou sem ligantes. Em particular, o fragmento Fc de imunoglobulinas pode ser ligado à terminação N da cadeia B de insulina através de um ligante de não-peptidila ou sem ligantes de não-peptidila, mas não é particularmente limitado aos mesmos.[094] Furthermore, the present invention is characterized by the fact that the physiologically active protein or peptide is conjugated to an Fc fragment of immunoglobulins to improve the solubility of the protein or peptide. There is no particular limitation on the binding site. However, modification of the insulin A chain can reduce activity and stability, and therefore the Fc fragment of immunoglobulins can be linked to the B chain through a linker or without linkers. In particular, the Fc fragment of immunoglobulins can be linked to the N-terminus of the insulin B chain through a non-peptidyl linker or without non-peptidyl linkers, but is not particularly limited thereto.

[095] Conforme o uso em questão, o termo “oxintomodulina” se refere a um peptídeo derivado a partir de um precursor de glucagon, pré-glucagon, e inclui oxin- tomodulina nativa, precursores, derivados, fragmentos, e variantes dos mesmos.[095] According to the use in question, the term “oxyntomodulin” refers to a peptide derived from a glucagon precursor, pre-glucagon, and includes native oxyntomodulin, precursors, derivatives, fragments, and variants thereof.

[096] De modo específico, a oxintomodulina tem uma sequência de aminoá- cido de HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEQ ID NO: 3).[096] Specifically, oxyntomodulin has an amino acid sequence of HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEQ ID NO: 3).

[097] O derivado de oxintomodulina inclui peptídeos, derivados de peptídeo, ou miméticos peptídicos que são preparados pela adição, exclusão, ou substituição de uma parte dos aminoácidos da sequência de oxintomodulina a fim de ativar tanto o receptor GLP-1 e como o receptor de glucagon em um alto nível comparado à oxintomodulina nativa. Na presente invenção, o derivado de oxintomodulina pode ter qualquer sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 4 a 36.[097] The oxyntomodulin derivative includes peptides, peptide derivatives, or peptide mimetics that are prepared by adding, deleting, or replacing a portion of the amino acids of the oxyntomodulin sequence in order to activate both the GLP-1 receptor and the of glucagon at a high level compared to native oxyntomodulin. In the present invention, the oxyntomodulin derivative can have any amino acid sequence from SEQ ID NOS: 4 to 36.

[098] Ademais, o fragmento de oxintomodulina retém a função de controlar o nível de glicose sanguínea no corpo.[098] Furthermore, the oxyntomodulin fragment retains the function of controlling the level of blood glucose in the body.

[099] Ademais, a variante de oxintomodulina é um peptídeo que tem um ou mais resíduos de aminoácido diferentes daqueles da sequência de aminoácido de oxintomodulina nativa e possui uma função de ativar receptores de GLP-1 e glucagon. Os métodos de preparar a variante, derivado e fragmento de oxintomodulina podem ser usados sozinhos ou em combinação. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que tenha um ou mais aminoácidos diferentes daqueles de peptí- deo nativo e deaminação dos resíduos de aminoácido N-terminal, e tem uma função de ativar tanto o receptor GLP-1 como o receptor de glucagon.[099] Furthermore, the oxyntomodulin variant is a peptide that has one or more amino acid residues different from those of the native oxyntomodulin amino acid sequence and has a function of activating GLP-1 and glucagon receptors. The methods of preparing the oxyntomodulin variant, derivative and fragment can be used alone or in combination. For example, the present invention includes a peptide that has one or more amino acids different from those of the native peptide and deamination of the N-terminal amino acid residues, and has a function of activating both the GLP-1 receptor and the glucagon receptor.

[0100] Na presente invenção, o derivado de oxintomodulina abrange qualquer peptídeo que seja preparado por substituições, adições, exclusões, ou modificações pós-translacionais (por exemplo, mutilação, acilação, ubiquitinação, ligação covalente intramolecular) na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 a fim de ativar os receptores de glucagon e GLP-1 ao mesmo tempo. Mediante a substituição ou adição de aminoácidos, pode-se usar qualquer um dos 20 aminoácidos comu- mente encontrados nas proteínas humanas, bem como aminoácidos atípicos ou de ocorrência não-natural. Fontes comerciais de aminoácidos atípicos incluem Sigma- Aldrich, ChemPep Inc., e Genzyme Pharmaceuticals. Os peptídeos incluindo esses aminoácidos e sequências de peptídeo atípico podem ser sintetizados e adquiridos junto a fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company (EUA),Bachem (EUA), ou Anygen (Coreia).[0100] In the present invention, the oxyntomodulin derivative encompasses any peptide that is prepared by substitutions, additions, deletions, or post-translational modifications (e.g., mutilation, acylation, ubiquitination, intramolecular covalent bonding) in the amino acid sequence of SEQ ID NO:3 in order to activate glucagon and GLP-1 receptors at the same time. By substituting or adding amino acids, any of the 20 amino acids commonly found in human proteins, as well as atypical or non-naturally occurring amino acids, can be used. Commercial sources of atypical amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., and Genzyme Pharmaceuticals. Peptides including these amino acids and atypical peptide sequences can be synthesized and purchased from commercial suppliers, for example, American Peptide Company (USA), Bachem (USA), or Anygen (Korea).

[0101] Em uma modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo inovador incluindo a sequência de aminoácido a Fórmula 1 a seguir:R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (Fórmula 1)[0101] In a specific embodiment, the oxyntomodulin derivative of the present invention is an innovative peptide including the following amino acid sequence Formula 1: R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8- X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (Formula 1)

[0102] em que R1 é histidina, desamino-histidil, dimetil-histidil (N-dimetil- histidil), beta-hidróxi imidazopropionil, 4-imidazoacetil, beta-carbóxi imidazopropionil, ou tirosina;[0102] wherein R1 is histidine, desaminohistidyl, dimethylhistidyl (N-dimethylhistidyl), beta-hydroxy imidazopropionyl, 4-imidazoacetyl, beta-carboxy imidazopropionyl, or tyrosine;

[0103] X1 é AIB (ácido aminoisobutírico), D-alanina, glicina, Sar (N-metil gli- cina), serina, ou D-serina; X2 é ácido glutâmico ou glutamina; X3 é leucina ou tirosina; X4 é serina ou alanina; X5 é lisina ou arginina; X6 é glutamina ou tirosina; X7 é leucina ou metionina; X8 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; X9 é ácido glutâmico, serina, ácido alfa-metil-glutâmico, ou excluído; X10 é glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina, serina, ou excluído; X11 é alanina, arginina, valina, ou excluído; X12 é alanina, arginina, serina, valina, ou excluído; X13 é lisina, glutamina, arginina, ácido alfa-metil-glutâmico, ou excluído; X14 é ácido aspártico, ácido glutâmico, leucina, ou excluído; X15 é fenilalanina ou excluído; X16 é isoleucina, valina, ou excluído; X17 é alanina, cisteína, ácido glutâmico, lisina, glutamina, ácido alfa-metil- glutâmico, ou excluído; X18 é triptofano ou excluído; X19 é alanina, isoleucina, leucina, serina, valina, ou excluído; X20 é alanina, lisina, metionina, glutamina, arginina, ou excluído; X21 é asparagina ou excluído; X22 é alanina, glicina, treonina, ou excluído; X23 é cisteína, lisina, ou excluído; X24 é um peptídeo tendo de 2 a 10 aminoácidos que consiste em combinações de alanina, glicina, e serina, ou excluído; e[0103] X1 is AIB (aminoisobutyric acid), D-alanine, glycine, Sar (N-methyl glycine), serine, or D-serine; X2 is glutamic acid or glutamine; X3 is leucine or tyrosine; X4 is serine or alanine; X5 is lysine or arginine; X6 is glutamine or tyrosine; X7 is leucine or methionine; X8 is aspartic acid or glutamic acid; X9 is glutamic acid, serine, alpha-methyl-glutamic acid, or deleted; X10 is glutamine, glutamic acid, lysine, arginine, serine, or excluded; X11 is alanine, arginine, valine, or deleted; X12 is alanine, arginine, serine, valine, or excluded; X13 is lysine, glutamine, arginine, alpha-methyl-glutamic acid, or deleted; X14 is aspartic acid, glutamic acid, leucine, or excluded; X15 is phenylalanine or deleted; X16 is isoleucine, valine, or deleted; X17 is alanine, cysteine, glutamic acid, lysine, glutamine, alpha-methyl-glutamic acid, or deleted; X18 is tryptophan or deleted; X19 is alanine, isoleucine, leucine, serine, valine, or deleted; X20 is alanine, lysine, methionine, glutamine, arginine, or excluded; X21 is asparagine or deleted; X22 is alanine, glycine, threonine, or excluded; X23 is cysteine, lysine, or deleted; X24 is a peptide having 2 to 10 amino acids that consists of combinations of alanine, glycine, and serine, or excluded; It is

[0104] R2 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 40), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 41), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 42), ou excluído (removido caso a sequência de aminoácido de Fórmula 1 seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 3).[0104] R2 is KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 40), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 41), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 42), or deleted (removed if the amino acid sequence of Formula 1 is identical to that of SEQ ID NO: 3).

[0105] A fim de aprimorar a atividade da oxintomodulina do tipo selvagem para o receptor de glucagon e o receptor GLP-1, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser substituído por 4-imidazoacetil onde o alfa-carbono de histidina na posição 1 da sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 3 é excluído, desamino-histidil onde o grupo amino N-terminal é excluído, dimetil- histidil (N-dimetil-histidil) onde o grupo amino N-terminal é modificado por dois grupos metila, beta-hidróxi imidazopropionil onde o grupo amino N-terminal é substituído por um grupo hidroxila, ou beta-carbóxi imidazopropionil onde o grupo amino N- terminal é substituído por um grupo carboxila. Além disso, a região de ligação ao receptor GLP-1 pode ser substituída por aminoácidos que acentuam as ligações hi- drofóbicas e iônicas ou combinações das mesmas. Uma parte da sequência de oxin- tomodulina pode ser substituída pela sequência de aminoácido de GLP-1 ou exendi- na-4 para acentuar a atividade no receptor GLP-1.[0105] In order to enhance the activity of wild-type oxyntomodulin towards the glucagon receptor and the GLP-1 receptor, the oxyntomodulin derivative of the present invention can be replaced by 4-imidazoacetyl where the alpha-carbon of histidine at position 1 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is deleted, desaminohistidyl where the N-terminal amino group is deleted, dimethylhistidyl (N-dimethylhistidyl) where the N-terminal amino group is modified by two methyl groups , beta-hydroxy imidazopropionyl where the N-terminal amino group is replaced by a hydroxyl group, or beta-carboxy imidazopropionyl where the N-terminal amino group is replaced by a carboxyl group. Furthermore, the GLP-1 receptor binding region can be replaced by amino acids that enhance hydrophobic and ionic bonds or combinations thereof. A part of the oxyntomodulin sequence can be replaced with the GLP-1 or exendin-4 amino acid sequence to enhance activity at the GLP-1 receptor.

[0106] Ademais, uma parte da sequência de oxintomodulina pode ser substituída por uma sequência que estabiliza uma alfa-hélice. Por exemplo, aminoácidos nas posições 10, 14, 16, 20, 24, e 28 da sequência de aminoácido de Fórmula 1 podem ser substituídos por aminoácidos que consistem em Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-thienil), e Ala(benzotienil) que sejam conhecidos por estabilizar uma alfa-hélice, ou derivados de aminoácidos.[0106] Furthermore, a part of the oxyntomodulin sequence can be replaced by a sequence that stabilizes an alpha-helix. For example, amino acids at positions 10, 14, 16, 20, 24, and 28 of the amino acid sequence of Formula 1 can be replaced by amino acids consisting of Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe (4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-thienyl), and Ala(benzotienyl) that are known to stabilize an alpha helix, or amino acid derivatives.

[0107] No presente documento, Tyr(4-Me) é um derivado de tirosina no qual o hidrogênio de um grupo hidroxila de tirosina é substituído por um grupo metila; Phe(4-Me) é um derivado de fenilalanina no qual a para-posição de fenilalanina é substituída por um grupo metil a; Phe(4-Cl) é um derivado de fenilalanina no qual a para-posição de grupo fenila é substituída por cloro; Phe(4-CN) é um derivado de fenilalanina no qual a para-posição do grupo fenila é substituída por um grupo ciane-to; Phe(4-NO2) é um derivado de fenilalanina no qual a para-posição do grupo fenila é substituída por um grupo nitro; e Phe(4-NH2) é um derivado de fenilalanina no qual a para-posição do grupo fenila é substituído por um grupo amina.[0107] In this document, Tyr(4-Me) is a tyrosine derivative in which the hydrogen of a tyrosine hydroxyl group is replaced by a methyl group; Phe(4-Me) is a phenylalanine derivative in which the para-position of phenylalanine is replaced by a methyl group; Phe(4-Cl) is a phenylalanine derivative in which the para-position phenyl group is replaced by chlorine; Phe(4-CN) is a phenylalanine derivative in which the para-position of the phenyl group is replaced by a cyanide group; Phe(4-NO2) is a phenylalanine derivative in which the para-position of the phenyl group is replaced by a nitro group; and Phe(4-NH2) is a phenylalanine derivative in which the para-position of the phenyl group is replaced by an amine group.

[0108] Ademais, Phg representa fenilglicina; Pal é um derivado de alanina no qual o grupo beta-metila de alanina é substituído por um grupo piridila; Nal é um derivado de alanina no qual o grupo beta-metila de alanina é substituído por um grupo naftila; Ala(2-thienil) é um derivado de alanina no qual o grupo beta-metila de alanina é substituído por um grupo 2-tienila; e Ala(benzotienil) é um derivado de alanina no qual o grupo beta-metila de alanina é substituído por um grupo benzo-tienila.[0108] Furthermore, Phg represents phenylglycine; Pal is an alanine derivative in which the beta-methyl group of alanine is replaced by a pyridyl group; Nal is an alanine derivative in which the beta-methyl group of alanine is replaced by a naphthyl group; Ala(2-thienyl) is an alanine derivative in which the beta-methyl group of alanine is replaced by a 2-thienyl group; and Ala(benzotienyl) is an alanine derivative in which the beta-methyl group of alanine is replaced by a benzo-thienyl group.

[0109] Não existem limitações quanto ao tipo e ao número de aminoácidos estabilizadores de alfa-hélice ou derivados de aminoácidos a serem inseridos. Em uma modalidade específica, anéis intramoleculares podem ser formados entre os resíduos de aminoácidos. Por exemplo, os anéis intramoleculares podem ser formados nas posições 10 e 14, 12 e 16, 16 e 20, 20 e 24, e 24 e 28, e, nesse caso, as posições correspondentes podem ser substituídas por um par de ácido glutâmico e lisina. Não há limitação quanto ao número de anéis intramoleculares formados no derivado de oxintomodulina, cuja solubilidade pode ser aperfeiçoada pelo método da presente invenção.[0109] There are no limitations on the type and number of alpha-helix stabilizing amino acids or amino acid derivatives to be inserted. In a specific embodiment, intramolecular rings can be formed between amino acid residues. For example, intramolecular rings can be formed at positions 10 and 14, 12 and 16, 16 and 20, 20 and 24, and 24 and 28, in which case the corresponding positions can be replaced by a pair of glutamic acid and lysine. There is no limitation on the number of intramolecular rings formed in the oxyntomodulin derivative, the solubility of which can be improved by the method of the present invention.

[0110] Em uma modalidade, oxintomodulina, cuja solubilidade é aperfeiçoada pelo método da presente invenção, ou um derivado da mesma pode ser um derivado de oxintomodulina tendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir das Fórmulas 2 a 6 a seguir. Em uma modalidade específica, o derivado de oxinto- modulina da presente invenção é um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido da Fórmula 2 a seguir, no qual a sequência de aminoácido de oxintomodulina é substituída pela sequência de exendina ou GLP-1:R1-A’-R3 (Fórmula 2)[0110] In one embodiment, oxyntomodulin, whose solubility is improved by the method of the present invention, or a derivative thereof may be an oxyntomodulin derivative having an amino acid sequence selected from Formulas 2 to 6 below. In a specific embodiment, the oxyntomodulin derivative of the present invention is a peptide having an amino acid sequence of Formula 2 below, in which the oxyntomodulin amino acid sequence is replaced by the exendin or GLP-1:R1-A sequence. '-R3 (Formula 2)

[0111] Em outra modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido da Fórmula 3 a seguir, no qual uma parte da sequência de aminoácido de oxintomodulina é ligada à sequência de exendina ou GLP-1 usando um ligante de aminoácido apropriado:R1-B’-C’-R4 (Fórmula 3)[0111] In another specific embodiment, the oxyntomodulin derivative of the present invention is a peptide having an amino acid sequence of Formula 3 below, in which a part of the oxyntomodulin amino acid sequence is linked to the exendin or GLP-1 sequence using an appropriate amino acid linker: R1-B'-C'-R4 (Formula 3)

[0112] Em ainda outra modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo no qual uma parte da sequência de aminoácido de oxintomodulina é substituído por aminoácidos capazes de acentuar a afinidade de ligação ao receptor de GLP-1. Por exemplo, Leu na posição 26, que se liga ao receptor GLP-1 por interação hidrofóbica, é substituído pelo resíduo hidrofóbico, Ile ou Val, acentuando, assim, a afinidade de ligação ao receptor GLP-1. De modo mais específico, a Fórmula 4 a seguir é um peptídeo incluindo os peptídeos de oxintomo- dulina tendo uma afinidade de ligação ao receptor aperfeiçoada (D6 substituído):R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3 (Fórmula 4)[0112] In yet another specific embodiment, the oxyntomodulin derivative of the present invention is a peptide in which a part of the oxyntomodulin amino acid sequence is replaced by amino acids capable of enhancing the binding affinity to the GLP-1 receptor. For example, Leu at position 26, which binds to the GLP-1 receptor by hydrophobic interaction, is replaced by the hydrophobic residue, Ile or Val, thus enhancing the binding affinity to the GLP-1 receptor. More specifically, the following Formula 4 is a peptide including oxyntomodulin peptides having improved receptor binding affinity (substituted D6): R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6 -D7-N-D8-R3 (Formula 4)

[0113] Em ainda outra modalidade específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo incluindo a Fórmula 5 a seguir, na qual uma parte da sequência de aminoácido é excluída, adicionada, ou substituída por outro aminoácido com o intuito de acentuar as atividades de oxintomodulina nativa no receptor GLP-1 e receptor de glucagon:R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-Fv-E6-WLMNT-E7-R5 (Fórmula 5)[0113] In yet another specific embodiment, the oxyntomodulin derivative of the present invention is a peptide including Formula 5 below, in which a portion of the amino acid sequence is deleted, added, or replaced by another amino acid with the aim of enhancing the activities of native oxyntomodulin on the GLP-1 receptor and glucagon receptor:R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-Fv-E6-WLMNT-E7-R5 (Formula 5)

[0114] Nas Fórmulas 2 a 5, R1 é igual ao da descrição da Fórmula 1;[0114] In Formulas 2 to 5, R1 is the same as in the description of Formula 1;

[0115] A’ é selecionado a partir do grupo que consiste em SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 43), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 44), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 45), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 46), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 48), e SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 49);[0115] A' is selected from the group consisting of SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 43), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 44), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 45), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 46), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 48), and SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 49);

[0116] B’ é selecionado a partir do grupo que consiste em SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 43), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 44), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 45), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 46), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 48), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 49), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 50), e SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 51); C’ é um peptídeo tendo de 2 a 10 aminoácidos que consistem em combina- ções de alanina, glicina e serina; D1 é serina, ácido glutâmico ou arginina; D2 é arginina, ácido glutâmico ou serina; D3 é arginina, alanina ou valina; D4 é arginina, valina ou serina; D5 é glutamina, arginina ou lisina; D6 é isoleucina, valina ou serina; D7 é metionina, arginina ou glutamina; D8 é treonina, glicina ou alanina; E1 é serina, AIB, Sar, D-alanina ou D-serina; E2 é serina ou ácido glutâmico; E3 é arginina ou lisina; E4 é glutamina ou lisina; E5 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; E6 é glutamina, cisteína ou lisina; E7 é cisteína, lisina ou excluído;[0116] B' is selected from the group consisting of SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 43), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 44), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 45), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 46), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 48), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 49), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 50), and SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 51); C’ is a peptide having 2 to 10 amino acids that consist of combinations of alanine, glycine and serine; D1 is serine, glutamic acid or arginine; D2 is arginine, glutamic acid or serine; D3 is arginine, alanine or valine; D4 is arginine, valine or serine; D5 is glutamine, arginine or lysine; D6 is isoleucine, valine or serine; D7 is methionine, arginine or glutamine; D8 is threonine, glycine or alanine; E1 is serine, AIB, Sar, D-alanine or D-serine; E2 is serine or glutamic acid; E3 is arginine or lysine; E4 is glutamine or lysine; E5 is aspartic acid or glutamic acid; E6 is glutamine, cysteine or lysine; E7 is cysteine, lysine or deleted;

[0117] R3 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), ou GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39);[0117] R3 is KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), or GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39);

[0118] R4 é HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 40), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 41), ou HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 42); e[0118] R4 is HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 40), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 41), or HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 42); It is

[0119] R5 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39), ou excluído (removido caso a sequência de ami- noácidos de Fórmulas 2 a 5 seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 3).[0119] R5 is KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39), or excluded (removed if the amino acid sequence of Formulas 2 to 5 is identical to that of SEQ ID NO: 3).

[0120] De modo específico, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser um peptídeo da Fórmula 6 a seguir: R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15- X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (Fórmula 6) em que R1 é histidina, desamino-histidil, 4-imidazoacetil ou tirosina; XI é AIB (ácido aminoisobutírico), glicina, serina ou D-serina; X2 é ácido glutâmico ou glutamina; X3 é leucina ou tirosina; X4 é serina ou alanina; X5 é lisina ou arginina; X6 é glutamina ou tirosina; X7 é leucina ou metionina; X8 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; X9 é ácido glutâmico, ácido alfa-metil-glutâmico, ou excluído; X10 é glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina, ou excluído; XII é alanina, arginina, ou excluído; X12 é alanina, valina, ou excluído; X13 é lisina, glutamina, arginina, ácido alfa-metil-glutâmico, ou excluído; X14 é ácido aspártico, ácido glutâmico, leucina, ou excluído; X15 é fenilalanina ou excluído; X16 é isoleucina, valina, ou excluído; X17 é alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, ácido alfa-metil- glutâmico, ou excluído; X18 é triptofano ou excluído; X19 é alanina, isoleucina, leucina, valina, ou excluído; X20 é alanina, lisina, metionina, arginina, ou excluído; X21 é asparagina ou excluído; X22 é treonina ou excluído; X23 é cisteína, lisina, ou excluído; X24 é um peptídeo tendo de 2 a 10 aminoácidos que consistem em glicina ou é excluído; e R2 é KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 40), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 41), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 42), ou excluído (removido caso a sequência de aminoácido de Fórmula 6 seja idêntica àquela de SEQ ID NO: 3).[0120] Specifically, the oxyntomodulin derivative of the present invention may be a peptide of the following Formula 6: R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11- X12-X13-X14-X15- XI is AIB (aminoisobutyric acid), glycine, serine or D-serine; X2 is glutamic acid or glutamine; X3 is leucine or tyrosine; X4 is serine or alanine; X5 is lysine or arginine; X6 is glutamine or tyrosine; X7 is leucine or methionine; X8 is aspartic acid or glutamic acid; X9 is glutamic acid, alpha-methyl-glutamic acid, or excluded; X10 is glutamine, glutamic acid, lysine, arginine, or excluded; XII is alanine, arginine, or excluded; X12 is alanine, valine, or deleted; X13 is lysine, glutamine, arginine, alpha-methyl-glutamic acid, or deleted; X14 is aspartic acid, glutamic acid, leucine, or excluded; X15 is phenylalanine or deleted; X16 is isoleucine, valine, or deleted; X17 is alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, alpha-methyl-glutamic acid, or deleted; X18 is tryptophan or deleted; X19 is alanine, isoleucine, leucine, valine, or deleted; X20 is alanine, lysine, methionine, arginine, or excluded; X21 is asparagine or deleted; X22 is threonine or deleted; X23 is cysteine, lysine, or deleted; X24 is a peptide having 2 to 10 amino acids that consist of glycine or are deleted; and R2 is KRNRNNIA (SEQ ID NO: 37), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 38), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 39), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 40), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 41), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK ( SEQ ID NO: 42), or deleted (removed if the amino acid sequence of Formula 6 is identical to that of SEQ ID NO: 3).

[0121] De modo específico, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste nos peptídeos de SEQ ID NOS: 4 a 36.[0121] Specifically, the oxyntomodulin derivative of the present invention can be selected from the group consisting of the peptides of SEQ ID NOS: 4 to 36.

[0122] Oxintomodulina tem atividades de dois peptídeos, GLP-1 e glucagon. GLP-1 diminui a glicose sanguínea, reduz a ingestão de alimentos, e suprime o esvaziamento gástrico, enquanto glucagon aumenta a glicose sanguínea, facilita a lipó- lise, e diminui o peso corporal aumentando-se o metabolismo energético. Se dois peptídeos tendo diferentes efeitos biológicos estiverem presentes em um peptídeo e um dos peptídeos exibir um efeito mais dominante do que outro, podem-se gerar efeitos indesejados. Se glucagon mostrar um efeito mais dominante do que GLP-1, a glicose sanguínea pode ser aumentada. Se GLP-1 mostrar um efeito mais dominante do que glucagon, efeitos colaterais, tais como náuseas e vômitos podem ser provocados. A eficácia geral pode diferir dependendo das razões de atividade dos dois peptídeos.[0122] Oxintomodulin has the activities of two peptides, GLP-1 and glucagon. GLP-1 lowers blood glucose, reduces food intake, and suppresses gastric emptying, while glucagon increases blood glucose, facilitates lipolysis, and decreases body weight by increasing energy metabolism. If two peptides having different biological effects are present in a peptide and one of the peptides exhibits a more dominant effect than the other, undesired effects may be generated. If glucagon shows a more dominant effect than GLP-1, blood glucose may be increased. If GLP-1 shows a more dominant effect than glucagon, side effects such as nausea and vomiting may be provoked. The overall effectiveness may differ depending on the activity ratios of the two peptides.

[0123] Conforme o uso em questão, o termo “peptídeo insulinotrópico” se refere a um peptídeo que possui uma função insulinotrópica, e o peptídeo insulinotró- pico promove a síntese e a expressão de insulina em uma célula beta pancreática. O peptídeo insulinotrópico pode ser exemplificado por peptídeo tipo glucagon 1 (GLP- 1), peptídeo tipo glucagon 2 (GLP-2), exendina-3, exendina-4, imidazoacetil (CA) exendina-4, ou peptídeo insulinotrópico glicose-dependente (GIP), mas não se limita aos mesmos, desde que possua a função insulinotrópica. O peptídeo insulinotrópico usando na presente invenção inclui todos os derivados, variantes, e fragmentos dos mesmos, além do peptídeo insulinotrópico nativo. Descrições gerais dos mesmos são iguais àquelas descritas anteriormente.[0123] According to the use in question, the term “insulinotropic peptide” refers to a peptide that has an insulinotropic function, and the insulinotropic peptide promotes the synthesis and expression of insulin in a pancreatic beta cell. The insulinotropic peptide can be exemplified by glucagon-like peptide 1 (GLP-1), glucagon-like peptide 2 (GLP-2), exendin-3, exendin-4, imidazoacetyl (CA) exendin-4, or glucose-dependent insulinotropic peptide ( GIP), but is not limited to them, as long as it has an insulinotropic function. The insulinotropic peptide used in the present invention includes all derivatives, variants, and fragments thereof, in addition to the native insulinotropic peptide. General descriptions of them are the same as those described previously.

[0124] Descrições de GLP-1, exendina-3 ou exendina-4, e derivados dos mesmos estão incluídas na Publicação de Patente Coreana no 10-2012-0137271 (ou WO2012-169798) referente ao derivado de oxintomodulina e na Publicação de Patente Coreana no 10-2009-0008151 (ou WO2009-011544) referente ao derivado de peptídeo insulinotrópico, estando as mesmas aqui incorporadas, sem limitação, a título de referência.[0124] Descriptions of GLP-1, exendin-3 or exendin-4, and derivatives thereof are included in Korean Patent Publication No. 10-2012-0137271 (or WO2012-169798) relating to the oxyntomodulin derivative and in Patent Publication Korean No. 10-2009-0008151 (or WO2009-011544) referring to the insulinotropic peptide derivative, the same being incorporated herein, without limitation, by reference.

[0125] Conforme o uso em questão, o termo “glucagon” se refere a um hormônio de peptídeo que aumenta os níveis de glicose sanguínea. O glucagon funciona para decompor o glicogênio em glicose no fígado para aumentar os níveis de glicose sanguínea.[0125] According to the use in question, the term “glucagon” refers to a peptide hormone that increases blood glucose levels. Glucagon works to break down glycogen into glucose in the liver to increase blood glucose levels.

[0126] Entretanto, o glucagon nativo pode ter a sequência a seguir.[0126] However, native glucagon may have the following sequence.

[0127] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 52)[0127] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser- Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln -Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 52)

[0128] Ademais, o glucagon usado na presente invenção inclui todos os derivados, variantes, e fragmentos do mesmo, além do glucagon nativo. Descrições gerais do mesmo são iguais àquelas descritas anteriormente.[0128] Furthermore, the glucagon used in the present invention includes all derivatives, variants, and fragments thereof, in addition to native glucagon. General descriptions of it are the same as those described previously.

[0129] Conforme o uso em questão, o termo “hormônio da paratireoide (PTH)” se refere a um hormônio liberado pelas glândulas paratireoides, e atua para aumentar a concentração de cálcio no sangue. As informações sobre uma sequência de aminoácido do hormônio da paratireoide podem estar disponíveis a partir do banco de dados conhecido, tal como GenBank do Instituto Norte-Americano de Saúde. O hormônio da paratireoide inclui todos os derivados, variantes e fragmentos do mesmo, além do hormônio da paratireoide nativo.[0129] According to the usage in question, the term “parathyroid hormone (PTH)” refers to a hormone released by the parathyroid glands, and acts to increase the concentration of calcium in the blood. Information about a parathyroid hormone amino acid sequence may be available from a known database, such as GenBank of the American Institutes of Health. Parathyroid hormone includes all derivatives, variants, and fragments thereof, in addition to the native parathyroid hormone.

[0130] Conforme o uso em questão, o termo “calcitonina” é um hormônio da tireoide que regula a concentração de cálcio no sangue, e funciona para diminuir a concentração de cálcio no sangue. Informações sobre uma sequência de aminoáci- do da calcitonina podem estar disponíveis a partir do banco de dados conhecido, tal como GenBank do Instituto Norte-Americano de Saúde. A calcitonina inclui todos os derivados, variantes e fragmentos da mesma, além da calcitonina nativa.[0130] According to the usage in question, the term “calcitonin” is a thyroid hormone that regulates the concentration of calcium in the blood, and functions to reduce the concentration of calcium in the blood. Information about an amino acid sequence of calcitonin may be available from a known database, such as GenBank of the American Institutes of Health. Calcitonin includes all derivatives, variants and fragments thereof, in addition to native calcitonin.

[0131] O método da presente invenção é usado para aumentar efetivamente a solubilidade da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos sem usar um tensoati- vo. No entanto, o tensoativo pode ser usado a fim de aumentar adicionalmente a solubilidade.[0131] The method of the present invention is used to effectively increase the solubility of physiologically active protein or peptide without using a surfactant. However, surfactant can be used in order to further increase solubility.

[0132] Ou seja, o tensoativo é adicionado à solução aquosa, e os conjugados de ação prolongada da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e do fragmento Fc de imunoglobulinas são encapsulados nas micelas, aumentando, assim, adicionalmente a solubilidade do conjugado.[0132] That is, the surfactant is added to the aqueous solution, and the long-acting conjugates of the physiologically active protein or peptide and the Fc fragment of immunoglobulins are encapsulated in the micelles, thus additionally increasing the solubility of the conjugate.

[0133] Ademais, outro aspecto da presente invenção se refere a uma composição para aperfeiçoar a solubilidade ad proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos, sendo que a composição inclui o fragmento Fc de imunoglobulinas e, logo, exibe uma solubilidade aperfeiçoada comparada àquela de uma composição não contendo um fragmento Fc de imunoglobulinas.[0133] Furthermore, another aspect of the present invention relates to a composition for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide, wherein the composition includes the Fc fragment of immunoglobulins and, therefore, exhibits an improved solubility compared to that of a composition not containing an Fc fragment of immunoglobulins.

[0134] No presente documento, a composição inclui o conjugado da proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos e do fragmento Fc de imunoglobulinas no qual a proteína ou peptídeo fisiologicamente ativos é ligada ao fragmento Fc de imunoglo- bulinas através do ligante de peptídeo ou ligante de não-peptidila como um ingrediente ativo.[0134] In this document, the composition includes the conjugate of the physiologically active protein or peptide and the Fc fragment of immunoglobulins in which the physiologically active protein or peptide is linked to the Fc fragment of immunoglobulins through the peptide linker or non-binding linker. -peptidyl as an active ingredient.

[0135] Em uma modalidade da presente invenção, examinou-se se a solubilidade de insulina ou oxintomodulina é aumentada em um pH ácido fraco conjugando-se um peptídeo fisiologicamente ativo representativo, insulina, ou oxintomodulina com a imunoglobulina Fc. Como resultado, a forma conjugada de fragmento Fc de imunoglobulinas aumentou significativamente a solubilidade de insulina ou oxinto- modulina comparada a uma forma não-conjugada (Tabelas 2 e 3, Figura 2; e Tabelas 5 e 6; Figura 4). Esse resultado sugere que o método da presente invenção pode ser usado para aperfeiçoar a solubilidade de um peptídeo ou proteína, e, em particular, aperfeiçoar consideravelmente a solubilidade de um peptídeo ou proteína que tem uma solubilidade muito baixa em uma condição neutra ou ácida fraca, e, logo, uma formulação incluindo uma concentração farmaceuticamente eficaz da mesma é difícil.[0135] In one embodiment of the present invention, it was examined whether the solubility of insulin or oxyntomodulin is increased at a weak acidic pH by conjugating a representative physiologically active peptide, insulin, or oxyntomodulin with immunoglobulin Fc. As a result, the conjugated form of immunoglobulin Fc fragment significantly increased the solubility of insulin or oxyntomodulin compared to an unconjugated form (Tables 2 and 3, Figure 2; and Tables 5 and 6; Figure 4). This result suggests that the method of the present invention can be used to improve the solubility of a peptide or protein, and, in particular, considerably improve the solubility of a peptide or protein that has a very low solubility in a neutral or weak acidic condition. and therefore a formulation including a pharmaceutically effective concentration thereof is difficult.

[0136] Doravante, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, esses Exemplos servem somente para propósitos ilustrativos, e não se pretende que a invenção seja limitada por esses Exemplos.[0136] Hereinafter, the present invention will be described in greater detail with reference to the following Examples. However, these Examples are for illustrative purposes only, and the invention is not intended to be limited by these Examples.

Example 1: Assessment of the solubility of insulin and long-acting insulin conjugate (1) Preparation of long-acting insulin conjugate

[0137] Dissolveu-se pó de insulina em 10 mM de HCl, e, então, reagido com 3,4 K de PEG propion-ALD2 (PEG tendo dois grupos de propionaldeído, NOF, Japão) a 4°C durante cerca de 2 horas em uma razão molar de insulina:PEG igual a 1:2 e uma concentração de insulina de 5 mg/mL para PEGuilar a terminação N da cadeia B de insulina. Essa reação foi conduzida em 50 mM de citrato de sódio (pH 5,0) e isopropanol a 45%, e adicionaram-se 2 mM a 20 mM de cianoboroidreto de sódio como um agente redutor. A solução de reação foi purificada com uma coluna SP HP (GE Healthcare) usando um tampão contendo citrato de sódio (pH 3,0) e um gradiente de concentração de KCl. A fim de preparar um conjugado de insulina-PEG- fragmento Fc de imunoglobulinas, a insulina mono-PEGuilada e o fragmento Fc de imunoglobulinas foram reagidos em uma razão molar de cerca de 1:1,2 com uma concentração de proteína total de 20 mg/mL em temperatura ambiente durante cerca de 13 horas. Nesse sentido, a solução de reação era de 100 mM de HEPES e 22 mM de fosfato de potássio em um pH de 8,2, e adicionaram-se 20 mM de cianobo- roidreto de sódio como um agente redutor à mesma.[0137] Insulin powder was dissolved in 10 mM HCl, and then reacted with 3.4 K PEG propion-ALD2 (PEG having two propionaldehyde groups, NOF, Japan) at 4°C for about 2 hours at an insulin:PEG molar ratio of 1:2 and an insulin concentration of 5 mg/mL to PEGylate the N terminus of the insulin B chain. This reaction was conducted in 50 mM sodium citrate (pH 5.0) and 45% isopropanol, and 2 mM to 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent. The reaction solution was purified with an SP HP column (GE Healthcare) using a buffer containing sodium citrate (pH 3.0) and a KCl concentration gradient. In order to prepare an insulin-PEG-immunoglobulin Fc fragment conjugate, mono-PEGylated insulin and the immunoglobulin Fc fragment were reacted in a molar ratio of about 1:1.2 with a total protein concentration of 20 mg. /mL at room temperature for approximately 13 hours. In this sense, the reaction solution was 100 mM HEPES and 22 mM potassium phosphate at a pH of 8.2, and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent to it.

[0138] Após o término da reação, a solução de reação foi primeiramente passada através de uma coluna Q Sepharose HP (GE Healthcare) usando um tampão de Tris-HCl (pH 7,5) e um gradiente de concentração de NaCl, e, então, passada através de uma coluna Source 15 ISO (GE Healthcare) usando um tampão de Tris-HCl (pH 7,5) e um gradiente de concentração de sulfato de amônio, purificando, assim, finalmente o conjugado de insulina-PEG-imunoglobulina Fc.[0138] After completion of the reaction, the reaction solution was first passed through a Q Sepharose HP column (GE Healthcare) using a Tris-HCl buffer (pH 7.5) and a NaCl concentration gradient, and, then passed through a Source 15 ISO column (GE Healthcare) using a Tris-HCl buffer (pH 7.5) and an ammonium sulfate concentration gradient, thus finally purifying the insulin-PEG-immunoglobulin conjugate FC.

(2) Solubility test of insulin and long-acting insulin conjugate

[0139] Para examinar a solubilidade de insulina e do conjugado de insulina de ação prolongada, prepararam-se um material padrão e um material de teste de insulina e do conjugado de insulina de ação prolongada de acordo com a composição conforme na Tabela 1 a seguir, respectivamente.[0139] To examine the solubility of insulin and long-acting insulin conjugate, a standard material and a test material of insulin and long-acting insulin conjugate were prepared according to the composition as in Table 1 below , respectively.

[0140] Os materiais de teste de insulina e do conjugado de insulina de ação prolongada tinham uma composição de solução tampão de ácido acético em um pH de 6,0, polissorbato como um tensoativo não-iônico, manitol como um álcool de açúcar, e cloreto de sódio como um agente isotônico. De acordo com os valores quantitativos das Tabelas 2 e 3, os materiais de teste foram dissolvidos em temperatura ambiente, centrifugou-se o material de teste de insulina que foi incompletamente dissolvido, e somente o sobrenadante foi coletado e usado no teste de solubilidade.[0140] The insulin and long-acting insulin conjugate test materials had a composition of acetic acid buffer solution at a pH of 6.0, polysorbate as a nonionic surfactant, mannitol as a sugar alcohol, and sodium chloride as an isotonic agent. According to the quantitative values in Tables 2 and 3, the test materials were dissolved at room temperature, the insulin test material that was incompletely dissolved was centrifuged, and only the supernatant was collected and used in the solubility test.

[0141] Nesse sentido, como um valor quantitativo máximo dentre os valores quantitativos teóricos do material de teste de insulina, determinaram-se cerca de 10 mg/mL, que é um valor quantitativo obtido convertendo-se 100 mg/mL do conjugado de insulina de ação prolongada em insulina. O material de teste de insulina dissolvido em um valor quantitativo máximo foi serialmente diluído, e o ponto (0,008 mg/mL) no qual a insulina foi completamente dissolvida sem impurezas ou péletes foi deter- minado como um valor quantitativo mínimo.[0141] In this sense, as a maximum quantitative value among the theoretical quantitative values of the insulin test material, about 10 mg/mL was determined, which is a quantitative value obtained by converting 100 mg/mL of the insulin conjugate long-acting insulin. The insulin test material dissolved at a maximum quantitative value was serially diluted, and the point (0.008 mg/mL) at which the insulin was completely dissolved without impurities or pellets was determined as a minimum quantitative value.

[0142] Primeiramente, uma respectiva curva padrão de calibração de insulina e do conjugado de insulina de ação prolongada foi confirmada por Cromatografia Líquida de Fase Reversa de Alto Desempenho (RP-HPLC), como na Figura 1. Os valores quantitativos de insulina e do conjugado de insulina de ação prolongada foram calculados colocando-se as áreas de pico de insulina e os materiais de teste do conjugado de insulina de ação prolongada confirmados por cromatografia de fase reversa na curva padrão de calibração, respectivamente. Os resultados são forneci-dos nas Tabelas 2 e 3, e na Figura 2.[Tabela 1] [Tabela 2] [Tabela 3] [0142] Firstly, a respective calibration standard curve of insulin and the long-acting insulin conjugate was confirmed by High Performance Reverse Phase Liquid Chromatography (RP-HPLC), as in Figure 1. The quantitative values of insulin and insulin long-acting insulin conjugate were calculated by placing the peak areas of insulin and long-acting insulin conjugate test materials confirmed by reversed-phase chromatography on the calibration standard curve, respectively. The results are provided in Tables 2 and 3, and in Figure 2.[Table 1] [Table 2] [Table 3]

[0143] Conforme mostrado nas Tabelas 2 e 3, o valor quantitativo do material de teste do conjugado de insulina de ação prolongada dissolvido no tampão de formulação do conjugado de insulina de ação prolongada mostrou pouca diferença entre o valor teórico e o valor de medição, enquanto o valor quantitativo do material de teste de insulina dissolvido no tampão de formulação do conjugado de insulina de ação prolongada mostrou uma diferença maior (de até cerca de 16 vezes) entre o valor teórico e o valor de medição. Ademais, quando o material de teste de insulina for dissolvido no tampão de formulação do conjugado de insulina de ação prolongada, observaram-se péletes após a centrifugação em todos os casos, excluindo 0,008 mg/mL.[0143] As shown in Tables 2 and 3, the quantitative value of the long-acting insulin conjugate test material dissolved in the long-acting insulin conjugate formulation buffer showed little difference between the theoretical value and the measurement value, while the quantitative value of the insulin test material dissolved in the long-acting insulin conjugate formulation buffer showed a greater difference (up to about 16 times) between the theoretical value and the measurement value. Furthermore, when the insulin test material was dissolved in the long-acting insulin conjugate formulation buffer, pellets were observed after centrifugation in all cases, excluding 0.008 mg/mL.

[0144] Conforme mostrado no resultado, a solubilidade foi aperfeiçoada pelo fragmento Fc de imunoglobulinas usado como um carreador do conjugado de insulina de ação prolongada.[0144] As shown in the result, solubility was improved by the Fc fragment of immunoglobulins used as a carrier of the long-acting insulin conjugate.

Example 2: Assessment of the solubility of oxyntomodulin and long-acting oxyntomodulin conjugate (3) Preparation of long-acting oxyntomodulin derivative conjugate

[0145] Um derivado de oxintomodulina foi reagido com MAL-10 K-ALD PEG (NOF, Japão) a 4°C durante cerca de 1 hora em uma razão molar de 1:1 e uma concentração de derivado de oxintomodulina de 3 mg/mL para PEGuilar MAL-10K-ALD PEG no resíduo de cisteína na posição 30 de SEQ ID NO: 27, que é uma sequência de aminoácido do derivado de oxintomodulina. Essa reação foi conduzida em 50 mM de Tris (pH 7,5) e isopropanol a 60%. Após o término da reação, a solução de reação foi aplicada a uma coluna SP HP (GE healthcare, Suécia) usando um tampão de citrato de sódio (pH 3,0) e um gradiente de concentração de KCl para purificar o derivado de oxintomodulina mono-PEGuilado em cisteína.[0145] An oxyntomodulin derivative was reacted with MAL-10 K-ALD PEG (NOF, Japan) at 4°C for about 1 hour at a molar ratio of 1:1 and a concentration of oxyntomodulin derivative of 3 mg/ mL to PEGylate MAL-10K-ALD PEG at the cysteine residue at position 30 of SEQ ID NO: 27, which is an amino acid sequence of the oxyntomodulin derivative. This reaction was carried out in 50 mM Tris (pH 7.5) and 60% isopropanol. After completion of the reaction, the reaction solution was applied to an SP HP column (GE healthcare, Sweden) using a sodium citrate buffer (pH 3.0) and a KCl concentration gradient to purify the mono oxyntomodulin derivative. -PEGylated in cysteine.

[0146] Em seguida, o derivado de oxintomodulina mono-PEGuilado purificado e imunoglobulina Fc foram reagidos em uma razão molar de 1:4 com um nível total de proteína de 20 mg/mL a 4°C durante cerca de 16 horas. Nesse sentido, a solução de reação era de 100 mM de fosfato de potássio em um pH de 6,0, e adicionaram-se 20 mM de SCB de sódio como um agente redutor. Após o término da reação, a solução de reação foi primeiramente passada através de uma coluna Butil Sepharose FF (GE Healthcare, Suécia) usando um tampão de Bis-Tris e um gradiente de concentração de NaCl, e, então, passada através de uma coluna Source ISO (GE Healthcare, Suécia) usando um tampão de citrato de sódio e um gradiente de concentração de sulfato de amônio, purificando, assim, finalmente o conjugado de derivado de oxintomodulina-PEG-imunoglobulina Fc.[0146] Next, the purified mono-PEGylated oxyntomodulin derivative and Fc immunoglobulin were reacted in a molar ratio of 1:4 with a total protein level of 20 mg/mL at 4°C for about 16 hours. In this regard, the reaction solution was 100 mM potassium phosphate at a pH of 6.0, and 20 mM sodium SCB was added as a reducing agent. After completion of the reaction, the reaction solution was first passed through a Butyl Sepharose FF column (GE Healthcare, Sweden) using a Bis-Tris buffer and a NaCl concentration gradient, and then passed through a Source ISO (GE Healthcare, Sweden) using a sodium citrate buffer and an ammonium sulfate concentration gradient, thus finally purifying the oxyntomodulin derivative-PEG-immunoglobulin Fc conjugate.

(4) Solubility test of oxyntomodulin and long-acting oxyntomodulin conjugate

[0147] Para examinar a solubilidade do derivado de oxintomodulina de SEQ ID NO: 27 e do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada, um material padrão e um material de teste do derivado de oxintomodulina e do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada foram preparados de acordo com a composição conforme na Tabela 4 a seguir, respectivamente.[0147] To examine the solubility of the oxyntomodulin derivative of SEQ ID NO: 27 and the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate, a standard material and a test material of the oxyntomodulin derivative and the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate were prepared according to the composition as shown in Table 4 below, respectively.

[0148] Os materiais de teste do derivado de oxintomodulina e do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada tinham uma composição de solução tampão de citrato em um pH de 5,6, polissorbato como um tensoativo não- iônico, manitol como um álcool de açúcar, e metionina. De acordo com os valores quantitativos das Tabelas 5 e 6, os materiais de teste foram dissolvidos em temperatura ambiente, centrifugou-se o material de teste do derivado de oxintomodulina que foi incompletamente dissolvido, e somente o sobrenadante foi coletado e usado no teste de solubilidade.[0148] The oxyntomodulin derivative and long-acting oxyntomodulin derivative conjugate test materials had a composition of citrate buffer solution at a pH of 5.6, polysorbate as a non-ionic surfactant, mannitol as an alcohol of sugar, and methionine. According to the quantitative values in Tables 5 and 6, the test materials were dissolved at room temperature, the oxyntomodulin derivative test material that was incompletely dissolved was centrifuged, and only the supernatant was collected and used in the solubility test. .

[0149] Nesse sentido, como um valor quantitativa máximo dentre os valores quantitativos teóricos do material de teste do derivado de oxintomodulina, determinaram-se cerca de 5 mg/mL, que é um valor quantitativo obtido convertendo-se 80 mg/mL do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada em derivado de oxintomodulina. O material de teste do derivado de oxintomodulina dissolvido no valor quantitativo máximo foi serialmente diluído, e o ponto (0,008 mg/mL) no qual a insulina foi completamente dissolvida sem impurezas ou péletes foi determinado como um valor quantitativo mínimo.[0149] In this sense, as a maximum quantitative value among the theoretical quantitative values of the oxyntomodulin derivative test material, around 5 mg/mL was determined, which is a quantitative value obtained by converting 80 mg/mL of the conjugate from long-acting oxyntomodulin derivative to oxyntomodulin derivative. The oxyntomodulin derivative test material dissolved at the maximum quantitative value was serially diluted, and the point (0.008 mg/mL) at which insulin was completely dissolved without impurities or pellets was determined as a minimum quantitative value.

[0150] Primeiramente, confirmou-se uma respectiva curva padrão de calibra- ção do derivado de oxintomodulina e do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada por cromatografia de fase reversa, conforme na Figura 3. Os valores quantitativos do derivado de oxintomodulina e do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada foram calculados colocando-se as áreas de pico do derivado de oxintomodulina e dos materiais de teste do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada confirmados por cromatografia de fase reversa na curva padrão de calibração, respectivamente.[Tabela 4] [Tabela 5] [Tabela 6] [0150] Firstly, a respective standard calibration curve of the oxyntomodulin derivative and the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate was confirmed by reversed-phase chromatography, as shown in Figure 3. The quantitative values of the oxyntomodulin derivative and the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate were calculated by placing the peak areas of the oxyntomodulin derivative and the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate test materials confirmed by reversed-phase chromatography on the calibration standard curve, respectively.[ Table 4] [Table 5] [Table 6]

[0151] Conforme mostrado nas Tabelas 5 e 6, e na Figura 4, o valor quantitativo do material de teste do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada dissolvido no tampão de formulação do conjugado de oxintomodulina de ação prolongada mostrou pouca diferença entre o valor teórico e o valor de medição, enquanto o material de teste do valor quantitativo do derivado de oxintomodulina dissolvido no tampão de formulação do conjugado de oxintomodulina de ação pro-longada mostrou uma diferença maior (até cerca de 27 vezes) entre o valor teórico e o valor de medição. Ademais, quando o material de teste do derivado de oxintomo- dulina for dissolvido no tampão de formulação do conjugado de oxintomodulina de ação prolongada, observaram-se péletes após a centrifugação em todos os casos, excluindo 0,008 mg/mL. Conforme mostrado no resultado, a solubilidade do derivado de oxintomodulina foi aperfeiçoada pelo fragmento Fc de imunoglobulinas usado como um carreador do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada.[0151] As shown in Tables 5 and 6, and Figure 4, the quantitative value of the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate test material dissolved in the long-acting oxyntomodulin conjugate formulation buffer showed little difference between the value theoretical and measurement value, while the test material of the quantitative value of the oxyntomodulin derivative dissolved in the long-acting oxyntomodulin conjugate formulation buffer showed a greater difference (up to about 27 times) between the theoretical value and the measurement value. Furthermore, when the oxyntomodulin derivative test material was dissolved in the long-acting oxyntomodulin conjugate formulation buffer, pellets were observed after centrifugation in all cases, excluding 0.008 mg/mL. As shown in the result, the solubility of the oxyntomodulin derivative was improved by the Fc fragment of immunoglobulins used as a carrier of the long-acting oxyntomodulin derivative conjugate.

[0152] Esses resultados indicam que o fragmento Fc de imunoglobulinas usado como um carreador da proteína e peptídeo fisiologicamente ativos da presente invenção é capaz de aperfeiçoar efetivamente a solubilidade da proteína e do peptídeo.[0152] These results indicate that the immunoglobulin Fc fragment used as a carrier of the physiologically active protein and peptide of the present invention is capable of effectively improving the solubility of the protein and peptide.

[0153] Com base na descrição anterior, os indivíduos versados na técnica compreenderão que a presente invenção pode ser implementada em uma forma específica diferente sem alterar o âmbito técnico ou as características fundamentais da mesma. Portanto, deve-se compreender que a modalidade anterior não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações anexas ao invés de pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadrem nos limites e divisas das reivindicações, ou equivalentes desses limites e divisas, são, portanto, destinadas a serem abrangidas pelas reivindicações.[0153] Based on the previous description, individuals skilled in the art will understand that the present invention can be implemented in a different specific form without changing the technical scope or fundamental characteristics thereof. Therefore, it must be understood that the previous modality is not limiting, but illustrative in all aspects. The scope of the invention is defined by the appended claims rather than by the description preceding them, and therefore all changes and modifications falling within the limits and boundaries of the claims, or equivalents of such limits and boundaries, are therefore intended to be covered by the claims.

Claims

1. Method for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide in an aqueous solution having a pH of 5.0 to 7.0 as compared to the physiologically active protein or peptide that is not conjugated to an immunoglobulin Fc fragment CHARACTERIZED by the fact that the method comprises conjugating the physiologically active protein or peptide to the N-terminus of the Fc fragment of immunoglobulin by means of a linker, in which the linker is selected from the group consisting of polypropylene glycol, a copolymer of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, a biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA) and polylactic glycolic acid (PLGA), a lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and a combination thereof.

2. Method, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the immunoglobulin Fc fragment is an Fc fragment derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.

3. Method according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that the immunoglobulin Fc fragment is a hybrid of domains in which each domain has a different origin derived from the immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

4. Method according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that the immunoglobulin Fc fragment is a dimer or a multimer consisting of single-chain immunoglobulins of the same origin.

5. Method according to claim 4, CHARACTERIZED by the fact that the immunoglobulin Fc fragment is an aglycosylated human IgG4 Fc fragment.

6. Method, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the physiologically active protein or peptide conjugated to the immunoglobulin Fc fragment is in the form of a fusion protein.

7. Method, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the binder is polyethylene glycol.

8. Method according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the aqueous solution comprises a buffer solution of citric acid or acetic acid, polysorbate as a non-ionic surfactant, mannitol as a sugar alcohol, and sodium chloride or methionine as an isotonic agent.

9. Method according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the physiologically active protein or peptide is exendin-4, glucagon, glucagon-like peptide 1 (GLP-1), glucagon-like peptide 2 (GLP-2), hormone parathyroid (PTH), calcitonin, insulin or oxyntomodulin.

10. Composition for improving the solubility of a physiologically active protein or peptide in an aqueous solution having a pH of 5.0 to 7.0, CHARACTERIZED by the fact that it comprises a physiologically active protein or peptide and an Fc fragment of immunoglobulin, wherein the physiologically active protein or peptide is linked to the N-terminus of the immunoglobulin Fc fragment through a linker as an active ingredient, wherein the linker is selected from the group consisting of polypropylene glycol, ethylene copolymer glycol and propylene glycol, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, a biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA) and polylactic glycolic acid (PLGA), a lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and a combination thereof, and wherein the composition improves solubility compared to a composition without an immunoglobulin Fc fragment.