BR112016019997B1

BR112016019997B1 - METHOD FOR PRODUCING METHACRYLIC ACID ESTERS

Info

Publication number: BR112016019997B1
Application number: BR112016019997-9A
Authority: BR
Inventors: Yasuhisa Asano; Eiji Sato; Fujio Yu; Wataru Mizunashi
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corporation
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2015-03-05
Publication date: 2023-09-19

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR ÉSTER DE ÁCIDO METACRÍLICO E SINTASE DE ÉSTER DE ÁCIDO METACRÍLICO. É fornecido um método para produzir um éster de ácido metacrílico com o uso de um biocatalisador, o dito método compreendendo uma etapa de reagir um álcool ou um fenol com metacrilil-CoA na presença de um álcool aciltransferase originado de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta que pertence ao gênero Osmanthus, uma planta que pertence ao gênero Vitis, uma planta que pertence ao gênero Citrus, uma planta que pertence ao gênero Durio, uma planta que pertence ao gênero Magnolia e uma planta que pertence ao gênero Chamaemelum para sintetizar, dessa maneira, o éster de ácido metacrílico.METHOD FOR PRODUCING METHACRYLIC ACID ESTERS AND METHACRYLIC ACID ESTERS SYNTHASE. A method is provided for producing a methacrylic acid ester with the use of a biocatalyst, said method comprising a step of reacting an alcohol or a phenol with methacrylyl-CoA in the presence of an alcohol acyltransferase originating from a plant selected from the group which consists of a plant belonging to the genus Osmanthus, a plant belonging to the genus Vitis, a plant belonging to the genus Citrus, a plant belonging to the genus Durio, a plant belonging to the genus Magnolia and a plant belonging to the genus Chamaemelum to synthesize methacrylic acid ester in this way.

Description

FIELD OF TECHNIQUE

[0001] A presente invenção refere-se a um método para produzir ésteres de ácido orgânico, especialmente ésteres de ácido metacrílico, com o uso de biocatalisadores, mais especificamente, a um método para produzir ésteres de ácido metacrílico com o uso de álcool acil- transferase com a capacidade de produzir ésteres de ácido metacríli- co. Além disso, a presente invenção refere-se a álcool aciltransferase e a um método para usar a mesma.[0001] The present invention relates to a method for producing organic acid esters, especially methacrylic acid esters, with the use of biocatalysts, more specifically, to a method for producing methacrylic acid esters with the use of acyl alcohol. transferase with the ability to produce methacrylic acid esters. Furthermore, the present invention relates to alcohol acyltransferase and a method for using the same.

PREVIOUS TECHNIQUE

[0002] Os ésteres de ácido metacrílico são essencialmente usados como matéria-prima em resinas acrílicas, embora haja muita demanda para uso como comonômeros em aplicações tais como tintas, adesivos e modificadores de resina. Alguns exemplos conhecidos em métodos de fabricação industrial são métodos de ACH (acetona cianidrina) com o uso de acetona e cianeto de hidrogênio como matérias-primas, e métodos para oxidação direta com o uso de isobutileno e álcool terc- butil como matérias-primas. Aqueles métodos de produção química dependem de matérias-primas fósseis e exigem uma grande quantidade de energia.[0002] Methacrylic acid esters are essentially used as raw materials in acrylic resins, although there is much demand for use as comonomers in applications such as paints, adhesives and resin modifiers. Some known examples in industrial manufacturing methods are ACH (acetone cyanohydrin) methods using acetone and hydrogen cyanide as raw materials, and methods for direct oxidation using isobutylene and tert-butyl alcohol as raw materials. Those chemical production methods rely on fossil raw materials and require a large amount of energy.

[0003] Nos últimos anos, as tecnologias para produzir vários pro dutosquímicos a partir de biomassa como uma fonte de carbono que substitui matérias-primas fósseis convencionais têm atraído a atenção a partir dos pontos de vistas de proteção ambiental e prevenção de aquecimento global. Embora também seja esperado que os ésteres de ácido metacrílico sejam produzidos a partir de matérias-primas de bi-omassa, um exemplo de produção específica de matérias-primas de biomassa com o uso de um biocatalisador não foi relatado.[0003] In recent years, technologies for producing various chemical products from biomass as a carbon source that replaces conventional fossil raw materials have attracted attention from the points of view of environmental protection and prevention of global warming. Although methacrylic acid esters are also expected to be produced from biomass feedstocks, an example of specific production of biomass feedstocks with the use of a biocatalyst has not been reported.

[0004] Por exemplo, os métodos com o uso de micro-organismos existentes na natureza para produzir ácido 2-hidróxi-isobutírico e ácido 3-hidróxi-isobutírico como precursores de ácido metacrílico a partir de uma fonte natural tal como açúcar têm sido propostos (refira às Literaturas de Patente 1 e 2 e à Literatura de Não Patente 1). Entretanto, nesses métodos, os procedimentos para desidratar precursores e formarácido metacrílico ainda dependem de técnicas químicas.[0004] For example, methods using naturally occurring microorganisms to produce 2-hydroxyisobutyric acid and 3-hydroxyisobutyric acid as precursors of methacrylic acid from a natural source such as sugar have been proposed. (refer to Patent Literature 1 and 2 and Non-Patent Literature 1). However, in these methods, the procedures to dehydrate precursors and form methacrylic acid still depend on chemical techniques.

[0005] Além disso, os métodos para formar ácido metacrílico a partir de glicose com o uso de micro-organismos recombinantes que não existem naturalmente e são produzidos introduzindo-se múltiplos genes de enzima têm sido propostos; entretanto, esses métodos são resultados da combinação de uma reação de enzima já conhecida e uma reação de enzima hipotética analógica de tal reação e, desse modo, não têm sido provados (refira às Literaturas de Patente 3 a 5). Em particular, embora a Literatura de Patente 5 mostre exemplos de vários biocatalisadores (hidrolase, sintetase de éster de cera, álcool acetiltransferase) que têm atividade de formação de éster comum, é incerto se os biocatalisadores exemplificados têm a atividade sintética para éster de ácido metacrílico.[0005] Furthermore, methods for forming methacrylic acid from glucose using recombinant microorganisms that do not exist naturally and are produced by introducing multiple enzyme genes have been proposed; however, these methods are results of the combination of an already known enzyme reaction and a hypothetical enzyme reaction analogue of such a reaction and, therefore, have not been proven (refer to Patent Literatures 3 to 5). In particular, although Patent Literature 5 shows examples of various biocatalysts (hydrolase, wax ester synthetase, alcohol acetyltransferase) that have common ester-forming activity, it is uncertain whether the exemplified biocatalysts have the synthetic activity for methacrylic acid ester. .

[0006] Além disso, a Literatura de Patente 6 revela um método pa ra produzir ésteres de ácido acrílico através de reação de hidrolase na presença de acrilil-CoA e álcool. O mesmo documento sugere que os ésteres de ácido metacrílico também sejam produzidos por tal método. Entretanto, ao levar em conta a diversidade e especificidade de substrato de biocatalisadores, o mesmo meramente sugere a produção de ésteres de ácido acrílico por um determinado tipo de hidrolase, e não está claro se a hidrolase tem a capacidade de produzir ésteres de ácidometacrílico que têm estruturas diferentes. Além disso, é totalmente incerto se outros tipos de biocatalisadores que têm diferentes mecanismos de reação têm a capacidade de produzir ésteres de ácido me- tacrílico. Além disso, quando os ésteres são sintetizados pela hidro- lase descrita na Literatura de Patente 6, é previsto que o éster formado seja decomposto pela atividade de hidrólise no primeiro lugar e, desse modo, tal método de produção é um tanto improvável de ser eficaz.[0006] Furthermore, Patent Literature 6 discloses a method for producing acrylic acid esters through hydrolase reaction in the presence of acrylyl-CoA and alcohol. The same document suggests that methacrylic acid esters are also produced by this method. However, when taking into account the diversity and substrate specificity of biocatalysts, it merely suggests the production of acrylic acid esters by a particular type of hydrolase, and it is unclear whether the hydrolase has the ability to produce methacrylic acid esters that have different structures. Furthermore, it is completely uncertain whether other types of biocatalysts that have different reaction mechanisms have the ability to produce methacrylic acid esters. Furthermore, when esters are synthesized by the hydrolase described in Patent Literature 6, the ester formed is predicted to be decomposed by the hydrolysis activity first, and thus such a production method is somewhat unlikely to be effective. .

[0007] Por outro lado, o álcool acetiltransferase tem sido conheci do como uma sintetase de sabor frutado. A Literatura de Patente 7 identifica os mesmos genes de enzima contidos em frutas específicas e propõe métodos sintéticos de vários ésteres que são de sabores de fruta. Entretanto, se os ésteres de ácido metacrílico são sintetizáveis com essas enzimas não é relatado e é completamente incerto.[0007] On the other hand, alcohol acetyltransferase has been known as a fruity flavor synthetase. Patent Literature 7 identifies the same enzyme genes contained in specific fruits and proposes synthetic methods of various esters that are of fruit flavors. However, whether methacrylic acid esters are synthesizable with these enzymes is not reported and is completely uncertain.

[0008] Conforme estabelecido acima, embora algumas propostas ou estudos tenham sido feitos, não há exemplos de ésteres de ácido metacrílico realmente produzidos através de reações enzimáticas e, desse modo, o estabelecimento de um método de produção eficaz tem sido desejado.[0008] As established above, although some proposals or studies have been made, there are no examples of methacrylic acid esters actually produced through enzymatic reactions and, therefore, the establishment of an effective production method has been desired.

PRIOR ART DOCUMENT PATENT LITERATURE

[0009] Literatura de Patente 1: no WO2007/110394[0009] Patent Literature 1: in WO2007/110394

[0010] Literatura de Patente 2: no WO2008/145737[0010] Patent Literature 2: in WO2008/145737

[0011] Literatura de Patente 3: no WO2009/135074[0011] Patent Literature 3: in WO2009/135074

[0012] Literatura de Patente 4: no WO2011/031897[0012] Patent Literature 4: in WO2011/031897

[0013] Literatura de Patente 5: no WO2012/135789[0013] Patent Literature 5: in WO2012/135789

[0014] Literatura de Patente 6: no WO2007/039415[0014] Patent Literature 6: in WO2007/039415

[0015] Literatura de Patente 7: no WO2000/32789[0015] Patent Literature 7: in WO2000/32789

[0016] Literatura de Patente 8: no JP2011-200133A[0016] Patent Literature 8: no JP2011-200133A

[0017] Literatura de Patente 9: no JPH05-64589A[0017] Patent Literature 9: no JPH05-64589A

[0018] Literatura de Patente 10: no JPH10-337185A[0018] Patent Literature 10: no JPH10-337185A

[0019] Literatura de Patente 11: no JPH10-24867A[0019] Patent Literature 11: no JPH10-24867A

NON-PATENT LITERATURE

[0020] Literatura de Não Patente 1: Green Chemistry, 2012, 14, 1.942 a 1.948[0020] Non-Patent Literature 1: Green Chemistry, 2012, 14, 1942 to 1948

[0021] Literatura de Não Patente 2: Methods in Enzymology, 2000, 324, 73 a 79[0021] Non-Patent Literature 2: Methods in Enzymology, 2000, 324, 73 to 79

[0022] Literatura de Não Patente 3: Botanical Journal of the Lin- nean Society, 2009, 161, 105 a 121[0022] Non-Patent Literature 3: Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105 to 121

[0023] Literatura de Não Patente 4: Microbiology, 1999, 145, 2.323 a 2.334[0023] Non-Patent Literature 4: Microbiology, 1999, 145, 2,323 to 2,334

SUMMARY OF THE INVENTION PROBLEMS TO BE SOLVED BY THE INVENTION

[0024] O objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir um éster de ácido metacrílico com o uso de um biocatalisa- dor. Além disso, o objetivo da presente invenção é fornecer um álcool aciltransferase inovador que tem atividade sintética para produzir um éster de ácido metacrílico.[0024] The objective of the present invention is to provide a method for producing a methacrylic acid ester with the use of a biocatalyst. Furthermore, the object of the present invention is to provide an innovative alcohol acyltransferase that has synthetic activity to produce a methacrylic acid ester.

SOLUTIONS TO PROBLEMS

[0025] Os inventores da presente invenção constataram que o ál cool aciltransferase derivado de uma determinada planta tem atividade sintética para produzir um éster de ácido metacrílico, e os mesmos concluíram a presente invenção. Ademais, os inventores produziram um álcool aciltransferase inovador a partir de uma suspensão preparada usando-se uma planta. A saber, a presente invenção é conforme a seguir.[0025] The inventors of the present invention found that the alcohol acyltransferase derived from a certain plant has synthetic activity to produce a methacrylic acid ester, and they concluded the present invention. Furthermore, the inventors produced an innovative alcohol acyltransferase from a suspension prepared using a plant. Namely, the present invention is as follows.

[0026] [1] Um método para produzir um éster de ácido metacrílico que compreende uma etapa para sintetizar um éster de ácido metacrí- lico reagindo-se álcool ou fenol com metacrilil-CoA na presença de um álcool aciltransferase derivado de uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em plantas que pertencem a Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales e Asterales.[0026] [1] A method for producing a methacrylic acid ester comprising a step for synthesizing a methacrylic acid ester by reacting alcohol or phenol with methacrylyl-CoA in the presence of an alcohol acyltransferase derived from a plant selected from from a group consisting of plants belonging to Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales and Asterales.

[0027] [2] Um método para produzir um éster de ácido metacrílico, que compreende uma etapa para sintetizar um éster de ácido metacrí- lico reagindo-se álcool ou fenol com metacrilil-CoA na presença de um álcool aciltransferase derivado de uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em plantas que pertencem a Oleaceae, Vitace- ae, Rutaceae, Malvaceae, Magnoliaceae e Asteraceae.[0027] [2] A method for producing a methacrylic acid ester, comprising a step for synthesizing a methacrylic acid ester by reacting alcohol or phenol with methacrylyl-CoA in the presence of an alcohol acyltransferase derived from a selected plant from a group consisting of plants belonging to Oleaceae, Vitaceae, Rutaceae, Malvaceae, Magnoliaceae and Asteraceae.

[0028] [3] Um método para produzir um éster de ácido metacrílico, que compreende uma etapa para sintetizar um éster de ácido metacrí- lico reagindo-se álcool ou fenol com metacrilil-CoA na presença de um álcool aciltransferase derivado de uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em plantas que pertencem a Osmanthus, Vitis, Citrus, Durio, Magnolia e Chamaemelum.[0028] [3] A method for producing a methacrylic acid ester, comprising a step for synthesizing a methacrylic acid ester by reacting alcohol or phenol with methacrylyl-CoA in the presence of an alcohol acyltransferase derived from a selected plant from a group consisting of plants belonging to Osmanthus, Vitis, Citrus, Durio, Magnolia and Chamaemelum.

[0029] [4] O método para produzir um éster de ácido metacrílico, de acordo com [1] a [3], em que a planta é selecionada a partir de um grupo que consiste em Osmanthus fragrans, Vitis vinifera, Ci- trusxparadisi, Durio zibethinus, Michelia figo e Chamaemelum nobile.[0029] [4] The method for producing a methacrylic acid ester, according to [1] to [3], in which the plant is selected from a group consisting of Osmanthus fragrans, Vitis vinifera, Citrusxparadisi , Durio zibethinus, Michelia fig and Chamaemelum nobile.

[0030] [5] Um método para produzir um éster de ácido metacrílico que compreende uma etapa para sintetizar um éster de ácido metacrí- lico reagindo-se álcool ou fenol com metacrilil-CoA na presença de um álcool aciltransferase que tem as propriedades físico-químicas (1) a (3) a seguir: (1) produzir um éster de ácido metacrílico reagindo-se com metacrilil-CoA na presença de álcool ou fenol; (2) ter uma atividade maior em metacrilil-CoA do que em acetil-CoA; e (3) ter um valor Km de 0,5 mM ou inferior para metacrilil- CoA.[0030] [5] A method for producing a methacrylic acid ester comprising a step for synthesizing a methacrylic acid ester by reacting alcohol or phenol with methacrylyl-CoA in the presence of an alcohol acyltransferase that has the physical properties chemicals (1) to (3) as follows: (1) produce a methacrylic acid ester by reacting with methacrylyl-CoA in the presence of alcohol or phenol; (2) have greater activity on methacrylyl-CoA than on acetyl-CoA; and (3) have a Km value of 0.5 mM or less for methacrylyl-CoA.

[0031] [6] Um álcool aciltransferase ou sua composição, que tem as propriedades físico-químicas (1) a (5) a seguir: (1) produzir um éster de ácido metacrílico reagindo-se com metacrilil-CoA na presença de álcool ou fenol; (2) ter uma atividade maior em metacrilil-CoA do que em acetil-CoA; (3) ter uma atividade maior em isobutiril-CoA do que em acetil-CoA; (4) ter um valor Km de 0,5 mM ou inferior para metacrilil- CoA; e (5) ter um pH ideal de 8 a 9 ao usar metacrilil-CoA e n- butanol como o substrato.[0031] [6] An alcohol acyltransferase or its composition, which has the following physicochemical properties (1) to (5): (1) produce a methacrylic acid ester by reacting with methacrylyl-CoA in the presence of alcohol or phenol; (2) have greater activity on methacrylyl-CoA than on acetyl-CoA; (3) have greater activity on isobutyryl-CoA than on acetyl-CoA; (4) have a Km value of 0.5 mM or less for methacrylyl-CoA; and (5) have an optimal pH of 8 to 9 when using methacrylyl-CoA and n-butanol as the substrate.

[0032] [7] O álcool aciltransferase ou sua composição, de acordo com [6], que é derivado de uma planta que pertence a Asterales.[0032] [7] Alcohol acyltransferase or its composition, according to [6], which is derived from a plant belonging to Asterales.

[0033] [8] O álcool aciltransferase ou sua composição, de acordo com [7], que é derivado de uma planta que pertence a Asteraceae.[0033] [8] Alcohol acyltransferase or its composition, according to [7], which is derived from a plant belonging to Asteraceae.

[0034] [9] O álcool aciltransferase ou sua composição, de acordo com [8], que é derivado de uma planta que pertence a Chamaemelum.[0034] [9] Alcohol acyltransferase or its composition, according to [8], which is derived from a plant belonging to Chamaemelum.

[0035] [10] O álcool aciltransferase ou sua composição, de acordo com [9], que é derivado de uma planta que pertence a Chamaemelum nobile.[0035] [10] Alcohol acyltransferase or its composition, according to [9], which is derived from a plant belonging to Chamaemelum nobile.

[0036] [11] Um método para produzir um éster de ácido orgânico com o uso de um álcool aciltransferase ou sua composição, de acordo com qualquer um dentre [6] a [10].[0036] [11] A method for producing an organic acid ester with the use of an alcohol acyltransferase or its composition, according to any one of [6] to [10].

[0037] [12] Um álcool aciltransferase, que é derivado de uma plan ta selecionada a partir de um grupo que consiste em Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales e Asterales, e que tem a capacidade de produzir um éster de ácido metacrílico reagindo-se com metacri- lil-CoA na presença de álcool ou fenol.[0037] [12] An alcohol acyltransferase, which is derived from a plant selected from a group consisting of Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales and Asterales, and which has the ability to produce a methacrylic acid ester reacting with methacrylyl-CoA in the presence of alcohol or phenol.

[0038] [13] O álcool aciltransferase, de acordo com [12], em que a planta pertence a Oleaceae, Vitaceae, Rutacea, Malvaceae, Magnolia- ceae ou Asteraceae.[0038] [13] Alcohol acyltransferase, according to [12], in which the plant belongs to Oleaceae, Vitaceae, Rutacea, Malvaceae, Magnoliaceae or Asteraceae.

[0039] [14] O álcool aciltransferase, de acordo com [13], em que a planta pertence a Osmanthus, Vitis, Citrus, Durio, Magnolia ou Chamaemelum.[0039] [14] Alcohol acyltransferase, according to [13], in which the plant belongs to Osmanthus, Vitis, Citrus, Durio, Magnolia or Chamaemelum.

[0040] [15] O álcool aciltransferase de acordo com [14], em que a planta pertence a Osmanthus fragrans, Vitis vinifera, Citrusxparadisi, Durio zibethinus, Michelia figo ou Chamaemelum nobile.[0040] [15] The alcohol acyltransferase according to [14], in which the plant belongs to Osmanthus fragrans, Vitis vinifera, Citrusxparadisi, Durio zibethinus, Michelia figo or Chamaemelum nobile.

[0041] [16] O álcool aciltransferase, de acordo com [15], que tem as propriedades físico-químicas (1) a (6) a seguir: (1) produzir um éster de ácido metacrílico reagindo-se com metacrilil-CoA na presença de álcool ou fenol; (2) ter uma atividade maior em metacrilil-CoA do que em acetil-CoA; (3) ter uma atividade maior em isobutiril-CoA do que em acetil-CoA; (4) ter uma atividade maior em propionil-CoA do que em acetil-CoA; (5) ter um valor Km de 0,5 mM ou inferior para metacrilil- CoA; e (6) ter um pH ideal de 8 a 9 com um substrato de metacrilil- CoA e n-butanol.[0041] [16] Alcohol acyltransferase, according to [15], which has the following physicochemical properties (1) to (6): (1) produce a methacrylic acid ester by reacting with methacrylyl-CoA in the presence of alcohol or phenol; (2) have greater activity on methacrylyl-CoA than on acetyl-CoA; (3) have greater activity on isobutyryl-CoA than on acetyl-CoA; (4) have greater activity on propionyl-CoA than on acetyl-CoA; (5) have a Km value of 0.5 mM or less for methacrylyl-CoA; and (6) have an ideal pH of 8 to 9 with a substrate of methacrylyl-CoA and n-butanol.

[0042] [17] O álcool aciltransferase, de acordo com [16], que é de rivado de uma planta que pertence a Asteraceae.[0042] [17] Alcohol acyltransferase, according to [16], which is derived from a plant that belongs to Asteraceae.

[0043] [18] O álcool aciltransferase, de acordo com [17], que é de rivado de uma planta que pertence a Chamaemelum.[0043] [18] Alcohol acyltransferase, according to [17], which is derived from a plant belonging to Chamaemelum.

[0044] [19] O álcool aciltransferase, de acordo com [18], que é de rivado de uma planta que pertence a Chamaemelum nobile.[0044] [19] Alcohol acyltransferase, according to [18], which is derived from a plant belonging to Chamaemelum nobile.

EFFECTS OF THE INVENTION

[0045] De acordo com a presente invenção, os ésteres de ácido metacrílico são produzidos usando-se biocatalisadores. Quando o método de produção da presente invenção é combinado com metabolismoin vivo, a produção fermentativa de ésteres de ácido metacrílico também é alcançada. Como resultado, quando comparado com um processo de produção química convencional, energia, recursos e carga no ambiente são reduzidos de maneira notória ao produzir ésteres de ácido metacrílico. Além disso, com o uso de uma enzima inovadora relacionada à presente invenção, os ésteres de ácido orgânico tais como ésteres de ácido metacrílico são produzidos de modo mais eficiente.[0045] According to the present invention, methacrylic acid esters are produced using biocatalysts. When the production method of the present invention is combined with in vivo metabolism, fermentative production of methacrylic acid esters is also achieved. As a result, when compared to a conventional chemical production process, energy, resources and burden on the environment are noticeably reduced when producing methacrylic acid esters. Furthermore, with the use of an innovative enzyme related to the present invention, organic acid esters such as methacrylic acid esters are produced more efficiently.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0046] A Figura 1 é um gráfico que mostra purificação através de uma coluna de DEAE-Toyopearl (segunda vez) (padrões de eluição);[0046] Figure 1 is a graph showing purification through a DEAE-Toyopearl column (second time) (elution patterns);

[0047] A Figura 2 é um gráfico que mostra a purificação conduzida através de uma coluna de Q - Sepharose(padrões de eluição);[0047] Figure 2 is a graph showing purification conducted through a Q - Sepharose column (elution standards);

[0048] A Figura 3 é um gráfico que mostra a purificação através de uma coluna MonoQ 5/50 GL (padrões de eluição);[0048] Figure 3 is a graph showing purification through a MonoQ 5/50 GL column (elution standards);

[0049] A Figura 4 é um gráfico que mostra a purificação através de coluna Superdex 200 10/300 GL (padrões de eluição);[0049] Figure 4 is a graph showing purification through a Superdex 200 10/300 GL column (elution standards);

[0050] A Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados de medi ção de pH ideal de AAT derivado de Chamaemelum nobile; e[0050] Figure 5 is a graph showing the ideal pH measurement results of AAT derived from Chamaemelum nobile; It is

[0051] A Figura 6 é um gráfico que mostra as relações entre a concentração de substrato e taxas de reação de AAT derivado de Chamaemelum nobile: o gráfico (A) mostra os resultados com o uso de metacrilil-CoA, e o gráfico (B) mostra os resultados com o uso de ace- til-CoA.[0051] Figure 6 is a graph showing the relationships between substrate concentration and reaction rates of AAT derived from Chamaemelum nobile: graph (A) shows the results using methacrylyl-CoA, and graph (B ) shows the results using acetyl-CoA.

METHODS FOR CARRYING OUT THE INVENTION

[0052] A seguir, as modalidades preferenciais da presente inven ção são descritas com referência aos desenhos. Entretanto, as moda-lidades abaixo são mostradas como exemplos que representam a pre-sente invenção, e não são destinadas a limitar o escopo da presente invenção.[0052] In the following, preferred embodiments of the present invention are described with reference to the drawings. However, the embodiments below are shown as examples representing the present invention, and are not intended to limit the scope of the present invention.

1. METHOD FOR PRODUCING METHACRYLIC ACID ESTERS USING ALCOHOL ACYLTRANSFERASE METHACRYLIC ACID ESTERS

[0053] Na presente invenção, um éster de ácido metacrílico é um composto representado pela fórmula 1 abaixo. Na fórmula 1, “R” indica um grupo de hidrocarboneto C1-C20 de cadeia linear ou ramificada. O grupo hidrocarboneto pode ser saturado ou insaturado acíclico, ou saturado ou insaturado cíclico; preferencialmente, um grupo arila, aral- quila ou alquila C1-C10 não substituído de cadeia linear ou ramificada. Especialmente preferenciais são grupos fenila, benzila ou alquila C1C8 tais como grupos metila, grupos etila, grupos n-propila, grupos iso- propila, grupos n-butila, grupos isobutila, grupos sec-butila, grupos terc-butila, grupos n-pentila, grupos isopentila, grupos terc-pentila, grupos n-hexila, grupos iso-hexila, grupos 2-hexila, grupos dimetilbuti- la, grupos etilbutila, grupos heptila, grupos octila e grupos 2-etilexila. CH2=C(CH3)COO-R (fórmula 1)[0053] In the present invention, a methacrylic acid ester is a compound represented by formula 1 below. In formula 1, “R” indicates a straight-chain or branched C1-C20 hydrocarbon group. The hydrocarbon group may be saturated or unsaturated acyclic, or saturated or unsaturated cyclic; preferably, an unsubstituted straight-chain or branched aryl, aralkyl or C1-C10 alkyl group. Especially preferred are phenyl, benzyl or C1C8 alkyl groups such as methyl groups, ethyl groups, n-propyl groups, isopropyl groups, n-butyl groups, isobutyl groups, sec-butyl groups, tert-butyl groups, n-pentyl groups. , isopentyl groups, tert-pentyl groups, n-hexyl groups, isohexyl groups, 2-hexyl groups, dimethylbutyl groups, ethylbutyl groups, heptyl groups, octyl groups and 2-ethylhexyl groups. CH2=C(CH3)COO-R (formula 1)

[0054] “Ácido metacrílico” (nome IUPAC: ácido 2-metil-2- propenoico) indica um composto que tem a fórmula abaixo, incluindo quaisquer sais ou formas ionizadas dos mesmos. Exemplos de sais de ácido metacrílico são sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio, sais de magnésio e similares. CH2=C(CH3)COOH[0054] “Methacrylic acid” (IUPAC name: 2-methyl-2-propenoic acid) indicates a compound having the formula below, including any salts or ionized forms thereof. Examples of methacrylic acid salts are sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts and the like. CH2=C(CH3)COOH

METHACRYLYL-COA

[0055] O metacrilil-CoA relacionado à presente invenção é um composto representado pela fórmula estrutural abaixo. O metacrilil- CoA é conhecido como um intermediário metabólico de valina dentro de organismos. O metacrilil-CoA usado na presente invenção também pode ser produzido por um método conhecido ou inovador. Exemplos de um método sintético conhecido são sintetizar organoquimicamente um anidrido metacrílico e coenzima A (Methods in Enzymology, 324, 73-79 (2000)), métodos com o uso de uma reação de enzima e similares. QUÍMICA 1 [0055] The methacrylyl-CoA related to the present invention is a compound represented by the structural formula below. Methacrylyl-CoA is known as a valine metabolic intermediate within organisms. The methacrylyl-CoA used in the present invention can also be produced by a known or novel method. Examples of a known synthetic method are organochemically synthesizing a methacrylic anhydride and coenzyme A (Methods in Enzymology, 324, 73-79 (2000)), methods using an enzyme reaction and the like. CHEMISTRY 1

[0056] Na presente invenção, entre esses, metacrilil-CoA trans formado a partir de isobutiril-CoA através da ação de acil-CoA desi- drogenase (EC 1.3.99.3) (doravante denominado ACD), ou metacrilil- CoA transformado a partir de 3-hidróxi-isobutiril-CoA através da ação de enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.17) (doravante denominado ECH) é preferencial. Além disso, o metacrilil-CoA usado nas modalidades da presente invenção pode ser produzido a partir de ácido 2- oxoisovalérico por meio de isobutiril-CoA. A saber, com o uso de me- tacrilil-CoA produzido a partir de isobutiril-CoA ou 3-hidróxi-isobutiril- CoA, o método relacionado à presente invenção tem a capacidade de realizar reações contínuas com enzimas, alcançando, desse modo, um aprimoramento no rendimento e uma redução de impurezas. Enquanto isso, o método tem a capacidade de produzir diretamente um éster de ácido metacrílico sem passar por uma trajetória sintética de ácido me- tacrílico, produzido ou gerado como um subproduto, que é altamente tóxico para organismos. Com o uso de o método acima relacionado à presente invenção, os ésteres de ácido metacrílico são produzidos através de reações contínuas in vivo(fermentação metabólica) com uma baixa carga ambiental.[0056] In the present invention, among these, methacrylyl-CoA transformed from isobutyryl-CoA through the action of acyl-CoA dehydrogenase (EC 1.3.99.3) (hereinafter referred to as ACD), or methacrylyl-CoA transformed from of 3-hydroxy-isobutyryl-CoA through the action of enoyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.17) (hereinafter referred to as ECH) is preferred. Furthermore, the methacrylyl-CoA used in embodiments of the present invention can be produced from 2-oxoisovaleric acid through isobutyryl-CoA. Namely, with the use of methacrylyl-CoA produced from isobutyryl-CoA or 3-hydroxyisobutyryl-CoA, the method related to the present invention has the ability to carry out continuous reactions with enzymes, thus achieving a improvement in yield and a reduction in impurities. Meanwhile, the method has the ability to directly produce a methacrylic acid ester without going through a synthetic methacrylic acid pathway, produced or generated as a by-product, which is highly toxic to organisms. With the use of the above method related to the present invention, methacrylic acid esters are produced through continuous in vivo reactions (metabolic fermentation) with a low environmental load.

ALCOHOLS, PHENOLS

[0057] Os álcoois ou fenóis, usados como matérias-primas ao pro duzir os ésteres de ácido metacrílico relacionados à presente invenção, são compostos representados pela fórmula 2 abaixo. A estrutura do álcool ou fenol corresponde a um éster de ácido metacrílico; portanto, a estrutura do mesmo é definida do mesmo modo daquela para “R” na fórmula 1, e representa um grupo hidrocarboneto C1-C20 linear ou ramificado. O grupo hidrocarboneto pode ser saturado ou insaturado acíclico, ou saturado ou insaturado cíclico. É preferencial um álcool não substituído C1-C10 linear ou ramificado, aralquil álcool ou fenol. São mais preferenciais álcoois de alquila C1-C8, álcoois benzílicos ou fenóis tais como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, terc-butanol, álcool n-pentílico, álcool isopentí- lico, álcool terc-pentílico, álcool n-hexílico, álcool isso-hexílico, álcool 2-hexílico, álcool dimetilbutílico, álcool etilbutílico, álcool heptílico, álcooloctílico e álcoois 2-etil-hexílicos. Especialmente preferenciais são álcool n-hexil, metanol, etanol, n-butanol e isobutanol. R-OH (fórmula 2)[0057] The alcohols or phenols, used as raw materials when producing the methacrylic acid esters related to the present invention, are compounds represented by formula 2 below. The structure of alcohol or phenol corresponds to a methacrylic acid ester; therefore, its structure is defined in the same way as that for “R” in formula 1, and represents a linear or branched C1-C20 hydrocarbon group. The hydrocarbon group may be saturated or unsaturated acyclic, or saturated or unsaturated cyclic. A straight or branched C1-C10 unsubstituted alcohol, aralkyl alcohol or phenol is preferred. More preferred are C1-C8 alkyl alcohols, benzyl alcohols or phenols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, tert-butanol, n-pentyl alcohol, isopentyl alcohol, tert-pentyl alcohol, n-hexyl alcohol, isohexyl alcohol, 2-hexyl alcohol, dimethylbutyl alcohol, ethylbutyl alcohol, heptyl alcohol, octyl alcohol and 2-ethylhexyl alcohols. Especially preferred are n-hexyl alcohol, methanol, ethanol, n-butanol and isobutanol. R-OH (formula 2)

ALCOHOL ACYLTRANSFERASE

[0058] O álcool aciltransferase relacionado à presente invenção (doravante denominado AAT) é uma enzima que tem atividade catalítica para sintetizar ésteres que transferem o grupo acil de acil-CoA para o álcool ou fenol. O AAT é considerado contribuir para a formação de ésteres em várias frutas. O AAT é conhecido por estar presente em plantas tais como Zingiberales (banana), Rosales (morango, maçã, pera, pêssego), Cucurbitales (melão), Ericales (quiuí), Lamiales (azeitona), Solanales (tomate) e Sapindales (limão, manga).[0058] The alcohol acyltransferase related to the present invention (hereinafter referred to as AAT) is an enzyme that has catalytic activity to synthesize esters that transfer the acyl group of acyl-CoA to alcohol or phenol. AAT is considered to contribute to the formation of esters in several fruits. AAT is known to be present in plants such as Zingiberales (banana), Rosales (strawberry, apple, pear, peach), Cucurbitales (melon), Ericales (kiwi), Lamiales (olive), Solanales (tomato) and Sapindales (lemon). , mango).

[0059] O AAT usado nas modalidades da presente invenção é de rivado de uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales e Asterales. Tal AAT não é limitado a nenhum tipo ou origem desde que tenha a capacidade de produzir um éster de ácido metacrílico a partir de meta- crilil-CoA e álcool ou fenol como matérias-primas.[0059] The AAT used in embodiments of the present invention is derived from a plant selected from a group consisting of Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales and Asterales. Such AAT is not limited to any type or origin as long as it has the ability to produce a methacrylic acid ester from methacrylyl-CoA and alcohol or phenol as raw materials.

[0060] O AAT preferencial a ser usado nas modalidades da pre sente invenção pode ser facilmente obtido a partir das plantas supra-mencionadas empregando-se o método a seguir: obter uma parte apropriada de um tecido cortando-se o tecido conforme necessário, adicionar à parte cortada uma solução contendo metacrilil-CoA e álco- ol ou fenol representados pela fórmula 2 acima, sacudir a solução e deixar que a mesma reaja durante uma duração determinada. Verificando-se a presença de um éster de ácido metacrílico na mistura de reação através de GC (cromatografia gasosa), a atividade sintética é confirmada. Mais especificamente, folhas, flores, botões de flor, polpa de fruto ou cascas de fruto, por exemplo, são cortados, aos quais uma solução contendo 0,01 a 10 mM de metacrilil-CoA, e n-butanol a 2 a 50 molar vezes a quantidade de metacrilil-CoA é adicionada e sacudida a 30 °C durante 1 a 10 horas. Após a reação estar concluída, confirmando-se a presença de um éster de ácido metacrílico através de GC, um AAT aplicável à presente invenção é alcançado.[0060] The preferred AAT to be used in embodiments of the present invention can be easily obtained from the above-mentioned plants by employing the following method: obtaining an appropriate part of a tissue by cutting the tissue as necessary, adding to the cut part a solution containing methacrylyl-CoA and alcohol or phenol represented by formula 2 above, shake the solution and allow it to react for a determined duration. By verifying the presence of a methacrylic acid ester in the reaction mixture using GC (gas chromatography), the synthetic activity is confirmed. More specifically, leaves, flowers, flower buds, fruit pulp or fruit peels, for example, are cut, to which a solution containing 0.01 to 10 mM methacrylyl-CoA, and 2 to 50 molar n-butanol times the amount of methacrylyl-CoA is added and shaken at 30 °C for 1 to 10 hours. After the reaction is completed, confirming the presence of a methacrylic acid ester through GC, an AAT applicable to the present invention is achieved.

[0061] A fonte de enzima de AAT preferencial a ser usada nas modalidades da presente invenção é uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliale e Asterales.[0061] The preferred AAT enzyme source to be used in embodiments of the present invention is a plant selected from a group consisting of Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliale and Asterales.

[0062] As plantas preferenciais que pertencem a Lamiales são Acanthaceae, Bignoniaceae, Byblidaceae, Calceolariaceae, Carle- manniaceae, Gesneriaceae, Lamiaceae, Linderniaceae, Lentibularia- ceae, Martyniaceae, Oleaceae, Orobanchaceae, Paulowniaceae, Pe- daliaceae, Phrymaceae, Plantaginaceae, Plocospermataceae, Schle- geliaceae, Scrophulariaceae, Stilbaceae, Tetrachondraceae, Thoman- dersiaceae e Verbenaceae.[0062] The preferred plants that belong to Lamiales are Acanthaceae, Bignoniaceae, Byblidaceae, Calceolariaceae, Carlemanniaceae, Gesneriaceae, Lamiaceae, Linderniaceae, Lentibulariaceae, Martyniaceae, Oleaceae, Orobanchaceae, Paulowniaceae, Pedaliaceae, Phrymaceae, Plantaginaceae, Plocospermataceae , Schlegeliaceae, Scrophulariaceae, Stilbaceae, Tetrachondraceae, Thomandersiaceae and Verbenaceae.

[0063] As plantas preferenciais que pertencem a Vitales são Vita- ceae.[0063] The preferred plants that belong to Vitales are Vitaceae.

[0064] As plantas preferenciais que pertencem a Sapindales são Anacardiaceae, Biebersteiniaceae, Burseraceae, Kirkiaceae, Meliace- ae, Nitrariaceae, Rutaceae, Sapindaceae e Simaroubaceae.[0064] The preferred plants that belong to Sapindales are Anacardiaceae, Biebersteiniaceae, Burseraceae, Kirkiaceae, Meliace-ae, Nitrariaceae, Rutaceae, Sapindaceae and Simaroubaceae.

[0065] As plantas preferenciais que pertencem a Malvales são Bi- xaceae, Cistaceae, Cytinaceae, Dipterocarpaceae, Malvaceae, Mun- tingiaceae, Neuradaceae, Sarcolaenaceae, Sphaerosepalaceae e Thymelaeaceae.[0065] The preferred plants that belong to Malvales are Bixaceae, Cistaceae, Cytinaceae, Dipterocarpaceae, Malvaceae, Muntingiaceae, Neuradaceae, Sarcolaenaceae, Sphaerosepalaceae and Thymelaeaceae.

[0066] As plantas preferenciais que pertencem a Magnoliales são Annonaceae, Degeneriaceae, Eupomatiaceae, Himantandraceae, Magnoliaceae e Myristicaceae.[0066] The preferred plants that belong to Magnoliales are Annonaceae, Degeneriaceae, Eupomatiaceae, Himantandraceae, Magnoliaceae and Myristicaceae.

[0067] As plantas preferenciais que pertencem a Asterales são Al- seuosmiaceae, Argophyllaceae, Asteraceae, Calyceraceae, Campanu- laceae, Goodeniaceae, Menyanthaceae, Pentaphragmataceae, Phelli- naceae, Rousseaceae e Stylidiaceae.[0067] The preferred plants that belong to Asterales are Alsuaosmiaceae, Argophyllaceae, Asteraceae, Calyceraceae, Campanulaceae, Goodeniaceae, Menyanthaceae, Pentaphragmataceae, Phellinaceae, Rousseaceae and Stylidiaceae.

[0068] Entre essas listadas acima, Oleaceae, Vitaceae, Rutaceae, Malvaceae, Magnoliaceae e Asteraceae são mais preferenciais.[0068] Among those listed above, Oleaceae, Vitaceae, Rutaceae, Malvaceae, Magnoliaceae and Asteraceae are more preferred.

[0069] Em particular, as plantas preferenciais que pertencem a Oleaceae são Osmanthus, Olea, Jasminum, Forsythia, Syringa, Chio- nanthus, Fraxinus e Ligustrum; uma planta preferencial que pertence a Verbenaceae é Glandularia.[0069] In particular, the preferred plants belonging to Oleaceae are Osmanthus, Olea, Jasminum, Forsythia, Syringa, Chionanthus, Fraxinus and Ligustrum; a preferred plant that belongs to Verbenaceae is Glandularia.

[0070] Uma planta preferencial que pertence a Lamiaceae é Sal via.[0070] A preferred plant that belongs to Lamiaceae is Sal via.

[0071] As plantas preferenciais que pertencem a Vitaceae são Vi- tis, Ampelopsis, Cayratia, Cissus, Cyphostemma, Leea, Parthenocis- sus e Tetrastigma.[0071] The preferred plants that belong to Vitaceae are Vitis, Ampelopsis, Cayratia, Cissus, Cyphostemma, Leea, Parthenocissus and Tetrastigma.

[0072] As plantas preferenciais que pertencem Rutaceae são Ci trus, Aegle, Zanthoxylum, Murraya, Ruta, Orixa, Skimmia, Euodia, Phellodendron, Boronia, Acronychia, Clausena, Correa, Glycosmis e Melicope.[0072] The preferred plants that belong to Rutaceae are Citrus, Aegle, Zanthoxylum, Murraya, Ruta, Orixa, Skimmia, Euodia, Phellodendron, Boronia, Acronychia, Clausena, Correa, Glycosmis and Melicope.

[0073] As plantas preferenciais que pertencem a Sapindaceae são Litchi.[0073] The preferred plants that belong to Sapindaceae are Litchi.

[0074] As plantas preferenciais que pertencem a Anacardiaceae são Mangifera.[0074] The preferred plants that belong to Anacardiaceae are Mangifera.

[0075] As plantas preferenciais que pertencem a Malvaceae são Durio, Theobroma, Abutilon, Abelmoschus, Gossypium, Pavonia, Hi-biscus, Sida e Malva.[0075] The preferred plants that belong to Malvaceae are Durio, Theobroma, Abutilon, Abelmoschus, Gossypium, Pavonia, Hi-biscus, Sida and Malva.

[0076] Uma planta preferencial que pertence a Magnoliaceae é Magnolia, e as plantas preferenciais que pertencem a Asteraceae são Chamaemelum, Achillea, Echinacea, Matricaria, Tanacetum, Taraxacum, Artemisia, Petasites, Helichrysum, Santolina, Cynara, Silybum, Calendula, Cichorium, Carthamus e Chrysanthemum.[0076] A preferred plant that belongs to Magnoliaceae is Magnolia, and preferred plants that belong to Asteraceae are Chamaemelum, Achillea, Echinacea, Matricaria, Tanacetum, Taraxacum, Artemisia, Petasites, Helichrysum, Santolina, Cynara, Silybum, Calendula, Cichorium, Carthamus and Chrysanthemum.

[0077] Entre essas acima, plantas especialmente preferenciais são aquelas que pertencem a Osmanthus, Vitis, Citrus, Durio, Magnolia ou Chamaemelum.[0077] Among those above, especially preferred plants are those belonging to Osmanthus, Vitis, Citrus, Durio, Magnolia or Chamaemelum.

[0078] Mais especificamente, as plantas preferenciais que perten cem a Osmanthus são Osmanthus asiaticus, Osmanthus fragrans, Osmanthus heterophyllus, Osmanthus marginatus, Osman- thusxfortunei e Osmanthus insularis.[0078] More specifically, the preferred plants belonging to Osmanthus are Osmanthus asiaticus, Osmanthus fragrans, Osmanthus heterophyllus, Osmanthus marginatus, Osmanthusxfortunei and Osmanthus insularis.

[0079] Uma planta preferencial que pertence a Olea é Olea euro- paea.[0079] A preferred plant that belongs to Olea is Olea europaea.

[0080] Uma planta preferencial que pertence a Salvia é Salvia splendens.[0080] A preferred plant that belongs to Salvia is Salvia splendens.

[0081] Uma planta preferencial que pertence a Glandularia é Glandulariaxhybrida.[0081] A preferred plant that belongs to Glandularia is Glandulariaxhybrida.

[0082] As plantas preferenciais que pertencem a Vitis são Vitis vi- nifera, Vitis labrusca, Vitis aestivalis, Vitis coignetiae e Vitis ficifolia.[0082] The preferred plants that belong to Vitis are Vitis vinifera, Vitis labrusca, Vitis aestivalis, Vitis coignetiae and Vitis ficifolia.

[0083] As plantas preferenciais que pertencem a Citius são Citrus limon, Citrus sudachi, Citrus sphaerocarpa, Citrusxparadisi, Citrus junos, Citrus aurantifolia, Citrus unshiu e Citrus sinensis.[0083] The preferred plants that belong to Citius are Citrus limon, Citrus sudachi, Citrus sphaerocarpa, Citrusxparadisi, Citrus junos, Citrus aurantifolia, Citrus unshiu and Citrus sinensis.

[0084] Uma planta preferencial que pertence a Aegle é Aegle marmelos.[0084] A preferred plant that belongs to Aegle is Aegle marmelos.

[0085] Uma planta preferencial que pertence Litchi é Litchi chinen- sis.[0085] A preferred plant that belongs to Litchi is Litchi chinensis.

[0086] Uma planta preferencial que pertence Mangifera é Mangife- ra indica.[0086] A preferred plant that belongs to Mangifera is Mangifera indica.

[0087] As plantas preferenciais que pertencem a Durio são Durio zibethinus, Durio testudinarius, Durio kutejensis, Durio oxleyanus, Du- rio graveolens, Durio dulcis.[0087] The preferred plants that belong to Durio are Durio zibethinus, Durio testudinarius, Durio kutejensis, Durio oxleyanus, Durio graveolens, Durio dulcis.

[0088] Uma planta preferencial que pertence a Theobroma é Theobroma cacao.[0088] A preferred plant that belongs to Theobroma is Theobroma cacao.

[0089] As plantas preferenciais que pertencem a Magnolia são Magnolia figo, Magnolia compressa, Magnolia champaca, Magnolia liliiflora, Magnolia kobus, Magnolia obovata e Magnolia laevifolia.[0089] The preferred plants that belong to Magnolia are Magnolia figo, Magnolia compressa, Magnolia champaca, Magnolia liliiflora, Magnolia kobus, Magnolia obovata and Magnolia laevifolia.

[0090] As plantas preferenciais que pertencem a Chamaemelum são Chamaemelum nobile e Chamaemelum fuscatum.[0090] The preferred plants that belong to Chamaemelum are Chamaemelum nobile and Chamaemelum fuscatum.

[0091] Entre essas listadas acima, são especialmente preferenci ais Osmanthus fragrans, Vitis vinifera, Citrusxparadisi, Durio zibethi- nus, Magnolia figo e Chamaemelum nobile.[0091] Among those listed above, Osmanthus fragrans, Vitis vinifera, Citrusxparadisi, Durio zibethinus, Magnolia figo and Chamaemelum nobile are especially preferred.

[0092] Assim como para a fonte de enzima em reações sintéticas em que um álcool C1-C2 é o substrato, se uma planta for usada conforme é, é especialmente preferencial usar uma planta que pertença a Vitis ou Durio (consulte a Tabela 1 de exemplos descritos posteriormente).[0092] Just as for the enzyme source in synthetic reactions in which a C1-C2 alcohol is the substrate, if a plant is used as is, it is especially preferred to use a plant that belongs to Vitis or Durio (see Table 1 of examples described later).

[0093] Na presente invenção, as classificações de plantas são de finidas com base no sistema APG III de classificação de planta em flo-ração (Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105121).[0093] In the present invention, plant classifications are defined based on the APG III flowering plant classification system (Botanical Journal of the Linnean Society, 2009, 161, 105121).

[0094] Na presente invenção, mediante o suprimento de um AAT para reação, o modo de uso não é particularmente limitado desde que o AAT exiba a atividade catalítica mencionada acima, e o tecido biológico contendo AAT ou produto processado do mesmo também pode ser usado conforme é. Exemplos de tais tecidos biológicos são todo um corpo de planta, órgãos de planta (tais como fruto, folha, pétala de flor, caule e semente) e tecidos de planta (tais como casca de fruta e polpa de fruta). Exemplos de produtos processados são um líquido de enzima de AAT cru extraído a partir de tais tecidos biológicos, enzima purificada dos mesmos, e similares.[0094] In the present invention, upon supplying an AAT for reaction, the mode of use is not particularly limited as long as the AAT exhibits the catalytic activity mentioned above, and the biological tissue containing AAT or processed product thereof can also be used as it is. Examples of such biological tissues are a whole plant body, plant organs (such as fruit, leaf, flower petal, stem and seed) and plant tissues (such as fruit peel and fruit pulp). Examples of processed products are raw AAT enzyme liquid extracted from such biological tissues, purified enzyme therefrom, and the like.

[0095] A purificação de AAT não é limitada a nenhum método es pecífico, mas um método de isolamento preferencial é conforme a se-guir.Após um tecido de uma planta listada acima que tem atividade de AAT ser homogenizado, o mesmo é suspenso em uma solução de tampão tal como um tampão de Tris-HCl ou tampão de fosfato. O líquido de enzima cru obtido é, então, submetido a um processo normalmente empregado para purificação de enzima, por exemplo, (1) precipitação fracionada, (2) vários tipos de cromatografia, (3) diálise, ultrafiltração e similares. Esses podem ser usados sozinhos ou em combinação com os mesmos.[0095] Purification of AAT is not limited to any specific method, but a preferred isolation method is as follows. After a tissue from a plant listed above that has AAT activity is homogenized, it is suspended in a buffer solution such as Tris-HCl buffer or phosphate buffer. The raw enzyme liquid obtained is then subjected to a process normally employed for enzyme purification, for example, (1) fractional precipitation, (2) various types of chromatography, (3) dialysis, ultrafiltration and the like. These can be used alone or in combination with them.

[0096] Um processo de purificação especificamente preferencial de AAT é conforme a seguir. Após um tecido biológico ser congelado por nitrogênio líquido ou similar e homogeneizado, AAT é extraído em uma quantidade de cinco vezes de um tampão de Tris-HCl contendo DTT (ditiotreitol) e glicerol e similares. A seguir, a cromatografia por troca iônica é conduzida no extrato de enzima cru de modo a coletar a porção não adsorvida. Assim, um extrato de enzima é obtido. Como resultado de estudo de métodos para preparar um extrato de enzima crua, constata-se que o método acima é capaz de remover o efeito negativo de polifenol contido em uma planta de modo a fornecer de modo eficiente uma qualidade consistente de extratos. Além disso, a precipitação fracionada com sulfato de amônio ou similar é também conhecida por induzir a inatividade de enzima.[0096] A specifically preferred purification process for AAT is as follows. After a biological tissue is frozen by liquid nitrogen or similar and homogenized, AAT is extracted in a fivefold amount from a Tris-HCl buffer containing DTT (dithiothreitol) and glycerol and the like. Next, ion exchange chromatography is conducted on the raw enzyme extract in order to collect the unadsorbed portion. Thus, an enzyme extract is obtained. As a result of studying methods for preparing a raw enzyme extract, it is found that the above method is capable of removing the negative effect of polyphenol contained in a plant so as to efficiently provide a consistent quality of extracts. Furthermore, fractional precipitation with ammonium sulfate or similar is also known to induce enzyme inactivity.

[0097] Usando-se cromatografia de troca iônica ou separação em coluna de gel filtração ou similar no extrato de enzima obtido, a proteína de enzima é purificada de modo eficiente.[0097] Using ion exchange chromatography or gel filtration column separation or similar on the obtained enzyme extract, the enzyme protein is efficiently purified.

[0098] As informações genéticas da proteína de AAT purificado são obtidas através de técnicas de engenharia genética. As informações genéticas, isoladas ou totalmente sintetizadas através de um método conhecido, são introduzidas em um sistema de vetor hospedeiro comum. Com o uso de um micro-organismo transformado pelo sistema de vetor, a proteína alvo é expressa e é usada para produzir um éster de ácido metacrílico relacionado à presente invenção.[0098] The genetic information of the purified AAT protein is obtained through genetic engineering techniques. Genetic information, either isolated or fully synthesized through a known method, is introduced into a common host vector system. Using a microorganism transformed by the vector system, the target protein is expressed and is used to produce a methacrylic acid ester related to the present invention.

PREFERRED ENZYMATIC PROPERTIES OF AAT TO PRODUCE METHACRYLIC ACID ESTERS

[0099] O AAT relacionado à presente invenção reage com metacri- lil-CoA na presença de álcool ou fenol de modo a catalisar uma reação para produzir éster de ácido metacrílico. É preferencial usar um AAT com a capacidade de exibir alta reatividade quando metacrilil-CoA é o substrato. Em particular, é preferencial usar um AAT que tem atividade maior em metacrilil-CoA do que em acetil-CoA, e que tem um valor Km para o metacrilil-CoA de 0,5 mM ou menor. Com o uso de AAT com as propriedades acima, um éster de ácido metacrílico é produzido com alta seletividade.[0099] The AAT related to the present invention reacts with methacrylyl-CoA in the presence of alcohol or phenol in order to catalyze a reaction to produce methacrylic acid ester. It is preferred to use an AAT with the ability to exhibit high reactivity when methacrylyl-CoA is the substrate. In particular, it is preferred to use an AAT that has greater activity on methacrylyl-CoA than on acetyl-CoA, and that has a Km value for methacrylyl-CoA of 0.5 mM or less. With the use of AAT with the above properties, a methacrylic acid ester is produced with high selectivity.

(1) SUBSTRATE SPECIFICITY

[00100] Na presente invenção, é preferencial usar um AAT que tem uma reatividade que é menor em acetil-CoA do que em metacrilil-CoA. Mais especificamente, em relação ao AAT relacionado à presente invenção, quando sua reatividade em metacrilil-CoA com n-butanol à medida que o substrato é definido como 100%, é preferencial que a reatividade em acetil-CoA seja igual ou menor, mais preferencialmente 50% ou menos, ainda mais preferencialmente 40% ou menos. Além disso, quando a reatividade em metacrilil-CoA com n-hexanol à medida que o substrato é definido como 100%, é preferencial que a reativi- dade do AAT em acetil-CoA seja igual ou menor, mais preferencialmente 70% ou menos, ainda mais preferencialmente 50% ou menos. (2) AFINIDADE PARA METACRILIL-COA[00100] In the present invention, it is preferred to use an AAT that has a reactivity that is lower in acetyl-CoA than in methacrylyl-CoA. More specifically, with respect to the AAT related to the present invention, when its reactivity in methacrylyl-CoA with n-butanol as the substrate is set to 100%, it is preferred that the reactivity in acetyl-CoA is equal to or less, more preferably 50% or less, even more preferably 40% or less. Furthermore, when the reactivity in methacrylyl-CoA with n-hexanol as the substrate is set to 100%, it is preferred that the reactivity of AAT in acetyl-CoA is equal to or less, more preferably 70% or less, even more preferably 50% or less. (2) AFFINITY FOR METHACRYLYL-COA

[00101] O AAT relacionado à presente invenção é preferencial para exibir alta afinidade para metacrilil-CoA. A afinidade para um substrato é avaliada pela constante de Michaelis (Km). O valor de Km para me- tacrilil-CoA é obtido medindo-se/calculando conforme descrito em exemplos posteriores.[00101] The AAT related to the present invention is preferred to exhibit high affinity for methacrylyl-CoA. The affinity for a substrate is evaluated by the Michaelis constant (Km). The Km value for methacrylyl-CoA is obtained by measuring/calculating as described in later examples.

[00102] O valor de Km preferencial de AAT para metacrilil-CoA re-lacionadoà presente invenção é o mesmo ou menor do que o valor de Km para acetil-CoA, preferencialmente 0,5 mM ou menos, mais prefe-rencialmente 0,2 mM ou menos, ainda mais preferencialmente 0,1 mM ou menos, de modo especialmente preferencial 0,05 mM ou menos. Quando o AAT exibe um nível de afinidade maior, as reações catalíticas supramencionadas são facilitadas até mesmo com uma baixa con-centração do metacrilil-CoA como matéria-prima. Assim, os ésteres de ácido metacrílico são produzidos de modo ainda mais eficiente.[00102] The preferred Km value of AAT for methacrylyl-CoA related to the present invention is the same or less than the Km value for acetyl-CoA, preferably 0.5 mM or less, more preferably 0.2 mM or less, even more preferably 0.1 mM or less, especially preferably 0.05 mM or less. When AAT exhibits a higher level of affinity, the aforementioned catalytic reactions are facilitated even with a low concentration of methacrylyl-CoA as raw material. Thus, methacrylic acid esters are produced even more efficiently.

RECOMBINANT MICROORGANISM FOR THE EXPRESSION OF AAT ACTIVITY

[00103] Ademais, para suprir AAT às reações, o gene do AAT é isolado e introduzido a um sistema de vetor hospedeiro convencional, que é, então, usado para transformar um micro-organismo. Os hospedeiros de bactéria são, por exemplo, E. coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces e similares; os hospedeiros de levedura são Caccharomyces, Candida, Shizosac- charomyces, Pichia e similares; e os hospedeiros de fungo filamentoso são Aspergillus e similares. Entre os mesmos, o uso de E.coli é o mais simples e mais eficiente.[00103] Furthermore, to supply AAT to reactions, the AAT gene is isolated and introduced into a conventional host vector system, which is then used to transform a microorganism. Bacteria hosts are, for example, E. coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces and the like; yeast hosts are Caccharomyces, Candida, Shizosac-charomyces, Pichia and the like; and the filamentous fungus hosts are Aspergillus and the like. Among them, the use of E.coli is the simplest and most efficient.

[00104] Os genes de AAT de algumas plantas já foram publicados. Com base em tais informações, as sondas de DNA são preparadas, e primers para PCR são formados de modo que PCR seja conduzido para isolar o gene. Além disso, a sequência de base do gene de AAT também pode ser inteiramente sintetizada por um método convencional. O método supramencionado pode ser usado para verificar se um AAT com informações de gene conhecidas tem ou não atividade sintética para produzir um éster de ácido metacrílico. Por outro lado, em relação a um AAT com informações de gene desconhecidas, o AAT é purificado e suas informações de gene são obtidas usando-se as técnicas de engenharia genética com base na proteína.[00104] The AAT genes of some plants have already been published. Based on such information, DNA probes are prepared, and primers for PCR are formed so that PCR is conducted to isolate the gene. Furthermore, the base sequence of the AAT gene can also be entirely synthesized by a conventional method. The aforementioned method can be used to verify whether or not an AAT with known gene information has synthetic activity to produce a methacrylic acid ester. On the other hand, for an AAT with unknown gene information, the AAT is purified and its gene information is obtained using protein-based genetic engineering techniques.

[00105] Na presente invenção, os genes de AAT preferenciais não são limitados especificamente desde que o AAT seja derivado de uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales e Asterales, e seu produto traduzido tem a capacidade de produzir um éster de ácido metacrílico. O gene de AAT é selecionado de modo apropriado a partir das fontes de enzima de AAT listadas acima.[00105] In the present invention, the preferred AAT genes are not specifically limited as long as the AAT is derived from a plant selected from a group consisting of Lamiales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales and Asterales, and its translated product has the ability to produce a methacrylic acid ester. The AAT gene is appropriately selected from the AAT enzyme sources listed above.

[00106] Na modalidade da presente invenção, o gene de AAT contém uma sequência de aminoácido na qual um ou diversos aminoáci- dos são substituídos por, excluídos de ou adicionados em aminoácidos em uma sequência de aminoácido do tipo selvagem. O gene de AAT também contém o gene que codifica a proteína que tem atividade para produzir um éster de ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA e álcool.[00106] In the embodiment of the present invention, the AAT gene contains an amino acid sequence in which one or several amino acids are replaced by, deleted from, or added to amino acids in a wild-type amino acid sequence. The AAT gene also contains the gene encoding the protein that has activity to produce a methacrylic acid ester from methacrylyl-CoA and alcohol.

[00107] Aqui, “diversos” significa 1 a 40, preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente 10 ou menos. A mutação pode ser introduzida em um gene através de um método conhecido tal como um método Kunkel ou um método dúplex incompleto, e com o uso de um kit de mutagênese de sítio direcionado, por exemplo, Kit de Mutagênese de Sítio Direcionado QuikChangeTM(Stratagene), Sistema de Mutagênese de Sítio Direcionado GeneTailorTM(Invitrogen), Sistema de Mutagêne- se de Sítio Direcionado TaKaRa (Mutan-K, Mutan-Super Express Km : Takara Bio). Alternativamente, todo o gene que tem uma sequência que inclui mutação pode ser sintetizado artificialmente.[00107] Here, “miscellaneous” means 1 to 40, preferably 1 to 20, more preferably 10 or less. The mutation can be introduced into a gene through a known method such as a Kunkel method or an incomplete duplex method, and with the use of a site-directed mutagenesis kit, e.g., QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) , GeneTailorTM Site Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km: Takara Bio). Alternatively, any gene that has a sequence that includes mutation can be synthesized artificially.

[00108] Nas modalidades da presente invenção, a sequência de base de DNA é confirmada por determinação de sequência através de um método convencional. Por exemplo, com base no método de San ger, a sequência pode ser confirmada com o uso de um sequenciador de DNA apropriado.[00108] In embodiments of the present invention, the DNA base sequence is confirmed by sequence determination using a conventional method. For example, based on Sanger's method, the sequence can be confirmed using an appropriate DNA sequencer.

[00109] Ademais, o gene de AAT da presente invenção contém um gene que codifica uma proteína idêntica pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 99,5%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 99,9%, à proteína que tem uma sequência de aminoácido do tipo selvagem, e que tem atividade para produzir um éster de ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA e álcool.[00109] Furthermore, the AAT gene of the present invention contains a gene that encodes a protein identical to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 99.5%, even more preferably at least 99.9 %, to the protein that has a wild-type amino acid sequence, and that has activity to produce a methacrylic acid ester from methacrylyl-CoA and alcohol.

[00110] Além disso, também incluídos no gene de AAT da presente invenção são genes que têm a capacidade de hibridizar sob condições rigorosas com um polinucleotídeo que tem uma sequência de base complementar à sequência de base do tipo selvagem, e que codificam proteína que tem atividade para produzir um éster de ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA e álcool. Em relação às condições rigorosas, um Exemplo é conforme a seguir: a hibridização é realizada mantendo-se uma membrana de náilon com DNA fixo a uma temperatura de 65 °C durante 20 horas junto com sondas em uma solução contendo 6 x SSC (1 x SSC é preparado dissolvendo-se 8,76 gramas de cloreto de sódio e 4,41 gramas de citrato de sódio em 1 litro de água), 1% de SDS, 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão, 0,1% de albumina de soro bovino, 0,1% de polivinilpirrolidona e 0,1% de ficoll. Mas essa não é a única opção. Uma pessoa versada na técnica deve ter a capacidade de definir condições para a hibridização levando-se em consideração outros termos tais como concentração de sonda, comprimento de sonda e tempo de reação além de tais condições como concentração de sal, temperatura de tampão e assim por diante. As condições de lavagem após a hibridização são, por exemplo, “2 x SSC, 0,1% de SDS, 42 °C” e “1 x SSC, 0,1% de SDS, 37 °C,” e co nforme condições mais rigorosas, por exemplo, condições tais como “1 x SSC, 0,1% de SDS, 65 °C” e “0,5 x SSC, 0,1% de SDS, 50 °C” podem ser usadas.[00110] Furthermore, also included in the AAT gene of the present invention are genes that have the ability to hybridize under stringent conditions with a polynucleotide that has a base sequence complementary to the wild-type base sequence, and that encode protein that has activity to produce a methacrylic acid ester from methacrylyl-CoA and alcohol. Regarding stringent conditions, an Example is as follows: hybridization is performed by keeping a nylon membrane with fixed DNA at a temperature of 65 °C for 20 hours together with probes in a solution containing 6 x SSC (1 x SSC is prepared by dissolving 8.76 grams of sodium chloride and 4.41 grams of sodium citrate in 1 liter of water), 1% SDS, 100 µg/ml salmon sperm DNA, 0.1% of bovine serum albumin, 0.1% of polyvinylpyrrolidone and 0.1% of giroll. But that's not the only option. A person skilled in the art should have the ability to define conditions for hybridization taking into account other terms such as probe concentration, probe length and reaction time in addition to such conditions as salt concentration, buffer temperature and so on. against. Wash conditions after hybridization are, for example, “2 x SSC, 0.1% SDS, 42 °C” and “1 x SSC, 0.1% SDS, 37 °C,” and as per conditions more stringent conditions, for example, conditions such as “1 x SSC, 0.1% SDS, 65 °C” and “0.5 x SSC, 0.1% SDS, 50 °C” can be used.

[00111] Para uma sequência detalhada do método de hibridização, refira a Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987 a 1997)) ou similares.[00111] For a detailed sequence of the hybridization method, refer to Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987 to 1997)) or similar.

[00112] Além disso, o gene de AAT relacionado à presente invenção é formado de genes pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% idênticos àqueles de uma sequência de base do tipo selvagem quando calculados com o uso de BLAST ou similar (por exemplo, padrão, ou seja, um parâmetro de definição inicial), e contém genes que codificam uma proteína que tem atividade para produzir um éster de ácido metacrílico a partir de metacrilil-CoA e álcool. Além disso, os códons dos genes de AAT mencionados acima podem ser aqueles modificados de acordo com a frequência de códon de uso no hospedeiro de micro-organismo usado em transformação genética.[00112] Furthermore, the AAT gene related to the present invention is made up of genes at least 80%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95% identical to those of a wild-type base sequence when calculated with using BLAST or similar (e.g., standard, i.e., an initial defining parameter), and contains genes encoding a protein that has activity to produce a methacrylic acid ester from methacrylyl-CoA and alcohol. Furthermore, the codons of the AAT genes mentioned above may be those modified according to the codon frequency of use in the microorganism host used in genetic transformation.

[00113] Aqui, “identidade de sequência” é definida por uma percentagem obtida quando dois conjuntos de sequências de base a serem comparadas são alinhados de modo que suas bases correspondam o máximo possível, e quando o número de bases correspondidas é dividido pelo número total de bases. Para o alinhamento mencionado acima, um vão apropriado pode ser inserido em um ou ambos dentre os dois conjuntos de sequências a serem comparados, se aplicável. Tal alinhamento de sequências pode ser realizado com o uso de um programa conhecido tal como BLAST, FASTA ou CLUSTALW, por exemplo. Quando um vão é inserido, o número total mencionado acima de bases conta o vão como um. Quando o número total de bases contadas conforme acima é diferente entre as duas sequências, a identidade de sequência (%) é calculada dividindo-se o número de correspondência de bases pelo número total de bases na sequência mais longa. O mesmo se aplica à identidade de sequências de aminoácido.[00113] Here, “sequence identity” is defined by a percentage obtained when two sets of base sequences to be compared are aligned so that their bases match as closely as possible, and when the number of bases matched is divided by the total number of bases. For the alignment mentioned above, an appropriate gap can be inserted into one or both of the two sets of sequences to be compared, if applicable. Such sequence alignment can be performed using a known program such as BLAST, FASTA or CLUSTALW, for example. When a gap is inserted, the above-mentioned total number of bases counts the gap as one. When the total number of bases counted as above is different between the two sequences, sequence identity (%) is calculated by dividing the number of base matches by the total number of bases in the longer sequence. The same applies to the identity of amino acid sequences.

[00114] Em reações sintéticas de éster de ácido metacrílico, um caldo obtido cultivando-se os micro-organismos recombinantes mencionados acima pode ser usado conforme é, ou células bacterianas co-letadasatravés de centrifugação do caldo ou produtos processados do mesmo também podem ser usadas. Exemplos de produtos processados com célula bacteriana são células bacterianas tratadas com acetona, tolueno ou similar, células bacterianas secas por congelamento, homogenados bacterianos, extrato livre de célula a partir dos homoge- nados bacterianos, enzimas cruas ou enzimas purificadas extraídas dessas células ou produtos e assim por diante.[00114] In synthetic methacrylic acid ester reactions, a broth obtained by cultivating the above-mentioned recombinant microorganisms can be used as is, or bacterial cells collected through centrifugation of the broth or processed products thereof can also be used . Examples of bacterial cell processed products are bacterial cells treated with acetone, toluene or similar, freeze-dried bacterial cells, bacterial homogenates, cell-free extract from the bacterial homogenates, raw enzymes or purified enzymes extracted from such cells or products and so on.

[00115] É uma opção sintetizar um éster de ácido metacrílico a partir de um precursor tal como isobutiril-CoA, 3-hidróxi-isobutiril-CoA, ácido 2-oxoisovalérico ou similar introduzindo-se o gene ACD, gene ECH, gene BCKAD (2-oxoisovalerato desidrogenase) ou similar em um micro-organismo com o gene de AAT introduzido, se aplicável.[00115] It is an option to synthesize a methacrylic acid ester from a precursor such as isobutyryl-CoA, 3-hydroxy-isobutyryl-CoA, 2-oxoisovaleric acid or similar by introducing the ACD gene, ECH gene, BCKAD gene ( 2-oxoisovalerate dehydrogenase) or similar in a microorganism with the introduced AAT gene, if applicable.

[00116] “Precursor” indica um composto que é induzível em meta- crilil-CoA, ou seja, isobutiril-CoA ou 3-hidróxi-isobutiril-CoA, e uma substância que é induzível nesses dois compostos.[00116] “Precursor” indicates a compound that is inducible in methacrylyl-CoA, that is, isobutyryl-CoA or 3-hydroxy-isobutyryl-CoA, and a substance that is inducible in these two compounds.

[00117] Exemplos de uma substância induzível aos dois compostos acima são ácidos tais como ácido 2-oxoisovalérico, ácido isobutírico, ácido 3-hidróxi-isobutírico, ácido acético, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido acetoacético, ácido butírico, ácido propiônico, ácido málico, áci-dofumárico, ácido cítrico e ácido succínico; aminoácidos tais como valina, alanina, leucina, lisina e ácido glutâmico; sacarídeos tais como glicose, frutose e xilose; e assim por diante.[00117] Examples of a substance inducible to the above two compounds are acids such as 2-oxoisovaleric acid, isobutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, acetic acid, pyruvic acid, lactic acid, acetoacetic acid, butyric acid, propionic acid, acid malic, fumaric acid, citric acid and succinic acid; amino acids such as valine, alanine, leucine, lysine and glutamic acid; saccharides such as glucose, fructose and xylose; and so on.

[00118] Para produzir ésteres de ácido metacrílico a partir desses precursores, é uma opção usar vários sistemas metabólicos originalmente contidos em um micro-organismo hospedeiro, ou outra opção é que o gene seja introduzido em ou excluído do micro-organismo hos- pedeiro, se aplicável.[00118] To produce methacrylic acid esters from these precursors, it is one option to use several metabolic systems originally contained in a host microorganism, or another option is for the gene to be introduced into or deleted from the host microorganism, if applicable.

2. PROCESS TO SYNTHESIS METHACRYLIC ACID ESTER

[00119] Os ésteres de ácido metacrílico são produzidos através do método a seguir: preparar uma solução ou suspensão adicionando-se metacrilil-CoA e álcool ou fenol representado pela fórmula 2 acima a um solvente; depois, levar AAT em contato com a solução ou suspensão de modo a reagir o metacrilil-CoA com o álcool ou fenol enquanto as condições tais como temperatura e similares são controladas. De acordo com tais reações, um grupo metacrílico do metacrilil-CoA é transferido para o álcool ou fenol da fórmula 2 acima, e um éster de ácido metacrílico é produzido em conformidade.[00119] Methacrylic acid esters are produced using the following method: prepare a solution or suspension by adding methacrylyl-CoA and alcohol or phenol represented by formula 2 above to a solvent; then, bring AAT into contact with the solution or suspension in order to react the methacrylyl-CoA with alcohol or phenol while conditions such as temperature and the like are controlled. According to such reactions, a methacrylic group from methacrylyl-CoA is transferred to the alcohol or phenol of formula 2 above, and a methacrylic acid ester is produced accordingly.

[00120] Uma solução contendo o metacrilil-CoA e álcool ou fenol representado pela fórmula 2 acima é normalmente preparado com o uso de um meio aquoso tal como uma solução de tampão. Aqui, a fim de facilitar a reação de maneira uniforme, a osmolaridade e/ou força iônica podem ser controladas por um regulador de pressão osmótica ou similar. Qualquer tipo de regulador de pressão osmótica pode ser adicionado desde que seja uma substância solúvel em água com a capacidade de definir a pressão osmótica do meio aquoso para ser isotônica ou hipertônica àquela do líquido dentro de células. O mesmo pode ser um sal ou sacarídeo, preferencialmente um sal. O sal é preferencialmente um sal metálico, mais preferencialmente, um sal de metal alcalino, ainda mais preferencialmente um haleto de metal alcalino; por exemplo, cloreto de sódio e cloreto de potássio podem ser usados. O sacarídeo é preferencialmente um monossacarídeo ou oligossacarí- deo, mais preferencialmente, um monossacarídeo ou dissacarídeo; por exemplo, glicose, sacarose, manitol ou similares podem ser usados. O regulador de pressão osmótica é preferencialmente adicionado a uma concentração de pelo menos 1 mM. É especialmente preferencial ajus- tar a solução para ser isotônica ou hipertônica em relação à pressão osmótica do líquido dentro da célula de um organismo vivo a ser usado.[00120] A solution containing methacrylyl-CoA and alcohol or phenol represented by formula 2 above is normally prepared using an aqueous medium such as a buffer solution. Here, in order to facilitate the reaction in a uniform manner, the osmolarity and/or ionic strength can be controlled by an osmotic pressure regulator or similar. Any type of osmotic pressure regulator can be added as long as it is a water-soluble substance with the ability to set the osmotic pressure of the aqueous medium to be isotonic or hypertonic to that of the liquid within cells. It may be a salt or saccharide, preferably a salt. The salt is preferably a metal salt, more preferably an alkali metal salt, even more preferably an alkali metal halide; for example, sodium chloride and potassium chloride can be used. The saccharide is preferably a monosaccharide or oligosaccharide, more preferably a monosaccharide or disaccharide; for example, glucose, sucrose, mannitol or the like can be used. The osmotic pressure regulator is preferably added at a concentration of at least 1 mM. It is especially preferred to adjust the solution to be isotonic or hypertonic with respect to the osmotic pressure of the liquid within the cell of a living organism to be used.

[00121] Além disso, para isolar o éster de ácido metacrílico obtido, é também uma opção adicionar um solvente orgânico antecipadamente de modo a realizar reações em um sistema bifásico. Assim como para o solvente orgânico, por exemplo, um hidrocarboneto alifático saturado ou insaturado linear, cíclico ou ramificado, hidrocarboneto aromático saturado ou insaturado ou similares podem ser usados sozinhos ou em combinação dos mesmos. Exemplos mais específicos são solventes de hidrocarboneto (tais como pentano, hexano, ciclo- hexano, benzeno, tolueno e xileno), solventes de hidrocarboneto halo- genados (tais como cloreto de metileno e clorofórmio), solventes de éter (tais como éter dietílico, éter dipropílico, éter diisopropílico, éter dibutílico, éter terc-butilmetílico e dimetoxietano), solventes de éster (tais como formato de metil, acetato de metila, acetato de etila, acetato de butila e propionato de metil), e assim por diante. Quando esses solventesorgânicos são adicionados, o éster de ácido metacrílico produzido migra para a fase orgânica, e a reação pode progredir de modo eficiente.[00121] Furthermore, to isolate the methacrylic acid ester obtained, it is also an option to add an organic solvent in advance in order to carry out reactions in a two-phase system. As for the organic solvent, for example, a linear, cyclic or branched saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon, saturated or unsaturated aromatic hydrocarbon or the like can be used alone or in combination thereof. More specific examples are hydrocarbon solvents (such as pentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene and xylene), halogenated hydrocarbon solvents (such as methylene chloride and chloroform), ether solvents (such as diethyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, tert-butylmethyl ether and dimethoxyethane), ester solvents (such as methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate and methyl propionate), and so on. When these organic solvents are added, the methacrylic acid ester produced migrates to the organic phase, and the reaction can progress efficiently.

[00122] As razões molares e concentrações de metacrilil-CoA e álcool ou fenol representadas pela fórmula 2 acima na solução de reação não são limitadas de modo particular, e podem ser definidas em qualquer taxa. Além disso, a quantidade de AAT e condições de reação são determinadas de modo apropriado com base nas matérias- primas. Normalmente, a concentração de cada matéria-prima é definida para ser 0,0000001 a 10% em massa de metacrilil-CoA, e álcool ou fenol é adicionado a uma concentração de 0,1 a 1.000 molar times, preferencialmente 0,5 a 500 molar times/, a quantidade de metacrilil- CoA.[00122] The molar ratios and concentrations of methacrylyl-CoA and alcohol or phenol represented by formula 2 above in the reaction solution are not particularly limited, and can be set at any rate. Furthermore, the amount of AAT and reaction conditions are determined appropriately based on the raw materials. Typically, the concentration of each raw material is set to be 0.0000001 to 10% by mass of methacrylyl-CoA, and alcohol or phenol is added at a concentration of 0.1 to 1,000 molar times, preferably 0.5 to 500 molar times/, the amount of methacrylyl-CoA.

[00123] Várias outras condições tais como a temperatura de reação e o tempo de reação não são especificamente limitadas e podem ser determinadas de modo apropriado com base nas matérias-primas, ati-vidadeenzimática e assim por diante; normalmente, é suficiente se a reação for realizada a 5 a 80 °C durante 1 hora a 1 semana, preferen-cialmente, a 10 a 70 °C durante 1 a 120 horas, mais preferencialmente, pelo menos 1 hora, ainda mais preferencialmente, pelo menos 3 horas. O pH da solução de reação não é particularmente limitado desde que a reação progrida de modo eficiente; entretanto, o valor de pH é preferencial ser 4 a 10, mais preferencialmente 5,0 a 9,0. As condições tais como temperatura, tempo e o pH da solução de reação são preferenciais para serem selecionadas de maneira apropriada de modo que a reação seja concluída.[00123] Various other conditions such as reaction temperature and reaction time are not specifically limited and can be determined appropriately based on raw materials, enzyme activity and so on; normally, it is sufficient if the reaction is carried out at 5 to 80 °C for 1 hour to 1 week, preferably, at 10 to 70 °C for 1 to 120 hours, more preferably, at least 1 hour, even more preferably, at least 3 hours. The pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the reaction progresses efficiently; however, the pH value is preferably 4 to 10, more preferably 5.0 to 9.0. Conditions such as temperature, time and the pH of the reaction solution are preferred to be selected appropriately so that the reaction is completed.

[00124] Preferencialmente, sob condições de pH de 5,5 a 9,0, a concentração de metacrilil-CoA é ajustada para ser direta ou indiretamente a 0,000001 a 1% em massa, e a concentração de álcool ou fe- nol é ajustada para ser 1 a 500 molar vezes a quantidade de metacrilil- CoA. Então, a reação é realizada durante pelo menos uma hora a uma temperatura definida de 20 a 40 °C. A matéria-prima (substrato) pode ser suprida de modo contínuo até alcançar as faixas acima. Ao realizar isso, a concentração acumulada do produto é aprimorada.[00124] Preferably, under pH conditions of 5.5 to 9.0, the concentration of methacrylyl-CoA is adjusted to be directly or indirectly 0.000001 to 1% by mass, and the concentration of alcohol or phenol is adjusted to be 1 to 500 molar times the amount of methacrylyl-CoA. Then, the reaction is carried out for at least one hour at a set temperature of 20 to 40 °C. The raw material (substrate) can be supplied continuously until reaching the above ranges. By doing this, the accumulated concentration of the product is improved.

[00125] É também eficaz realizar a presente reação sob pressão reduzida ou condições de aeração. Isso se deve ao fato de que o éster de ácido metacrílico produzido é isolado continuamente sob tais condições, e as reações progridem, desse modo, de maneira eficiente.[00125] It is also effective to carry out the present reaction under reduced pressure or aeration conditions. This is due to the fact that the methacrylic acid ester produced is continuously isolated under such conditions, and the reactions thus progress efficiently.

[00126] Quando os ésteres de ácido metacrílico são produzidos com o uso de metacrilil-CoA convertido através da ação de ACD a partir de isobutiril-CoA como matéria-prima ou metacrilil-CoA convertido através da ação de ECH a partir de 3-hidróxi-isobutiril-CoA, é preferencial que a reação seja realizada sob condições ajustadas para estar nas faixas acima. Aqui, as reações para sintetizar metacrilil-CoA com o uso de ACD ou ECH podem ser realizadas por um método conhecido (por exemplo, as condições de reação para ACD, as condições descritas em Microbiology (1999), 145, pp. 2323 a 2334). Ademais, em combinação com outras reações biológicas, os ésteres de ácido metacríli- co são produzidos através de reações contínuas (produção fermentati- va) em um organismo.[00126] When methacrylic acid esters are produced using methacrylyl-CoA converted through the action of ACD from isobutyryl-CoA as raw material or methacrylyl-CoA converted through the action of ECH from 3-hydroxy -isobutyryl-CoA, it is preferred that the reaction is carried out under conditions adjusted to be in the above ranges. Here, reactions to synthesize methacrylyl-CoA using ACD or ECH can be carried out by a known method (e.g., the reaction conditions for ACD, the conditions described in Microbiology (1999), 145, pp. 2323 to 2334 ). Furthermore, in combination with other biological reactions, methacrylic acid esters are produced through continuous reactions (fermentative production) in an organism.

3. METHACRYLIC ACID ESTERS COLLECTION

[00127] O éster de ácido metacrílico formado no meio de cultura ou solução de reação e sua quantidade são detectados e medidos por um método convencional tal como cromatografia líquida em alta velocidade e LC-MS. Além disso, o éster de ácido metacrílico volatilizado na fase gasosa (headspace) do recipiente de cultura ou recipiente de reação e sua quantidade são detectados e medidos por um método convencional tal como cromatografia gasosa.[00127] The methacrylic acid ester formed in the culture medium or reaction solution and its quantity are detected and measured by a conventional method such as high-speed liquid chromatography and LC-MS. Furthermore, the volatilized methacrylic acid ester in the gas phase (headspace) of the culture vessel or reaction vessel and its quantity are detected and measured by a conventional method such as gas chromatography.

[00128] O éster de ácido metacrílico é separado da solução de reação através de métodos conhecidos tais como filtração, centrifugação, concentração de vácuo, cromatografia por adsorção ou troca iônica, extração de solvente, destilação e cristalização. Esses métodos podem ser conduzidos sozinhos ou em combinação com os mesmos. O éster de ácido metacrílico obtido pode ser polimerizado por um método conhecido e usado em aplicações convencionais.[00128] The methacrylic acid ester is separated from the reaction solution by known methods such as filtration, centrifugation, vacuum concentration, adsorption or ion exchange chromatography, solvent extraction, distillation and crystallization. These methods can be conducted alone or in combination with them. The obtained methacrylic acid ester can be polymerized by a known method and used in conventional applications.

[00129] Os ésteres de ácido metacrílico obtidos conforme acima e seus polímeros reduzem de maneira significativa energia, recursos e cargas ambientais quando comparados com aqueles produzidos quimicamente a partir de petróleo e, desse modo, têm valores sociais notoriamente grandes como materiais de carga ambientalmente baixa.[00129] The methacrylic acid esters obtained as above and their polymers significantly reduce energy, resources and environmental burdens when compared to those produced chemically from petroleum and thus have notoriously great social values as low environmentally burden materials .

4. INNOVATIVE AAT AND PRODUCTION OF ORGANIC ACID ESTER WITH THE USE OF THE SAME

[00130] Um AAT inovador, conforme um aspecto da presente in- venção, e um método de produção com o uso de tal AAT inovador são descritos abaixo em detalhes.[00130] An innovative AAT, according to an aspect of the present invention, and a method of production using such an innovative AAT are described below in detail.

[00131] O AAT relacionado à presente invenção é uma enzima que catalisa reações para produzir um éster de ácido orgânico através da ação de acil-CoA na presença de álcool ou fenol.[00131] The AAT related to the present invention is an enzyme that catalyzes reactions to produce an organic acid ester through the action of acyl-CoA in the presence of alcohol or phenol.

[00132] A composição de enzima relacionada à presente invenção não é limitada a nenhum tipo particular desde que a mesma contenha AAT que tem atividade sintética para produzir um éster de ácido meta- crílico. Os exemplos são tecidos biológicos contendo AAT ou seus produtos tratados, e líquidos de enzima crus de AAT extraído a partir de tecidos biológicos ou enzimas purificadas dos mesmos. Exemplos também incluem líquido obtido cultivando-se os organismos geneticamente transformados supramencionados, células bacterianas coletadas a partir dos líquidos de cultura e seus produtos tratados, e enzimas cruas ou purificadas extraídas das células ou produtos tratados.[00132] The enzyme composition related to the present invention is not limited to any particular type as long as it contains AAT that has synthetic activity to produce a methacrylic acid ester. Examples are biological tissues containing AAT or treated products thereof, and raw enzyme liquids of AAT extracted from biological tissues or purified enzymes therefrom. Examples also include liquid obtained by cultivating the aforementioned genetically transformed organisms, bacterial cells collected from the culture liquids and treated products thereof, and raw or purified enzymes extracted from the treated cells or products.

(1) SUBSTRATE SPECIFICITY

[00133] O AAT relacionado à presente invenção tem alta reativida- de em substratos tais como metacrilil-CoA, propionil-CoA e isobutiril- CoA. A saber, o AAT tem uma atividade maior em metacrilil-CoA, pro- pionil-CoA e isobutiril-CoA do que em acetil-CoA. Mais especificamente, quando a reatividade do AAT relacionado à presente invenção em metacrilil-CoA em um substrato de n-butanol é definida a 100%, os níveis de reatividade em propionil-CoA e isobutiril-CoA são aproximadamente o mesmo, enquanto a reatividade em acetil-CoA é praticamente a mesma ou menor, mais preferencialmente 50% ou menos, ainda mais preferencialmente 40% ou menos. Ademais, em relação a esses três substratos (metacrilil-CoA, propionil-CoA e isobutiril-CoA), a reatividade de AAT em butiril-CoA e hexanoil-CoA é 50% ou menos, ou seja, tão baixa quanto em acetil-CoA.[00133] The AAT related to the present invention has high reactivity on substrates such as methacrylyl-CoA, propionyl-CoA and isobutyryl-CoA. Namely, AAT has greater activity on methacrylyl-CoA, propionyl-CoA and isobutyryl-CoA than on acetyl-CoA. More specifically, when the reactivity of the AAT related to the present invention on methacrylyl-CoA on an n-butanol substrate is set to 100%, the reactivity levels on propionyl-CoA and isobutyryl-CoA are approximately the same, while the reactivity on acetyl-CoA is practically the same or less, more preferably 50% or less, even more preferably 40% or less. Furthermore, in relation to these three substrates (methacrylyl-CoA, propionyl-CoA and isobutyryl-CoA), the reactivity of AAT in butyryl-CoA and hexanoyl-CoA is 50% or less, that is, as low as in acetyl-CoA .

(2) AFFINITY FOR METHACRYLYL-COA

[00134] O AAT relacionado à presente invenção tem uma alta afinidade para metacrilil-CoA. A afinidade para um substrato é avaliada pela constante de Michaelis (Km). O valor de Km para metacrilil-CoA é medido e calculado de acordo com exemplos descritos posteriormente.[00134] The AAT related to the present invention has a high affinity for methacrylyl-CoA. The affinity for a substrate is evaluated by the Michaelis constant (Km). The Km value for methacrylyl-CoA is measured and calculated according to examples described later.

[00135] Em relação ao AAT relacionado à presente invenção, seu valor Km para metacrilil-CoA é o mesmo ou menor do que aquele para acetil-CoA, preferencialmente 0,5 mM ou menos, mais preferencialmente 0,2 mM ou menos, ainda mais preferencialmente 0,1 mM ou menos, de modo especialmente preferencial 0,05 mM ou menos. Com um nível maior de afinidade, até mesmo quando a concentração de metacrilil-CoA como matéria-prima é baixa, as reações catalíticas su-pramencionadasprogredirão, e os ésteres de ácido metacrílico são produzidos, desse modo, de modo ainda mais eficiente.[00135] In relation to the AAT related to the present invention, its Km value for methacrylyl-CoA is the same or lower than that for acetyl-CoA, preferably 0.5 mM or less, more preferably 0.2 mM or less, even more preferably 0.1 mM or less, most preferably 0.05 mM or less. With a higher level of affinity, even when the concentration of methacrylyl-CoA as raw material is low, the above-mentioned catalytic reactions will progress, and methacrylic acid esters are thus produced even more efficiently.

(3) IDEAL REACTION PH

[00136] A reatividade a um pH do AAT relacionado à presente invenção é reconhecida em uma faixa relativamente grande, tal como pH 6 a 10,5. Os níveis de pH ideais para as reações são 7 a 9, de modo mais particular, aproximadamente 8 a 9. Especialmente, o AAT exibe a maior atividade quando um tampão Tris (tris(hidroximetil)aminometano)-HCl a pH 8,5 é usado.[00136] The pH reactivity of AAT related to the present invention is recognized in a relatively large range, such as pH 6 to 10.5. Optimal pH levels for reactions are 7 to 9, more particularly approximately 8 to 9. Especially, AAT exhibits the greatest activity when a Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane)-HCl buffer at pH 8.5 is used.

(4) ORIGIN

[00137] O AAT relacionado à presente invenção pode ser isolado de uma planta selecionada a partir de um grupo que consiste em plantas que pertencem ao Laminales, Vitales, Sapindales, Malvales, Mag- noliales e Asterales supramencionados. É preferencial que o AAT seja derivado de uma planta que pertence a Asteraceae, mais especificamente, uma planta que pertence a Chamaemelum, de modo especialmente preferencial uma planta que pertence a Chamaemelum nobile.[00137] The AAT related to the present invention can be isolated from a plant selected from a group consisting of plants belonging to the aforementioned Laminales, Vitales, Sapindales, Malvales, Magnoliales and Asterales. It is preferred that the AAT is derived from a plant belonging to Asteraceae, more specifically, a plant belonging to Chamaemelum, especially preferably a plant belonging to Chamaemelum nobile.

[00138] Conforme descrito até então, o AAT relacionado à presente invenção exibe excelentes características e é útil de maneira significa- tiva como uma enzima para sintetizar ésteres de ácido orgânico C3-C4 saturados ou insaturados. A saber, ainda se acetil-CoA indesejado for misturado na matéria-prima, o AAT relacionado à presente invenção tem a capacidade de produzir, de modo seletivo, ésteres de ácido orgânico desejados. Assim, a enzima relacionada à presente invenção exibe excelentes efeitos em aplicações em que substâncias indeseja- das podem ser misturadas (produção por fermentação de ésteres a partir de materiais de biomassa ou similares).[00138] As described so far, the AAT related to the present invention exhibits excellent characteristics and is significantly useful as an enzyme for synthesizing saturated or unsaturated C3-C4 organic acid esters. Namely, even if unwanted acetyl-CoA is mixed into the raw material, the AAT related to the present invention has the ability to selectively produce desired organic acid esters. Thus, the enzyme related to the present invention exhibits excellent effects in applications in which undesirable substances can be mixed (production by fermentation of esters from biomass materials or similar).

EXAMPLES

[00139] A seguir, a presente invenção é descrita em detalhes referindo-se aos exemplos abaixo. Entretanto, o escopo da presente invenção não é limitado ao escopo desses exemplos.[00139] In the following, the present invention is described in detail referring to the examples below. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of these examples.

EXAMPLE 1: SYNTHESIS OF BUTYL METHACRYLATE BY OSMANTHUS FRAGRANS

[00140] Em um frasco com uma capacidade de 20 ml (23x75 mm, produzido por National Scientific) para GC de espaço confinado (he-adspace), 1 grama de folhas trituradas de Osmanthus fragrans foi medido e adicionado. No frasco, 1 ml de uma solução de substrato (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 40 mM de n-butanol, 0,125 mM de metacrilil- CoA) foi adicionado. Então, o frasco foi vedado, e a mistura foi reagida a 30 °C durante 12 horas. Após a conclusão da reação, 10 µl de 10 mM 2-hexanona foi adicionado como um padrão interno, e a substância produzida foi analisada por GC-MS com o uso de um método SPME (microextração de fase sólida). Para SPME, Carboxen/PDMS (75 µm, sílica fundida, produzida por Sigma-Aldrich) foi usado, e a substância foi adsorvida a 30 °C durante 10 minutos. CONDIÇÕES PARA ANÁLISE GC-MS [00140] In a bottle with a capacity of 20 ml (23x75 mm, produced by National Scientific) for confined space GC (he-adspace), 1 gram of crushed leaves of Osmanthus fragrans was measured and added. In the flask, 1 ml of a substrate solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM n-butanol, 0.125 mM methacrylyl-CoA) was added. Then, the vial was sealed, and the mixture was reacted at 30 °C for 12 hours. After completion of the reaction, 10 µl of 10 mM 2-hexanone was added as an internal standard, and the substance produced was analyzed by GC-MS using an SPME (solid phase microextraction) method. For SPME, Carboxen/PDMS (75 µm, fused silica, produced by Sigma-Aldrich) was used, and the substance was adsorbed at 30 °C for 10 minutes. CONDITIONS FOR GC-MS ANALYSIS

[00141] Além disso, com o uso de uma solução de metacrilato de butila de 0,1 mM (50 mM de Tris-HCl, pH 8,5), a reação de hidrólise de um éster de ácido metacrílico usando-se uma folha de Osmanthus fra- grans foi confirmada. A reação foi realizada a 30 °C durante 12 horas.[00141] Furthermore, with the use of a 0.1 mM butyl methacrylate solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.5), the hydrolysis reaction of a methacrylic acid ester using a sheet of Osmanthus fragrans was confirmed. The reaction was carried out at 30 °C for 12 hours.

[00142] A quantidade de éster de ácido metacrílico produzida foi calculada por uma curva de calibração preparada por um método padrão interno. Uma solução padrão em cada nível de concentração foi preparada no mesmo volume e recipiente, à qual 10 µl de 10 mM 2- hexanona foi adicionado como um padrão interno, e a mistura de reação foi analisada por métodos SPME e GC-MS (n=3). A substância produzida foi confirmada comparando-se seu tempo de retenção e espectro de massa com aqueles do padrão. Além disso, um espaço vazio (nenhum substrato) foi analisado ao mesmo tempo e nenhuma produção de metacrilato de butila foi confirmada. O resultado é mostrado na Tabela 1. Uma produção de 0,7 µM de metacrilato de butila pela ação de Osmanthus fragrans foi confirmada. TABELA 1 [00142] The amount of methacrylic acid ester produced was calculated by a calibration curve prepared by an internal standard method. A standard solution at each concentration level was prepared in the same volume and container, to which 10 µl of 10 mM 2-hexanone was added as an internal standard, and the reaction mixture was analyzed by SPME and GC-MS methods (n= 3). The substance produced was confirmed by comparing its retention time and mass spectrum with those of the standard. Furthermore, a void (no substrate) was analyzed at the same time and no production of butyl methacrylate was confirmed. The result is shown in Table 1. A production of 0.7 µM of butyl methacrylate by the action of Osmanthus fragrans was confirmed. TABLE 1

[00143] A Tabela 2 mostra a atividade de decomposição em meta- crilato de butila pela folha de Osmanthus fragrans. Uma redução signi-ficativa em metacrilato de butila foi confirmada. A taxa de produção de um éster de ácido metacrílico pela ação de AAT derivado de Osman- thus fragrans foi indicada ser maior do que a taxa de decomposição do éster de ácido metacrílico pela estrase ou similar contida no mesmo tecido de planta. TABELA 2 [00143] Table 2 shows the decomposition activity in butyl methacrylate by the Osmanthus fragrans leaf. A significant reduction in butyl methacrylate was confirmed. The rate of production of a methacrylic acid ester by the action of AAT derived from Osmanthus fragrans was indicated to be greater than the rate of decomposition of the methacrylic acid ester by estrase or similar contained in the same plant tissue. TABLE 2

EXAMPLE 2: SYNTHESIS OF METHYL METHACRYLATE BY VITIS VINIFERA

[00144] Um grama de uma fruta finamente cortada de uva com casca (uva de mesa: Vitis vinifera) foi medido em um frasco, ao qual 0,5 ml de uma solução de substrato (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 40 mM de metanol, 10 mM de metacrilil-CoA) foi adicionado. O frasco foi, então, vedado e a mistura foi reagida a 30 °C durante 12 horas. A mesma análise conforme no Exemplo 1 foi conduzida, e uma produção de 0,8 µM de metacrilato de metila foi confirmada (Tabela 1).[00144] One gram of a finely cut unpeeled grape fruit (table grape: Vitis vinifera) was measured into a vial, to which 0.5 ml of a substrate solution (50 mM Tris-HCl (pH 8, 5), 40 mM methanol, 10 mM methacrylyl-CoA) was added. The vial was then sealed and the mixture was reacted at 30°C for 12 hours. The same analysis as in Example 1 was conducted, and a production of 0.8 µM methyl methacrylate was confirmed (Table 1).

[00145] Além disso, com o uso de uma solução de 0,1 mM de me- tacrilato de metila (50 mM de Tris-HCl, pH 8,5), a reação de hidrólise de um éster de ácido metacrílico foi confirmada. A reação foi realizada a 30 °C durante 3 horas. O resultado é mostrado na Tabela 2.[00145] Furthermore, with the use of a 0.1 mM solution of methyl methacrylate (50 mM Tris-HCl, pH 8.5), the hydrolysis reaction of a methacrylic acid ester was confirmed. The reaction was carried out at 30 °C for 3 hours. The result is shown in Table 2.

EXAMPLE 3: SYNTHESIS OF BUTYL METHACRYLATE BY VITIS VINIFERA

[00146] A reação foi realizada do mesmo modo conforme no Exemplo 2 exceto que o metanol foi substituído por n-butanol. Como resultado, uma produção de 9,0 µm de metacrilato de butila foi confirmada. A reação de hidrólise do éster de ácido metacrílico também foi confirmada do mesmo modo conforme no Exemplo 2.[00146] The reaction was carried out in the same way as in Example 2 except that methanol was replaced by n-butanol. As a result, a production of 9.0 µm of butyl methacrylate was confirmed. The hydrolysis reaction of methacrylic acid ester was also confirmed in the same way as in Example 2.

EXAMPLE 4: SYNTHESIS OF HEXYL METHACRYLATE BY CITRUSxPARADISI

[00147] Dois gramas de saco de suco solto de uma fruta Ci- trusxparadisi foi medido em um frasco, ao qual 0,5 ml de uma solução de substrato (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5, 40 mM de n-hexanol, 10 mM de metacrilil-CoA) foi adicionado. O frasco foi vedado e a mistura foi reagida a 30 °C durante 12 horas. A mesma análise conforme no Exemplo 1 foi realizada, e uma produção de 0,3 µM de metacrilato de hexila foi confirmada.[00147] Two grams of loose juice bag from a Citrusxparadisi fruit was measured into a flask, to which 0.5 ml of a substrate solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.5, 40 mM n -hexanol, 10 mM methacrylyl-CoA) was added. The vial was sealed and the mixture was reacted at 30 °C for 12 hours. The same analysis as in Example 1 was performed, and a production of 0.3 µM methacrylate of hexyl was confirmed.

EXAMPLE 5: SYNTHESIS OF ETHYL METHACRYLATE BY DURIO ZIBETHINUS

[00148] Um grama de uma fruta Durio zibethinus foi finamente fatiado e medido em um frasco, ao qual 0,5 ml de uma solução de substrato (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5, 40 mM de etanol, 0,125 mM de me- tacrilil-CoA) foi adicionado. O frasco foi vedado e a mistura foi reagida a 30 °C durante 3 horas. A mesma análise conforme no Exemplo 1 foi realizada, e a produção de 6,7 µM de metacrilato de etila foi confirmada.[00148] One gram of a Durio zibethinus fruit was finely sliced and measured into a vial, to which 0.5 ml of a substrate solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.5, 40 mM ethanol, 0.125 mM of methacrylyl-CoA) was added. The vial was sealed and the mixture was reacted at 30 °C for 3 hours. The same analysis as in Example 1 was performed, and the production of 6.7 µM ethyl methacrylate was confirmed.

[00149] Além disso, com o uso de uma solução de metacrilato de etila de 0,1 mM (50 mM de Tris-HCl, pH 8,5), a reação de hidrólise de um éster de ácido metacrílico foi confirmada. A reação foi realizada a 30 °C durante 3 horas. O resultado é mostrado na Tabela 2.[00149] Furthermore, with the use of a 0.1 mM ethyl methacrylate solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.5), the hydrolysis reaction of a methacrylic acid ester was confirmed. The reaction was carried out at 30 °C for 3 hours. The result is shown in Table 2.

EXAMPLE 6: SYNTHESIS OF BUTYL METHACRYLATE BY DURIO ZIBETHINUS

[00150] A reação foi realizada do mesmo modo conforme no Exemplo 5 exceto que o etanol foi substituído por n-butanol. Como resultado, a produção de 14 µM de metacrilato de butila foi confirmada. A reação de hidrólise do éster de ácido metacrílico também foi confirmada ser a mesma conforme no Exemplo 5.[00150] The reaction was carried out in the same way as in Example 5 except that the ethanol was replaced by n-butanol. As a result, the production of 14 µM butyl methacrylate was confirmed. The hydrolysis reaction of methacrylic acid ester was also confirmed to be the same as in Example 5.

EXAMPLE 7: SYNTHESIS OF BUTYL METHACRYLATE BY MAGNOLIA FIGO

[00151] Um grama e 0,5 grama respectivamente de folha fatiada e botão de flor de Magnolia figo foram medidos em frascos, aos quais 1 ml de uma solução de substrato (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 40 mM de n-butanol, 0,125 mM de metacrilil-CoA) foi adicionado. Os frascos foram vedados e as misturas foram reagidas a 30 °C durante 12 horas. A mesma análise conforme no Exemplo 1 foi realizada, e as produções de 4,4 µM e 0,4 µM de metacrilato de butila foram confirmadas respec-tivamente.[00151] One gram and 0.5 grams respectively of sliced leaf and flower bud of Magnolia fig were measured into vials, to which 1 ml of a substrate solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM n-butanol, 0.125 mM methacrylyl-CoA) was added. The vials were sealed and the mixtures were reacted at 30°C for 12 hours. The same analysis as in Example 1 was carried out, and the productions of 4.4 µM and 0.4 µM of butyl methacrylate were confirmed respectively.

[00152] Além disso, com o uso de uma solução de 0,01 mM de me- tacrilato de butila (50 mM de Tris-HCl, pH 8,5), a reação de hidrólise de um éster de ácido metacrílico foi confirmada. A reação foi realizada a 30 °C durante 12 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 2.[00152] Furthermore, with the use of a solution of 0.01 mM butyl methacrylate (50 mM Tris-HCl, pH 8.5), the hydrolysis reaction of a methacrylic acid ester was confirmed. The reaction was carried out at 30 °C for 12 hours. The results are shown in Table 2.

EXAMPLE 8: SYNTHESIS OF BUTYL METHACRYLATE BY CHAMAEMELUM NOBILE

[00153] Em um frasco, 0,5 grama de folha triturada de Chamaeme- lum nobile foi medido, ao qual 0,5 ml de uma solução de substrato (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 40 mM de n-butanol, 0,125 mM de metacrilil- CoA) foi adicionado. O frasco foi vedado e a mistura foi reagida a 30 °C durante 12 horas. A mesma análise conforme no Exemplo 1 foi realizada, e a produção de 6,7 µM de metacrilato de butila foi confirmada.[00153] In a vial, 0.5 grams of crushed Chamaemelum nobile leaf was measured, to which 0.5 ml of a substrate solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM n-butanol, 0.125 mM methacrylyl-CoA) was added. The vial was sealed and the mixture was reacted at 30°C for 12 hours. The same analysis as in Example 1 was performed, and the production of 6.7 µM butyl methacrylate was confirmed.

[00154] Além disso, com o uso de uma solução de 0,1 mM de me- tacrilato de butila (50 mM de Tris-HCl, pH 8,5), a reação de hidrólise de um éster de ácido metacrílico foi confirmada. A reação foi realizada a 30 °C durante 3 horas. O resultado é mostrado na Tabela 2.[00154] Furthermore, with the use of a 0.1 mM butyl methacrylate solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.5), the hydrolysis reaction of a methacrylic acid ester was confirmed. The reaction was carried out at 30 °C for 3 hours. The result is shown in Table 2.

EXAMPLE 9: PURIFICATION OF AAT DERIVED FROM CHAMAEMELUM NOBILE

[00155] A menos que especificado de outra maneira, as enzimas foram purificadas a uma temperatura de 4 °C ou menos. A atividade de AAT em cada fração foi analisada através de GC com o uso de n- butanol e metacrilil-CoA como o substrato.[00155] Unless otherwise specified, enzymes were purified at a temperature of 4 °C or less. AAT activity in each fraction was analyzed via GC using n-butanol and methacrylyl-CoA as the substrate.

(1) PREPARATION OF RAW ENZYME LIQUID

[00156] Em nitrogênio líquido, 38 gramas de folhas de Chamaeme- lum nobile foram transformadas em pó. O pó foi, então, suspenso em 190 ml de tampão de extração (10% de glicerol, 5 mM de ditiotreitol (DTT), 5% de polivinilpirrolidona, e 250 mM de Tris-HCl (pH 7,5)) e a suspensão foi filtrada através de uma gaze de quatro camadas. O filtrado foi centrifugado a 15.000 g durante 15 minutos. Assim, um líquido de enzima cru foi obtido.[00156] In liquid nitrogen, 38 grams of Chamaemelum nobile leaves were transformed into powder. The powder was then suspended in 190 ml of extraction buffer (10% glycerol, 5 mM dithiothreitol (DTT), 5% polyvinylpyrrolidone, and 250 mM Tris-HCl (pH 7.5)) and the suspension was filtered through four-layer gauze. The filtrate was centrifuged at 15,000 g for 15 minutes. Thus, a crude enzyme liquid was obtained.

(2) METHOD FOR DETERMINING AAT ACTIVITY

[00157] Em um frasco rosqueado com capacidade de 2 ml (Auto-samplerVials, produzidos por National Scientific), 500 µl de uma solução de reação (50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM de n-butanol, 0,12 mM de metacrilil-CoA) foi preparado. Então, a enzima purificada em cada uma dentre as etapas (3) a (6) abaixo foi adicionada, o frasco foi vedado, e a mistura foi reagida a 30 °C durante uma hora.[00157] In a screw-top vial with a capacity of 2 ml (Auto-samplerVials, produced by National Scientific), 500 µl of a reaction solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM n-butanol , 0.12 mM methacrylyl-CoA) was prepared. Then, the enzyme purified in each of steps (3) to (6) below was added, the vial was sealed, and the mixture was reacted at 30 ° C for one hour.

[00158] Após a reação, 50 µl de 10 mM 2-hexanona foi adicionado como o padrão interno, e a extração de solvente foi realizada com o uso de 200 µl de octano. A mistura foi centrifugada e 8 µl do líquido separado foi injetado em GC, e a quantidade de metacrilato de butila produzida na reação enzimática foi medida. A quantidade de éster de ácido metacrílico foi medida pela curva de calibração preparada com o uso de um método padrão interno. CONDIÇÕES DE ANÁLISE DE GC [00158] After the reaction, 50 µl of 10 mM 2-hexanone was added as the internal standard, and solvent extraction was performed using 200 µl of octane. The mixture was centrifuged and 8 µl of the separated liquid was injected into GC, and the amount of butyl methacrylate produced in the enzymatic reaction was measured. The amount of methacrylic acid ester was measured by the calibration curve prepared using an internal standard method. GC ANALYSIS CONDITIONS

(3) DEAE-TOYOPEARL COLUMN PURIFICATION (TWICE)

[00159] O líquido de enzima crua foi suprido a uma coluna de DEAE-Toyopearl (20 ml), que foi equilibrada com um tampão de 250 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 10% de glicerol e 2 mM de DTT. A fração de fluxo atravessante foi coletada e submetida à diálise contra um tampão de 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 10% de glicerol e 2 mM de DTT (doravante denominado tampão B).[00159] The crude enzyme liquid was supplied to a DEAE-Toyopearl column (20 ml), which was equilibrated with a 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10% glycerol and 2 mM DTT. The flow-through fraction was collected and dialyzed against a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10% glycerol and 2 mM DTT (hereinafter referred to as buffer B).

[00160] Além disso, a fração dialisada foi suprida novamente para uma coluna de DEAE-Toyopearl (10 ml) equilibrada com tampão B. A fração foi bem lavada com tampão B e, então, eluída com um gradiente linear de cloreto de sódio elevado de 0 M a 0,3 M. O eluato foi dividido em frações de 5,5 ml. Os padrões de eluição são mostrados na Figura 1. A fração ativa de AAT obtida foi coletada e dialisada contra o tampão B. No gráfico, para “atividade de AAT” (pontos brancos), a quantidade de enzima para produzir 1 µmol de éster por minuto foi definida como 1 U. A “concentração de proteína” (pontos pretos) foi medidaatravés de um Kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, USA) que usa albumina de soro bovino como o padrão.[00160] Additionally, the dialyzed fraction was fed back to a DEAE-Toyopearl column (10 ml) equilibrated with buffer B. The fraction was washed well with buffer B and then eluted with a high sodium chloride linear gradient from 0 M to 0.3 M. The eluate was divided into 5.5 ml fractions. The elution patterns are shown in Figure 1. The active AAT fraction obtained was collected and dialyzed against buffer B. In the graph, for “AAT activity” (white dots), the amount of enzyme to produce 1 µmol of ester per minute was defined as 1 U. “Protein concentration” (black dots) was measured using a Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) that uses bovine serum albumin as the standard.

(4) Q SEPHAROSE COLUMN PURIFICATION

[00161] A fração ativa AAT dialisada foi suprida em uma coluna de Q Sepharose (10 ml) equilibrada com tampão B. O líquido foi bem lavado com tampão B, e, então, eluído com um gradiente linear de cloreto de sódio elevado a 0 M a 0,3 M. O eluato foi dividido em frações de 5,5 ml. Os padrões de eluição são mostrados na Figura 2. Então, a fração ativa de AAT obtida foi coletada e dialisada contra um tampão de 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 2 mM de DTT (doravante denominadotampão C).[00161] The dialyzed AAT active fraction was supplied onto a Q Sepharose column (10 ml) equilibrated with buffer B. The liquid was washed well with buffer B, and then eluted with a linear gradient of sodium chloride raised to 0 M to 0.3 M. The eluate was divided into 5.5 ml fractions. The elution patterns are shown in Figure 2. Then, the obtained AAT active fraction was collected and dialyzed against a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 2 mM DTT (hereinafter referred to as buffer C).

(5) PURIFICATION BY MONOQ COLUMN 5/50 GL

[00162] A fração ativa de AAT dialisado obtida pela cromatografia em coluna de Q Sepharose foi suprida em uma coluna de MonoQ 5/50 GL (1 ml) equilibrada com tampão C e, então, eluída com um gradiente linear de cloreto de sódio elevado de 0 M a 0,5 M. Os padrões de elui- ção são mostrados na Figura 3. A fração ativa de AAT foi coletada e concentrada com o uso de filtro centrífugo Amicon Ultra-0,5 ml. A purificação pela presente coluna foi conduzida com o uso de um AKTA Explorer 10S (GE Healthcare) sob uma condição de taxa de fluxo de 0,5 ml/min. O eluato foi dividido em frações de 0,5 ml.[00162] The active fraction of dialyzed AAT obtained by Q Sepharose column chromatography was supplied to a MonoQ 5/50 GL column (1 ml) equilibrated with buffer C and then eluted with a high sodium chloride linear gradient from 0 M to 0.5 M. The elution patterns are shown in Figure 3. The active AAT fraction was collected and concentrated using an Amicon Ultra-0.5 ml centrifugal filter. Purification by the present column was conducted using an AKTA Explorer 10S (GE Healthcare) under a flow rate condition of 0.5 ml/min. The eluate was divided into 0.5 ml fractions.

(6) PURIFICATION BY SUPERDEX 200 COLUMN 10/300 GL

[00163] A fração ativa de AAT concentrado obtida pela cromatogra- fia em coluna de MonoQ 5/50 GL foi suprida a uma coluna de Superdex 200 10/300 GL equilibrada com tampão C contendo 0,3 M de cloreto de sódio. A purificação pela presente coluna foi conduzida sob uma condição de taxa de fluxo de 0,5 ml/min com o uso de AKTA Explorer 10S e o eluato foi dividido em frações de 0,5 ml. Os padrões de eluição são mostrados na Figura 4. A fração ativa de AAT foi coletada e submetida à diálise contra tampão B.[00163] The active fraction of concentrated AAT obtained by chromatography on a MonoQ 5/50 GL column was supplied to a Superdex 200 10/300 GL column equilibrated with buffer C containing 0.3 M sodium chloride. Purification by the present column was conducted under a flow rate condition of 0.5 ml/min using AKTA Explorer 10S and the eluate was divided into 0.5 ml fractions. The elution patterns are shown in Figure 4. The active AAT fraction was collected and dialyzed against buffer B.

(7) SUMMARY OF EACH PURIFICATION STAGE

[00164] A Tabela 3 mostra a quantidade coletada e a atividade da composição de enzima em cada estágio de purificação. Após realizar a separação de coluna cinco vezes, 201 mU/mg de AAT foi obtido e puri-ficado para ter 209 vezes a atividade inicial. TABELA 3 [00164] Table 3 shows the amount collected and the activity of the enzyme composition at each stage of purification. After performing column separation five times, 201 mU/mg of AAT was obtained and purified to have 209 times the initial activity. TABLE 3

EXAMPLE 10: SPECIFICITY OF AAT SUBSTRATE DERIVED FROM CHAMAEMELUM NOBILE

[00165] A especificidade de substrato de AAT foi avaliada pela fração purificada obtida pela cromatografia em coluna MonoQ 5/50 GL no Exemplo 9.[00165] The substrate specificity of AAT was evaluated by the purified fraction obtained by MonoQ 5/50 GL column chromatography in Example 9.

[00166] Em um frasco rosqueado de capacidade de 2 ml, uma solução de reação (50 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 40 mM de álcool, 0,12 mM de acil-CoA) foi preparada, na qual a fração purificada foi adicionada para ser 500 µl. O frasco foi vedado e a mistura foi reagida a 30 °C durante uma hora.[00166] In a screw-top flask with a capacity of 2 ml, a reaction solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM alcohol, 0.12 mM acyl-CoA) was prepared, in which the purified fraction was added to be 500 µl. The vial was sealed and the mixture was reacted at 30°C for one hour.

[00167] Após a reação estar concluída, 50 µl de 10 mM 2-hexanona foi adicionado como o padrão interno, e a extração de solvente foi conduzida com o uso de 200 µl de octano ou hexano. A centrifugação foi conduzida e 8 µl do líquido separado foi injetado em GC para medir o éster produzido através da reação enzimática. A quantidade de éster foi calculada pela curva de calibração com o uso de um método padrão interno. As condições de medição de GC foram definidas da mesma maneira conforme no Exemplo 9 exceto que a temperatura de coluna foi ajustada de modo apropriado para cada um dentre os ésteres alvo (consulte a Tabela 4). Para determinar a quantidade de n-butil propionato, visto que a presente coluna é incapaz de separar seu pico do pico de n-butanol, o método de curva de calibração absoluto foi empregado sob as condições de análise GC-MS iguais conforme no Exemplo 1 (entretanto, as condições de temperatura foram alteradas para 80 °C-1 min^W °C/min^200 °C-5 min). TABELA 4 [00167] After the reaction was complete, 50 µl of 10 mM 2-hexanone was added as the internal standard, and solvent extraction was conducted using 200 µl of octane or hexane. Centrifugation was conducted and 8 µl of the separated liquid was injected into GC to measure the ester produced through the enzymatic reaction. The amount of ester was calculated from the calibration curve using an internal standard method. The GC measurement conditions were set in the same manner as in Example 9 except that the column temperature was adjusted appropriately for each of the target esters (see Table 4). To determine the amount of n-butyl propionate, since the present column is unable to separate its peak from the n-butanol peak, the absolute calibration curve method was employed under the same GC-MS analysis conditions as in Example 1 (However, the temperature conditions were changed to 80 °C-1 min^W °C/min^200 °C-5 min). TABLE 4

[00168] Os resultados são mostrados na Tabela 5. Os valores de atividade relativos são mostrados com base na atividade específica de metacrilato de butila definida como 100%. TABELA 5 *N.D= não detectado, N.T= não conduzido[00168] The results are shown in Table 5. Relative activity values are shown based on the specific activity of butyl methacrylate set to 100%. TABLE 5 *ND= not detected, NT= not driven

EXAMPLE 11: IDEAL PH OF AAT DERIVED FROM CHAMAEMELUM NOBILE

[00169] O pH ideal foi avaliado na fração purificada obtida por cro- matografia em coluna MonoQ 5/50 GL no Exemplo 9.[00169] The ideal pH was evaluated in the purified fraction obtained by chromatography on a MonoQ 5/50 GL column in Example 9.

[00170] Com o uso de um tampão de acetato, tampão PIPES (peperazina-1,4-bis(ácido 2-etanossulfônico)), tampão Tris (tris(hidroximetil)aminometano)-HCl ou tampão de glicina-hidróxido de sódio, uma composição de reação contendo 40 mM de n-butanol e 0,12 mM de metacrilil-CoA foram cada uma preparadas. A concentração de cada tampão foi definida a 50 mM. Então, a fração purificada foi adicionada a cada composição de reação para ser 500 µl. O frasco foi vedado, e a reação foi realizada a 30 °C durante uma hora.[00170] With the use of an acetate buffer, PIPES buffer (peperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)), Tris buffer (tris(hydroxymethyl)aminomethane)-HCl or glycine-sodium hydroxide buffer, a reaction composition containing 40 mM n-butanol and 0.12 mM methacrylyl-CoA were each prepared. The concentration of each buffer was set at 50 mM. Then, the purified fraction was added to each reaction composition to be 500 µl. The vial was sealed, and the reaction was carried out at 30 °C for one hour.

[00171] Após a reação estar concluída, a análise de GC, a mesma conforme no Exemplo 9, foi conduzida para medir metacrilato de butila produzido na reação enzimática. Os resultados são mostrados na Figura 5. No gráfico, os círculos indicam o resultado no tampão de acetato, quadrados indicam o resultado no tampão PIPES, os triângulos indicam o resultado no tampão Tris (tris(hidroximetil)aminometano)- HCl, e os hexágonos indicam o resultado no tampão de glicina- hidróxido de sódio. O pH ideal foi 8~9.[00171] After the reaction was completed, GC analysis, the same as in Example 9, was conducted to measure butyl methacrylate produced in the enzymatic reaction. The results are shown in Figure 5. In the graph, circles indicate the result in acetate buffer, squares indicate the result in PIPES buffer, triangles indicate the result in Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)-HCl buffer, and hexagons indicate the result in the glycine-sodium hydroxide buffer. The ideal pH was 8~9.

EXAMPLE 12: KM OF AAT DERIVED FROM CHAMAEMELUM NOBILE

[00172] Os valores de Km para metacrilil-CoA e acetil-CoA foram medidos com o uso da fração purificada obtida por cromatografia em coluna MonoQ 5/50 GL no Exemplo 9. Uma solução de reação de 500 µl foi preparada adicionando-se a fração purificada, 40 mM de n- hexanol e metacrilil-CoA ou acetil-CoA em cada concentração a um tampão de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,5). O frasco foi vedado, e a reação foi realizada a 30 °C durante 2 horas.[00172] The Km values for methacrylyl-CoA and acetyl-CoA were measured using the purified fraction obtained by MonoQ 5/50 GL column chromatography in Example 9. A 500 µl reaction solution was prepared by adding to purified fraction, 40 mM n-hexanol and methacrylyl-CoA or acetyl-CoA at each concentration in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). The vial was sealed, and the reaction was carried out at 30 °C for 2 hours.

[00173] Após a reação estar concluída, a mesma análise de GC conforme no Exemplo 10 foi conduzida para medir o éster produzido na reação enzimática. Os resultados são mostrados na Figura 6. A constante de taxa (Km) foi aplicada a uma expressão Michaelis- Menten para calcular os valores com o uso de um software Kaleida- graph produzido por HULINKS. Assim, o valor Km para metacrilil-CoA foi determinado ser 0,041 mM, e o valor Km para acetil-CoA foi 0,711 mM.[00173] After the reaction was completed, the same GC analysis as in Example 10 was conducted to measure the ester produced in the enzymatic reaction. The results are shown in Figure 6. The rate constant (Km) was applied to a Michaelis-Menten expression to calculate the values using Kaleida-graph software produced by HULINKS. Thus, the Km value for methacrylyl-CoA was determined to be 0.041 mM, and the Km value for acetyl-CoA was 0.711 mM.

Claims

1. Method for producing a methacrylic acid ester, characterized by the fact that it comprises: synthesizing a methacrylic acid ester by reacting alcohol or phenol with methacrylyl-CoA in the presence of an alcohol acyltransferase derived from a plant belonging to the genus Osmanthus or Magnolia, in which the alcohol acyltransferase is derived from Osmanthus fragrans or Magnolia fig.