BR112016021878B1 - Métodos para detectar uma desregulação em um gene alvo e para diagnosticar a presença ou ausência de câncer ou uma susceptibilidade ao câncer em um indivíduo - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DETECTAR UMA DESREGULAÇÃO EM UM GENE ALVO E PARA DIAGNOSTICAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE CÂNCER OU UMA SUSCEPTIBILIDADE AO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO São descritos aqui métodos e kits para detectar a presença ou ausência de desregulações de genes como as que surgem a partir de fusões de genes e/ou anomalias cromossômicas, por exemplo, translocações, inserções, inversões e deleções. Os métodos, composições e kits são úteis para detectar mutações que causam a expressão diferencial de uma porção 5' de um gene alvo relativo à região 3' do gene alvo. A expressão média da porção 5' do gene alvo é comparada com a expressão média da porção 3' do gene alvo para determinar uma expressão diferencial intragênica (IDE). A IDE pode então ser usada para determinar se uma desregulação ou uma doença particular (ou susceptibilidade a uma doença) está presente ou ausente em um indivíduo ou amostra.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade e o benefício de Pedido Provisório US no. 61/969.897, depositado em 25 de março de 2014, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DE INVENÇÃO

[002] A presente tecnologia refere-se geralmente à detecção de desregulações de genes, como as provenientes de translocações e/ou fusões de genes, que podem estar associadas com várias doenças. Em um aspecto particular, a presente tecnologia refere-se à detecção de desregulações de genes usando PCR em tempo real quantitativa.

FUNDAMENTOS

[003] A seguinte descrição é fornecida para auxiliar a compreensão do leitor. Nenhuma das informações fornecidas ou referências citadas é admitida como sendo técnica anterior à presente invenção.

[004] Variações na estrutura de cromossomos envolvem mudanças em partes de cromossomos em vez de mudanças no número de cromossomos ou conjuntos de cromossomos no genoma. Existem quatro tipos comuns de mutações: deleções e duplicações (ambas envolvendo uma mudança na quantidade de DNA em um cromossomo), inversões (que envolvem uma mudança no arranjo de um segmento cromossômico), e translocações (que envolvem um rearranjo de porções em cromossomos não homólogos).

[005] As translocações recíprocas e robertsonianas são os tipos de ocorrência mais frequente de translocações. Translocações recíprocas geralmente envolvem uma troca de duas vias entre diferentes cromossomos. Os cromossomos se rompem e segmentos abaixo dos pontos de interrupção trocam de posições. Se o evento for balanceado, nenhum ganho ou perda líquida de material genético resulta e o indivíduo geralmente se torna fenotipicamente não afetado se nenhum gene for rompido.

[006] As translocações robertsonianas ocorrem quando dois cromossomos fundem nos centros e, essencialmente, combinam em um. A maior parte do material genético permanece de ambos os cromossomos. Como em translocações recíprocas balanceadas, o carreador pode ser normal, mas produz gametas geneticamente desbalanceados. A maior parte da progênie se originando de gametas desbalanceados não sobrevive e um aborto espontâneo ocorre durante a gravidez precoce. Se o carreador for fértil e sobreviver à progênie, vários defeitos poderiam ocorrer. Uma translocação robertsoniana resulta na fusão de cromossomos 14 e 21. A progênie resultante pode herdar três cópias do cromossomo 21 que causa a síndrome de Down.

[007] Uma fusão de genes pode resultar quando uma translocação se une às porções de dois genes de outro modo separados. Tal ocorrência é comum em alguns canceres, como câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

[008] Linfoma quinase anaplásica (ALK) é um receptor tirosina quinase que está frequentemente envolvido em fusões de genes em distúrbios hematológicos e tem pelo menos 4 parceiros de fusão relatados em NSCLC: EML4, KLC1, KIF5B e TFG (3-5). Os produtos de fusão de genes (encontrados em 3 ~ 7% NSCLC) levam à ativação de ALK quinase constitutiva e servem como acionadores oncogênicos com capacidade de transformação. O desenvolvimento de inibidores de tirosina quinase (TKIs) alvo-marcando os produtos de fusão EML4-ALK tem alcançado sucesso e crizotinib foi aprovado pelo FDA em 2011 para o tratamento pacientes com NSCLC com translocações ALK, junto com ALK fluorescente em teste de hibridização in situ (FISH) como diagnóstico companheiro (6).

[009] ROS1, como ALK, é um receptor tirosina quinase. Aproximadamente 1,7% de NSCLC abrigam a translocação ROS1 e ROS1 tem pelo menos 7 parceiros de fusão: FIG, GOPC, TPM3, SDC4, SLC34A2, CD74 e EXR (7-9). Similar a ALK, os produtos de fusão ROS1 levam à atividade de quinase constitutiva e são sensíveis a TKIs. Embora não se tenha atualmente inibidores de ROS1 específicos em experiências clínicas, os dados sugerem que os pacientes NSCLC com translocações ROS1 poderiam se beneficiar da terapia alvo-marcada usando crizotinib (10).

[0010] RET (rearranjado durante a transfecção) é outro receptor tirosina quinase e é conhecido por sua associação com o câncer de tiroide papilar através de rearranjos cromossômicos (RET/PTC). Cerca de 1,9% de NSCLC carregam as translocações RET com pelo menos 2 parceiros de fusão: KIF5B e CCDC6 (7, 9). Além disso, as translocações RET em NSCLC são alvos potenciais para TKIs como vandetanib, que é aprovado para o tratamento de câncer da tiroide (11).

[0011] Câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por cerca de 80% de todos os casos de câncer de pulmão. Na última década, a caracterização de alterações genéticas em NSCLC levou ao desenvolvimento de novos tratamentos terapêuticos, como gefitinib e erlotinib para pacientes com NSCLC com mutações EGFR (2). Em geral, mutação EGFR, mutação KRAS, translocações ALK, ROS1 e RET são mutuamente exclusivos em pacientes com NSCLC. Os métodos melhorados para detectar translocações, como, por exemplo, translocações ALK, ROS1 e RET em indivíduos como, por exemplo, pacientes com NSCLC, seriam utilizáveis para identificar pacientes que poderiam se beneficiar de tratamentos terapêuticos alvo-marcados com TKIs como crizotinib e vandetanib. Um painel e/ou kit para detectar tais translocações também seriam úteis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] São aqui descritos métodos, composições e kits para a detecção de desregulações de genes, como as provenientes de fusões de genes e translocações cromossômicas. Os métodos, composições e kits são úteis para a detecção de mutações que causam a expressão diferencial de uma região 5’ de um gene alvo com relação à região 3' do gene alvo. Um teste sensível, preciso e rentável para detectar translocações ALK, ROS1 e RET em pacientes com NSCLC também é descrito. Um método para o diagnóstico de câncer é também descrito.

[0013] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para detectar a presença ou ausência de uma desregulação em um gene alvo em uma amostra de teste. Em uma modalidade, o método inclui: (a) amplificar porções de uma região 5’ de um transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente em uma amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvo 5’ que são direcionados às porções da região 5’ do gene alvo; (b) amplificar porções de uma região 3’ dom transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvo 3’ que são direcionados às porções da região 3’ do gene alvo; (c) detectar os produtos de amplificação produzidos pelos dois ou mais pares de iniciadores alvo 5’ e os dois ou mais pares de iniciadores alvo 3’; (d) determinar o limite de ciclo médio (Ct) entre os dois ou mais pares de iniciadores alvo 5’ e o Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvo 3’, (e) calcular uma pontuação de IDE como a diferença entre o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvo 5’ e o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvo 3’, e (f) identificar a amostra de teste como (i) tendo uma desregulação do gene alvo se a pontuação de IDE for significativamente diferente de um valor de corte e a diferença indicar a presença de uma desregulação do gene alvo, ou (ii) não tendo uma desregulação do gene alvo se a pontuação de IDE na amostra de teste não diferir significativamente do valor de corte.

[0014] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um método para diagnosticar a presença ou ausência de câncer ou uma susceptibilidade a câncer em um indivíduo. Em uma modalidade, o método inclui: (a) obter uma amostra de teste que compreende ácido nucleico do indivíduo; (b) amplificar porções de uma região 5’ de um transcrito de um gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvo 5’ que são direcionados às porções da região 5’ do gene alvo; (c) amplificar porções de uma região 3’ de um transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvo 3’ que são direcionados às porções da região 3' do gene alvo; (d) detectar os produtos de amplificação produzidos pelos dois ou mais pares de iniciadores alvo 5’ e os dois ou mais pares de iniciadores alvo 3’; (e) determinar o limite de ciclo médio (Ct) entre os dois ou mais pares de iniciadores alvo 5’ e o Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvo 3’; (f) calcular uma pontuação de IDE como a diferença entre o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvo 5’ e o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvo 3’, e (g) diagnosticar o indivíduo como (i) tendo câncer ou uma susceptibilidade para câncer quando a pontuação de IDE for significativamente diferente de um valor de corte e a diferença indicar a presença de câncer ou um susceptibilidade para câncer, ou (ii) não tendo câncer ou uma susceptibilidade para câncer resultante da desregulação do gene alvo se a pontuação de IDE na amostra de teste não diferir significativamente do valor de corte.

[0015] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano e o câncer é o câncer de pulmão de células não pequenas. Exemplos de genes alvo que podem ser testados para a translocação para detectar a presença ou ausência de NSCLC são ROS1, RET e ALK. Em algumas modalidades, estes três genes constituem um painel de NSCLC e são todos analisados usando os métodos descritos.

[0016] Uma amostra pode ser uma amostra biológica ou outra amostra contendo ácidos nucleicos como, por exemplo, mRNA ou cDNA. Amplificação pode ser realizada usando PCR em tempo real e detecção de produtos de amplificação pode ser realizada usando sonda(s) marcada(s) de modo detectável, como uma sonda oligonucleotídica que compreende um marcador detectável.

[0017] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o nível de expressão da região 5’ de um gene alvo é determinado por amplificação usando dois, três, quatro, cinco ou seis pares de iniciadores diferentes direcionados a várias porções da região 5’ do alvo gene. Similarmente, dois, três, quatro, cinco ou seis pares de iniciadores diferentes direcionados a várias porções da região 3’ do gene alvo podem ser usados para determinar o nível de expressão da região 3’ do gene alvo. As quantidades de produtos de amplificação podem, cada, ser normalizadas para a quantidade de um transcrito de gene de controle endógeno ("Controle") como, por exemplo, ABL.

[0018] Em algumas modalidades, o nível de expressão ou quantidade relativa de transcrição pode ser determinado usando PCR em tempo real e a comparação do ciclo de limite (Ct) para cada amplicon. Os valores de Ct médios para cada uma das regiões 3’ (médCt3’) e 5’ (médCt5’) de um gene alvo são usados para calcular a pontuação de IDE, que podem ser calculada como IDE = (médCt5‘ - médCt3’), ou IDE = (médCt5’)/(Ctcontroie)- (médCt3’)/(Ctcontrole), ou IDE = [Ln((médCt5’)/ Ctcontrole)]-[Ln((médCt3’)/ Ctcontroie)]. Em aigumas modaiidades, os vaiores de Ct são normaiizados para uma amostra de referência.

[0019] Amostras bioiógicas como, por exempio, sangue totai, céiuias sanguíneas isoiadas, piasma, soro e urina podem ser anaiisadas usando os métodos descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] Figura 1 é um diagrama ilustrando a determinação da expressão diferencial intragênica (IDE) com base em níveis de expressão médios de regiões 5’ e regiões 3' de um gene para detectar a presença ou ausência de um transcrito de fusão. Parte (1) mostra a diferença em níveis de expressão (IDE) entre a região 5’ e a região 3’, indicando a presença de um transcrito de fusão. Parte (2) mostra níveis iguais de expressão da região 5’ e região 3’, indicando que não está presente transcrito de fusão.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0021] São aqui descritos métodos, reagentes e kits para a detecção de desregulações de genes, como os surgindo como um resultado de fusões de genes ou translocações cromossômicas, em uma amostra, em que a desregulação conduz à expressão diferencial ou quantidades de porções particulares de genes alvo. Translocações são mutações cujo efeito é justapor pedaços previamente separados de DNA, potencialmente reunindo junto os genes separados para formar genes de fusão funcionalmente distintos (por exemplo, ROS1-FIG, ROS1-TPM3 e ROS1-SLC34A2).

[0022] Para facilitar uma compreensão da presente invenção, vários termos e frases são definidos abaixo.

[0023] Como usado aqui, salvo indicado de outra forma, as formas singulares "um", "uma" e "o" e “a” incluem as referências no plural. Assim, por exemplo, uma referência a "um oligonucleotídeo" inclui uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeos, uma referência a marcador é uma referência a um ou mais marcadores, uma referência a sonda é uma referência a uma ou mais sondas e uma referência a " um ácido nucleico "é uma referência a um ou mais polinucleotídeos.

[0024] Como aqui usado, salvo indicação em contrário, quando fazendo referência a um valor numérico, o termo "cerca de" significa mais ou menos 10% do valor enumerado.

[0025] Os termos "amplificação" ou "amplificar" como aqui usados, incluem métodos para copiar um ácido nucleico alvo, aumentando assim o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico selecionada. Amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser ou DNA ou RNA. As sequências amplificadas deste modo formam um "produto de amplificação". Enquanto os métodos exemplificativos descritos a seguir referem-se à amplificação usando a reação em cadeia polimerase (PCR), em numerosos outros métodos são conhecidos na técnica para a amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, métodos isotérmicos, métodos de círculo rolante, etc.). O versado na técnica compreenderá que estes métodos podem ser usados em vez de, ou junto com os métodos de PCR. Ver, Saiki, "Amplification of Genomic DNA" em PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, Calif. 1990, pp. 13-20; Wharam et al., Nucleic Acids Res., 29(11):E54-E54, 2001; Hafner et al., Biotechniques, 30(4):852-56, 858, 860, 2001: Zhong et al., Biotechniques, 30(4):852-6, 858, 860, 2001.

[0026] Como aqui usado, o termo "detectar" refere-se a observação de um sinal a partir de um marcador detectável para indicar a presença de um ácido nucleico alvo na amostra. O termo detecção não requer que método proporcione 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade. Como é bem conhecido, "sensibilidade" é a probabilidade de que um teste seja positivo, dado que o indivíduo tem uma sequência de ácido nucleico alvo, enquanto que "especificidade" é a probabilidade de que um teste seja negativo, dado que o indivíduo não tem a sequência de ácido nucleico alvo. Uma sensibilidade de pelo menos 50% é preferida, embora sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 99% sejam claramente mais preferidas. Uma especificidade de pelo menos 50% é preferida, embora sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 99% sejam claramente mais preferidas. Detecção também engloba testes com falsos positivos e falsos negativos. As taxas de falsos negativos podem ser de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou mesmo maiores. As taxas de falsos positivos podem ser de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou mesmo maiores.

[0027] Os termos "complemento", "complementar" ou "complementaridade", como aqui usados com referência aos polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico genômico) relacionados com as regras de pareamento de bases. O complemento de uma sequência de ácido nucleico, como aqui usado, refere-se a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico de tal modo que a extremidade 5' de uma sequência é pareada com a extremidade 3' da outra, está em "associação antiparalelo". Por exemplo, para a sequência 5'-A-G-T-3’ é complementar da sequência 3'-T-C- A-5'. Algumas bases que não são comumente encontradas nos ácidos nucleicos naturais podem ser incluídas nos ácidos nucleicos da presente invenção e incluem, por exemplo, inosina e 7-desazaguanina. Complementaridade não precisa ser perfeita; duplexes estáveis podem conter pares de bases mal correspondidos ou bases não correspondidas. Os versados na técnica da tecnologia do ácido nucleico podem determinar a estabilidade duplex empiricamente considerando um certo número de variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, a composição de base e a sequência do oligonucleotídeo, a força iônica e a incidência de pares de bases mal correspondidas. A complementaridade pode ser "parcial", em que apenas algumas das bases dos ácidos nucleicos são correspondidas de acordo com as regras de pareamento de bases. Ou, pode haver complementaridade "completa", "total", ou "cheia" entre os ácidos nucleicos.

[0028] O termo "marcador detectável", como aqui usado refere-se a uma molécula ou um composto ou um grupo de moléculas ou um grupo de compostos associados com uma sonda e é usado para identificar a sonda hibridada com um ácido nucleico genômico ou de ácido nucleico de referência. Em alguns casos, o marcador detectável pode ser detectado diretamente. Em outros casos, o marcador detectável pode ser uma parte de um par de ligação, que pode então ser subsequentemente detectado. Sinais do marcador detectável podem ser detectados por vários meios e dependerão da natureza do marcador detectável. Exemplos de meios para detectar o marcador detectável incluem, mas não são limitados aos meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, electromagnéticos, radioquímicos, ou por meios químicos, como fluorescência, quimifluorescência ou quimioluminescência, ou quaisquer outros meios apropriados.

[0029] Um "fragmento", no contexto de um fragmento de gene ou um fragmento cromossômico refere-se a uma sequência de resíduos de nucleotídeos que são pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, pelo menos cerca de 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, pelo menos cerca de 40 nucleotídeos, pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, pelo menos cerca de 100 nucleotídeos, pelo menos cerca de 250 nucleotídeos, pelo menos cerca de 500 nucleotídeos, pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 2000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 5000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 10.000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 20.000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 50.000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 100000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 500000 nucleotídeos, pelo menos cerca de 1.000.000 nucleotídeos ou mais.

[0030] O termo "anomalia genética" ou "anomalia cromossômica", como aqui usado, refere-se a um desvio da sequência de ácido nucleico a partir de uma sequência genética de tipo selvagem ou normal. Uma anomalia genética pode refletir uma diferença entre o complemento genético completo de um organismo, ou qualquer porção do mesmo, em comparação com um complemento genético normal e completo de todos os cromossomos nesse organismo. Por exemplo, uma anomalia genética pode incluir uma mudança nos cromossomos ou uma porção dos mesmos (por exemplo, deleções, duplicações, amplificações); ou uma mudança na estrutura cromossômica (por exemplo, translocações, mutações de pontos). A anomalia genética pode ser hereditária, ou seja, passada de geração em geração ou não hereditária. As anomalias genéticas podem estar presentes em algumas células de um organismo ou em todas as células deste organismo.

[0031] O termo "gene de controle endógeno", como aqui usado, refere-se a genes que são geralmente sempre expressados e que se pensa estarem envolvidas no metabolismo celular de rotina. Os genes de controle endógenos são bem conhecidos e incluem tais genes como ABL, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PDH ou GAPDH), albumina, actinas, tubulinas, ciclofilina, hipoxantina fosforibosiltransferase (HRPT), L32. 28S, e 18S rRNAs. Detecção de genes de controle endógenos em um teste de diagnóstico pode servir como um controle positivo para o teste.

[0032] Os termos "identidade" e "idêntico" referem-se a um grau de identidade entre as sequências. Pode haver identidade parcial ou identidade completa. Uma sequência parcialmente idêntica é uma que é menos de 100% idêntica a outra sequência. As sequências parcialmente idênticas podem ter uma identidade global de pelo menos 70% ou pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90% ou pelo menos 95%.

[0033] Como aqui usados, os termos "isolado", "purificado" ou "substancialmente purificado" referem-se a moléculas, como ácido nucleico, que são removidas de seu ambiente natural, isoladas ou separadas, e que são pelo menos 60% livres, preferivelmente 75% livres, e mais preferivelmente 90% livres de outros componentes com os quais elas são naturalmente associadas. Uma molécula isolada é, assim, uma molécula substancialmente purificada.

[0034] O termo "PCR multiplex", como aqui usado, refere-se a um teste que fornece amplificação e detecção simultâneas de dois ou mais produtos dentro do mesmo vaso de reação. Cada produto é iniciado usando um par de iniciadores distinto. Uma reação multiplex pode ainda incluir sondas específicas para cada um dos produtos que são marcados de modo detectável com diferentes porções detectáveis.

[0035] Como aqui usado, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a um polímero curto composto por desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou qualquer combinação dos mesmos. Os oligonucleotídeos têm, geralmente, entre cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, ou 30 a cerca de 150 nucleotídeos (nt) em comprimento, mais preferivelmente cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, ou 30 a cerca de 70 nt, e o mais preferivelmente entre cerca de 18 a cerca de 26 nt em comprimento.

[0036] Um oligonucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo irá "hibridar" para o ácido nucleico sob condições severas. Como aqui usado, "hibridização" ou "hibridizando" refere-se ao processo pelo qual um filamento único de oligonucleotídeo se anela com um filamento complementar através do pareamento de bases, sob condições de hibridização definidas. Esta é uma interação específica, isto é, não aleatória, entre dois polinucleotídeos complementares. A hibridização e a resistência da hibridização (isto é, a resistência de associação entre os ácidos nucleicos) é influenciada por fatores como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, a estringência das condições envolvidas, e Tm do híbrido formado.

[0037] "Hibridização específica" é uma indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos compartilham um elevado grau de complementaridade. Complexos de hibridização específicos se formam em condições de anelamento permissivas e permanecem hibridizados depois de quaisquer etapas de lavagem subsequentes. As condições permissivas para anelamento de sequências de ácidos nucleicos, que são rotineiramente determináveis por um versado na técnica, ocorrem sob condições estringentes. A estringência da hibridização pode ser expressada, em parte, com referência à temperatura sob a qual as etapas de lavagem são realizadas. Essas temperaturas são tipicamente selecionadas para serem cerca de 5°C a 20°C, inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a uma resistência iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) em que 50% da sequência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondida. As equações para o cálculo de Tm e as condições para hibridização de ácido nucleico são conhecidos na técnica. "Condições de hibridização estringentes", como aqui referidas designam 50% formamida, NaCl 1M, 1% SDS a 37°C. Os procedimentos de hibridização são bem conhecidos na técnica e são descritos em por exemplo Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994.

[0038] Como aqui usado, um "iniciador" para amplificação é um oligonucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos alvo e leva à adição de nucleotídeos à extremidade 3’ do iniciador na presença de uma DNA ou RNA polimerase. O nucleotídeo 3’ do iniciador deve geralmente ser idêntico à sequência de ácido nucleico alvo em uma posição de nucleotídeo correspondente para a expressão e amplificação ótimas. O termo "iniciador" como aqui usado, inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizados incluindo iniciadores de peptídeo ácido nucleico, iniciadores de ácido nucleico bloqueado, iniciadores modificados de fosforotioato, iniciadores marcados, e similares. Os iniciadores de PCR a montante e a jusante específicos para determinadas sequências ou regiões de sequências podem ser projetados usando programas de computador disponíveis e/ou por aplicação de regras gerais de projeto de iniciadores conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os iniciadores de um par de iniciadores têm, cada, 18-30 pares de bases de comprimento a temperaturas de fusão similares (dentro de 5°C uma da outra) e a temperaturas de fusão entre 65 ° e 75°C. Em algumas modalidades, um iniciador tem um teor de GC entre 40 e 60%, e a 3’ de cada iniciador termina em C ou G para promover a ligação. Ao projetando iniciadores, as regiões de estrutura secundária tipicamente são evitadas, e sequências com uma distribuição balanceada dos domínios ricos em GC e ricos em AT são preferidos. Ciclos de 4 ou mais de uma base, ou repetições de dinucleotídeos (por exemplo, ACCCC ou ATATATAT) também são tipicamente evitados.

[0039] Como aqui usado, um "iniciador dianteiro" é um iniciador que é complementar à cadeia antissentido de dsDNA. Um "iniciador reverso" é complementar à fita sentido de dsDNA. Um "iniciador exógeno" refere-se especificamente a um oligonucleotídeo que é adicionado a um recipiente de reação de amplificação contendo o ácido nucleico de amostra a ser amplificado a partir do exterior do recipiente e não é produzido a partir da amplificação no recipiente de reação. Um iniciador que é "associado com" um fluoróforo ou outro marcador está fisicamente conectado ao marcador através de alguns meios. Um exemplo é um iniciador-sonda. Como aqui usado, um "iniciador-sonda" é um tipo de iniciador.

[0040] Iniciadores são tipicamente de pelo menos 10, 15, 18 ou 30 nucleotídeos de comprimento até cerca de 100, 110, 125 ou 200 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente de pelo menos 15 até cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente de pelo menos 25 até cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os iniciadores e/ou sondas têm 15 a 35 nucleotídeos de comprimento. Não há comprimento padrão para a hibridização ou amplificação de reação de cadeia polimerase ótimas. Um comprimento ótimo para uma aplicação de iniciador particular pode ser prontamente determinado do modo descrito em H. Erlich, PCR Technology, Principies and Application for DNA Amplification, (1989).

[0041] Um "par de iniciadores" é um par de iniciadores que são ambos direcionados à sequência de ácido nucleico alvo. Um par de iniciadores que é direcionado a um gene ou sequência particular contém um iniciador dianteiro e um iniciador reverso, cada um do quais hibridiza sob condições estringentes com uma fita diferente (sentido ou antissentido) da sequência de ácido nucleico. O iniciador dianteiro é complementar para à fita antissentido do dsDNA e o iniciador reverso é complementar à fita sentido. Um iniciador de um par de iniciadores pode ser um iniciador-sonda (isto é, uma molécula bifuncional que contém um elemento de iniciador de PCR ligado covalentemente por um grupo de bloqueio de polimerase a um elemento de sonda e, em adição, pode conter um fluoróforo que interage com um extintor). Um par de iniciadores que hibridiza especificamente sob condições estringentes para um gene alvo pode flanquear a totalidade ou uma porção do gene (que é relativamente complementar à sequência do iniciador). Como resultado, o gene completo pode ser amplificado, ou um segmento do gene pode ser amplificado, dependendo da posição em ou em torno do gene, onde os iniciadores hibridizam. Dois ou mais pares de iniciadores são diferentes se pelo menos uma sequência de iniciador de um par de iniciadores não é idêntica a qualquer uma das sequências de iniciadores do outro par de iniciadores. Assim, dois pares de iniciadores podem ser diferentes, mesmo se eles compartilham um iniciador idêntico. Em algumas modalidades. Em algumas modalidades, diferentes pares de iniciadores não compartilham quaisquer sequências de iniciadores comuns.

[0042] Como aqui usado, o termo "sistema de detecção de iniciador- sonda" refere-se a um método para PCR em tempo real. Este método utiliza uma molécula bifuncional (aqui referida como um iniciador-sonda), que contém um elemento de iniciador de PCR ligado covalentemente por um grupo de bloqueio de polimerase para um elemento de sonda. Adicionalmente, cada molécula de iniciador-sonda contém um fluoróforo que interage com um extintor para reduzir a fluorescência de fundo. Iniciador- sondas, como aqui usado, pode compreender um iniciador 3’ com uma cauda de sonda estendida 5’, compreendendo uma estrutura de grampo de cabelo, que possui um par fluoróforo/extintor. Durante a PCR, a polimerase é bloqueada de se estender para a cauda da sonda pela inclusão de hexaetileno glicol (HEG). Durante o primeiro ciclo de amplificação, o iniciador específico de alvo 3’ hibridiza com o ácido nucleico alvo e é estendido de tal modo que o iniciador-sonda é agora incorporado na fita recentemente sintetizada, que possui uma região alvo recentemente sintetizada para a sonda 5'. Durante o próximo ciclo de desnaturação e anelamento, a região de sonda do laço de grampo de cabelo iniciador-sonda irá hibridizar com o alvo, separando, assim, o fluoróforo e o extintor e criando um sinal mensurável. Tais iniciadores- sondas são descritos em Whitcombe et al., Nature Biotech 17: 804-807 (1999). Os iniciadores SCORPION são iniciadores-sondas exemplares.

[0043] Como aqui usado "sistema de detecção TaqMan ® PCR" refere-se a um método para PCR em tempo real. Neste método, uma sonda TaqMan ® que hibridiza com o segmento de ácido nucleico amplificado é incluída na mistura principal de amplificação. A sonda TaqMan ® compreende um doador e um fluoróforo extintor em cada extremidade da sonda e em proximidade suficientemente perto um do outro para que a fluorescência do doador seja retomada pelo extintor. No entanto, quando a sonda hibridiza com o segmento amplificado, a atividade 5'-exonuclease de Taq polimerases cliva a sonda, permitindo, assim, ao fluoróforo doador emitir fluorescência, que pode ser detectada.

[0044] Como aqui usado, um oligonucleotídeo é "específico" para um ácido nucleico se o oligonucleotídeo tem pelo menos 50% de identidade de sequência com uma porção do ácido nucleico quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico estão alinhados. Um oligonucleotídeo que é específico para um ácido nucleico é um que, sob as condições de hibridização ou lavagem apropriadas, é capaz de hibridizar com o alvo de interesse e não substancialmente hibridizar com os ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis mais elevados de identidade de sequência são preferidos e incluem, pelo menos, 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de computador disponível comercialmente com uma configuração padrão de default que emprega algoritmos bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST). Como aqui usado, sequências que têm "elevada identidade de sequência" têm nucleotídeos idênticos, pelo menos em cerca de 50% das posições de nucleotídeos alinhadas, preferivelmente pelo menos cerca de 60% de posições de nucleotídeos alinhadas, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 75% de posições de nucleotídeos alinhados.

[0045] Os termos "ácido nucleico alvo", "gene alvo" e "sequência alvo" são aqui usados de modo interpermutável e referem-se à sequência de ácido nucleico que se destina a ser identificada. Os ácidos nucleicos alvo podem incluir regiões 5’ ou 3' de um gene alvo ou transcrito ou qualquer outra sequência de interesse. Os ácidos nucleicos alvo podem representar sequências alternativas ou alelos de um gene particular. Os ácidos nucleicos alvo podem ser de fita dupla ou de fita única, ou parcialmente de fita dupla, ou parcialmente de fita simples ou uma molécula de grampo de cabelo. Os ácidos nucleicos alvo pode ser de cerca de 1-5 bases, cerca de 10 bases, cerca de 20 bases, cerca de 50 bases, cerca de 100 bases, cerca de 500 bases, cerca de 1.000 bases, cerca de 2.000 bases, 2,500 bases, cerca de 3.000 bases, cerca de 3.000 bases, cerca de 4.000 bases, cerca de 5.000 bases, cerca de 7.500 bases, cerca de 10.000 bases, cerca de 20.000 bases, cerca de 30.000 bases, cerca de 40.000 bases, cerca de 50.000 bases, cerca de 75.000 bases, cerca de 100.000 bases, cerca de 1.000.000 bases ou mais.

[0046] O termo "transcrito", quando se refere a um ácido nucleico alvo, refere-se a qualquer ácido nucleico que é representativo do ácido nucleico genômico de uma célula incluindo, por exemplo, RNA em qualquer forma (por exemplo, mRNA, pré-mRNA, e snRNA) e representações sintéticas, como cDNA.

[0047] O termo "amostra de teste", como aqui usado refere-se a uma amostra, que contém o ácido nucleico ou é suspeita de conter o ácido nucleico. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos na amostra de teste são para uso de acordo com os métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, uma amostra de teste é uma amostra biológica obtida de um indivíduo. Em algumas modalidades, uma amostra de teste é extraída de ácidos nucleicos de uma amostra biológica. Em algumas modalidades, uma amostra de teste é cDNA que foi transcrito de modo reverso a partir de mRNA de uma amostra biológica.

[0048] O termo "amostra biológica", como aqui usado refere-se a uma amostra obtida de um indivíduo, que contém ácidos nucleicos alvo ou é usado como uma fonte de ácidos nucleicos alvo para os métodos da invenção. Uma amostra biológica pode incluir amostras clínicas (isto é, obtidas diretamente a partir de um paciente), ou ácidos nucleicos isolados e podem ser amostras de fluidos e/ou tecidos celulares e acelulares (por exemplo, biópsia). Em algumas modalidades, uma amostra é obtida a partir de um tecido ou fluido corporal coletado de um indivíduo. Fontes de amostras incluem, mas não estão limitados a, esputo (processados ou não processado), lavagem alveolar dos brônquios (BAL), lavagem brônquica (BW), células de sangue total ou de sangue isoladas de qualquer tipo (por exemplo, linfócitos), fluidos corporais, fluido cerebrospinal (CSF), urina, plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia). O termo "amostra do paciente", como aqui usado refere- se a uma amostra obtida a partir de um humano procurando diagnóstico e/ou tratamento de uma doença. No caso em que o indivíduo é um feto, a amostra do paciente pode ser do indivíduo (isto é, feto), fluido amniótico, ou maternal (por exemplo, sangue da mãe).

[0049] Como aqui usado, o termo "indivíduo" refere-se a um mamífero, como um humano, mas também pode ser outro animal como um animal doméstico (por exemplo, um cão, gato ou similares), um animal de criação de fazenda, como uma vaca, uma ovelha, um suíno, um cavalo, ou similares) ou animais de laboratório (por exemplo, um macaco, um rato, um camundongo, um coelho, um porquinho-da-índia, ou similar). O termo "paciente" refere-se a um "indivíduo" que está, ou se suspeita estar afligido por uma doença relacionada com uma anomalia cromossômica.

[0050] Uma "translocação" cromossômica é o intercâmbio de partes entre cromossomos não homólogos. Ela é geralmente detectada através de citogenética ou cariotipagem das células afetadas. Existem dois tipos principais, recíproca, em que todo o material cromossómico é retida e robertsoniana, em que alguma parte do material cromossômico é perdida. Além disso, translocações podem ser balanceadas (em uma troca regular de material sem informação genética extra ou ausente) ou desbalanceadas (onde a troca de material cromossômico é desigual resultando em genes extras ou faltando).

[0051] Uma translocação recíproca entre cromossomos 9 e 22 resulta em um cromossomo acrocêntrico citogeneticamente distinto, denominado o cromossomo Filadélfia. Esta translocação funde o locus do gene BCR de cromossomo 22 e o locus do proto-oncogene ABL de cromossomo 9 para formar uma proteína oncogênica bcr/abl (Tefferi et al, Mayo Clin Proc, 80(3):. 390-402, 2005). Embora o cromossomo Filadélfia seja associado primeiro com CML, ele é agora conhecido como sendo um indicador de prognóstico em outros distúrbios do sangue, como leucemia linfoblástica aguda (LLA).

[0052] Um "ponto de interrupção de translocação de gene", como aqui usado, refere-se a uma posição em uma sequência de gene, em que a sequência de tipo selvagem é rompida e a porção do gene ou a montante ou a jusante da posição (ponto de interrupção é deletado ou translocado para um local diferente no genoma (isto é, se rompe do restante do gene e se incorpora no genoma em uma posição diferente).

Visão Geral da Tecnologia

[0053] Descreve-se aqui um método de detecção da presença ou ausência de uma desregulação do gene alvo em uma amostra. Também é descrito um método de diagnóstico ou monitoramento de câncer, como, por exemplo, o câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Os canceres exemplares adicionais incluem câncer de tiroide (incluindo, mas não se limitando a câncer de tiroide papilar), sarcomas de osso e tecidos moles, e qualquer uma de vários leucemias e linfomas (como, por exemplo, leucemia mieloide aguda (AML)). Em algumas modalidades, os métodos descritos da invenção são realizados sobre uma amostra obtida de um indivíduo em necessidade de uma determinação da presença ou ausência de translocação de gene.

[0054] O método aqui descrito proporciona, geralmente, a detecção, medição e comparação de níveis de expressão de genes de diferentes regiões de um gene alvo dentro de uma amostra de teste. Assim, a tecnologia refere- se a detecção e/ou monitoramento de uma amostra contendo um RNA mensageiro de um gene alvo para determinar o nível de expressão de uma região 5’ do gene alvo e uma região 3’ do gene alvo. Como aqui usado, as frases "detectar a quantidade" ou "detectar o nível de" referem-se à observação de um sinal de um marcador detectável que indica a quantidade de transcrito a partir de qualquer gene ou porção de um gene, como região 5’ de um gene, uma região 3’ do gene alvo, ou um gene de referência. A quantidade pode ser expressada como uma concentração, como um número de cópias, ou como um valor de limite de ciclo (Ct), por exemplo. Como aqui usado, um "limite de ciclo" para um análito é o ciclo de PCR em que o sinal de detecção (por exemplo, um sinal de fluorescência) cruza um limite de detecção especificado (como, por exemplo, um limite de fluorescência) quando realizando amplificação do ácido nucleico em tempo real. O Ct depende da eficiência da reação de amplificação que inclui o número de cópias do gabarito de início, lise do organismo, amplificação por PCR, hibridização ou clivagem de sonda fluorogênica e a sensibilidade de detecção.

[0055] Detecção do nível ou quantidade de expressão de gene não requer que o método forneça 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade. Como é bem conhecido, "sensibilidade" é a probabilidade de que um teste seja positivo, dado que o indivíduo tem uma sequência de ácido nucleico alvo, enquanto "especificidade" é a probabilidade de que um teste seja negativo, dado que o indivíduo não tem a sequência de ácido nucleico alvo. Uma sensibilidade de pelo menos 50% é preferida, embora sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 99% sejam claramente mais preferidas. Uma especificidade de pelo menos 50% é preferida, embora sensibilidades de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e pelo menos 99% sejam claramente mais preferidas. A detecção também engloba ensaios com falsos positivos e falsos negativos. As taxas de falsos negativos podem ser de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou mesmo maiores. As taxas de falsos positivos podem ser de 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou mesmo maiores.

[0056] O método descrito explora expressão diferencial intragênica (IDE) exibida quando ou a porção 5’ de um gene a porção 3’ de um gene é deletada ou se transloca para outro local dentro do genoma. Um gene que sofre tal rearranjo irá exibir expressão diferencial da região do gene 5’ em relação à região 3' do gene. A região 5’ de um gene alvo é a porção do gene alvo que está a montante do ponto de interrupção de translocação do gene e a região 3' de um gene alvo é a porção do gene alvo que está a jusante do ponto de interrupção de translocação do gene. Em algumas modalidades, o termo "região 5’" refere-se à porção de um polinucleotídeo localizado em direção à extremidade 5' do polinucleotídeo em relação à região 3’, e pode ou não incluir o(s) nucleotídeo(s) mais a 5' do mesmo polinucleotídeo. No contexto das translocações, a região 5' refere-se a uma região que está na direção 5’, ou a montante de um ponto de interrupção de translocação. No contexto dos presentes métodos, a região 5’ pode estar localizado perto da extremidade 5' da porção transcrita do gene alvo. Em algumas modalidades, a região 5’ engloba a totalidade ou uma porção da região não traduzida 5’ (UTR) do gene alvo. Em outras modalidades, a região 5’ está localizado a jusante do códon de partida (se o gene alvo é um gene codificando proteína); por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, ou pelo menos 500 nucleotídeos a jusante do códon de parada. O tamanho da região 5’ a ser amplificada pode variar, dependendo do método de detecção escolhido. Em algumas modalidades, os iniciadores podem ser selecionados para amplificar pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, ou pelo menos 500 nucleotídeos na região 5’.

[0057] Em algumas modalidades, o termo "região 3’" refere-se à porção de um polinucleotídeo localizado em direção à extremidade 3' do polinucleotídeo em relação à região 5’, e pode ou não incluir os nucleotídeo(s) mais 3' do mesmo polinucleotídeo. No contexto das translocações, a região 3’ refere-se a uma região que se encontra na direção 3' ou a jusante de um ponto de interrupção de translocação. No contexto dos métodos da presente invenção, a região 3’ pode estar localizada perto da extremidade 3' da porção transcrita do gene alvo. Em algumas modalidades, a região 3’ engloba a totalidade ou uma parte 3' UTR do gene alvo. Em outras modalidades, a região 3’ está localizada a montante do códon de parada (se o gene alvo é um gene codificando proteína); por exemplo, pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, ou pelo menos 500 nucleotídeos a montante do códon de parada. O tamanho da região 3’ a ser amplificada pode variar, dependendo do método de detecção escolhido. Em algumas modalidades, os iniciadores podem ser selecionados para amplificar pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, ou pelo menos 500 nucleotídeos na região 3’.

[0058] Quando avaliando anomalias genéticas conhecidas, os termos "5'-região 5’" e "região 3’" são um tanto relativas em que cada região é selecionada para estar em um lado diferente do defeito (por exemplo, ponto de interrupção) que resulta na anomalia genética. Estas regiões podem ser selecionadas por conveniência ou por outras razões substanciais (isto é, a avaliação simultânea de outras anomalias como mutações (SNPs), deleções, inserções e similares) e não precisam de estar nos 5'- e 3'-terminais, respectivamente, do transcrito. É preferível que, quando se avalia ácidos nucleicos alvo para transcritos desconhecidos (ou seja, um ponto de interrupção específico não tinha sido previamente identificado), a distância entre a região 5’ e a região 3’ para um gene alvo particular, devem ser maximizados na maior extensão possível para permitir a detecção de uma variedade de anomalias cromossômicas que podem ocorrer entre as duas regiões. Esta estratégia maximiza a possibilidade de que qualquer ponto de interrupção está associado com uma anomalia genética ocorrendo entre as duas regiões. Em uma modalidade, uma ou ambas das regiões 5' e 3' avaliadas pelos métodos da presente invenção estão localizadas nas regiões não traduzidas (UTRs) dos transcritos. Diretrizes para selecionar os iniciadores para amplificação por PCR são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, McPherson et al, Basics PCR:. From Background to Bench, Springer-Verlag, 2000. Uma variedade de programas de computador para projetar iniciadores estão disponíveis, por exemplo, Oligo (National Biosciences, Inc, Plymouth Minnesota), MacVector (Kodak/IBI), e a GCG suíte de programas de análise de sequência (Genetics Computer Group, Madison, Wis. 53711).

[0059] Um IDE exemplar é o que ocorre em situações em que a região 5’ de um gene permanece sob o controle de elementos reguladores normais do gene, por exemplo, os elementos contidos na região 5' não traduzida (UTR), enquanto a região 3’ do gene transloca-se e torna-se justaposta, de modo a estar sob o controle de elementos regulatórios diferentes ou mesmo nenhum. Para estes tipos de mutações, a região 5’ do gene é expressada de acordo com elementos reguladores próprios do gene alvo, enquanto que a região 3' do gene não será expressada (no caso em que a região 3’ é deletada ou translocada para uma posição que não é expressada de forma ativa) ou vai ser expressada a um nível compatível com os elementos de regulação de um gene diferente.

[0060] O método IDE aqui descrito emprega dois ou mais iniciadores, os pares de iniciadores e/ou sondas que se estendem por várias porções de uma região 5’ do gene alvo 5’ e dois ou mais iniciadores adicionais, pares de iniciadores e/ou sondas que se estendem por várias porções das regiões 3’ do gene alvo. Uma combinação de vários iniciadores, pares de iniciadores e/ou sondas é identificada para amplificar porções de cada uma região 5’ do gene e a região 3' do gene e a IDE podem ser expressadas como ΔCt, que é calculado com base nos valores médios de Ct entre os múltiplos iniciadores nas regiões 5’ e 3'. Em algumas modalidades, três, quatro, cinco, seis, ou mais iniciadores, pares de iniciadores e/ou sondas são empregados para cada uma das regiões 3' e 5' do gene.

[0061] Em uma modalidade, uma pontuação de IDE pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula: IDE = ΔCt = (médCt5‘ - médCt3’) em que ΔCt é a diferença entre os valores médios de Ct para os iniciadores direcionados à região do gene 5’ (médCt5’) e os valores de Ct médios para os iniciadores direcionados à região do gene 3’ (médCt3'). Ver Figura 1. Nesta modalidade, o médCt5’ é maior (o que reflete um número de cópia menor) do que médCt3’ quando um espécime é positivo para translocação. Os valores de Ct são inversamente proporcionais aos níveis de expressão de modo que quando os níveis de expressão de 3’ são maiores que os níveis de expressão de 5’, o nível de médCt3’ será menor do que o médCt5’. Os valores de Ct podem ser obtidos por PCR em tempo real e determinados como o ciclo de PCR no qual o sinal de fluorescência para cada iniciador cruza um limite de fluorescência especificado.

[0062] Os inventores da presente invenção descobriram, surpreendentemente, que o cálculo de um ΔCt a partir do Ct médio de múltiplos iniciadores ou pares de iniciadores para a região de gene alvo 3’ e o Ct médio de múltiplos iniciadores ou pares de iniciadores para a região do gene alvo 5' resultou em desempenho do ensaio superior. De fato, quando dois ou mais iniciadores ou pares de iniciadores são usados para amplificar porções múltiplas de cada região do gene alvo 3’ e a região do gene alvo 5' e o ΔCt é calculado a partir do Ct médio dos múltiplos iniciadores ou pares de iniciadores para cada região, observando-se que a sensibilidade do ensaio, especificidade, valor preditivo negativo (NPV) e valor preditivo positivo (PPV) foram tais que o ensaio de IDE poderia ser usado eficazmente como uma ferramenta de triagem para translocação, de tal modo que as amostras IDE-negativas fossem verdadeiramente negativas para a translocação de genes e as amostras IDE-positivas fossem positivas putativas para a translocação do gene. Se desejado, a designação de amostras como IDE- positivas usando o método aqui descrito pode ser ainda confirmada por FISH subsequente ou outros ensaios moleculares.

[0063] Além disso, também foi descoberto, surpreendentemente, que o uso de vários iniciadores e/ou sondas superou um problema associado com outros métodos, em que algumas amostras não amplificaram bem, resultando em elevadas taxas de falsos positivos e falsos negativos. Ao empregar vários iniciadores e/ou sondas direcionadas a cada uma das região 5’ e região 3’ de um gene alvo, o projeto de IDE aqui descrito exibe taxas muito reduzidas de falsos positivos e falsos negativos e a sensibilidade de ensaio e especificidade superiores em comparação com métodos em que apenas um único par de iniciadores é empregado para cada região (isto é, a região 3’ e a região 5’).

[0064] Em algumas modalidades, os melhores iniciadores, par(es) de iniciador e/ou sonda(s) são identificados para cada uma região 5’ e a região 3' e a pontuação de IDE é calculada com base no nível de expressão do gene 3’ e a expressão do gene 5’, como determinado usando esses iniciadores e/ou sondas. Em algumas modalidades, vários iniciadores ou pares de iniciadores são empregados para cada região (isto é, a região 3’ e a região 5’) e a pontuação de IDE é calculada a partir do nível médio de expressão para cada região, como determinado a partir dos sinais detectados com os múltiplos iniciadores ou pares de iniciadores para cada região.

[0065] Em algumas modalidades, uma pontuação de IDE (ΔCt) é calculado como a diferença entre o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvo 5’ e o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvo 3’, e a amostra de teste é identificada como tendo uma desregulação do gene alvo, se a pontuação de IDE for significativamente diferente de um valor de corte pré-determinado e a diferença indica a severidade de uma desregulação do gene alvo. Um "valor de corte" significa o valor de IDE (ou ΔCt) em ou acima do qual uma amostra é identificada como positiva para fusão. O valor de "corte" é determinado a partir das faixas de pontuações de IDE de amostras conhecidas positivas para fusão e negativas para fusão. Em algumas modalidades, o ponto de corte para a positividade é calculado como ΔCt> 2,> 4,> 5,> 8, ou> 10 entre 5’ e 3'.

[0066] Assim, o método descrito prevê a detecção de mutações que resultam na expressão diferencial de região 5’ de um gene em relação à região 3’ do gene. Um exemplo desta situação ocorre em alguns pacientes com NSCLC que têm uma translocação de um gene ALK, ROS1 ou RET de modo que a região 5’ do gene permanece sob o controle do promotor normalmente associado com o gene alvo, mas a região do gene 3' é translocada de tal modo que é expressada por um promotor muito mais robusto que está associado com um gene diferente.

[0067] Os espécimes que não contêm uma anomalia cromossômica dentro de um gene alvo irão demonstrar o mesmo padrão de expressão entre a região 5’ e a região 3' porque eles estão ligados de uma forma unimolecular. No entanto, quando o gene alvo é afetado por alguma anomalia genética ou cromossômica, as regiões 5’ e 3' podem mostrar padrões de expressão independentes para as regiões 5’ e 3'. No caso de uma translocação, as regiões 5’ e 3' irão exibir diferentes padrões de expressão, porque estas duas regiões estão agora desassociadas no cromossomo.

[0068] Como aqui usado, as frases "diferença de nível”, "diferença em quantidades" e "diferença nos padrões de expressão" referem-se a diferenças na quantidade de transcrição a partir da região a 5’ de um gene em comparação com a quantidade de transcrição da região 3’ do gene alvo. Em uma modalidade, a transcrição da região 5’ de um gene está presente em uma quantidade elevada ou em uma quantidade diminuída em uma amostra em comparação com a quantidade de transcrição da região 3' do gene alvo. Em células de tipo selvagem ou normais, a quantidade de transcrito de região 5’ do gene alvo e a quantidade de transcrição da região 3’ do gene-alvo é esperada como sendo quantidades iguais ou quase iguais. Por quantidade igual, entende-se que as quantidades medidas de transcrito ou sinal detectável (que se correlaciona com a quantidade de transcrição) para a região 5’ e a região 3’ não apresentam uma diferença estatisticamente significativa a partir da mesma comparação, em amostras de controle. Métodos para comparar esses valores são conhecidos dos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados ao teste t de Student e análise ANOVA. O versado reconhece que, devido às diferenças técnicas inerentes nas metodologias de detecção aqui usadas, a quantidade de sinal detectável da região 5’ pode não ser necessariamente igual à quantidade de sinal detectável da região 3’ mesmo que nenhuma anomalia cromossômica esteja presente (isto é, ambas as regiões permanecem ligadas de modo unimolecular e sob o controle dos mesmos elementos regulatórios).

[0069] Os níveis de expressão do gene alvo 3' distintos que se espera sejam encontrados em amostras contendo translocações de gene alvo e aqueles sem translocações podem ser estabelecidos através da normalização dos níveis de expressão do gene alvo 3’ para o gene alvo 5'.

[0070] Em algumas modalidades, cada medição do nível de expressão alvo 3'- e 5'- pode ser normalizada para um gene de controle endógeno (Ctcontrole), e a média das medições normalizadas usadas no cálculo de uma pontuação de IDE. Algumas fórmulas úteis incluem, por exemplo: IDE = ΔCt = [méd(Ct5’/Ctcontrole)] — [méd(Ct3’/Ctcontrole)], e IDE = ΔCt = Ln[méd(Ct5’/Ctcontrole)] - Ln[méd(Ct3’/Ctcontrole)]

[0071] Em algumas modalidades uma ΔCt > 4 indica a presença de produtos de fusão de genes alvo. Em algumas modalidades, um ΔCt > 2, 4,5, 5, ou 8, indica a presença de produtos de fusão de gene alvo.

[0072] Em outras modalidades, a quantidade medida dos transcritos 3'- e 5'- na amostra de teste pode ser normalizada para o nível dos mesmos transcritos a partir de amostra de controle, em vez de um gene endógeno.

[0073] A pontuação de IDE pode ser expressada como uma "quantidade relativa" ou "razão" da expressão da região 5’ do gene alvo em relação à região 3’ do gene alvo. As quantidades relativas podem ser um valor único ou uma faixa de valores. A expressão de cada região (ou a região 5’ ou a região 3’) é determinada como Ct médio dos transcritos a partir dos iniciadores múltiplos, pares de iniciadores e/ou sondas direcionadas a essa região do gene alvo. Se a razão entre a média de expressão da região 5’ do gene alvo em relação à expressão média da região 3’ do gene alvo é estatisticamente inferior ou superior a 1, então uma anomalia cromossômica é detectada. Quando a razão é inferior a 1, a região 3’ do gene alvo foi translocada para uma região genômica que é mais ativa transcripcionalmente do que gene alvo nativo. Quando a razão é maior que 1, a região 3’ ou foi deletada ou translocada para uma região genômica que é menos ativa transcripcionalmente do gene alvo nativo. Em ambos os casos, uma razão que é significativamente diferente de 1 indicará expressão diferencial e pode-se concluir que as regiões 5’ e 3' do gene alvo estão sendo expressadas sob o controle de diferentes promotores (ou uma região pode não ser expressada de todo), de tal modo que se nota uma anomalia cromossômica no gene alvo.

[0074] Em algumas modalidades, se a quantidade média de sinal transcrito ou detectável para a região 5' e a região 3' estão dentro de cerca de 1 desvio padrão, dentro de cerca de 0,5 desvios padrões, dentro de cerca de 0,2 desvios padrões, dentro de cerca de 0,1 desvios padrões, ou dentro de cerca de 0,01 desvios padrões, então pode não existir nenhuma diferença significante entre as duas quantidades. Neste exemplo, é possível concluir que as regiões 5' e 3' são expressadas de um modo uni-molecular e não existe nenhuma anomalia cromossômica no gene alvo.

[0075] Alternativamente, se a quantidade média de sinal transcrito ou detectável para a região 5' e a região 3' exceder cerca de 1 desvio padrão, cerca de 1,5 desvios padrões, cerca de 2,0 desvios padrões, ou cerca de 2,5 desvios padrões, então pode existir uma diferença significante entre as duas quantidades. Em tal caso, a pessoa pode concluir que as regiões 5’ e 3’ são expressadas sob o controle de promotores diferentes (ou uma região pode não ser expressada de modo algum), de modo que existe uma anomalia cromossômica no gene alvo.

[0076] Uma vantagem adicional do método IDE descrito como em comparação com outros métodos é que uma curva padrão não precisa ser gerada para praticar o método descrito. Deste modo, o processo de concepção do ensaio é simplificado eliminando as necessidades de padrões de concepção para cada gene alvo que amplifica igualmente em ambas das 5’ e 3’.

[0077] Iniciadores e/ou pares de iniciadores múltiplos direcionados a cada da região 5’ e da região 3’ de múltiplos genes podem ser empregados para a triagem de um painel de translocação de genes para uma doença ou distúrbio particular.

[0078] Uma amostra obtida de uma pessoa pode ser testada usando reação em cadeia de polimerase-transcrição reversa (RT-PCR) e/ou reação em cadeia de polimerase em tempo real (PCR em tempo real) para determinar os níveis de expressão relativa das regiões 5’ e 3’ de um gene particular ou sequência de ácido nucleico de interesse. RT-PCR é uma técnica sensível para detecção e quantificação de mRNA. Comparada com as duas outras técnicas comumente usadas para quantificação dos níveis de mRNA, análise de Northern blot e ensaios de proteção de RNase, RT-PCR podem ser usados para quantificar os níveis de mRNA a partir de amostras muito menores. De fato, esta técnica é sensível o suficiente para permitir a quantificação de RNA a partir de uma única célula.

[0079] Os versados na técnica saberão como projetar iniciadores e sondas de oligonucleotídeo para uso para detectar expressão diferencial na 5' e 3' a partir de qualquer gene de interesse, desde que a sequência do gene de interesse seja conhecida. O tamanho do iniciador dependerá de muitos fatores, incluindo a função final ou uso do oligonucleotídeo. Um oligonucleotídeo que funciona como um iniciador de extensão ou sonda, por exemplo, será suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença de um catalisador, por exemplo, DNA polimerase, e deoxinucleotídeo trifosfatos.

[0080] Alternativamente, um evento de inserção ou transposição pode levar à expressão diferencial da região 5' e da região 3' de um gene alvo. A inserção de, por exemplo, um promotor ou outro elemento regulatório, ou a transposição de um elemento transposicionável no meio da sequência de codificação de um gene de interesse pode criar uma situação onde a região 5' do gene alvo é expressada em um nível diferente da região 3' do gene alvo.

[0081] Qualquer tal mutação que resulte na expressão diferencial de uma região 5' de um gene alvo e da região 3' do gene alvo é detectável de acordo com os métodos, composições e kits descritos aqui. Os versados na técnica saberão como direcionar, por exemplo, iniciadores de PCR na região 5' de um gene de interesse que ocorre na ou perto do início da transcrição, assegurando assim um produto correspondendo a uma região que é 5’ (a montante) de uma anomalia cromossômica potencial. Os versados na técnica precisam se referir apenas à sequência conhecida do gene alvo e regras de pareamento de base conhecidas para determinar um iniciador de PCR ou par de iniciador efetivos.

[0082] Igualmente, os versados na técnica podem projetar um iniciador ou par de iniciador direcionado a uma região 3' do gene de interesse. Em exemplos particulares, onde uma anomalia cromossômica conhecida ocorre os versados na técnica são auxiliados adicionalmente pelo conhecimento de um sítio de mutação conhecido, permitindo assim o projeto de iniciadores que estão no ou perto do sítio de mutação, por exemplo, um iniciador ou pares de iniciador podem ser projetados imediatamente 5' (a montante) do sítio de mutação e imediatamente 3' (a jusante) do sítio de mutação; ou o iniciador ou pares de iniciador podem ser projetados, por exemplo, dentro de cerca de 5 nucleotídeos (nt) do sítio de mutação em ambos os lados, dentro de cerca de 10 nt do sítio de mutação em ambos os lados, dentro de cerca de 20 nt do sítio de mutação em ambos os lados, dentro de cerca de 50 nt do sítio de mutação em ambos os lados, dentro de cerca de 100 nt do sítio de mutação em ambos os lados, dentro de cerca de 250 nt do sítio de mutação em ambos os lados ou dentro de cerca de 500 nt do sítio de mutação em ambos os lados.

[0083] Em certas modalidades, os métodos de IDE descritos aqui permitem a detecção de translocações independente do ponto de interrupção cromossômico.

Anomalias cromossômicas:

[0084] Uma anomalia cromossômica pode refletir uma diferença entre o complemento genético completo ou qualquer porção do mesmo, de um organismo, em comparação com um complemento genético completo normal de todos os cromossomos naquele organismo. Por exemplo, uma anomalia genética pode incluir uma mudança no número da cópia cromossômica (por exemplo, aneuploidia), ou uma porção do mesmo (por exemplo, deleções, duplicações, amplificações); ou uma mudança na estrutura cromossômica (por exemplo, translocações, ponto de mutações). Uma anomalia genética pode levar a condições patológicas. Embora algumas doenças, tal como câncer, sejam indícios de anomalias cromossômicas adquiridas em umas poucas células durante a vida, o termo "doença genética" se refere mais comumente a doenças presentes em todas as células do corpo e presentes desde a concepção. Anomalias genéticas podem ser hereditárias ou não hereditárias.

[0085] Duplicação genética é qualquer duplicação de uma região da sequência genômica. Ela pode ocorrer como um erro na recombinação homóloga, um evento de retrotransposição, ou duplicação de todo o cromossomo. A duplicação de um gene tem sido associada com várias doenças tal como alguns casos de osteossarcoma pagético que está associado com a duplicação do gene MYC (Sarcoma, 1(3-4):131-134, 1997), alguns casos de câncer de mama estão associados com a duplicação do gene HER- 2/neu (Ann Oncol., 12(suppl 1):S3-S8, 2001), alguns casos de tumor na bexiga estão associados com a duplicação do gene c-erb-2 (Cancer Res., 55:2422-2430, 1995).

[0086] Uma deleção (também chamada deleção de gene, deficiência, ou mutação de deleção) é uma aberração genética em que uma parte de um cromossomo ou uma sequência de DNA está faltando. Deleção é a perda de material genético. Qualquer número de nucleotídeos pode ser deletado, de uma base única para um pedaço total do cromossomo. Deleções podem ser causadas por erros no cruzamento cromossômico durante meiose. As deleções estão associadas com um arranjo de distúrbios genéticos, incluindo alguns casos de infertilidade masculina e dois terços de casos de distrofia muscular de Duchenne, uma deleção de parte do alvo curto do cromossomo 5 resulta em uma síndrome chamada Cri du chat, também conhecida como síndrome do "miado de gato".

[0087] Anomalias genéticas podem ser também mutações, inserções ou deleções de pontos. Uma mutação, ou substituição de pontos, é um tipo de mutação que causa a substituição de um único nucleotídeo de base com outro nucleotídeo. Inserção e deleção incluem inserções ou deleções de um único par de base. Mutações no gene ou cromossomo estão frequentemente associadas com doenças, como anemia da célula falciforme, fibrose cística, hemofilia, fenilcetonúria, espinha bífida, etc.

Preparação da amostra

[0088] As amostras descritas aqui que podem ser analisadas de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas de modo algum a, sangue (todo o sangue ou uma fração do sangue tal como plasma, soro, ou frações de células particulares), linfa, muco, lágrimas, saliva, fluido cístico, urina, sêmen, fezes, fluido cerebrospinal (CSF), fluido de ascite, e amostras de biópsia de tecido do corpo, aspirado com agulha fina (FNA), lavagem broncoalveolar (BAL). Espécimes adicionais a partir dos quais ácidos nucleicos alvo podem ser detectados e quantificados com os métodos da presente invenção podem ser obtidos de pessoas de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica de coleta de fluido sinovial, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido intraocular, biópsias de tecido ou aspirados endotraqueais, esputos, esfregaços, por exemplo, da pele, inguinal, nasal e/ou garganta. Métodos de obter amostras de teste e amostras de referência são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a aspirações, seção de tecido, extração de sangue ou outros fluidos, biópsias cirúrgicas ou com agulha, coleta de tecido embebido em parafina, coleta de fluidos corporais, coleta de fezes, e similares. Em uma modalidade, a amostra de teste pode ser obtida a partir de um indivíduo que é suspeito de ter uma doença (tal como, por exemplo, câncer) ou uma anomalia genética. Em algumas modalidades, espécimes são amostras de tecido (amostras de biópsia) de uma pessoa tendo ou suspeita de ter uma doença ou uma anomalia genética.

[0089] O ácido nucleico (DNA e/ou RNA) pode ser isolado da amostra de acordo com quaisquer métodos bem conhecidos pelos versados na técnica. Se necessário, a amostra pode ser coletada ou concentrada por centrifugação e similares. As células da amostra podem ser submetidas à lise, como por tratamentos com enzimas, tensoativos aquecidos, ultrassonicação ou combinações dos mesmos. O tratamento de lise é realizado a fim de obter uma quantidade suficiente de RNA derivado das células de interesse, se presentes na amostra, para detecção usando RT-PCR e/ou PCR em tempo real. Ácido nucleico não precisa ser extraído, mas pode ser tornado disponível pelo tratamento apropriado de células ou como descrito na Publicação de Patente US No. 2008/131876.

[0090] Em uma modalidade, mRNA ou cDNA gerados a partir de mRNA ou RNA total podem ser usados. Vários métodos de extração de RNA são apropriados para isolar o RNA. Métodos apropriados incluem extração com fenol e clorofórmio. Ver Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 16.54 (1989). Além disso, kits para isolar mRNA e sintetizar cDNA estão disponíveis comercialmente, por exemplo, RNeasy Protect Mini kit, RNeasy Protect Cell Mini kit da Qiagen.

[0091] Em uma modalidade, um método de isolamento duplo RNA/DNA é usado empregando um reagente à base de trizol para o isolamento inicial de RNA e DNA a partir de amostras do paciente. Quando do contato com as amostras do paciente, o fenol e altos reagentes de sal no trizol inativam efetivamente qualquer agente de doença ou agente de doença secundária que pode estar presente na amostra do paciente. Após o RNA e DNA serem isolados das amostras do paciente, uma coluna à base de sílica pode ser usada para isolar adicionalmente o RNA e DNA. O uso de colunas à base de sílica permite que as etapas de lavagem sejam realizadas rapidamente e eficientemente enquanto minimizando a possibilidade de contaminação. As etapas de lavagem podem ser usadas para remover inibidores de PCR e RT- PCR. O método da coluna para purificações de ácido nucleico é vantajoso à medida que ele pode ser usado com diferentes tipos de amostras do paciente e as etapas de centrifugação e lavagem removem efetivamente inibidores de PCR ou RT-PCR.

Amplificação de ácidos nucleicos

[0092] Amostras de ácido nucleico ou ácidos nucleicos alvo podem ser amplificadas por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica. Em modalidades apropriadas, PCR é usado para amplificar ácidos nucleicos de interesse. Resumidamente, no PCR, duas sequências de iniciador são preparadas que são complementares a regiões nos filamentos complementares opostos da sequência do marcador. Um excesso de deoxinucleotídeo trifosfatos é adicionado em uma mistura de reação junto com DNA polimerase, por exemplo, Taq polimerase. Nos presentes métodos, pelo menos dois pares de iniciadores são usados para amplificar duas porções diferentes da região 5’ de um transcrito. Pelo menos dois pares de iniciadores também são usados para amplificar porções diferentes da região 3’ de um transcrito. Em algumas modalidades, três, quatro, cinco ou seis pares de iniciadores diferentes são usados para amplificar porções diferentes da região 5’ e/ou região 3’. “Porções diferentes” ou “partes diferentes” de uma região 5’ ou de uma região 3’ se referem a regiões do gene transcrito tendo sequências de nucleotídeo que não são idênticas uma com a outra. Regiões diferentes podem se sobrepor uma com a outra.

[0093] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos alvos são amplificados em uma reação de amplificação múltipla. Uma variedade de estratégias de amplificação múltipla é conhecida na técnica e podem ser usadas com os métodos da invenção. A estratégia de amplificação múltipla pode usar PCR, RT-PCR ou uma combinação dos mesmos dependendo do tipo de ácido nucleico contido no(s) agente(s) de doença. Por exemplo, se um genoma de RNA está presente, RT-PCR pode ser utilizado. A enzima do PCR pode ser uma enzima tanto com a função de transcrição reversa como polimerase. Além disso, a enzima do PCR pode ser capaz de reações "hot start", como é conhecido na técnica.

[0094] Se a sequência alvo está presente em uma amostra, os iniciadores se ligarão a sequência e a polimerase fará com que os iniciadores sejam estendidos ao longo da sequência alvo pela adição de nucleotídeos. Pela elevação e diminuição da temperatura da mistura de reação, os iniciadores estendidos irão se dissociar do ácido nucleico alvo para formar produtos da reação, iniciadores em excesso se ligarão ao ácido nucleico alvo e aos produtos da reação e o processo é repetido, gerando assim produtos da amplificação. Os parâmetros de ciclagem podem ser variados, dependendo do comprimento dos produtos da amplificação a serem estendidos. Um controle de amplificação positiva interno (IC) pode ser incluído na amostra, utilizando iniciadores e/ou sondas de oligonucleotídeo.

Detecção de ácidos nucleicos amplificados

[0095] A amplificação de ácidos nucleicos pode ser detectada por qualquer um dos diversos métodos bem conhecidos na técnica, como eletroforese em gel, cromatografia em coluna, hibridização com uma sonda, sequenciamento, análise da curva de fusão, ou detecção em "tempo real".

[0096] Em uma abordagem, sequências de dois ou mais fragmentos de interesse são amplificadas no mesmo vaso de reação (isto é, "PCR múltiplo"). A detecção pode acontecer pela medição do ponto final da reação ou em "tempo real." Para detecção em tempo real, iniciadores e/ou sondas podem ser marcados de modo detectável para permitir diferenças na fluorescência quando os iniciadores se tornam incorporados ou quando as sondas são hibridizadas, por exemplo, e amplificadas em um instrumento capaz de monitorar a mudança na fluorescência durante a reação. Métodos de detecção em tempo real para amplificação de ácido nucleico são bem conhecidos e incluem, por exemplo, o sistema TAQMANTM, a molécula bifuncional SCORPIONTM, e o uso de corantes intercalados para ácido nucleico de fita dupla.

[0097] Na detecção de ponto final, o(s) amplicon(s) pode(m) ser detectado(s) separando primeiro os amplicons por tamanho, detectando então os amplicons separados por tamanho. A separação de amplicons de diferentes tamanhos pode ser realizada, por exemplo, por eletroforese em gel, cromatografia em coluna, ou eletroforese capilar. Estes e outros métodos de separação são bem conhecidos na técnica. Em um exemplo, amplicons de cerca de 10 a cerca de 150 pares de base cujos tamanhos diferem em 10 ou mais pares de bases podem ser separados, por exemplo, em um gel de agarose a 4% a 5% (um gel de agarose a 2% a 3% para cerca de 150 a cerca de 300 amplicons do par de base), ou um gel de poliacrilamida a 6% a 10%. Os ácidos nucleicos separados podem ser então coloridos com um corante tal como brometo de etídio e o tamanho da banda ou bandas coloridas resultantes pode ser comparado a uma escada padrão de DNA.

[0098] Em outra modalidade, dois ou mais fragmentos de interesse são amplificados em vasos de reação separados. Se a amplificação é específica, isto é, um par de iniciador se amplifica para um fragmento de interesse, mas não para o outro, a detecção de amplificação é suficiente para distinguir entre os dois tipos e a separação por tamanho não será exigida.

[0099] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos amplificados são detectados por hibridização com uma sonda específica. Sonda de oligonucleotídeos, complementares a uma porção da sequência alvo amplificada pode ser usada para detectar fragmentos amplificados. A hibridização pode ser detectada em tempo real ou em tempo não real. Ácidos nucleicos amplificados para cada das sequências alvo podem ser detectados simultaneamente (isto é, no mesmo vaso de reação) ou individualmente (isto é, em vasos de reação separados). Em algumas modalidades, o DNA amplificado é detectado simultaneamente, usando duas ou mais sondas de oligonucleotídeo de um gene específico, marcado de modo distinguível, uma que hibridiza para a primeira sequência alvo e uma que hibridiza para a segunda sequência alvo.

[00100] A sonda pode ser marcada detectavelmente por métodos conhecidos na técnica. Marcadores utilizáveis incluem, por exemplo, corantes fluorescentes (por exemplo, CY5TM, CY3 TM, FITC, rodamina, lantamida fósforos, vermelho do Texas, FAM, JOE, Cal Fluor Red 610®, Quasar 670 TM 32 35 3 14 125 131 ), P, S, H, C, I, I, reagentes densos em elétrons (por exemplo, ouro), enzimas, por exemplo, como comumente usadas em ELISA (por exemplo, peroxidase de raiz forte, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores colorimétricos (por exemplo, ouro coloidal), marcadores magnéticos (por exemplo, DYNABEADSTM), biotina, dioxigenina, ou haptenos e proteínas para as quais anticorpos antissoros ou monoclonais estão disponíveis. Outros marcadores incluem ligantes ou oligonucleotídeos capazes de formar um complexo com o complemento do receptor ou oligonucleotídeo correspondente, respectivamente. O marcador pode ser incorporado diretamente dentro do ácido nucleico a ser detectado, ou ele pode ser fixado a uma sonda (por exemplo, um oligonucleotídeo) que se hibridiza ou se liga ao ácido nucleico a ser detectado.

[00101] Um método geral para PCR em tempo real usa sondas fluorescentes tais como as sondas TaqMan®, balizas moleculares, e Scorpions™. PCR em tempo real quantifica a quantidade inicial do gabarito com mais especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, do que outras formas de PCR quantitativo, que detectam a quantidade do produto final amplificado. PCR em tempo real não detecta o tamanho do amplicon. As sondas empregadas nas tecnologias SCORPIONTM e TAQMAN® são baseadas no princípio de extinção de fluorescência e envolvem um fluoróforo doador e uma porção de extinção.

[00102] Em uma modalidade, o marcador detectável é um fluoróforo. O termo "fluoróforo" como usado aqui se refere a uma molécula que absorve luz em um comprimento de onda particular (frequência de excitação) e subsequentemente emite luz de um comprimento de onda mais longo (frequência de emissão). O termo "fluoróforo doador", como usado aqui, significa um fluoróforo que, quando em proximidade íntima com uma porção do extintor, doa ou transfere energia de emissão para o extintor. Como um resultado da energia doada para a porção do extintor, o fluoróforo doador emitirá, ele mesmo, menos luz a uma frequência de emissão particular do que ele teria na ausência de uma porção do extintor posicionada proximamente.

[00103] O termo "porção de extintor", como usado aqui, significa uma molécula que, em proximidade íntima com um fluoróforo doador, absorve a energia de emissão gerada pelo doador e ou dissipa a energia como calor ou emite luz de um comprimento de onda mais longo do que o comprimento de onda de emissão do doador. No último caso, o extintor é considerado como sendo um fluoróforo aceitador. A porção do extintor pode atuar por extinção proximal (isto é, colisional) ou por transferência de energia por ressonância de Foster ou por fluorescência ("FRET"). Extinção por FRET é geralmente usada em sondas TAQMANTM enquanto extinção proximal é usada em sondas do tipo farol molecular e SCORPIONTM.

[00104] Na extinção proximal (também conhecido como extinção por "contato" ou "colisional"), o doador está em proximidade íntima com a porção do extintor de modo que a energia do doador é transferida para o extintor, que dissipa a energia como calor como oposto a emissão por fluorescência. Na extinção por FRET, o fluoróforo doador transfere sua energia para um extintor que libera a energia como fluorescência em um comprimento de onda superior. Extinção proximal exige o posicionamento muito próximo do doador e da porção do extintor, enquanto extinção por FRET, também a distância relacionada, ocorre ao longo de uma distância maior (geralmente 1-10 nm, a transferência de energia dependendo de R-6, onde R é a distância entre o doador e o aceitador). Deste modo, quando extinção por FRET está envolvida, a porção do extintor é um fluoróforo aceitador que tem um espectro de frequência de excitação que se sobrepõem com o espectro da frequência de emissão do doador. Quando extinção por FRET é empregada, o ensaio pode detectar um aumento na fluorescência do fluoróforo resultante da distância aumentada entre o doador e o extintor (fluoróforo aceitador) ou uma diminuição da emissão do fluoróforo aceitador resultante da distância diminuída entre o doador e o extintor (fluoróforo aceitador).

[00105] Porções fluorescentes apropriadas incluem os fluoróforos seguintes conhecidos na técnica: ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno- 2,2' dissulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina) Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas moleculares), ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS), 4- amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 dissulfonato (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, extintor Black Hole (BHQTM) corantes (Biosearch Technologies), BODIPY® R-6G, BODIPY® 530/550, BODEPY® FL, cumarina amarelo brilhante e derivados (cumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4- trifluorometilculuarina (Cumarina 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenylindol (DAPI), 5',5''- dibromopirogalol-sulfoneftaleina (Bromopirogalol vermelho), 7-dietilamino- 3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, dietilenotriamina penta-acetato, ácido 4,4'-di-isoti-iocianato-di-hidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico, ácido 4,4'-di- isotiocianatostilbeno-2,2'-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno- 1-sulfonila (DNS, cloreto de dansil), ácido 4-(4'- dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'- isotiocianato (DABITC), Eclipse (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isocianato de eritrosina), etídio, fluoresceína e derivados (5- carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6- carboxifluoresceína (HEX), QFITC (XRITC), tetraclorofluoresceína (TET)), fluorescamina, IR144, IR1446, isotiocianato de verde de malaquita, 4- metilumbeliferona, orto cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho de fenol, B-ficoeritrina, R- ficoeritrina, o-ftaldialdeído, Oregon Green®, iodeto de propídio, pireno e derivados (pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil 1-pireno), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (sondas moleculares), vermelho reativo 4 (vermelho brilhante Cibacron® 3B-A), rodamina e derivados (6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), cloreto de sulfonil lisamina rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina verde, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonil sulforodamina 101 (vermelho do Texas)), N,N,N',N'-tetrametil-6- carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), CAL Fluor Red 610, Quasar 670, riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio.

[00106] Outros análogos de nucleotídeo fluorescente podem ser usados, ver, por exemplo, Jameson, 278 Meth. Enzymol., 363-390 (1997); Zhu, 22 Nucl. Acids Res., 3418-3422 (1994). Pat. U.S. Nos. 5.652.099 e 6.268.132 que também descrevem análogos de nucleosídeo para incorporação em ácidos nucleicos, por exemplo, DNA e/ou RNA, ou oligonucleotídeos, ou por síntese enzimática ou química para produzir oligonucleotídeos fluorescentes. Pat. U.S. No. 5.135.717 descreve reagentes de ftalocianina e tetrabenztriazaporfirina para uso como marcadores fluorescentes.

[00107] O marcador detectável pode ser incorporado em, associado com ou conjugado com um ácido nucleico. O marcador pode ser fixado pelos braços do espaçador de vários comprimentos para reduzir o potencial de impedimento estereoquímico ou impacto nas outras propriedades utilizáveis ou desejadas. Ver, por exemplo, Mansfield, Mol. Cell Probes, 9:145-156 (1995). Marcadores detectáveis podem ser incorporados em ácidos nucleicos por meios covalentes ou não covalentes, por exemplo, por transcrição, tal como pela marcação do iniciador aleatório usando polimerase Klenow, ou tradução nick, ou amplificação, ou equivalentes como é conhecido na técnica. Por exemplo, uma base de nucleotídeo é conjugada em uma porção detectável, tal como um corante fluorescente, e então incorporada dentro de ácidos nucleicos durante a síntese ou amplificação do ácido nucleico.

[00108] Com sondas Scorpion™, a detecção do produto PCR e iniciador específico da sequência é alcançada usando uma única molécula. A sonda Scorpion™ mantém uma configuração de tronco-alça no estado não hibridizado. O fluoróforo é fixado na extremidade 5' e é extinto por uma porção acoplada na extremidade 3'. A porção 3' do tronco também contém a sequência que é complementar ao produto da extensão do iniciador. Esta sequência é ligada à extremidade 5' de um iniciador específico por um monômero não amplificável. Após a extensão do iniciador Scorpion™, a sequência da sonda específica é capaz de se ligar ao seu complemento dentro do amplicon estendido, desse modo abrindo o laço do grampo de cabelo. Isto evita que a fluorescência seja extinta e um sinal é observado. Um alvo específico é amplificado por um iniciador reverso e a porção do iniciador do Scorpion™, resultando em um produto da extensão. Um sinal fluorescente é gerado devido à separação do fluoróforo do extintor resultante da ligação do elemento da sonda do Scorpion™ com o produto da extensão.

[00109] Sondas TAQMAN® (Heid et al., Genome Res, 6:986-994, 1996) usam a atividade 5’ exonuclease fluorogênica da Taq polimerase para medir a quantidade de sequências alvo nas amostras de cDNA. Sondas TaqMan® são oligonucleotídeos que contêm um fluoróforo doador geralmente em ou perto da base 5', e uma porção extintora tipicamente na ou perto da base 3'. A porção do extintor pode ser um corante como TAMRA ou pode ser uma molécula não fluorescente, como ácido 4-(4- dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL). Ver Tyagi et al., Nature Biotechnology, 16:49-53 (1998). Quando irradiado, o doador fluorescente excitado transfere a energia para a porção de extinção mais próxima pelo FRET em vez de fluorescer. Deste modo, a proximidade íntima do doador e extintor evita a emissão de fluorescência do doador enquanto a sonda está intacta.

[00110] Sondas TAQMAN® são projetadas para anelar com uma região interna de um produto de PCR. Quando a polimerase (por exemplo, transcriptase reversa) replica um padrão ao qual uma sonda TAQMAN® está ligada, sua atividade exonuclease na 5' cliva a sonda. Isto acaba com a atividade do extintor (sem FRET) e o fluoróforo doador começa a emitir fluorescência que aumenta em cada ciclo proporcionalmente a taxa de clivagem da sonda. O acúmulo de produto de PCR é detectado pelo aumento na fluorescência do corante repórter (observe que os iniciadores não estão marcados). Se o extintor é um fluoróforo aceitador, então a acumulação de produto do PCR pode ser detectada pelo monitoramento da diminuição na fluorescência do fluoróforo aceitador.

[00111] Em uma modalidade apropriada, PCR em tempo real é realizado usando qualquer instrumento apropriado capaz de detectar fluorescência a partir de um ou mais marcadores fluorescentes. Por exemplo, detecção em tempo real no instrumento (por exemplo, um detector de sequência ABI Prism® 7900HT) monitora a fluorescência e calcula a medida do sinal repórter, ou valor Rn, durante cada ciclo do PCR. O ciclo limiar, ou valor Ct, é o ciclo em que a fluorescência cruza o valor limiar. O valor de limiar é determinado pelo software com sistema de detecção de sequência ou manualmente. O valor Ct pode estar relacionado com a quantidade ácido nucleico padrão inicial na reação.

[00112] Em algumas modalidades, a análise da curava de fusão pode ser usada para detectar um produto da amplificação. A análise da curva de fusão envolve determinar a temperatura de fusão do amplicon do ácido nucleico expondo o amplicon a um gradiente de temperatura e observando um sinal detectável de um fluoróforo. A análise da curva de fusão é com base no fato que uma sequência de ácido nucleico funde a uma temperatura característica chamada a temperatura de fusão (Tm), que é definida como a temperatura em que metade dos duplexes DNA se separou em um único filamento. A temperatura de fusão de um DNA depende primeiramente de sua composição de nucleotídeo. Deste modo, moléculas de DNA ricas em nucleotídeos G e C têm uma Tm maior do que os tendo uma abundância de nucleotídeos A e T.

[00113] Onde um corante fluorescente é usado para determinar a temperatura de fusão de um ácido nucleico no método, o corante fluorescente pode emitir um sinal que pode ser distinguido do sinal emitido por quaisquer um dos outros corantes fluorescentes diferentes que são usados para marcar os oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, o corante fluorescente para determinar a temperatura de fusão de um ácido nucleico pode ser excitado por energias de comprimento de onda diferentes do que qualquer outro dos corantes fluorescentes diferentes que são usados para marcar os oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, o segundo corante fluorescente para determinar a temperatura de fusão do ácido nucleico detectado é um agente de intercalação. Agentes e intercalação apropriados podem incluir, mas não estão limitados a corante SYBRT™ Green 1, corantes SYBR™, Pico Green, corantes SYTO, corantes SYTOX, brometo de etídio, homodímero-1 de etídio, homodímero-2 de etídio, derivados de etídio, acridina, acridina laranja, derivados de acridina, heterodímero de etídio-acridina, etídio monoazida, iodeto de propídeo, monômeros de cianina, 7-aminoactinomicina D, YOYO-1, TOTO-1 YOYO-3, TOTO-3, POPO-1, BOBO-1, POPO-3, BOBO-3, LOLO-1, JOJO-1, dímeros de cianina, YO-PRO-1, TO-PRO-1, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, PO-PRO-1, BO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-3, LO-PRO-1. JO-PRO-1, e misturas dos mesmos. Em modalidades apropriadas, o agente de intercalação selecionado é o corante SYBR™ Green 1.

[00114] Pela detecção da temperatura em que o sinal fluorescência é perdido, a temperatura de fusão pode ser determinada. Nos métodos descritos, cada dos ácidos nucleicos alvos amplificados podem ter temperaturas de fusão diferentes. Por exemplo, cada destes ácidos nucleicos alvos amplificados podem ter uma temperatura de fusão que difere em pelo menos cerca de 1° C, mais preferivelmente em pelo menos cerca de 2° C, ou ainda mais preferivelmente em pelo menos cerca de 4° C da temperatura de fusão de qualquer um dos outros ácidos nucleicos alvos amplificados.

Métodos de diagnose

[00115] Em um aspecto, os métodos descritos aqui proporcionam uma diagnose de câncer de próstata ou uma susceptibilidade ao câncer em uma pessoa. O termo "diagnose" ou "diagnóstico" como usados aqui se referem ao ato ou processo de identificar ou determinar uma doença ou condição em um organismo ou a causa da doença ou condição pela avaliação dos sinais e sintomas da doença ou distúrbio. Geralmente, uma diagnose de uma doença ou distúrbio é com base na avaliação de um ou mais fatores e/ou sintomas que são indicativos da doença. Isto é, uma diagnose pode ser feita com base na presença, ausência ou quantidade de um fator que é indicativo da presença ou ausência da doença ou condição. Cada fator ou sintoma que é considerado como sendo indicativo para a diagnose de uma doença particular não precisa ser relacionado exclusivamente à doença particular, isto é, podem ser diagnósticos diferencias que podem ser inferidos a partir de um fator da diagnose ou sintoma. Igualmente, podem existir casos onde um fator ou sintoma que é indicativo de uma doença particular está presente em um indivíduo que não tem a doença particular. Os métodos incluem, mas não estão limitados ao câncer de próstata e pulmão e translocações, inserções, inversões e deleções associadas com estes cânceres.

[00116] Em uma modalidade, o nível de expressão da região 5' do gene ROS1 é comparado ao nível de expressão da região 3' do gene ROS1 em uma amostra de uma pessoa, em que a diferença nos níveis de expressão da região 5' do gene ROS1 e da região 3' do gene ROS1 são indicativos de NSCLC ou uma susceptibilidade a NSCLC em uma pessoa.

[00117] Em outra modalidade, o nível de expressão da região 5’ do gene RET é comparado ao nível de expressão da região 3’ do gene RET em uma amostra de uma pessoa, em que a diferença nos níveis de expressão da região 5' do gene RET e da região 3' do gene RET é indicativa de NSCLC ou uma susceptibilidade a NSCLC em uma pessoa.

[00118] Em uma modalidade, o nível de expressão da região 5’ do gene ALK é comparado ao nível de expressão da região 3’ do gene ALK na amostra de uma pessoa, em que a diferença nos níveis de expressão da região 5' do gene ALK e da região 3' do gene ALK é indicativa de NSCLC ou uma susceptibilidade a NSCLC na pessoa.

Métodos de prognose

[00119] Em um aspecto, os métodos descritos aqui proporcionam uma prognose para câncer em uma pessoa. O termo "prognose" como usado aqui se refere a uma previsão do curso provável e resultado de uma condição ou doença clínica. Uma prognose de um paciente é feita geralmente avaliando fatores ou sintomas de uma doença que são indicativos de um curso ou resultado favorável ou não favorável da doença. O termo prognose não se refere à capacidade para prever o curso ou resultado de uma condição com 100% de exatidão. Em vez disso, os versados na técnica entenderão que o termo "prognose" se refere a uma probabilidade aumentada que um determinado curso ou resultado irá ocorrer; isto é, aquele curso ou resultado é mais provável de ocorrer em um paciente que exibe uma dada condição, quando comparado com aqueles indivíduos que não exibem a condição. Uma prognose pode ser expressa como a quantidade de tempo que poder ser esperada que o paciente sobreviva. Alternativamente, uma prognose pode se referir a probabilidade que a doença entra em remissão ou a quantidade de tempo que é esperada que a doença permaneça em remissão. O prognóstico pode ser expresso de várias formas; por exemplo, a prognose pode ser expressada como um percentual da possibilidade de que o paciente sobreviverá após um ano, cinco anos, dez anos ou similares. Alternativamente a prognose pode ser expressada como o número de anos, na média que o paciente pode esperar sobreviver como um resultado de uma condição ou doença. A prognose de um paciente pode ser considerada como uma expressão do relativismo, com muitos fatores afetando o resultado final. Por exemplo, para pacientes com determinadas condições, prognose pode ser expressada apropriadamente como a probabilidade que uma condição pode ser tratável ou curável, ou a probabilidade que uma doença entrará em remissão, enquanto para pacientes com condições mais severas o prognóstico pode ser mais apropriadamente expresso como a probabilidade de sobrevivência durante um período específico de tempo. Os métodos incluem, mas não estão limitados a câncer de próstata e pulmão.

[00120] Uma prognose é determinada frequentemente examinando um ou mais fatores ou indicadores prognósticos. Estes são marcadores, tal como a presença de uma translocação cromossômica particular, a presença ou quantidade na qual em um sinal do paciente (ou uma amostra obtida do paciente) uma probabilidade de um dado curso ou resultado ocorrerá. Os versados na técnica entenderão que a associação de um indicador prognóstico com uma predisposição para um resultado adverso pode envolver análise estatística.

[00121] Em uma modalidade, o nível de expressão da região 5’ do gene ROS1 é comparado ao nível de expressão da região 3’ do gene ROS1 em uma amostra de uma pessoa, em que a diferença nos níveis de expressão da região 5' do gene ROS1 e da região 3' do gene ROS1 é indicativa do estágio, severidade ou resultado de câncer de próstata em uma pessoa.

Kits

[00122] Em outro aspecto, a descrição fornece um kit para detectar uma anomalia genética em uma amostra. O kit pode incluir: (a) pelo menos dois pares de iniciadores direcionados a regiões diferentes de uma porção 5’ de um transcrito do gene alvo, e (b) pelo menos dois pares de iniciadores direcionados a regiões diferentes de uma porção 3’ de um transcrito do gene alvo. O kit pode, opcionalmente, conter adicionalmente pelo menos uma sonda direcionada a pelo menos uma sequência de amplicon que resulta da amplificação com os iniciadores no kit. Em algumas modalidades, o pelo menos um iniciador em cada par de iniciador é marcado detectavelmente e/ou é um iniciador-sonda.

[00123] Em uma modalidade, o gene alvo é ROS1, RET ou ALK. Em algumas modalidades, pares de iniciadores direcionados a cada dos transcritos do gene alvo na 3’ estão presentes no kit.

[00124] Em algumas modalidades o kit compreende adicionalmente um ou mais reagentes tais como, por exemplo, reagentes usados para realizar a transcrição reversa, PCR, e/ou PCR em tempo real. Em algumas modalidades um kit compreende instruções impressas.

[00125] Como usado aqui, um “kit” se refere a um conjunto de componentes embalados usados para um propósito específico. Exemplos não limitativos de materiais em que um kit pode ser embalado incluem caixas, sacos, envelopes e tubos, mas os componentes do kit podem ser fornecidos para um consumidor em tipos adicionais de materiais para embalagem. Em algumas modalidades, os iniciadores e/ou sondas incluídos em um kit são polinucleotídeos isolados e podem ser fornecidos em tubos, fracos ou outros tipos de recipientes dentro do kit. Em algumas modalidades um kit contém adicionalmente instruções para o uso dos componentes do kit. As instruções podem ser impressas em um material dentro do kit ou fornecidas em formato eletrônico. Em algumas modalidades, as instruções impressas especificam como usar os reagentes contidos no kit para detectar expressão diferencial intragênica.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Ensaio de expressão diferencial intragênica (IDE) para um painel de translocação de ALK+ROS1+RET

[00126] Os exemplos abaixo ilustram um protocolo padrão para realizar PCR em tempo real e análise tempo real. O sistema TaqMan de marcação de sonda é um método exemplar de detecção em tempo real de amplicons de PCR. Os exemplos seguintes servem para ilustrar a presente invenção e de nenhum modo se destinam a limitar o escopo da invenção.

Protocolo de IDE:

[00127] Múltiplos pares de iniciadores/sondas foram projetados alvo- marcando diferentes regiões 5’ (pontos de interrupção antes da translocação) e 3’ (pontos de interrupção após translocação) de ALK, ROS1 e RET (tabela 1). RNA extraído foi primeiro transcrito reverso em cDNA usando Superscript III (Life Technologies), então misturado com iniciadores dianteiro/reverso da sequência específica (IDT, Coralville, Iowa), e 2X PCR Master Mix (Celera, Alameda, CA). A mistura foi submetida a 45 ciclos de amplificação PCR (95oC durante 15 seg, então 60oC durante 60 seg) tanto no BioMark HD Gene Expression 48.48 Array Chip (Fluidigm, South San Francisco, CA) como no ViiA7instrument (Life Technologies, Carlsbad, CA). O ΔCt foi calculado e uma pontuação de IDE alta (ΔCt > 4,0) implica na presença dos produtos da fusão do gene alvo. Tabela 1. Projeto do iniciador em ensaio RT-PCR multiplex para expressão diferencial intragênica (IDE).

Protocolo FISH

[00128] Hibridização de fluorescência in situ (FISH) foi realizada em um subconjunto de amostras. Seções de FFPE (espessura de 4 μm) foram hibridizadas com um Vysis ALK Break Apart FISH Probe (Abbott Molecular, Abbott Park, IL), ROS1 Breakapart probe (CytoCell, Cambridge, UK) e Poseidon RET Break Apart Probe (Kreatech, Amsterdam, NL). Resumindo, seções de tecido desparafinizado foram pré-tratadas com 1 M de solução de tiocianato de sódio 70oC seguido pela digestão de pepsina (10mg/mL) a 40oC. 10μL de sonda foram colocados em cada lâmina desidratados ou secos com ar e codesnaturados a 85oC durante 3 minutos seguido pela hibridização ao longo da noite a 37oC. A lavagem após a hibridização foi realizada com 2 xSSC/0, 3% NP-40 a 72oC. As lâminas foram montadas com contracoloração DAPI I (Vector Laboratories Inc., Burlingame CA). Resultados FISH foram avaliados com um microscópio de fluorescência Nikon 50i (Nikon Corp., Tokyo, Japão). As imagens foram capturadas usando uma câmara CCD e sistema de formação de imagem Isis® (MetaSystems, Watertown, MA). Um total de 50 células foi analisado em todos os casos normais e 100 células em quaisquer dos casos anormais. Em todos os casos, toda a lâmina foi examinada para áreas possíveis onde rearranjos podem ter sido perdidos. O corte para o rearranjo do gene para ALK, ROS1 e RET foi 15%, 9% e 12%, respectivamente.

Protocolo EML4-ALK

[00129] EML4-ALK por RT-PCR multiplex foi realizado como previamente descrito (12). Resumindo, amostras de RNA foram amplificadas por RT-PCR multiplex com iniciador marcado com FAM -. Os produtos de RT-PCR foram então diluídos, desnaturados, e fracionados por tamanho por eletroforese capilar em um analisador genético ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os resultados foram analisados com o software GeneMapper (Applied Biosystems).

Protocolo RET-PTC

[00130] Rearranjos RET-PTC, RET-PTC3 foram detectados por RT- PCR em tempo real como previamente descrito acima (13). RNA extraído foi transcrito reverso e então amplificado por PCR em tempo real no instrumento ABI 7900 (Life Technologies), e o resultado foi analisado pelo software SDS (Life Technologies). Resultados:

Eficiência de PCR para ensaios de IDE

[00131] Diluições em série de vários padrões de RNA (Raji para ABL, PC3 para ALK, HCC-78 para ROS1, TPC-1 para RET, e várias amostras clínicas) foram usadas para estabelecer a eficiência de amplificação para ensaios IDE (tabela 2). Um total de 18 pares de iniciador foi selecionado para o teste de eficiência de PCR. Todos exibiram eficiência de PCR (entre 90~110%). Tabela 2. Eficiência de amplificação de PCR em ensaio de IDE (pares de iniciador selecionados).

Resultado de IDE para espécimes de linhagem celular (controle positivo):

[00132] RNA da translocação de linhagens celulares positivas foi estudado em 9 configurações separadas e o resultado é resumido na tabela 3. O resultado é 100% de concordância entre o esperado e o observado, usando um ΔCt >4,0 entre 5’ e 3’ como um corte para positividade. Tabela 3. Desempenho do ensaio de IDE: RNA de linhagem celular de controle positivo.

Resumo do resultado ALK, ROS1, RET IDE:

[00133] Em seguida, um total de 408 amostras clínicas de NSCLC foi testado para ALK, ROS1, e translocações RET por IDE (ver tabela 4). No total, 33 (8,40%) de amostras clínicas foram testadas positivo para ALK, ROS1, RET IDE. O ensaio IDE teve uma taxa de falha de 3,67%. Tabela 4. Prevalência de ALK, ROS1, RET por IDE.

[00134] Para ALK, 20 das amostras foram testadas positivo por IDE (tabela 5). 15/20 eram conhecidas como sendo positivas para ALK por FISH e/ou EML4-ALK. 5/20 foram testadas como positivas por IDE, mas negativas para FISH ou EML4-ALK (falsos positivos). Além disso, uma amostra positiva FISH foi testada como negativa por ambos IDE e EML4-ALK (falso negativo) Tabela 5. Resumo do resultado de IDE de ALK.

[00135] Para ROS1, tanto linhagens celulares positivas para ROS1 como 3/408 (0,76%) amostras de NSCLC testadas como positivas por IDE (tabela 6). A positividade de ROS1 e ALK IDE era mutuamente exclusiva. Entre as 3 amostras de NSCLC positivas em IDE, 1 foi confirmada como positiva por FISH, e 1 negativa por FISH. Tabela 6. Resumo do resultado de IDE ROS1.

[00136] Para RET, todos as 7 amostras de NSCLC positivas para RET conhecidos e 10/408 (2,5%) deram positivo por IDE (tabela 7). A positividade de RET e ALK IDE foi mutuamente exclusiva. Entre as 10 amostras clínicas positivas por IDE, 4 foram confirmadas positivas por FISH ou RET-PTC, e 2 foram negativas por FISH. Tabela 7. Resumo do resultado de IDE de RET.

Características do ensaio de IDE de ALK:

[00137] Amostras clínicas positivas verdadeiras IDE de ALK (com resultados positivos confirmados por FISH e/ou EML4-ALK) exibiram ΔCt superior (média 6,87), comparado com aquele das amostras negativas verdadeiras de IDE de ALK (média ΔCt a 2,11, tabela 8). Amostras de IDE de ALK positivas falsas (com resultados negativos por FISH e/ou EML4-ALK) exibiram uma faixa ΔCt entre estas. Tabela 8. Faixa ΔCt de IDE de ALK para amostras clínicas.

[00138] Os resultados do estudo de concordância entre IDE de ALK FISH, EML4-ALK, e ALK indicaram uma concordância de 96,9% (186/192) entre IDE e FISH e uma concordância de 96% (185/192) entre IDE e EML4- ALK (tabela 9). 3 amostras EML4-ALK negativas foram positivas tanto para FISH como IDE, enquanto amostra ALK FISH negativa foi positivo tanto para EML4-ALK como IDE. Encontrou-se 1 falso negativo (FISH positivo, mas negativo tanto para IDE como EML4-ALK) e 4 amostras positivas falsas (IDE positivo, mas FISH e EML4-ALK negativo). Tabela 9. Estudo de concordância ALK: FISH versus EML4-ALK, versus IDE.

[00139] Para calcular a sensibilidade e especificidade do ensaio IDE de ALK, foram notadas 15 amostras verdadeiras positivas, 5 amostras falsas positivas (IDE positivo, mas FISH e/ou EML4-ALK negativo), 1 falso negativo (FISH positivo, mas IDE e EML4-ALK negativo), e 372 amostras verdadeiras negativas (ver tabela 5).

[00140] Assim, as características de desempenho de ensaio para IDE de ALK foram calculadas como a seguir: Sensibilidade = TP/(TP+FN)*100% = 93,7% Especificidade = TN/(FP+TN)*100% = 98,7% Valor previsível positivo (PPV) = TP/(TP+FP)*100% = 75% Valor previsível negativo (NPV) = TN/(TN+FN)*100% = 99,7%

[00141] Em resumo, um total de 416 amostras (408 amostras clínicas de câncer de pulmão e 2 linhagens celulares positivas para ROS1, e 7 amostras clínicas positivas para RET) foram usadas para estabelecer as características de desempenho do ensaio para IDE. Todas, exceto uma, as amostras positivas para translocação de ALK, ROS1, e RET conhecidas foram corretamente identificadas por IDE. A taxa de positividade de translocação para IDE foi 5,09% para ALK, 0,76% para ROS1, e 2,54% para RET.

[00142] Os ensaios de IDE com ALK, ROS1, RET podem ser usados ou como os únicos testes, ou ser empregados como uma ferramenta de triagem efetiva para pegar amostras positivas de translocação para confirmação por FISH ou outro método de acompanhamento. Além disso, marcadores adicionais de translocação/rearranjo para pacientes com NSCLC (exemplo, NTRK, BRAF, etc.) ou painéis adicionais de translocação orientada para a doença (exemplo tireoide) podem ser examinados usando a mesma estratégia de DE.

[00143] Outras modalidades: Assim, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido descrita especificamente pelas modalidades e características preferidas, modificações, aperfeiçoamentos e variações adicionais da invenção realizada e descrita aqui podem ocorrer aos versados na técnica, e que tais modificações, aperfeiçoamentos e variação são considerados como estando dentro do escopo desta invenção. Os materiais, métodos, exemplos aqui apresentados são representativos das modalidades preferidas, são exemplares, e não são planejados como limitações do escopo da invenção.

[00144] A invenção foi descrita de modo amplo e geral aqui. Cada uma das espécies e agrupamentos subgenéricos mais estritos estando dentro da descrição geral também formando parte da invenção. Isto inclui a descrição geral da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto relacionado com o gênero, independentemente de se o material excisado aqui é especificamente citado aqui.

[00145] Além disso, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, os versados na técnica reconhecerão que a invenção é descrita também em termos de qualquer membro individual ou subgrupos de membros do grupo Markush.

[00146] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são expressamente incorporadas por referência em sua totalidade, na mesma extensão como se cada fosse incorporada por referência individualmente. Em caso de conflito, o presente relatório, incluindo definições, será o controle.

[00147] As invenções descritas ilustrativamente aqui podem ser apropriadamente praticadas na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente descritas aqui. Deste modo, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidos de modo expansivo e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não existe nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. REFERÊNCIAS 1. Howlader N et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2009 (2012) National Cancer Institute. Bethesda, MD, 2. Herbst RS and Bunn PA Jr. Targeting the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. (2003) 9:581324. 3. Soda M et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature (2007) 448:561-6. 4. Howlader N et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2009 (2012) Rikova K et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell (2007) 131:1190-203. 5. Takeuchi K et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK- positive lung cancer. Clin Cancer Res. (2009) 15:3143-9. 6. Kwak EL et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. (2010) 363:1693-703. 7. Takeuchi K et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. (2012) 18:378-81. 8. Rimkunas VM et al. Analysis of receptor tyrosine kinase ROSl-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG- ROS1 fusion. Clin Cancer Res. (2012) 18:4449-57. 9. Suehara Y et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC- ROS1 Fusions in Lung Adenocarcinomas through a Comprehensive mRNA- Based Screen for Tyrosine Kinase Fusions. Clin Cancer Res. (2012) 18:6599608. 10. Bergethon K et al. ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers. J Clin Oncol. (2012) 30:863-70. 11. Kohno T et al. KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma. Nat Med. (2012) 18:375-7. 12. Sanders, HR, Li HR, Bruey JM, Scheerle JA, Meloni-Ehrig AM, Kelly JC, Novick C, Albitar M. Exon scanning by reverse transcriptase- polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genet. 2011 204:45-52. 13. Cyniak-Magierska A, Wojciechowska-Durczynska K, Krawczyk-Rusiecka K, Zygmunt A, Lewinski A. Assessment of RET/PTC1 and RET/PTC3 rearrangements in fine-needle aspiration biopsy specimens collected from patients with Hashimoto's thyroiditis. Thyroid Res. (2011) 4:5.

Claims (15)

1. Método para detectar uma desregulação em um gene alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) amplificar porções de uma região 5’ de um transcrito de um gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente em uma amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvejados 5’ que são direcionados às porções da região 5’ do gene alvo, (b) amplificar porções de uma região 3’ do transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvejados 3’ que são direcionados às porções da região 3’ do gene alvo, (c) detectar os produtos de amplificação produzidos pelos dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’, (d) determinar o limite de ciclo médio (Ct) entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e o Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’, e (e) identificar a amostra de ácido nucleico como tendo uma desregulação de gene quando a diferença no Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e o Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’ como determinado na etapa (d) indicarem que o gene alvo está desregulado.

2. Método para detectar uma desregulação em um gene alvo em uma amostra de teste, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) amplificar porções de uma região 5’ de um transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvejados 5’ que são direcionados às porções da região 5’ do gene alvo, (b) amplificar porções de uma região 3’ do transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvejado 3’ que são direcionados às porções da região 3’ do gene alvo, (c) detectar os produtos de amplificação produzidos pelos dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’, (d) determinar o limite de ciclo médio (Ct) entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e o Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’, (e) calcular uma Pontuação de expressão diferencial intragênica (IDE) como a diferença entre o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvejados 5’ e o limite de ciclo médio entre os pares de iniciadores alvejados 3’, e (f) identificar a amostra de teste como tendo uma desregulação de gene alvo se a Pontuação de IDE for significativamente diferente de um valor de corte e a diferença indicar a presença de uma desregulação de gene alvo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene alvo é selecionado do grupo que consiste em ROS1, RET, ALK, BRAF, TMPRSS2, ERG, ETV1, SLC45A3, NTRK, C150RF21, HNRPA2B1, ETV4, ETV5, EML4, EUS, RANBP2, PAX, BUS, COL1A1 CLTC, KIF5B FKHR, PDGFB, FEV, DDIT3, ATF1, CREA, SP3, NR4A3, WT1, SYT, SSX1, SSX2, SSX4, BCR, ABL, BCL2, RARA, NPM e ATIC.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a detecção é efetuada usando uma sonda oligonucleotídica marcada complementar a cada sequência de produto de amplificação.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada usando PCR em tempo real quantitativa.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as quantidades de produtos de amplificação produzidos na etapa (c) são, cada uma, normalizadas para a quantidade de um transcrito de gene de controle endógeno.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente amplificar uma região do transcrito de gene de controle endógeno presente na amostra de teste com um par de iniciadores direcionado à região do gene de controle endógeno e detectar a amplificação da região do gene de controle endógeno.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a Pontuação de IDE é calculada usando uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: a) Pontuação de IDE = ΔCt = (médCt5’ - médCt3’) b) IDE = (médCt5’)/(Ctcontrole)-( médCt3’)/(Ctcontrole), e c) IDE = [Ln((médCt5’)/Ctcontrole)]-[Ln((médCt3’)/Ctcontrole)]

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o gene de controle endógeno é ABL.

10. Método para diagnosticar a presença ou ausência de câncer ou uma susceptibilidade ao câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma amostra de teste que compreende ácidos nucleicos do indivíduo, (b) amplificar porções de uma região 5’ de um transcrito de um gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvejados 5’ que são direcionados às porções da região 5’ do gene alvo, em que a desregulação do gene alvo é associada com câncer, (c) amplificar porções de uma região 3’ de um transcrito do gene alvo ou um cDNA derivado do mesmo, se presente na amostra de teste, com dois ou mais diferentes pares de iniciadores alvejados 3’ que são direcionados às porções da região 3’ do gene alvo, (d) detectar os produtos de amplificação produzidos pelos dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’, (e) determinar o limite de ciclo médio (Ct) entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 5’ e o Ct médio entre os dois ou mais pares de iniciadores alvejados 3’, (f) calcular uma Pontuação de IDE como a diferença entre o Ct entre os pares de iniciadores alvejados 5’ e o Ct médio entre os pares de iniciadores alvejados 3’, e (g) diagnosticar o indivíduo como i. tendo câncer ou uma susceptibilidade ao câncer quando a Pontuação de IDE for significativamente diferente de um valor de corte e a diferença indicar a presença de câncer ou uma susceptibilidade ao câncer, ou ii. não tendo câncer ou uma susceptibilidade ao câncer resultante de desregulação do gene alvo se a Pontuação de IDE na amostra de teste não diferir significativamente do valor de corte.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene alvo é selecionado do grupo que consiste em ROS1, RET, ALK, BRAF, TMPRSS2, ERG, ETV1, SLC45A3, NTRK, C150RF21, HNRPA2B1, ETV4, ETV5, EML4, EUS, RANBP2, PAX, BUS, COL1A1 CLTC, KIF5B FKHR, PDGFB, FEV, DDIT3, ATF1, CREA, SP3, NR4A3, WT1, SYT, SSX1, SSX2, SSX4, BCR, ABL, BCL2, RARA, NPM e ATIC.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o gene alvo é selecionado do grupo que consiste em ROS1, RET e ALK.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a Pontuação de IDE é calculada usando uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: a) Pontuação de IDE = ΔCt = (médCt5’ - médCt3’) b) IDE = (médCt5’)/(Ctcontrole) - (médCt3’)/(Ctcontrole), e c) IDE = [Ln((médCt5’)/Ctcontrole)] - [Ln((médCt3’)/Ctcontrole)], em que Ctcontrole é o valor Ct para um transcrito de gene de controle endógeno.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é selecionada do grupo que consiste em sangue total, células sanguíneas isoladas, plasma, soro e urina.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).