BR112016013704B1

BR112016013704B1 - ANTI-TROP2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE, ANTITUMOR AND/OR ANTI-CANCER DRUG, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF.

Info

Publication number: BR112016013704B1
Application number: BR112016013704-3A
Authority: BR
Inventors: Toshinori Agatsuma; Shu Takahashi; Jun Hasegawa; Daisuke Okajima; Hirofumi Hamada; Miki YAMAGUCHI
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited; Sapporo Medical University
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2023-07-25

Abstract

CONJUGADO DE ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-TROP2. O propósito da presente invenção é fornecer um fármaco antitumor que se dintingue no efeito antitumor e segurança, e que tem um excelente efeito terapêutico. É fornecido um conjugado de anticorpo-fármaco caracterizado pelo fato de que um composto antitumor representado por uma fórmula e um anticorpo anti-TROP2 são ligados por um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C (=O)- (em que o anticorpo anti-TROP2 liga-se ao terminal de L1, e o composto antitumor liga-se ao grupo carbonila da porção -(CH2)n2-C(=O)- usando o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como o sítio de ligação).ANTI-TROP2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE. The purpose of the present invention is to provide an antitumor drug which is distinguished in antitumor effect and safety, and which has an excellent therapeutic effect. An antibody-drug conjugate is provided, characterized in that an antitumor compound represented by the formula and an anti-TROP2 antibody are linked by a linker having a structure represented by the formula: -L1-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-(CH2)n2-C (=O)- (in which the anti-TROP2 antibody binds to the terminus of L1, and the antitumor compound binds to the carbonyl group of the -(CH2)n2-C moiety (=O)- using the nitrogen atom of the amino group in position 1 as the binding site).

Description

Technical Field

[001] A presente invenção presente invenção refere-se a um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um fármaco antitumor conjugado a um anticorpo anti-TROP2 por uma porção de estrutura de ligante, o ser conjugado útil como um fármaco antitumor.[001] The present invention relates to an antibody-drug conjugate having an antitumor drug conjugated to an anti-TROP2 antibody by a linker structure portion, the conjugate being useful as an antitumor drug.

Background Technique

[002] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) tendo um fármaco com citotoxicidade conjugada a um anticorpo cujo antígeno também é expresso em uma superfície de células cancerosas e que da mesma forma liga-se a um antígeno capaz de internalização celular, e portanto, pode liberar o fármaco seletivamente às células cancerosas e pode desse modo esperar causar o acúmulo do fármaco dentro das células cancerosas e matar as células cancerosas (veja, Literaturas de Não Patente 1 a 3). Como um ADC, Mylotarg (Gentuzumab ozogamicina (marca registrada)) em que calicamicina é conjugada a um anticorpo anti-CD33 é aprovado como um agente terapêutico para leucemia mieloide aguda. Além disso, Adcetris (Brentuximab vedotina (marca registrada)) em que auristatina E é conjugada a um anticorpo anti-CD30, foi recentemente aprovado como um agente terapêutico para o linfoma de Hodgkin e linfoma de células grandes anaplásico (veja, Literatura de Não Patente 4). Os fármacos contidos em ADCs que foram aprovados até agora alvejam DNA ou tubulina.[002] An antibody-drug conjugate (ADC) having a drug with cytotoxicity conjugated to an antibody whose antigen is also expressed on a surface of cancer cells and which likewise binds to an antigen capable of cellular internalization, and therefore , can selectively deliver the drug to cancer cells and can thereby hope to cause accumulation of the drug within cancer cells and kill cancer cells (see, Non-Patent Literatures 1 to 3). As an ADC, Mylotarg (Gentuzumab ozogamicin (trademark)) in which calicamycin is conjugated to an anti-CD33 antibody is approved as a therapeutic agent for acute myeloid leukemia. Additionally, Adcetris (Brentuximab vedotin (trademark)), in which auristatin E is conjugated to an anti-CD30 antibody, was recently approved as a therapeutic agent for Hodgkin's lymphoma and anaplastic large cell lymphoma (see, Non-Patent Literature 4). The drugs contained in ADCs that have been approved so far target DNA or tubulin.

[003] Com respeito a um antitumor, compostos de baixo peso molecular, derivados de camptotecina, compostos que inibem a topoisomerase I para exibir um efeito antitumor, são conhecidos. Entre eles, um composto antitumor representado pela fórmula abaixo Fórmula 1 (exatecana, nome químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di- hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona) é um derivado solúvel em água de camptotecina (Literatura de Patente 1 e 2). Ao contrário de irinotecana atualmente usado em rotinas clínicas, este composto não requer uma ativação por uma enzima para mostrar um efeito antitumor. Além disso, a atividade inibidora em topoisomerase I é mais alta que SN-38 que é uma substância farmaceuticamente ativa principal de irinotecana e topotecana, usados em rotinas clínicas, e atividade citocida in vitro superior é obtida por contrapartida de várias células cancerosas. Em particular, exibe o efeito contra células cancerosas que têm resistência a SN-38 ou similares devido à expressão de P-glicoproteína. Além disso, em um modelo de camundongo subcutaneamente transplantado de tumor humano, exibiu um efeito antitumor potente, e desse modo tem passado por estudos clínicos, mas não foi posto no mercado ainda (veja, Literaturas de Não Patente 5 a 10). Permanece obscuro se ou não a exatecana age efetivamente como um ADC.[003] With respect to an antitumor, low molecular weight compounds, derived from camptothecin, compounds that inhibit topoisomerase I to exhibit an antitumor effect, are known. Among them, an antitumor compound represented by the formula below Formula 1 (exatecan, chemical name: (1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyran[ 3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-dione) is a water-soluble derivative of camptothecin (Patent Literature 1 and 2). Unlike irinotecan currently used in clinical routines, this compound does not require activation by an enzyme to show an antitumor effect. Furthermore, the inhibitory activity on topoisomerase I is higher than SN-38 which is a main pharmaceutically active substance of irinotecan and topotecan, used in clinical routines, and higher in vitro cytocidal activity is obtained in contrast to various cancer cells. In particular, it exhibits the effect against cancer cells that have resistance to SN-38 or similar due to the expression of P-glycoprotein. Furthermore, in a mouse model subcutaneously transplanted from a human tumor, it exhibited a potent antitumor effect, and thus has undergone clinical studies, but has not been put on the market yet (see, Non-Patent Literatures 5 to 10). It remains unclear whether or not exatecan effectively acts as an ADC.

[004] DE-310 é um complexo no qual exatecana é conjugada a um polímero de carboximetildextrana poliálcool biodegradável por um espaçador de peptídeo de GGFG (Literatura de Patente 3). Convertendo-se a exatecana em uma forma de um pró-fármaco de polímero, uma propriedade de retenção de sangue alta pode ser mantida e da mesma forma, uma propriedade alvejável alta a uma área de tumor é aumentada passivamente utilizando-se a permeabilidade aumentada de vasos sanguíneos recentemente formados dentro de tumor e propriedade de retenção em tecidos de tumor. Com DE-310, por uma clivagem do espaçador de peptídeo por enzima, exatecana e exatecana com glicina conectada a um grupo amino são liberadas continuamente como uma substância ativa principal. Como um resultado, as farmacocinéticas são melhoradas. DE-310 foi constatado ter efetividade mais alta do que exatecana administrada sozinha embora a quantidade total de exatecana contida nisso seja mais baixa que o caso da administração de exatecana sozinha de acordo com vários modelos de avaliação de tumor em estudos não clínicos. Um estudo clínico foi conduzido para DE-310, e da mesma forma, casos efetivos foram confirmados, em que um relato que sugere que a substância ativa principal acumula-se em um tumor do que em tecidos normais estava presente, porém, há da mesma forma um relato que indica que o acúmulo de DE-310 e a substância ativa principal em um tumor não é muito diferente do acúmulo em tecidos normais em humanos, e desse modo nenhum alvejamento passivo é observado em humanos (veja, Literaturas de Não Patente 11 a 14). Como um resultado, DE-310 não foi da mesma forma comercializado, e permanece obscuro se ou não a exatecana age efetivamente como um fármaco direcionado a tal alvejamento.[004] DE-310 is a complex in which exatecan is conjugated to a biodegradable polyalcohol carboxymethyldextran polymer by a GGFG peptide spacer (Patent Literature 3). By converting exatecan into a polymer prodrug form, a high blood retention property can be maintained and similarly, a high targetable property to a tumor area is passively increased utilizing the increased permeability of newly formed blood vessels within tumor and retention property in tumor tissues. With DE-310, by enzyme cleavage of the peptide spacer, exatecan and exatecan with glycine attached to an amino group are continuously released as a main active substance. As a result, pharmacokinetics are improved. DE-310 has been found to have higher effectiveness than exatecan administered alone although the total amount of exatecan contained therein is lower than the case when administered exatecan alone according to various tumor assessment models in non-clinical studies. A clinical study was conducted for DE-310, and likewise, effective cases were confirmed, in which a report suggesting that the main active substance accumulates in a tumor than in normal tissues was present, however, there is just as much forms a report that the accumulation of DE-310 and the main active substance in a tumor is not very different from the accumulation in normal tissues in humans, and thus no passive targeting is observed in humans (see, Non-Patent Literatures 11 to 14). As a result, DE-310 has not been similarly commercialized, and it remains unclear whether or not exatecan effectively acts as a targeted drug.

[005] Como um composto relativo a DE-310, um complexo em que uma porção de estrutura representada por -NH-(CH2)4-C(=O)- é inserida entre o espaçador de -GGFG- e exatecana para formar - GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- usado como uma estrutura de espaçador é da mesma forma conhecido (Literatura de Patente 4). Entretanto, o efeito antitumor do referido complexo não é conhecido de modo algum.[005] As a compound related to DE-310, a complex in which a structure moiety represented by -NH-(CH2)4-C(=O)- is inserted between the spacer of -GGFG- and exatecan to form - GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- used as a spacer structure is likewise known (Patent Literature 4). However, the antitumor effect of the aforementioned complex is not known at all.

[006] TROP2 humano (TACSTD2: transdutor de sinal de cálcio associado ao tumor 2, GA733-1, EGP-1, M1S1; em seguida, referido como hTROP2) é uma proteína de membrana celular tipo 1 de transmembrana de única passagem que consiste em 323 resíduos de aminoácido. Enquanto a presença de uma proteína de membrana celular envolvida na resistência imune, que é comum aos trofoblastos humanos e células cancerosas (Literatura de Não Patente 15), foi previamente sugerida, uma molécula de antígeno reconhecida por um anticorpo monoclonal (162-25.3 ou 162-46.2) contra uma proteína de membrana celular em uma linhagem celular de coriocarcinoma humano foi identificada e designada como TROP2 como uma das moléculas expressas em trofoblastos humanos (Literatura de Não Patente 16). Esta molécula foi da mesma forma encontrada depois por outros investigadores e da mesma forma designada como um antígeno de tumor GA733-1 reconhecido por um anticorpo monoclonal de camundongo GA733 (Literatura de Não Patente 17) obtido por imunização com uma linhagem celular de câncer gástrico ou uma glicoproteína epitelial (EGP-1; Literatura de Não Patente 18) reconhecida por um anticorpo monoclonal de camundongo RS7-3G11 obtido por imunização com células de câncer de pulmão de células não pequenas. Em 1995, porém, o gene TROP2 foi clonado, e todas estas moléculas foram confirmados serem moléculas idênticas (Literatura de Não Patente 19). A sequência de DNA e sequência de aminoácido de hTROP2 estão disponíveis em uma base de dados público e podem ser referida, por exemplo, sob Nos. De Acesso. NM_002353 e NP_002344 (NCBI).[006] Human TROP2 (TACSTD2: tumor-associated calcium signal transducer 2, GA733-1, EGP-1, M1S1; hereinafter referred to as hTROP2) is a single-pass transmembrane type 1 cell membrane protein consisting in 323 amino acid residues. While the presence of a cell membrane protein involved in immune resistance, which is common to human trophoblasts and cancer cells (Non-Patent Literature 15), has been previously suggested, an antigen molecule recognized by a monoclonal antibody (162-25.3 or 162 -46.2) against a cell membrane protein in a human choriocarcinoma cell line was identified and designated as TROP2 as one of the molecules expressed in human trophoblasts (Non-Patent Literature 16). This molecule was similarly found later by other investigators and similarly designated as a GA733-1 tumor antigen recognized by a GA733 mouse monoclonal antibody (Non-Patent Literature 17) obtained by immunization with a gastric cancer cell line or an epithelial glycoprotein (EGP-1; Non-Patent Literature 18) recognized by a mouse monoclonal antibody RS7-3G11 obtained by immunization with non-small cell lung cancer cells. In 1995, however, the TROP2 gene was cloned, and all of these molecules were confirmed to be identical molecules (Non-Patent Literature 19). The DNA sequence and amino acid sequence of hTROP2 are available in a public database and can be referred to, for example, under Nos. Access. NM_002353 and NP_002344 (NCBI).

[007] O gene hTROP2 constitui a família do gene TACSTD, junto com TROP-1 humano (EpCAM, EGP-2,TACSTD1) gene tendo cerca de 50% de homologia (Literatura de Não Patente 21). A proteína de hTROP2 é constituída por uma sequência de sinal que consiste em 26 resíduos de aminoácido N-terminais, um domínio extracelular que consiste em 248 resíduos de aminoácido, um domínio de transmembrana que consiste em 23 resíduos de aminoácido, e um domínio intracelular que consiste em 26 resíduos de aminoácido. O domínio extracelular tem quatro sítios de glicosilação ligados a N e sabe-se que tem um peso molecular aparente de cerca de 10 kD mais o valor calculado teórico 35 kD (Literatura de Não Patente 19).[007] The hTROP2 gene constitutes the TACSTD gene family, together with human TROP-1 (EpCAM, EGP-2, TACSTD1) gene having about 50% homology (Non-Patent Literature 21). The hTROP2 protein consists of a signal sequence consisting of 26 N-terminal amino acid residues, an extracellular domain consisting of 248 amino acid residues, a transmembrane domain consisting of 23 amino acid residues, and an intracellular domain consisting of consists of 26 amino acid residues. The extracellular domain has four N-linked glycosylation sites and is known to have an apparent molecular weight of about 10 kD plus the theoretical calculated value 35 kD (Non-Patent Literature 19).

[008] Nenhum ligante fisiológico de hTROP2 foi identificado, nem suas funções moleculares foram reveladas até agora. hTROP2 foi constatada transduzir sinais de cálcio em células de tumor (Literatura de Não Patente 20). Além disso, hTROP2 é fosforilado a um resíduo intracelular serina 303 por proteína cinase C que é uma cinase dependente de Ca2+ (Literatura de Não Patente 18), e tem uma sequência de ligação de PIP2 no domínio intracelular, sugerindo as funções de sinalização em células de tumor (Literatura de Não Patente 22).[008] No physiological ligand of hTROP2 has been identified, nor have its molecular functions been revealed so far. hTROP2 has been found to transduce calcium signals in tumor cells (Non-Patent Literature 20). Furthermore, hTROP2 is phosphorylated at an intracellular serine 303 residue by protein kinase C, which is a Ca2+-dependent kinase (Non-Patent Literature 18), and has a PIP2-binding sequence in the intracellular domain, suggesting signaling functions in cells of tumor (Non-Patent Literature 22).

[009] Em análise imunoistoquímica usando as amostras clínicas, hTROP2 foi constatado ser superexpresso em vários carcinomas de célula epitelial e ser expresso em células epiteliais em tipos limitados de tecidos normais em um nível de expressão baixo em comparação com os tecidos de tumor (Literaturas de Não Patente 23 a 27). Da mesma forma, a expressão de hTROP2 foi relatada correlacionar-se com o prognóstico inferior de câncer colorretal (Literatura de Não Patente 23), câncer gástrico (Literatura de Não Patente 24), câncer pancreático (Literatura de Não Patente 25), câncer oral (Literatura de Não Patente 26), e glioma (Literatura de Não Patente 27).[009] In immunohistochemical analysis using clinical samples, hTROP2 was found to be overexpressed in several epithelial cell carcinomas and to be expressed in epithelial cells in limited types of normal tissues at a low expression level compared to tumor tissues (Literatures of No Patent 23 to 27). Similarly, hTROP2 expression has been reported to correlate with inferior prognosis of colorectal cancer (Non-Patent Literature 23), gastric cancer (Non-Patent Literature 24), pancreatic cancer (Non-Patent Literature 25), oral cancer (Non-Patent Literature 26), and glioma (Non-Patent Literature 27).

[0010] A partir dos modelos que usam células de câncer colorretal, foi também relatado que a expressão de hTROP2 está envolvida no crescimento da célula independente de andaime de células de tumor e tumorigênese em camundongos imunodeficientes (Literatura de Não Patente 28).[0010] From models using colorectal cancer cells, it has also been reported that hTROP2 expression is involved in scaffold-independent cell growth of tumor cells and tumorigenesis in immunodeficient mice (Non-Patent Literature 28).

[0011] Com respeito a tal informação que sugestiona a associação com câncer, uma pluralidade de anticorpos anti-hTROP2 foi estabelecida até aqui e estudada para seus efeitos antitumor. Entre estes anticorpos, é descoberto, por exemplo, um anticorpo não conjugado que exibe sua própria atividade antitumor em modelos de xenoenxerto de camundongo nu (Literaturas de Patente 5 a 8) bem como um anticorpo que exibe atividade antitumor como ADC com um fármaco citotóxico (Literaturas de Patente 9 a 12). Porém, a resistência ou cobertura de sua atividade ainda é insuficiente, e há necessidades médicas insatisfeitas para hTROP2 como um alvo terapêutico.[0011] With respect to such information suggesting association with cancer, a plurality of anti-hTROP2 antibodies have been established thus far and studied for their antitumor effects. Among these antibodies, there is discovered, for example, an unconjugated antibody that exhibits its own antitumor activity in nude mouse xenograft models (Patent Literatures 5 to 8) as well as an antibody that exhibits antitumor activity as an ADC with a cytotoxic drug ( Patent Literatures 9 to 12). However, the resistance or coverage of its activity is still insufficient, and there is unmet medical need for hTROP2 as a therapeutic target.

Citation list Patent Literature

[0012] Literatura de Patente 1: Patente Japonesa Depositada em Aberto No. 5-59061[0012] Patent Literature 1: Open Filed Japanese Patent No. 5-59061

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[0046] Literatura de Não Patente 23: Ohmachi T, et al., Clin. Cancer Res., 12(10), 3057-3063 (2006).[0046] Non-Patent Literature 23: Ohmachi T, et al., Clin. Cancer Res., 12(10), 3057-3063 (2006).

[0047] Literatura de Não Patente 24: Muhlmann G, et al., J. Clin. Pathol., 62(2), 152-158 (2009).[0047] Non-Patent Literature 24: Muhlmann G, et al., J. Clin. Pathol., 62(2), 152-158 (2009).

[0048] Literatura de Não Patente 25: Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), 1290-1295 (2008).[0048] Non-Patent Literature 25: Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), 1290-1295 (2008).

[0049] Literatura de Não Patente 26: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), 186-191 (2008).[0049] Non-Patent Literature 26: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), 186-191 (2008).

[0050] Literatura de Não Patente 27: Ning S, et al., Neurol. Sci., 34(10), 1745-1750 (2013).[0050] Non-Patent Literature 27: Ning S, et al., Neurol. Sci., 34(10), 1745-1750 (2013).

[0051] Literatura de Não Patente 28: Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), 280-285 (2008).[0051] Non-Patent Literature 28: Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), 280-285 (2008).

Summary of the Invention Technical problem

[0052] Com respeito ao tratamento de tumor por um anticorpo, um efeito antitumor insuficiente pode ser observado até mesmo quando o anticorpo reconhece um antígeno para ligar-se às células de tumor, e há um caso no qual um anticorpo antitumor mais efetivo é necessário. Além disso, muitos compostos antitumor de baixo peso molecular têm um problema na segurança como efeito colateral e toxicidade mesmo que os compostos tenham um excelente efeito antitumor, ele permanece como um objeto para alcançar um efeito terapêutico superior realçando-se também a segurança. Desse modo, um objetivo da presente invenção é obter para fornecer um fármaco antitumor tendo um excelente efeito terapêutico, que é excelente em termos de efeito antitumor e segurança.[0052] With respect to tumor treatment by an antibody, an insufficient antitumor effect can be observed even when the antibody recognizes an antigen to bind to tumor cells, and there is a case in which a more effective antitumor antibody is necessary . Furthermore, many low molecular weight antitumor compounds have a problem in safety such as side effect and toxicity. Even though the compounds have an excellent antitumor effect, it remains an object to achieve a superior therapeutic effect while also enhancing safety. Therefore, an object of the present invention is to provide an antitumor drug having an excellent therapeutic effect, which is excellent in terms of antitumor effect and safety.

[0053] Os inventores pensaram que, quando um composto antitumor exatecana é convertido em um conjugado de anticorpo- fármaco, por uma porção de estrutura de ligante, por conjugação ao anticorpo anti-TROP2, que é capaz de alvejar células de tumor, que está tendo uma propriedade capaz de reconhecer as células de tumor, uma propriedade capaz de ligar às células de tumor, uma propriedade de internalizar dentro das células de tumor, ou similares, a atividade citocida com base no anticorpo pode ser adquirida, o composto antitumor pode ser mais seguramente liberado às células de tumor para especificamente exibir o efeito antitumor do composto em células de tumor, e desse modo o efeito antitumor pode ser seguramente exibido, e uma dose do composto antitumor pode ser reduzida em comparação a um caso de administração do composto sozinho, e desse modo uma influência do composto antitumor em células normais pode ser aliviada de forma que a segurança mais alta possa ser alcançada.[0053] The inventors thought that when an exatecan antitumor compound is converted into an antibody-drug conjugate, by a linker backbone moiety, by conjugation to the anti-TROP2 antibody, which is capable of targeting tumor cells, which are having a property capable of recognizing tumor cells, a property capable of binding to tumor cells, a property of internalizing within tumor cells, or the like, cytocidal activity based on the antibody can be acquired, the antitumor compound can be more safely delivered to tumor cells to specifically exhibit the antitumor effect of the compound on tumor cells, and thereby the antitumor effect can be safely exhibited, and a dose of the antitumor compound can be reduced compared to a case of administering the compound alone , and in this way an influence of the antitumor compound on normal cells can be alleviated so that the highest safety can be achieved.

[0054] A este respeito, os inventores criaram um ligante com uma estrutura específica e tiveram sucesso na obtenção de um conjugado de anticorpo-fármaco em que o anticorpo anti-TROP2 e exatecana são conjugados mutuamente pelo ligante, e confirmaram um efeito antitumor excelente exibido pelo conjugado para desse modo completar a presente invenção.[0054] In this regard, the inventors created a linker with a specific structure and were successful in obtaining an antibody-drug conjugate in which the anti-TROP2 antibody and exatecan are mutually conjugated by the linker, and confirmed an excellent antitumor effect exhibited by the conjugate to thereby complete the present invention.

[0055] Especificamente, a presente invenção refere-se aos seguintes. [1] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela fórmula seguinte: Fórmula 2 é conjugado a um anticorpo anti-TROP2 por uma ligação tioéter que é formada em uma porção de ligação de dissulfeto presente em uma parte da articulação do anticorpo anti-TROP2 por um ligante tendo uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Aqui, o anticorpo anti-TROP2 é conectado ao terminal de L1, o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção - (CH2)n2-C(=O)- com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como a posição de conexão, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, n2 representa um número inteiro de 0 a 5, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-, em que n3 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos, La representa -O- ou uma ligação simples, e -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 3 que é conectada ao anticorpo anti-TROP2 na posição 3 da mesma e é conectada a um grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1. A presente invenção também se refere a cada dos seguintes. [2] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que o resíduo de peptídeo de LP é um resíduo de peptídeo compreendendo um aminoácido selecionado a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico. [3] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que LP é um resíduo de peptídeo selecionado a partir do seguinte grupo: -GGF-, -DGGF-, -(D-)D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, e -GGFGGGF-; em que "(D-)D" representa ácido D-aspártico. [4] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos. [5] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [4], em que LP é um resíduo de tetrapeptídeo de - GGFG-. [6] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [5], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, e L2 é uma ligação simples. [7] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [5], em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH- (CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, e n4 é 2 ou 4. [8] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [7], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos. [9] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [7], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura parcial tendo um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos. [10] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [9], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é -NH-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. [11] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [9], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. [12] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [9], em que a porção de estrutura de fármaco-ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX). Em que -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 4 que é conectada ao anticorpo anti-TROP2 na posição 3 da mesma e é conectada a um grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(NH-DX) representa um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 5 em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma porção de conexão, e -GGFG- representa um resíduo de tetrapeptídeo de -Gly-Gly-Phe-Gly-. [13] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [9], em que a porção de estrutura de fármaco-ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). Aqui, -(Succinimid-3-il-N)-, -(NH-DX), e -GGFG- são como definidos acima. [14] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela seguinte fórmula: Fórmula 6 é conjugado a um anticorpo anti-TROP2 por uma ligação tioéter que é formada em uma porção de ligação de dissulfeto presente em uma parte da articulação do anticorpo anti-TROP2 por um ligante tendo uma estrutura representada pela seguinte fórmula: em que o anticorpo anti-TROP2 é conectado ao terminal de L1, o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção - (CH2)n2-C(=O)-, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, n2 representa um número inteiro de 0 a 5, L1representa-(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-, em que n3 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de tetrapeptídeo de -GGFG-, La representa -O- ou uma ligação simples, e -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 7 que é conectada ao anticorpo anti-TROP2 na posição 3 da mesma e é conectada a um grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1. [15] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14], em que n1 é 3, n2 é 0, n3 é 2, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 é 2, e La é uma ligação simples, n1 é 1, n2 é 1, n3 é 5, L2 é uma ligação simples, e La é -O-, ou n1 é 2, n2 é 1, n3 é 5, L2 é uma ligação simples, e La é -O-. [16] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14] ou [15], em que n3 é 2 ou 5, e L2 é uma ligação simples. [17] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [14] ou [15], em que n3 é 2 ou 5, L2 é -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, e n4 é 2 ou 4. [18] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [14] a [17], em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- é -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. [19] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [14] a [18], em que a porção de estrutura de fármaco-ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX); em que -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 8 que é conectada ao anticorpo anti-TROP2 na posição 3 da mesma e é conectada a um grupo metileno na estrutura de ligante contendo esta estrutura no átomo de nitrogênio na posição 1, -(NH-DX) representa um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 9 em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma porção de conexão, e -GGFG- representa um resíduo de tetrapeptídeo de -Gly-Gly-Phe-Gly-. [20] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [14] a [18], em que a porção de estrutura de fármaco-ligante tendo um fármaco conectado a -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- é uma estrutura de fármaco-ligante selecionada a partir do seguinte grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). Aqui, -(Succinimid-3-il-N)-, -(NH-DX) e -GGFG- são como definidos acima. [21] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [20], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 1 a 10. [22] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [20], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 2 a 8. [23] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [20], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 3 a 8. [24] Um fármaco contendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo. [25] Um fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer contendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo. [26] O fármaco antitumor e/ou fármaco anticâncer de acordo com [25], que é aplicado ao câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, ou câncer esofágico. [27] Uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo como um componente ativo, e um componente de formulação farmaceuticamente aceitável. [28] A composição farmacêutica de acordo com [27], que é aplicado ao câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer gástrico,câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, ou câncer esofágico. [29] Um método para tratar tumor e/ou câncer compreendendo administrar o conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um dentre [1] a [23], um sal do mesmo ou um hidrato do mesmo. [30] Um método para produzir um conjugado de anticorpo- fármaco compreendendo reagir um composto representado pela seguinte fórmula: (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- (NH-DX) com um anticorpo anti-TROP2 ou um derivado reativo do mesmo e conjugando uma porção de fármaco-ligante ao anticorpo por um método para formar uma ligação tioéter em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte da articulação do anticorpo. Na fórmula, n3 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos selecionados a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, n2 representa um número inteiro de 0 a 5, La representa -O- ou uma ligação simples, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 10 em que o átomo de nitrogênio é uma posição de conexão. -(NH-DX) é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 11 em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma posição de conexão. [31] O método de produção de acordo com [30], em que o método para conjugar uma porção de fármaco-ligante a um anticorpo anti-TROP2 é um método de reduzir o anticorpo para converter o anticorpo a um derivado reativo. [32] O método de produção de acordo com [30] ou [31], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 1 a 10. [33] O método de produção de acordo com [30] ou [31], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 2 a 8. [34] O método de produção de acordo com [30] ou [31], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 3 a 8. [35] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido pelo método de produção de acordo com qualquer dentre [30] a [34]. [36] Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido formando-se uma ligação tioéter em um sítio de ligação de sulfeto em uma parte da articulação de um anticorpo anti-TROP2, em que o anticorpo anti- TROP2 é tratado em uma condição de redução e em seguida reagido com um composto selecionado a partir do seguinte grupo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), e (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX). Nos anteriores, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 12 em que o átomo de nitrogênio é uma posição de conexão. -(NH-DX) é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 13 em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma posição de conexão. -GGFG- representa um resíduo de tetrapeptídeo de -Gly-Gly-Phe-Gly-. Um conjugado de anticorpo-fármaco obtido formando-se uma ligação tioéter em um sítio de ligação de sulfeto presente em uma parte da articulação de um anticorpo anti-TROP2, em que o anticorpo anti-TROP2 é tratado em uma condição de redução e em seguida reagido com um composto selecionado a partir do seguinte grupo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), e (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX). Aqui, (maleimid-N-il)-,-(NH-DX), e -GGFG- são como definidos acima. [38] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [36] ou [37], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 1 a 10. (39) O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [36] ou [37], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 2 a 8. (40) O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [36] ou [37], em que um número médio de unidades de uma estrutura de fármaco-ligante selecionada conjugada por anticorpo está em uma faixa de 3 a 8.[0055] Specifically, the present invention relates to the following. [1] An antibody-drug conjugate in which an antitumor compound is represented by the following formula: Formula 2 is conjugated to an anti-TROP2 antibody by a thioether bond that is formed in a disulfide bond moiety present in a joint part of the anti-TROP2 antibody by a linker having a structure represented by the following formula: Here, the anti-TROP2 antibody is connected to the terminus of L1, the antitumor compound is connected to the carbonyl group of the moiety - (CH2)n2-C(=O)- with the nitrogen atom of the amino group at position 1 as the connection, where n1 represents an integer from 0 to 6, n2 represents an integer from 0 to 5, L1 represents -(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-, where n3 represents an integer from 2 to 8, L2 represents -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- or a single bond, where n4 represents an integer from 1 to 6, LP represents a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids, La represents -O- or a single bond, and -(Succinimid-3-yl-N)- has a structure represented by the following formula: Formula 3 which is connected to the anti-TROP2 antibody at position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure at the nitrogen atom at position 1. The present invention also relates to each of the following. [2] The antibody-drug conjugate according to [1], wherein the LP peptide residue is a peptide residue comprising an amino acid selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid , and aspartic acid. [3] The antibody-drug conjugate according to [1] or [2], wherein LP is a peptide residue selected from the following group: -GGF-, -DGGF-, -(D-)D- GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, and -GGFGGGF-; where "(D-)D" represents D-aspartic acid. [4] The antibody-drug conjugate according to [1] or [2], where LP is a peptide residue consisting of 4 amino acids. [5] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [4], where LP is a tetrapeptide residue of -GGFG-. [6] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [5], where n3 is an integer from 2 to 5, and L2 is a single bond. [7] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [5], where n3 is an integer from 2 to 5, L2 is -NH- (CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C (=O)-, and n4 is 2 or 4. [8] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [7], wherein -NH-(CH2)n1-La-(CH2 )n2-C(=O)- is a partial structure having a chain length of 4 to 7 atoms. [9] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [7], wherein -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- is a partial structure having a chain length of 5 or 6 atoms. [10] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [9], wherein -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- is -NH- CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2- O-CH2-C(=O)-, or - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. [11] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [9], wherein -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- is -NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, or -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. [12] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [9], wherein the drug-ligand backbone portion having a drug connected to -L1-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-(CH2)n2- C(=O)- is a drug-ligand structure selected from the following group: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-( NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid- 3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) , -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX). Where -(Succinimid-3-yl-N)- has a structure represented by the following formula: Formula 4 which is connected to the anti-TROP2 antibody in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure on the nitrogen atom in position 1, -(NH-DX) represents a group represented by the following formula: Formula 5 wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is a connecting moiety, and -GGFG- represents a tetrapeptide residue of -Gly-Gly-Phe-Gly-. [13] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [9], wherein the drug-ligand backbone portion having a drug connected to -L1-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-(CH2)n2- C(=O)- is a drug-ligand structure selected from the following group: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C (=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). Here, -(Succinimid-3-yl-N)-, -(NH-DX), and -GGFG- are as defined above. [14] An antibody-drug conjugate in which an antitumor compound represented by the following formula: Formula 6 is conjugated to an anti-TROP2 antibody by a thioether bond that is formed in a disulfide bond moiety present in a joint part of the anti-TROP2 antibody by a linker having a structure represented by the following formula: where the anti-TROP2 antibody is connected to the L1 terminus, the antitumor compound is connected to the carbonyl group of the moiety - (CH2)n2-C(=O)-, where n1 represents an integer from 0 to 6, n2 represents an integer from 0 to 5, L1 represents-(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-, where n3 represents an integer from 2 to 8, L2 represents -NH- (CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- or a single bond, where n4 represents an integer from 1 to 6, LP represents a tetrapeptide residue of -GGFG-, La represents -O- or a single bond, and -(Succinimid-3-yl-N)- has a structure represented by the following formula: Formula 7 which is connected to the anti-TROP2 antibody at position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure on the nitrogen atom at position 1. [15] The antibody-drug conjugate according to [14] , where n1 is 3, n2 is 0, n3 is 2, L2 is -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 is 2, and La is a single bond, n1 is 1 , n2 is 1, n3 is 5, L2 is a single bond, and La is -O-, or n1 is 2, n2 is 1, n3 is 5, L2 is a single bond, and La is -O-. [16] The antibody-drug conjugate according to [14] or [15], wherein n3 is 2 or 5, and L2 is a single bond. [17] The antibody-drug conjugate according to [14] or [15], wherein n3 is 2 or 5, L2 is -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, and n4 is 2 or 4. [18] The antibody-drug conjugate according to any one of [14] to [17], where -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O )- is -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, or -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. [19] The antibody-drug conjugate according to any one of [14] to [18], wherein the drug-ligand backbone portion having a drug connected to -L1-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-(CH2)n2- C(=O)- is a drug-ligand structure selected from the following group: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-( NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid- 3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) , -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX); where -(Succinimid-3-yl-N)- has a structure represented by the following formula: Formula 8 which is connected to the anti-TROP2 antibody in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure on the nitrogen atom in position 1, -(NH-DX) represents a group represented by the following formula: Formula 9 wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is a connecting moiety, and -GGFG- represents a tetrapeptide residue of -Gly-Gly-Phe-Gly-. [20] The antibody-drug conjugate according to any one of [14] to [18], wherein the drug-ligand backbone portion having a drug connected to -L1-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-(CH2)n2- C(=O)- is a drug-ligand structure selected from the following group: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C (=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). Here, -(Succinimid-3-yl-N)-, -(NH-DX) and -GGFG- are as defined above. [21] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [20], wherein an average number of units of a selected antibody-conjugated drug-ligand structure is in a range of 1 to 10. [22] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [20], wherein an average number of units of a selected antibody-conjugated drug-ligand structure is in a range of 2 to 8. [23] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [20], wherein an average number of units of a selected antibody-conjugated drug-ligand structure is in a range of 3 to 8. [24] A drug containing the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof or a hydrate thereof. [25] An antitumor drug and/or anticancer drug containing the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof or a hydrate thereof. [26] The antitumor drug and/or anticancer drug according to [25], which is applied to lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, cancer breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, head and neck cancer, or esophageal cancer. [27] A pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof or a hydrate thereof as an active component, and a pharmaceutically acceptable formulation component. [28] The pharmaceutical composition according to [27], which is applied to lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, head and neck cancer, or esophageal cancer. [29] A method for treating tumor and/or cancer comprising administering the antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [23], a salt thereof or a hydrate thereof. [30] A method for producing an antibody-drug conjugate comprising reacting a compound represented by the following formula: (maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-(CH2)n2-C(=O)- (NH-DX) with an anti-TROP2 antibody or a reactive derivative thereof and conjugating a drug-linker moiety to the antibody by a method to form a thioether bond in a disulfide bonding site present in a hinge part of the antibody. In the formula, n3 represents an integer from 2 to 8, L2 represents -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- or a single bond, where n4 represents an integer from 1 to 6, LP represents a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid, n1 represents an integer from 0 to 6, n2 represents an integer from 0 to 5, La represents -O- or a single bond, (maleimid-N-yl)- is a group represented by the following formula: Formula 10 where the nitrogen atom is a connecting position. -(NH-DX) is a group represented by the following formula: Formula 11 wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is a connecting position. [31] The production method according to [30], wherein the method for conjugating a drug-ligand moiety to an anti-TROP2 antibody is a method of reducing the antibody to convert the antibody to a reactive derivative. [32] The production method according to [30] or [31], wherein an average number of units of a selected antibody-conjugated drug-ligand structure is in a range of 1 to 10. [33] The method production method according to [30] or [31], wherein an average number of units of a selected drug-ligand structure conjugated per antibody is in a range of 2 to 8. [34] The production method according to [30] or [31], wherein an average number of units of a selected antibody-conjugated drug-ligand structure is in a range of 3 to 8. [35] An antibody-drug conjugate obtained by the method of producing agreement with any of [30] to [34]. [36] An antibody-drug conjugate obtained by forming a thioether bond at a sulfide binding site in a hinge part of an anti-TROP2 antibody, wherein the anti-TROP2 antibody is treated in a reducing condition and then reacted with a compound selected from the following group: (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid- N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH -CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), ( maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) , (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(= O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid- N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), ( maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O -CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl) -CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N- il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) , (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C (=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2 -C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid- N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O) -(NH-DX), and (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX). In the above, (maleimid-N-yl)- is a group represented by the following formula: Formula 12 where the nitrogen atom is a connecting position. -(NH-DX) is a group represented by the following formula: Formula 13 wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is a connecting position. -GGFG- represents a tetrapeptide residue of -Gly-Gly-Phe-Gly-. An antibody-drug conjugate obtained by forming a thioether bond at a sulfide binding site present in a hinge part of an anti-TROP2 antibody, wherein the anti-TROP2 antibody is treated in a reducing condition and then reacted with a compound selected from the following group: (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) , and (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX). Here, (maleimid-N-yl)-, -(NH-DX), and -GGFG- are as defined above. [38] The antibody-drug conjugate according to [36] or [37], wherein an average number of units of a selected drug-ligand structure conjugated per antibody is in a range of 1 to 10. (39) The antibody-drug conjugate according to [36] or [37], wherein an average number of units of a selected drug-ligand structure conjugated per antibody is in a range of 2 to 8. (40) The antibody-drug conjugate according to [36] or [37] antibody-drug according to [36] or [37], wherein an average number of units of a selected drug-ligand structure conjugated per antibody is in a range of 3 to 8.

Advantageous Effects of the Invention

[0056] Com um conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 tendo um composto antitumor exatecana conjugado por um ligante com uma estrutura específica, um excelente efeito antitumor e segurança podem ser obtidos.[0056] With an anti-TROP2 antibody-drug conjugate having an exatecan antitumor compound conjugated by a ligand with a specific structure, an excellent antitumor effect and safety can be obtained.

Brief Description of the Drawings

[0057] Figura 1 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 7) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 8) de uma cadeia pesada de anticorpo cTINA1.[0057] Figure 1 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of a cTINA1 antibody heavy chain.

[0058] Figura 2 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 9) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 10) de uma cadeia leve de anticorpo cTINA1.[0058] Figure 2 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of a cTINA1 antibody light chain.

[0059] Figura 3 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 11) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 12) de uma cadeia pesada hTINA1-H1.[0059] Figure 3 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 11) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of a hTINA1-H1 heavy chain.

[0060] Figura 4 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 13) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 14) de uma cadeia pesada hTINA1-H2.[0060] Figure 4 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of a hTINA1-H2 heavy chain.

[0061] Figura 5 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 15) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 16) de uma hTINA1-H3 cadeia pesada.[0061] Figure 5 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) of a hTINA1-H3 heavy chain.

[0062] Figura 6 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 17) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 18) de uma cadeia leve de hTINA1-L1.[0062] Figure 6 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) of a light chain of hTINA1-L1.

[0063] Figura 7 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 19) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 20) de uma cadeia leve de hTINA1-L2.[0063] Figure 7 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) of a light chain of hTINA1-L2.

[0064] Figura 8 mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 21) e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 22) de uma cadeia leve de hTINA1-L3.[0064] Figure 8 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 21) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 22) of a light chain of hTINA1-L3.

[0065] Figura 9 mostra uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 23) de CDRH1 de um anticorpo TINA1, uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 24) de CDRH2 do mesmo, uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 25) de CDRH3 do mesmo, uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 26) de CDRL1 do mesmo, uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 27) de CDRL2 do mesmo, e uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 28) de CDRL3 do mesmo.[0065] Figure 9 shows an amino acid sequence (SEQ ID NO: 23) of CDRH1 of a TINA1 antibody, an amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) of CDRH2 thereof, an amino acid sequence (SEQ ID NO: 25 ) of CDRH3 thereof, an amino acid sequence (SEQ ID NO: 26) of CDRL1 thereof, an amino acid sequence (SEQ ID NO: 27) of CDRL2 thereof, and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 28) of CDRL3 of the same.

[0066] Figura 10 mostra a capacidade de internalização da célula de um anticorpo anti-CD9, um anticorpo anti-CD46, um anticorpo anti- CD55, um anticorpo anti-CD59, um anticorpo anti-CD71, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-CD147, um anticorpo anti-CD276, um anticorpo anti-EpCAM, um anticorpo anti-EGFR, e um anticorpo anti- TROP2 (anticorpo TINA1).[0066] Figure 10 shows the cell internalization capacity of an anti-CD9 antibody, an anti-CD46 antibody, an anti-CD55 antibody, an anti-CD59 antibody, an anti-CD71 antibody, an anti-CD73 antibody, an anti-CD147 antibody, an anti-CD276 antibody, an anti-EpCAM antibody, an anti-EGFR antibody, and an anti-TROP2 antibody (TINA1 antibody).

[0067] Figura 11 mostra a capacidade de internalização da célula de um anticorpo anti-CD59, um anticorpo anti-CD71, um anticorpo anti-EGFR, um anticorpo anti-EpCAM, e um anticorpo anti-TROP2 (anticorpo TINA1).[0067] Figure 11 shows the cell internalization capacity of an anti-CD59 antibody, an anti-CD71 antibody, an anti-EGFR antibody, an anti-EpCAM antibody, and an anti-TROP2 antibody (TINA1 antibody).

[0068] Figura 12 mostra a capacidade de internalização da célula de vários anticorpos anti-TROP2.[0068] Figure 12 shows the cell internalization capacity of various anti-TROP2 antibodies.

[0069] Figura 13 mostra o efeito antitumor de um conjugado de anticorpo-fármaco (1), (6), ou (12) em uma linhagem celular de câncer colorretal humano COLO205 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0069] Figure 13 shows the antitumor effect of an antibody-drug conjugate (1), (6), or (12) on a COLO205 human colorectal cancer cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/nu mice.

[0070] Figura 14 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (1), (6), ou (12) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0070] Figure 14 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (1), (6), or (12) on a BxPC-3 human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/nu mice.

[0071] Figura 15 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (1), (6), ou (12) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano Capan-1 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0071] Figure 15 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (1), (6), or (12) on a Capan-1 human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/nu mice.

[0072] Figura 16 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (2), (5), (7), ou (10) em uma linhagem celular de câncer colorretal humano COLO205 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0072] Figure 16 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (2), (5), (7), or (10) in a COLO205 human colorectal cancer cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/ mice naked.

[0073] Figura 17 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (2), (5), (7), ou (10) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0073] Figure 17 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (2), (5), (7), or (10) on a BxPC-3 human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c- mice nude/nude.

[0074] Figura 18 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de câncer colorretal humano COLO205 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0074] Figure 18 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) in a COLO205 human colorectal cancer cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/ mice naked.

[0075] Figura 19 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0075] Figure 19 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) on a BxPC-3 human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c- mice nude/nude.

[0076] Figura 20 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de câncer ovariano humano NIH:OVCAR-3 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0076] Figure 20 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) in a human ovarian cancer cell line NIH:OVCAR-3 subcutaneously transplanted into BALB/ mice c-nu/nu.

[0077] Figura 21 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de câncer gástrico humanoNCI-N87 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0077] Figure 21 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) on a human gastric cancer cell line NCI-N87 subcutaneously transplanted into BALB/c-nu mice /naked.

[0078] Figura 22 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de câncer de pulmão humano NCI-H292 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0078] Figure 22 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) on a NCI-H292 human lung cancer cell line subcutaneously transplanted into BALB/c mice -nu/nu.

[0079] Figura 23 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de câncer de garganta humano FaDu subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0079] Figure 23 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) on a FaDu human throat cancer cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu mice /naked.

[0080] Figura 24 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8), ou (9) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano CFPAC-1 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0080] Figure 24 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (3), (4), (8), or (9) in a CFPAC-1 human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c- mice nude/nude.

[0081] Figura 25 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (8) ou (13) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano CFPAC-1 subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0081] Figure 25 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (8) or (13) on a CFPAC-1 human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/nu mice.

[0082] Figura 26 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (8) ou (13) em uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano HPAC subcutaneamente transplantada em camundongos BALB/c-nu/nu.[0082] Figure 26 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (8) or (13) on a HPAC human pancreatic adenocarcinoma cell line subcutaneously transplanted into BALB/c-nu/nu mice.

[0083] Figura 27 mostra o efeito antitumor do conjugado de anticorpo-fármaco (8) ou (13) em tecidos de câncer esofágico humano subcutaneamente transplantado em camundongos NOD-scid.[0083] Figure 27 shows the antitumor effect of the antibody-drug conjugate (8) or (13) on human esophageal cancer tissues subcutaneously transplanted into NOD-scid mice.

Description of Modalities

[0084] A seguir, modos preferidos para realizar a presente invenção serão descritos com referência aos desenhos. As modalidades descritas abaixo são determinadas como exemplos típicos das modalidades da presente invenção e não são pretendidos limitar o escopo da presente invenção.[0084] In the following, preferred modes of carrying out the present invention will be described with reference to the drawings. The embodiments described below are intended as typical examples of embodiments of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

[0085] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção é um fármaco antitumor em que um anticorpo anti- TROP2 é conjugado a um composto antitumor por uma porção de estrutura de ligante e explicado a seguir em detalhes.[0085] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is an antitumor drug in which an anti-TROP2 antibody is conjugated to an antitumor compound by a linker structure moiety and explained below in detail.

Antibody

[0086] O anticorpo anti-TROP2 usado no conjugado de anticorpo- fármaco anti-TROP2 da presente invenção pode ser derivado de qualquer espécie, e exemplos preferidos das espécies podem incluir os humanos, ratos, camundongos, e coelhos. No caso de quando derivados de diferentes espécies humanas, é preferivelmente quimerizado ou humanizado usando uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal e pode ser preferivelmente um anticorpo monoclonal.[0086] The anti-TROP2 antibody used in the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be derived from any species, and preferred examples of the species can include humans, rats, mice, and rabbits. In the case when derived from different human species, it is preferably chimerized or humanized using a well-known technique. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody and may preferably be a monoclonal antibody.

[0087] O anticorpo anti-TROP2 é capaz de alvejar células de tumor, isto é, tem uma propriedade capaz de reconhecer uma célula de tumor, uma propriedade capaz de ligar a uma célula de tumor, uma propriedade de internalizar em uma célula de tumor, ou similares, e pode ser convertido em um conjugado de anticorpo-fármaco por conjugação a um composto tendo atividade antitumor por um ligante.[0087] The anti-TROP2 antibody is capable of targeting tumor cells, that is, it has a property capable of recognizing a tumor cell, a property capable of binding to a tumor cell, a property of internalizing into a tumor cell , or the like, and can be converted into an antibody-drug conjugate by conjugation to a compound having antitumor activity by a ligand.

[0088] A atividade de ligação do anticorpo contra células de tumor pode ser confirmada usando citometria de fluxo. Exemplos do método para confirmar a internalização do anticorpo em células de tumor podem incluir (1) um ensaio de visualizar um anticorpo incorporado em células sob um microscópio de fluorescência usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando-se ao anticorpo terapêutico (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) um ensaio de medir uma intensidade de fluorescência incorporada em células usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando-se ao anticorpo terapêutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004), ou (3) um ensaio de Mab-ZAP usando uma imunotoxina ligando-se ao anticorpo terapêutico em que a toxina é liberada na incorporação em células para inibir o crescimento da célula (Bio Techniques 28:162-165, January 2000). Uma proteína do complexo recombinante de uma região catalítica da toxina de difteria e proteína G pode ser usada como a imunotoxina.[0088] The binding activity of the antibody against tumor cells can be confirmed using flow cytometry. Examples of the method for confirming antibody internalization into tumor cells may include (1) an assay of visualizing an antibody incorporated into cells under a fluorescence microscope using a secondary (fluorescently labeled) antibody binding to the therapeutic antibody (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) an assay measuring a cell-embedded fluorescence intensity using a secondary (fluorescently labeled) antibody binding to the therapeutic antibody (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004), or (3) a Mab-ZAP assay using an immunotoxin binding therapeutic antibody in which the toxin is released upon incorporation into cells to inhibit cell growth (Bio Techniques 28:162- 165, January 2000). A recombinant complex protein of a diphtheria toxin catalytic region and G protein can be used as the immunotoxin.

[0089] Considerando que o fármaco conjugado no conjugado de anticorpo-fármaco mostra um efeito antitumor, é preferido, mas não essencial que o próprio anticorpo tenha um efeito antitumor. Com a finalidade de especificamente e seletivamente mostrar a atividade citocida do composto antitumor em células de tumor, é importante e da mesma forma preferido que o anticorpo tenha a propriedade de internalização para migrar em células de tumor.[0089] Considering that the drug conjugate in the antibody-drug conjugate shows an antitumor effect, it is preferred, but not essential, that the antibody itself has an antitumor effect. In order to specifically and selectively show the cytocidal activity of the antitumor compound in tumor cells, it is important and also preferred that the antibody has the internalization property to migrate into tumor cells.

[0090] O anticorpo anti-TROP2 pode ser obtido usando um método normalmente realizado na técnica, que envolve a imunização de animais com um polipeptídeo antigênico e coleta e purificação de anticorpos produzidos in vivo. A origem do antígeno não está limitada a humanos, e os animais podem ser imunizados com um antígeno derivado de um animal não humano tal como um camundongo, um rato, e similares. Neste caso, a reatividade cruzada dos anticorpos ligando-se ao antígeno heterólogo obtido com antígenos humanos pode ser testada para avaliar um anticorpo aplicável a uma doença humana.[0090] The anti-TROP2 antibody can be obtained using a method normally performed in the art, which involves immunizing animals with an antigenic polypeptide and collecting and purifying antibodies produced in vivo. The origin of the antigen is not limited to humans, and animals can be immunized with an antigen derived from a non-human animal such as a mouse, a rat, and the like. In this case, the cross-reactivity of antibodies binding to heterologous antigen obtained with human antigens can be tested to evaluate an antibody applicable to a human disease.

[0091] Alternativamente, as células produtoras de anticorpo que produzem anticorpos contra o antígeno são fundidas com células de mieloma de acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975)256, p.495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) para estabelecer hibridomas, dos quais anticorpos monoclonais podem por sua vez ser obtidos.[0091] Alternatively, antibody-producing cells that produce antibodies against the antigen are fused with myeloma cells according to a method known in the art (e.g., Kohler and Milstein, Nature (1975)256, p.495-497; and Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) to establish hybridomas, from which monoclonal antibodies can in turn be obtained.

[0092] O antígeno pode ser obtido criando-se geneticamente as células hospedeiro para produzir um gene que codifica a proteína antigênica. Especificamente, os vetores que permitem a expressão do gene de antígeno são preparados e transferidos para as células hospedeiro de forma que o gene seja expresso. O antígeno desse modo expresso pode ser purificado. O anticorpo pode da mesma forma ser obtido usando um método de imunização de animais com as células de expressão de antígeno geneticamente criadas acima descritas ou uma linhagem celular expressando o antígeno.[0092] The antigen can be obtained by genetically engineering the host cells to produce a gene that encodes the antigenic protein. Specifically, vectors that allow expression of the antigen gene are prepared and transferred into host cells so that the gene is expressed. The antigen thus expressed can be purified. The antibody may also be obtained using a method of immunizing animals with the genetically engineered antigen-expressing cells described above or a cell line expressing the antigen.

[0093] O anticorpo anti-TROP2 pode ser obtido por um procedimento conhecido na técnica.[0093] The anti-TROP2 antibody can be obtained by a procedure known in the art.

[0094] O anticorpo anti-TROP2 que pode ser usado na presente invenção não está particularmente limitado, e, por exemplo, aqueles especificados pelas sequências de aminoácido mostradas na Listagem de Sequência do presente pedido podem ser preferivelmente usados. O anticorpo anti-TROP2 usado na presente invenção tem preferivelmente propriedades como descrito abaixo. (41) Um anticorpo tendo as seguintes propriedades: (a) ligar especificamente a TROP2, e (b) ter uma atividade de internalização em células de expressão de TROP2 ligando-se ao TROP2. (42) O anticorpo de acordo com (1), em que TROP2 é TROP2 humano. (43) O anticorpo de acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo tem CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 23, CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 24, e CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 25 como regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada, e CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 26, CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 27, e CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 28 como regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve. (44) O anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (3), em que a região constante do mesmo é uma região constante derivada de humano. (45) O anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (4), em que o anticorpo é um anticorpo humanizado. (46) O anticorpo de acordo com (5), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em (a) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 12, (b) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 14, (c) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 16, (d) uma sequência de aminoácido tendo homologia de pelo menos 95% ou superior a quaisquer das sequências (a) a (c), e (e) uma sequência de aminoácido derivada de quaisquer das sequências (a) a (c) pelas deleções, substituições ou adições de pelo menos um aminoácido, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em (f) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 18, (g) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 20, (h) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 22,(i) uma sequência de aminoácido tendo homologia de pelo menos 95% ou superior a quaisquer das sequências (f) a (h), e (j) uma sequência de aminoácido derivada de quaisquer das sequências (f) a (h) pelas deleções, substituições ou adições de pelo menos um aminoácido. (47) O anticorpo de acordo com (6), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo em uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 18, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 20, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 22, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 18, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 20, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 22, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 18, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 22. (48) O anticorpo de acordo com (7), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo em uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 18, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 18, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 14 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 20, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 140 em SEQ ID NO: 16 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 129 em SEQ ID NO: 22. (49) O anticorpo de acordo com (6) ou (7), em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 20, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 22, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 20, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 22, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 20, e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 22. (50) O anticorpo de acordo com (6) ou (7), em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 20, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 22, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 20, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 22, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 20, e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 22. (51) O anticorpo de acordo com (8), em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 18, uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 20, e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 470 em SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 234 em SEQ ID NO: 22. (52) O anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (11), em que o anticorpo necessita de um resíduo de lisina no terminal carboxila da cadeia pesada. (53) Um anticorpo obtido por um método para produzir o anticorpo de acordo com qualquer dentre (1) a (12), o método compreendendo as etapas de: cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo; e coletar o anticorpo de interesse das culturas obtidas na etapa precedente.[0094] The anti-TROP2 antibody that can be used in the present invention is not particularly limited, and, for example, those specified by the amino acid sequences shown in the Sequence Listing of the present application may preferably be used. The anti-TROP2 antibody used in the present invention preferably has properties as described below. (41) An antibody having the following properties: (a) specifically bind to TROP2, and (b) have an internalization activity in TROP2-expressing cells by binding to TROP2. (42) The antibody according to (1), wherein TROP2 is human TROP2. (43) The antibody according to (1) or (2), wherein the antibody has CDRH1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, CDRH2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, and CDRH3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 as heavy chain complementarity determining regions, and CDRL1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, CDRL2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, and CDRL3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 as light chain complementarity determining regions. (44) The antibody according to any of (1) to (3), wherein the constant region thereof is a human-derived constant region. (45) The antibody according to any of (1) to (4), wherein the antibody is a humanized antibody. (46) The antibody according to (5), wherein the antibody has a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 12, (b) an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 14, (c) an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 16 , (d) an amino acid sequence having homology of at least 95% or greater to any of sequences (a) to (c), and (e) an amino acid sequence derived from any of sequences (a) to (c) by deletions, substitutions or additions of at least one amino acid, and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (f) an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, (g) an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 20, (h) an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 22, (i) an amino acid sequence having homology of at least 95% or greater to any of sequences (f) to (h), and (j) an amino acid sequence derived from any of sequences (f) to (h) by deletions, substitutions or additions of at least one amino acid. (47) The antibody according to (6), wherein the antibody has a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from the group consisting of a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 20, a heavy chain variable region comprising a sequence of amino acid described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 22, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, a chain variable region heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 20, a variable region heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 22, a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 18 , a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: : 20, and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 22. (48) The antibody according to (7), wherein the antibody has a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from the group consisting of a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, a chain variable region heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 18, a variable region heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 140 in SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 129 in SEQ ID NO: 22. (49) The antibody according to (6) or (7), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 20, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 22, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 14 and a chain light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising a sequence of amino acid described in amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 20, a heavy chain comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 22, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 22. (50) The antibody according to (6) or (7), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO : 12 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 , a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, and a heavy chain comprising the sequence of amino acid represented by SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22. (51) The antibody according to (8), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: : 18, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 470 in SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 234 in SEQ ID NO: 22. (52) The antibody according to any of (1) to (11), where the antibody requires a lysine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain. (53) An antibody obtained by a method for producing the antibody according to any of (1) to (12), the method comprising the steps of: culturing a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody; and collect the antibody of interest from the cultures obtained in the previous step.

[0095] A seguir, o anticorpo anti-TROP2 usado na invenção é descrito.[0095] Next, the anti-TROP2 antibody used in the invention is described.

[0096] Os termos "câncer" e "tumor" quando aqui usados são usados com o mesmo significado.[0096] The terms "cancer" and "tumor" when used here are used with the same meaning.

[0097] O termo "gene" quando aqui usado não inclui apenas o DNA, mas da mesma forma, mRNA do mesmo, cDNA do mesmo, e cRNA do mesmo.[0097] The term "gene" when used here does not only include DNA, but likewise, mRNA thereof, cDNA thereof, and cRNA thereof.

[0098] O termo "polinucleotídeo" quando aqui usado é usado com o mesmo significado como um ácido nucleico e da mesma forma, inclui o DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos, e iniciadores.[0098] The term "polynucleotide" when used herein is used with the same meaning as a nucleic acid and likewise includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers.

[0099] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" quando aqui usados são usado sem distinção.[0099] The terms "polypeptide" and "protein" when used here are used interchangeably.

[00100] O termo "célula" quando aqui usado da mesma forma inclui células em um indivíduo animal e células cultivadas.[00100] The term "cell" when used herein in the same way includes cells in an animal individual and cultured cells.

[00101] O termo "TROP2" quando aqui usado é usado no mesmo significado como proteína TROP2.[00101] The term "TROP2" when used herein is used in the same meaning as TROP2 protein.

[00102] O termo "CDR" quando aqui usado refere-se a uma região de determinação de complementaridade (CDR). Sabe-se que cada cadeia pesada e leve de uma molécula de anticorpo tem três regiões de determinação de complementaridade (CDRs). A CDR é da mesma forma chamada de domínio hipervariável, e está presente em uma região variável de cada cadeia pesada e leve de um anticorpo. É um sítio que tem variabilidade não usualmente alta em sua estrutura primária, e há três CDRs separadas na estrutura primária de cada cadeia de polipeptídeo pesada e clara. Nesta especificação, como para as CDRs de um anticorpo, as CDRs da cadeia pesada são representadas por CDRH1, CDRH2, e CDRH3 do lado amino-terminal da sequência de aminoácido da cadeia pesada, e as CDRs de cadeia leve são representadas por CDRL1, CDRL2, e CDRL3 do lado aminoterminal da sequência de aminoácido da cadeia leve. Estes sítios são aproximados entre si na estrutura terciária e determinam a especificidade para um antígeno ao qual os anticorpos ligam-se.[00102] The term "CDR" when used herein refers to a complementarity determining region (CDR). It is known that each heavy and light chain of an antibody molecule has three complementarity determining regions (CDRs). The CDR is also called the hypervariable domain, and is present in a variable region of each heavy and light chain of an antibody. It is a site that has unusually high variability in its primary structure, and there are three separate CDRs in the primary structure of each heavy and light polypeptide chain. In this specification, as for the CDRs of an antibody, the heavy chain CDRs are represented by CDRH1, CDRH2, and CDRH3 on the amino-terminal side of the heavy chain amino acid sequence, and the light chain CDRs are represented by CDRL1, CDRL2 , and CDRL3 on the amino-terminal side of the light chain amino acid sequence. These sites are brought together in the tertiary structure and determine the specificity for an antigen to which the antibodies bind.

[00103] A frase "hibridização é realizada sob condições estritas" quando aqui usada refere-se a um processo no qual a hibridização é realizada sob condições sob as quais a identificação pode ser obtida realizando-se a hibridização a 68oC em uma solução de hibridização comercialmente disponível ExpressHyb Hybrization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) ou realizando-se a hibridização a 68oC na presença de 0,7 a 1,0 M de NaCl usando um filtro tendo DNA imobilizado nisto, seguido realizando-se a lavagem a 68oC usando 0,1 a 2 x de solução de SSC (1 x de solução de SSC é composto de 150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio) ou sob condições equivalentes a isto.[00103] The phrase "hybridization is carried out under strict conditions" when used herein refers to a process in which hybridization is carried out under conditions under which identification can be obtained by carrying out hybridization at 68oC in a hybridization solution commercially available ExpressHyb Hybrization Solution (manufactured by Clontech, Inc.) or by performing hybridization at 68oC in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter having DNA immobilized thereon, followed by washing at 68oC using 0.1 to 2x SSC solution (1x SSC solution is composed of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) or under conditions equivalent thereto.

1. TROP2

[00104] TROP2 é um membro da família de TACSTD expressa em trofoblastos humanos e é uma proteína de membrana celular tipo 1 de transmembrana de única passagem envolvida na resistência imune, que é comum aos trofoblastos humanos e células cancerosas.[00104] TROP2 is a member of the TACSTD family expressed in human trophoblasts and is a single-pass transmembrane type 1 cell membrane protein involved in immune resistance, which is common to human trophoblasts and cancer cells.

[00105] Quanto à proteína TROP2 a ser usada na invenção, a proteína TROP2 pode ser purificada diretamente das células de expressão de TROP2 de um mamífero humano ou não humano (tal como um rato ou um camundongo) e usada, ou uma fração de membrana celular das células acima descritas pode estar preparada e usada. Além disso, TROP2 pode ser obtida por síntese in vitro da mesma, ou produção da mesma em uma célula hospedeira por engenharia genética. Na engenharia genética, especificamente, após o cDNA de TROP2 ser integrado em um vetor capaz de expressar o cDNA de TROP2, a proteína TROP2 pode ser obtida sintetizando-a em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para transcrição e translação, ou expressando-se TROP2 em outra célula hospedeiro transformada procariótica ou eucariótica. Alternativamente, as células de expressão de TROP2 geneticamente criada acima descrita ou uma linhagem celular expressando TROP2 podem ser usadas como a proteína TROP2.[00105] As for the TROP2 protein to be used in the invention, the TROP2 protein can be purified directly from the TROP2-expressing cells of a human or non-human mammal (such as a rat or mouse) and used, or a membrane fraction cell of the cells described above can be prepared and used. Furthermore, TROP2 can be obtained by its in vitro synthesis, or its production in a host cell by genetic engineering. In genetic engineering, specifically, after the TROP2 cDNA is integrated into a vector capable of expressing the TROP2 cDNA, the TROP2 protein can be obtained by synthesizing it in a solution containing an enzyme, a substrate and an energy substance required for transcription and translation, or by expressing TROP2 in another prokaryotic or eukaryotic transformed host cell. Alternatively, the genetically created TROP2 expressing cells described above or a TROP2 expressing cell line can be used as the TROP2 protein.

[00106] A sequência de DNA e sequência de aminoácido de TROP2 estão disponíveis em uma base de dados pública e pode ser referida, por exemplo, sob os Nos. de Acesso NM_002353 e NP_002344 (NCBI).[00106] The DNA sequence and amino acid sequence of TROP2 are available in a public database and can be referred to, for example, under Nos. Access Numbers NM_002353 and NP_002344 (NCBI).

[00107] Além disso, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido em que um ou vários aminoácidos são substituídos, deletados e/ou adicionados em quaisquer das sequências de aminoácido acima descritas de TROP2 e da mesma forma tem uma atividade biológica equivalente àquela da proteína é da mesma forma cultivada em TROP2.[00107] Furthermore, a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and/or added in any of the above-described amino acid sequences of TROP2 and likewise has a biological activity equivalent to that of protein is likewise grown in TROP2.

[00108] A proteína TROP2 humana é constituída por uma sequência de sinal consistindo em 26 resíduos de aminoácido N- terminais, um domínio extracelular consistindo em 248 resíduos de aminoácido, um domínio de transmembrana consistindo em 23 resíduos de aminoácido, e um domínio intracelular consistindo em 26 resíduos de aminoácido.[00108] The human TROP2 protein is constituted by a signal sequence consisting of 26 N-terminal amino acid residues, an extracellular domain consisting of 248 amino acid residues, a transmembrane domain consisting of 23 amino acid residues, and an intracellular domain consisting of in 26 amino acid residues.

2. Production of anti-TROP2 antibody

[00109] O anticorpo contra TROP2 da invenção pode ser obtido usando um método normalmente realizado na técnica, que envolve a imunização de um animal com TROP2 ou um polipeptídeo arbitrário selecionado da sequência de aminoácido de TROP2 pode ser obtido, e colecionando e purificando o anticorpo produzido in vivo. As espécies biológicas de TROP2 a ser usadas como um antígeno não estão limitadas ao ser humano, e um animal pode ser imunizado com TROP2 derivado de um animal diferente de humanos tal como, um camundongo ou um rato. Neste caso, examinando-se a reatividade cruzada entre um anticorpo ligando-se à TROP2 heteróloga e TROP2 humana obtidas, um anticorpo aplicável a uma doença humana pode ser selecionado.[00109] The antibody against TROP2 of the invention can be obtained using a method commonly performed in the art, which involves immunizing an animal with TROP2 or an arbitrary polypeptide selected from the amino acid sequence of TROP2 can be obtained, and collecting and purifying the antibody produced in vivo. The biological species of TROP2 to be used as an antigen is not limited to humans, and an animal can be immunized with TROP2 derived from an animal other than humans such as a mouse or a rat. In this case, by examining the cross-reactivity between an antibody binding to heterologous TROP2 and obtained human TROP2, an antibody applicable to a human disease can be selected.

[00110] Além disso, um anticorpo monoclonal pode ser obtido de um hibridoma estabelecido fundindo-se as células de produção de anticorpo que produzem um anticorpo contra TROP2 com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R., ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).[00110] Furthermore, a monoclonal antibody can be obtained from an established hybridoma by fusing antibody-producing cells that produce an antibody against TROP2 with myeloma cells according to a known method (e.g., Kohler and Milstein, Nature , (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R., ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).

[00111] TROP2 a ser usada como um antígeno pode ser obtida por expressão de gene de TROP2 em uma célula hospedeira usando a engenharia genética.[00111] TROP2 to be used as an antigen can be obtained by expressing the TROP2 gene in a host cell using genetic engineering.

[00112] Especificamente, um vetor capaz de expressar o gene de TROP2 é produzido, e o vetor resultante é transfectado em uma célula hospedeira para expressar o gene, e, portanto, TROP2 expressa é purificada.[00112] Specifically, a vector capable of expressing the TROP2 gene is produced, and the resulting vector is transfected into a host cell to express the gene, and therefore, expressed TROP2 is purified.

[00113] Alternativamente, as células de expressão de TROP2 geneticamente criadas acima descrito ou uma linhagem celular expressando TROP2 podem ser usadas como a proteína TROP2. Em seguida, um método de obter um anticorpo contra TROP2 é especificamente descrito.[00113] Alternatively, the genetically created TROP2 expressing cells described above or a cell line expressing TROP2 can be used as the TROP2 protein. Next, a method of obtaining an antibody against TROP2 is specifically described.

Antigen preparation

[00114] Exemplos do antígeno a ser usado para produzir o anticorpo anti-TROP2 incluem TROP2, ou um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido parcial compreendendo pelo menos 6 aminoácidos consecutivos de TROP2, ou um derivado obtido adicionando-se uma determinada sequência de aminoácido ou portador também.[00114] Examples of the antigen to be used to produce the anti-TROP2 antibody include TROP2, or a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence comprising at least 6 consecutive amino acids of TROP2, or a derivative obtained by adding a certain amino acid sequence or carrier as well.

[00115] TROP2 pode ser purificada diretamente de tecidos de tumor humanos ou células de tumor e usada. Além disso, TROP2 pode ser obtida sintetizando-a in vitro ou produzindo-a em uma célula hospedeira por engenharia genética.[00115] TROP2 can be purified directly from human tumor tissues or tumor cells and used. Furthermore, TROP2 can be obtained by synthesizing it in vitro or producing it in a host cell by genetic engineering.

[00116] Com respeito à engenharia genética, especificamente, após o cDNA de TROP2 ser integrado em um vetor capaz de expressar o cDNA de TROP2, o antígeno pode ser obtido sintetizando-se em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para transcrição e translação, ou expressando-se TROP2 em outra célula hospedeira transformada procariótica ou eucariótica.[00116] With respect to genetic engineering, specifically, after the TROP2 cDNA is integrated into a vector capable of expressing the TROP2 cDNA, the antigen can be obtained by synthesizing it in a solution containing an enzyme, a substrate and a substance of energy required for transcription and translation, or by expressing TROP2 in another transformed prokaryotic or eukaryotic host cell.

[00117] Além disso, o antígeno pode da mesma forma ser obtido como uma proteína secretora expressando-se uma proteína de fusão obtida ligando-se o domínio extracelular de TROP2, que é uma proteína de membrana, à região constante de um anticorpo em um sistema de hospedeiro-vetor apropriado.[00117] Furthermore, the antigen can also be obtained as a secretory protein by expressing a fusion protein obtained by binding the extracellular domain of TROP2, which is a membrane protein, to the constant region of an antibody in a appropriate host-vector system.

[00118] cDNA de TROP2 pode ser obtido por, por exemplo, um então chamado método de PCR em que uma reação em cadeia de polimerase (a seguir referida como "PCR"; veja Saiki, R., K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489) é realizada usando uma biblioteca de cDNA expressando cDNA de TROP2 como um padrão e iniciadores que especificamente amplificam o cDNA de TROP2.[00118] TROP2 cDNA can be obtained by, for example, a so-called PCR method in which a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR"; see Saiki, R., K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489) is performed using a cDNA library expressing TROP2 cDNA as a standard and primers that specifically amplify the TROP2 cDNA.

[00119] Como a síntese in vitro do polipeptídeo, por exemplo, Sistema de Translação Rápido (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc., pode ser exemplificado, porém, não está limitado a isto.[00119] As the in vitro synthesis of the polypeptide, for example, Rapid Translation System (RTS) manufactured by Roche Diagnostics, Inc., can be exemplified, however, it is not limited to this.

[00120] Exemplos das células hospedeiras procarióticas incluem Escherichia coli e Bacillus subtilis. Para transformar as células hospedeiras com um gene alvo, as células hospedeiras são transformadas por um vetor de plasmídeo compreendendo um réplicon, isto é, uma origem de replicação derivada de uma espécie compatível com o hospedeiro, e uma sequência reguladora. Além disso, o vetor preferivelmente tem uma sequência capaz de impor a seletividade fenotípica na célula transformada.[00120] Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. To transform host cells with a target gene, the host cells are transformed by a plasmid vector comprising a replicon, that is, an origin of replication derived from a species compatible with the host, and a regulatory sequence. Furthermore, the vector preferably has a sequence capable of imposing phenotypic selectivity on the transformed cell.

[00121] Exemplos das células hospedeiras eucarióticas incluem células vertebradas, células de inseto, e células de levedura. Como as células vertebradas, por exemplo, células de COS de símio (Gluzman Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCCCRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e cepas deficientes de di-hidrofolato redutase (Urlaub, G., e Chasin, L., A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células ovarianas de hamster Chinês (células de CHO; ATCC: CCL- 61); e similares são frequentemente usados, porém, as células não são limitadas a isto.[00121] Examples of eukaryotic host cells include vertebrate cells, insect cells, and yeast cells. Such as vertebrate cells, e.g., simian COS cells (Gluzman Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCCCRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), murine NIH3T3 fibroblasts (ATCC No. . CRL-1658), and dihydrofolate reductase deficient strains (Urlaub, G., and Chasin, L., A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) of Chinese hamster ovarian cells (CHO cells; ATCC: CCL-61); and the like are often used, however, cells are not limited to this.

[00122] O transformante desse modo obtido pode ser cultivado de acordo com um método normalmente realizado na técnica, e pelo cultivo do transformante, um polipeptídeo alvo é produzido intracelularmente ou extracelularmente.[00122] The transformant thus obtained can be cultivated according to a method normally carried out in the art, and by cultivating the transformant, a target polypeptide is produced intracellularly or extracellularly.

[00123] Um meio adequado a ser usado para o cultivo pode ser selecionado por aqueles versados na técnica de vários meios de cultura geralmente usados dependendo das células hospedeiras empregadas. Se Escherichia coli é empregada, por exemplo, um meio de LB suplementado com um antibiótico tal como ampicilina ou IPMG quando necessário pode ser usado.[00123] A suitable medium to be used for cultivation can be selected by those skilled in the art from various commonly used culture media depending on the host cells employed. If Escherichia coli is employed, for example, LB medium supplemented with an antibiotic such as ampicillin or IPMG when necessary can be used.

[00124] Uma proteína recombinante produzida intracelularmente ou extracelularmente pelo transformante por tal cultivo pode ser separada e purificada por quaisquer de vários métodos de separação conhecidos que utilizam a propriedade física ou química da proteína.[00124] A recombinant protein produced intracellularly or extracellularly by the transformant by such cultivation can be separated and purified by any of several known separation methods that utilize the physical or chemical property of the protein.

[00125] Exemplos específicos dos métodos incluem tratamento com um precipitante de proteína comum, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia líquida tais como, cromatografia de peneiração molecular (filtração de gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de permuta de íons, e cromatografia de afinidade, diálise, e uma combinação das mesmas.[00125] Specific examples of the methods include treatment with a common protein precipitant, ultrafiltration, various types of liquid chromatography such as molecular sieving chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography , dialysis, and a combination thereof.

[00126] Além disso, ligando-se um rótulo de seis resíduos de histidina a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser purificada eficazmente com uma coluna de afinidade de níquel. Alternativamente, ligando-se a região de Fc de IgG a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser purificada eficazmente com uma coluna de proteína A.[00126] Furthermore, by attaching a six-residue histidine tag to a recombinant protein to be expressed, the protein can be effectively purified with a nickel affinity column. Alternatively, by linking the IgG Fc region to a recombinant protein to be expressed, the protein can be effectively purified with a protein A column.

[00127] Combinando-se os métodos acima descritos, uma quantidade grande de um polipeptídeo alvo pode ser produzida facilmente em rendimento alto e pureza alta.[00127] By combining the methods described above, a large amount of a target polypeptide can be produced easily in high yield and high purity.

[00128] O próprio transformante acima descrito pode da mesma forma ser usado como o antígeno. Alternativamente, uma linhagem celular expressando TROP2 pode ser usada como o antígeno. Exemplos de uma tal linhagem celular podem incluir linhagens de câncer de pulmão humano NCI-H322, PC14, NCIH-H2122, e LCAM1, uma linhagem de câncer de próstata humano PC3, linhagens de câncer pancreático humano BxPC-3, Capan-1, e PK-1, uma linhagem de câncer ovariano humano SKOV3, e uma linhagem de câncer colorretal humano COLO205, entretanto a linhagem celular de acordo com a presente invenção não é limitada a estes linhagens celulares contanto que expressando TROP2.[00128] The transformant described above can also be used as the antigen. Alternatively, a cell line expressing TROP2 can be used as the antigen. Examples of such a cell line may include human lung cancer lines NCI-H322, PC14, NCIH-H2122, and LCAM1, a human prostate cancer line PC3, human pancreatic cancer lines BxPC-3, Capan-1, and PK-1, a human ovarian cancer line SKOV3, and a human colorectal cancer line COLO205, however the cell line according to the present invention is not limited to these cell lines as long as they express TROP2.

(2) Production of anti-TROP2 monoclonal antibody

[00129] Exemplos do anticorpo especificamente ligado à TROP2 incluem um anticorpo monoclonal especificamente ligado à TROP2, e um método de obter tal anticorpo é como descrito abaixo.[00129] Examples of the antibody specifically bound to TROP2 include a monoclonal antibody specifically bound to TROP2, and a method of obtaining such an antibody is as described below.

[00130] A produção de um anticorpo monoclonal geralmente requer as seguintes etapas operacionais de: (a) purificar um biopolímero a ser usado como um antígeno, ou preparar as células de expressão de antígeno; (b) preparar as células de produção de anticorpo imunizando um animal por injeção do antígeno, coletar o sangue, analisar seu título de anticorpo para determinar quando o baço deve ser cortado; (c) preparar as células de mieloma (em seguida referidas como "mieloma"); (d) fundir as células de produção de anticorpo com o mieloma; (e) avaliar um grupo de hibridomas que produz um anticorpo desejado; (f) dividir os hibridomas em clones de célula isolada (clonagem); (g) opcionalmente, cultivar o hibridoma ou criando um animal implantado com o hibridoma para produzir uma quantidade grande de anticorpo monoclonal; (h) examinar o anticorpo monoclonal desse modo produzido para atividade biológica e especificidade de ligação, ou analisar o mesmo quanto a propriedades como um reagente rotulado; e similares.[00130] The production of a monoclonal antibody generally requires the following operational steps of: (a) purifying a biopolymer to be used as an antigen, or preparing antigen-expressing cells; (b) prepare the antibody-producing cells by immunizing an animal by injecting the antigen, collecting the blood, analyzing its antibody titer to determine when the spleen should be cut; (c) preparing myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma"); (d) fusing the antibody-producing cells with the myeloma; (e) evaluating a group of hybridomas that produce a desired antibody; (f) dividing the hybridomas into single cell clones (cloning); (g) optionally, culturing the hybridoma or creating an animal implanted with the hybridoma to produce a large amount of monoclonal antibody; (h) examining the monoclonal antibody thus produced for biological activity and binding specificity, or analyzing the same for properties as a labeled reagent; and similar.

[00131] Em seguida, o método de produzir um anticorpo monoclonal será descrito em detalhes seguindo as etapas acima, entretanto, o método não está limitado a estas, e, por exemplo, as células de produção de anticorpos diferentes das células de baço e mieloma podem ser usadas.[00131] Next, the method of producing a monoclonal antibody will be described in detail following the above steps, however, the method is not limited to these, and, for example, antibody producing cells other than spleen and myeloma cells can be used.

Antigen purification

[00132] Como o antígeno, TROP2 preparada pelo método como descrito acima ou um peptídeo parcial do mesmo pode ser usada.[00132] As the antigen, TROP2 prepared by the method as described above or a partial peptide thereof can be used.

[00133] Além disso, uma fração de membrana preparada de células recombinante expressando TROP2 ou as células recombinantes expressando TROP2 por si próprias, e da mesma forma um peptídeo parcial da proteína da invenção quimicamente sintetizado por um método conhecido por aqueles versados na técnica pode da mesma forma ser usado como o antígeno.[00133] Furthermore, a membrane fraction prepared from recombinant cells expressing TROP2 or the recombinant cells expressing TROP2 themselves, and likewise a partial peptide of the protein of the invention chemically synthesized by a method known to those skilled in the art can of similarly be used as the antigen.

[00134] Além disso, uma linhagem celular expressando TROP2 pode da mesma forma ser usada como o antígeno.[00134] Furthermore, a cell line expressing TROP2 can also be used as the antigen.

(b) Preparation of antibody-producing cells

[00135] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund ou agente auxiliar tal como aluminossulfato de potássio, e a mistura resultante é usada como um imunógeno para imunizar um animal experimental. Em um método alternativo, o animal experimental é imunizado com células de expressão de antígeno como um imunógeno. Como o animal experimental, qualquer animal usado em um método de produção de hibridoma conhecido pode ser usado sem impedimento. Especificamente, por exemplo, um camundongo, um rato, uma cabra, ovelha, gado, um cavalo, ou similares podem ser usados. Entretanto, do ponto de vista da facilidade de disponibilidade das células de mieloma a serem fundidas com as células de produção de anticorpo extraídas, um camundongo ou um rato é preferivelmente usado como o animal a ser imunizado.[00135] The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as complete or incomplete Freund's adjuvant or auxiliary agent such as potassium aluminosulfate, and the resulting mixture is used as an immunogen to immunize an experimental animal. In an alternative method, the experimental animal is immunized with antigen-expressing cells as an immunogen. Like the experimental animal, any animal used in a known hybridoma production method can be used without hindrance. Specifically, for example, a mouse, a rat, a goat, sheep, cattle, a horse, or the like can be used. However, from the point of view of the ease of availability of the myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, a mouse or a rat is preferably used as the animal to be immunized.

[00136] Além disso, a cepa de um camundongo ou um rato a ser usada não está particularmente limitada, e no caso de um camundongo, por exemplo, várias cepas tais como, A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, e 129, e similares podem ser usadas, e no caso de um rato, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer, e similares podem ser usados.[00136] Furthermore, the strain of a mouse or a rat to be used is not particularly limited, and in the case of a mouse, for example, various strains such as A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE , C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, and 129, and the like can be used, and in the case of a mouse, for example, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer, and the like can be used.

[00137] Estes camundongos e ratos podem ser obtidos de criadores/distribuidores de animais experimentais, por exemplo, CLEA Japan, Inc., e Charles River Laboratories Japan, Inc.,[00137] These mice and rats can be obtained from experimental animal breeders/distributors, for example, CLEA Japan, Inc., and Charles River Laboratories Japan, Inc.,

[00138] Em atenção à compatibilidade da fusão com células de mieloma descritas abaixo, no caso de um camundongo, cepa de BALB/c, e no caso de um rato, cepas de Wistar e Low são particularmente preferidas como o animal a ser imunizado.[00138] In consideration of the compatibility of the fusion with myeloma cells described below, in the case of a mouse, BALB/c strain, and in the case of a rat, Wistar and Low strains are particularly preferred as the animal to be immunized.

[00139] Além disso, em atenção à homologia antigênica entre os seres humanos e camundongos, é da mesma forma preferido usar um camundongo tendo a função biológica diminuída para remover os autoanticorpos, isto é, um camundongo com uma doença autoimune.[00139] Furthermore, in consideration of the antigenic homology between humans and mice, it is also preferred to use a mouse having diminished biological function to remove the autoantibodies, that is, a mouse with an autoimmune disease.

[00140] A idade de tal camundongo ou rato na hora da imunização é preferivelmente 5 a 12 semanas de idade, mais preferivelmente 6 a 8 semanas de idade.[00140] The age of such a mouse or rat at the time of immunization is preferably 5 to 12 weeks of age, more preferably 6 to 8 weeks of age.

[00141] Para imunizar um animal com TROP2 ou um recombinante do mesmo, por exemplo, um método conhecido descrito em detalhes em, por exemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ou similares pode ser usado.[00141] To immunize an animal with TROP2 or a recombinant thereof, for example, a known method is described in detail in, for example, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) or the like can be used.

[00142] Entre estes métodos de imunização, um método específico preferido na presente invenção é, por exemplo, como segue.[00142] Among these immunization methods, a specific method preferred in the present invention is, for example, as follows.

[00143] Isto é, primeiro, uma fração de proteína de membrana que serve como o antígeno ou células feito(s) para expressar o antígeno é/são intradermicamente ou intraperitonealmente administrado(s) a um animal. Entretanto, a combinação de ambas as rotinas de administração é preferida para aumentar a eficiência da imunização, e quando a administração intradérmica é realizada na primeira metade e a administração intraperitoneal é realizada na segunda metade ou apenas na última dosagem, a eficiência da imunização pode ser aumentada particularmente.[00143] That is, first, a membrane protein fraction that serves as the antigen or cells made to express the antigen is/are intradermally or intraperitoneally administered to an animal. However, the combination of both administration routines is preferred to increase the immunization efficiency, and when intradermal administration is performed in the first half and intraperitoneal administration is performed in the second half or only in the last dosage, the immunization efficiency can be particularly increased.

[00144] O horário de administração do antígeno varia, dependendo do tipo de animal a ser imunizado, diferença individual ou similares. Entretanto, em geral, um horário de administração no qual a frequência de administração do antígeno é 3 a 6 vezes, e o intervalo de dosagem é 2 a 6 semanas é preferido, e um horário de administração no qual a frequência de administração do antígeno é 3 a 4 vezes, e o intervalo de dosagem é 2 a 4 semanas é mais preferido.[00144] The antigen administration time varies, depending on the type of animal to be immunized, individual differences or similar. However, in general, an administration schedule in which the antigen administration frequency is 3 to 6 times, and the dosing interval is 2 to 6 weeks is preferred, and an administration schedule in which the antigen administration frequency is 3 to 4 times, and the dosage interval is 2 to 4 weeks is more preferred.

[00145] Além disso, a dose do antígeno varia, dependendo do tipo de animal, diferenças individuais ou similares, entretanto, a dose é geralmente fixada em 0,05 a 5 mg, preferivelmente cerca de 0,1 a 0,5 mg.[00145] Furthermore, the dose of antigen varies depending on the type of animal, individual differences or the like, however, the dose is generally fixed at 0.05 to 5 mg, preferably about 0.1 to 0.5 mg.

[00146] Uma imunização de reforço é realizada 1 a 6 semanas, preferivelmente 1 a 4 semanas, mais preferivelmente 1 a 3 semanas após a administração do antígeno como descrito acima. Quando o imunógeno é células, 1 x 106 a 1 x 107 células são empregadas.[00146] A booster immunization is carried out 1 to 6 weeks, preferably 1 to 4 weeks, more preferably 1 to 3 weeks after administration of the antigen as described above. When the immunogen is cells, 1 x 106 to 1 x 107 cells are employed.

[00147] A dose do antígeno na hora da realização da imunização de reforço varia dependendo do tipo ou tamanho de animal ou similares, entretanto, no caso de, por exemplo, um camundongo, a dose geralmente é fixada em 0,05 a 5 mg, preferivelmente 0,1 a 0,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a 0,2 mg. Quando o imunógeno é células, 1 x 106 a 1 x 107 células são empregadas.[00147] The dose of antigen when carrying out booster immunization varies depending on the type or size of animal or similar, however, in the case of, for example, a mouse, the dose is generally fixed at 0.05 to 5 mg , preferably 0.1 to 0.5 mg, more preferably about 0.1 to 0.2 mg. When the immunogen is cells, 1 x 106 to 1 x 107 cells are employed.

[00148] As células de baço ou linfócitos incluindo as células de produção de anticorpos são assepticamente removidos do animal imunizado após 1 a 10 dias, preferivelmente 2 a 5 dias, mais preferivelmente 2 a 3 dias da imunização de reforço. Neste momento, o título de anticorpo é medido, e se um animal tendo um título de anticorpo suficientemente aumentado é usado como uma fonte de fornecimento das células de produção de anticorpos, o procedimento subsequente pode ser realizado mais eficazmente.[00148] Spleen cells or lymphocytes including antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized animal after 1 to 10 days, preferably 2 to 5 days, more preferably 2 to 3 days of booster immunization. At this time, the antibody titer is measured, and if an animal having a sufficiently increased antibody titer is used as a source of supply of the antibody-producing cells, the subsequent procedure can be carried out more effectively.

[00149] Exemplos do método de medir o título de anticorpo a ser usado aqui incluem um método de RIA e um método de ELISA, mas o método não está limitado a estes. Por exemplo, se um método de ELISA é empregado, a medida do título de anticorpo na invenção pode ser realizada de acordo com os procedimentos como descrito abaixo.[00149] Examples of the method of measuring the antibody titer to be used here include an RIA method and an ELISA method, but the method is not limited to these. For example, if an ELISA method is employed, measurement of the antibody titer in the invention can be carried out according to the procedures as described below.

[00150] Primeiro, um antígeno purificado ou parcialmente purificado é absorvido à superfície de uma fase sólida tal como uma placa de 96 cavidades para ELISA, e a superfície da fase sólida não tendo nenhum antígeno absorvido a esta é revestida com uma proteína não relacionada ao antígeno tal como albumina de soro bovina (BSA). Após a lavagem da superfície, a superfície é trazida em contato com uma amostra serialmente diluída (por exemplo, soro de camundongo) como um anticorpo primário para permitir o anticorpo na amostra ligar- se ao antígeno.[00150] First, a purified or partially purified antigen is absorbed to the surface of a solid phase such as a 96-well plate for ELISA, and the surface of the solid phase having no antigen absorbed to it is coated with a protein unrelated to the antigen such as bovine serum albumin (BSA). After washing the surface, the surface is brought into contact with a serially diluted sample (e.g., mouse serum) as a primary antibody to allow the antibody in the sample to bind to the antigen.

[00151] Além disso, como um anticorpo secundário, um anticorpo rotulado com uma enzima contra um anticorpo de camundongo é adicionado e é permitido ligar-se ao anticorpo de camundongo. Após a lavagem, um substrato para a enzima é adicionado e uma mudança na absorvência que ocorre devido ao desenvolvimento da cor induzido por degradação do substrato ou similares é medido e o título de anticorpo é calculado com base na medida.[00151] Furthermore, as a secondary antibody, an enzyme-labeled antibody against a mouse antibody is added and is allowed to bind to the mouse antibody. After washing, a substrate for the enzyme is added and a change in absorbency that occurs due to color development induced by degradation of the substrate or the like is measured and the antibody titer is calculated based on the measurement.

[00152] A separação das células de produção de anticorpos das células de baço ou linfócitos do animal imunizado pode ser realizada de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por exemplo, no caso de células de baço, um método geral no qual as células de produção de anticorpo são separadas homogeneizando-se o baço para obter as células por filtração com uma malha de aço inoxidável e suspendendo-se as células no Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM) pode ser empregado.[00152] Separation of antibody-producing cells from spleen cells or lymphocytes of the immunized animal can be carried out according to a known method (e.g., Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). For example, in the case of spleen cells, a general method in which antibody-producing cells are separated by homogenizing the spleen to obtain the cells by filtration through a stainless steel mesh and suspending the cells in Minimum Essential Medium of Eagle (MEM) can be employed.

(c) Preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma")

[00153] As células de mieloma a ser usadas para fusão da célula não estão particularmente limitadas e as células adequadas podem ser selecionadas a partir das linhagens celulares conhecidas. Entretanto, em atenção à conveniência quando um hibridoma é selecionado de células fundidas, é preferido usar uma cepa deficiente de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase) cujo procedimento de seleção foi estabelecido.[00153] Myeloma cells to be used for cell fusion are not particularly limited and suitable cells can be selected from known cell lines. However, in consideration of convenience when a hybridoma is selected from fused cells, it is preferred to use an HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) deficient strain whose selection procedure has been established.

[00154] Mais especificamente, exemplos da cepa deficiente de HGPRT incluem X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63- Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11- 45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, e BU.1 derivado de camundongos; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivado de ratos; e U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR- LOW-HMy2(HMy2) e 8226AR/NIP4-1(NP41) derivado de humanos. Estas cepas deficientes de HGPRT estão disponíveis de, por exemplo, ATCC ou similares.[00154] More specifically, examples of the HGPRT-deficient strain include X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), /0-Ag14(SP2/0), MPC11- 45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, and mouse-derived BU.1; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derived from rats; and human-derived U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR- LOW-HMy2(HMy2), and 8226AR/NIP4-1(NP41). These HGPRT deficient strains are available from, for example, ATCC or the like.

[00155] Estas cepas de célula são subcultivadas em um meio apropriado tal como um meio de 8-azaguanina (um meio obtido adicionando-se 8-azaguanina a um meio de RPMI1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, e soro de bezerro fetal (em seguida referido como "FBS")), Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), ou Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM). Neste caso, 3 a 4 dias antes de realizar a fusão da célula, as células são subcultivadas em um meio normal (por exemplo, um meio de ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) contendo 10% de FCS) para garantir não menos que 2 x 107 células no dia da fusão da célula.[00155] These cell strains are subcultured in an appropriate medium such as 8-azaguanine medium (a medium obtained by adding 8-azaguanine to RPMI1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and calf serum (hereinafter referred to as "FBS")), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), or Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). In this case, 3 to 4 days before performing cell fusion, the cells are subcultured in a normal medium (e.g., ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Ltd.) containing 10% FCS) to ensure no less than 2 x 107 cells on the day of cell fusion.

(d) Cell fusion

[00156] A fusão entre as células de produção de anticorpos e as células de mieloma pode ser realizada adequadamente de acordo com um método conhecido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), sob condições tal que a taxa de sobrevivência das células não é excessivamente reduzida.[00156] Fusion between antibody-producing cells and myeloma cells can be suitably carried out according to a known method (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford ( 1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), under conditions such that the survival rate of the cells is not excessively reduced.

[00157] Como um tal método, por exemplo, um método químico em que as células de produção de anticorpos e as células de mieloma são misturadas em uma solução contendo um polímero tal como polietileno glicol a uma concentração alta, um método físico usando a estimulação elétrica, ou similares pode ser usado. Entre estes métodos, um exemplo específico do método químico é como descrito abaixo.[00157] As such a method, for example, a chemical method in which antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a solution containing a polymer such as polyethylene glycol at a high concentration, a physical method using stimulation electric, or similar can be used. Among these methods, a specific example of the chemical method is as described below.

[00158] Isto é, no caso onde o polietileno glicol é usado na solução contendo um polímero em uma alta concentração, as células de produção de anticorpos, e as células de mieloma são misturadas em uma solução de polietileno glicol tendo um peso molecular de 1500 a 6000, mais preferivelmente 2000 a 4000 a uma temperatura de 30 a 40oC, preferivelmente de 35 a 38oC durante 1 a 10 minutos, preferivelmente 5 a 8 minutos.[00158] That is, in the case where polyethylene glycol is used in the solution containing a polymer in a high concentration, antibody-producing cells, and myeloma cells are mixed in a solution of polyethylene glycol having a molecular weight of 1500 to 6000, more preferably 2000 to 4000 at a temperature of 30 to 40°C, preferably 35 to 38°C for 1 to 10 minutes, preferably 5 to 8 minutes.

(e) Selection of a group of hybridomas

[00159] O método de selecionar hibridomas obtidos pela fusão de célula acima descrito não é particularmente limitado. Normalmente, um método de seleção de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p., 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p., 550) é usado.[00159] The method of selecting hybridomas obtained by cell fusion described above is not particularly limited. Typically, a HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) selection method (Kohler et al., Nature (1975), 256, p., 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p., 550) it is used.

[00160] Este método é efetivo quando os hibridomas são obtidos usando as células de mieloma de uma cepa deficiente de HGPRT que não sobrevive na presença de aminopterina. Isto é, cultivando-se as células não fundidas e os hibridomas em um meio de HAT, apenas os hibridomas resistentes à aminopterina são seletivamente permitidos sobreviverem e proliferarem.[00160] This method is effective when hybridomas are obtained using myeloma cells from an HGPRT-deficient strain that does not survive in the presence of aminopterin. That is, by growing unfused cells and hybridomas in HAT medium, only aminopterin-resistant hybridomas are selectively allowed to survive and proliferate.

(f) Division into an isolated cell clone (cloning)

[00161] Como um método de clonagem para hibridomas, um método conhecido tal como um método de metilcelulose, um método de agarose macia, ou um método de diluição limitante pode ser usado (veja, por exemplo, Barbara, B.M. e Stanley, M.S.: Selected Methods in Celular Immunology, W., H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estes métodos, particularmente, um método de cultura tridimensional tal como um método de metilcelulose é preferido. Por exemplo, o grupo de hibridomas produzidos por fusão de célula é suspenso em um meio de metilcelulose tal como Meio D de seleção ClonaCell-HY (fabricado por StemCell Technologies, Inc., #03804) e cultivado. Em seguida, as colônias de hibridoma formadas são coletadas, por meio das quais os hibridomas monoclonais podem ser obtidos. As colônias de hibridoma respectivas coletadas são cultivadas, e um hibridoma que foi confirmado ter um título de anticorpo estável em um sobrenadante de cultura de hibridoma obtido é selecionado como uma cepa de hibridoma de produção de anticorpo monoclonal de TROP2.[00161] As a cloning method for hybridomas, a known method such as a methylcellulose method, a soft agarose method, or a limiting dilution method can be used (see, for example, Barbara, B.M. and Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W., H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Among these methods, particularly, a three-dimensional culture method such as a methylcellulose method is preferred. For example, the pool of hybridomas produced by cell fusion is suspended in a methylcellulose medium such as ClonaCell-HY Selection Medium D (manufactured by StemCell Technologies, Inc., #03804) and cultured. Then the formed hybridoma colonies are collected, through which monoclonal hybridomas can be obtained. The collected respective hybridoma colonies are cultured, and a hybridoma that has been confirmed to have a stable antibody titer in an obtained hybridoma culture supernatant is selected as a TROP2 monoclonal antibody-producing hybridoma strain.

[00162] Exemplos da cepa de hibridoma desse modo estabelecida incluem o hibridoma de TROP2 TINA1. Nesta especificação, um anticorpo produzido pelo hibridoma de TROP2 TINA1 é referido como "anticorpo TINA1" ou simplesmente "TINA1".[00162] Examples of the hybridoma strain thus established include the TROP2 TINA1 hybridoma. In this specification, an antibody produced by the TROP2 TINA1 hybridoma is referred to as a "TINA1 antibody" or simply "TINA1".

[00163] A região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:2 na Listagem de Sequência. Além disso, a região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:4 na Listagem de Sequência.[00163] The heavy chain variable region of the TINA1 antibody has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2 in the Sequence Listing. Furthermore, the light chain variable region of the TINA1 antibody has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4 in the Sequence Listing.

(g) Preparation of monoclonal antibody by culturing the hybridoma

[00164] Cultivando-se o hibridoma desse modo selecionado, um anticorpo monoclonal pode ser obtido eficazmente. Entretanto, antes de cultivar, é preferido realizar a avaçiação de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal alvo.[00164] By cultivating the hybridoma selected in this way, a monoclonal antibody can be effectively obtained. However, before culturing, it is preferred to perform evaluation of a hybridoma that produces a target monoclonal antibody.

[00165] Em tal avaliação, um método conhecido pode ser empregado.[00165] In such an assessment, a known method can be employed.

[00166] A medida do título de anticorpo na invenção pode ser realizada por, por exemplo, um método de ELISA explicado no item (b) descrito acima.[00166] The measurement of the antibody titer in the invention can be carried out by, for example, an ELISA method explained in item (b) described above.

[00167] O hibridoma obtido pelo método descrito acima pode ser armazenado em um estado congelado em nitrogênio líquido ou em um congelador a -80oC ou abaixo.[00167] The hybridoma obtained by the method described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at -80oC or below.

[00168] Depois da conclusão da clonagem, o meio é mudado de um médio de HT para um meio normal, e o hibridoma é cultivado.[00168] After completion of cloning, the medium is changed from HT medium to normal medium, and the hybridoma is cultured.

[00169] A cultura em grande escala é realizada por cultura de rotação usando um frasco de cultura grande ou por cultura de centrifugação. A partir do sobrenadante obtido pela cultura em grande escala, um anticorpo monoclonal que especificamente liga-se à proteína da invenção pode ser obtido por purificação usando um método conhecido por aqueles versados na técnica tal como filtração de gel.[00169] Large-scale culture is performed by rotation culture using a large culture bottle or by centrifuge culture. From the supernatant obtained by large-scale culture, a monoclonal antibody that specifically binds the protein of the invention can be obtained by purification using a method known to those skilled in the art such as gel filtration.

[00170] Além disso, o hibridoma é injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma cepa como o hibridoma (por exemplo, o BALB/c acima descrito) ou um camundongo Nu/Nu para proliferar o hibridoma, por meio do qual o ascito contendo uma quantidade grande do anticorpo monoclonal da invenção pode ser obtido.[00170] Furthermore, the hybridoma is injected into the abdominal cavity of a mouse of the same strain as the hybridoma (e.g., the BALB/c described above) or a Nu/Nu mouse to proliferate the hybridoma, whereby the ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the invention can be obtained.

[00171] No caso onde o hibridoma é administrado na cavidade abdominal, se um óleo mineral tal como 2, 6, 10, 14-tetrametil pentadecano (pristano) é administrado 3 a 7 dias antes disso, uma quantidade maior do ascito pode ser obtida.[00171] In the case where the hybridoma is administered into the abdominal cavity, if a mineral oil such as 2, 6, 10, 14-tetramethyl pentadecane (pristane) is administered 3 to 7 days before that, a larger amount of ascites can be obtained .

[00172] Por exemplo, um imunossupressor é previamente injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma cepa como o hibridoma para inativar as células T. 20 Dias após, 106 a 107 células de clone de hibridoma são suspensas em um meio livre de soro (0,5 ml), e a suspensão é administrada na cavidade abdominal do camundongo. Em geral, quando o abdômen é ampliado e preenchido com o ascito, o ascito é coletado a partir do camundongo. Por este método, o anticorpo monoclonal pode ser obtido em uma concentração que é cerca de 100 vezes ou muito maior do que aquela na solução de cultura.[00172] For example, an immunosuppressant is previously injected into the abdominal cavity of a mouse of the same strain as the hybridoma to inactivate the T cells. 20 Days later, 106 to 107 hybridoma clone cells are suspended in a serum-free medium ( 0.5 ml), and the suspension is administered into the abdominal cavity of the mouse. In general, when the abdomen is enlarged and filled with ascites, the ascites is collected from the mouse. By this method, the monoclonal antibody can be obtained at a concentration that is about 100 times or much higher than that in the culture solution.

[00173] O anticorpo monoclonal obtido pelo método acima descrito pode ser purificado por um método descrito em, por exemplo, Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).[00173] The monoclonal antibody obtained by the method described above can be purified by a method described in, for example, Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).

[00174] O anticorpo monoclonal desse modo obtido tem especificidade de antígeno alta para TROP2. (n) Ensaio de anticorpo monoclonal[00174] The monoclonal antibody thus obtained has high antigen specificity for TROP2. (n) Monoclonal antibody assay

[00175] O isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal desse modo obtido podem ser determinados como segue.[00175] The isotype and subclass of the monoclonal antibody thus obtained can be determined as follows.

[00176] Primeiro, exemplos do método de identificação incluem um método de Ouchterlony, um método de ELISA, e um método de RIA.[00176] First, examples of the identification method include an Ouchterlony method, an ELISA method, and an RIA method.

[00177] Um método de Ouchterlony é simples, porém, quando a concentração do anticorpo monoclonal é baixa, uma operação de condensação é requerida.[00177] An Ouchterlony method is simple, however, when the concentration of the monoclonal antibody is low, a condensation operation is required.

[00178] Por outro lado, quando um método de ELISA ou um método de RIA é usado, reagindo-se diretamente o sobrenadante de cultura com uma fase sólida absorvida por antígeno e usando anticorpos que correspondem a vários tipos de isótipos de imunoglobulina e subclasses como anticorpos secundários, o isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal podem ser identificados.[00178] On the other hand, when an ELISA method or an RIA method is used, directly reacting the culture supernatant with an antigen-absorbed solid phase and using antibodies that correspond to various types of immunoglobulin isotypes and subclasses such as secondary antibodies, the isotype and subclass of the monoclonal antibody can be identified.

[00179] Além disso, como um método mais simples, um kit de identificação comercialmente disponível (por exemplo, Mouse Typer Kit fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) ou similares pode da mesma forma ser usado.[00179] Furthermore, as a simpler method, a commercially available identification kit (e.g., Mouse Typer Kit manufactured by Bio-Rad Laboratories, Inc.) or the like can also be used.

[00180] Além disso, a determinação quantitativa de uma proteína pode ser realizada pelo método de Folin Lowry e um método de cálculo com base na absorvência em 280 nm (1,4 (OD280) = Imunoglobulina 1 mg/ml).[00180] Furthermore, the quantitative determination of a protein can be carried out by the Folin Lowry method and a calculation method based on absorbance at 280 nm (1.4 (OD280) = Immunoglobulin 1 mg/ml).

[00181] Além disso, até mesmo quando o anticorpo monoclonal é separadamente e independentemente obtido realizando-se novamente as etapas de (a) a (h) em (2), é possível obter um anticorpo tendo uma atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo TINA1. Como um exemplo de um tal anticorpo, um anticorpo que liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo TINA1 pode ser exemplificado. Se um anticorpo monoclonal recentemente produzido liga-se a um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial a qual o anticorpo TINA1 ligase, pode ser determinado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo TINA1. Além disso, confirmando-se que o anticorpo monoclonal compete com o anticorpo TINA1 para a ligação a TROP2 (isto é, o anticorpo monoclonal inibe a ligação entre o anticorpo TINA1 e TROP2), pode ser determinado que o anticorpo monoclonal ligue-se mesmo ao mesmo epítopo como o anticorpo anti- TROP2 mesmo que a sequência de epítopo específica ou estrutura não tenha sido determinada. Quando é confirmado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo anti-TROP2, é esperado fortemente que o anticorpo monoclonal tenha a afinidade de ligação de antígeno e uma atividade biológica equivalente àquela do anticorpo TINA1.[00181] Furthermore, even when the monoclonal antibody is separately and independently obtained by performing steps (a) to (h) in (2) again, it is possible to obtain an antibody having a cytotoxic activity equivalent to that of the TINA1 antibody . As an example of such an antibody, an antibody that binds to the same epitope as the TINA1 antibody can be exemplified. If a newly produced monoclonal antibody binds to a partial peptide or a partial tertiary structure to which the TINA1 antibody binds, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the TINA1 antibody. Furthermore, by confirming that the monoclonal antibody competes with the TINA1 antibody for binding to TROP2 (i.e., the monoclonal antibody inhibits binding between the TINA1 antibody and TROP2), it can be determined that the monoclonal antibody binds even to same epitope as the anti-TROP2 antibody even if the specific epitope sequence or structure has not been determined. When it is confirmed that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the anti-TROP2 antibody, it is strongly expected that the monoclonal antibody will have antigen-binding affinity and biological activity equivalent to that of the TINA1 antibody.

(3) Other antibodies

[00182] O anticorpo da invenção não inclui apenas o anticorpo monoclonal acima descrito contra TROP2, porém, da mesma forma um anticorpo recombinante obtido por modificação artificial com a finalidade de diminuir a antigenicidade heteróloga para humanos tais como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Estes anticorpos podem ser produzidos usando um método conhecido.[00182] The antibody of the invention not only includes the above-described monoclonal antibody against TROP2, but also a recombinant antibody obtained by artificial modification for the purpose of decreasing heterologous antigenicity for humans such as a chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody. These antibodies can be produced using a known method.

[00183] Como o anticorpo quimérico, um anticorpo no qual regiões constantes e variáveis de anticorpo são derivadas de espécies diferentes, por exemplo, um anticorpo quimérico em que uma região variável de anticorpo derivada de camundongo ou de rato é conectada a uma região constante de anticorpo derivada de humano pode ser exemplificado (veja Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).[00183] As a chimeric antibody, an antibody in which antibody constant and variable regions are derived from different species, for example, a chimeric antibody in which a mouse or rat derived antibody variable region is connected to a constant region of human-derived antibody can be exemplified (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).

[00184] Como o anticorpo humanizado, um anticorpo obtido integrando-se apenas uma região de determinação de complementaridade (CDR) em um anticorpo derivado de humano (veja Nature (1986) 321, pp. 522-525), e um anticorpo obtido enxertando-se uma parte dos resíduos de aminoácido da estrutura bem como a sequência de CDR a um anticorpo humano por um método de enxerto de CDR (Publicação Internacional No. WO90/07861) pode ser exemplificado.[00184] As the humanized antibody, an antibody obtained by integrating only a complementarity determining region (CDR) into a human-derived antibody (see Nature (1986) 321, pp. 522-525), and an antibody obtained by grafting A part of the framework amino acid residues as well as the CDR sequence to a human antibody by a CDR grafting method (International Publication No. WO90/07861) can be exemplified.

[00185] Entretanto, o anticorpo humanizado derivado do anticorpo TINA1 não está limitado a um anticorpo humanizado específico contanto que o anticorpo humanizado tenha todos os 6 tipos de sequências de CDR do anticorpo TINA1. A região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 tem CDRH1 (TAGMQ) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:23 na Listagem de Sequência, CDRH2 (WINTHSGVPKYAEDFKG) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:24 na Listagem de Sequência, e CDRH3 (SGFGSSYWYFDV) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:25 na Listagem de Sequência. Além disso, a região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 tem CDRL1 (KASQDVSTAVA) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:26 na Listagem de Sequência, CDRL2 (SASYRYT) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:27 na Listagem de Sequência, e CDRL3 (QQHYITPLT) consistindo em uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO:28 na Listagem de Sequência.[00185] However, the humanized antibody derived from the TINA1 antibody is not limited to a specific humanized antibody as long as the humanized antibody has all 6 types of CDR sequences of the TINA1 antibody. The heavy chain variable region of the TINA1 antibody has CDRH1 (TAGMQ) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:23 in the Sequence Listing, CDRH2 (WINTHSGVPKYAEDFKG) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:24 in Sequence Listing, and CDRH3 (SGFGSSYWYFDV) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:25 in the Sequence Listing. Furthermore, the light chain variable region of the TINA1 antibody has CDRL1 (KASQDVSTAVA) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:26 in the Sequence Listing, CDRL2 (SASYRYT) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: :27 in the Sequence Listing, and CDRL3 (QQHYITPLT) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:28 in the Sequence Listing.

[00186] Como um exemplo do anticorpo humanizado de um anticorpo de camundongo TINA1, uma combinação arbitrária de uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em qualquer uma dentre (1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO:12, 14, ou 16 na Listagem de Sequência, (2) uma sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácido (1) descrita acima, e (3) uma sequência de aminoácido em que um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácido (1) descrita acima é/são deletado(s), substituído(s) ou adicionado(s) e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em qualquer uma dentre (4) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO:18, 20, ou 22 na Listagem de Sequência, (5) uma sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácido (4) descrita acima, e (6) uma sequência de aminoácido em que um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácido (4) descrita acima é/são deletado(s), substituído(s) ou adicionado(s) pode(m) ser exemplificado(s).[00186] As an example of the humanized antibody of a TINA1 mouse antibody, an arbitrary combination of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of any one of (1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO:12, 14, or 16 in the Sequence Listing, (2) an amino acid sequence having a homology of at least 95% or more to the amino acid sequence (1) described above, and (3) a sequence of amino acid in which one or more amino acids in the amino acid sequence (1) described above is/are deleted, substituted or added and a light chain comprising a light chain variable region consisting of any one of (4) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 of SEQ ID NO:18, 20, or 22 in the Sequence Listing, (5) an amino acid sequence having a homology of at least 95% or more to the amino acid sequence (4) described above, and (6) an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence (4) described above is/are deleted, substituted or added may (m) be exemplified.

[00187] O termo "vários" quando aqui usado refere-se a 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, ou 1 ou 2.[00187] The term "several" when used herein refers to 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 or two.

[00188] Como a substituição de aminoácido nesta especificação, uma substituição de aminoácido conservadora é preferida. A substituição de aminoácido conservadora refere-se a uma substituição ocorrendo dentro de um grupo de aminoácidos relacionados às cadeias laterais de aminoácido. Grupos de aminoácido preferidos são como segue: um grupo ácido (ácido aspártico e ácido glutâmico); um grupo básico (lisina, arginina, e histidina); um grupo não polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, e triptofano); e uma família polar não carregada (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, e tirosina). Grupos de aminoácido mais preferidos são como segue: um grupo hidróxi alifático (serina e treonina); um grupo contendo amida (asparagina e glutamina); um grupo alifático (alanina, valina, leucina, e isoleucina); e um grupo aromático (fenilalanina, triptofano, e tirosina). Uma tal substituição de aminoácido é preferivelmente realizada dentro de uma faixa que não concede propriedades de uma substância tendo a sequência de aminoácido original.[00188] As with the amino acid substitution in this specification, a conservative amino acid substitution is preferred. Conservative amino acid substitution refers to a substitution occurring within a group of amino acids related to the amino acid side chains. Preferred amino acid groups are as follows: an acidic group (aspartic acid and glutamic acid); a basic group (lysine, arginine, and histidine); a nonpolar group (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan); and an uncharged polar family (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, and tyrosine). More preferred amino acid groups are as follows: an aliphatic hydroxy group (serine and threonine); an amide-containing group (asparagine and glutamine); an aliphatic group (alanine, valine, leucine, and isoleucine); and an aromatic group (phenylalanine, tryptophan, and tyrosine). Such an amino acid substitution is preferably carried out within a range that does not impart properties of a substance having the original amino acid sequence.

[00189] Como um anticorpo que tem uma combinação preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 20; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 22; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 20; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 22; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 20; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 22 podem ser exemplificados. (1) Além disso, como um anticorpo que tem uma combinação mais preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 20; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 22; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 20; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 22; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 20; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 22 podem ser exemplificados.[00189] As an antibody having a preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 20; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 22; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 20; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 22; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 20; and an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of positions of amino acid 21 to 129 of SEQ ID NO: 22 can be exemplified. (1) Furthermore, as an antibody having a more preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 20; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 22; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 20; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 22; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 20; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: : 22 can be exemplified.

[00190] Como um anticorpo que tem uma combinação preferida superior de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 20; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 140 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 129 de SEQ ID NO: 22 podem ser exemplificados.[00190] As an antibody having a higher preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 of SEQ ID NO: 20; and an antibody consisting of a heavy chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 16 and a light chain comprising a variable region consisting of an amino acid sequence consisting of residues of amino acid 21 to 129 of SEQ ID NO: 22 can be exemplified.

[00191] Além disso, como um anticorpo que tem uma outra combinação mais preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 podem ser exemplificados.[00191] Furthermore, as an antibody having another more preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 can be exemplified.

[00192] Como um anticorpo que tem uma combinação preferida superior de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 20; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 470 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 22 podem ser exemplificados.[00192] As an antibody having a higher preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 20; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: : 22 can be exemplified.

[00193] Além disso, como um anticorpo que tem uma combinação preferida mais superior de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 469 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 469 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 469 de SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 20; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 20 a 469 de SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em posições de aminoácido 21 a 234 de SEQ ID NO: 22 podem ser exemplificados.[00193] Furthermore, as an antibody having a more superior preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 469 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 469 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 469 of SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 20; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 20 to 469 of SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid positions 21 to 234 of SEQ ID NO: : 22 can be exemplified.

[00194] Combinando-se uma sequência tendo uma alta homologia com a sequência de aminoácido de cadeia pesada acima descrita com uma sequência tendo uma homologia alta com a sequência de aminoácido de cadeia leve acima descrita, é possível selecionar um anticorpo tendo uma atividade biológica equivalente àquela dos anticorpos acima descritos. Uma tal homologia é geralmente uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente uma homologia de 90% ou mais, mais preferivelmente uma homologia de 95% ou mais, preferivelmente uma homologia de 99% ou mais. Além disso, combinando-se uma sequência de aminoácido em que um a vários resíduos de aminoácido são substituídos, deletados ou adicionados na sequência de aminoácido de cadeia pesada ou de cadeia leve, também é possível selecionar um anticorpo tendo uma atividade biológica equivalente àquela de cada dentre os anticorpos acima descritos.[00194] By combining a sequence having a high homology to the above-described heavy chain amino acid sequence with a sequence having a high homology to the above-described light chain amino acid sequence, it is possible to select an antibody having an equivalent biological activity to that of the antibodies described above. Such homology is generally a homology of 80% or more, preferably a homology of 90% or more, more preferably a homology of 95% or more, preferably a homology of 99% or more. Furthermore, by combining an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted or added to the heavy chain or light chain amino acid sequence, it is also possible to select an antibody having a biological activity equivalent to that of each among the antibodies described above.

[00195] A homologia entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando parâmetros básicos do algoritmo Blast versão 2.2.2 (Altschul, Stephen F.,Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST e PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). O algoritmo BLAST pode ser usado da mesma forma pela Internet acessando-se o site www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.[00195] Homology between two amino acid sequences can be determined using basic parameters of the Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). The BLAST algorithm can be used in the same way over the Internet by accessing the website www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.

[00196] Na sequência de aminoácido de cadeia pesada representada por SEQ ID NO:12, 14 ou 16 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 19 é uma sequência de sinal, uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido 20 a 140 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido 141 a 470 é uma região constante. A sequência de SEQ ID NO:12, 14 e 16 é mostrada na Fig. 3, 4 e 5 respectivamente.[00196] In the heavy chain amino acid sequence represented by SEQ ID NO:12, 14 or 16 in the Sequence Listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence, an amino acid sequence that consisting of amino acid residues 20 to 140 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 141 to 470 is a constant region. The sequence of SEQ ID NO:12, 14 and 16 is shown in Fig. 3, 4 and 5 respectively.

[00197] Além disso, na sequência de aminoácido de cadeia leve representada por SEQ ID NO:18, 20 ou 22 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 20 é uma sequência de sinal, uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido 21 a 129 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido que consiste em resíduos de aminoácido 130 a 234 é uma região constante. A sequência de SEQ ID NO:18, 20 e 22 é mostrada na Fig. 6, 7 e 8 respectivamente.[00197] Furthermore, in the light chain amino acid sequence represented by SEQ ID NO:18, 20 or 22 in the Sequence Listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is a signal sequence, a sequence An amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 is a constant region. The sequence of SEQ ID NO:18, 20 and 22 is shown in Fig. 6, 7 and 8 respectively.

[00198] Além disso, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo humano que liga-se a TROP2. Um anticorpo humano anti-TROP2 refere-se a um anticorpo humano que tem apenas uma sequência de um anticorpo derivado de um cromossomo humano. O anticorpo humano anti-TROP2 pode ser obtido por um método usando um camundongo de produção de anticorpo humano tendo um fragmento de cromossomo humano compreendendo genes de cadeia pesada e leve de um anticorpo humano (veja, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).[00198] Furthermore, the antibody of the invention includes a human antibody that binds to TROP2. A human anti-TROP2 antibody refers to a human antibody that has only one sequence of an antibody derived from a human chromosome. Human anti-TROP2 antibody can be obtained by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment comprising heavy and light chain genes of a human antibody (see, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).

[00199] Um tal camundongo de produção de anticorpo humano especificamente pode ser criado como segue. Um animal geneticamente modificado em que os locais de gene de cadeia leve e pesada de imunoglobulina endógena têm rompido, e como alternativa, os locais de gene de cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana foram introduzidos por um vetor de cromossomo artificial de levedura (YAC) ou similares é criado produzindo-se um animal de nocaute e um animal transgênico e acasalando estes animais.[00199] Such a specifically human antibody-producing mouse can be created as follows. A genetically modified animal in which the endogenous immunoglobulin light and heavy chain gene sites have been disrupted, and alternatively, the human immunoglobulin light and heavy chain gene sites have been introduced by a yeast artificial chromosome (YAC) vector or similar is created by producing a knockout animal and a transgenic animal and mating these animals.

[00200] Além disso, de acordo com um técnica de DNA recombinante, usando-se cDNAs codificando cada de uma tal uma cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano, e preferivelmente um vetor compreendendo tais cDNAs, as células eucarióticas são transformadas, e uma célula transformante que produz um anticorpo monoclonal humano recombinante é cultivada, por meio de qual o anticorpo da mesma forma pode ser obtido do sobrenadante de cultura.[00200] Furthermore, according to a recombinant DNA technique, using cDNAs each encoding one of such a heavy chain and light chain of a human antibody, and preferably a vector comprising such cDNAs, eukaryotic cells are transformed, and a transforming cell that produces a recombinant human monoclonal antibody is cultivated, whereby the antibody can likewise be obtained from the culture supernatant.

[00201] Aqui, como o hospedeiro, por exemplo, células eucarióticas, preferivelmente células mamíferas tais como células de CHO, linfócitos, ou células de mieloma podem ser usadas.[00201] Here, as the host, for example, eukaryotic cells, preferably mammalian cells such as CHO cells, lymphocytes, or myeloma cells can be used.

[00202] Além disso, um método de obter um anticorpo humano derivado de exibição de fago selecionado de uma biblioteca de anticorpo humana (veja Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43(7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002),1(2), pp.189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp.427-431, etc.) é da mesma forma conhecido.[00202] Furthermore, a method of obtaining a phage display-derived human antibody selected from a human antibody library (see Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43(7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), pp.189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp.427-431, etc.) is likewise known.

[00203] Por exemplo, um método de exibição de fago no qual uma região variável de um anticorpo humano é expressa na superfície de um fago como um anticorpo de cadeia simples (scFv), e um fago que liga-se a um antígeno é selecionado (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) pode ser usado.[00203] For example, a phage display method in which a variable region of a human antibody is expressed on the surface of a phage as a single-chain antibody (scFv), and a phage that binds to an antigen is selected (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) can be used.

[00204] Analisando-se o gene do fago selecionado com base na ligação a um antígeno, a sequência de DNA codificando a região variável de um anticorpo humano que liga a um antígeno pode ser determinada.[00204] By analyzing the phage gene selected based on binding to an antigen, the DNA sequence encoding the variable region of a human antibody that binds to an antigen can be determined.

[00205] Se a sequência de DNA de scFv que liga a um antígeno for determinada, um anticorpo humano pode ser obtido preparando-se um vetor de expressão compreendendo a sequência e introduzindo-se o vetor em um hospedeiro apropriado para expressá-lo. (Publicação International No. WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).[00205] If the scFv DNA sequence that binds to an antigen is determined, a human antibody can be obtained by preparing an expression vector comprising the sequence and introducing the vector into an appropriate host to express it. (International Publication No. WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12 , pp. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).

[00206] Se um anticorpo humano recentemente produzido liga-se a um peptídeo parcial ou a uma estrutura terciária parcial em que o anticorpo TINA1 liga-se, pode ser determinado que o anticorpo humano ligue-se ao mesmo epítopo como o anticorpo TINA1. Além disso, confirmando-se que o anticorpo humano compete com o anticorpo TINA1 para a ligação ao TROP2 (isto é, o anticorpo humano inibe a ligação entre o anticorpo TINA1 e TROP2), pode ser determinado que o anticorpo humano ligue-se até mesmo ao mesmo epítopo como o anticorpo TINA1 mesmo que a sequência de epítopo específica ou estrutura não tenha sido determinada. Quando é confirmado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo TINA1, é esperado fortemente que o anticorpo humano tenha uma atividade biológica equivalente àquela do anticorpo TINA1.[00206] If a newly produced human antibody binds to a partial peptide or partial tertiary structure to which the TINA1 antibody binds, it can be determined that the human antibody binds to the same epitope as the TINA1 antibody. Furthermore, by confirming that the human antibody competes with the TINA1 antibody for binding to TROP2 (i.e., the human antibody inhibits binding between the TINA1 antibody and TROP2), it can be determined that the human antibody binds even to the same epitope as the TINA1 antibody even if the specific epitope sequence or structure has not been determined. When it is confirmed that the human antibody binds to the same epitope as the TINA1 antibody, it is strongly expected that the human antibody will have a biological activity equivalent to that of the TINA1 antibody.

[00207] Os anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, ou anticorpos humanos obtidos pelo método acima descrito são avaliados quanto à propriedade de ligação a um antígeno por um método conhecido ou similares, e um anticorpo preferido pode ser selecionado.[00207] Chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies obtained by the method described above are evaluated for the property of binding to an antigen by a known method or the like, and a preferred antibody can be selected.

[00208] Como um exemplo de outro índice para uso na comparação das propriedades de anticorpos, a estabilidade de anticorpos pode ser exemplificada. A calorimetria diferencial de varredura (DSC) é um dispositivo capaz de rapidamente e precisamente medir uma temperatura de ponto central de desnaturação precisão (Tm) a ser usada como um índice favorável da estabilidade conformational relativa de proteínas. Medindo-se os valores de Tm usando DSC e comparando-se os valores, uma diferença na estabilidade térmica pode ser comparada. Sabe-se que a estabilidade de armazenamento dos anticorpos mostra alguma correlação com a estabilidade térmica dos anticorpos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical and Technology (2007) 12, pp. 265-273), e um anticorpo preferido pode ser selecionado usando-se a estabilidade térmica como um índice. Exemplos de outros índices para selecionar os anticorpos incluem as seguintes características: o rendimento em uma célula hospedeira apropriada é alto; e a capacidade de agregação em uma solução aquosa é baixa. Por exemplo, um anticorpo que mostra o rendimento mais alto nem sempre mostra a estabilidade térmica mais alta, e portanto, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para a administração a humanos tornando-se a avaliação compreensiva com base nos índices acima descrito.[00208] As an example of another index for use in comparing antibody properties, antibody stability can be exemplified. Differential scanning calorimetry (DSC) is a device capable of quickly and accurately measuring a precision denaturation center point temperature (Tm) to be used as a favorable index of the relative conformational stability of proteins. By measuring Tm values using DSC and comparing the values, a difference in thermal stability can be compared. It is known that the storage stability of antibodies shows some correlation with the thermal stability of antibodies (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical and Technology (2007) 12, pp. 265-273), and a preferred antibody can be selected using thermal stability as an index. Examples of other indices for selecting antibodies include the following characteristics: the yield in an appropriate host cell is high; and the aggregation capacity in an aqueous solution is low. For example, an antibody that shows the highest yield does not always show the highest thermal stability, and therefore, it is necessary to select an antibody more suitable for administration to humans by making the evaluation comprehensive based on the indices described above.

[00209] Na presente invenção, uma variante modificada do anticorpo é da mesma forma incluída. A variante modificada refere-se a uma variante obtida submetendo-se o anticorpo da presente invenção à modificação química ou biológica. Exemplos da variante quimicamente modificada incluem variantes quimicamente modificadas ligando-se uma porção química a um esqueleto de aminoácido, variantes quimicamente modificadas com uma cadeia de carboidrato ligada ao N ou ligada ao O, etc. Exemplos da variante biologicamente modificada incluem variantes obtidas por modificação pós-translacional (tal como, glicosilação ligada ao N ou ligada ao O, processo de N- ou C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, ou oxidação de metionina), e variantes nas quais um resíduo de metionina foi adicionado ao terminal N sendo expresso em uma célula hospedeira procariótica.[00209] In the present invention, a modified variant of the antibody is likewise included. Modified variant refers to a variant obtained by subjecting the antibody of the present invention to chemical or biological modification. Examples of the chemically modified variant include chemically modified variants by attaching a chemical moiety to an amino acid backbone, chemically modified variants with an N-linked or O-linked carbohydrate chain, etc. Examples of the biologically modified variant include variants obtained by post-translational modification (such as N-linked or O-linked glycosylation, N- or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, or methionine oxidation), and variants in which a methionine residue was added to the N terminus and was expressed in a prokaryotic host cell.

[00210] Além disso, um anticorpo rotulado para permitir a detecção ou isolamento do anticorpo ou um antígeno da invenção, por exemplo, um anticorpo rotulado por enzima, um anticorpo rotulado por fluorescência, e um anticorpo rotulado por afinidade são da mosma forma incluídos no significado de variante modificada. Uma tal variante modificada do anticorpo da invenção é útil para melhorar a estabilidade e retenção de sangue do anticorpo, reduzindo a antigenicidade do mesmo, detectando-se ou isolando-se um anticorpo ou um antígeno, e assim por diante.[00210] Furthermore, an antibody labeled to enable detection or isolation of the antibody or an antigen of the invention, for example, an enzyme-labeled antibody, a fluorescence-labeled antibody, and an affinity-labeled antibody are likewise included in the modified variant meaning. Such a modified variant of the antibody of the invention is useful for improving the stability and blood retention of the antibody, reducing the antigenicity thereof, detecting or isolating an antibody or an antigen, and so on.

[00211] Além disso, regulando-se a modificação de um glicano que é ligado ao anticorpo da invenção (glicosilação, desfucosilação, etc.), é possível aumentar uma atividade citotóxica celular dependente de anticorpo. Como a técnica para regular a modificação de um glicano de anticorpos, Publicação International No. WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140, etc. é conhecida. Entretanto, a técnica não está limitada a isto. No anticorpo da presente invenção, um anticorpo no qual a modificação de um glicano é regulada, é da mesma forma incluído.[00211] Furthermore, by regulating the modification of a glycan that is linked to the antibody of the invention (glycosylation, defucosylation, etc.), it is possible to increase an antibody-dependent cellular cytotoxic activity. As the technique for regulating the modification of an antibody glycan, International Publication No. WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140, etc. it's known. However, the technique is not limited to this. In the antibody of the present invention, an antibody in which the modification of a glycan is regulated is likewise included.

[00212] No caso onde um anticorpo é produzido isolando-se primeiro um gene de anticorpo e em seguida introduzindo-se o gene em um hospedeiro apropriado, uma combinação de hospedeiro apropriado e um vetor de expressão apropriado pode ser usada. Exemplos específicos do gene de anticorpo incluem uma combinação de um gene que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo descrito nesta especificação e um gene que codifica uma sequência de cadeia leve do mesmo. Quando uma célula hospedeira é transformada, é possível inserir o gene de sequência de cadeia pesada e o gene de sequência de cadeia leve no mesmo vetor de expressão, e da mesma forma em vetores de expressão diferentes separadamente.[00212] In the case where an antibody is produced by first isolating an antibody gene and then introducing the gene into an appropriate host, a combination of an appropriate host and an appropriate expression vector can be used. Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene encoding a heavy chain sequence of an antibody described in this specification and a gene encoding a light chain sequence thereof. When a host cell is transformed, it is possible to insert the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene into the same expression vector, and similarly into different expression vectors separately.

[00213] No caso onde as células eucarióticas são usadas como o hospedeiro, células animais, células de planta, e micro-organismos eucarióticos podem ser usados. Como as células animais, células mamíferas, por exemplo, células de COS de símio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCCCRL-1650), fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e cepas deficientes de di-hidrofolato redutase (Urlaub, G., e Chasin, L., A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células ovarianas de hamster Chinês (células de CHO; ATCC: CCL-61) podem ser exemplificadas.[00213] In the case where eukaryotic cells are used as the host, animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used. Like animal cells, mammalian cells, e.g., simian COS cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCCCRL-1650), murine fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL- 1658), and dihydrofolate reductase-deficient strains (Urlaub, G., and Chasin, L., A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) of ovarian cells from Chinese hamster (CHO cells; ATCC: CCL-61) can be exemplified.

[00214] No caso onde as células procarióticas são usadas, por exemplo, Escherichia coli e Bacillus subtilis podem ser exemplificados.[00214] In the case where prokaryotic cells are used, for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis can be exemplified.

[00215] Introduzindo-se um gene de anticorpo desejado nestas células por transformação, e cultivando-se as células desse modo transformadas in vitro, o anticorpo pode ser obtido. No método de cultura acima descrito, o rendimento pode às vezes variar dependendo da sequência do anticorpo, e portanto, é possível selecionar um anticorpo que é facilmente produzido como um farmacêutico usando- se o rendimento como um índice entre os anticorpos tendo uma atividade de ligação equivalente. Portanto, no anticorpo da presente invenção, um anticorpo obtido por um método de produzir um anticorpo, caracterizado incluindo-se uma etapa de cultivar a célula hospedeira transformada e uma etapa de coletar um anticorpo desejado de um produto cultivado obtido na etapa de cultivo é da mesma forma cultivada.[00215] By introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and cultivating the cells thus transformed in vitro, the antibody can be obtained. In the above-described culture method, the yield may sometimes vary depending on the sequence of the antibody, and therefore, it is possible to select an antibody that is easily produced as a pharmaceutical using the yield as an index between antibodies having binding activity. equivalent. Therefore, in the antibody of the present invention, an antibody obtained by a method of producing an antibody, characterized by including a step of culturing the transformed host cell and a step of collecting a desired antibody from a cultured product obtained in the cultivation step is of the same way cultivated.

[00216] Sabe-se que um resíduo de lisina no terminal carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula mamífera cultivada é deletado (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), e sabe-se da mesma forma que dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) no terminal carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula mamífero cultivada são deletados e um resíduo de prolina recentemente localizado no terminal carboxila é amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Entretanto, tal deleção e modificação da sequência de cadeia pesada não afetam a afinidade de ligação de antígeno, e a função do efetor (a ativação de um complemento, a citotoxicidade celular dependente de anticorpo, etc.) do anticorpo. Portanto, no anticorpo de acordo com a presente invenção, um anticorpo submetido a tal modificação e um fragmento funcional do anticorpo são da mesma forma incluídos, e uma variante de deleção, em que em que um ou dois aminoácidos foram deletados no terminal carboxila da cadeia pesada, uma variante obtida por amidação da variante de deleção (por exemplo, uma cadeia pesada em que o resíduo de prolina de terminal carboxila foi amidada), e similares são da mesma forma abrangidas. O tipo de variante de deleção tendo uma deleção ao terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a invenção não está limitado às variantes anteriores contanto que a afinidade de ligação de antígeno, e a função do efetor sejam conservadas. As duas cadeias pesadas constituindo o anticorpo de acordo com a invenção podem ser de um tipo selecionado a partir do grupo consistindo em uma cadeia pesada de tamanho natural, e a variante de deleção acima descrita, ou podem ser de dois tipos em combinação selecionada destas. A relação da quantidade de cada variante de deleção pode ser afetada pelo tipo de células mamíferas cultivadas que produzem o anticorpo de acordo com a invenção, e as condições de cultura, entretanto, um caso onde um resíduo de aminoácido no terminal carboxila foi deletado em ambas dentre as duas cadeias pesadas contidas como componentes principais no anticorpo de acordo com a invenção podem ser exemplificadas.[00216] It is known that a lysine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain of an antibody produced in a cultured mammalian cell is deleted (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), and it is also known way that two amino acid residues (glycine and lysine) at the carboxyl terminus of the heavy chain of an antibody produced in a cultured mammalian cell are deleted and a newly located proline residue at the carboxyl terminus is amidated (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 ( 2007)). However, such deletion and modification of the heavy chain sequence do not affect the antigen binding affinity, and effector function (activation of a complement, antibody-dependent cellular cytotoxicity, etc.) of the antibody. Therefore, in the antibody according to the present invention, an antibody subjected to such modification and a functional fragment of the antibody are likewise included, and a deletion variant, in which one or two amino acids have been deleted at the carboxyl terminus of the chain. heavy chain, a variant obtained by amidation of the deletion variant (for example, a heavy chain in which the carboxyl-terminal proline residue has been amidated), and the like are likewise covered. The type of deletion variant having a deletion at the carboxyl terminus of the heavy chain of the antibody according to the invention is not limited to the above variants as long as the antigen binding affinity and effector function are conserved. The two heavy chains constituting the antibody according to the invention may be of a type selected from the group consisting of a full-length heavy chain, and the deletion variant described above, or may be of two types in a selected combination thereof. The relationship of the amount of each deletion variant may be affected by the type of cultured mammalian cells that produce the antibody according to the invention, and the culture conditions, however, a case where an amino acid residue at the carboxyl terminus was deleted in both one of the two heavy chains contained as main components in the antibody according to the invention can be exemplified.

[00217] Como isótipo do anticorpo da invenção, por exemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) pode ser exemplificado, e IgG1 ou IgG2 podem ser exemplificados preferivelmente.[00217] As an isotype of the antibody of the invention, for example, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) can be exemplified, and IgG1 or IgG2 can be exemplified preferably.

[00218] Como a atividade biológica do anticorpo, geralmente uma atividade de ligação de antígeno, uma atividade de internalização em células expressando um antígeno ligando-se ao antígeno, uma atividade de neutralização da atividade de um antígeno, uma atividade de aumento da atividade de um antígeno, uma atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e uma atividade de fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) podem ser exemplificadas. A função do anticorpo da presente invenção é uma atividade de ligação ao TROP2, preferivelmente uma atividade de internalização em células de expressão de TROP2 ligando-se ao TROP2. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ter uma atividade de ADCC, uma atividade de CDC, e/ou uma atividade de ADCP além de uma atividade de internalização da célula.[00218] As the biological activity of the antibody, generally an antigen-binding activity, an internalization activity in cells expressing an antigen by binding to the antigen, a neutralizing activity of the activity of an antigen, an activity of increasing the activity of an antigen, an antibody-dependent cellular cytotoxicity activity (ADCC), a complement-dependent cytotoxicity activity (CDC), and an antibody-dependent cell-mediated phagocytosis activity (ADCP) can be exemplified. The function of the antibody of the present invention is a TROP2-binding activity, preferably an internalization activity in TROP2-expressing cells by binding to TROP2. Furthermore, the antibody of the present invention may have an ADCC activity, a CDC activity, and/or an ADCP activity in addition to a cell internalization activity.

[00219] O anticorpo obtido pode ser purificado para homogeneidade. A separação e purificação do anticorpo podem ser realizadas empregando uma separação de proteína convencional e método de purificação. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado adequadamente selecionando-se e combinando-se cromatografia de coluna, filtração por filtro, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese em gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese de focalização isoelétrica, e similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), mas o método não está limitado a isto.[00219] The antibody obtained can be purified to homogeneity. Antibody separation and purification can be carried out employing a conventional protein separation and purification method. For example, the antibody can be separated and purified appropriately by selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salt precipitation, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing electrophoresis, and the like (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) , but the method is not limited to this.

[00220] Exemplos de tal cromatografia incluem cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta de íons, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de filtração de gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de adsorção.[00220] Examples of such chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reversed phase chromatography, and adsorption chromatography.

[00221] Tal cromatografia podem ser realizada empregando-se a cromatografia líquido tal como, HPLC ou FPLC.[00221] Such chromatography can be carried out using liquid chromatography such as HPLC or FPLC.

[00222] Como uma coluna a ser usada na cromatografia de afinidade, uma coluna de Proteína A e uma coluna de Proteína G podem ser exemplificadas. Por exemplo, como uma coluna usando uma coluna de Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia), e similares podem ser exemplificadas.[00222] As a column to be used in affinity chromatography, a Protein A column and a Protein G column can be exemplified. For example, as a column using a Protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia), and the like can be exemplified.

[00223] Além disso, usando-se um portador tendo um antígeno imobilizado nele, o anticorpo pode da mesma forma ser purificado utilizando-se a propriedade de ligação do anticorpo ao antígeno.[00223] Furthermore, using a carrier having an antigen immobilized on it, the antibody can likewise be purified using the binding property of the antibody to the antigen.

[00224] Composto antitumor[00224] Antitumor compound

[00225] O composto antitumor a ser conjugado ao conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção é explicado. O composto antitumor usado na presente invenção não está limitado particularmente se for um composto tendo um efeito antitumor e um grupo de substituinte ou uma estrutura parcial permitindo a conexão a uma estrutura de ligante. Quando uma parte ou todo o ligante clivado em células de tumor, a porção do composto antitumor é liberada para exibir o efeito antitumor do composto antitumor. Como o ligante é clivado em uma posição de conexão no fármaco, o composto antitumor é liberado em sua estrutura não modificada para exibir seu efeito antitumor intrínseco.[00225] The antitumor compound to be conjugated to the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is explained. The antitumor compound used in the present invention is not particularly limited if it is a compound having an antitumor effect and a substituent group or a partial structure allowing connection to a linker structure. When part or all of the linker is cleaved in tumor cells, the portion of the antitumor compound is released to exhibit the antitumor effect of the antitumor compound. As the linker is cleaved at a connecting position in the drug, the antitumor compound is released into its unmodified structure to exhibit its intrinsic antitumor effect.

[00226] Como o composto antitumor usado na presente invenção, exatecana (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4- metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina- 10,13(9H,15H)-diona; mostrado na seguinte fórmula), um dos derivados de camptotecina, pode ser preferivelmente usado. Fórmula 14 [00226] As the antitumor compound used in the present invention, exatecan (((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H ,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)-dione; shown in the following formula), one of the derivatives of camptothecin, may be preferably used. Formula 14

[00227] Embora tendo um excelente efeito antitumor, exatecana não foi commercializada como um fármaco antitumor. O composto pode ser facilmente obtido por um método conhecido e o grupo amino na posição 1 pode ser preferivelmente usado como uma porção de conexão à estrutura do ligante. Além disso, embora a exatecana possa da mesma forma ser liberada em células de tumor enquanto parte do ligante é ainda ligada a estas, é um excelente composto exibindo um excelente efeito antitumor mesmo em tal estrutura.[00227] Although having an excellent antitumor effect, exatecan has not been commercialized as an antitumor drug. The compound can be easily obtained by a known method and the amino group in position 1 can preferably be used as a connecting moiety to the ligand structure. Furthermore, although exatecan can also be released into tumor cells while part of the ligand is still bound to them, it is an excellent compound exhibiting an excellent antitumor effect even in such a structure.

[00228] Porque a exatecana tem uma estrutura de camptotecina, sabe-se que o equilíbrio troca para uma estrutura com um anel de lactona fechado (anel fechado) em um meio ácido aquoso (por exemplo, pH 3 ou aproximadamente) mas troca para uma estrutura com um anel de lactona aberto (anel aberto) em um meio básico aquoso (por exemplo, pH 10 ou aproximadamente). Um conjugado de fármaco sendo introduzido com um resíduo de exatecana que corresponde à estrutura de anel fechado, e a estrutura de anel aberto é da mesma forma esperado ter o mesmo efeito antitumor e é desnecessário dizer que quaisquer destes estados está dentro do escopo da presente invenção.[00228] Because exatecan has a camptothecin structure, it is known that the equilibrium switches to a structure with a closed lactone ring (ring closed) in an aqueous acidic medium (e.g., pH 3 or thereabouts) but switches to a structure with an open lactone ring (open ring) in an aqueous basic medium (e.g. pH 10 or thereabouts). A drug conjugate being introduced with an exatecan residue corresponding to the closed ring structure, and the open ring structure is likewise expected to have the same antitumor effect and it is needless to say that either of these states is within the scope of the present invention. .

[00229] Outros exemplos do composto antitumor podem incluir doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vimblastina, metotrexato, agente antitumor com base em platina (cisplatina ou derivados da mesma), taxol ou derivados da mesma, e camptotecina ou derivados da mesma, (o agente antitumor descrito na Patente Japonesa Depositada em Aberto No. 6-87746).[00229] Other examples of the antitumor compound may include doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, cyclocytidine, vincristine, vinblastine, methotrexate, platinum-based antitumor agent (cisplatin or derivatives thereof), taxol or derivatives thereof, and camptothecin or derivatives thereof, (the antitumor agent described in Japanese Open Patent No. 6-87746).

[00230] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco, o número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo é um fator chave tendo uma influência na eficácia e segurança. A produção do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada definindo-se a condição de reação incluindo as quantidades de uso de matérias-primas e reagentes para reação para ter um número constante de moléculas de fármaco conjugadas, e o conjugado de anticorpo-fármaco geralmente é obtido como uma mistura contendo números diferentes de moléculas de fármaco conjugadas, ao contrário da reação química de um composto de baixo peso molecular. O número de fármacos conjugados em uma molécula de anticorpo é expresso ou especificado pelo valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugadas. A menos que especificamente descrito de outra maneira como um princípio, o número de moléculas de fármaco conjugadas significa um valor médio menos em um caso no qual representa um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um número específico de moléculas de fármaco conjugadas que é incluído em uma mistura de conjugado de anticorpo-fármaco tendo o número diferente de moléculas de fármaco conjugadas. O número de moléculas de exatecana conjugadas a uma molécula de anticorpo é controlável, e como um número médio de moléculas de fármaco conjugadas por anticorpo, cerca de 1 a 10 exatecanas podem ser conectadas. Preferivelmente, é 2 a 8 anos, e mais preferivelmente 3 a 8. Enquanto isso, uma pessoa versada na técnica pode projetar uma reação para conjugar um número exigido de moléculas de fármaco a uma molécula de anticorpo com base na descrição dos Exemplos do presente pedido e podem obter um conjugado de anticorpo-fármaco com um número controlado de moléculas de exatecana.[00230] With respect to the antibody-drug conjugate, the number of drug molecules conjugated per antibody molecule is a key factor having an influence on efficacy and safety. The production of antibody-drug conjugate is carried out by setting the reaction condition including the usage amounts of raw materials and reagents for reaction to have a constant number of conjugated drug molecules, and the antibody-drug conjugate is generally obtained as a mixture containing different numbers of conjugated drug molecules, as opposed to the chemical reaction of a low molecular weight compound. The number of conjugated drugs on an antibody molecule is expressed or specified by the mean value, that is, the average number of conjugated drug molecules. Unless otherwise specifically described as a principle, the number of conjugated drug molecules means an average value minus in a case in which it represents an antibody-drug conjugate having a specific number of conjugated drug molecules that is included in a antibody-drug conjugate mixture having different number of conjugated drug molecules. The number of exatecan molecules conjugated to an antibody molecule is controllable, and as an average number of drug molecules conjugated per antibody, about 1 to 10 exatecans can be attached. Preferably, it is 2 to 8 years, and more preferably 3 to 8. Meanwhile, a person skilled in the art can design a reaction to conjugate a required number of drug molecules to an antibody molecule based on the description of the Examples of the present application. and can obtain an antibody-drug conjugate with a controlled number of exatecan molecules.

Ligand Structure

[00231] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco anti- TROP2 da presente invenção, a estrutura de ligante para conjugar um composto antitumor ao anticorpo anti-TROP2 é explicada. O ligante tem uma estrutura da seguinte fórmula: i. [00231] With respect to the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention, the linker structure for conjugating an antitumor compound to the anti-TROP2 antibody is explained. The ligand has a structure of the following formula: i.

[00232] O anticorpo é conectado ao terminal de L1 (terminal oposto à conexão ao L2), e o composto antitumor é conectado ao grupo carbonila da porção -La-(CH2)n2-C(=O)-. i. n1 representa um número inteiro de 0 a 6 e é preferivelmente um número inteiro de 1 a 5, e mais preferivelmente 1 a 3. I. L1 II. L1 é representado pela estrutura de III. -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)-.[00232] The antibody is connected to the L1 terminal (terminal opposite the connection to L2), and the antitumor compound is connected to the carbonyl group of the -La-(CH2)n2-C(=O)- portion. i. n1 represents an integer from 0 to 6 and is preferably an integer from 1 to 5, and more preferably 1 to 3. I. L1 II. L1 is represented by the structure of III. -(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-.

[00233] Nos anteriores, n3 é um número inteiro de 2 a 8, e "- (Succinimid-3-il-N)-" tem uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 15 [00233] In the above, n3 is an integer from 2 to 8, and "- (Succinimid-3-yl-N)-" has a structure represented by the following formula: Formula 15

[00234] Posição 3 da estrutura parcial acima é uma porção de conexão ao anticorpo anti-TROP2. A ligação ao anticorpo anti-TROP2 na posição 3 é caracterizada por ligação com a formação de tioéter. O átomo de nitrogênio na posição 1 da porção de estrutura é conectado ao átomo de carbono de metileno que esta presente dentro do ligante incluindo a estrutura. Especificamente, -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3- C(=O)-L2- é uma estrutura representada pela seguinte fórmula (aqui, "anticorpo-S-" origina-se de um anticorpo). Fórmula 16 [00234] Position 3 of the partial structure above is a connecting portion to the anti-TROP2 antibody. Binding to the anti-TROP2 antibody at position 3 is characterized by binding with the formation of thioether. The nitrogen atom at position 1 of the framework portion is connected to the methylene carbon atom that is present within the ligand including the framework. Specifically, -(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3- C(=O)-L2- is a structure represented by the following formula (here, "antibody-S-" originates from an antibody). Formula 16

[00235] Na fórmula, n3 é um número inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 2 a 5.[00235] In the formula, n3 is an integer from 2 to 8, and preferably 2 to 5.

[00236] Exemplos específicos de L1 podem incluir -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. 2. L2 L2 é um ligante representado pela seguinte estrutura: -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, L2 pode não estar presente, e em um tal caso, L2 é uma ligação simples. Nos anteriores, n4 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 2 a 4. L2 é conectado ao L1 em seu grupo amino terminal e é conectado ao LP em seu grupo carbonila no outro terminal. Exemplos específicos de L2 podem incluir -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-. 3. LP LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos. Especificamente, consiste em um resíduo de oligopeptídeo em que 2 a 7 aminoácidos são ligados por uma ligação de peptídeo. LP é conectado ao L2 em seu N terminal e é conectado ao o grupo amino da porção -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- do ligante em seu C terminal.[00236] Specific examples of L1 may include -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-, - (Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. 2. L2 L2 is a ligand represented by the following structure: -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-, L2 may not be present, and in such a case, L2 is a single bond. In the above, n4 is an integer from 1 to 6, and preferably 2 to 4. L2 is connected to L1 at its terminal amino group and is connected to LP at its carbonyl group at the other terminal. Specific examples of L2 may include -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-O -CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-, -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 - O-CH2CH2-C(=O)-. 3. LP LP is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids. Specifically, it consists of an oligopeptide residue in which 2 to 7 amino acids are linked by a peptide bond. LP is connected to L2 at its N terminus and is connected to the amino group of the -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- portion of the linker at its C terminus.

[00237] O aminoácido constituindo LP no ligante não está particularmente limitado, entretanto, exemplos do mesmo incluem um L- ou D-aminoácido, preferivelmente um L-aminoácido. E, pode ser an aminoácido tendo uma estrutura tal como β-alanina, ácido ε- aminocaproico, ou ácido y-aminobutírico além de um a-aminoácido, além disso, pode ser um aminoácido tipo não natural tal como aminoácido N-metilado.[00237] The amino acid constituting LP in the linker is not particularly limited, however, examples thereof include an L- or D-amino acid, preferably an L-amino acid. And, it may be an amino acid having a structure such as β-alanine, ε-aminocaproic acid, or ε-aminobutyric acid in addition to an α-amino acid, furthermore, it may be a non-natural type amino acid such as N-methylated amino acid.

[00238] A sequência do aminoácido de LP não está particularmente limitado, porém exemplos do aminoácido constituinte incluem fenilalanina (Phe; F), tirosina (Tyr; Y), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), alanina (Ala; A), valina (Val; V), lisina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), ácido glutâmico (Glu; E), e ácido aspártico (Asp; D).[00238] The amino acid sequence of LP is not particularly limited, but examples of the constituent amino acid include phenylalanine (Phe; F), tyrosine (Tyr; Y), leucine (Leu; L), glycine (Gly; G), alanine ( Ala; A), valine (Val; V), lysine (Lys; K), citrulline (Cit), serine (Ser; S), glutamic acid (Glu; E), and aspartic acid (Asp; D).

[00239] Entre estes, exemplos preferidos incluem fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico. Dependendo do tipo do aminoácido, o padrão de liberação do fármaco pode ser controlado. O número do aminoácido pode estar entre 2 a 7.[00239] Among these, preferred examples include phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid. Depending on the type of amino acid, the drug release pattern can be controlled. The amino acid number can be between 2 to 7.

[00240] Exemplos específicos de LP podem incluir -GGF-, -DGGF-, -(D-)D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF-.[00240] Specific examples of LP may include -GGF-, -DGGF-, -(D-)D-GGF-, -EGGF-, -GGFG-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG- , -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF-.

[00241] Nos anteriores, "(D-)D" representa um ácido D-aspártico. Exemplos particularmente preferidos de LP para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem incluir um resíduo de tetrapeptídeo de -GGFG-. 4. La-(CH2)n2-C(=O)-[00241] In the above, "(D-)D" represents a D-aspartic acid. Particularly preferred examples of LP for the antibody-drug conjugate of the present invention may include a -GGFG- tetrapeptide residue. 4. La-(CH2)n2-C(=O)-

[00242] La em La-(CH2)n2-C(=O)- é uma estrutura de -O- ou uma ligação simples. n2 é um número inteiro de 0 a 5, mais preferivelmente 0 a 3, mais preferivelmente 0 ou 1.[00242] La in La-(CH2)n2-C(=O)- is an -O- structure or a single bond. n2 is an integer from 0 to 5, more preferably 0 to 3, more preferably 0 or 1.

[00243] Exemplos de La-(CH2)n2-C(=O)- podem incluir aqueles tendo as seguintes estruturas: - O-CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2-C(=O)-, - CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. Um deles, - O-CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2-C(=O)-, ou um caso em que La é uma ligação simples, e n2 é 0 é preferido.[00243] Examples of La-(CH2)n2-C(=O)- may include those having the following structures: - O-CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2-C(=O)-, - CH2CH2-C (=O)-, - CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. One of them, - O-CH2-C(=O)-, - O-CH2CH2-C(=O)-, or a case where La is a single bond, and n2 is 0 is preferred.

[00244] Exemplos específicos da estrutura representada por -NH- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- no ligante podem incluir - NH-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou -NH-CH2CH2-O-C(=O)- é mais preferido.[00244] Specific examples of the structure represented by -NH- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- in the linker may include - NH-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2 -C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-C(=O)-, - NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O) -, - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. - NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, or -NH-CH2CH2-O-C(=O)- is more preferred.

[00245] No ligante, o comprimento de cadeia de -NH-(CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)- é preferivelmente um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos, e mais preferivelmente um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.[00245] In the linker, the chain length of -NH-(CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)- is preferably a chain length of 4 to 7 atoms, and more preferably a chain length of chain of 5 or 6 atoms.

[00246] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco anti- TROP2 da presente invenção, é considerado que o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 é transferido ao interior das células de tumor, a porção de ligante é clivada e o derivado de fármaco tendo uma estrutura representada por NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH- DX) é liberado para expressar uma ação antitumor. Exemplos do derivado de antitumor exibindo um efeito antitumor por liberação do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção incluem um derivado antitumor tendo uma porção de estrutura em que a estrutura representada por -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- do ligante tem um grupo terminal, e o particularmente preferido inclui os seguintes. NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).[00246] With respect to the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention, it is considered that the anti-TROP2 antibody-drug conjugate is transferred into the tumor cells, the linker portion is cleaved and the drug derivative having a structure represented by NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH- DX) is released to express an antitumor action. Examples of the antitumor derivative exhibiting an antitumor effect upon release of the antibody-drug conjugate of the present invention include an antitumor derivative having a backbone moiety wherein the backbone represented by -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)- of the linker has a terminal group, and the particularly preferred one includes the following. NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX ), NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).

[00247] Enquanto isso, in case of NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), foi confirmado que, como a estrutura aminal na molécula é instável, novamente para por uma autodegradação para liberar o seguinte HO- CH2-C(=O)-(NH-DX). Aqueles compostos podem ser da mesma forma preferivelmente usados como um intermediário de produção do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção.[00247] Meanwhile, in case of NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), it was confirmed that, as the aminal structure in the molecule is unstable, it again stops for self-degradation to release the following HO- CH2-C(=O)-(NH-DX). Those compounds can also be preferably used as an intermediate for producing the antibody-drug conjugate of the present invention.

[00248] Para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção em que exatecana é usada como um fármaco, é preferível que uma porção de estrutura de fármaco-ligante [-L1-L2-LP-NH- (CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] tendo a seguinte estrutura seja conectada a um anticorpo. O número conjugado médio da referida porção de estrutura de fármaco-ligante por anticorpo pode ser 1 a 10. Preferivelmente, é 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX).[00248] For the antibody-drug conjugate of the present invention in which exatecan is used as a drug, it is preferred that a drug-ligand backbone moiety [-L1-L2-LP-NH- (CH2)n1-La- (CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] having the following structure is connected to an antibody. The average conjugate number of said drug-ligand backbone moiety per antibody may be 1 to 10. Preferably, it is 2 to 8, and more preferably 3 to 8. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C( =O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(= O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid- 3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O )-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C (=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX ), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O) -(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O- CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX).

[00249] Entes eles, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX).[00249] Among them, the most preferred are the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O - CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX).

[00250] Os particularmente preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).[00250] Particularly preferred are the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N )-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

[00251] Com respeito à estrutura de ligante para conjugação do anticorpo anti-TROP2 e um fármaco no conjugado de anticorpo- fármaco da presente invenção, o ligante preferido pode ser construído conectando-se as estruturas preferidas mostradas para cada parte do ligante explicado acima. Como para a estrutura de ligante, aqueles com a seguinte estrutura podem ser preferivelmente usados. Enquanto isso, o terminal esquerdo da estrutura é uma porção de conexão com o anticorpo e o terminal direito é uma porção de conexão com o fármaco. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.[00251] With respect to the linker structure for conjugation of the anti-TROP2 antibody and a drug in the antibody-drug conjugate of the present invention, the preferred linker can be constructed by connecting the preferred structures shown for each part of the linker explained above. As for the linker structure, those with the following structure can be preferably used. Meanwhile, the left terminus of the structure is an antibody-connecting portion and the right terminus is a drug-connecting portion. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-, -(Succinimid- 3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH - CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid- 3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[00252] Entre eles, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.[00252] Among them, the most preferred are the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C (=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C (=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[00253] Os particularmente preferidos incluem os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.[00253] Particularly preferred ones include the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-, -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C (=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

Production method

[00254] Em seguida, as explicações são dadas para o método representativo para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou um intermediário de produção do mesmo. Enquanto isso, os compostos são descritos a seguir com o número de composto mostrado em cada fórmula de reação. Especificamente, eles são referidos como um "composto da fórmula (1)", um "composto (1)", ou similares. Os compostos com os numerous diferentes daqueles são da mesma forma descritos similarmente.[00254] Next, explanations are given for the representative method for producing the antibody-drug conjugate of the present invention or a production intermediate thereof. Meanwhile, the compounds are described below with the compound number shown in each reaction formula. Specifically, they are referred to as a "compound of formula (1)", a "compound (1)", or the like. Compounds with numbers other than those are similarly described.

1. Production method 1

[00255] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) que é conectado à estrutura de fármaco-ligante por tioéter pode ser produzido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 17 [00255] The antibody-drug conjugate represented by formula (1) which is connected to the drug-ligand structure by thioether can be produced by the following method, for example. Formula 17

[00256] Na fórmula, AB representa um anticorpo tendo um grupo sulfidrila, e L1' representa estrutura de ligante L1 em que o terminal de ligante é um grupo maleimidila (fórmula mostrada abaixo) Fórmula 18 (na fórmula, o átomo de nitrogênio é a posição de conexão), e especificamente representa um grupo em que a porção de - (Succinimid-3-il-N)- em -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n3-C(=O)- de L1 é um grupo maleimidila. Além disso, o -(NH-DX) representa uma estrutura representada pela seguinte fórmula: Fórmula 19 e representa um grupo que é derivado removendo-se um átomo de hidrogênio do grupo amino na posição 1 de exatecana.][00256] In the formula, AB represents an antibody having a sulfhydryl group, and L1' represents L1 linker structure in which the linker terminus is a maleimidyl group (formula shown below) Formula 18 (in the formula, the nitrogen atom is the connection position), and specifically represents a group in which the portion of -(Succinimid-3-yl-N)- in -(Succinimid-3-yl-N)-(CH2 )n3-C(=O)- of L1 is a maleimidyl group. Furthermore, the -(NH-DX) represents a structure represented by the following formula: Formula 19 and represents a group that is derived by removing a hydrogen atom from the amino group at position 1 of exatecan.]

[00257] Além disso, o composto da fórmula (1) na fórmula de reação acima é interpretado como uma estrutura em que uma porção de estrutura correspondente do fármaco ao terminal de ligante conecta-se a um anticorpo. Entretanto, é apenas a descrição dada por uma questão de conveniência, e há atualmente muitos casos em que uma pluralidade das porções de estrutura é conectada a uma molécula de anticorpo. O mesmo aplica-se à explicação do método de produção descrito abaixo.[00257] Furthermore, the compound of formula (1) in the above reaction formula is interpreted as a structure in which a corresponding structure portion of the drug to the ligand terminal connects to an antibody. However, it is only the description given for the sake of convenience, and there are currently many cases in which a plurality of framework moieties are connected to an antibody molecule. The same applies to the explanation of the production method described below.

[00258] O conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo-se o composto (2) que é obtenível pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila.[00258] The antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2) that is obtainable by the method described below, with the antibody (3a) having a sulfhydryl group.

[00259] O anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila pode ser obtido por um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G., T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos incluem: reagente de Traut é reagido com o grupo amino do anticorpo; S-acetiltioalcanoatos de N-Succinimidila são reagidos com o grupo amino do anticorpo seguido por reação com hidroxilamina; após reagir com 3-(piridilditio)propionato de N- Succinimidila, o anticorpo é reagido com um agente de redução; o anticorpo é reagido com um agente de redução tais como, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, e cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reduzir a ligação de dissulfeto em uma parte da articulação no anticorpo para formar um grupo sulfidrila, porém, não está limitado a isto.[00259] Antibody (3a) having a sulfhydryl group can be obtained by a method well known in the art (Hermanson, G., T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996) ). Examples include: Traut's reagent is reacted with the amino group of the antibody; N-Succinimidyl S-acetylthioalkanoates are reacted with the amino group of the antibody followed by reaction with hydroxylamine; after reacting with N-Succinimidyl 3-(pyridyldithio)propionate, the antibody is reacted with a reducing agent; The antibody is reacted with a reducing agent such as dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, and tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) to reduce the disulfide bond at a hinge part in the antibody to form a sulfhydryl group, however, it is not limited to this.

[00260] Especificamente, usando 0,3 a 3 equivalentes molar de TCEP como um agente de redução por dissulfeto na parte da articulação no anticorpo e reagindo com o anticorpo em uma solução de tampão contendo um agente de quelação, o anticorpo com dissulfeto parcialmente ou completamente reduzido na parte da articulação no anticorpo pode ser obtido. Exemplos do agente de quelação incluem ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) e ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA). Podem ser usados em concentração de 1 mM a 20 mm. Exemplos da solução de tampão que pode ser usada incluem uma solução de fosfato de sódio, borato de sódio, ou acetato de sódio. Especificamente, reagindo-se o anticorpo com TCEP a 4oC a 37oC durante 1 a 4 horas, o anticorpo (3a) tendo o grupo sulfidrila parcialmente ou completamente reduzido pode ser obtido.[00260] Specifically, using 0.3 to 3 molar equivalents of TCEP as a disulfide reducing agent at the hinge part in the antibody and reacting with the antibody in a buffer solution containing a chelating agent, the disulfide antibody partially or completely reduced in the joint part in the antibody can be obtained. Examples of the chelating agent include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA). They can be used in concentrations from 1 mM to 20 mm. Examples of the buffer solution that can be used include a solution of sodium phosphate, sodium borate, or sodium acetate. Specifically, by reacting the antibody with TCEP at 4oC to 37oC for 1 to 4 hours, the antibody (3a) having the sulfhydryl group partially or completely reduced can be obtained.

[00261] Enquanto isso, conduzindo-se a reação para adicionar um grupo sulfidrila a uma porção de fármaco-ligante, a porção de fármaco- ligante pode ser conjugada por uma ligação tioéter.[00261] Meanwhile, by conducting the reaction to add a sulfhydryl group to a drug-ligand moiety, the drug-ligand moiety can be conjugated by a thioether bond.

[00262] Usando-se 2 a 20 equivalentes molar do composto (2) para o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila, o conjugado de anticorpo- fármaco (1) em que 2 a 8 moléculas de fármaco são conjugadas por anticorpo pode ser produzido. Especificamente, é suficiente que a solução contendo o composto (2) do dissolvido nesta seja adicionada a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. Aqui, exemplos da solução de tampão que pode ser usada incluem solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, e borato de sódio. O pH para a reação é 5 a 9, e mais preferivelmente a reação é realizada próxima ao pH 7. Exemplos do solvente para dissolver o composto (2) incluem um solvente orgânico tais como, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetil acetamida (DMA), e N-metil-2-piridona (NMP).[00262] Using 2 to 20 molar equivalents of the compound (2) to the antibody (3a) having a sulfhydryl group, the antibody-drug conjugate (1) in which 2 to 8 drug molecules are conjugated per antibody can be produced. Specifically, it is sufficient that the solution containing the compound (2) dissolved therein is added to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group for the reaction. Here, examples of the buffer solution that can be used include sodium acetate solution, sodium phosphate, and sodium borate. The pH for the reaction is 5 to 9, and more preferably the reaction is carried out at about pH 7. Examples of the solvent for dissolving the compound (2) include an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethyl acetamide (DMA), and N-methyl-2-pyridone (NMP).

[00263] É suficiente que a solução de solvente orgânico contendo o composto (2) dissolvido nesta seja adicionada em 1 a 20% em v/v a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. A temperatura de reação é 0 a 37oC, mais preferivelmente 10 a 25oC, e o tempo de reação é 0,5 a 2 horas. A reação pode ser terminada desativando-se a reatividade do composto não reagido (2) com um reagente contendo tiol. Exemplos do reagente contendo tiol incluem cisteína e N-acetil-L-cisteína (NAC). Mais especificamente, 1 a 2 equivalentes molar de NAC são adicionados ao composto (2) usado e, incubando-se em temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos, a reação pode ser terminada.[00263] It is sufficient that the organic solvent solution containing the compound (2) dissolved in it is added at 1 to 20% v/v to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group for the reaction. The reaction temperature is 0 to 37oC, more preferably 10 to 25oC, and the reaction time is 0.5 to 2 hours. The reaction can be terminated by deactivating the reactivity of the unreacted compound (2) with a thiol-containing reagent. Examples of the thiol-containing reagent include cysteine and N-acetyl-L-cysteine (NAC). More specifically, 1 to 2 molar equivalents of NAC are added to the compound (2) used and, by incubating at room temperature for 10 to 30 minutes, the reaction can be terminated.

[00264] O conjugado de anticorpo-fármaco produzido (1) pode ser submetido a, após a concentração, permuta de tampão, purificação, e a medição da concentração de anticorpo e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo de acordo com os procedimentos comuns descritos abaixo, identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1).[00264] The produced antibody-drug conjugate (1) can be subjected to, after concentration, buffer exchange, purification, and measurement of antibody concentration and average number of conjugated drug molecules per antibody molecule in accordance with the common procedures described below, identification of the antibody-drug conjugate (1).

Common Procedure A: Concentration of aqueous solution of antibody or antibody-drug conjugate

[00265] Em um recipiente Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), uma solução de anticorpo ou de conjugado de anticorpo- fármaco foi adicionada, e a solução do anticorpo ou do conjugado de anticorpo-fármaco foi concentrado por centrifugação (centrífugar durante 5 a 20 minutos em 2000 G a 3800 G) usando uma centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).[00265] In an Amicon Ultra container (50,000 MWCO, Millipore Corporation), an antibody or antibody-drug conjugate solution was added, and the antibody or antibody-drug conjugate solution was concentrated by centrifugation (centrifuge for 5 to 20 minutes at 2000 G to 3800 G) using a centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).

Common Procedure B: Antibody Concentration Measurement

[00266] Usando um detector UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), a medição da concentração de anticorpo foi realizada de acordo com o método definido pelo fabricante. Nesse momento, o coeficiente de absorção de 280 nm diferente para cada anticorpo foi usado (1,3 mLmg-1cm-1 a 1,8 mLmg-1cm-1).[00266] Using a UV detector (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), measurement of antibody concentration was performed according to the method defined by the manufacturer. At this time, a different 280 nm absorption coefficient for each antibody was used (1.3 mLmg-1cm-1 to 1.8 mLmg-1cm-1).

Common Procedure C-1: Buffer Exchange for Antibody

[00267] Coluna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando o portador Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (10 mM, pH 6,0; é referido como PBS6.0/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (137 mM) e ácido etileno diamina tetraacético (EDTA, 5 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. A solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL para coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6.0/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Depois de medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada em 10 mg/mL usando PBS6.0/EDTA.[00267] NAP-25 column (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) using the Sephadex G-25 carrier was equilibrated with phosphate buffer (10 mM, pH 6.0; it is referred to as PBS6. 0/EDTA in specification) containing sodium chloride (137 mM) and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA, 5 mM) according to the method defined by the manufacturer. The aqueous antibody solution was applied in an amount of 2.5 mL to a simple NAP-25 column, and then the fraction (3.5 mL) eluted with 3.5 mL of PBS6.0/EDTA was collected. The resulting fraction was concentrated by Common Procedure A. After measuring the antibody concentration using Common Procedure B, the antibody concentration was adjusted to 10 mg/mL using PBS6.0/EDTA.

Common Procedure C-2: Buffer Exchange for Antibody

[00268] Coluna NAP-25 (Cat. No.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando o veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com o tampão de fosfato (50 mM, pH 6.5; referido como PBS6.5/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (50 mM) e EDTA (2 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. A solução aquosa do anticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL para coluna NAP- 25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6.5/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Depois de medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada em 20 mg/mL usando PBS6.5/EDTA.[00268] NAP-25 column (Cat. No.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) using the Sephadex G-25 vehicle was equilibrated with phosphate buffer (50 mM, pH 6.5; referred to as PBS6.5/ EDTA in specification) containing sodium chloride (50 mM) and EDTA (2 mM) according to the method defined by the manufacturer. The aqueous antibody solution was applied in an amount of 2.5 mL to a simple NAP-25 column, and then the fraction (3.5 mL) eluted with 3.5 mL of PBS6.5/EDTA was collected. The resulting fraction was concentrated by Common Procedure A. After measuring the antibody concentration using Common Procedure B, the antibody concentration was adjusted to 20 mg/mL using PBS6.5/EDTA.

Common Procedure D: Purification of Antibody-Drug Conjugate

[00269] Coluna NAP-25 foi equilibrada com qualquer tampão selecionado do tampão de fosfato comercialmente disponível (PBS7.4, Cat.No.10010-023, Invitrogen), tampão de fosfato de sódio (10mM, pH 6,0; é referido como PBS6.0) contendo cloreto de sódio (137 mM), e tampão de acetato contendo sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; é referido como ABS na especificação). A solução aquosa da reação do conjugado de anticorpo-fármaco foi aplicada em uma quantidade de cerca de 1,5 mL à coluna NAP-25, e em seguida eluída com o tampão em uma quantidade definida pelo fabricante para coletar a fração de anticorpo. A fração coletada foi aplicada novamente à coluna NAP-25 e, repetindo-se 2 a 3 vezes no total o processo de purificação por filtração de gel eluindo-se com tampão, o conjugado de anticorpo- fármaco excluindo o ligante de fármaco não conjugado e um composto de baixo peso molecular (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L-cisteína (NAC), e dimetilsulfóxide) foi obtido.[00269] NAP-25 column was equilibrated with any buffer selected from commercially available phosphate buffer (PBS7.4, Cat.No.10010-023, Invitrogen), sodium phosphate buffer (10mM, pH 6.0; it is referred to as PBS6.0) containing sodium chloride (137 mM), and acetate buffer containing sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; it is referred to as ABS in the specification). The aqueous solution of the antibody-drug conjugate reaction was applied in an amount of about 1.5 mL to the NAP-25 column, and then eluted with the buffer in an amount defined by the manufacturer to collect the antibody fraction. The collected fraction was applied again to the NAP-25 column and, repeating the purification process by gel filtration 2 to 3 times in total, eluting with buffer, the antibody-drug conjugate excluding the unconjugated drug ligand and a low molecular weight compound (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), N-acetyl-L-cysteine (NAC), and dimethylsulfoxide) was obtained.

Common Procedure E: Measurement of antibody concentration in the antibody-drug conjugate and average number of drug molecules conjugated per antibody molecule (1).

[00270] A concentração de fármaco conjugada no conjugado de anticorpo-fármaco pode ser calculada medindo-se a absorvência UV de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em dois comprimentos de onda de 280 nm e 370 nm, seguido realizando-se o cálculo mostrado abaixo.[00270] The concentration of drug conjugated in the antibody-drug conjugate can be calculated by measuring the UV absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at two wavelengths of 280 nm and 370 nm, followed by performing the calculation shown below.

[00271] Porque a absorvência total em qualquer comprimento de onda é igual à soma da absorvência de todas as espécies químicas de absorção de luz que estão presentes em um sistema (aditividade da absorvência), quando os coeficientes de absorção molares do anticorpo e o fármaco permanece o mesmo antes e depois da conjugação entre o anticorpo e o fármaco, a concentração do anticorpo e a concentração do fármaco no conjugado de anticorpo- fármaco são expressadas com as seguintes equações. [00271] Because the total absorbance at any wavelength is equal to the sum of the absorbance of all light-absorbing chemical species that are present in a system (additivity of absorbance), when the molar absorption coefficients of the antibody and the drug remains the same before and after the conjugation between antibody and drug, the concentration of antibody and the concentration of drug in the antibody-drug conjugate are expressed with the following equations.

[00272] No anterior, A280 representa a absorvência de uma solução aqUOsa dO cOnjUgadO de anticOrpO-fármacO em 280 nm, A370 representa a absOrvência de Uma sOlUÇãO aqUOsa dO cOnjUgadO de anticOrpO-fármacO em 370 nm, AA,280 representam a absOrvência de Um anticOrpO em 280 nm, AA,370 representa a absOrvência de Um anticOrpO em 370 nm, AD,280 representa a absOrvência de Um precUrsOr dO cOnjUgadO em 280 nm, AD,370 representa a absOrvência de Um precursor do conjugado em 370 nm, SA,280 representa o coeficiente de absorção molar de um anticorpo em 280 nm, SA,370 representa o coeficiente de absorção molar de um anticorpo em 370 nm, SD,280 representa o coeficiente de absorÇão molar de um precursor do conjugado em 280 nm, SD,370 representa o coeficiente de absorção molar de um precursor do conjugado em 370 nm, CA representa a concentração de anticorpo em um conjugado de anticorpo-fármaco, e CD representa a concentração de fármaco em um conjugado de anticorpo-fármaco.[00272] In the above, A280 represents the absorbance of an aqueous solution of the anti-body-drug conjugate at 280 nm, A370 represents the absorbance of an aqueous solution of the anti-body-drug conjugate at 370 nm, AA,280 represents the absorbance of A antibody at 280 nm, AA.370 represents the absorptivity of an antibody at 370 nm, AD.280 represents the absorptivity of a precursor of the conjugate at 280 nm, AD.370 represents the absorpncy of a precursor of the conjugate at 370 nm, SA, 280 represents the molar absorption coefficient of an antibody at 280 nm, SA,370 represents the molar absorption coefficient of an antibody at 370 nm, SD,280 represents the molar absorption coefficient of a conjugate precursor at 280 nm, SD, 370 represents the molar absorption coefficient of a conjugate precursor at 370 nm, CA represents the concentration of antibody in an antibody-drug conjugate, and CD represents the concentration of drug in an antibody-drug conjugate.

[00273] Quanto aos SA,280, SA,370, SD,280, e SD,370 nos anteriores, valores previamente preparados (valor estimado com base no cálculo ou valor de medida obtido por medida de UV do composto) são usados. Por exemplo, SA,280 pode ser calculado da sequência de aminoácido de um anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). SA,370 é geralmente zero. SD,280 e SD,370 podem ser obtidos com base na lei de Lambert-Beer (Absorvência = concentração molar x coeficiente de absorção molar x comprimento do caminho da célula) medindo-se a absorvência de uma solução em que o precursor do conjugado a ser usado é dissolvido a uma certa concentração molar. Medindo-se A280 e A370 de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco e resolvendo-se as equações simultâneas (I) e (II) usando os valores, CA e CD podem ser obtidas. Além disso, dividindo-se CD por CA, o número médio do fármaco conjugado por anticorpo pode ser obtido.[00273] As for SA,280, SA,370, SD,280, and SD,370 in the above, previously prepared values (estimated value based on calculation or measurement value obtained by UV measurement of the compound) are used. For example, SA,280 can be calculated from the amino acid sequence of an antibody using a known calculation method (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). SA,370 is generally zero. SD.280 and SD.370 can be obtained based on the Lambert-Beer law (Absorbance = molar concentration x molar absorption coefficient x cell path length) by measuring the absorbance of a solution in which the conjugate precursor a be used is dissolved at a certain molar concentration. By measuring A280 and A370 of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate and solving simultaneous equations (I) and (II) using the values, CA and CD can be obtained. Furthermore, by dividing CD by CA, the average number of drug conjugates per antibody can be obtained.

[00274] Procedimento comum F: Medida do número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado de anticorpo-fármaco - (2).[00274] Common procedure F: Measurement of the average number of drug molecules conjugated per antibody molecule in the antibody-drug conjugate - (2).

[00275] O número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado de anticorpo-fármaco pode da mesma forma ser determinado por análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) usando um método descrito abaixo, além do procedimento comum E supracitado.[00275] The average number of conjugated drug molecules per antibody molecule in the antibody-drug conjugate can also be determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis using a method described below, in addition to the common procedure E above. .

[00276] F-1. Preparação de amostra para análise por HPLC (redução do conjugado de anticorpo-fármaco)[00276] F-1. Sample preparation for HPLC analysis (antibody-drug conjugate reduction)

[00277] Uma solução de conjugado de anticorpo-fármaco (cerca de 1 mg/mL, 60 μL) é misturada com uma solução de ditiotreitol aquoso (DTT) (100 mM, 15 μL). A mistura é incubada a 37oC durante 30 minutos para clivar a ligação do dissulfeto entre a cadeia L, e a cadeia H do conjugado de anticorpo-fármaco. A amostra resultante é usada em análise por HPLC.[00277] An antibody-drug conjugate solution (about 1 mg/mL, 60 μL) is mixed with an aqueous dithiothreitol (DTT) solution (100 mM, 15 μL). The mixture is incubated at 37oC for 30 minutes to cleave the disulfide bond between the L chain and the H chain of the antibody-drug conjugate. The resulting sample is used in HPLC analysis.

[00278] F-2. Análise por HPLC[00278] F-2. HPLC analysis

[00279] A análise por HPLC é administrada sob as seguintes condições de medida:[00279] HPLC analysis is administered under the following measurement conditions:

[00280] Sistema de HPLC: sistema de HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.)[00280] HPLC system: Agilent 1290 HPLC system (Agilent Technologies, Inc.)

[00281] Detector: espectrômetro de absorção UV (comprimento de onda de medida: 280 nm)[00281] Detector: UV absorption spectrometer (measurement wavelength: 280 nm)

[00282] Coluna: PLRP-S (2,1 x 50 mm, 8 μm, 1000 angstroms; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)[00282] Column: PLRP-S (2.1 x 50 mm, 8 μm, 1000 angstroms; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)

[00283] Temperatura de coluna: 80oC[00283] Column temperature: 80oC

[00284] Fase móvel A: 0,04% de solução de ácido trifluoroacético aquoso (TFA)[00284] Mobile phase A: 0.04% aqueous trifluoroacetic acid (TFA) solution

[00285] Fase móvel B: solução de acetonitrila contendo 0,04% de TFA[00285] Mobile phase B: acetonitrile solution containing 0.04% TFA

[00286] Programa de gradiente: 29%-36% (0 min-12,5 min), 36%- 42% (12,5-15 min), 42%-29% (15 min-15,1 min), 29%-29% (15,1 min- 25 min)[00286] Gradient program: 29%-36% (0 min-12.5 min), 36%-42% (12.5-15 min), 42%-29% (15 min-15.1 min) , 29%-29% (15.1 min- 25 min)

[00287] Volume de injeção da amostra: 15 μL[00287] Sample injection volume: 15 μL

[00288] F-3. Análise de dados[00288] F-3. Data analysis

[00289] [F-3-1] Em comparação com uma cadeia L (L0) e uma cadeia H (H0) de um anticorpo não conjugado, uma cadeia L conjugada de fármaco (cadeia L conectada a uma molécula de fármaco: L1) e cadeias H (cadeia H conectada a uma molécula de fármaco: H1, cadeia H conectada a duas moléculas de fármaco: H2, cadeia H conectada a três moléculas de fármaco: H3) exibe a hidrofobicidade superior em proporção ao número de moléculas de fármaco conjugadas e desse modo tem um tempo de retenção maior. Estas cadeias são, portanto, eluídas na ordem de L0 e L1 ou H0, H1, H2 e H3. Picos de detecção podem ser nomeados para quaisquer dentre L0, L1, H0, H1, H2 e H3 pela comparação dos tempos de retenção com L0 e H0.[00289] [F-3-1] Compared to an L chain (L0) and an H chain (H0) of an unconjugated antibody, a drug conjugated L chain (L chain connected to a drug molecule: L1) and H chains (H chain connected to one drug molecule: H1, H chain connected to two drug molecules: H2, H chain connected to three drug molecules: H3) exhibit superior hydrophobicity in proportion to the number of conjugated drug molecules and thus has a longer retention time. These chains are therefore eluted in the order of L0 and L1 or H0, H1, H2 and H3. Detection peaks can be assigned to any of L0, L1, H0, H1, H2 and H3 by comparing the retention times with L0 and H0.

[00290] [F-3-2] Visto que o ligante de fármaco tem absorção UV, xos valores de área de pico são corrigidos com respeito ao número de moléculas de ligante de fármaco conjugadas de acordo com a expressão seguinte usando os coeficientes de absorção molar da cadeia L, da cadeia H, e do ligante de fármaco. Expressão 1 Valor corrigido da área de pico da cadeia L (Li) = Área de pico x Coeficiente de extinção molar da cadeia L[00290] [F-3-2] Since the drug ligand has UV absorption, the peak area values are corrected with respect to the number of conjugated drug ligand molecules according to the following expression using the absorption coefficients molar of the L chain, the H chain, and the drug linker. Expression 1 Corrected value of the peak area of the L chain (Li) = Peak area x Molar extinction coefficient of the L chain

[00291] Coeficiente de extinção molar da cadeia L + O número de moléculas de fármaco conjugadas x Coeficiente de extinção molar do ligante de fármaco Expressão 2 Valor corrigido da área de pico da cadeia H (Hi) = Área de pico x Coeficiente de extinção molar da cadeia H.[00291] Molar extinction coefficient of the L chain + The number of conjugated drug molecules x Molar extinction coefficient of the drug ligand Expression 2 Corrected value of the peak area of the H chain (Hi) = Peak area x Molar extinction coefficient of the H chain.

[00292] Coeficiente de extinção molar da cadeia H + O número de moléculas de fármaco conjugadas x Coeficiente de extinção molar do ligante de fármaco[00292] Molar extinction coefficient of the H chain + The number of conjugated drug molecules x Molar extinction coefficient of the drug ligand

[00293] Aqui, quanto ao coeficiente de extinção molar (280 nm) da cadeia L ou da cadeia H de cada anticorpo, um valor estimado da sequência de aminoácido da cadeia L ou da cadeia H de cada anticorpo por um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) pode ser usado. No caso de hTINA, um coeficiente de extinção molar de 34690 e um coeficiente de extinção molar de 95000 foram usados como valores estimados para a cadeia L, e para a cadeia H, respectivamente, de acordo com sua sequência de aminoácido. Quanto ao coeficiente de extinção molar (280 nm) do ligante de fármaco, o coeficiente de extinção molar medido (280 nm) de um composto em que o grupo de maleimida foi convertido à Succinimida tioéter pela reação de cada ligante de fármaco com mercaptoetanol ou N-acetilcisteína foi usado.[00293] Here, as to the molar extinction coefficient (280 nm) of the L chain or H chain of each antibody, an estimated value of the amino acid sequence of the L chain or H chain of each antibody by a known calculation method ( Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) can be used. In the case of hTINA, a molar extinction coefficient of 34690 and a molar extinction coefficient of 95000 were used as estimated values for the L chain, and for the H chain, respectively, according to their amino acid sequence. As for the molar extinction coefficient (280 nm) of the drug linker, the measured molar extinction coefficient (280 nm) of a compound in which the maleimide group has been converted to the succinimide thioether by reacting each drug linker with mercaptoethanol or N -acetylcysteine was used.

[00294] [F-3-3] A relação da área de pico (%) de cada cadeia é calculada para o total dos valores corrigidos das áreas de pico de acordo com a expressão seguinte. Expressão 3 Relação da área de pico da cadeia L = ALi x 100 a. AL0 + ALi Relação da área de pico da cadeia H = AHi x 100 b. AH0 + AHi + AH2 + AH3 ALi, AHi : Valores corrigidos das áreas de pico respectivos de Li e Hi[00294] [F-3-3] The peak area ratio (%) of each chain is calculated for the total of the corrected peak area values according to the following expression. Expression 3 Chain peak area ratio L = ALi x 100 a. AL0 + ALi Chain peak area ratio H = AHi x 100 b. AH0 + AHi + AH2 + AH3 ALi, AHi : Corrected values of the respective peak areas of Li and Hi

[00295] [F-3-4] O número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo no conjugado de anticorpo- fármaco é calculado de acordo com a expressão seguinte.[00295] [F-3-4] The average number of conjugated drug molecules per antibody molecule in the antibody-drug conjugate is calculated according to the following expression.

[00296] Número médio de moléculas de fármaco conjugadas = (relação da área de pico de L0 x 0 + relação da área de pico de L0 x 1 + relação da área de pico de H0 x 0 + relação da área de pico de H1 x 1 + relação da área de pico de H2 x 2 + relação da área de pico de H3 x 3) / 100 x 2[00296] Average number of conjugated drug molecules = (L0 x 0 peak area ratio + L0 x 1 peak area ratio + H0 x 0 peak area ratio + H1 x peak area ratio 1 + H2 peak area ratio x 2 + H3 peak area ratio x 3) / 100 x 2

[00297] O composto representado pela fórmula (2) no Método de produção 1 é um composto representado pela seguinte fórmula: 1. (maleimid-N-il)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)-(NH-DX)[00297] The compound represented by formula (2) in Production Method 1 is a compound represented by the following formula: 1. (maleimid-N-yl)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH -(CH2)n1-La-(CH2)n2- C(=O)-(NH-DX)

[00298] Na fórmula, n3 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n4 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos selecionados de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico n1 representa um número inteiro de 0 a 6, n2 representa um número inteiro de 0 a 5, La representa -O- ou uma ligação simples, (maleimid-N-il)- é um grupo maleimidila (grupo 2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-ila) representado pela seguinte fórmula: Fórmula 20 em que o átomo de nitrogênio é uma posição de conexão, -(NH-DX) é um grupo representado pela seguinte fórmula: Fórmula 21 em que o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 é uma posição de conexão.[00298] In the formula, n3 represents an integer from 2 to 8, L2 represents -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- or a single bond, where n4 represents an integer from 1 to 6, LP represents a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid n1 represents an integer from 0 to 6, n2 represents an integer from 0 to 5, La represents -O- or a single bond, (maleimid-N-yl)- is a maleimidyl group (2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1H-pyrrole-1-yl group ) represented by the following formula: Formula 20 in which the nitrogen atom is a connecting position, -(NH-DX) is a group represented by the following formula: Formula 21 wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is a connecting position.

[00299] Quando L2 é uma ligação simples ou -NH-(CH2CH2-O)n4- CH2CH2-C(=O)-, um composto no qual n4 é um número inteiro de 2 a 4 é preferido como um intermediário de produção.[00299] When L2 is a single bond or -NH-(CH2CH2-O)n4- CH2CH2-C(=O)-, a compound in which n4 is an integer from 2 to 4 is preferred as a production intermediate.

[00300] Quanto ao resíduo de peptídeo de LP, um composto tendo um resíduo de peptídeo compreendendo um aminoácido selecionado a partir de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico é preferido como um intermediário de produção. Entre esses resíduos de peptídeo, um composto em que LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos é preferido como um intermediário de produção. Mais especificamente, um composto em que LP é um resíduo de tetrapeptídeo de -GGFG- é preferido como um intermediário de produção.[00300] As for the LP peptide residue, a compound having a peptide residue comprising an amino acid selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid is preferred as a production intermediate . Among these peptide residues, a compound in which LP is a peptide residue consisting of 4 amino acids is preferred as a production intermediate. More specifically, a compound in which LP is a tetrapeptide residue of -GGFG- is preferred as a production intermediate.

[00301] Além disso, quanto ao -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto tendo -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH- CH2CH2-O-CH2 é mais preferido.[00301] Furthermore, regarding -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O- CH2- is preferred as a production intermediate. A compound having -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2 is more preferred.

[00302] Além disso, no composto representado pela fórmula (2), um composto em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido. Um composto em que n3 é um número inteiro de 2 ou 5 é também preferido.[00302] Furthermore, in the compound represented by formula (2), a compound in which n3 is an integer from 2 to 5, L2 is a single bond, and -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2 - is -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediary. A compound in which -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- is -NH-CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O- CH2- is more preferred. A compound wherein n3 is an integer of 2 or 5 is also preferred.

[00303] Além disso, no composto representado pela fórmula (2), um composto em que n3 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2- O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 é um número inteiro de 2 a 4, e -NH-(CH2)n1- La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que n4 é um número inteiro de 2 ou 4 é mais preferido. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é também preferido.[00303] Furthermore, in the compound represented by formula (2), a compound in which n3 is an integer from 2 to 5, L2 is -NH-(CH2CH2- O)n4-CH2CH2-C(=O)-, n4 is an integer from 2 to 4, and -NH-(CH2)n1- La-(CH2)n2- is -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2- , -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound in which n4 is an integer of 2 or 4 is more preferred. A compound in which -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- is -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is also preferred.

[00304] Como tais intermediários preferidos úteis na produção do composto da presente invenção, os seguintes podem ser exemplificados. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).[00304] As such preferred intermediates useful in producing the compound of the present invention, the following can be exemplified. (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX ), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O )-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH -DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C( =O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O )-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)- CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C( =O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl )-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O )- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N -yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C( =O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid -N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

[00305] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção pode ser produzido reagindo-se um composto de ligante de fármaco selecionado a partir do grupo acima descrito dos compostos intermediários de produção com um anticorpo anti-TROP2 ou um derivado reativo do mesmo, e formando uma ligação tioéter em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte da articulação do anticorpo anti-TROP2. Neste caso, um derivado reativo do anticorpo anti-TROP2 é preferivelmente usado. Particularmente, um derivado reativo obtido reduzindo-se o anticorpo anti-TROP2 é preferido.[00305] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be produced by reacting a drug-binding compound selected from the above-described group of production intermediate compounds with an anti-TROP2 antibody or a reactive derivative of the same, and forming a thioether bond in a disulfide bond site present in a joint part of the anti-TROP2 antibody. In this case, a reactive derivative of the anti-TROP2 antibody is preferably used. Particularly, a reactive derivative obtained by reducing the anti-TROP2 antibody is preferred.

[00306] Os seguintes são compostos mais preferidos como intermediários de produção. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).[00306] The following are most preferred compounds as production intermediates. (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX ), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O )-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O )-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N -il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid -N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C( =O)-(NH-DX).

[00307] Entre o grupo acima descrito dos compostos intermediários, um composto representado pela seguinte fórmula: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), ou (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), é um composto preferido adicional.[00307] Among the above-described group of intermediate compounds, a compound represented by the following formula: (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2- C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(= O)-(NH-DX), or (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX), is a additional preferred compound.

[00308] Para garantir a quantidade do conjugado, uma pluralidade de conjugados obtidos sob condições de produção similares para ter um número equivalente de fármacos (por exemplo, cerca de +1) pode ser misturada para preparar grupos novos. Neste caso, o número médio de fármacos diminui entre os números médios de fármacos dos fármacos nos conjugados antes da mistura.[00308] To guarantee the amount of the conjugate, a plurality of conjugates obtained under similar production conditions to have an equivalent number of drugs (for example, about +1) can be mixed to prepare new groups. In this case, the average number of drugs decreases between the average drug numbers of the drugs in the conjugates before mixing.

2. Production Method 2

[00309] O composto representado pela fórmula (2) como um intermediário usado no método farmacologicamente aceitável do de produção anterior e um sal mesmo, pode ser produzido pelo método seguinte, por exemplo. Fórmula 22 [00309] The compound represented by formula (2) as an intermediate used in the pharmacologically acceptable method of the previous production and a salt itself, can be produced by the following method, for example. Formula 22

[00310] Na fórmula, L1’ representa um grupo maleimidila, e P1, P2, e P3 cada qual representa um grupo protetor.[00310] In the formula, L1' represents a maleimidyl group, and P1, P2, and P3 each represent a protecting group.

[00311] O composto (6) pode ser produzido derivando-se o ácido carboxílico (5) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-os com NH2-DX (4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo, na presença de um base. NH2-DX (4) representa exatecana (nome químico: (1S,9S)-1-amino-9- etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)- diona).[00311] The compound (6) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (5) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting them with NH2-DX (4) or a pharmacologically acceptable salt of the same, in the presence of a base. NH2-DX (4) represents exatecan (chemical name: (1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H- benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-dione).

[00312] Reagentes de reação e condições que são geralmente usados para a síntese de peptídeo podem ser empregados para a reação. Há vários tipos de éster ativo. Por exemplo, podem ser produzidos reagindo-se fenóis tais como, p-nitrofenol, N- hidroxibenzotriazol, N-hidroxiSuccinimida, ou similares, com o ácido carboxílico (5) usando um agente de condensação tal como, N,N'- dicicloexilcarbodiimida ou cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida. Além disso, o éster ativo pode da mesma forma ser produzido por uma reação do ácido carboxílico (5) com pentafluorofenil trifluoroacetato ou similares; uma reação do ácido carboxílico (5) com hexafluorofosfito de 1-benzotriazolil oxitripirrolidinofosfônio; uma reação do ácido carboxílico (5) com dietil cianofosfonato (método de dispersão); uma reação do ácido carboxílico (5) com trifenilfosfina e 2,2'-dipiridil dissulfeto (método de Mukaiyama); uma reação do ácido carboxílico (5) com um derivado de triazina tal como cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolínio (DMTMM); ou similares. Além disso, a reação pode da mesma forma ser realizada, por exemplo, por um método de haleto ácido por qual o ácido carboxílico (5) é tratado com haleto ácido tais como, cloreto de tionila e cloreto de oxalila na presença de uma base.[00312] Reaction reagents and conditions that are generally used for peptide synthesis can be employed for the reaction. There are several types of active ester. For example, phenols such as p-nitrophenol, N-hydroxybenzotriazole, N-hydroxySuccinimide, or the like can be produced by reacting with the carboxylic acid (5) using a condensing agent such as N,N'-dicyclohexylcarbodiimide or 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride. Furthermore, the active ester can also be produced by a reaction of carboxylic acid (5) with pentafluorophenyl trifluoroacetate or the like; a reaction of carboxylic acid (5) with 1-benzotriazolyl oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphite; a reaction of carboxylic acid (5) with diethyl cyanophosphonate (dispersion method); a reaction of carboxylic acid (5) with triphenylphosphine and 2,2'-dipyridyl disulfide (Mukaiyama method); a reaction of the carboxylic acid (5) with a triazine derivative such as 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM); or similar. Furthermore, the reaction can also be carried out, for example, by an acid halide method whereby the carboxylic acid (5) is treated with acid halide such as thionyl chloride and oxalyl chloride in the presence of a base.

[00313] Reagindo-se o éster ativo, anidrido ácido misturado, ou haleto ácido do ácido carboxílico (5) obtido como acima com o composto (4) na presença de uma base adequada em um solvente inerte a uma temperatura de reação de -78oC a 150oC, o composto (6) pode ser produzido. Enquanto isso, "solvente inerte" indica um solvente que não inibe uma reação alvo para a qual o solvente é usado.[00313] Reacting the active ester, mixed acid anhydride, or acid halide of the carboxylic acid (5) obtained as above with the compound (4) in the presence of a suitable base in an inert solvent at a reaction temperature of -78oC at 150oC, compound (6) can be produced. Meanwhile, "inert solvent" indicates a solvent that does not inhibit a target reaction for which the solvent is used.

[00314] Exemplos específicos da base usada para cada etapa descrita acima podem incluir carbonato, alcóxido, hidróxido, ou hidreto de um metal de álcali ou um metal alcalino terroso incluindo carbonato de sódio, carbonato de potássio, etóxido de sódio, butóxido de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidreto de sódio, e hidreto de potássio, base organometálica representada por um alquil lítio incluindo n-butilítio, dialquilaminolítio incluindo di-isopropilamida de lítio; base organometálica de bissililamina incluindo bis(trimetilsilil)amida de lítio; e base orgânica incluindo amina terciária ou composto heterocíclico contendo nitrogênio tais como, piridina, 2,6- lutidina, colidina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N-metilmorfolina, di-isopropiletilamina, e diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU).[00314] Specific examples of the base used for each step described above may include carbonate, alkoxide, hydroxide, or hydride of an alkali metal or an alkaline earth metal including sodium carbonate, potassium carbonate, sodium ethoxide, potassium butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydride, and potassium hydride, organometallic base represented by an alkyl lithium including n-butyllithium, dialkylaminolithium including lithium diisopropylamide; bissilylamine organometallic base including lithium bis(trimethylsilyl)amide; and organic base including tertiary amine or nitrogen-containing heterocyclic compound such as, pyridine, 2,6-lutidine, collidine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N-methylmorpholine, diisopropylethylamine, and diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU).

[00315] Exemplos do solvente inerte que é usado para a reação da presente invenção incluem um solvente de hidrocarboneto halogenado tais como, diclorometano, clorofórmio, e tetracloreto de carbono; um solvente de éter tais como, tetra-hidrofurano, 1,2-dimetoxietano, e dioxano; um solvente de hidrocarboneto aromático tais como, benzeno e tolueno; e um solvente de amida tais como, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, e N-metilpirrolidin-2-ona. Além deles, um solvente de sulfóxido tal como dimetil sulfóxido e sulfolano; um solvente de cetona tais como, acetona e metil etil cetona; e um solvente de álcool tais como metanol e etanol pode ser usado em algum caso. Além disso, estes solventes podem ser misturados para uso.[00315] Examples of the inert solvent that is used for the reaction of the present invention include a halogenated hydrocarbon solvent such as dichloromethane, chloroform, and carbon tetrachloride; an ether solvent such as tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, and dioxane; an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene; and an amide solvent such as N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidin-2-one. In addition to them, a sulfoxide solvent such as dimethyl sulfoxide and sulfolane; a ketone solvent such as acetone and methyl ethyl ketone; and an alcohol solvent such as methanol and ethanol may be used in some cases. Furthermore, these solvents can be mixed for use.

[00316] Quanto ao grupo protetor P1 para o grupo amino terminal do composto (6), um grupo protetor para um grupo amino que é geralmente usado para síntese de peptídeo, por exemplo, grupo terc- butiloxicarbonila, grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila, e grupo benziloxicarbonila, pode ser usado. Exemplos do outro grupo protetor para um grupo amino podem incluir um grupo alcanoíla tal como, grupo acetila; um grupo alcoxicarbonila tais como, grupo metoxicarbonila e grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetoxicarbonila tal como grupo parametoxibenziloxicarbonila, e grupo para (ou orto)nitroibenziloxicarbonila; um grupo arilmetila tais como, grupo benzila e grupo trifenilmetila; um grupo aroíla tal como, grupo benzoíla; e um grupo arilsulfonila tais como grupo 2,4-dinitrobenzeno sulfonila e grupo ortonitrobenzeno sulfonila. O grupo protetor P1 pode ser selecionado dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo um grupo amino a ser protegido.[00316] As for the P1 protecting group for the terminal amino group of compound (6), a protecting group for an amino group that is generally used for peptide synthesis, for example, tert-butyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, and benzyloxycarbonyl, can be used. Examples of the other protecting group for an amino group may include an alkanoyl group such as acetyl group; an alkoxycarbonyl group such as methoxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group; an arylmethoxycarbonyl group such as paramethoxybenzyloxycarbonyl group, and para (or ortho)nitroibenzyloxycarbonyl group; an arylmethyl group such as benzyl group and triphenylmethyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and an arylsulfonyl group such as 2,4-dinitrobenzene sulfonyl group and orthonitrobenzene sulfonyl group. The protecting group P1 can be selected depending, for example, on the properties of a compound having an amino group to be protected.

[00317] Desprotegendo-se o grupo protetor P1 para o grupo amino terminal do composto (6) obtido, o composto (7) pode ser produzido. Para este desproteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.[00317] By deprotecting the protective group P1 for the terminal amino group of the compound (6) obtained, the compound (7) can be produced. For this deprotection, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.

[00318] O composto (9) pode ser produzido derivando-se o ácido peptídeo carboxílico (8) tendo o N terminal protegido com P2 em um éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-os com o composto (7) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido peptídeo carboxílico (8), e o composto (7) podem ser selecionados adequadamente e podem ser usados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo protetor P2 pode ser selecionado adequadamente e usado daqueles descritos para o grupo protetor do composto (6), e a seleção pode ser feita com base, por exemplo, nas propriedades do composto tendo um grupo amino a ser protegido. Como é geralmente usado para a síntese de peptídeo, repetindo-se sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo que constitui o ácido peptídeo carboxílico (8) para alongamento, o composto (9) pode da mesma forma ser produzido.[00318] The compound (9) can be produced by deriving the peptide carboxylic acid (8) having the N terminal protected with P2 in an active ester, mixed acid anhydride, or similar and reacting them with the compound (7) obtained . The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide carboxylic acid (8), and the compound (7) can be selected appropriately and can be used from those described for the synthesis of the compound ( 6). The protecting group P2 can be suitably selected and used from those described for the protecting group of the compound (6), and the selection can be made based, for example, on the properties of the compound having an amino group to be protected. As is generally used for peptide synthesis, by sequentially repeating the reaction and deprotection of the amino acid or peptide constituting the peptide carboxylic acid (8) for elongation, the compound (9) can likewise be produced.

[00319] Desprotegendo-se o grupo protetor P2 para o grupo amino do composto (9) obtido, o composto (10) pode ser produzido. Para esta desproteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.[00319] By deprotecting the protective group P2 for the amino group of the compound (9) obtained, the compound (10) can be produced. For this deprotection, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.

[00320] É possível produzir o composto (2) derivando-se o ácido carboxílico (11) em um éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-os com o composto (10) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico (11), e o composto (10) podem ser selecionados adequadamente e usados a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00320] It is possible to produce the compound (2) by derivatizing the carboxylic acid (11) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or similar and reacting them with the compound (10) obtained. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the carboxylic acid (11), and the compound (10) can be suitably selected and used from those described for the synthesis of the compound (6 ).

[00321] O composto (9) pode da mesma forma ser produzido pelo método seguinte, por exemplo.[00321] Compound (9) can also be produced by the following method, for example.

[00322] O composto (13) pode ser produzido derivando-se o ácido peptídeo carboxílico (8) tendo o N terminal protegido com P2 em éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-os na presença de uma base com o composto de amina (12) tendo o grupo carbóxi protegido com P3. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido peptídeo carboxílico (8), e o composto (12) podem ser selecionados adequadamente e usados a partir daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00322] The compound (13) can be produced by deriving the carboxylic acid peptide (8) having the N terminal protected with P2 in active ester, mixed acid anhydride, or similar and reacting them in the presence of a base with the compound of amine (12) with the carboxy group protected with P3. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide carboxylic acid (8), and the compound (12) can be suitably selected and used from those described for the synthesis of the compound ( 6).

[00323] O grupo protetor P2 para o grupo amino do composto (13) pode ser protegido com um grupo protetor que é geralmente usado.[00323] The protecting group P2 for the amino group of compound (13) can be protected with a protecting group that is generally used.

[00324] Especificamente, exemplos do grupo protetor para um grupo hidroxila incluem um grupo alcoximetila tal como, grupo metoximetila; um grupo arilmetila tais como, grupo benzila, grupo 4- metoxibenzila, e grupo trifenilmetila; um grupo alcanoíla tal como, grupo acetila; um grupo aroíla tal como, grupo benzoíla; e um grupo silila tal como, terc-butil difenilsilila. Grupo carbóxi pode ser protegido, por exemplo, como um éster com um grupo alquila tais como, grupo metila, grupo etila, e grupo terc-butila, um grupo alila, ou um grupo arilmetila tal como, grupo benzila. Exemplos do grupo protetor para um grupo amino incluem, por exemplo, um grupo alquiloxicarbonila tais como, grupo terc-butiloxicarbonila, grupo metoxicarbonila, e grupo etoxicarbonila; grupo aliloxicarbonila, ou um grupo arilmetoxicarbonila tais como grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila, grupo benziloxicarbonila, grupo parametoxibenziloxicarbonila, e grupo para (ou orto)nitroibenziloxicarbonila; um grupo alcanoíla tal como, grupo acetila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila e grupo trifenilmetila; um grupo aroíla tal como grupo benzoíla; e um grupo arilsulfonila tal como grupo 2, 4-dinitrobenzenossulfonila ou grupo ortonitrobenzenossulfonila.[00324] Specifically, examples of the protecting group for a hydroxyl group include an alkoxymethyl group such as methoxymethyl group; an arylmethyl group such as benzyl group, 4-methoxybenzyl group, and triphenylmethyl group; an alkanoyl group such as acetyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and a silyl group such as tert-butyl diphenylsilyl. Carboxy group can be protected, for example, as an ester with an alkyl group such as methyl group, ethyl group, and tert-butyl group, an allyl group, or an arylmethyl group such as benzyl group. Examples of the protecting group for an amino group include, for example, an alkyloxycarbonyl group such as tert-butyloxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, and ethoxycarbonyl group; allyloxycarbonyl group, or an arylmethoxycarbonyl group such as 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, paramethoxybenzyloxycarbonyl group, and para (or ortho)nitroibenzyloxycarbonyl group; an alkanoyl group such as acetyl group; an arylmethyl group such as benzyl group and triphenylmethyl group; an aroyl group such as benzoyl group; and an arylsulfonyl group such as 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group or orthonitrobenzenesulfonyl group.

[00325] Quanto ao grupo protetor P3 para um grupo carbóxi, um grupo protetor geralmente usado como um grupo protetor para um grupo carbóxi na química sintética orgânica, em particular, síntese de peptídeo pode ser usado. Exemplos específicos incluem ésteres com um grupo alquila tal como um grupo metila, um grupo etila, ou uma terc-butila, alil éstes, e benzil ésteres, e o grupo protetor pode ser selecionado adequadamente dos grupos protetores acima descrito. Em tal caso, é preferido que o grupo protetor para um grupo amino, e o grupo protetor para um grupo carbóxi possam ser aqueles preferivelmente removidos por um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação em que P2 é um grupo terc-butiloxicarbonila e P3 é um grupo benzila. Os grupos protetores podem ser selecionados a partir daqueles acima mencionados dependendo, por exemplo, das propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a serem protegidos. Para a remoção dos grupos protetores, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.[00325] As for the protecting group P3 for a carboxy group, a protecting group generally used as a protecting group for a carboxy group in organic synthetic chemistry, in particular, peptide synthesis can be used. Specific examples include esters with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or a tert-butyl, allyl esters, and benzyl esters, and the protecting group can be suitably selected from the protecting groups described above. In such a case, it is preferred that the protecting group for an amino group, and the protecting group for a carboxy group may be those preferably removed by a different method or different conditions. For example, a representative example includes a combination in which P2 is a tert-butyloxycarbonyl group and P3 is a benzyl group. Protecting groups can be selected from those mentioned above depending, for example, on the properties of a compound having an amino group and a carboxy group to be protected. For the removal of protecting groups, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.

[00326] Desprotegendo-se o grupo protetor P3 para o grupo carbóxi do composto (13) obtido, o composto (14) pode ser produzido. Para esta desproteção, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo protetor.[00326] By deprotecting the protective group P3 for the carboxy group of the compound (13) obtained, the compound (14) can be produced. For this deprotection, reagents and conditions are selected depending on the protecting group.

[00327] O composto (9) pode ser produzido derivando-se o composto (14) obtido em éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser selecionados adequadamente daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00327] The compound (9) can be produced by derivatizing the compound (14) obtained in active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting with the compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reaction reagents and conditions that are generally used for peptide synthesis may likewise be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction may be suitably selected from those described for the synthesis. of compound (6).

[00328] O composto (2) pode da mesma forma ser produzido pelo método seguinte, por exemplo.[00328] Compound (2) can also be produced by the following method, for example.

[00329] Desprotegendo-se o grupo protetor P2 para o grupo amino do composto (13), o composto (15) pode ser produzido. Para esta desproteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo protetor.[00329] By deprotecting the P2 protecting group for the amino group of compound (13), compound (15) can be produced. For this deprotection, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.

[00330] O composto (16) pode ser produzido derivando-se o derivado de ácido carboxílico (11) em éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-os com o composto (15) obtido na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de amida entre o ácido peptídeo carboxílico (11), e o composto (15) podem ser selecionados adequadamente daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00330] The compound (16) can be produced by derivatizing the carboxylic acid derivative (11) into active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting them with the compound (15) obtained in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form an amide bond between the peptide carboxylic acid (11), and the compound (15) can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6).

[00331] Desprotegendo-se o grupo protetor para o grupo carbóxi do composto (16) obtido, o composto (17) pode ser produzido. Esta desproteção pode ser realizada similarmente à desproteção no grupo carbóxi para produzir o composto (14).[00331] By deprotecting the protecting group for the carboxy group of the compound (16) obtained, the compound (17) can be produced. This deprotection can be carried out similarly to the deprotection at the carboxy group to produce the compound (14).

[00332] O composto (2) pode ser produzido derivando-se o composto (17) em éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-os com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser selecionados adequadamente daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00332] The compound (2) can be produced by derivatizing the compound (17) into active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting them with the compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reaction reagents and conditions that are generally used for peptide synthesis may likewise be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction may be suitably selected from those described for the synthesis. of compound (6).

3. Production method 3

[00333] O composto representado pela fórmula (2) de um intermediário pode da mesma forma ser produzido pelo método seguinte. Fórmula 23 [00333] The compound represented by formula (2) of an intermediate can also be produced by the following method. Formula 23

[00334] Na fórmula, L1’ corresponde a L1 tendo uma estrutura na qual o terminal é convertido a um grupo maleimidila, e P4 representa um grupo protetor.[00334] In the formula, L1' corresponds to L1 having a structure in which the terminal is converted to a maleimidyl group, and P4 represents a protecting group.

[00335] O composto (19) pode ser produzido derivando-se o composto (11) em éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-o na presença de uma base com o ácido peptídeo carboxílico (18) tendo o terminal C protegido com P4. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido peptídeo carboxílico (18) e o composto (11) podem ser selecionados adequadamente daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo protetor P4 para o grupo carbóxi do composto (18) pode ser selecionado adequadamente do grupo protetor descrito acima.[00335] The compound (19) can be produced by derivatizing the compound (11) into active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting it in the presence of a base with the peptide carboxylic acid (18) having the C-terminus protected with P4. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide carboxylic acid (18) and the compound (11) can be appropriately selected from those described for the synthesis of the compound (6). The protecting group P4 for the carboxy group of compound (18) can be suitably selected from the protecting group described above.

[00336] Desprotegendo-se o grupo protetor para o grupo carbóxi do composto (19) obtido, o composto (20) pode ser produzido. Esta desproteção pode ser realizada semelhante à desproteção do grupo carbóxi para produzir o composto (14).[00336] By deprotecting the protecting group for the carboxy group of the compound (19) obtained, the compound (20) can be produced. This deprotection can be performed similar to the deprotection of the carboxy group to produce the compound (14).

[00337] O composto (2) pode ser produzido derivando-se o composto (20) obtido em éster ativo, anidrido ácido misturado, ou similares e reagindo-os com o composto (7). Para a reação, reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem da mesma forma ser usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser selecionados adequadamente daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00337] The compound (2) can be produced by derivatizing the compound (20) obtained into active ester, mixed acid anhydride, or the like and reacting them with the compound (7). For the reaction, reaction reagents and conditions that are generally used for peptide synthesis may likewise be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction may be suitably selected from those described for the synthesis. of compound (6).

4. Production method 4

[00338] A seguir, o método para produzir o composto (10b) tendo n1 = 1, La = O no intermediário de produção (10) descrito no Método de produção 2 é descrito em detalhes. O composto representado pela fórmula (10b), um sal ou um solvato do mesmo, pode ser produzido de acordo com o método seguinte, por exemplo. Fórmula 24 [00338] Next, the method for producing the compound (10b) having n1 = 1, La = O in the production intermediate (10) described in Production Method 2 is described in detail. The compound represented by formula (10b), a salt or a solvate thereof, can be produced according to the following method, for example. Formula 24

[00339] Na fórmula, LP é como definido acima, L representa um grupo acila que é um grupo alcanoíla, um grupo acetila ou um grupo de liga tal como um grupo benzoíla, um átomo de hidrogênio, ou similares, X e Y cada qual representa um oligopeptídeo que consiste em 1 a 3 aminoácidos, P5 e P7 cada qual representa um grupo protetor para um grupo amino, e P6 representa um grupo protetor para um grupo carbóxi.[00339] In the formula, LP is as defined above, L represents an acyl group which is an alkanoyl group, an acetyl group or an alloy group such as a benzoyl group, a hydrogen atom, or the like, X and Y each represents an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P5 and P7 each represent a protecting group for an amino group, and P6 represents a protecting group for a carboxy group.

[00340] Um composto representado pela fórmula (21) pode ser produzido usando ou aplicando o método descrito na Patente Japonesa Depositada em Aberto No. 2002-60351 ou a literatura (J. Org. Chem., Vol. 51, página 3196, 1986), e conduzindo-se a remoção dos grupos protetores ou modificação do grupos funcionais, se necessário. Alternativamente, pode da mesma forma ser obtido tratando-se um aminoácido com um grupo amino terminal protegido ou amida ácida de oligopeptídeo com grupo amino protegido com aldeído ou cetona.[00340] A compound represented by formula (21) can be produced using or applying the method described in Open Depositary Japanese Patent No. 2002-60351 or the literature (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986 ), and removing protective groups or modifying functional groups, if necessary. Alternatively, it can also be obtained by treating an amino acid with a protected terminal amino group or acid amide of an oligopeptide with an amino group protected with an aldehyde or ketone.

[00341] Reagindo-se o composto (21) com o composto (22) tendo um grupo hidroxila a uma temperatura variando de sob condições de temperatura de resfriamento à temperatura ambiente em um solvente inerte na presença de um ácido ou uma base, o composto (23) pode ser produzido.[00341] By reacting the compound (21) with the compound (22) having a hydroxyl group at a temperature varying from under cooling temperature conditions to room temperature in an inert solvent in the presence of an acid or a base, the compound (23) can be produced.

[00342] Exemplos do ácido que pode ser usado aqui podem incluir ácido inorgânico tais como, ácido fluorídrico, cloreto de hidrogênio, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e ácido bórico; um ácido orgânico tais como, ácido acético, ácido cítrico, ácido paratolueno sulfônico, e ácido metanossulfônico; e um ácido de Lewis tais como, tetrafluoroborato, cloreto de zinco, cloreto de estanho, cloreto de alumínio, e cloreto de ferro. Entre eles, ácidos sulfônico, particularmente, ácido paratolueno sulfônico é preferível. Quanto à base, qualquer uma das bases acima mencionadas pode ser selecionada adequadamente e usada. Exemplos preferidos das mesmas incluem um alcóxido de metal de álcali como, terc-butóxido de potássio; um hidróxido de metal de álcali tais como, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio; hidreto de metal de álcali tais como, hidreto de sódio e hidreto de potássio; base organometálica representada por dialquilaminolítio tal como, di-isopropilamida de lítio; e base organometálica de bissililamina tal como, bis(trimetilsilil)amida de lítio. Exemplos do solvente a ser usado para a reação incluem um solvente de éter tais como, tetra-hidrofurano e 1,4-dioxano; e um solvente de hidrocarboneto aromático tais como, benzeno e tolueno. Esses solventes podem ser preparados como uma mistura com água. Além disso, o grupo protetor para um grupo amino como exemplificado por P5 não está limitado particularmente se for um grupo geralmente usado para proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos protetores para um grupo amino que é descrito no Método de produção 2. Entretanto, na reação presente, pode haver um caso em que o grupo protetor para um grupo amino como exemplificado por P5 é clivado. Em tal caso, é necessário realizar uma reação com um reagente adequado para proteger um grupo amino visto que pode ser requerido introduzir o grupo protetor novamente.[00342] Examples of the acid that can be used here may include inorganic acid such as hydrofluoric acid, hydrogen chloride, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and boric acid; an organic acid such as acetic acid, citric acid, paratoluene sulfonic acid, and methanesulfonic acid; and a Lewis acid such as tetrafluoroborate, zinc chloride, tin chloride, aluminum chloride, and iron chloride. Among them, sulfonic acids, particularly, paratoluene sulfonic acid is preferable. As for the base, any of the above-mentioned bases can be appropriately selected and used. Preferred examples thereof include an alkali metal alkoxide such as potassium tert-butoxide; an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkali metal hydride such as sodium hydride and potassium hydride; organometallic base represented by dialkylaminolithium such as lithium diisopropylamide; and bissilylamine organometallic base such as lithium bis(trimethylsilyl)amide. Examples of the solvent to be used for the reaction include an ether solvent such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; and an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene. These solvents can be prepared as a mixture with water. Furthermore, the protecting group for an amino group as exemplified by P5 is not particularly limited if it is a group generally used for protecting an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group that are described in Production Method 2. However, in the present reaction, there may be a case in which the protecting group for an amino group as exemplified by P5 is cleaved. In such a case, it is necessary to carry out a reaction with a suitable reagent to protect an amino group as it may be necessary to introduce the protecting group again.

[00343] O composto (24) pode ser produzido removendo-se o grupo protetor P6 do composto (23). Aqui, os exemplos representativos do grupo protetor para um grupo carbóxi como exemplificado por P6 são descritos no Método de produção 2, e aquele adequado pode ser selecionado deles. No composto (23), é desejável que o grupo protetor P5 para um grupo amino e o grupo protetor P6 para um grupo carbóxi sejam os grupos protetores que podem ser removidos por um método diferente ou condições diferentes. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação em que P5 é um grupo 9- fluorenilmetiloxicarbonila e P6 é um grupo benzila. Os grupos protetores podem ser selecionados dependendo, por exemplo, das propriedades de um composnto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a serem protegidos. Para remoção dos grupos protetores, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo protetor.[00343] The compound (24) can be produced by removing the protective group P6 from the compound (23). Here, representative examples of the protecting group for a carboxy group as exemplified by P6 are described in Production Method 2, and the suitable one can be selected from them. In compound (23), it is desirable that the protecting group P5 for an amino group and the protecting group P6 for a carboxy group are the protecting groups that can be removed by a different method or different conditions. For example, a representative example includes a combination in which P5 is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group and P6 is a benzyl group. Protecting groups can be selected depending, for example, on the properties of a compound having an amino group and a carboxy group to be protected. For removal of protecting groups, reagents and conditions are selected depending on the protecting group.

[00344] O composto (26) pode ser produzido derivando-se o ácido carboxílico (24) em éster ativo, anidrido ácido misturado, haleto ácido, ou similares e reagindo-o com o composto (4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo, para produzir o composto (25) seguido por remoção do grupo protetor P5 do composto (25) obtido. Para a reação entre o composto (4), e o ácido carboxílico (24), e a reação para remover o grupo protetor P6, os mesmos reagentes e condições reacionais como aquelas descritas para o Método de produção 2 podem ser usados.[00344] The compound (26) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (24) into active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like and reacting it with the compound (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof , to produce the compound (25) followed by removing the protective group P5 from the compound (25) obtained. For the reaction between the compound (4), and the carboxylic acid (24), and the reaction to remove the P6 protecting group, the same reagents and reaction conditions as those described for Production Method 2 can be used.

[00345] O composto (10b) pode ser produzido reagindo-se o composto (26) com um aminoácido tendo o grupo amino terminal protegido ou o oligopeptídeo (27) tendo o grupo amino protegido para produzir o composto (9b) e removendo o grupo protetor P7 do composto (9b) obtido. O grupo protetor para um grupo amino como representado por P7 não está limitado particularmente se for geralmente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos do mesmo, incluem o grupos protetores para um grupo amino que é descrito no Método de produção 2. Para remover o grupo protetor, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo protetor. Para a reação entre o composto (26), e o composto (27), os reagentes de reação e condições que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser empregados. O composto (10b) produzido pelo método acima mencionado pode ser derivado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrito acima.[00345] The compound (10b) can be produced by reacting the compound (26) with an amino acid having the terminal amino group protected or the oligopeptide (27) having the amino group protected to produce the compound (9b) and removing the group protector P7 of the compound (9b) obtained. The protecting group for an amino group as represented by P7 is not limited particularly if it is generally used for the protection of an amino group. Representative examples thereof include the protecting groups for an amino group which is described in Production Method 2. To remove the protecting group, reagents and conditions are selected depending on the protecting group. For the reaction between the compound (26), and the compound (27), the reaction reagents and conditions that are generally used for peptide synthesis can be employed. The compound (10b) produced by the above-mentioned method can be derivatized into the compound (1) of the present invention according to the method described above.

[00346] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção, quando é deixado no ar ou recristalizado, por exemplo, para purificação, pode absorver a umidade para ter água de absorção ou se transformar em um hidrato, e um tal composto e um sal contendo água são da mesma forma incluídos na presente invenção.[00346] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention, when it is left in air or recrystallized, for example, for purification, can absorb moisture to have absorption water or transform into a hydrate, and such a compound and a water-containing salt are likewise included in the present invention.

[00347] Um composto rotulado com vários isótopos radioativos ou não radioativos é da mesma forma incluído na presente invenção. Um ou mais átomos que constituem o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode conter um isótopo atômico em relação não natural. Exemplos do isótopo atômico incluem deutério (2H), trício (3H), iodo-125 (125I), e carbono-14 (14C). Além disso, o composto da presente invenção pode ser radioativo-rotulado com um isótopo radioativo tal como trício (3H), iodo-125 (125I), carbono-14 (14C), cobre- 64 (64Cu), zircônio-89 (89Zr), iodo-124 (124I), flúor-18 (18F), índio-111 (111I), carbono-11 (11C) e iodo-131 (131I). O composto rotulado com um isótopo radioativo é útil como um agente terapêutico ou profilático, um reagente para pesquisa tal como um reagente de ensaio e um agente para diagnóstico tal como um agente de imageamento diagnóstico in vivo. Sem estar relacionado à radioatividade, qualquer tipo de variante de isótopo do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção está dentro do escopo da presente invenção.[00347] A compound labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes is likewise included in the present invention. One or more atoms constituting the antibody-drug conjugate of the present invention may contain an atomic isotope in an unnatural relationship. Examples of the atomic isotope include deuterium (2H), tritium (3H), iodine-125 (125I), and carbon-14 (14C). Furthermore, the compound of the present invention may be radioactive-labeled with a radioactive isotope such as tritium (3H), iodine-125 (125I), carbon-14 (14C), copper-64 (64Cu), zirconium-89 (89Zr ), iodine-124 (124I), fluorine-18 (18F), indium-111 (111I), carbon-11 (11C) and iodine-131 (131I). The compound labeled with a radioactive isotope is useful as a therapeutic or prophylactic agent, a research reagent such as an assay reagent, and a diagnostic agent such as an in vivo diagnostic imaging agent. Without being related to radioactivity, any type of isotope variant of the antibody-drug conjugate of the present invention is within the scope of the present invention.

Drugs

[00348] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção exibe uma atividade citotóxica contra as células cancerosas, e desse modo, pode ser usado como um fármaco, particularmente como um agente terapêutico e/ou agente profilático para o câncer.[00348] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention exhibits cytotoxic activity against cancer cells, and therefore, can be used as a drug, particularly as a therapeutic agent and/or prophylactic agent for cancer.

[00349] Isto é, o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção pode ser seletivamente usado como um fármaco para quimioterapia, que é um método principal para tratar o câncer e como resultado, pode retardar o desenvolvimento de células cancerosas, inibir o crescimento do mesmo, e também matar as células cancerosas. Isto pode permitir os pacientes com câncer ficarem livres de sintomas causados pelo câncer ou obter melhoria em QOL de pacientes com câncer e atingir um efeito terapêutico sustentando-se as vidas dos pacientes com câncer. Mesmo que o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção não realize a morte das células cancerosas, ele pode obter QOL mais alto de pacientes com câncer enquanto obtendo sua sobrevivência a longo prazo, inibindo-se ou controlando-se o crescimento das células cancerosas.[00349] That is, the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be selectively used as a drug for chemotherapy, which is a main method for treating cancer, and as a result, it can delay the development of cancer cells, inhibit its growth, and also kill cancer cells. This may enable cancer patients to be free from symptoms caused by cancer or achieve improvement in QOL of cancer patients and achieve a therapeutic effect by sustaining the lives of cancer patients. Even though the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention does not kill cancer cells, it can obtain higher QOL of cancer patients while achieving their long-term survival by inhibiting or controlling the growth of cancer cells. cancer cells.

[00350] Em tal terapia de fármaco, pode ser usado como um fármaco sozinho bem como um fármaco em combinação com uma terapia adicional em terapia adjuvante e pode ser combinado com operação cirúrgica, radioterapia, terapia hormonal, ou similares. Além disso, pode da mesma forma ser usado como um fármaco para terapia de fármaco em terapia neoadjuvante.[00350] In such drug therapy, it can be used as a drug alone as well as a drug in combination with an additional therapy in adjuvant therapy and can be combined with surgical operation, radiotherapy, hormonal therapy, or the like. Furthermore, it can also be used as a drug for drug therapy in neoadjuvant therapy.

[00351] Além do uso terapêutico como descrito acima, um efeito de suprimir o crescimento de células cancerosas metastáticas mínimas e também matá-las ligando-se a estas células cancerosas pode da mesma forma ser esperado em virtude da propriedade de ligação do anticorpo ao antígeno. Particularmente, quando a expressão de TROP2 é confirmada para células cancerosas primárias, a inibição da metástase de câncer ou um efeito profilático pode ser esperado administrando-se o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção. Por exemplo, um efeito de inibir e matar as células cancerosas em um fluido corporal no curso da metástase ou um efeito de, por exemplo, inibir e matar as células cancerosas mínimas imediatamente após a implantação em qualquer tecido pode ser esperado. Além disso, a inibição da metástase de câncer ou um efeito profilático pode ser esperado, particularmente, após a remoção cirúrgica do câncer. Adequadamente, um efeito de inibição da metástase do câncer pode ser esperado.[00351] In addition to the therapeutic use as described above, an effect of suppressing the growth of minimal metastatic cancer cells and also killing them by binding to these cancer cells can likewise be expected by virtue of the binding property of the antibody to the antigen . Particularly, when TROP2 expression is confirmed for primary cancer cells, inhibition of cancer metastasis or a prophylactic effect can be expected by administering the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention. For example, an effect of inhibiting and killing cancer cells in a body fluid in the course of metastasis or an effect of, for example, inhibiting and killing minimal cancer cells immediately after implantation in any tissue can be expected. Furthermore, inhibition of cancer metastasis or a prophylactic effect can be expected, particularly after surgical removal of cancer. Suitably, a cancer metastasis inhibition effect can be expected.

[00352] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção pode ser esperado para mostrar um efeito terapêutico por administração como terapia sistêmica para pacientes, e adicionalmente, por administração local aos tecidos cancerosos.[00352] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be expected to show a therapeutic effect upon administration as systemic therapy to patients, and additionally, upon local administration to cancerous tissues.

[00353] Exemplos do tipo de câncer ao qual o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção é aplicado incluem câncer de pulmão, câncer de rim, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer gástrico, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, ou câncer esofágico, porém, não estão limitados a eles contanto que seja uma célula cancerosa expressando, em uma célula cancerosa como um objeto de tratamento, uma proteína que o anticorpo dentro do conjugado de anticorpo-fármaco pode reconhecer.[00353] Examples of the type of cancer to which the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention is applied include lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, cancer pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, head and neck cancer, or esophageal cancer, however, are not limited to them as long as it is a cancer cell expressing, in a cell cancer as an object of treatment, a protein that the antibody within the antibody-drug conjugate can recognize.

[00354] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção pode ser administrado preferivelmente a um mamífero, porém, é administrado mais preferivelmente a um humano.[00354] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can preferably be administered to a mammal, however, it is more preferably administered to a human.

[00355] Substâncias usadas em uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção podem ser selecionadas adequadamente e aplicadas de aditivos de formulação ou similares que são geralmente usados na técnica, devido à dosagem ou concentração de administração.[00355] Substances used in a pharmaceutical composition containing the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be appropriately selected and applied from formulation additives or the like that are generally used in the art, due to the dosage or concentration of administration.

[00356] O conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica contendo pelo menos um ingrediente farmaceuticamente adequado. Por exemplo, a composição farmacêutica acima tipicamente contém, pelo menos um veículo farmacêutico (por exemplo, líquido esterilizado). Aqui, o líquido inclui, por exemplo, água e óleo (óleo de petróleo e óleo de origem animal, de origem de planta, ou de origem sintética). O óleo pode ser, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, ou óleo de gergelim. Água é um veículo mais típico quando a composição farmacêutica acima é intravenosamente administrada. Solução salina, uma solução de dextrose aquosa, e uma solução de glicerol aquosa podem da mesma forma ser usadas como um veículo líquido, em particular, para uma solução de injeção. Um veículo farmacêutico adequado é conhecido na técnica. Se desejado, a composição acima pode da mesma forma conter uma quantidade de traço de agente hidratante, agente emulsificante, ou um agente de proteção de pH. Exemplos de veículo farmacêutico adequado são descritos em "Remington’s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. As formulações correspondem a um modo de administração.[00356] The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically suitable ingredient. For example, the above pharmaceutical composition typically contains at least one pharmaceutical carrier (e.g., sterile liquid). Here, the liquid includes, for example, water and oil (petroleum oil and oil of animal origin, of plant origin, or of synthetic origin). The oil may be, for example, peanut oil, soybean oil, mineral oil, or sesame oil. Water is a more typical vehicle when the above pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solution, an aqueous dextrose solution, and an aqueous glycerol solution can likewise be used as a liquid carrier, in particular, for an injection solution. A suitable pharmaceutical carrier is known in the art. If desired, the above composition may also contain a trace amount of moisturizing agent, emulsifying agent, or a pH protecting agent. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. The formulations correspond to a mode of administration.

[00357] Vários sistemas de liberação são conhecidos e eles podem ser usados para administrar o conjugado de anticorpo-fármaco anti- TROP2 da presente invenção. Exemplos da rotina de administração incluem rotinas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, e subcutânea, mas não limitados a estas. A administração pode ser feita por injeção ou injeção de bolo, por exemplo. De acordo com uma modalidade preferida específica, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada por injeção. A administração parenteral é uma rotina de administração preferida.[00357] Various delivery systems are known and they can be used to administer the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention. Examples of the administration routine include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous routines. Administration can be done by injection or bolus injection, for example. According to a specific preferred embodiment, administration of the antibody-drug conjugate is carried out by injection. Parenteral administration is a preferred administration routine.

[00358] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita, como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a humano, de acordo com os procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em uma solução de tampão aquosa estéril e isotônica. Se necessário, a fármaco pode conter agente de solubilização e anestésicos locais para aliviar a dor no sítio de injeção (por exemplo, lignocaína). Geralmente, o ingrediente acima é fornecido individualmente como qualquer um dentre pó liofilizado ou um concentrado anidroso contido em um recipiente que é obtido selando-se em uma ampola ou um sachê tendo uma quantidade do agente ativo ou como uma mistura em uma forma de dosagem unitária. Quando o fármaco estiver na forma de administração por injeção, ele pode ser administrado de um frasco de injeção contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Quando o fármaco é administrado por injeção, uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção pode ser fornecida tal que os ingredientes acima mencionados são misturados entre si antes da administração.[00358] According to a representative embodiment, the pharmaceutical composition is prescribed, as a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration to humans, in accordance with conventional procedures. The composition for intravenous administration is typically a solution in a sterile, isotonic aqueous buffer solution. If necessary, the drug may contain solubilizing agent and local anesthetics to relieve pain at the injection site (e.g. lignocaine). Generally, the above ingredient is supplied individually as any one of a lyophilized powder or an anhydrous concentrate contained in a container that is obtained by sealing in an ampoule or a sachet having a quantity of the active agent or as a mixture in a unit dosage form. . When the drug is in injection form, it can be administered from an injection vial containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the drug is administered by injection, an ampoule of sterile water or saline solution for injection may be provided such that the above-mentioned ingredients are mixed together before administration.

[00359] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica contendo apenas o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 da aplicação presente ou uma composição farmacêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 e pelo menos um agente de tratamento de câncer diferente do conjugado. O conjugado de anticorpo-fármaco anti- TROP2 da presente invenção pode ser administrado com outro agente de tratamento de câncer. O efeito anticâncer pode ser adequadamente aumentado. Outro agente anticâncer usado para tal propósito pode ser administrado a um indivíduo simultaneamente com, separadamente de, ou subsequentemente ao conjugado de anticorpo-fármaco, e pode ser administrado enquanto variando o intervalo de administração para cada. Exemplos do agente de tratamento de câncer incluem abraxano, paclitaxel, cisplatina, gencitabina, irinotecana (CPT-11), paclitaxel, pemetrexede, sorafenibe, vinorelbina, drogas descritas na Publicação International No. WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorrelina, gosserrelina, ou similares), fosfato de estramustina, antagonista de estrogênio (tamoxifeno, raloxifeno, ou similares), e um inibidor de aromatase (anastrozol, letrozol, exemestano, ou similares), mas não estão limitados contanto que sejam um fármaco tendo uma atividade antitumor.[00359] The pharmaceutical composition of the present invention can be a pharmaceutical composition containing only the anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present application or a pharmaceutical composition containing the anti-TROP2 antibody-drug conjugate and at least one anti-TROP2 antibody-drug conjugate. cancer other than the conjugate. The anti-TROP2 antibody-drug conjugate of the present invention can be administered with another cancer treatment agent. The anticancer effect can be appropriately enhanced. Another anticancer agent used for such a purpose can be administered to an individual simultaneously with, separately from, or subsequently to the antibody-drug conjugate, and can be administered while varying the administration interval for each. Examples of the cancer treatment agent include abraxan, paclitaxel, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinorelbine, drugs described in International Publication No. WO 2003/038043, LH-RH analogs (leuprorelin , goserelin, or similar), estramustine phosphate, estrogen antagonist (tamoxifen, raloxifene, or similar), and an aromatase inhibitor (anastrozole, letrozole, exemestane, or similar), but are not limited as long as they are a drug having a antitumor activity.

[00360] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma formulação de liofilização ou uma formulação líquida como uma formulação tendo composição desejada e pureza requerida. Quando formulada como uma formulação de liofilização, pode ser uma formulação contendo aditivos de formulação adequados que são usados na técnica. Da mesma forma para uma formulação líquida, pode ser formulada como uma formulação líquida contendo vários aditivos de formulação que são usados na técnica.[00360] The pharmaceutical composition can be formulated in a freeze-drying formulation or a liquid formulation as a formulation having desired composition and required purity. When formulated as a freeze-drying formulation, it may be a formulation containing suitable formulation additives that are used in the art. Likewise for a liquid formulation, it may be formulated as a liquid formulation containing various formulation additives that are used in the art.

[00361] Composição e concentração da composição farmacêutica podem variar dependendo do método de administração. Entretanto, o conjugado de anticorpo-fármaco anti-TROP2 contido na composição farmacêutica da presente invenção pode exibir o efeito farmacêutico até mesmo em uma dosagem pequena quando o conjugado de anticorpo-fármaco tem afinidade superior por um antígeno, isto é, afinidade superior (= valor de Kd inferior) em termos da constante dissociação (isto é, valor de Kd) para o antígeno. Desse modo, para determinar a dosagem do conjugado de anticorpo-fármaco, a dosagem pode ser determinada devido a uma situação relativa à afinidade entre o conjugado de anticorpo-fármaco e antígeno. Quando o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é administrado a um humano, por exemplo, cerca de 0,001 a 100 mg/kg podem ser administrados uma vez ou administrados várias vezes com um intervalo de uma vez durante 1 a 180 dias.[00361] Composition and concentration of the pharmaceutical composition may vary depending on the method of administration. However, the anti-TROP2 antibody-drug conjugate contained in the pharmaceutical composition of the present invention can exhibit the pharmaceutical effect even at a small dosage when the antibody-drug conjugate has higher affinity for an antigen, that is, higher affinity (= lower Kd value) in terms of the dissociation constant (i.e., Kd value) for the antigen. Thus, to determine the dosage of the antibody-drug conjugate, the dosage can be determined due to a situation regarding the affinity between the antibody-drug conjugate and antigen. When the antibody-drug conjugate of the present invention is administered to a human, for example, about 0.001 to 100 mg/kg may be administered once or administered multiple times at an interval of once for 1 to 180 days.

Examples

[00362] A presente invenção é especificamente descrita em vista dos exemplos mostrados abaixo. Porém, a presente invenção não está limitada a eles. Além disso, é de modo algum interpretada de uma forma limitada. Além disso, a menos que especificamente descrito de outro modo, os reagente, solvente e material de partida descritos na especificação podem ser obtidos facilmente de um fornecedor comercial.[00362] The present invention is specifically described in view of the examples shown below. However, the present invention is not limited to them. Furthermore, it is by no means interpreted in a limited way. Furthermore, unless specifically described otherwise, the reagent, solvent and starting material described in the specification can be readily obtained from a commercial supplier.

Example 1: Mouse immunization and obtaining a hybridoma Preparation of the cell to be used in mouse immunization

[00363] 5 x 106 células NCI-H322 (linhagem celular de câncer de pulmão de célula não pequena humana, ATCC CRL-5806; ATCC: American Type Culture Collection) foram cultivadas em um meio de RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) (10 ml) durante 5 dias, em seguida recuperadas, lavadas com PBS (solução salina tamponada por fosfato) duas vezes, e ressuspensas em PBS (500 μl). Imunização de camundongo[00363] 5 x 106 NCI-H322 cells (human non-small cell lung cancer cell line, ATCC CRL-5806; ATCC: American Type Culture Collection) were cultured in RPMI-1640 medium (Roswell Park Memorial Institute- 1640) (10 ml) for 5 days, then recovered, washed with PBS (phosphate buffered saline) twice, and resuspended in PBS (500 μl). Mouse immunization

[00364] Para a primeira imunização, cada camundongo BALB/c (6 semanas de idade) foi intraperitonealmente imunizado com células NCI-H322 (1 x 107 células). Durante as segunda a quinta imunizações, o camundongo foi intraperitonealmente imunizado com 1 x 106 células NCI-H322 em intervalos de 1 semana. Para a sexta (final) imunização, o camundongo foi imunizado pela veia da cauda e intraperitonealmente com as células NCI-H322 em 1 x 106 células/200 μl de PBS para cada rotina. As células de baço foram cortadas 3 dias depois da imunização final.[00364] For the first immunization, each BALB/c mouse (6 weeks old) was intraperitoneally immunized with NCI-H322 cells (1 x 107 cells). During the second to fifth immunizations, the mouse was intraperitoneally immunized with 1 x 106 NCI-H322 cells at 1-week intervals. For the sixth (final) immunization, the mouse was immunized via the tail vein and intraperitoneally with NCI-H322 cells at 1 x 106 cells/200 μl of PBS for each routine. Spleen cells were cut 3 days after the final immunization.

Immunized mouse spleen cell preparation

[00365] O baço do camundongo imunizado foi cortado, em seguida moído e suspenso em um meio de FBS a 10% (soro bovino fetal) (+) RPMI 1640. A suspensão celular foi passada através de um coador de célula (100 μm, BD Falcon) e em seguida centrifugado a 1500 rpm em temperatura ambiente durante 5 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Uma solução de Tris-NH4Cl (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,83% de NH4Cl; 10 mL) foi adicionada ao resíduo, seguido por tratamento em temperatura ambiente durante 5 minutos. Um meio de FBS (+) RPMI 1640 (10 ml) foi adicionado à suspensão celular, e a mistura foi passada através de um coador de célula e em seguida centrifugado a 1500 rpm em temperatura ambiente durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado, e as células de baço foram ressuspensas em um meio de FBS (-) RPMI 1640 (10 ml).[00365] The spleen of the immunized mouse was cut, then ground and suspended in a medium of 10% FBS (fetal bovine serum) (+) RPMI 1640. The cell suspension was passed through a cell strainer (100 μm, BD Falcon) and then centrifuged at 1500 rpm at room temperature for 5 minutes, and the supernatant was discarded. A Tris-NH4Cl solution (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.83% NH4Cl; 10 mL) was added to the residue, followed by treatment at room temperature for 5 minutes. FBS (+) RPMI 1640 medium (10 ml) was added to the cell suspension, and the mixture was passed through a cell strainer and then centrifuged at 1500 rpm at room temperature for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the spleen cells were resuspended in FBS (-) RPMI 1640 medium (10 ml).

Myeloma cell preparation

[00366] Células P3U1 (linhagem celular de mieloma de camundongo) foram recuperadas e centrifugadas a 1500 rpm em temperatura ambiente durante 5 minutos. Uma solução de EDTA (0,02%) (10 ml) foi adicionada às células P3U1, seguido por tratamento a 37°C durante 5 minutos. A suspensão de célula P3U1 foi centrifugada a 1500 rpm em temperatura ambiente durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e ressuspenso em um meio de FBS (-) RPMI 1640 (10 ml).[00366] P3U1 cells (mouse myeloma cell line) were recovered and centrifuged at 1500 rpm at room temperature for 5 minutes. An EDTA (0.02%) solution (10 ml) was added to P3U1 cells, followed by treatment at 37°C for 5 minutes. The P3U1 cell suspension was centrifuged at 1500 rpm at room temperature for 5 minutes. The supernatant was discarded and resuspended in FBS (-) RPMI 1640 medium (10 ml).

cell fusion

[00367] As células de baço e as células de mieloma foram misturadas em uma relação de 5:1 e centrifugadas (1200 rpm, 5 minutos). As células obtidas na fração precipitada foram bem soltas, e polietileno glicol-4000 (PEG-4000; 1 mL) foi em seguida gradualmente adicionado a isto durante cerca de 1 minuto com agitação. Em seguida, um meio de RPMI (1 mL) foi adicionado ao fluido contendo a célula várias vezes com intervalo de 1 minuto, e um meio de RPMI foi em seguida adicionado a isto para ajustar a quantidade total em 50 mL. A suspensão celular foi centrifugada (900 rpm, 5 minutos), e as células obtidas na fração precipitada foram ligeiramente soltas, e em seguida suavemente suspensas em um meio de HAT (meio de PRMI1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% e HAT Media Supplement; 100 mL). A suspensão foi dispensada em 200 μL/cavidade a uma placa de 96 cavidades para cultura e cultivada até 50% de confluência em uma incubadora de CO2 a 5% de 37°C.[00367] Spleen cells and myeloma cells were mixed in a 5:1 ratio and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes). The cells obtained in the precipitated fraction were well loosened, and polyethylene glycol-4000 (PEG-4000; 1 mL) was then gradually added thereto for about 1 minute with stirring. Then, RPMI medium (1 mL) was added to the cell-containing fluid several times at 1 minute intervals, and RPMI medium was then added to this to adjust the total amount to 50 mL. The cell suspension was centrifuged (900 rpm, 5 minutes), and the cells obtained in the precipitated fraction were slightly loosened, and then gently suspended in a HAT medium (PRMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and HAT Media Supplement ; 100ml). The suspension was dispensed at 200 μL/well to a 96-well culture plate and grown to 50% confluency in a 37°C 5% CO2 incubator.

Hybridoma evaluation using FZ33 variant adenovirus

[00368] As células NCI-H322 foram semeadas a 5 x 103 células/cavidade a uma placa de 96 cavidades e cultivadas a 37°C durante 48 horas. As células foram lavadas com 150 μl/cavidade de PBS duas vezes, e cada sobrenadante de cultura de hibridoma (50 μl) foi adicionado a cada cavidade e reagido a 4°C durante 1 hora. As células foram lavadas com 150 μl/cavidade de PBS duas vezes. Um adenovírus Ax3CAZ3-FZ33 (adenovírus de expressão de β- galactosidase modificado com fibra de Z33 para ligar-se a um anticorpo (veja a Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2012/0237518)) foi diluído com um meio de RPMI1640 (-) a uma concentração de 3 x 106 vp/100 μl (1 x 103 vp/célula), e esta solução diluída foi adicionada a isto a 100 μl/cavidade. Depois da reação a 4°C durante 1 hora, as células foram lavadas com 150 μl/cavidade de PBS duas vezes. Um meio de FBS (+) RPMI1640 foi adicionado a isto a 100 μl/cavidade, e as células foram cultivadas a 37°C durante 24 horas. As células NCI-H322 tratadas com ensaio de gene repórter de β-Gal usando Galacto-Light Plus Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems, Inc.) foram lavadas com 200 μl/cavidade de PBS. Solução de lise foi adicionada a isto a 50 μl/cavidade, e a mistura foi deixada em temperatura ambiente durante 10 minutos. Esta célula lisada (10 μL) foi diluída 100 vezes com Galacton-Plus Galacto Reaction Buffer Diluent, em seguida adicionado a uma placa de 96 cavidades White microwell SH 96 (Nunc/Thermo Fisher Scientific, Inc.), e reagida em temperatura ambiente durante 1 hora. Accelerator II foi adicionado a isto a 150 μl/cavidade. A quimioluminescência foi medida durante 5 segundos usando um contador de múltiplos rótulos Wallac 1420 ARVOsx (PerkinElmer, Inc.), e a dose infecciosa do vírus nas células NCI-H322 foi indicada com o valor médio por segundo como RLU (quantidade de luminescência). Na avaliação do grupo hibridoma desse modo executada, um clone cujo valor de medida (RLU) foi 5000 RLU ou mais alto foi selecionado do grupo inteiro (mínimo: 1383 RLU, médio: 10914 RLU, máximo: 78746 RLU). Primeiro, como avaliação primária, 81 cavidades positivas foram selecionados a partir de 960 cavidades de hibridoma obtidas por uma fusão celular. Como avaliação de validação, o ensaio também foi conduzido em duplicata pelo mesmo método como na avaliação primária. Quando uma cavidade que exibiu um valor de medida de 5000 RLU ou mais alto em ambos os testes foi considerada como positiva, 52 cavidades positivas foram selecionadas a partir das 81 cavidades obtidas na avaliação primária. Os clones selecionados foram subclonados 2 a 4 vezes para estabelecer 44 linhagens celulares de hibridoma monoclonais.[00368] NCI-H322 cells were seeded at 5 x 103 cells/well in a 96-well plate and cultured at 37°C for 48 hours. Cells were washed with 150 μl/well of PBS twice, and each hybridoma culture supernatant (50 μl) was added to each well and reacted at 4°C for 1 hour. Cells were washed with 150 μl/well of PBS twice. An adenovirus Ax3CAZ3-FZ33 (β-galactosidase-expressing adenovirus modified with Z33 fiber to bind an antibody (see U.S. Patent Application Publication No. 2012/0237518)) was diluted with RPMI1640 medium (- ) at a concentration of 3 x 10 vp/100 μl (1 x 10 vp/cell), and this diluted solution was added thereto at 100 μl/well. After the reaction at 4°C for 1 hour, cells were washed with 150 μl/well of PBS twice. An FBS (+) RPMI1640 medium was added to this at 100 μl/well, and the cells were cultured at 37°C for 24 hours. NCI-H322 cells treated with β-Gal reporter gene assay using Galacto-Light Plus Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems, Inc.) were washed with 200 μl/well of PBS. Lysis solution was added to this at 50 μl/well, and the mixture was left at room temperature for 10 minutes. This cell lysate (10 μL) was diluted 100-fold with Galacton-Plus Galacto Reaction Buffer Diluent, then added to a White microwell SH 96 96-well plate (Nunc/Thermo Fisher Scientific, Inc.), and reacted at room temperature for 1 hour. Accelerator II was added to this at 150 μl/well. Chemiluminescence was measured for 5 seconds using a Wallac 1420 ARVOsx multilabel counter (PerkinElmer, Inc.), and the infectious dose of virus in NCI-H322 cells was indicated with the average value per second as RLU (luminescence amount). In the hybridoma group evaluation performed in this way, a clone whose measurement value (RLU) was 5000 RLU or higher was selected from the entire group (minimum: 1383 RLU, average: 10914 RLU, maximum: 78746 RLU). First, as a primary assessment, 81 positive wells were selected from 960 hybridoma wells obtained by cell fusion. As a validation assessment, the assay was also conducted in duplicate using the same method as in the primary assessment. When a cavity that exhibited a measurement value of 5000 RLU or higher in both tests was considered positive, 52 positive cavities were selected from the 81 cavities obtained in the primary evaluation. The selected clones were subcloned 2 to 4 times to establish 44 monoclonal hybridoma cell lines.

Example 2: Purification of hybridoma antibody

[00369] Pristano (2, 6, 10, 14-tetrametilpentadecano; 0,5 ml) foi intraperitonealmente administrado com antecedência a cada camundongo com 8 a 10 semana de idade ou camundongo nu, que em seguida foi elevado para 2 semanas. Cada hibridoma de produção de anticorpo monoclonal obtido no Exemplo 1 foi intraperitonealmente injetado ao camundongo. Depois de 10 a 21 dias, o hibridoma foi permitido causar canceração ascítica, e o ascite foi em seguida coletado. O ascite obtido foi centrifugado para remover matéria sólida. Em seguida, anticorpos foram purificados salinizando-se com 40 a 50% de sulfato de amônio, um método de precipitação de ácido caprílico, uma coluna DEAE-Sepharose e uma coluna de proteína G e frações de IgG ou IgM foram coletadas e usadas como anticorpos monoclonais purificados.[00369] Pristano (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane; 0.5 ml) was administered intraperitoneally in advance to each 8 to 10 week old mouse or nude mouse, which was then raised to 2 weeks. Each monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in Example 1 was intraperitoneally injected into the mouse. After 10 to 21 days, the hybridoma was allowed to cause ascites cancer, and the ascites was then collected. The ascites obtained was centrifuged to remove solid matter. Then, antibodies were purified by salting with 40 to 50% ammonium sulfate, a caprylic acid precipitation method, a DEAE-Sepharose column and a protein G column, and IgG or IgM fractions were collected and used as antibodies. purified monoclonals.

Example 3: Identification of antigen to which the antibody produced by hybridoma binds

[00370] Um antígeno foi identificado por TINA1, um anticorpo produzido pelo hibridoma preparado no Exemplo 2.[00370] An antigen was identified by TINA1, an antibody produced by the hybridoma prepared in Example 2.

3-1) Immunoprecipitation of biotin-labeled cell surface protein using TINA1 antibody

[00371] 5 x 106 células NCI-H322 foram recuperadas e lavadas com PBS três vezes. EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Inc.) foi suspensa em PBS a uma concentração de 0,1 mg/ml. As células NCI-H322 foram giradas em temperatura ambiente durante 30 minutos em solução de biotina/PBS, em seguida lavada com solução de glicina/PBS a 100 mM (25 ml) duas vezes, e em seguida lavada com PBS (25 ml) três vezes. As células desse modo lavadas foram ressuspensas em um tampão de lise (NaCl a 150 mM, Tris-HCl a 50 mM pH 7.6, 1% de NP-40 + inibidor de Protease, 1 comprimido/50 ml de EDTA Completo livre (Hoffmann-La Roche Ltd.); 2 ml) e tratadas a 4°C durante 30 minutos. Tampão de proteína G Sepharose/lise (suspensão a 50%; 30 μl) obtido substituindo-se um tampão de Proteína G Sepharose (Proteína G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Japan Corporation)) com um tampão de lise foi adicionado ao lisado celular, e a mistura foi girada a 4°C durante 1 hora, e em seguida centrifugada a 4°C durante 5 minutos para recuperar um sobrenadante. O anticorpo TINA1 (3 μg) foi adicionado ao sobrenadante, e a mistura foi girada a 4°C durante 1 hora. Em seguida, tampão de Proteína G Sepharose/lise (suspensão a 50%; 60 μl) foi adicionado a isto, e a mistura foi girada a 4°C durante 2 horas. Proteína G Sepharose foi lavada com um tampão de lise (1 ml) seis vezes, e em seguida ressuspensa em tampão de amostra de 1 x SDS/tampão 5% de 2-Me (2-mercaptoetanol) (Tris-HCl a 62,5 mM (pH 6.8 a 25°C), 2% (w/v) de SDS, 10% de glicerol e 0,01% (w/v) de fenol vermelho). A suspensão foi tratada a 100°C durante 5 minutos, e a solução foi em seguida recuperada e usada como uma amostra para SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida).[00371] 5 x 106 NCI-H322 cells were recovered and washed with PBS three times. EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Inc.) was suspended in PBS at a concentration of 0.1 mg/ml. NCI-H322 cells were spun at room temperature for 30 minutes in biotin/PBS solution, then washed with 100 mM glycine/PBS solution (25 ml) twice, and then washed with PBS (25 ml) three times. times. The cells thus washed were resuspended in a lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40 + Protease inhibitor, 1 tablet/50 ml Complete EDTA free (Hoffmann- La Roche Ltd.); 2 ml) and treated at 4°C for 30 minutes. Protein G Sepharose/lysis buffer (50% suspension; 30 μl) obtained by replacing a Protein G Sepharose buffer (Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Japan Corporation)) with a lysis buffer was added to the cell lysate , and the mixture was rotated at 4°C for 1 hour, and then centrifuged at 4°C for 5 minutes to recover a supernatant. TINA1 antibody (3 μg) was added to the supernatant, and the mixture was rotated at 4°C for 1 hour. Then, Protein G Sepharose/lysis buffer (50% suspension; 60 μl) was added to this, and the mixture was rotated at 4°C for 2 hours. Protein G Sepharose was washed with lysis buffer (1 ml) six times, and then resuspended in 1x SDS sample buffer/5% 2-Me (2-mercaptoethanol) buffer (Tris-HCl at 62.5 mM (pH 6.8 at 25°C), 2% (w/v) SDS, 10% glycerol and 0.01% (w/v) phenol red). The suspension was treated at 100°C for 5 minutes, and the solution was then recovered and used as a sample for SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis).

3-2) SDS-PAGE and West Staining

[00372] A amostra de SDS-PAGE preparada em 3-1) foi submetida à eletroforese a 20 mA usando Read Gels J 5-20% (Bio-Rad Laboratories, Inc.), e em seguida manchada a 0,1 mA/cm2 do gel para a membrana. A membrana foi lavada com PBS-T (PBS (-)-0,05% de Tween 20) durante 5 minutos, e em seguida bloqueada durante 1 hora. A membrana foi lavada com PBS-T durante 5 minutos três vezes, e em seguida reagida com conjugado de Estreptavidina-peroxidase de rábano-picante (Amersham Biosciences Corp.; diluído 2000 vezes com PBS-T para uso) durante 1 hora. A membrana foi lavada com PBS-T durante 10 minutos quatro vezes, e uma faixa alvo foi em seguida detectada usando reagentes de detecção de manchamento do Oeste de ECL (Amersham Biosciences Corp.) e Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences Corp.). As células NCI-H322 rotuladas por biotina pelos procedimentos do Exemplo 3-1) foram submetidas à imunoprecipitação com um anticorpo de KCI7A3, cujo antígeno já foi constatado ser TROP2 por espectrometria de massa, ou o anticorpo TINA1, e os produtos imunoprecipitados obtidos foram analisados por SDS-PAGE e manchamento do Oeste na presença ou ausência de DTT. Em qualquer caso de uso do anticorpo de KCI7A3 ou anticorpo TINA1, uma faixa foi detectada em um peso molecular de 46 kDa na ausência de DTT, e uma faixa foi detectada em um peso molecular de 37 kDa nas amostras suplementadas com DTT.[00372] The SDS-PAGE sample prepared in 3-1) was electrophoresed at 20 mA using Read Gels J 5-20% (Bio-Rad Laboratories, Inc.), and then stained at 0.1 mA/ cm2 of the gel to the membrane. The membrane was washed with PBS-T (PBS (-)-0.05% Tween 20) for 5 minutes, and then blocked for 1 hour. The membrane was washed with PBS-T for 5 minutes three times, and then reacted with Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (Amersham Biosciences Corp.; diluted 2000 times with PBS-T for use) for 1 hour. The membrane was washed with PBS-T for 10 minutes four times, and a target band was then detected using ECL West Blot detection reagents (Amersham Biosciences Corp.) and Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences Corp.). NCI-H322 cells labeled by biotin by the procedures of Example 3-1) were subjected to immunoprecipitation with an antibody to KCI7A3, whose antigen was already found to be TROP2 by mass spectrometry, or the antibody TINA1, and the immunoprecipitated products obtained were analyzed by SDS-PAGE and Western staining in the presence or absence of DTT. In any case of using the KCI7A3 antibody or TINA1 antibody, a band was detected at a molecular weight of 46 kDa in the absence of DTT, and a band was detected at a molecular weight of 37 kDa in the DTT-supplemented samples.

3-3) FACS analysis

[00373] Porque o antígeno do anticorpo TINA1 foi predito ser TROP2 a partir do padrão de faixa, a análise de superexpressão por transferência de gene de cDNA foi conduzida sem espectrometria de massa. Como resultado de análise por FACS, o anticorpo TINA1 exibiu uma forte resposta positiva em células CHOK1 que expressam TROP2 humano, indicando o antígeno do anticorpo TINA1 é TROP2. Análise por FACS similar foi conduzida usando uma linhagem celular de câncer de pulmão PC14, uma linhagem celular de câncer de pulmão NCI-H322, uma linhagem celular de câncer de pulmão NCI-H2122, uma linhagem celular de câncer de pulmão LCAM1, uma linhagem celular de câncer de pulmão LC2/ad, uma linhagem celular de câncer pancreático MIAPaCa2, uma linhagem celular de câncer pancreático PK-1, uma linhagem celular de câncer prostático PC3, uma linhagem celular de câncer colorretal HCT116, uma linhagem celular de melanoma A375, uma linhagem celular de câncer ovariano SKOV3, uma linhagem celular de tumor hematopoético RPMI8226, uma linhagem celular de tumor hematopoético K562, PBMC (células mononucleares de sangue periférico humano) e plaqueta humana. Todas as linhagens celulares de câncer de pulmão examinadas foram TROP2-positivas, e PC3, PK1 e SKOV3 foram positivas como a linhagens celulares com exceção daquelas de câncer de pulmão. Por outro lado, todas as células de sangue normais foram negativas.[00373] Because the TINA1 antibody antigen was predicted to be TROP2 from the stripe pattern, cDNA gene transfer overexpression analysis was conducted without mass spectrometry. As a result of FACS analysis, the TINA1 antibody exhibited a strong positive response in CHOK1 cells expressing human TROP2, indicating the antigen of the TINA1 antibody is TROP2. Similar FACS analysis was conducted using a PC14 lung cancer cell line, an NCI-H322 lung cancer cell line, an NCI-H2122 lung cancer cell line, an LCAM1 lung cancer cell line, a LC2/ad lung cancer cell line, a MIAPaCa2 pancreatic cancer cell line, a PK-1 pancreatic cancer cell line, a PC3 prostate cancer cell line, an HCT116 colorectal cancer cell line, an A375 melanoma cell line, a ovarian cancer cell line SKOV3, a hematopoietic tumor cell line RPMI8226, a hematopoietic tumor cell line K562, PBMC (human peripheral blood mononuclear cells) and human platelet. All lung cancer cell lines examined were TROP2-positive, and PC3, PK1, and SKOV3 were positive as cell lines with the exception of those from lung cancer. On the other hand, all normal blood cells were negative.

Example 4: Measurement of antibody internalization activity 4-1) Antibody internalization activity assessment system

[00374] Uma proteína de fusão recombinante DT3C foi produzida com a finalidade de medir a atividade de internalização e a atividade de imunotoxina de um anticorpo. Esta DT3C é uma proteína que tem um domínio catalítico de toxina de difteria (DT) e três regiões de ligação de anticorpo de proteína G. DT3C especificamente liga-se a um porção de Fc de um anticorpo, é estável, e induz a morte celular inibindo a síntese de proteína quando apreendida nas células. Por uso deste sistema, o efeito de internalização de anticorpo, e o efeito citocida do mesmo, por imunotoxina pode ser observado ao mesmo tempo (Yamaguchi, M., Hamada, H., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600-603).[00374] A recombinant DT3C fusion protein was produced for the purpose of measuring the internalization activity and immunotoxin activity of an antibody. This DT3C is a protein that has a diphtheria toxin (DT) catalytic domain and three G protein antibody binding regions. DT3C specifically binds to an Fc portion of an antibody, is stable, and induces cell death. inhibiting protein synthesis when seized in cells. By using this system, the antibody internalization effect, and the cytocidal effect thereof, by immunotoxin can be observed at the same time (Yamaguchi, M., Hamada, H., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014 ) 600-603).

4-2) Assessment of internalization activity and immunotoxin activity using DT3C

[00375] 4 μg/mL de DT3C foram adicionados a 25 μL/cavidade a uma placa de 96 cavidades, também os sobrenadantes de cultura de 11 hibridomas obtidos pelo método do Exemplo 1 ou um método equivalente a isto foram cada qual adicionados a 25 μL/cavidade à placa, e a placa foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Os antígenos reconhecidos por anticorpos produzidos pelos hibridomas diferentes do hibridoma de produção de anticorpo TINA1 foram com antecedência confirmados ser CD9, CD46, CD55, CD59, CD71, CD73, CD147, CD276, EpCAM ou EGFR. 2 x 104 células/mL (meio de RPMI1640 suplementado com 20% de FBS de IgG Baixa) de células NCI-H322 foram semeadas a isto a 50 μL/cavidade. Depois da incubação em temperatura ambiente durante 30 minutos, as células foram cultivadas durante 3 dias em uma incubadora de CO2 de 37°C. Depois da cultura, o sobrenadante foi removido, e 10% de WST-10% de FBS-RPMI1640 foram adicionados a 100 μL/cavidade à placa. Depois da incubação durante 1 hora em uma incubadora de CO2 de 37°C, o número de células vivas foi medido usando uma leitora de microplaca (OD450 a OD640, infinito 200, Tecan Trading AG). Entre os sobrenadantes de cultura das células de hibridoma avaliadas, os anticorpos contra CD59, CD71, EGFR, EpCAM ou TROP2 foram confirmados ter forte atividade de internalização e atividade de imunotoxina (Figura 10).[00375] 4 μg/mL of DT3C was added at 25 μL/well to a 96-well plate, also culture supernatants from 11 hybridomas obtained by the method of Example 1 or a method equivalent thereto were each added at 25 μL /well to the plate, and the plate was incubated at room temperature for 30 minutes. The antigens recognized by antibodies produced by hybridomas other than the TINA1 antibody-producing hybridoma were previously confirmed to be CD9, CD46, CD55, CD59, CD71, CD73, CD147, CD276, EpCAM or EGFR. 2 x 104 cells/mL (RPMI1640 medium supplemented with 20% Low IgG FBS) of NCI-H322 cells were seeded at 50 μL/well. After incubation at room temperature for 30 minutes, cells were cultured for 3 days in a 37°C CO2 incubator. After culture, the supernatant was removed, and 10% WST-10% FBS-RPMI1640 was added at 100 μL/well to the plate. After incubation for 1 hour in a 37°C CO2 incubator, the number of live cells was measured using a microplate reader (OD450 to OD640, infinity 200, Tecan Trading AG). Among the culture supernatants of the evaluated hybridoma cells, antibodies against CD59, CD71, EGFR, EpCAM or TROP2 were confirmed to have strong internalization activity and immunotoxin activity (Figure 10).

4-3) Difference in internalization activity and immunotoxin activity between antibodies against CD59, CD71, EGFR, EpCAM or TROP2

[00376] Cada solução diluída de DT3C (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 ou 40 μg/mL) foi adicionada a 25 μL/cavidade a uma placa de 96 cavidades, em seguida cada anticorpo (40 μg/mL) foi adicionado a 25 μL/cavidade à placa, e a placa foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Além disso, 2 x 104 células/mL (meio de RPMI1640 suplementado com 20% de FBS de IgG Baixa) de células NCI-H322 foram semeadas a isto a 50 μL/cavidade. Depois da incubação em temperatura ambiente durante 30 minutos, as células foram cultivadas durante 3 dias em uma incubadora de CO2 de 37°C. Depois da cultura, o sobrenadante foi removido, e 10% de WST-1-10% de FBS- RPMI1640 foram adicionados a 100 μL/cavidade à placa. Depois da incubação durante 1 hora em uma incubadora de CO2 de 37°C, o número de células vivas foi medido usando uma leitora de placa (OD450 a OD640). Entre os anticorpos avaliados, TINA1, um anticorpo contra TROP2, teve a atividade de internalização mais forte e atividade de imunotoxina (Figura 11).[00376] Each diluted DT3C solution (0, 0.004, 0.04, 0.4, 4 or 40 μg/mL) was added at 25 μL/well to a 96-well plate, then each antibody (40 μg/well mL) was added at 25 μL/well to the plate, and the plate was incubated at room temperature for 30 minutes. Additionally, 2 x 104 cells/mL (RPMI1640 medium supplemented with 20% Low IgG FBS) of NCI-H322 cells were seeded at 50 μL/well. After incubation at room temperature for 30 minutes, cells were cultured for 3 days in a 37°C CO2 incubator. After culture, the supernatant was removed, and 10% WST-1-10% FBS-RPMI1640 was added at 100 μL/well to the plate. After incubation for 1 hour in a 37°C CO2 incubator, the number of live cells was measured using a plate reader (OD450 to OD640). Among the antibodies evaluated, TINA1, an antibody against TROP2, had the strongest internalization activity and immunotoxin activity (Figure 11).

4-4) Difference in internalization activity and immunotoxin activity between anti-TROP2 antibody clones

[00377] Anticorpos anti-TROP2 TINA1 (imunógeno: linhagem de câncer de pulmão NCI-H322), KCL7A3 e KCL2D6 (imunógeno: linhagem celular de câncer pancreático KCL-MOH1), Pr1E11 e Pr8H10 (imunógeno: linhagem celular de câncer prostático Pc-1) e NY16 e NY17 (imunógeno: linhagem celular de câncer pancreático PK-1) obtidos pelo método do Exemplo 1 ou um método equivalente a isto, e 77220 comercialmente disponível (R&D Systems Inc.) foi avaliado quanto a sua atividade de internalização e atividade de imunotoxina da mesma maneira como no Exemplo 4-3). Como resultado, entre os 8 anticorpos anti-TROP2, o anticorpo TINA1 teve a atividade mais forte (Figura 12).[00377] Anti-TROP2 antibodies TINA1 (immunogen: lung cancer cell line NCI-H322), KCL7A3 and KCL2D6 (immunogen: pancreatic cancer cell line KCL-MOH1), Pr1E11 and Pr8H10 (immunogen: prostate cancer cell line Pc- 1) and NY16 and NY17 (immunogen: PK-1 pancreatic cancer cell line) obtained by the method of Example 1 or a method equivalent thereto, and commercially available 77220 (R&D Systems Inc.) was evaluated for its internalization activity and immunotoxin activity in the same manner as in Example 4-3). As a result, among the 8 anti-TROP2 antibodies, the TINA1 antibody had the strongest activity (Figure 12).

Example 5: Nucleotide sequence determination of cDNA encoding TINA1 antibody gene variable region and production of chimeric TINA1 antibody (then called cTINA1)

[00378] 5-1) Determinação de sequência de nucleotídeo de cDNA de codificação de região variável de gene de anticorpo TINA1[00378] 5-1) Determination of nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of TINA1 antibody gene

[00379] 5-1-1) Preparação de mRNA de hibridoma de produção de anticorpo TINA1[00379] 5-1-1) Preparation of TINA1 antibody-producing hybridoma mRNA

[00380] Para ampliar cDNAs que codificam as regiões variáveis do anticorpo TINA1, mRNA foi preparado a partir do hibridoma de produção de anticorpo TINA1 usando kit de Isolamento de mRNA (Roche Applied Science).[00380] To amplify cDNAs encoding the variable regions of the TINA1 antibody, mRNA was prepared from the TINA1 antibody-producing hybridoma using mRNA Isolation kit (Roche Applied Science).

[00381] 5-1-2) Síntese de cDNA (cDNA 5'-RACE-Ready)[00381] 5-1-2) cDNA synthesis (5'-RACE-Ready cDNA)

[00382] cDNA (cDNA 5'-RACE-Ready) foi sintetizado usando o mRNA (100 ng) preparado em 5-1-1), e Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.).[00382] cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) was synthesized using mRNA (100 ng) prepared in 5-1-1), and SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories, Inc.).

[00383] 5-1-3) Amplificação de cDNA que codifica região variável de cadeia pesada de anticorpo TINA1 por 5'-RACE PCR, e determinação de sequência[00383] 5-1-3) Amplification of cDNA encoding TINA1 antibody heavy chain variable region by 5'-RACE PCR, and sequence determination

[00384] UPM (Universal Primer A Mix: incluído em Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE) e um oligonucleotídeo que tem uma sequência de 5'- AGAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAGG-3' (SEQ ID NO: 33: iniciador mG2aVR2) foi usado como iniciadores por amplificar o cDNA de região variável do gene de cadeia pesada por PCR. UPM incluído em Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.) foi usado, e mG2aVR2 foi projetado a partir da sequência de uma região constante de cadeia pesada de camundongo (IgG2a) em um banco de dados.[00384] UPM (Universal Primer A Mix: included in SMARTer RACE cDNA Amplification Kit) and an oligonucleotide having a sequence of 5'-AGAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAGG-3' (SEQ ID NO: 33: primer mG2aVR2) were used as primers by amplify the variable region cDNA of the heavy chain gene by PCR. UPM included in SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories, Inc.) was used, and mG2aVR2 was designed from the sequence of a mouse heavy chain constant region (IgG2a) in a database.

[00385] cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 foi amplificado por 5'-RACE PCR usando este conjunto de iniciador, e o cDNA (cDNA 5'-RACE-Ready) sintetizado no Exemplo 5-1-2) como um padrão. Esta PCR foi realizada de acordo com o manual de Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.) no programa de PCR touchdown usando KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) como polimerase.[00385] cDNA encoding the heavy chain variable region of the TINA1 antibody was amplified by 5'-RACE PCR using this primer set, and the cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) synthesized in Example 5-1-2) as a standard. This PCR was performed according to the SMARTer RACE cDNA Amplification Kit manual (Clontech Laboratories, Inc.) in the touchdown PCR program using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) as polymerase.

[00386] O cDNA de codificação de região variável de cadeia pesada amplificado por 5'-RACE PCR foi purificado usando Kit de Purificação de PCR MinElute (QIAGEN N.V.), e em seguida clonado usando Kit de Clonagem de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.). A sequência de nucleotídeo do cDNA de codificação de região variável de cadeia pesada clonado foi analisada por sequenciamento. Os iniciadores de sequenciamento usados foram o iniciador descrito acima mG2aVR2 projetado a partir da sequência de uma região constante de cadeia pesada de camundongo em um banco de dados, e NUP (Nested Universal Primer A: incluído em Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE).[00386] The heavy chain variable region coding cDNA amplified by 5'-RACE PCR was purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN N.V.), and then cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen Corp .). The nucleotide sequence of the cloned heavy chain variable region coding cDNA was analyzed by sequencing. The sequencing primers used were the above-described mG2aVR2 primer designed from the sequence of a mouse heavy chain constant region in a database, and NUP (Nested Universal Primer A: included in SMARTer RACE cDNA Amplification Kit).

[00387] A análise de sequenciamento foi realizada usando um mecanismo de análise de sequência de gene ("ABI PRISMA 3700 DNA Analyzer" ou "Applied Biosystems 3730xl Analyzer", Applied Biosystems, Inc.), e a reação de sequenciamento empregou Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).[00387] Sequencing analysis was performed using a gene sequence analysis engine ("ABI PRISMA 3700 DNA Analyzer" or "Applied Biosystems 3730xl Analyzer", Applied Biosystems, Inc.), and the sequencing reaction employed Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).

[00388] A sequência de nucleotídeo determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 é mostrada em SEQ ID NO: 1 do Listagem de Sequência, e a sequência de aminoácido codificada desse modo é mostrada em SEQ ID NO: 2.[00388] The determined nucleotide sequence of the cDNA encoding the heavy chain variable region of the TINA1 antibody is shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, and the amino acid sequence thus encoded is shown in SEQ ID NO: 2 .

[00389] 5-1-4) Amplificação de cDNA que codifica a região variável de cadeia leve de anticorpo TINA1 por 5'-RACE PCR, e determinação de sequência[00389] 5-1-4) Amplification of cDNA encoding the TINA1 antibody light chain variable region by 5'-RACE PCR, and sequence determination

[00390] UPM (Universal Primer A Mix: incluído em Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE) e um oligonucleotídeo que tem uma sequência de 5'- AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG-3' (SEQ ID NO: 34: iniciador mKVR2) foi usado como iniciadores por amplificar o cDNA de região variável do gene de cadeia leve do anticorpo TINA1 por PCR. UPM incluído em Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.) foi usado, e mKVR2 foi projetado a partir da sequência de uma região constante de cadeia leve de camundongo em um banco de dados.[00390] UPM (Universal Primer A Mix: included in SMARTer RACE cDNA Amplification Kit) and an oligonucleotide having a sequence of 5'- AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG-3' (SEQ ID NO: 34: primer mKVR2) were used as primers by amplify the variable region cDNA of the TINA1 antibody light chain gene by PCR. UPM included in SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories, Inc.) was used, and mKVR2 was designed from the sequence of a mouse light chain constant region in a database.

[00391] cDNA que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 foi amplificado por 5'-RACE PCR usando este conjunto de iniciador, e o cDNA (cDNA 5'-RACE-Ready) sintetizado no Exemplo 5-1-2) como um padrão. Esta PCR foi realizada de acordo com o manual de Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.) no programa de PCR touchdown usando KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) como polimerase.[00391] cDNA encoding the light chain variable region of the TINA1 antibody was amplified by 5'-RACE PCR using this primer set, and the cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) synthesized in Example 5-1-2) as a standard. This PCR was performed according to the SMARTer RACE cDNA Amplification Kit manual (Clontech Laboratories, Inc.) in the touchdown PCR program using KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) as polymerase.

[00392] O cDNA de codificação de região variável de cadeia leve amplificado por 5'-RACE PCR usando Kit de Purificação de PCR MinElute foi purificado (QIAGEN N.V.), e em seguida clonado usando Kit de Clonagem de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.). A sequência de nucleotídeo do cDNA de codificação de região variável de cadeia leve clonado foi analisado por sequenciamento.[00392] The light chain variable region coding cDNA amplified by 5'-RACE PCR using MinElute PCR Purification Kit was purified (QIAGEN N.V.), and then cloned using TOPO Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen Corp .). The nucleotide sequence of the cloned light chain variable region coding cDNA was analyzed by sequencing.

[00393] Os iniciadores de sequenciamento usados foram o iniciador mKVR2 descrito acima projetado a partir da sequência de uma região constante de cadeia leve de camundongo em um banco de dados, e NUP.[00393] The sequencing primers used were the mKVR2 primer described above designed from the sequence of a mouse light chain constant region in a database, and NUP.

[00394] A análise de sequenciamento, e a reação de sequenciamento empregaram o mecanismo descrito acima.[00394] The sequencing analysis and sequencing reaction employed the mechanism described above.

[00395] A sequência de nucleotídeo determinada do cDNA que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 é mostrada em SEQ ID NO: 3 da Listagem de Sequência, e a sequência de aminoácido codificada desse modo é mostrada em SEQ ID NO: 4.[00395] The determined nucleotide sequence of the cDNA encoding the TINA1 antibody light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing, and the amino acid sequence thus encoded is shown in SEQ ID NO: 4 .

[00396] 5-2) Produção de anticorpo cTINA1[00396] 5-2) Production of cTINA1 antibody

[00397] 5-2-1) Construção de vetor de expressão de cadeia leve de anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK[00397] 5-2-1) Construction of chimeric and humanized antibody light chain expression vector pCMA-LK

[00398] Um fragmento de cerca de 5,4 kb obtido digerindo-se um plasmídeo pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) com enzimas de restrição XbaI e PmeI, e um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA que codifica um sinal de secreção de cadeia K humana e uma região constante de cadeia K humana mostrada em SEQ ID NO: 5 foram ligados usando kit de clonagem de PCR InFusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para produzir pcDNA3.3/LK.[00398] A fragment of about 5.4 kb obtained by digesting a pcDNA3.3-TOPO/LacZ plasmid (Invitrogen Corp.) with XbaI and PmeI restriction enzymes, and a DNA fragment that contains a DNA sequence that encoding a human K chain secretion signal and a human K chain constant region shown in SEQ ID NO: 5 were ligated using InFusion Advantage PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.) to produce pcDNA3.3/LK.

[00399] pcDNA3.3/LK foi usado como um padrão em PCR usando um conjunto de iniciador descrito abaixo. O fragmento obtido de cerca de 3,8 kb foi fosforilado, e em seguida autoligado para construir um vetor de expressão de cadeia leve de anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK que tem uma sequência de sinal, um sítio de cloneamento, e o gene de região constante de cadeia K humana a jusante do promotor de CMV.[00399] pcDNA3.3/LK was used as a standard in PCR using a primer set described below. The obtained fragment of about 3.8 kb was phosphorylated, and then self-ligated to construct a chimeric and humanized antibody light chain expression vector pCMA-LK that has a signal sequence, a cloning site, and the gene for human K chain constant region downstream of the CMV promoter.

[00400] Conjunto de iniciador[00400] Launcher Set

[00401] 5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3' (SEQ ID NO: 35: iniciador 3.3-F1)[00401] 5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3' (SEQ ID NO: 35: primer 3.3-F1)

[00402] 5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3' (SEQ ID NO: 36: iniciador 3.3-R1)[00402] 5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3' (SEQ ID NO: 36: primer 3.3-R1)

[00403] 5-2-2) Construção de vetor de expressão de cadeia pesada do tipo anticorpo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1[00403] 5-2-2) Construction of chimeric and humanized IgG1 antibody heavy chain expression vector pCMA-G1

[00404] Um fragmento de DNA de pCMA-LK sem a sequência de DNA que codifica um sinal de secreção de cadeia k humana e uma região constante de cadeia k humana por digestão com XbaI e PmeI, e um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA que codifica aminoácidos de uma sequência de sinal de cadeia pesada humana e uma região constante de IgG1 humana mostradas em SEQ ID NO: 6 foram ligados usando kit de clonagem de PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de cadeia pesada do tipo anticorpo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1 que tem uma sequência de sinal, um sítio de cloneamento, e o gene de região constante de cadeia pesada de IgG1 humano a jusante do promotor de CMV.[00404] A pCMA-LK DNA fragment lacking the DNA sequence encoding a human k-chain secretion signal and a human k-chain constant region by digestion with XbaI and PmeI, and a DNA fragment containing a sequence of DNA encoding amino acids of a human heavy chain signal sequence and a human IgG1 constant region shown in SEQ ID NO: 6 were ligated using In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.) to construct a Chimeric and humanized IgG1 antibody-type heavy chain expression vector pCMA-G1 that has a signal sequence, a cloning site, and the human IgG1 heavy chain constant region gene downstream of the CMV promoter.

[00405] 5-2-3) Construção de vetor de expressão de cadeia pesada de anticorpo cTINA1[00405] 5-2-3) Construction of cTINA1 antibody heavy chain expression vector

[00406] Um fragmento de DNA que contém o cDNA que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 foi amplificado usando o cDNA de codificação de região variável de cadeia pesada obtido no Exemplo 5-1-3) como um padrão, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), e um conjunto de iniciador descrito abaixo, e inserido a um sítio clivado pela enzima de restrição BlpI do vetor de expressão de cadeia pesada do tipo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1 usando kit de clonagem de PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de cadeia pesada de anticorpo cTINA1. O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA- G1/cTINA1". A sequência de nucleotídeo da cadeia pesada de anticorpo cTINA1 é mostrada em SEQ ID NO: 7, e a sequência de aminoácido codificada desse modo é mostrada na SEQ ID NO: 8. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 são da mesma forma descritas na Figura 1.[00406] A DNA fragment containing the cDNA encoding the heavy chain variable region of the TINA1 antibody was amplified using the heavy chain variable region encoding cDNA obtained in Example 5-1-3) as a standard, KOD- Plus- (Toyobo Co., Ltd.), and a primer set described below, and inserted into a BlpI restriction enzyme cleaved site of the chimeric and humanized IgG1-type heavy chain expression vector pCMA-G1 using cloning kit In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.) to construct a cTINA1 antibody heavy chain expression vector. The expression vector obtained was designated as "pCMA-G1/cTINA1". The nucleotide sequence of the cTINA1 antibody heavy chain is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence thus encoded is shown in SEQ ID NO: 8. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and the sequence amino acid number of SEQ ID NO: 8 are similarly described in Figure 1.

[00407] Conjunto de iniciador para cadeia pesada de anticorpo cTINA1 5'- CCAGATGGGTGCTGAGCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCT GAG-3' (SEQ ID NO: 37: iniciador TINA1H-F) 5'- CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACGGTGACCGCGGTCCCTGCGCCCC AGAC-3' (SEQ ID NO: 38: iniciador TINA1H-R)[00407] Primer set for cTINA1 antibody heavy chain 5'- CCAGATGGGTGCTGAGCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCT GAG-3' (SEQ ID NO: 37: primer TINA1H-F) 5'- CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACGGTGACCGCGGTCCCTGCGCCCC AGAC-3' (SEQ ID NO: 38: primer TINA1H- R)

[00408] 5-2-4) Construção de vetor de expressão de cadeia leve de anticorpo cTINA1[00408] 5-2-4) Construction of cTINA1 antibody light chain expression vector

[00409] Um fragmento de DNA que contém o cDNA que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 foi amplificado usando o cDNA de codificação de região variável de cadeia leve obtido no Exemplo 5-1-4) como um padrão, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), e um conjunto de iniciador descrito abaixo, e inserido a um sítio clivado por BsiWI de enzima de restrição do vetor de propósito geral de expressão de cadeia leve de anticorpo quimérico e humanizado pCMA-LK usando kit de clonagem de PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de cadeia leve de anticorpo cTINA1. O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-LK/cTINA1". A sequência de nucleotídeo da cadeia leve de anticorpo cTINA1 é mostrada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácido codificada desse modo é mostrada na SEQ ID NO: 10. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 são da mesma forma descritas na Figura 2.[00409] A DNA fragment containing the cDNA encoding the light chain variable region of the TINA1 antibody was amplified using the light chain variable region encoding cDNA obtained in Example 5-1-4) as a standard, KOD- Plus- (Toyobo Co., Ltd.), and a primer set described below, and inserted into a BsiWI restriction enzyme cleaved site of the chimeric and humanized antibody light chain general purpose expression vector pCMA-LK using In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.) to construct a cTINA1 antibody light chain expression vector. The expression vector obtained was designated as "pCMA-LK/cTINA1". The nucleotide sequence of the cTINA1 antibody light chain is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence thus encoded is shown in SEQ ID NO: 10. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and the sequence of amino acid of SEQ ID NO: 10 are similarly described in Figure 2.

[00410] Conjunto de iniciador para cadeia leve de anticorpo cTINA1 5'- ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAA TTC-3' (SEQ ID NO: 39: iniciador TINA1L-F) 5'- GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG C-3' (SEQ ID NO: 40: iniciador TINA1L-R)[00410] Primer set for cTINA1 antibody light chain 5'- ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAA TTC-3' (SEQ ID NO: 39: primer TINA1L-F) 5'- GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAG C-3' (SEQ ID NO: 40: primer TINA1L- R)

[00411] 5-2-5) Produção em pequena escala de anticorpo cTINA1[00411] 5-2-5) Small-scale production of cTINA1 antibody

[00412] Células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual.[00412] FreeStyle 293F cells (Invitrogen Corp.) were subcultured and cultured according to the manual.

[00413] 1 x 107 células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) na fase de crescimento logarítmica foram diluídas com um meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) para 9,6 mL, em seguida semeadas em um Frasco de Armazenamento Quadrado de 30 mL (Nalgene/Thermo Fisher Scientific, Inc.), e em seguida cultivadas por agitação a 90 rpm durante 1 hora em uma incubadora de CO2 a 8% de 37°C. Polietilenoimina (Poliscience #24765; 30 μg) foi dissolvida em Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 200 μL). Em seguida, o vetor de expressão de cadeia leve (6 μg), e o vetor de expressão de cadeia pesada (4 μg) preparado usando o kit de Plasmídeo PureLink HiPure (Invitrogen Corp.) foram adicionados a Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 200 μL). A solução mista de vetor de expressão/Opti-Pro SFM (200 μL) foi adicionada à solução mista de polietilenoimina/Opti-Pro SFM (200 μL), e a mistura foi agitada suavemente, também deixada durante 5 minutos, e em seguida adicionada às Células FreeStyle 293F. Um sobrenadante de cultura obtido por cultura por agitação a 90 rpm durante 7 dias em uma incubadora de CO2 a 8% de 37°C foi filtrado por filtro Minisart-Plus (Sartorius AG) e usado como uma amostra para avaliação.[00413] 1 x 10 FreeStyle 293F cells (Invitrogen Corp.) in the logarithmic growth phase were diluted with FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen Corp.) to 9.6 mL, then seeded in a 30 Square Storage Flask mL (Nalgene/Thermo Fisher Scientific, Inc.), and then cultured by shaking at 90 rpm for 1 hour in a 37°C 8% CO2 incubator. Polyethyleneimine (Poliscience #24765; 30 μg) was dissolved in Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 200 μL). Then, the light chain expression vector (6 μg), and the heavy chain expression vector (4 μg) prepared using the PureLink HiPure Plasmid Kit (Invitrogen Corp.) were added to Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp. .; 200 μL). The expression vector/Opti-Pro SFM mixed solution (200 μL) was added to the polyethyleneimine/Opti-Pro SFM mixed solution (200 μL), and the mixture was gently stirred, also left for 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F Cells. A culture supernatant obtained by shaking culture at 90 rpm for 7 days in an 8% CO2 incubator at 37°C was filtered by Minisart-Plus filter (Sartorius AG) and used as a sample for evaluation.

[00414] O anticorpo TINA1 quimérico humano obtido pela combinação de pCMA-G1/cTINA1 e pCMA-LK/cTINA1 foi designado como um "anticorpo cTINA1".[00414] The human chimeric TINA1 antibody obtained by combining pCMA-G1/cTINA1 and pCMA-LK/cTINA1 was designated as a "cTINA1 antibody".

[00415] Exemplo 6: Projeto de anticorpo humanizado de anticorpo monoclonal anti-TROP2 de camundongo[00415] Example 6: Humanized antibody design of mouse anti-TROP2 monoclonal antibody

[00416] 6-1) Projeto de versão humanizada de TINA1[00416] 6-1) TINA1 humanized version project

[00417] 6-1-1) Modelagem molecular da região variável de TINA1[00417] 6-1-1) Molecular modeling of the variable region of TINA1

[00418] A modelagem molecular das regiões variáveis de TINA1 foi realizada por um método conhecido na técnica como modelagem por homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153 (1991)). As regiões variáveis de TINA1 determinadas acima foram comparadas com as sequências primárias (estruturas tridimensionais derivadas de estruturas de cristal de raios X estão disponíveis) de regiões variáveis de imunoglobulina humana registradas em Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)). Como um resultado, 1ZEA foi selecionado como aquele tendo a homologia de sequência mais alta à região variável de cadeia pesada de TINA1 entre anticorpos similarmente tendo uma deleção em suas estruturas. Da mesma forma, 3IU4 foi selecionado como aquele tendo a homologia de sequência mais alta à região variável de cadeia leve de TINA1. As estruturas tridimensionais de regiões de estrutura foram preparadas como um "modelo de estrutura" combinando-se as coordenadas de 1ZEA e 3IU4 que correspondem à cadeia pesada, e à cadeia leve de TINA1. Subsequentemente, a conformação típica de cada CDR foi incorporada no padrão de estrutura.[00418] Molecular modeling of the variable regions of TINA1 was carried out by a method known in the art as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153 (1991)). The variable regions of TINA1 determined above were compared with the primary sequences (three-dimensional structures derived from X-ray crystal structures are available) of human immunoglobulin variable regions recorded in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 ( 2007)). As a result, 1ZEA was selected as the one having the highest sequence homology to the heavy chain variable region of TINA1 among antibodies similarly having a deletion in their structures. Similarly, 3IU4 was selected as the one having the highest sequence homology to the light chain variable region of TINA1. Three-dimensional structures of framework regions were prepared as a "structure model" by combining the coordinates of 1ZEA and 3IU4 which correspond to the heavy chain, and the light chain of TINA1. Subsequently, the typical conformation of each CDR was incorporated into the structure pattern.

[00419] Finalmente, o cálculo de energia para excluir o contato interatômico desvantajoso foi conduzido para obter possíveis modelos moleculares das regiões variáveis de TINA1 em termos de energia. Estes procedimentos foram realizados usando um programa de predição de estrutura tridimensional de proteína comercialmente disponível Discovery Studio (Accelrys, Inc.).[00419] Finally, energy calculation to exclude disadvantageous interatomic contact was conducted to obtain possible molecular models of the variable regions of TINA1 in terms of energy. These procedures were performed using a commercially available protein three-dimensional structure prediction program Discovery Studio (Accelrys, Inc.).

[00420] 6-1-2) Projeto de sequência de aminoácido para TINA1 humanizado[00420] 6-1-2) Amino acid sequence design for humanized TINA1

[00421] O anticorpo TINA1 humanizado foi construído por um método conhecido na técnica como enxerto de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989)). Um anticorpo aceptor foi selecionado com base na homologia de aminoácidos em regiões de estrutura. As sequências das regiões de estrutura de TINA1 foram comparadas com as sequências de todas as estruturas humanas registradas no banco de dados de Kabat (Nuc. Acid Res., 29, 205-206 (2001)) de sequências de aminoácido de anticorpo. Como um resultado, um anticorpo HuPR1A3 foi selecionado como um aceptor devido a sua homologia de sequência de 74% de acordo com as regiões de estrutura. Os resíduos de aminoácido das regiões de estrutura em HuPR1A3 foram alinhados com os resíduos de aminoácido das regiões de estrutura de TINA1 para identificar as posições de ácidos aminados que não correspondem mutuamente. As posições destes resíduos foram analisadas usando o modelo tridimensional de TINA1 construído acima. Em seguida, os resíduos de doador a ser enxertados no aceptor foram selecionados de acordo com os critérios fornecidos por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Alguns resíduos de doador desse modo selecionados foram transferidos para o anticorpo aceptor para construir a sequência de TINA1 humanizada como descrito nos Exemplos abaixo.[00421] The humanized TINA1 antibody was constructed by a method known in the art as CDR grafting (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989)). An acceptor antibody was selected based on amino acid homology in framework regions. The sequences of the TINA1 framework regions were compared with the sequences of all human frameworks recorded in the Kabat database (Nuc. Acid Res., 29, 205-206 (2001)) of antibody amino acid sequences. As a result, a HuPR1A3 antibody was selected as an acceptor due to its 74% sequence homology according to the framework regions. The amino acid residues of the framework regions in HuPR1A3 were aligned with the amino acid residues of the framework regions of TINA1 to identify the amino acid positions that do not correspond to each other. The positions of these residues were analyzed using the three-dimensional model of TINA1 constructed above. Then, the donor residues to be grafted onto the acceptor were selected according to the criteria provided by Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Some thus selected donor residues were transferred to the acceptor antibody to construct the humanized TINA1 sequence as described in the Examples below.

[00422] 6-2) Humanização de cadeia pesada de TINA1[00422] 6-2) TINA1 heavy chain humanization

[00423] 6-2-1) Cadeia pesada do tipo hTINA1-H1:[00423] 6-2-1) hTINA1-H1 type heavy chain:

[00424] Uma cadeia pesada de TINA1 humanizada projetada envolvendo a substituição da posição de aminoácido 21 (isoleucina) com valina, posição de aminoácido 28 (prolina) com alanina, posição de aminoácido 30 (leucina) com valina, posição de aminoácido 35 (ácido glutâmico) com alanina, posição de aminoácido 36 (treonina) com serina, posição de aminoácido 38 (arginina) com lisina, posição de aminoácido 39 (isoleucina) com valina, posição de aminoácido 57 (glutamina) com arginina, posição de aminoácido 58 (lisina) com glutamina, posição de aminoácido 59 (metionina) com alanina, posição de aminoácido 62 (lisina) com glutamina, posição de aminoácido 65 (lisina) com ácido glutâmico, posição de aminoácido 67 (isoleucina) com metionina, posição de aminoácido 87 (fenilalanina) com valina, posição de aminoácido 88 (alanina) com treonina, posição de aminoácido 89 (fenilalanina) com isoleucina, posição de aminoácido 91 (leucina) com alanina, posição de aminoácido 92 (ácido glutâmico) com ácido aspártico, posição de aminoácido 95 (alanina) com treonina, posição de aminoácido 102 (isoleucina) com leucina, posição de aminoácido 104 (asparagina) com serina, posição de aminoácido 107 (asparagina) com serina, posição de aminoácido 111 (treonina) com alanina, posição de aminoácido 112 (treonina) com valina, posição de aminoácido 114 (fenilalanina) com tirosina, posição de aminoácido 132 (alanina) com glutamina e posição de aminoácido 135 (alanina) com leucina de acordo com a cadeia pesada de TINA1 mostrada na SEQ ID NO: 8 da Listagem de Sequência foi designada como uma "cadeia pesada do tipo hTINA1-H1".[00424] An engineered humanized TINA1 heavy chain involving the replacement of amino acid position 21 (isoleucine) with valine, amino acid position 28 (proline) with alanine, amino acid position 30 (leucine) with valine, amino acid position 35 (acid glutamic) with alanine, amino acid position 36 (threonine) with serine, amino acid position 38 (arginine) with lysine, amino acid position 39 (isoleucine) with valine, amino acid position 57 (glutamine) with arginine, amino acid position 58 ( lysine) with glutamine, amino acid position 59 (methionine) with alanine, amino acid position 62 (lysine) with glutamine, amino acid position 65 (lysine) with glutamic acid, amino acid position 67 (isoleucine) with methionine, amino acid position 87 (phenylalanine) with valine, amino acid position 88 (alanine) with threonine, amino acid position 89 (phenylalanine) with isoleucine, amino acid position 91 (leucine) with alanine, amino acid position 92 (glutamic acid) with aspartic acid, position of amino acid position 95 (alanine) with threonine, amino acid position 102 (isoleucine) with leucine, amino acid position 104 (asparagine) with serine, amino acid position 107 (asparagine) with serine, amino acid position 111 (threonine) with alanine, amino acid position 111 (threonine) with alanine, amino acid position 112 (threonine) with valine, amino acid position 114 (phenylalanine) with tyrosine, amino acid position 132 (alanine) with glutamine, and amino acid position 135 (alanine) with leucine according to the TINA1 heavy chain shown in SEQ ID NO :8 of the Sequence Listing was designated as a "hTINA1-H1-type heavy chain".

[00425] A sequência de aminoácido da cadeia pesada do tipo hTINA1-H1 é descrita na SEQ ID NO: 12 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 19, uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 20 a 140 e uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 141 a 470 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 corresponde à sequência de sinal, à região variável de cadeia pesada e à região constante de cadeia pesada, respectivamente. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 é descrita na SEQ ID NO: 11 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em nucleotídeos 1 a 57, uma sequência que consiste em nucleotídeos 58 a 420, e uma sequência que consiste em nucleotídeos 421 a 1410 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 codifica a sequência de sinal, a sequência de região variável de cadeia pesada, e a sequência de região constante de cadeia pesada, respectivamente. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 são da mesma forma descritas na Figura 3.[00425] The amino acid sequence of the heavy chain of the hTINA1-H1 type is described in SEQ ID NO: 12 of the Sequence Listing. A sequence consisting of amino acid residues 1 to 19, a sequence consisting of amino acid residues 20 to 140, and a sequence consisting of amino acid residues 141 to 470 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 corresponds to the signal sequence , to the heavy chain variable region and the heavy chain constant region, respectively. The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is described in SEQ ID NO: 11 of the Sequence Listing. A sequence consisting of nucleotides 1 to 57, a sequence consisting of nucleotides 58 to 420, and a sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 encodes the signal sequence, the region sequence heavy chain variable, and the heavy chain constant region sequence, respectively. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 are similarly described in Figure 3.

[00426] 6-2-2) Cadeia pesada do tipo hTINA1-H2:[00426] 6-2-2) hTINA1-H2 type heavy chain:

[00427] Uma cadeia pesada de TINA1 humanizada projetada envolvendo a substituição da posição de aminoácido 21 (isoleucina) com valina, posição de aminoácido 28 (prolina) com alanina, posição de aminoácido 30 (leucina) com valina, posição de aminoácido 35 (ácido glutâmico) com alanina, posição de aminoácido 36 (treonina) com serina, posição de aminoácido 38 (arginina) com lisina, posição de aminoácido 39 (isoleucina) com valina, posição de aminoácido 57 (glutamina) com arginina, posição de aminoácido 58 (lisina) com glutamina, posição de aminoácido 59 (metionina) com alanina, posição de aminoácido 62 (lisina) com glutamina, posição de aminoácido 65 (lisina) com ácido glutâmico, posição de aminoácido 67 (isoleucina) com metionina, posição de aminoácido 87 (fenilalanina) com valina, posição de aminoácido 88 (alanina) com treonina, posição de aminoácido 89 (fenilalanina) com isoleucina, posição de aminoácido 92 (ácido glutâmico) com ácido aspártico, posição de aminoácido 95 (alanina) com treonina, posição de aminoácido 102 (isoleucina) com leucina, posição de aminoácido 104 (asparagina) com serina, posição de aminoácido 107 (asparagina) com serina, posição de aminoácido 111 (treonina) com alanina, posição de aminoácido 112 (treonina) com valina, posição de aminoácido 114 (fenilalanina) com tirosina, posição de aminoácido 132 (alanina) com glutamina e posição de aminoácido 135 (alanina) com leucina de acordo com a cadeia pesada de TINA1 mostrada na SEQ ID NO: 8 da Listagem de Sequência foi designada como uma "cadeia pesada do tipo hTINA1-H2".[00427] An engineered humanized TINA1 heavy chain involving the replacement of amino acid position 21 (isoleucine) with valine, amino acid position 28 (proline) with alanine, amino acid position 30 (leucine) with valine, amino acid position 35 (acid glutamic) with alanine, amino acid position 36 (threonine) with serine, amino acid position 38 (arginine) with lysine, amino acid position 39 (isoleucine) with valine, amino acid position 57 (glutamine) with arginine, amino acid position 58 ( lysine) with glutamine, amino acid position 59 (methionine) with alanine, amino acid position 62 (lysine) with glutamine, amino acid position 65 (lysine) with glutamic acid, amino acid position 67 (isoleucine) with methionine, amino acid position 87 (phenylalanine) with valine, amino acid position 88 (alanine) with threonine, amino acid position 89 (phenylalanine) with isoleucine, amino acid position 92 (glutamic acid) with aspartic acid, amino acid position 95 (alanine) with threonine, amino acid position 95 (alanine) with threonine, amino acid position 102 (isoleucine) with leucine, amino acid position 104 (asparagine) with serine, amino acid position 107 (asparagine) with serine, amino acid position 111 (threonine) with alanine, amino acid position 112 (threonine) with valine, amino acid position 112 (threonine) with valine, amino acid position 114 (phenylalanine) with tyrosine, amino acid position 132 (alanine) with glutamine and amino acid position 135 (alanine) with leucine according to the TINA1 heavy chain shown in SEQ ID NO: 8 of the Sequence Listing was designated as a "hTINA1-H2 type heavy chain".

[00428] A sequência de aminoácido da cadeia pesada do tipo hTINA1-H2 é descrita na SEQ ID NO: 14 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 19, uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 20 a 140 e uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 141 a 470 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 corresponde à sequência de sinal, a região variável de cadeia pesada, e a região constante de cadeia pesada, respectivamente. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é descrita na SEQ ID NO: 13 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em nucleotídeos 1 a 57, uma sequência que consiste em nucleotídeos 58 a 420, e uma sequência que consiste em nucleotídeos 421 a 1410 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 13 codifica a sequência de sinal, a sequência de região variável de cadeia pesada e a sequência de região constante de cadeia pesada, respectivamente. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 13, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 são da mesma forma descritas na Figura 4.[00428] The amino acid sequence of the heavy chain of the hTINA1-H2 type is described in SEQ ID NO: 14 of the Sequence Listing. A sequence consisting of amino acid residues 1 to 19, a sequence consisting of amino acid residues 20 to 140, and a sequence consisting of amino acid residues 141 to 470 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 corresponds to the signal sequence , the heavy chain variable region, and the heavy chain constant region, respectively. The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is described in SEQ ID NO: 13 of the Sequence Listing. A sequence consisting of nucleotides 1 to 57, a sequence consisting of nucleotides 58 to 420, and a sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 encodes the signal sequence, the region sequence heavy chain variable and the heavy chain constant region sequence, respectively. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 are similarly described in Figure 4.

[00429] 6-2-3) Cadeia pesada do tipo hTINA1-H3:[00429] 6-2-3) hTINA1-H3 type heavy chain:

[00430] Uma cadeia pesada de TINA1 humanizada projetada envolvendo a substituição da posição de aminoácido 28 (prolina) com alanina, posição de aminoácido 30 (leucina) com valina, posição de aminoácido 36 (treonina) com serina, posição de aminoácido 38 (arginina) com lisina, posição de aminoácido 39 (isoleucina) com valina, posição de aminoácido 58 (lisina) com glutamina, posição de aminoácido 65 (lisina) com ácido glutâmico, posição de aminoácido 67 (isoleucina) com metionina, posição de aminoácido 87 (fenilalanina) com valina, posição de aminoácido 88 (alanina) com treonina, posição de aminoácido 92 (ácido glutâmico) com ácido aspártico, posição de aminoácido 95 (alanina) com treonina, posição de aminoácido 102 (isoleucina) com leucina, posição de aminoácido 104 (asparagina) com serina, posição de aminoácido 107 (asparagina) com serina, posição de aminoácido 111 (treonina) com alanina, posição de aminoácido 112 (treonina) com valina, posição de aminoácido 114 (fenilalanina) com tirosina, posição de aminoácido 132 (alanina) com glutamina, e posição de aminoácido 135 (alanina) com leucina de acordo com a cadeia pesada de TINA1 mostrada na SEQ ID NO: 8 da Listagem de Sequência foi designada como uma "cadeia pesada do tipo hTINA1- H3".[00430] An engineered humanized TINA1 heavy chain involving replacement of amino acid position 28 (proline) with alanine, amino acid position 30 (leucine) with valine, amino acid position 36 (threonine) with serine, amino acid position 38 (arginine ) with lysine, amino acid position 39 (isoleucine) with valine, amino acid position 58 (lysine) with glutamine, amino acid position 65 (lysine) with glutamic acid, amino acid position 67 (isoleucine) with methionine, amino acid position 87 ( phenylalanine) with valine, amino acid position 88 (alanine) with threonine, amino acid position 92 (glutamic acid) with aspartic acid, amino acid position 95 (alanine) with threonine, amino acid position 102 (isoleucine) with leucine, amino acid position 104 (asparagine) with serine, amino acid position 107 (asparagine) with serine, amino acid position 111 (threonine) with alanine, amino acid position 112 (threonine) with valine, amino acid position 114 (phenylalanine) with tyrosine, amino acid position 132 (alanine) with glutamine, and amino acid position 135 (alanine) with leucine according to the TINA1 heavy chain shown in SEQ ID NO: 8 of the Sequence Listing was designated as a "hTINA1-H3 type heavy chain".

[00431] A sequência de aminoácido da cadeia pesada do tipo hTINA1-H3 é descrita na SEQ ID NO: 16 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 19, uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 20 a 140 e uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 141 a 470 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 corresponde à sequência de sinal, a região variável de cadeia pesada e a região constante de cadeia pesada, respectivamente. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 é descrita na SEQ ID NO: 15 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em nucleotídeos 1 a 57, uma sequência que consiste em nucleotídeos 58 a 420 e uma sequência que consiste em nucleotídeos 421 a 1410 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 15 codifica a sequência de sinal, a sequência de região variável de cadeia pesada e a sequência de região constante de cadeia pesada, respectivamente. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 15, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 são da mesma forma descritas na Figura 5.[00431] The amino acid sequence of the heavy chain of the hTINA1-H3 type is described in SEQ ID NO: 16 of the Sequence Listing. A sequence consisting of amino acid residues 1 to 19, a sequence consisting of amino acid residues 20 to 140, and a sequence consisting of amino acid residues 141 to 470 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 corresponds to the signal sequence , the heavy chain variable region and the heavy chain constant region, respectively. The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is described in SEQ ID NO: 15 of the Sequence Listing. A sequence consisting of nucleotides 1 to 57, a sequence consisting of nucleotides 58 to 420, and a sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 encodes the signal sequence, the variable region sequence heavy chain sequence and heavy chain constant region sequence, respectively. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 are similarly described in Figure 5.

[00432] 6-3) Humanização de cadeia leve de TINA1[00432] 6-3) TINA1 light chain humanization

[00433] 6-3-1) Cadeia leve do tipo hTINA1-L1:[00433] 6-3-1) hTINA1-L1 type light chain:

[00434] Uma cadeia leve de TINA1 humanizada projetada envolvendo a substituição da posição de aminoácido 23 (valina) com glutamina, posição de aminoácido 28 (histidina) com prolina, posição de aminoácido 29 (lisina) com serina, posição de aminoácido 30 (fenilalanina) com serina, posição de aminoácido 31 (metionina) com leucina, posição de aminoácido 33 (treonina) com alanina, posição de aminoácido 40 (serina) com treonina, posição de aminoácido 62 (glutamina) com lisina, posição de aminoácido 63 (serina) com alanina, posição de aminoácido 80 (ácido aspártico) com serina, posição de aminoácido 83 (treonina) com serina, posição de aminoácido 90 (alanina) com ácido aspártico, posição de aminoácido 93 (fenilalanina) com leucina, posição de aminoácido 98 (valina) com leucina, posição de aminoácido 100 (alanina) com prolina, posição de aminoácido 103 (leucina) com fenilalanina, posição de aminoácido 120 (alanina) com glutamina, posição de aminoácido 126 (leucina) com isoleucina e posição de aminoácido 129 (alanina) com treonina de acordo com a cadeia leve de TINA1 mostrada na SEQ ID NO: 10 da Listagem de Sequência foi designada como uma "cadeia leve do tipo hTINA1-L1".[00434] An engineered humanized TINA1 light chain involving replacement of amino acid position 23 (valine) with glutamine, amino acid position 28 (histidine) with proline, amino acid position 29 (lysine) with serine, amino acid position 30 (phenylalanine ) with serine, amino acid position 31 (methionine) with leucine, amino acid position 33 (threonine) with alanine, amino acid position 40 (serine) with threonine, amino acid position 62 (glutamine) with lysine, amino acid position 63 (serine ) with alanine, amino acid position 80 (aspartic acid) with serine, amino acid position 83 (threonine) with serine, amino acid position 90 (alanine) with aspartic acid, amino acid position 93 (phenylalanine) with leucine, amino acid position 98 (valine) with leucine, amino acid position 100 (alanine) with proline, amino acid position 103 (leucine) with phenylalanine, amino acid position 120 (alanine) with glutamine, amino acid position 126 (leucine) with isoleucine and amino acid position 129 (alanine) with threonine according to the TINA1 light chain shown in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing was designated as a "hTINA1-L1 type light chain".

[00435] A sequência de aminoácido da cadeia leve do tipo hTINA1- L1 é descrita na SEQ ID NO: 18 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 20, uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 21 a 129 e uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 130 a 234 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 corresponde à sequência de sinal, a região variável de cadeia leve e a região constante de cadeia leve, respectivamente. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 é descrita na SEQ ID NO: 17 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em nucleotídeos 1 a 60, uma sequência que consiste em nucleotídeos 61 a 387, e uma sequência que consiste em nucleotídeos 388 a 702 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 codifica a sequência de sinal, a sequência de região variável de cadeia leve e a sequência de região constante de cadeia leve, respectivamente. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 são da mesma forma descritas na Figura 6.[00435] The amino acid sequence of the hTINA1-L1 type light chain is described in SEQ ID NO: 18 of the Sequence Listing. A sequence consisting of amino acid residues 1 to 20, a sequence consisting of amino acid residues 21 to 129, and a sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 corresponds to the signal sequence , the light chain variable region and the light chain constant region, respectively. The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 is described in SEQ ID NO: 17 of the Sequence Listing. A sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 encodes the signal sequence, the region sequence light chain variable and the light chain constant region sequence, respectively. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 are similarly described in Figure 6.

[00436] 6-3-2) Cadeia leve do tipo hTINA1-L2:[00436] 6-3-2) hTINA1-L2 type light chain:

[00437] Uma cadeia leve de TINA1 humanizada projetada envolvendo a substituição da posição de aminoácido 28 (histidina) com prolina, posição de aminoácido 29 (lisina) com serina, posição de aminoácido 30 (fenilalanina) com serina, posição de aminoácido 31 (metionina) com leucina, posição de aminoácido 33 (treonina) com alanina, posição de aminoácido 40 (serina) com treonina, posição de aminoácido 62 (glutamina) com lisina, posição de aminoácido 63 (serina) com alanina, posição de aminoácido 80 (ácido aspártico) com serina, posição de aminoácido 83 (treonina) com serina, posição de aminoácido 90 (alanina) com ácido aspártico, posição de aminoácido 93 (fenilalanina) com leucina, posição de aminoácido 98 (valina) com leucina, posição de aminoácido 100 (alanina) com prolina, posição de aminoácido 103 (leucina) com fenilalanina, posição de aminoácido 120 (alanina) com glutamina, posição de aminoácido 126 (leucina) com isoleucina, e posição de aminoácido 129 (alanina) com treonina de acordo com a cadeia leve de TINA1 mostrada na SEQ ID NO: 10 da Listagem de Sequência foi designada como uma "cadeia leve do tipo hTINA1-L2".[00437] An engineered humanized TINA1 light chain involving the replacement of amino acid position 28 (histidine) with proline, amino acid position 29 (lysine) with serine, amino acid position 30 (phenylalanine) with serine, amino acid position 31 (methionine ) with leucine, amino acid position 33 (threonine) with alanine, amino acid position 40 (serine) with threonine, amino acid position 62 (glutamine) with lysine, amino acid position 63 (serine) with alanine, amino acid position 80 (acid aspartic) with serine, amino acid position 83 (threonine) with serine, amino acid position 90 (alanine) with aspartic acid, amino acid position 93 (phenylalanine) with leucine, amino acid position 98 (valine) with leucine, amino acid position 100 (alanine) with proline, amino acid position 103 (leucine) with phenylalanine, amino acid position 120 (alanine) with glutamine, amino acid position 126 (leucine) with isoleucine, and amino acid position 129 (alanine) with threonine according to TINA1 light chain shown in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing has been designated as a "hTINA1-L2 type light chain".

[00438] A sequência de aminoácido da cadeia leve do tipo hTINA1- L2 é descrita na SEQ ID NO: 20 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 20, uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 21 a 129, e uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 130 a 234 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 corresponde à sequência de sinal, a região variável de cadeia leve e a região constante de cadeia leve, respectivamente. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 é descrita na SEQ ID NO: 19 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em nucleotídeos 1 a 60, uma sequência que consiste em nucleotídeos 61 a 387, e uma sequência que consiste em nucleotídeos 388 a 702 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 19 codifica a sequência de sinal, a sequência de região variável de cadeia leve e a sequência de região constante de cadeia leve, respectivamente. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 19, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 são da mesma forma descritas na Figura 7.[00438] The amino acid sequence of the hTINA1-L2 type light chain is described in SEQ ID NO: 20 of the Sequence Listing. A sequence consisting of amino acid residues 1 to 20, a sequence consisting of amino acid residues 21 to 129, and a sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 corresponds to the sequence of signal, the light chain variable region and the light chain constant region, respectively. The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 is described in SEQ ID NO: 19 of the Sequence Listing. A sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 encodes the signal sequence, the region sequence light chain variable and the light chain constant region sequence, respectively. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 are similarly described in Figure 7.

[00439] 6-3-3) Cadeia leve do tipo hTINA1-L3:[00439] 6-3-3) hTINA1-L3 type light chain:

[00440] Uma cadeia leve de TINA1 humanizada projetada envolvendo a substituição da posição de aminoácido 28 (histidina) com prolina, posição de aminoácido 29 (lisina) com serina, posição de aminoácido 30 (fenilalanina) com serina, posição de aminoácido 31 (metionina) com leucina, posição de aminoácido 33 (treonina) com alanina, posição de aminoácido 40 (serina) com treonina, posição de aminoácido 62 (glutamina) com lisina, posição de aminoácido 63 (serina) com glutamina, posição de aminoácido 80 (ácido aspártico) com serina, posição de aminoácido 83 (treonina) com serina, posição de aminoácido 90 (alanina) com ácido aspártico, posição de aminoácido 93 (fenilalanina) com leucina, posição de aminoácido 98 (valina) com leucina, posição de aminoácido 100 (alanina) com prolina, posição de aminoácido 103 (leucina) com fenilalanina, posição de aminoácido 120 (alanina) com glutamina, posição de aminoácido 126 (leucina) com isoleucina, e posição de aminoácido 129 (alanina) com treonina de acordo com a cadeia leve de TINA1 mostrada na SEQ ID NO: 10 da Listagem de Sequência foi designada como uma "cadeia leve do tipo hTINA1-L3".[00440] An engineered humanized TINA1 light chain involving the replacement of amino acid position 28 (histidine) with proline, amino acid position 29 (lysine) with serine, amino acid position 30 (phenylalanine) with serine, amino acid position 31 (methionine ) with leucine, amino acid position 33 (threonine) with alanine, amino acid position 40 (serine) with threonine, amino acid position 62 (glutamine) with lysine, amino acid position 63 (serine) with glutamine, amino acid position 80 (acid aspartic) with serine, amino acid position 83 (threonine) with serine, amino acid position 90 (alanine) with aspartic acid, amino acid position 93 (phenylalanine) with leucine, amino acid position 98 (valine) with leucine, amino acid position 100 (alanine) with proline, amino acid position 103 (leucine) with phenylalanine, amino acid position 120 (alanine) with glutamine, amino acid position 126 (leucine) with isoleucine, and amino acid position 129 (alanine) with threonine according to TINA1 light chain shown in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing has been designated as a "hTINA1-L3 type light chain".

[00441] A sequência de aminoácido da cadeia leve do tipo hTINA1- L3 é descrita na SEQ ID NO: 22 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 1 a 20, uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 21 a 129, e uma sequência que consiste em resíduos de aminoácido 130 a 234 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 corresponde à sequência de sinal, a região variável de cadeia leve e a região constante de cadeia leve, respectivamente. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 é descrita na SEQ ID NO: 21 da Listagem de Sequência. Uma sequência que consiste em nucleotídeos 1 a 60, uma sequência que consiste em nucleotídeos 61 a 387, e uma sequência que consiste em nucleotídeos 388 a 702 na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 21 codifica a sequência de sinal, a sequência de região variável de cadeia leve, e a sequência de região constante de cadeia leve, respectivamente. A sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 21, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 são da mesma forma descritas na Figura 8.[00441] The amino acid sequence of the hTINA1-L3 type light chain is described in SEQ ID NO: 22 of the Sequence Listing. A sequence consisting of amino acid residues 1 to 20, a sequence consisting of amino acid residues 21 to 129, and a sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 corresponds to the sequence of signal, the light chain variable region and the light chain constant region, respectively. The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 is described in SEQ ID NO: 21 of the Sequence Listing. A sequence consisting of nucleotides 1 to 60, a sequence consisting of nucleotides 61 to 387, and a sequence consisting of nucleotides 388 to 702 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 encodes the signal sequence, the region sequence light chain variable, and the light chain constant region sequence, respectively. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 are similarly described in Figure 8.

[00442] Exemplo 7: Construção de vetor de expressão de anticorpo hTINA1e produção de anticorpo[00442] Example 7: Construction of hTINA1 antibody expression vector and antibody production

[00443] 7-1) Construção de vetor de expressão de cadeia pesada de hTINA1[00443] 7-1) Construction of hTINA1 heavy chain expression vector

[00444] 7-1-1) Construção de vetor de expressão de hTINA1-H1[00444] 7-1-1) Construction of hTINA1-H1 expression vector

[00445] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de hTINA1-H1 mostrada nas posições de nucleotídeo 36 a 437 da sequência de nucleotídeo de hTINA1-H1 representadas por SEQ ID NO: 11 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service). Um fragmento de DNA que contém a sequência de DNA que codifica a região variável de hTINA1-H1 foi amplificado usando o fragmento de DNA sintetizado como um padrão, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), e um conjunto de iniciador descrito abaixo, e inserido a um sítio clivado pela enzima de restrição BlpI do vetor de expressão de cadeia pesada do tipo IgG1 quimérico e humanizado pCMA-G1 usando kit de clonagem de PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de hTINA1-H1. O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-G1/hTINA1-H1".[00445] A DNA fragment containing a hTINA1-H1 variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 36 to 437 of the hTINA1-H1 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 of the Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service). A DNA fragment containing the DNA sequence encoding the variable region of hTINA1-H1 was amplified using the synthesized DNA fragment as a template, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), and a described primer set below, and inserted into a BlpI restriction enzyme cleaved site of the chimeric and humanized IgG1 heavy chain expression vector pCMA-G1 using In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.) to construct a vector of hTINA1-H1 expression. The expression vector obtained was designated as "pCMA-G1/hTINA1-H1".

[00446] Conjunto de iniciador 5'-agctcccagatgggtgctgagc-3' (SEQ ID NO: 41: iniciador EG-Inf-F) 5'-gggcccttggtggaggctgagc-3' (SEQ ID NO: 42: iniciador EG1-Inf-R)[00446] Primer set 5'-agctcccagatgggtgctgagc-3' (SEQ ID NO: 41: EG-Inf-F primer) 5'-gggcccttggtggaggctgagc-3' (SEQ ID NO: 42: EG1-Inf-R primer)

[00447] 7-1-2) Construção de vetor de expressão de hTINA1-H2[00447] 7-1-2) Construction of hTINA1-H2 expression vector

[00448] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de hTINA1-H2 mostrada nas posições de nucleotídeo 36 a 437 da sequência de nucleotídeo de hTINA1-H2 representada por SEQ ID NO: 13 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), e um vetor de expressão de hTINA1-H2 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 7-1-1). O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-G1/hTINA1-H2".[00448] A DNA fragment containing a hTINA1-H2 variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 36 to 437 of the hTINA1-H2 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 of the Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), and an hTINA1-H2 expression vector was constructed in the same way as in Example 7-1-1). The expression vector obtained was designated as "pCMA-G1/hTINA1-H2".

[00449] 7-1-3) Construção de vetor de expressão de hTINA1-H3[00449] 7-1-3) Construction of hTINA1-H3 expression vector

[00450] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de hTINA1-H3 mostrada nas posições de nucleotídeo 36 a 437 da sequência de nucleotídeo de hTINA1-H3 representada por SEQ ID NO: 15 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), e um vetor de expressão de hTINA1-H3 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 7-1-1). O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-G1/hTINA1-H3".[00450] A DNA fragment containing a hTINA1-H3 variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 36 to 437 of the hTINA1-H3 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 of the Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), and an hTINA1-H3 expression vector was constructed in the same manner as in Example 7-1-1). The obtained expression vector was designated as "pCMA-G1/hTINA1-H3".

[00451] 7-2) Construção de vetor de expressão de cadeia leve de hTINA1[00451] 7-2) Construction of hTINA1 light chain expression vector

[00452] 7-2-1) Construção de vetor de expressão de hTINA1-L1[00452] 7-2-1) Construction of hTINA1-L1 expression vector

[00453] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de hTINA1-L1 mostrada nas posições de nucleotídeo 38 a 402 da sequência de nucleotídeo de hTINA1-L1 representada por SEQ ID NO: 17 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service). Um fragmento de DNA que contém a sequência de DNA que codifica a região variável de hTINA1-L1 usando o fragmento de DNA sintetizado como um padrão foi amplificado, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), e um conjunto de iniciador descrito abaixo, e inserido a uma sítio clivado pela enzima de restrição BsiWl do vetor de expressão cadeia leve de anticorpo quimérico e humanizado usando kit de clonagem de PCR pCMA-LKusing In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.) para construir um vetor de expressão de hTINA1-L1. O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-LK/hTINA1-L1".[00453] A DNA fragment containing a hTINA1-L1 variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 38 to 402 of the hTINA1-L1 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 of the Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service). A DNA fragment containing the DNA sequence encoding the variable region of hTINA1-L1 using the synthesized DNA fragment as a template was amplified, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), and a primer set described. below, and inserted into a BsiW1 restriction enzyme cleaved site of the chimeric and humanized antibody light chain expression vector using pCMA-LKusing In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.) to construct an expression vector of hTINA1-L1. The expression vector obtained was designated as "pCMA-LK/hTINA1-L1".

[00454] Conjunto de iniciador 5'-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3' (SEQ ID NO: 43: iniciador CM-LKF) 5'-ggagggggcggccaccgtacg-3' (SEQ ID NO: 44: iniciador KCL-Inf-R)[00454] Primer set 5'-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3' (SEQ ID NO: 43: CM-LKF primer) 5'-ggagggggcggccaccgtacg-3' (SEQ ID NO: 44: KCL-Inf-R primer)

[00455] 7-2-2) Construção de vetor de expressão de hTINA1-L2[00455] 7-2-2) Construction of hTINA1-L2 expression vector

[00456] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de hTINA1-L2 mostrada nas posições de nucleotídeo 38 a 402 da sequência de nucleotídeo de hTINA1-L2 representada por SEQ ID NO: 19 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), e um vetor de expressão de hTINA1-L2 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 7-2-1). O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-LK/hTINA1-L2".[00456] A DNA fragment containing a hTINA1-L2 variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 38 to 402 of the hTINA1-L2 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 of the Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), and an hTINA1-L2 expression vector was constructed in the same way as in Example 7-2-1). The obtained expression vector was designated as "pCMA-LK/hTINA1-L2".

[00457] 7-2-3) Construção de vetor de expressão de hTINA1-L3[00457] 7-2-3) Construction of hTINA1-L3 expression vector

[00458] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de hTINA1-L3 mostrada nas posições de nucleotídeo 38 a 402 da sequência de nucleotídeo de hTINA1-L3 representada por SEQ ID NO: 21 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), e um vetor de expressão de hTINA1-L3 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 7-2-1). O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-LK/hTINA1-L3".[00458] A DNA fragment containing a hTINA1-L3 variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 38 to 402 of the hTINA1-L3 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 of the Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), and an hTINA1-L3 expression vector was constructed in the same manner as in Example 7-2-1). The expression vector obtained was designated as "pCMA-LK/hTINA1-L3".

[00459] 7-3) Produção e purificação de anticorpo hTINA1[00459] 7-3) Production and purification of hTINA1 antibody

[00460] 7-3-1) Produção em pequena escala de anticorpo hTINA1[00460] 7-3-1) Small-scale production of hTINA1 antibody

[00461] Cada anticorpo foi produzido da mesma maneira como no Exemplo 5-2-5).[00461] Each antibody was produced in the same manner as in Example 5-2-5).

[00462] O anticorpo hTINA1 obtido pela combinação de pCMA- G1/hTINA1-H1 e pCMA-LK/hTINA1-L1 foi designado como "hTINA1- H1L1"; o anticorpo hTINA1 obtido pela combinação de pCMA- G1/hTINA1-H2 e pCMA-LK/hTINA1-L1 foi designado como "hTINA1- H2L1"; o anticorpo hTINA1 obtido pela combinação de pCMA- G1/hTINA1-H2 e pCMA-LK/hTINA1-L2 foi designado como "hTINA1- H2L2"; e o anticorpo hTINA1 obtido pela combinação de pCMA- G1/hTINA1-H3 e pCMA-LK/hTINA1-L3 foi designado como "hTINA1- H3L3".[00462] The hTINA1 antibody obtained by combining pCMA-G1/hTINA1-H1 and pCMA-LK/hTINA1-L1 was designated as "hTINA1-H1L1"; the hTINA1 antibody obtained by combining pCMA-G1/hTINA1-H2 and pCMA-LK/hTINA1-L1 was designated as "hTINA1-H2L1"; the hTINA1 antibody obtained by combining pCMA-G1/hTINA1-H2 and pCMA-LK/hTINA1-L2 was designated as "hTINA1-H2L2"; and the hTINA1 antibody obtained by combining pCMA-G1/hTINA1-H3 and pCMA-LK/hTINA1-L3 was designated as "hTINA1-H3L3".

[00463] 7-3-2) Produção de anticorpo hTINA1[00463] 7-3-2) Production of hTINA1 antibody

[00464] hTINA1-H1L1, hTINA1-H2L1, hTINA1-H2L2 e hTINA1-H3L3 foram produzidos pelo método seguinte.[00464] hTINA1-H1L1, hTINA1-H2L1, hTINA1-H2L2 and hTINA1-H3L3 were produced by the following method.

[00465] Células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) foram subcultivadas e cultivadas de acordo com o manual. 1,2 x 109 células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) na fase de crescimento logarítmica foram semeadas em Frasco Fernbach Erlenmeyer de 3 L (Corning Inc.), em seguida diluídas com um meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) a 1,0 x 106 células/ml, e em seguida cultivadas por agitação a 90 rpm durante 1 hora em uma incubadora de CO2 a 8% de 37°C. Polietilenoimina (Poliscience #24765; 3,6mg) foi dissolvida em Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 20 ml). Em seguida, o vetor de expressão de cadeia leve (0,8 mg), e o vetor de expressão de cadeia pesada (0,4 mg) preparados usando kit de Plasmídeo PureLink HiPure (Invitrogen Corp.) foram adicionados a Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 20 ml). A solução mista de vetor de expressão/Opti-Pro SFM (20 ml) foi adicionada à solução mista de polietilenoimina/Opti-Pro SFM (20 ml), e a mistura foi agitada suavemente, também deixada durante 5 minutos, e em seguida adicionada às Células FreeStyle 293F. Um sobrenadante de cultura obtido por cultura por agitação a 90 rpm durante 7 dias em uma incubadora de CO2 a 8% de 37°C foi filtrado por Filtro de Cápsula Disponível (ADVANTEC #CCS-045-E1H).[00465] FreeStyle 293F cells (Invitrogen Corp.) were subcultured and cultured according to the manual. 1.2 x 10 FreeStyle 293F cells (Invitrogen Corp.) in the logarithmic growth phase were seeded in a 3 L Fernbach Erlenmeyer Flask (Corning Inc.), then diluted with FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen Corp.) to 1 .0 x 106 cells/ml, and then cultured by shaking at 90 rpm for 1 hour in a 37°C 8% CO2 incubator. Polyethyleneimine (Poliscience #24765; 3.6 mg) was dissolved in Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 20 ml). Then, the light chain expression vector (0.8 mg), and the heavy chain expression vector (0.4 mg) prepared using PureLink HiPure Plasmid kit (Invitrogen Corp.) were added to Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 20 ml). The expression vector/Opti-Pro SFM mixed solution (20 ml) was added to the polyethyleneimine/Opti-Pro SFM mixed solution (20 ml), and the mixture was gently stirred, also left for 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F Cells. A culture supernatant obtained by shaking culture at 90 rpm for 7 days in an 8% CO2 incubator at 37°C was filtered by Available Capsule Filter (ADVANTEC #CCS-045-E1H).

[00466] 7-3-3) Purificação de anticorpo hTINA1[00466] 7-3-3) Purification of hTINA1 antibody

[00467] Cada anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido em 7-3-2) acima por duas etapas usando cromatografia de afinidade de rProteína A (4 a 6°C) e hidroxiapatita cerâmica (temperatura ambiente). As etapas de substituição de tampão depois da purificação por cromatografia de afinidade de rProteína A e depois da purificação por hidroxiapatita cerâmica foram realizadas a 4 a 6°C. Primeiro, o sobrenadante de cultura foi aplicado a MabSelect Sure (fabricado por GE Healthcare Japan Corporation, coluna HiTrap) equilibrada com PBS. Depois da entrada do sobrenadante de cultura inteiro na coluna, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade pelo menos duas vezes o volume da coluna. Em seguida, frações contendo anticorpo foram coletadas por eluição com solução de cloridrato de arginina a 2 M (pH 4,0). As frações foram substituídas por tampão com PBS por diálise (Thermo Fisher Scientific, Inc., Slide-A- Lyzer Dialysis Cassete), e em seguida diluídas 5 vezes com um tampão de fosfato de sódio a 5 mM e MES a 50 mM (pH 7.0). A solução de anticorpo resultante foi aplicada a uma coluna de hidroxiapatita cerâmica (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHTType-I Hydroxyapatite Column) equilibrada com um tampão de NaPi a 5 mM, MES a 50 mM e NaCl a 30 mM (pH 7.0). As frações contendo anticorpo foram coletadas por eluição de gradiente de concentração linear usando cloreto de sódio. As frações foram substituídas por tampão com HBSor (histidina a 25 mM/sorbitol a 5%, pH 6.0) por diálise (Thermo Fisher Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassete). Finalmente, as frações foram concentradas e ajustadas a uma concentração de IgG de 20 mg/ml ou mais alto usando Dispositivo de Filtro Centrífugo UF VIVASPIN 20 (redução de peso molecular: UF10K, Sartorius AG, 4°C), e usadas como uma amostra purificada.[00467] Each antibody was purified from the culture supernatant obtained in 7-3-2) above by two steps using rProtein A affinity chromatography (4 to 6°C) and ceramic hydroxyapatite (room temperature). The buffer replacement steps after rProtein A affinity chromatography purification and after ceramic hydroxyapatite purification were carried out at 4 to 6°C. First, the culture supernatant was applied to MabSelect Sure (manufactured by GE Healthcare Japan Corporation, HiTrap column) equilibrated with PBS. After the entire culture supernatant was entered into the column, the column was washed with PBS in an amount at least twice the column volume. Then, antibody-containing fractions were collected by elution with 2 M arginine hydrochloride solution (pH 4.0). Fractions were buffer replaced with PBS for dialysis (Thermo Fisher Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), and then diluted 5-fold with a buffer of 5 mM sodium phosphate and 50 mM MES (pH 7.0). The resulting antibody solution was applied to a ceramic hydroxyapatite column (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHTType-I Hydroxyapatite Column) equilibrated with a buffer of 5 mM NaPi, 50 mM MES, and 30 mM NaCl. (pH 7.0). Antibody-containing fractions were collected by linear concentration gradient elution using sodium chloride. Fractions were buffer replaced with HBSor (25 mM histidine/5% sorbitol, pH 6.0) by dialysis (Thermo Fisher Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). Finally, the fractions were concentrated and adjusted to an IgG concentration of 20 mg/ml or higher using UF VIVASPIN 20 Centrifugal Filter Device (molecular weight reduction: UF10K, Sartorius AG, 4°C), and used as a sample purified.

[00468] Exemplo de Referência 1: Produção de vetor de expressão de anticorpo hRS7e produção de anticorpo[00468] Reference Example 1: Production of hRS7 antibody expression vector and antibody production

[00469] O anticorpo hRS7 foi produzido com base nas sequências de aminoácido de uma cadeia leve e uma cadeia pesada descritas na Publicação Internacional No. WO 2003/074566.[00469] The hRS7 antibody was produced based on the amino acid sequences of a light chain and a heavy chain described in International Publication No. WO 2003/074566.

(1) Construction of hRS7 antibody heavy chain expression vector

[00470] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de cadeia pesada de anticorpo hRS7 mostrada nas posições de nucleotídeo 36 a 437 da sequência de nucleotídeo da cadeia pesada de anticorpo hRS7 representada por SEQ ID NO: 29 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), e um vetor de expressão de cadeia pesada de anticorpo hRS7 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 7-1-1). O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA-G1/hRS7". A sequência de aminoácido da cadeia pesada de anticorpo hRS7 é mostrada na SEQ ID NO: 30 da Listagem de Sequência.[00470] A DNA fragment containing an hRS7 antibody heavy chain variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 36 to 437 of the hRS7 antibody heavy chain nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 of Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), and an hRS7 antibody heavy chain expression vector was constructed in the same manner as in Example 7-1-1). The expression vector obtained was designated as "pCMA-G1/hRS7". The amino acid sequence of the hRS7 antibody heavy chain is shown in SEQ ID NO: 30 of the Sequence Listing.

(1) Construction of hRS7 antibody light chain expression vector

[00471] Um fragmento de DNA que contém uma sequência de DNA de codificação de região variável de cadeia leve de anticorpo hRS7 mostrada nas posições de nucleotídeo 38 a 402 da sequência de nucleotídeo da cadeia leve de anticorpo hRS7 representada por SEQ ID NO: 31 da Listagem de Sequência foi sintetizado (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), e um vetor de expressão de cadeia leve de anticorpo hRS7 foi construído da mesma maneira como no Exemplo 72-1). O vetor de expressão obtido foi designado como "pCMA- LK/hRS7". A sequência de aminoácido da cadeia pesada de anticorpo hRS7 é mostrada na SEQ ID NO: 32 da Listagem de Sequência.[00471] A DNA fragment containing an hRS7 antibody light chain variable region coding DNA sequence shown at nucleotide positions 38 to 402 of the hRS7 antibody light chain nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 of Sequence Listing was synthesized (GeneArt Artificial Gene Synthesis service), and an hRS7 antibody light chain expression vector was constructed in the same manner as in Example 72-1). The expression vector obtained was designated as "pCMA-LK/hRS7". The amino acid sequence of the hRS7 antibody heavy chain is shown in SEQ ID NO: 32 of the Sequence Listing.

(1) Production and purification of hRS7 antibody

[00472] 1-3-1) Produção de anticorpo hRS7[00472] 1-3-1) Production of hRS7 antibody

[00473] O anticorpo hRS7 foi produzido da mesma maneira como no Exemplo 7-3-2) pela combinação de pCMA-G1/hRS7 e pCMA- LK/hRS7.[00473] The hRS7 antibody was produced in the same way as in Example 7-3-2) by combining pCMA-G1/hRS7 and pCMA-LK/hRS7.

[00474] 1-3-2) Purificação de anticorpo hRS7[00474] 1-3-2) Purification of hRS7 antibody

[00475] O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido em 1-3-1) da mesma maneira como no Exemplo 7-3-3).[00475] The antibody was purified from the culture supernatant obtained in 1-3-1) in the same way as in Example 7-3-3).

[00476] Exemplo 8: Medida de afinidade de ligação de antígeno de anticorpo hTINA1 e anticorpo hRS7[00476] Example 8: Measurement of antigen binding affinity of hTINA1 antibody and hRS7 antibody

[00477] 8-1) Medida de afinidade de ligação de antígeno usando anticorpo (sobrenadante de cultura) produziu em pequena escala[00477] 8-1) Measurement of antigen binding affinity using antibody (culture supernatant) produced on a small scale

[00478] Cada anticorpo foi analisado quanto a sua constante de dissociação para um antígeno (quimera de Fc de TROP-2 Humana Recombinante) usando Biacore 3000 (GE Healthcare Japan Corporation) pelo método de captura de capturar o anticorpo como um ligante em um anticorpo de IgG(Fab) anti-humano imobilizado e analisar o antígeno como um analisado. Cerca de 2000 RU do anticorpo de IgG(Fab) anti-humano (kit de captura de Fab Humano, GE Healthcare Japan Corporation) foi covalentemente ligado a um chip de sensor CM5 (BIAcore, Inc.) pelo método de acoplamento de amina. Similarmente, este anticorpo foi imobilizado em uma célula de fluxo de referência. O tampão fluente usado foi HBS-EP+ (HEPES a 10 mM pH 7.4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, Tensoativo P20 a 0,05%). O sobrenadante de cultura que contém o anticorpo foi adicionado durante 80 segundos no chip imobilizado por anticorpo de IgG(Fab) anti-humano, e em seguida diluições seriais (1 a 1000 nM) do antígeno foram cada qual adicionadas a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 300 segundos. Subsequentemente, a fase de dissociação foi monitorada durante 600 segundos. Gly-HCl a 10 mM (pH 1,5) contendo DMSO a 20% foi adicionado a isto como uma solução regenerando a uma taxa de fluxo de 10 μl/min durante 60 segundos. Os dados foram analisados usando o modelo de ligação Bivalente de software analítico (software BIAevaluation, versão 4.1) para calcular uma constante de taxa de associação kon, uma constante de taxa de dissociação koff, e uma constante de dissociação (KD; KD = koff/kon). Tabela 1 [00478] Each antibody was analyzed for its dissociation constant for an antigen (Recombinant Human TROP-2 Fc chimera) using Biacore 3000 (GE Healthcare Japan Corporation) by the capture method of capturing the antibody as a ligand in an antibody of immobilized anti-human IgG(Fab) and analyze the antigen as an analyte. About 2000 RU of anti-human IgG(Fab) antibody (Human Fab capture kit, GE Healthcare Japan Corporation) was covalently linked to a CM5 sensor chip (BIAcore, Inc.) by the amine coupling method. Similarly, this antibody was immobilized on a reference flow cell. The flowing buffer used was HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20). The culture supernatant containing the antibody was added for 80 seconds to the anti-human IgG(Fab) antibody-immobilized chip, and then serial dilutions (1 to 1000 nM) of the antigen were each added to it at a rate of flow of 30 μL/min for 300 seconds. Subsequently, the dissociation phase was monitored for 600 seconds. 10 mM Gly-HCl (pH 1.5) containing 20% DMSO was added to this as a regenerating solution at a flow rate of 10 μl/min for 60 seconds. Data were analyzed using the Bivalent Binding Model analytical software (BIAevaluation software, version 4.1) to calculate an association rate constant kon, a dissociation rate constant koff, and a dissociation constant (KD; KD = koff/ kon). Table 1

[00479] Atividade de ligação usando sobrenadante de cultura como amostra de anticorpo[00479] Binding activity using culture supernatant as antibody sample

[00480] 8-2) Medida de afinidade de ligação de antígeno usando anticorpo purificado[00480] 8-2) Measurement of antigen binding affinity using purified antibody

[00481] Cada anticorpo foi analisado quanto a sua constante de dissociação para um antígeno (quimera de Fc de TROP-2 Humana Recombinante) usando Biacore 3000 (GE Healthcare Japan Corporation) pelo método de captura de capturar o anticorpo como um ligante em um anticorpo de IgG(Fab) anti-humano imobilizado e analisar o antígeno como um analisado. Cerca de 2000 RU do anticorpo de IgG(Fab) anti-humano (kit de captura de Fab Humano, GE Healthcare Japan Corporation) foram covalentemente ligados a um chip de sensor CM5 (BIAcore, Inc.) pelo método de acoplamento de amina. Similarmente, este anticorpo foi imobilizado em uma célula de fluxo de referência. O tampão fluente usado foi HBS-EP+ (HEPES a 10 mM pH 7.4, NaCl a 0,15 M, EDTA a 3 mM, 0,05% de Tensoativo P20). O anticorpo foi adicionado durante 1 min no chip imobilizado por anticorpo de IgG(Fab) anti-humano, e em seguida diluições seriais (1 a 1000 nM) do antígeno foram cada qual adicionadas a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 300 segundos. Subsequentemente, a fase de dissociação foi monitorada durante 600 segundos. NaOH a 25 mM diluído com um tampão fluente foi adicionado duas vezes a isto como uma solução de regeneração a uma taxa de fluxo de 100 μl/min durante 3 segundos. Os dados foram analisados da mesma maneira como acima. Tabela 2 [00481] Each antibody was analyzed for its dissociation constant for an antigen (Recombinant Human TROP-2 Fc chimera) using Biacore 3000 (GE Healthcare Japan Corporation) by the capture method of capturing the antibody as a ligand in an antibody of immobilized anti-human IgG(Fab) and analyze the antigen as an analyte. About 2000 RU of anti-human IgG(Fab) antibody (Human Fab capture kit, GE Healthcare Japan Corporation) was covalently linked to a CM5 sensor chip (BIAcore, Inc.) by the amine coupling method. Similarly, this antibody was immobilized on a reference flow cell. The flowing buffer used was HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20). The antibody was added for 1 min to the anti-human IgG(Fab) antibody-immobilized chip, and then serial dilutions (1 to 1000 nM) of the antigen were each added to it at a flow rate of 30 μL/min. for 300 seconds. Subsequently, the dissociation phase was monitored for 600 seconds. 25 mM NaOH diluted with a flowing buffer was added twice to this as a regeneration solution at a flow rate of 100 μl/min for 3 seconds. Data were analyzed in the same way as above. Table 2

[00482] Medida de atividade de ligação usando anticorpo purificado como amostra de anticorpo[00482] Measurement of binding activity using purified antibody as antibody sample

[00483] Exemplo 9: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (1) Fórmula 25 [00483] Example 9: Production of hTINA1-H1L1 ADC (1) Formula 25

[00484] Processo 1: (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)carbamato de terc-butila[00484] Process 1: (4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 tert-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)carbamate butyl

[00485] Ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL), N-hidroxisSuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,216 g, 1,13 mmol) foram adicionados e agitados durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetilformamida (10 mL) carregada com exatecanomesilato (0,500 g, 0,94 mmol) e trietilamina (0,157 mL, 1,13 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante 1 dia. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado (0,595 g, quantitativo).[00485] 4-(tert-Butoxycarbonylamino)butanoic acid (0.237 g, 1.13 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 mL), N-hydroxysuccinimide (0.130 g, 1.13 mmol) and 1-ethyl-3 hydrochloride -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (0.216 g, 1.13 mmol) was added and stirred for 1 hour. The reaction solution was added dropwise to a solution of N,N-dimethylformamide (10 mL) loaded with exatecanomesylate (0.500 g, 0.94 mmol) and triethylamine (0.157 mL, 1.13 mmol) and stirred at room temperature. for 1 day. The solvent was removed under reduced pressure, and the obtained residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 8 : 2 (v/v)] to yield the titled compound (0.595 g, quantitative).

[00486] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J=7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J=7,2 Hz), 1,89-1,82 (2H, m), 2,12-2,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J=8,6 Hz).[00486] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J =7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J=7.2 Hz), 1.89-1.82 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2 .39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J=6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5 .24 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 ( 1H, t, J=6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.40 (1H, d, J=8.6 Hz).

[00487] MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+.[00487] MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+.

[00488] Processo 2: Trifluoroacetato de 4-amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5- fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanoamida[00488] Process 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10 trifluoroacetate ,13,15-hexahydro-1H,12H- benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]butanoamide

[00489] O composto (0,388 g, 0,61 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (9 mL). Ácido trifluoroacético (9 mL) foi adicionado, e foi agitado durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado (0,343 g, quantitativo).[00489] The compound (0.388 g, 0.61 mmol) obtained in Process 1 above was dissolved in dichloromethane (9 mL). Trifluoroacetic acid (9 mL) was added, and stirred for 4 hours. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue obtained was purified by column chromatography on silica gel [chloroform - divided organic layer of chloroform : methanol : water = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] to produce the titrated compound (0.343 g, quantitative).

[00490] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79-1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz).[00490] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2 .17 (2H, m), 2.27 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.80-2.86 (2H, m), 3.15- 3.20 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.72 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J= 11.0 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).

[00491] MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+.[00491] MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+.

[00492] Processo 3: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N- (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida[00492] Process 3: N-(tert-Butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanyl-N- (4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide

[00493] N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) foi dissolvido em diclorometano (3 mL), N- hidroxisSuccinimida (0,021 g, 0,19 mol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,036 g, 0,19 mmol) foram adicionados, e em seguida agitados durante 3,5 horas. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N- dimetilformamida (1,5 mL) carregada com o composto (0,080 g, 0,15 mmol) obtido no Processo 2 acima, e agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto titulado (0,106 g, 73%).[00493] N-(tert-Butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanylglycine (0.081 g, 0.19 mmol) was dissolved in dichloromethane (3 mL), N-hydroxysuccinimide (0.021 g, 0.19 mol) and 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (0.036 g, 0.19 mmol) was added, and then stirred for 3.5 hours. The reaction solution was added dropwise to a solution of N,N-dimethylformamide (1.5 mL) loaded with the compound (0.080 g, 0.15 mmol) obtained in Process 2 above, and stirred at room temperature for 4 hours. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue obtained was purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 8 : 2 (v/v)] to yield the titled compound (0.106 g, 73%).

[00494] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J=7,8 Hz), 2,15-2,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,1, 4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,16-3,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J=5,9 Hz), 3,573,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz).[00494] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J=12, 7, 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3.16-3.19 (2H , m), 3.54 (2H, d, J=5.9 Hz), 3,573.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 ( 1H, s), 7.00 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t , J=5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J =8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.2 Hz).

[00495] MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+.[00495] MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+.

[00496] Processo 4: Trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida[00496] Process 4: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2 trifluoroacetate ,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino }-4-oxobutyl)glycinamide

[00497] O composto (1,97 g, 2,10 mmol) obtido no Processo 3 acima foi dissolvido em diclorometano (7 mL). Depois de adicionar ácido trifluoroacético (7 mL), foi agitado durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e foi carregado com tolueno por destilação azeotrópica. Os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado (1,97 g, 99%).[00497] The compound (1.97 g, 2.10 mmol) obtained in Process 3 above was dissolved in dichloromethane (7 mL). After adding trifluoroacetic acid (7 ml), it was stirred for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and charged with toluene by azeotropic distillation. The residues obtained were purified by column chromatography on silica gel [chloroform - divided organic layer of chloroform : methanol : water = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] to produce the title compound (1.97 g, 99 %).

[00498] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J=5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,555,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78-7,81 (2H, m), 7,95 7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m).[00498] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1 .90 (2H, m), 2.12-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.03-3.09 (3H, m), 3.18-3.19 (2H, m), 3.58-3.60 (2H, m), 3.64 (1H, d, J=5 .9 Hz), 3.69 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J=16.8 , 5.9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz ), 5.42 (2H, s), 5.555.60 (1H, m), 7.17-7.27 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.78-7.81 ( 2H, m), 7.95 7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m).

[00499] MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+.[00499] MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+.

[00500] Processo 5: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol- 1-il)propanoil]amino}etóxi)etóxi]propanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida[00500] Process 5: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanoyl]amino}ethoxy) ethoxy]propanoyl}glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9 ,10,13,15- hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-yl]amino}-4- oxobutyl)glycinamide

[00501] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (1,20 mL) do composto (100 mg, 0,119 mmol) obtido no Processo 4 acima, di- isopropiletilamina (20,8 μL, 0,119 mmol) e N-Succinimidil 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato (50,7 mg, 0,119 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 5: 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (66,5 mg, 48%).[00501] In a solution of N,N-dimethylformamide (1.20 mL) of the compound (100 mg, 0.119 mmol) obtained in Process 4 above, diisopropylethylamine (20.8 μL, 0.119 mmol) and N-Succinimidyl 3 -(2-(2-(3-maleinimidepropanamide)ethoxy)ethoxy)propanoate (50.7 mg, 0.119 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 5:1 (v/v)] to yield the title compound as a pale yellow solid (66. 5mg, 48%).

[00502] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, t, J = 7,4 Hz), 1,65-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,07-2,19 (4H, m), 2,30 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,33-2,36 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J = 13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,18 (9H, m), 3,42-3,44 (4H, m), 3,53-3,76 (10H, m), 4,43 (1H, td, J = 8,6, 4,7 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,17 (1H, m), 7,18-7,25 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J = 5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J = 11,3 Hz), 7,988,03 (2H, m), 8,11 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J = 5,9 Hz), 8,44 (1H, d, J = 9,0 Hz).[00502] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1 .90 (2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 ( 4H, m), 3.53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J = 8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18, 8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J = 17.2 Hz ), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m), 7.18- 7.25 (4H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 11.3 Hz), 7,988.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.44 (1H, d, J = 9.0 Hz).

[00503] MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+.[00503] MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+.

[00504] Processo 6: Conjugado de anticorpo-fármaco (1)[00504] Process 6: Antibody-drug conjugate (1)

[00505] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (10,0 mL) foi coletada em um tubo de 50 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,317 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,500 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando- se a 37°C durante 1 hora.[00505] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (10.0 mL) was collected in a 50 mL tube and charged with 10 mM TCEP aqueous solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. ) (0.317 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.500 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00506] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água em temperatura ambiente, um dimetil sulfóxido (0,567 mL) foi adicionado a isto. Subsequentemente, uma solução de dimetil sulfóxido contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 acima (0,635 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,127 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante outros 20 minutos.[00506] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a water bath at room temperature, a dimethyl sulfoxide (0.567 mL) was added to it. Subsequently, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 above (0.635 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) was added to this and stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug linker to the antibody at room temperature for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.127 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for another 20 minutes.

[00507] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 35,0 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00507] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 35.0 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00508] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (SD,280 = 4964 (valor médio medido) e SD,370 = 18982 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00508] Physicochemical Characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (SD,280 = 4964 (average measured value) and SD,370 = 18982 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00509] Concentração de anticorpo: 2,70 mg/mL, rendimento de anticorpo: 94,5 mg (95%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medida pelo Procedimento comum E: 6,6.[00509] Antibody concentration: 2.70 mg/mL, antibody yield: 94.5 mg (95%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 6, 6.

[00510] Exemplo 10: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (2) Fórmula 26 [00510] Example 10: Production of hTINA1-H1L1 ADC (2) Formula 26

[00511] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (2)[00511] Process 1: Antibody-drug conjugate (2)

[00512] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (2,00 mL) foi coletada em um tubo de 4 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM de (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0690 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,100 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando- se a 37°C durante 1 hora.[00512] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (2.00 mL) was collected in a 4 mL tube and charged with a 10 mM TCEP aqueous solution from (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .) (0.0690 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.100 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00513] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,127 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 do Exemplo 9 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0190 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00513] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.127 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 9 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0190 mL; 13.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred using a tube rotator to terminate the reaction. drug binder at room temperature for 20 minutes.

[00514] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 9,00 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00514] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 9.00 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00515] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (SD,280 = 4964 (valor médio medido) e SD,370 = 18982 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00515] Physicochemical Characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (SD,280 = 4964 (average measured value) and SD,370 = 18982 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00516] Concentração de anticorpo: 2,08 mg/mL, rendimento de anticorpo: 18,7 mg (94%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 6,1.[00516] Antibody concentration: 2.08 mg/mL, antibody yield: 18.7 mg (94%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 6, 1.

[00517] Exemplo 11: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (3) Fórmula 27 [00517] Example 11: Production of hTINA1-H1L1 ADC (3) Formula 27

[00518] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (3)[00518] Process 1: Antibody-drug conjugate (3)

[00519] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (5,0 mL) foi coletada em um recipiente de 15 mL, carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0813 mL) com agitação, e em seguida agitada a 37°C durante 10 minutos. Depois de adicionar a isto uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0745 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) com agitação, e em seguida confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida por agitação a 37°C durante 1 hora.[00519] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (5.0 mL) was collected in a 15 mL container, charged with a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0813 mL) with stirring, and then stirred at 37°C for 10 minutes. After adding to this an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0745 mL; 2.3 equivalents per antibody molecule) with stirring, and then confirming that the solution had pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by stirring at 37°C for 1 hour.

[00520] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de agitar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,162 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 do Exemplo 9 foi gradualmente adicionada gota a gota a isto e agitada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0418 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00520] Conjugation between antibody and drug ligand: After stirring the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.162 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 9 was gradually added dropwise thereto and stirred to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0418 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at temperature environment for 20 minutes.

[00521] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 21,0 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00521] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 21.0 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00522] Caracterização físico-química: Usando os Procedimentos comuns E e F descritos no Método de produção 1 (SD,280 = 4964 (valor médio medido) e SD,370 = 18982 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00522] Physicochemical characterization: Using common Procedures E and F described in Production Method 1 (SD,280 = 4964 (measured mean value) and SD,370 = 18982 (measured mean value) were used), the characteristic values following were obtained.

[00523] Concentração de anticorpo: 2,19 mg/mL, rendimento de anticorpo: 46,0 mg (92%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 3,6 e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 3,6.[00523] Antibody concentration: 2.19 mg/mL, antibody yield: 46.0 mg (92%), average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 3.6 and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure F: 3.6.

[00524] Exemplo 12: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (4) Fórmula 28 [00524] Example 12: Production of hTINA1-H1L1 ADC (4) Formula 28

[00525] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (4)[00525] Process 1: Antibody-drug conjugate (4)

[00526] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10,0 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (5,00 mL) foi coletada em um recipiente de 15 mL, carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0813 mL) com agitação, e em seguida agitada a 37°C durante 10 minutos. Depois de adicionar a isto uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,162 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) com agitação, e em seguida confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida por agitação a 37°C durante 1 hora.[00526] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10.0 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1. 54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (5.00 mL) was collected in a 15 mL container, charged with a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0813 mL) with stirring, and then stirred at 37°C for 10 minutes. After adding to this an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.162 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) with stirring, and then confirming that the solution had a pH of 7 .0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge moiety in the antibody was reduced by stirring at 37°C for 1 hour.

[00527] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de agitar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,389 mL; 12,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 do Exemplo 9 foi gradualmente adicionada gota a gota a isto e agitada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0418 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00527] Conjugation between antibody and drug ligand: After stirring the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.389 mL; 12.0 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 9 was gradually added dropwise thereto and stirred to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0418 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at temperature environment for 20 minutes.

[00528] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 21,0 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00528] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 21.0 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00529] Caracterização físico-química: Usando os Procedimentos comuns E e F descritos no Método de produção 1 (SD,280 = 4964 (valor médio medido) e SD,370 = 18982 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00529] Physicochemical characterization: Using common Procedures E and F described in Production Method 1 (SD,280 = 4964 (measured mean value) and SD,370 = 18982 (measured mean value) were used), the characteristic values following were obtained.

[00530] Concentração de anticorpo: 2,19 mg/mL, rendimento de anticorpo: 46,0 mg (92%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 7,0, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 7,0.[00530] Antibody concentration: 2.19 mg/mL, antibody yield: 46.0 mg (92%), average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 7.0 , and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure F: 7.0.

[00531] Exemplo de Referência 13: Produção de ADC de hRS7 (5) Fórmula 29 [00531] Reference Example 13: Production of ADC from hRS7 (5) Formula 29

[00532] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (5)[00532] Process 1: Antibody-drug conjugate (5)

[00533] Redução do anticorpo: O hRS7 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,56 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (2,0 mL) foi coletada em um tubo de 4 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM de (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0690 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,100 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando- se a 37°C durante 1 hora.[00533] Antibody Reduction: The hRS7 produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.56 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (2.0 mL) was collected in a 4 mL tube and charged with a 10 mM TCEP aqueous solution from (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .) (0.0690 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.100 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00534] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,127 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 do Exemplo 9 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0190 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00534] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.127 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 9 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0190 mL; 13.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred using a tube rotator to terminate the reaction. drug binder at room temperature for 20 minutes.

[00535] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 9,00 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00535] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 9.00 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00536] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (SD,280 = 4964 (valor médio medido) e SD,370 = 18982 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00536] Physicochemical Characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (SD,280 = 4964 (average measured value) and SD,370 = 18982 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00537] Concentração de anticorpo: 2,04 mg/mL, rendimento de anticorpo: 18,4 mg (92%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 6,2.[00537] Antibody concentration: 2.04 mg/mL, antibody yield: 18.4 mg (92%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 6, two.

[00538] Exemplo 14: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (6) Fórmula 30 [00538] Example 14: Production of hTINA1-H1L1 ADC (6) Formula 30

[00539] Processo 1: Acetato de ({N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicil}amino)metila[00539] Process 1: ({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methyl acetate

[00540] Em uma mistura contendo N-9- fluorenilmetoxicarbonilglicilglicina (4,33 g, 12,2 mmol), tetra- hidrofurano (120 ml), e tolueno (40,0 ml), piridina (1,16 ml, 14,7 mmol) e tetraacetato de chumbo (6,84 g, 14,7 mmol) foram adicionados e aquecidos sob refluxo durante 5 horas. Depois que a solução de reação foi resfriada em temperatura ambiente, os insolúveis foram removidos por filtração por Celite e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em acetato de etila e lavados com água e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada em sulfato de magnésio anidroso. Depois que o solvente foi removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [hexano : acetato de etila = 9 : 1 (v/v) - acetato de etila] para produzir o composto titulado como um sólido incolor (3,00 g, 67%).[00540] In a mixture containing N-9-fluorenylmethoxycarbonylglycylglycine (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahydrofuran (120 ml), and toluene (40.0 ml), pyridine (1.16 ml, 14, 7 mmol) and lead tetraacetate (6.84 g, 14.7 mmol) were added and heated under reflux for 5 hours. After the reaction solution was cooled to room temperature, insolubles were removed by Celite filtration and concentrated under reduced pressure. The residues obtained were dissolved in ethyl acetate and washed with water and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After the solvent was removed under reduced pressure, the residues obtained were purified by column chromatography on silica gel [hexane : ethyl acetate = 9 : 1 (v/v) - ethyl acetate] to produce the title compound as a solid colorless (3.00 g, 67%).

[00541] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ: 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J=5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J=7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J=6,6 Hz), 5,26 (2H, d, J=7,0 Hz), 5,32 (1H, brs), 6,96 (1H, brs), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J=7,3 Hz), 7,77 (2H, d, J=7,3 Hz).[00541] 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J=5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J=7 .0 Hz), 4.46 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J=7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 ( 1H, brs), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J=7.3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.3 Hz).

[00542] Processo 2: [({N-[(9H-Fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicil}amino)metóxi]acetato de benzila[00542] Process 2: [({N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]benzyl acetate

[00543] Em uma solução de tetra-hidrofurano (40,0 mL) do composto (3,68 g, 10,0 mmol) obtido no Processo 1 acima e glicolato de benzila (4,99 g, 30,0 mmol), terc-butóxido de potássio (2,24 g, 20,0 mmol) foi adicionado a 0°C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com acetato de etila e água a 0°C e extraída com acetato de etila e clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em dioxano (40,0 mL) e água (10,0 mL), carregados com hidrogenocarbonato de sódio (1,01 g, 12,0 mmol) e cloroformiato de 9- fluorenilmetila (2,59 g, 10,0 mmol), e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregada com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi secada em sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto titulado em substância oleosa incolor (1,88 g, 40%).[00543] In a solution of tetrahydrofuran (40.0 mL) of the compound (3.68 g, 10.0 mmol) obtained in Process 1 above and benzyl glycolate (4.99 g, 30.0 mmol), Potassium tert-butoxide (2.24 g, 20.0 mmol) was added at 0°C and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction solution was charged with ethyl acetate and water at 0°C and extracted with ethyl acetate and chloroform. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure. The residues obtained were dissolved in dioxane (40.0 mL) and water (10.0 mL), loaded with sodium hydrogencarbonate (1.01 g, 12.0 mmol) and 9-fluorenylmethyl chloroformate (2.59 g, 10.0 mmol), and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction solution was charged with water and extracted with ethyl acetate. The organic layer obtained was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure, and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [hexane : ethyl acetate = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] to produce the title compound in colorless oily substance (1.88 g, 40%).

[00544] 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ: 3,84 (2H, d, J=5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J=6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J=6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,155,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, brs), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J=7,4 Hz).[00544] 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.84 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J=6.5 Hz), 4.49 ( 2H, d, J=6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.155.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 ( 1H, brs), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.79 (2H, d, J=7.4 Hz).

[00545] Processo 3: Ácido [({N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicil}amino)metóxi]acético[00545] Process 3: [({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]acetic acid

[00546] O composto (1,88 g, 3,96 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em etanol (40,0 mL) e acetato de etila (20,0 ml). Depois de adicionar catalisador de carbono de paládio (376 mg), foi agitado sob atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas. Os insolúveis foram removidos por filtração por Celite, e o solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto titulado como um sólido incolor (1,52 g, quantitativo).[00546] The compound (1.88 g, 3.96 mmol) obtained in Process 2 above was dissolved in ethanol (40.0 ml) and ethyl acetate (20.0 ml). After adding palladium carbon catalyst (376 mg), it was stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature for 2 hours. Insolubles were removed by Celite filtration, and the solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a colorless solid (1.52 g, quantitative).

[00547] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3,62 (2H, d, J=6,3 Hz), 3,97 (2H, s), 4,18-4,32 (3H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 7,29-7,46 (4H, m), 7,58 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,72 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,90 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,71 (1H, t, J=6,5 Hz).[00547] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.62 (2H, d, J=6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H , m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J=5.9 Hz), 7 .72 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J=6.5 Hz).

[00548] Processo 4: (2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]amino}-2-oxoetil)carbamato de 9H-Fluoren-9-ilmetila[00548] Process 4: (2-{[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9, 10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy 9H-Fluoren-9-ylmethyl )methyl]amino}-2-oxoethyl)carbamate

[00549] Sob resfriamento com gelo, a uma solução de N,N- dimetilformamida (10,0 mL) de mesilato de exatecano (0,283 g, 0,533 mmol), N-hidroxisSuccinimida (61,4 mg, 0,533 mmol), e o composto (0,205 g, 0,533 mmol) obtido no Processo 3 acima, N,N-di- isopropiletilamina (92,9 μL, 0,533 mmol) e N,N'-dicicloexilcarbodiimida (0,143 g, 0,693 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido marrom pálido (0,352 g, 82%).[00549] Under ice cooling, to a solution of N,N-dimethylformamide (10.0 mL) exatecan mesylate (0.283 g, 0.533 mmol), N-hydroxysuccinimide (61.4 mg, 0.533 mmol), and the compound (0.205 g, 0.533 mmol) obtained in Process 3 above, N,N-diisopropylethylamine (92.9 μL, 0.533 mmol) and N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0.143 g, 0.693 mmol) were added and stirred at temperature environment for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure, and the residues obtained were purified by column chromatography on silica gel [chloroform - divided organic layer of chloroform : methanol : water = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] to produce the compound titrated as a pale brown solid (0.352 g, 82%).

[00550] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,81 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,73-1,87 (2H, m), 2,06-2,20 (2H, m), 2,34 (3H, s), 3,01-3,23 (2H, m), 3,58 (2H, d, J=6,7 Hz), 3,98 (2H, s), 4,13-4,25 (3H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,09-5,22 (2H, m), 5,32-5,42 (2H, m), 5,50-5,59 (1H, m), 6,49 (1H, s), 7,24-7,30 (3H, m), 7,36 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,53 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,66 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,75 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,84 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz), 8,77 (1H, t, J=6,7 Hz).[00550] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.81 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2 .20 (2H, m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.98 ( 2H, s), 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32 -5.42 (2H, m), 5.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H , t, J=7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.75 (1H, d , J=11.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J =6.7 Hz).

[00551] MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+.[00551] MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+.

[00552] Processo 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida[00552] Process 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl ]glycinamide

[00553] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (11,0 mL) do composto (0,881 g, 1,10 mmol) obtido no Processo 4 acima, piperidina (1,1 mL) foi adicionado e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto titulado. A mistura foi usada para a próxima reação sem outra purificação.[00553] In a solution of N,N-dimethylformamide (11.0 mL) of the compound (0.881 g, 1.10 mmol) obtained in Process 4 above, piperidine (1.1 mL) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.

[00554] Processo 6: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L- fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida[00554] Process 6: N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9- hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[ 1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide

[00555] Sob resfriamento com gelo, a uma solução de N,N- dimetilformamida (50,0 mL) da mistura (0,439 mmol) obtida no Processo 5 acima, N-hidroxisSuccinimida (0,101 g, 0,878 mmol) e N- [(9H-Fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (Patente Japonesa Depositada em Aberto No. 2002-60351; 0,440 g, 0,878 mmol), N,N'-dicicloexilcarbodiimida (0,181 g, 0,878 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido laranja pálido (0,269 g, 58%).[00555] Under ice cooling, to a solution of N,N-dimethylformamide (50.0 mL) of the mixture (0.439 mmol) obtained in Process 5 above, N-hydroxysuccinimide (0.101 g, 0.878 mmol) and N- [( 9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanine (Open Japanese Patent No. 2002-60351; 0.440 g, 0.878 mmol), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0.181 g, 0.878 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 days. The solvent was removed under reduced pressure, and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [chloroform - chloroform : methanol = 9 : 1 (v/v)] to give the title compound as a pale orange solid (0.269 g , 58%).

[00556] MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+.[00556] MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+.

[00557] Processo 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5- fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida[00557] Process 7: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2, 3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino} -2- oxoethoxy)methyl]glycinamide

[00558] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (4,00 mL) do composto (0,269 g, 0,253 mmol) obtido no Processo 6 acima, piperidina (0,251 mL, 2,53 mmol) foi adicionada e agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto titulado. A mistura foi usada para a próxima reação sem outra purificação.[00558] In a solution of N,N-dimethylformamide (4.00 mL) of the compound (0.269 g, 0.253 mmol) obtained in Process 6 above, piperidine (0.251 mL, 2.53 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.

[00559] Processo 8: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida[00559] Process 8: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[ (1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[ de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide

[00560] Em uma solução de N,N-dimetilformamida (10,0 mL) do composto (0,253 mmol) obtido no Processo 7 acima, hexanoato de N- Succinimidil 6-maleimida (0,156 g, 0,506 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida, e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (0,100 g, 38%).[00560] In a solution of N,N-dimethylformamide (10.0 mL) of the compound (0.253 mmol) obtained in Process 7 above, N-Succinimidyl 6-maleimide hexanoate (0.156 g, 0.506 mmol) was added and stirred in room temperature for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure, and the obtained residues were purified by column chromatography on silica gel [chloroform - chloroform : methanol = 9 : 1 (v/v)] to give the title compound as a pale yellow solid (0.100 g , 38%).

[00561] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,09-1,21 (2H, m), 1,33-1,47 (4H, m), 1,75-1,90 (2H, m), 2,00-2,23 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,69-2,81 (1H, m), 2,94-3,03 (1H, m), 3,06-3,22 (2H, m), 3,23-3,74 (8H, m), 3,98 (2H, s), 4,39-4,50 (1H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,39 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,96 (2H, s), 7,11-7,24 (5H, m), 7,28 (1H, s), 7,75 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,97 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,09 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=6,5 Hz), 8,48 (1H, d, J=9,0 Hz), 8,60 (1H, t, J=6,5 Hz).[00561] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.83 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1 .47 (4H, m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (8H, m), 3.98 (2H , s), 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s) , 5.53-5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11-7.24 (5H, m), 7.28 (1H , s), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.9 Hz ), 8.09 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J=9.0 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.5 Hz).

[00562] MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+.[00562] MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+.

[00563] Processo 9: Conjugado de anticorpo-fármaco (6)[00563] Process 9: Antibody-drug conjugate (6)

[00564] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (10,0 mL) foi coletada em um tubo de 50 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM de (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,317 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,500 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando- se a 37°C durante 1 hora.[00564] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (10.0 mL) was collected in a 50 mL tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .) (0.317 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.500 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00565] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de temperatura ordinária, um dimetil sulfóxido (0,567 mL) foi adicionado a isto. Subsequentemente, uma solução de dimetil sulfóxido contendo 10 mM do composto obtido no Processo acima 8 (0,635 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,127 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante outros 20 minutos.[00565] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a water bath of ordinary temperature, a dimethyl sulfoxide (0.567 mL) was added to it. Subsequently, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in the above Process 8 (0.635 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) was added to this and stirred using a tube rotator to conjugate the drug linker to the antibody in room temperature for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.127 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for another 20 minutes.

[00566] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 35,0 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00566] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 35.0 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00567] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (SD,280 = 5178 (valor médio medido) e SD,3?O = 20217 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00567] Physicochemical Characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (SD,280 = 5178 (measured mean value) and SD,3?O = 20217 (measured mean value) were used), the characteristic values following were obtained.

[00568] Concentração de anticorpo: 2,70 mg/mL, rendimento de anticorpo: 94,5 mg (95%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 6,4.[00568] Antibody concentration: 2.70 mg/mL, antibody yield: 94.5 mg (95%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 6, 4.

[00569] Exemplo 15: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (7) Fórmula 31 [00569] Example 15: Production of hTINA1-H1L1 ADC (7) Formula 31

[00570] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (7)[00570] Process 1: Antibody-drug conjugate (7)

[00571] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (2,0 mL) foi coletada em um tubo de 4 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM de (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0690 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0299 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.[00571] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (2.0 mL) was collected in a 4 mL tube and charged with a 10 mM TCEP aqueous solution from (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .) (0.0690 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0299 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00572] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,127 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 do Exemplo 14 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0190 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00572] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.127 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 14 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0190 mL; 13.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred using a tube rotator to terminate the reaction. drug binder at room temperature for 20 minutes.

[00573] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 9,00 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00573] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 9.00 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00574] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (SD,280 = 5178 (valor médio medido) e SD,3?O = 20217 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00574] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (SD,280 = 5178 (measured mean value) and SD,3?O = 20217 (measured mean value) were used), the characteristic values following were obtained.

[00575] Concentração de anticorpo: 2,04 mg/mL, rendimento de anticorpo: 18,4 mg (92%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 5,7.[00575] Antibody concentration: 2.04 mg/mL, antibody yield: 18.4 mg (92%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 5, 7.

[00576] Exemplo 16: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (8) Fórmula 32 [00576] Example 16: Production of hTINA1-H1L1 ADC (8) Formula 32

[00577] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (8)[00577] Process 1: Antibody-drug conjugate (8)

[00578] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (30,0 mL) foi coletada em um recipiente de 100 mL, carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,4875 mL) com agitação, e em seguida agitada a 37°C durante 10 minutos. Depois de adicionar a isto uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,9721 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) com agitação, e em seguida confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida por agitação a 37°C durante 1 hora.[00578] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (30.0 mL) was collected in a 100 mL container, charged with a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.4875 mL) with stirring, and then stirred at 37°C for 10 minutes. After adding to this an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.9721 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) with stirring, and then confirming that the solution had pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by stirring at 37°C for 1 hour.

[00579] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de agitar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (2,33 mL; 12,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 do Exemplo 14 foi gradualmente adicionada gota a gota a isto e agitada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,251 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00579] Conjugation between antibody and drug ligand: After stirring the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (2.33 mL; 12.0 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 14 was gradually added dropwise thereto and stirred to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.251 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.

[00580] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 98,0 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado. Em seguida, a solução foi concentrada de acordo com o Procedimento comum A descrito no Método de produção 1 para produzir 17,5 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00580] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 98.0 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate. Then, the solution was concentrated according to Common Procedure A described in Production Method 1 to produce 17.5 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00581] Caracterização físico-química: Usando os Procedimentos comuns E e F descritos no Método de produção 1 (SD,280 = 5178 (valor médio medido) e SD,3?O = 20217 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00581] Physicochemical characterization: Using common Procedures E and F described in Production Method 1 (SD.280 = 5178 (average measured value) and SD.3?O = 20217 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00582] Concentração de anticorpo: 14,6 mg/mL, rendimento de anticorpo: 256 mg (85%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 6,7, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 7,0.[00582] Antibody concentration: 14.6 mg/mL, antibody yield: 256 mg (85%), average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 6.7, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure F: 7.0.

[00583] Exemplo 17: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (9) Fórmula 33 [00583] Example 17: Production of hTINA1-H1L1 ADC (9) Formula 33

[00584] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (9)[00584] Process 1: Antibody-drug conjugate (9)

[00585] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (5,0 mL) foi coletada em um recipiente de 15 mL, carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0813 mL) com agitação, e em seguida agitada a 37°C durante 10 minutos. Depois de adicionar a isto uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0778 mL; 2,4 equivalentes por molécula de anticorpo) com agitação, e em seguida confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida por agitação a 37°C durante 1 hora.[00585] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (5.0 mL) was collected in a 15 mL container, charged with a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0813 mL) with stirring, and then stirred at 37°C for 10 minutes. After adding to this an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0778 mL; 2.4 equivalents per antibody molecule) with stirring, and then confirming that the solution had pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by stirring at 37°C for 1 hour.

[00586] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de agitar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,162 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 do Exemplo 14 foi gradualmente adicionada gota a gota a isto e agitada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0418 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00586] Conjugation between antibody and drug ligand: After stirring the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.162 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 14 was gradually added dropwise thereto and stirred to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0418 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at temperature environment for 20 minutes.

[00587] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 21,0 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00587] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 21.0 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00588] Caracterização físico-química: Usando os Procedimentos comuns E e F descritos no Método de produção 1 (SD,280 = 5178 (valor médio medido) e SD,3?O = 20217 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00588] Physicochemical characterization: Using common Procedures E and F described in Production Method 1 (SD.280 = 5178 (average measured value) and SD.3?O = 20217 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00589] Concentração de anticorpo: 2,26 mg/mL, rendimento de anticorpo: 47,5 mg (95%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 3,5, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 3,6.[00589] Antibody concentration: 2.26 mg/mL, antibody yield: 47.5 mg (95%), average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 3.5 , and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure F: 3.6.

[00590] Exemplo de Referência 18: Produção de ADC de hRS7 (10) Fórmula 34 [00590] Reference Example 18: Production of ADC from hRS7 (10) Formula 34

[00591] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (10)[00591] Process 1: Antibody-drug conjugate (10)

[00592] Redução do anticorpo: O hRS7 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,56 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (2,0 mL) foi coletada em um tubo de 4 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM de (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0690 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0299 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando-se a 37°C durante 1 hora.[00592] Antibody Reduction: The hRS7 produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.56 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (2.0 mL) was collected in a 4 mL tube and charged with a 10 mM TCEP aqueous solution from (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .) (0.0690 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0299 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00593] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,1269 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 do Exemplo 14 foi adicionada a isto e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0190 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00593] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.1269 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 14 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Next, an aqueous solution (0.0190 mL; 13.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred using a tube rotator to terminate the reaction. drug binder at room temperature for 20 minutes.

[00594] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 9,00 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00594] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 9.00 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00595] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (SD,280 = 5178 (valor médio medido) e SD,370 = 20217 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00595] Physicochemical Characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (SD,280 = 5178 (average measured value) and SD,370 = 20217 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00596] Concentração de anticorpo: 2,07 mg/mL, rendimento de anticorpo: 18,6 mg (93%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 5,6.[00596] Antibody concentration: 2.07 mg/mL, antibody yield: 18.6 mg (93%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 5, 6.

[00597] Exemplo 19: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (11) Fórmula 35 [00597] Example 19: Production of hTINA1-H1L1 ADC (11) Formula 35

[00598] Processo 1: [2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]carbamato de terc-butila[00598] Process 1: [2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl ] tert-butyl carbamate

[00599] Mesilato de exatecano (3,10 g, 5,47 mol) foi reagido da mesma maneira como o Processo 1 do Exemplo 1 usando Ácido {2- [(terc-butoxicarbonil)amino]etóxi}acético (J. Med. Chem., 1992, Vol. 35, p., 2928; 1,55 g, 6,01 mmol) em vez de Ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (2,56 g, 73%).[00599] Exatecan mesylate (3.10 g, 5.47 mol) was reacted in the same manner as Process 1 of Example 1 using {2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethoxy}acetic acid (J. Med. Chem., 1992, Vol. 35, p., 2928; 1.55 g, 6.01 mmol) instead of 4-(tert-butoxycarbonylamino)butanoic acid to yield the title compound as a pale yellow solid (2.56 g, 73%).

[00600] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,26 (9H, s), 1,81-1,91 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,083,26 (4H, m), 3,43-3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J = 15,1 Hz), 4,05 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,14 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,22 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J = 16,6 Hz), 5,59-5,66 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,86 (1H, t, J = 5,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J = 10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J = 9,1 Hz).[00600] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.26 (9H, s), 1.81-1.91 (2H , m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 3.083.26 (4H, m), 3.43-3.53 (2H, m), 4, 00 (1H, d, J = 15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J = 15.1 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.22 ( 1H, d, J = 18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J = 16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J = 16.6 Hz), 5.59-5, 66 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.86 (1H, t, J = 5.4 Hz), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J = 9.1 Hz).

[00601] MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+.[00601] MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+.

[00602] Processo 2: Trifluoroacetato de 2-(2-aminoetóxi)-N- [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]acetamida[00602] Process 2: 2-(2-aminoethoxy)-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3 trifluoroacetate ,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-yl]acetamide

[00603] O composto (1,50 g, 2,36 mol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 2 do Exemplo 1 para produzir o composto titulado como um sólido amarelo pálido (1,50 g, quantitativo).[00603] The compound (1.50 g, 2.36 mol) obtained in Process 1 above was reacted in the same manner as Process 2 of Example 1 to produce the titled compound as a pale yellow solid (1.50 g, quantitative ).

[00604] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,15-2,23 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,05 (2H, t, J = 5,1 Hz), 3,15-3,23 (2H, m), 3,71 (2H, t, J = 5,1 Hz), 4,10 (2H, s), 5,19 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,66 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,73-7,84 (4H, m), 8,55 (1H, d, J = 9,1 Hz).[00604] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.5 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.15-2 .23 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.05 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.15-3.23 (2H, m), 3.71 ( 2H, t, J = 5.1 Hz), 4.10 (2H, s), 5.19 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.43 (2H, s), 5.58-5.66 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.33 (1H, s), 7.73-7.84 (4H, m), 8.55 (1H, d, J = 9.1 Hz).

[00605] MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+.[00605] MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+.

[00606] Processo 3: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N- [2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamida[00606] Process 3: N-(tert-Butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl -10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H- benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b ]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide

[00607] O composto (554 mg, 0,85 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 3 do Exemplo 1 para produzir o composto titulado (775 mg, 95%).[00607] The compound (554 mg, 0.85 mmol) obtained in Process 2 above was reacted in the same way as Process 3 of Example 1 to produce the titled compound (775 mg, 95%).

[00608] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,36 (9H, s), 1,78-1,89 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J = 13,4, 9,8 Hz), 2,95 (1H, dd, J = 13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,23-3,32 (2H, m), 3,40-3,62 (8H, m), 3,73 (1H, dd, J = 16,5, 5,5 Hz), 4,03 (2H, s), 4,39-4,47 (1H, m), 5,17 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J = 16,8 Hz), 5,45 (1H, d, J = 16,8 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (1H, t, J = 5,8 Hz), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,82 (2H, m), 7,90 (1H, t, J = 5,2 Hz), 8,13 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,27 (1H, t, J = 5,8 Hz), 8,49 (1H, d, J = 8,5 Hz).[00608] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H , m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J = 13.4, 9.8 Hz), 2.95 ( 1H, dd, J = 13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.23-3.32 (2H, m), 3.40-3.62 ( 8H, m), 3.73 (1H, dd, J = 16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m), 5.17 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J = 16.8 Hz), 5.45 (1H , d, J = 16.8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.54 (1H, s), 6.99 (1H, t, J = 5.8 Hz), 7 .13-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.76-7.82 (2H, m), 7.90 (1H, t, J = 5.2 Hz), 8.13 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J = 5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J = 8.5 Hz).

[00609] MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+.[00609] MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+.

[00610] Processo 4: Trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2- (2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-2-oxoetóxi)etil]glicinamida[00610] Process 4: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13- trifluoroacetate dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1- yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide

[00611] O composto (630 mg, 0,659 mmol) obtido no Processo 3 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 4 do Exemplo 1 para produzir o composto titulado (588 mg, 92%).[00611] The compound (630 mg, 0.659 mmol) obtained in Process 3 above was reacted in the same way as Process 4 of Example 1 to produce the titled compound (588 mg, 92%).

[00612] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J = 7,3 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J = 13,4, 10,1 Hz), 2,99 (1H, dd, J = 13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,24- 3,32 (3H, m), 3,41-3,71 (7H, m), 3,86 (1H, dd, J = 16,8, 5,8 Hz), 4,04 (2H, s), 4,52 (1H, td, J = 9,0, 4,1 Hz), 5,17 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,45 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J = 11,0 Hz), 7,87-8,01 (4H, m), 8,29-8,36 (2H, m), 8,468,55 (2H, m).[00612] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2 .22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J = 13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J = 13.4 , 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.24- 3.32 (3H, m), 3.41-3.71 (7H, m), 3.86 ( 1H, dd, J = 16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J = 9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H , d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.45 (1H, d , J = 16.5 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.13-7.26 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.87-8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.468.55 (2H , m).

[00613] MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+.[00613] MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+.

[00614] Processo 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamida[00614] Process 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2- {[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H- benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide

[00615] O composto (240 mg, 0,247 mmol) obtido no Processo 4 acima foi reagido da mesma maneira como o Processo 5 do Exemplo 1 usando trietilamina (31,4 μL, 0,22 mmol) em vez de di- isopropiletilamina e hexanoato de N-Succinimidil 6-maleimida (95,3 mg, 0,31 mmol) em vez de N-Succinimidil 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato para produzir o composto titulado (162 mg, 62%).[00615] The compound (240 mg, 0.247 mmol) obtained in Process 4 above was reacted in the same way as Process 5 of Example 1 using triethylamine (31.4 μL, 0.22 mmol) instead of diisopropylethylamine and hexanoate of N-Succinimidyl 6-maleimide (95.3 mg, 0.31 mmol) instead of N-Succinimidyl 3-(2-(2-(3-maleinimidepropanamide)ethoxy)ethoxy)propanoate to yield the titled compound (162 mg , 62%).

[00616] 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J = 7,6 Hz), 1,13-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,78-1,90 (2H, m), 2,09 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,14-2,21 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,74 (1H, dd, J = 13,6, 9,7 Hz), 2,96 (1H, dd, J = 13,6, 4,5 Hz), 3,08-3,24 (1H, m), 3,24-3,30 (1H, m), 3,33-3,40 (4H, m), 3,47-3,68 (7H, m), 3,72 (1H, dd, J = 16,6, 5,7 Hz), 4,03 (2H, s), 4,42 (1H, td, J = 8,6, 4,2 Hz), 5,17 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J = 18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,81 (2H, m), 7,99 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,03-8,11 (2H, m), 8,22 (1H, t, J = 5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J = 9,1 Hz).[00616] 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.6 Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1 .51 (4H, m), 1.78-1.90 (2H, m), 2.09 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J = 13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J = 13.6, 4.5 Hz), 3 .08-3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m), 3.33-3.40 (4H, m), 3.47-3.68 (7H, m) , 3.72 (1H, dd, J = 16.6, 5.7 Hz), 4.03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J = 8.6, 4.2 Hz), 5.17 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5, 44 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7 .25 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.81 (2H, m), 7.99 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.03- 8.11 (2H, m), 8.22 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J = 9.1 Hz).

[00617] MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+.[00617] MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+.

[00618] Processo 6: Conjugado de anticorpo-fármaco (11)[00618] Process 6: Antibody-drug conjugate (11)

[00619] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (3,0 mL) foi coletada em um recipiente de 15 mL, carregada com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0488 mL) com agitação, e em seguida agitada a 37°C durante 10 minutos. Depois de adicionar a isto uma solução aquosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0972 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) com agitação, e em seguida confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida por agitação a 37°C durante 1 hora.[00619] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (3.0 mL) was collected in a 15 mL container, charged with a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0488 mL) with stirring, and then stirred at 37°C for 10 minutes. After adding to this an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0972 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) with stirring, and then confirming that the solution had pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by stirring at 37°C for 1 hour.

[00620] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de agitar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de 15°C, uma solução de dimetil sulfóxido (0,2333 mL; 12,0 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 do Exemplo 11 foi gradualmente adicionada gota a gota a isto e agitada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água de 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0251 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00620] Conjugation between antibody and drug ligand: After stirring the previous solution for 10 minutes in a 15°C water bath, a solution of dimethyl sulfoxide (0.2333 mL; 12.0 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 11 was gradually added dropwise thereto and stirred to conjugate the drug ligand to the antibody in a 15°C water bath for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0251 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at temperature environment for 20 minutes.

[00621] Purificação: A solução anterior foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D descrito no Método de produção 1 para produzir 14 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00621] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D described in Production Method 1 to produce 14 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00622] Caracterização físico-química: Usando os Procedimentos comuns E e F descritos no Método de produção 1 (SD,280 = 5 1 93 (valor médio medido) e SD,370 = 20347 (valor médio medido) foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00622] Physicochemical characterization: Using the common Procedures E and F described in Production Method 1 (SD,280 = 5 1 93 (average measured value) and SD,370 = 20347 (average measured value) were used), the following characteristic values were obtained.

[00623] Concentração de anticorpo: 1,93 mg/mL, rendimento de anticorpo: 27,0 mg (90%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 7,1, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 7,0.[00623] Antibody concentration: 1.93 mg/mL, antibody yield: 27.0 mg (90%), average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 7.1 , and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure F: 7.0.

[00624] Exemplo de Referência 2: Produção de hRS7-CL2A-SN38 (12) Fórmula 36 [00624] Reference Example 2: Production of hRS7-CL2A-SN38 (12) Formula 36

[00625] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (12)[00625] Process 1: Antibody-drug conjugate (12)

[00626] Redução do anticorpo: O hRS7 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (10,0 mL) foi coletada em um tubo de 50 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM de (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,317 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,500 mL). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto a parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando- se a 37°C durante 1 hora.[00626] Antibody Reduction: The hRS7 produced in Reference Example 1 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as the absorption coefficient at 280 nm, 1.54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (10.0 mL) was collected in a 50 mL tube and charged with a 10 mM aqueous solution of TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd .) (0.317 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.500 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.

[00627] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de incubar a solução anterior durante 10 minutos em um banho de água de temperatura ordinária, um dimetil sulfóxido (0,567 mL) foi adicionado a isto. Subsequentemente, uma solução de dimetil sulfóxido contendo 10 mM de CL2A-SN38 sintetizada de acordo com Publicação de Patente U.S. No. 2011/0293513 (0,635 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isto e agitada usando um rotador de tubo para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,127 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isto e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante outros 20 minutos.[00627] Conjugation between antibody and drug ligand: After incubating the previous solution for 10 minutes in a water bath of ordinary temperature, a dimethyl sulfoxide (0.567 mL) was added to it. Subsequently, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM CL2A-SN38 synthesized according to U.S. Patent Publication No. 2011/0293513 (0.635 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) was added thereto and stirred using a rotator. tube to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.127 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added to this and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for another 20 minutes.

[00628] Purificação: A solução anterior de reação foi submetida repetidamente duas vezes à filtração em gel e purificação descritas no Procedimento comum D do Método de produção e subsequentemente submetida similarmente à purificação por filtração em gel com a coluna NAP-25 usando solução de trealose a 25 mM contendo polissorbato 80 (0,01%). Em seguida, o eluato obtido (35 mL) foi secado por congelamento.[00628] Purification: The previous reaction solution was repeatedly subjected twice to the gel filtration and purification described in Common Procedure D of the Production Method and subsequently similarly subjected to purification by gel filtration with the NAP-25 column using trehalose solution at 25 mM containing polysorbate 80 (0.01%). Then, the eluate obtained (35 mL) was freeze-dried.

[00629] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 para o eluato antes da secagem por congelamento, os valores característicos seguintes foram obtidos.[00629] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 for the eluate before freeze drying, the following characteristic values were obtained.

[00630] Concentração de anticorpo: 2,78 mg/mL, rendimento de anticorpo: 97,3 mg (97%) e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,6.[00630] Antibody concentration: 2.78 mg/mL, antibody yield: 97.3 mg (97%) and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.6.

[00631] Exemplo 20: Produção de ADC de hTINA1-H1L1 (13) Fórmula 37 [00631] Example 20: Production of hTINA1-H1L1 ADC (13) Formula 37

[00632] Processo 1: Conjugado de anticorpo-fármaco (13)[00632] Process 1: Antibody-drug conjugate (13)

[00633] Redução do anticorpo: O hTINA1-H1L1 produzido no Exemplo 7 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS 6.0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,54 foi usado) e o Procedimento comum C descrito no Método de produção 1. A solução (100 mL) foi colocada em um frasco Erlenmeyer de policarbonato de 250 mL, carregado com uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dipotássio a 1 M (1,4 mL) em temperatura ambiente com agitação usando um agitador magnético, e em seguida carregado com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (1,62 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo). Depois de confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a agitação foi terminada, e a ligação de dissulfeto a parte da articulação no anticorpo foi reduzida incubando- se a 37°C durante 2 horas.[00633] Antibody Reduction: The hTINA1-H1L1 produced in Example 7 was prepared to have an antibody concentration of 10 mg/mL by replacing the medium with PBS 6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1 .54 was used) and Common Procedure C described in Production Method 1. The solution (100 mL) was placed in a 250 mL polycarbonate Erlenmeyer flask charged with a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (1. 4 mL) at room temperature with stirring using a magnetic stirrer, and then loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (1.62 mL; 2.5 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, stirring was terminated, and the disulfide bond to the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 2 hours.

[00634] Conjugação entre anticorpo e ligante de fármaco: Depois de resfriar a solução anterior a 15°C, DMSO (3,24 mL) foi adicionado gradualmente gota a gota a isto com agitação. Subsequentemente, uma solução de DMSO que contém 10 mM do composto obtido no Processo 8 do Exemplo 14 (1,76 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada gradualmente gota a gota a isto. Esta solução foi agitada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,324 mL; 5,0 equivalentes por molécula de anticorpo) de 100 mM de NAC foi adicionada a isto com agitação e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco não reagido em temperatura ambiente durante outros 20 minutos.[00634] Conjugation between antibody and drug ligand: After cooling the previous solution to 15°C, DMSO (3.24 mL) was gradually added dropwise to it with stirring. Subsequently, a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 14 (1.76 ml; 5.0 equivalents per antibody molecule) was gradually added dropwise thereto. This solution was stirred to conjugate the drug linker to the antibody at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.324 mL; 5.0 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added to this with stirring and incubated to terminate the unreacted drug-binding reaction at room temperature for another 20 minutes.

[00635] Purificação: Solução de ácido acético aquosa a 20% (cerca de 0,52 mL) e ABS (100 mL) foi adicionada gradualmente na solução anterior com agitação para ajustar o pH da solução em 5,5 ± 0,1. Esta solução foi submetida à microfiltração (0,45 μm, membrana de PVDF) para remover a turbidez branca e produzir cerca de 200 mL de um filtrado. Este filtrado foi submetido à purificação por ultrafiltração usando um mecanismo de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassete, Ultracell 30 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump modelo 77521-40, Cabeça de Bomba modelo 7518-00) e um tubo (Cole-Parmer International, Tubo MasterFlex L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionada gota a gota (um total de 1600 mL) como uma solução de tamponamento para purificação à solução de reação, purificação por ultrafiltração foi realizada para remover ligantes de fármaco não conjugados e outros reagentes de baixo peso molecular, da mesma forma substituindo a solução de tamponamento com ABS, e também concentrando a solução. A solução purificada obtida foi submetida a microfiltração (0,22 μm, membrana de PVDF) para produzir 88 mL de uma solução que contém o conjugado de anticorpo-fármaco titulado.[00635] Purification: 20% aqueous acetic acid solution (about 0.52 mL) and ABS (100 mL) was gradually added into the previous solution with stirring to adjust the pH of the solution to 5.5 ± 0.1. This solution was subjected to microfiltration (0.45 μm, PVDF membrane) to remove the white turbidity and produce approximately 200 mL of a filtrate. This filtrate was subjected to ultrafiltration purification using an ultrafiltration mechanism composed of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Ultracell 30 KDa), a tube pump (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Head Pump model 7518-00) and a tube (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifically, at the same time that ABS was added dropwise (a total of 1600 mL) as a buffer solution for purification to the reaction solution, ultrafiltration purification was performed to remove unconjugated drug ligands and other low molecular weight reagents. , similarly replacing the buffer solution with ABS, and also concentrating the solution. The purified solution obtained was subjected to microfiltration (0.22 μm, PVDF membrane) to produce 88 mL of a solution containing the titrated antibody-drug conjugate.

[00636] Caracterização físico-química: Usando o Procedimento comum E e Procedimento comum F (SD,28Q = 5178, e SD,3?Q = 20217 foram usados), os valores característicos seguintes foram obtidos.[00636] Physicochemical characterization: Using Common Procedure E and Common Procedure F (SD,28Q = 5178, and SD,3?Q = 20217 were used), the following characteristic values were obtained.

[00637] Concentração de anticorpo: 9,96 mg/mL, rendimento de anticorpo: 876 mg (88%), número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum E: 3,8, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo medido pelo Procedimento comum F: 3,8.[00637] Antibody concentration: 9.96 mg/mL, antibody yield: 876 mg (88%), average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure E: 3.8, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule measured by Common Procedure F: 3.8.

[00638] Exemplo 21: Avaliação de efeito antitumor de ADC[00638] Example 21: Assessment of ADC antitumor effect

[00639] 21-a) Efeito antitumor de ADC - (1)[00639] 21-a) Antitumor effect of ADC - (1)

[00640] Camundongo: Camundongos BALB/c-nu/nu fêmeas com 5 a 6 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.) foram aclimatados durante 4 a 7 dias sob condições de SPF antes do uso na experiência. Os camundongos foram alimentados com alimento sólido esterilizado (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) e dado água de torneira esterilizada (preparada pela adição de 5 a 15 ppm de solução de hipoclorito de sódio).[00640] Mouse: 5 to 6 week old female BALB/c-nu/nu mice (Charles River Laboratories Japan, Inc.) were acclimatized for 4 to 7 days under SPF conditions before use in the experiment. Mice were fed sterilized solid food (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) and given sterilized tap water (prepared by adding 5 to 15 ppm sodium hypochlorite solution).

[00641] Ensaio e expressão de cálculo: Em todos os estudos, os eixo maior e eixo menor de tumor foram medidos duas vezes por semana usando um calibrador digital eletrônico (CD-15C, Mitutoyo Corp.), e o volume de tumor (mm3) foi calculado. A expressão de cálculo é como mostrada abaixo. i. Volume de tumor (mm3)=1/2x Eixo maior (mm)([Eixo menor (mm)]2[00641] Calculation assay and expression: In all studies, the tumor major axis and minor axis were measured twice a week using an electronic digital caliper (CD-15C, Mitutoyo Corp.), and the tumor volume (mm3 ) was calculated. The calculation expression is as shown below. i. Tumor volume (mm3)=1/2x Major axis (mm)([Minor axis (mm)]2

[00642] Todos os conjugados de anticorpo-fármaco foram diluídos com solução salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) e usados em um volume de 10 mL/kg para administração intravenosa à cauda de cada camundongo. Uma linhagem celular de câncer colorretal humano COLO205 foi adquirida de ATCC e suspenso em solução salina fisiológica. 2 x 106 células da suspensão foram subcutaneamente transplantadas para o abdômen direito de cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 7. O conjugado de anticorpo-fármaco (1), (6), ou (12) foi intravenosamente administrado a uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 7, 14 e 21. O anticorpo hTINA1-H1L1 não conjugado e anticorpo hRS7 foram cada qual administrados como um controle negativo a uma dose de 25 mg/kg pela mesma rotina como anteriormente mencionado. A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (1) ou (6) notavelmente diminuiu o volume de tumor comparado à administração do conjugado de anticorpo-fármaco (12), e ambos os conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 13). No desenho, a abscissa descreve o número de dias, e a ordenada descreve o volume de tumor.[00642] All antibody-drug conjugates were diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) and used in a volume of 10 mL/kg for intravenous administration to the tail of each mouse. A human colorectal cancer cell line COLO205 was purchased from ATCC and suspended in physiological saline. 2 x 10 cells from the suspension were subcutaneously transplanted into the right abdomen of each female BALB/c-nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 7. The antibody-drug conjugate (1), ( 6), or (12) was intravenously administered at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Days 7, 14, and 21. The unconjugated hTINA1-H1L1 antibody and hRS7 antibody were each administered as a negative control to a dose of 25 mg/kg by the same routine as previously mentioned. Administration of the antibody-drug conjugate (1) or (6) remarkably decreased tumor volume compared to administration of the antibody-drug conjugate (12), and both antibody-drug conjugates exerted an inhibitory effect on tumor growth. (Figure 13). In the drawing, the abscissa describes the number of days, and the ordinate describes the tumor volume.

[00643] 21-b) Efeito antitumor de ADC - (2)[00643] 21-b) Antitumor effect of ADC - (2)

[00644] Uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano Bx-PC3 adquirida de ATCC foi transplantada a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea e também passada como um enxerto de tumor sólido. Este enxerto de tumor foi subcutaneamente transplantado para o abdômen direito de cada camundongo BALB/c- nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 16. O conjugado de anticorpo-fármaco (1), (6) ou (12) foi intravenosamente administrado a uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 16, 23 e 30. O anticorpo hTINA1-H1L1 não conjugado e anticorpo hRS7 foram cada qual administrados como um controle negativo a uma dose de 25 mg/kg pela mesma rotina como anteriormente mencionado. A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (1) ou (6) notavelmente diminuiu o volume de tumor comparado à administração do conjugado de anticorpo-fármaco (12), e ambos os conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 14).[00644] A human pancreatic adenocarcinoma cell line Bx-PC3 acquired from ATCC was transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse and also passaged as a solid tumor graft. This tumor graft was subcutaneously transplanted into the right abdomen of each female BALB/c- nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 16. The antibody-drug conjugate (1), (6) or (12) was intravenously administered at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Days 16, 23, and 30. The unconjugated hTINA1-H1L1 antibody and hRS7 antibody were each administered as a negative control at a dose of 25 mg/kg by the same routine as previously mentioned. Administration of the antibody-drug conjugate (1) or (6) remarkably decreased tumor volume compared to administration of the antibody-drug conjugate (12), and both antibody-drug conjugates exerted an inhibitory effect on tumor growth. (Figure 14).

[00645] 21-c) Efeito antitumor de ADC - (3)[00645] 21-c) Antitumor effect of ADC - (3)

[00646] Uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreática humana que Capan-1 adquirida de ATCC foi transplantada a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea e também passada como um enxerto de tumor sólido. Este enxerto de tumor foi subcutaneamente transplantado para o abdômen direito de cada camundongo BALB/c- nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 18. O conjugado de anticorpo-fármaco (1), (6) ou (12) foi intravenosamente administrado a uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 18, 25 e 32. Os anticorpo hTINA1-H1L1 não conjugado e anticorpo hRS7 foram cada qual administrados como um controle negativo a uma dose de 25 mg/kg pela mesma rotina como anteriormente mencionado. A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (1) ou (6) notavelmente diminuiu o volume de tumor comparado à administração do conjugado de anticorpo-fármaco (12), e ambos os conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 15).[00646] A human pancreatic adenocarcinoma cell line that Capan-1 acquired from ATCC was transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse and also passed as a solid tumor graft. This tumor graft was subcutaneously transplanted into the right abdomen of each female BALB/c- nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 18. The antibody-drug conjugate (1), (6) or (12) was intravenously administered at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Days 18, 25, and 32. Unconjugated hTINA1-H1L1 antibody and hRS7 antibody were each administered as a negative control at a dose of 25 mg/kg by the same routine as previously mentioned. Administration of the antibody-drug conjugate (1) or (6) remarkably decreased tumor volume compared to administration of the antibody-drug conjugate (12), and both antibody-drug conjugates exerted an inhibitory effect on tumor growth. (Figure 15).

[00647] 21-d) Efeito antitumor de ADC - (4)[00647] 21-d) Antitumor effect of ADC - (4)

[00648] COLO205 foi subcutaneamente transplantado a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea da mesma maneira como no Exemplo 21-a) (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. O conjugado de anticorpo-fármaco (2) ou (5) a uma dose de 10 mg/kg e o conjugado de anticorpo-fármaco (7) ou (10) a uma dose de 3 mg/kg foram intravenosamente administrados, respectivamente, à cauda de cada camundongo nos Dias 11, 18 e 25. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (2), (5), (7) e (10) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 16).[00648] COLO205 was subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse in the same manner as in Example 21-a) (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 11. The antibody-drug conjugate ( 2) or (5) at a dose of 10 mg/kg and the antibody-drug conjugate (7) or (10) at a dose of 3 mg/kg were intravenously administered, respectively, to the tail of each mouse on Days 11 , 18 and 25. All administered antibody-drug conjugates (2), (5), (7) and (10) exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 16).

[00649] 21-e) Efeito antitumor de ADC - (5)[00649] 21-e) Antitumor effect of ADC - (5)

[00650] Bx-PC3 foi subcutaneamente transplantado a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea da mesma maneira como no Exemplo 21-b) (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 25. O conjugado de anticorpo-fármaco (2), (5), (7) ou (10) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 25 e 32. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (2), (5), (7) e (10) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 17).[00650] Bx-PC3 was subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse in the same manner as in Example 21-b) (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 25. The antibody-conjugate drug (2), (5), (7) or (10) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Days 25 and 32. All antibody-drug conjugates (2), ( 5), (7) and (10) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 17).

[00651] 21-f) Efeito antitumor de ADC - (6)[00651] 21-f) Antitumor effect of ADC - (6)

[00652] COLO205 foi subcutaneamente transplantado a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea da mesma maneira como no Exemplo 21-a) (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 9. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 9 e 16. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 18).[00652] COLO205 was subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse in the same manner as in Example 21-a) (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 9. The antibody-drug conjugate ( 3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Days 9 and 16. All antibody-drug conjugates (3), (4) , (8) and (9) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 18).

[00653] 21-g) Efeito antitumor de ADC - (7)[00653] 21-g) Antitumor effect of ADC - (7)

[00654] Bx-PC3 foi subcutaneamente transplantado a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea da mesma maneira como no Exemplo 21-b) (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 21. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 21 e 28. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 19).[00654] Bx-PC3 was subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse in the same manner as in Example 21-b) (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 21. The antibody- drug (3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Days 21 and 28. All antibody-drug conjugates (3), ( 4), (8) and (9) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 19).

[00655] 21-h) Efeito antitumor de ADC - (8)[00655] 21-h) Antitumor effect of ADC - (8)

[00656] 8 x 106 células de uma linhagem celular de câncer ovariano humana NIH:OVCAR-3 adquirida de ATCC foram suspensas em Matrigel (Becton, Dickinson and Company) e subcutaneamente transplantadas para cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 25. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 25. Todos os conjugados de anticorpo- fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 20).[00656] 8 x 106 cells from a human ovarian cancer cell line NIH:OVCAR-3 acquired from ATCC were suspended in Matrigel (Becton, Dickinson and Company) and subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse (Dia 0), and mice were randomly grouped on Day 25. The antibody-drug conjugate (3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse. on Day 25. All antibody-drug conjugates (3), (4), (8) and (9) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 20).

[00657] 21-i) Efeito antitumor de ADC - (9)[00657] 21-i) Antitumor effect of ADC - (9)

[00658] 1 x 107 células de uma linhagem celular de câncer gástrica humana NCI-N87 adquirida de ATCC foram suspensas na solução salina fisiológica e subcutaneamente transplantadas a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 6. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 6. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 21).[00658] 1 x 107 cells from a human gastric cancer cell line NCI-N87 acquired from ATCC were suspended in physiological saline and subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly pooled on Day 6. The antibody-drug conjugate (3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Day 6. All conjugates of antibody-drug (3), (4), (8) and (9) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 21).

[00659] 21-j) Efeito antitumor de ADC - (10)[00659] 21-j) Antitumor effect of ADC - (10)

[00660] 5 x 106 células de uma linhagem celular de câncer de pulmão humana NCI-H292 adquirida de ATCC foram suspensas na solução salina fisiológica e subcutaneamente transplantadas a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 9. O conjugado de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 9. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 22).[00660] 5 x 106 cells of a human lung cancer cell line NCI-H292 acquired from ATCC were suspended in physiological saline and subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 9. Antibody-drug conjugate (3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Day 9. All administered antibody-drug conjugates (3), (4), (8) and (9) exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 22).

[00661] 21-k) Efeito antitumor de ADC - (11)[00661] 21-k) Antitumor effect of ADC - (11)

[00662] 3 x 106 células de uma linhagem celular de câncer de garganta humana FaDu adquirida de ATCC foram suspensas na solução salina fisiológica e subcutaneamente transplantadas a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. O conjugado de anticorpo- fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 11. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 23).[00662] 3 x 106 cells of a FaDu human throat cancer cell line acquired from ATCC were suspended in physiological saline and subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly pooled on Day 11. The antibody-drug conjugate (3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Day 11. All drug conjugates were antibody-drug (3), (4), (8) and (9) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 23).

[00663] 21-l) Efeito antitumor de ADC - (12)[00663] 21-l) Antitumor effect of ADC - (12)

[00664] 4 x 106 células de uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreática humana CFPAC-1 adquirida de ATCC foram suspensas na solução salina fisiológica e subcutaneamente transplantadas a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 14. O conjugado de anticorpo- fármaco (3), (4), (8) ou (9) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 14. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (3), (4), (8) e (9) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 24).[00664] 4 x 106 cells from a human pancreatic adenocarcinoma cell line CFPAC-1 acquired from ATCC were suspended in physiological saline and subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly pooled on Day 14. The antibody-drug conjugate (3), (4), (8) or (9) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Day 14. All conjugates of antibody-drug (3), (4), (8) and (9) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 24).

[00665] 21-m) Efeito antitumor de ADC - (13)[00665] 21-m) Antitumor effect of ADC - (13)

[00666] CFPAC-1 foi subcutaneamente transplantado a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea da mesma maneira como no Exemplo 21-l (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 14. O conjugado de anticorpo-fármaco (8) ou (13) foi intravenosamente administrado a uma dose de 1 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 14. Todos os conjugados de anticorpo- fármaco (8) ou (13) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 25).[00666] CFPAC-1 was subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse in the same manner as in Example 21-1 (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 14. The antibody-drug conjugate (8) or (13) was intravenously administered at a dose of 1 mg/kg to the tail of each mouse on Day 14. All antibody-drug conjugates (8) or (13) administered exerted a tumor growth inhibitory effect. (Figure 25).

[00667] 21-n) Efeito antitumor de ADC - (14)[00667] 21-n) Antitumor effect of ADC - (14)

[00668] 3 x 106 células de uma linhagem celular de adenocarcinoma pancreática humana HPAC adquirida de ATCC foram suspensas na solução salina fisiológica e subcutaneamente transplantadas a cada camundongo BALB/c-nu/nu fêmea (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 12. O conjugado de anticorpo- fármaco (8) ou (13) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 12. Todos os conjugados de anticorpo-fármaco (8) ou (13) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 26).[00668] 3 x 106 cells from an HPAC human pancreatic adenocarcinoma cell line acquired from ATCC were suspended in physiological saline and subcutaneously transplanted into each female BALB/c-nu/nu mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 12. The antibody-drug conjugate (8) or (13) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Day 12. All antibody-drug conjugates (8) or (13 ) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 26).

[00669] 21-o) Efeito antitumor de ADC - (15)[00669] 21-o) Antitumor effect of ADC - (15)

[00670] Tecidos de câncer esofágico humano obtidos de Japan Health Sciences Foundation foram subcutaneamente transplantados a cada camundongo NOG (Central Institute for Experimental Animals) e permitidos crescer. O enxerto de tumor obtido foi também subcutaneamente transplantado a cada camundongo NOD-scid fêmea (Charles River Laboratories Japan, Inc.) (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 27. O conjugado de anticorpo- fármaco (8) ou (13) foi intravenosamente administrado a uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 27. Ambos os conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (13) administrados exerceram um efeito inibidor do crescimento do tumor (Figura 27).[00670] Human esophageal cancer tissues obtained from Japan Health Sciences Foundation were subcutaneously transplanted into each NOG (Central Institute for Experimental Animals) mouse and allowed to grow. The obtained tumor graft was also subcutaneously transplanted into each female NOD-scid mouse (Charles River Laboratories Japan, Inc.) (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 27. The antibody-drug conjugate (8) or (13) was intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Day 27. Both antibody-drug conjugates (8) and (13) administered exerted an inhibitory effect on tumor growth (Figure 27). .

[00671] Exemplo 22: Avaliação do efeito inibidor do crescimento de célula de ADC[00671] Example 22: Evaluation of the cell growth inhibitory effect of ADC

[00672] BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, uma linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão humano Calu-3 (ATCC), e uma linhagem celular de câncer ovariano humano CaOV3 (ATCC) como linhagens celulases de célula positiva de antígeno TROP2, e uma linhagem celular de câncer de pulmão humano Calu-6 (ATCC) e uma linhagem celular de melanoma cutâneo humano A375 (ATCC) como linhagens celulares negativas de antígeno TROP2 foram usadas na avaliação do efeito inibidor de crescimento celular de cada ADC. BxPC3 e NCI-H292 foram preparados com Meio RPMI1640 (Gibco) contendo 10% de soro bovino fetal (Moregate Biotech), NIH:OVCAR-3 foi preparado com Meio RPMI1640 contendo 20% de soro bovino fetal e 0,01 mg/mL de insulina (Invitrogen Corp.), CFPAC- 1 foi preparado com Meio de Dulbeco Modificado de Iscove (Gibco) contendo 10% de soro bovino fetal, FaDu, Calu-3, e Calu-6 foram preparados com o Meio Essencial Mínimo de Eagle (ATCC) contendo 10% de soro bovino fetal, e CaOV3 e A375 foram preparados com o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (Gibco) contendo 10% de soro bovino fetal, em cada tem 2,2 x 106 células/mL. Cada suspensão celular foi semeada em 90 μL/cavidade em uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. O conjugado de anticorpo-fármaco (4) ou (8) diluído com Meio RPMI1640 em 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0,8 nM, 0,16 nM, 0,032 nM, ou 0,0064 nM, ou Meio RPMI1640 para comparação foi adicionado a isto em 10 μL/cavidade, e as células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37oC durante 6 dias. Depois da cultura, a microplaca foi retirada da incubadora e deixada em repouso em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente de CellTiter-Glo (Promega) e agitada durante 10 minutos usando-se um misturador de placa. Após a lise celular, a intensidade de luminescência foi medida usando-se uma leitora de placa.[00672] BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, a human lung adenocarcinoma cell line Calu-3 (ATCC), and a human ovarian cancer cell line CaOV3 (ATCC) as cell lines TROP2 antigen-positive cell cellulases, and a human lung cancer cell line Calu-6 (ATCC) and a human cutaneous melanoma cell line A375 (ATCC) as TROP2 antigen-negative cell lines were used in evaluating the inhibitory effect of cell growth of each ADC. BxPC3 and NCI-H292 were prepared with RPMI1640 Medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Moregate Biotech), NIH:OVCAR-3 was prepared with RPMI1640 Medium containing 20% fetal bovine serum and 0.01 mg/mL of insulin (Invitrogen Corp.), CFPAC-1 was prepared with Iscove's Modified Dulbeco's Medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum, FaDu, Calu-3, and Calu-6 were prepared with Eagle's Minimum Essential Medium ( ATCC) containing 10% fetal bovine serum, and CaOV3 and A375 were prepared with Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum, each having 2.2 x 106 cells/mL. Each cell suspension was seeded at 90 μL/well in a 96-well cell culture microplate. The antibody-drug conjugate (4) or (8) is diluted with RPMI1640 Medium to 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM, or 0.0064 nM, or RPMI1640 Medium for comparison was added to this at 10 μL/well, and cells were cultured under 5% CO2 at 37oC for 6 days. After culture, the microplate was removed from the incubator and left to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken for 10 minutes using a plate mixer. After cell lysis, luminescence intensity was measured using a plate reader.

[00673] A taxa da inibição de crescimento da célula após a cultura durante 6 dias foi calculada de acordo com a seguinte equação: i. Taxa de inibição de crescimento celular (%) = a / b x 100 ii. a: Valor médio das cavidades suplementadas com amostra após a cultura durante 6 dias - Valor médio das cavidades não suplementadas com amostra no começo da cultura iii. b: Valor médio das cavidades suplementadas com meio após a cultura durante 6 dias - Valor médio das cavidades não suplementadas com meio no começo da cultura[00673] The rate of cell growth inhibition after culture for 6 days was calculated according to the following equation: i. Cell growth inhibition rate (%) = a/b x 100 ii. a: Average value of wells supplemented with sample after culture for 6 days - Average value of wells not supplemented with sample at the beginning of culture iii. b: Average value of wells supplemented with medium after culture for 6 days - Average value of wells not supplemented with medium at the beginning of culture

[00674] O valor de GI50 foi calculado de acordo com a seguinte equação: GI50 (nM) = antilog((50 - f) x (LOG10 (d) - LOG10 (c)) / (f - e) + LOG10(d))[00674] The GI50 value was calculated according to the following equation: GI50 (nM) = antilog((50 - f) x (LOG10 (d) - LOG10 (c)) / (f - e) + LOG10(d ))

[00675] c: Concentração da amostra c[00675] c: Sample concentration c

[00676] d: Concentração da amostra d[00676] d: Sample concentration d

[00677] e: Taxa de inibição de crescimento celular na concentração de amostra c[00677] e: Cell growth inhibition rate at sample concentration c

[00678] f: Taxa de inibição de crescimento celular na concentração de amostra d[00678] f: Cell growth inhibition rate at sample concentration d

[00679] As concentrações c e d estabelecem a relação c>d cruzando 50% da taxa de inibição do crescimento celular.[00679] Concentrations c and d establish the relationship c>d crossing 50% of the cell growth inhibition rate.

[00680] O conjugado de anticorpo-fármaco (4) e (8) exibiu um efeito inibidor de crescimento celular de GI50 < 1 (nM) nas linhagens celulares positivas de antígeno TROP2 BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1,FaDu, Calu-3, e CaOV3. Por outro lado, estes conjugados de anticorpo-fármaco não exibição nenhum efeito inibidor de crescimento celular (> 100 (nM)) nas linhagens celulare negativas de antígeno TROP2 Calu-6 e A375.[00680] The antibody-drug conjugate (4) and (8) exhibited a cell growth inhibitory effect of GI50 < 1 (nM) on the TROP2 antigen positive cell lines BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC -1, FaDu, Calu-3, and CaOV3. On the other hand, these antibody-drug conjugates do not exhibit any cell growth inhibitory effect (>100 (nM)) on the TROP2 antigen-negative cell lines Calu-6 and A375.

[00681] Texto Livre da Listagem de Sequência SEQ ID NO: 1: Sequência de nucleotídeo de cDNA codificando uma região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 3: Sequência de nucleotídeo de cDNA codificando uma região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 4: Sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 5 : Sequência de nucleotídeo codificando um sinal de secreção de cadeia K humana e uma região constante de cadeia K humana SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotídeo codificando um sinal de secreção de cadeia pesada humana e uma região constante de IgG1 humana SEQ ID NO: 7: Sequência de nucleotídeo de uma cadeia pesada do anticorpo cTINA1 SEQ ID NO: 8: Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo cTINA1 SEQ ID NO: 9: Sequência de nucleotídeo de uma cadeia leve do anticorpo cTINA1 SEQ ID NO: 10: Sequência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo cTINA1 SEQ ID NO: 11: Sequência de nucleotídeo de hTINA1-H1 SEQ ID NO: 12: Sequência de aminoácido de hTINA1-H1 SEQ ID NO: 13: Sequência de nucleotídeo de hTINA1-H2 SEQ ID NO: 14: Sequência de aminoácido de hTINA1-H2 SEQ ID NO: 15: Sequência de nucleotídeo de hTINA1-H3 SEQ ID NO: 16: Sequência de aminoácido de hTINA1-H3 SEQ ID NO: 17: Sequência de nucleotídeo de hTINA1-L1 SEQ ID NO: 18: Sequência de aminoácido de hTINA1-L1 SEQ ID NO: 19: Sequência de nucleotídeo de hTINA1-L2 SEQ ID NO: 20: Sequência de aminoácido de hTINA1-L2 SEQ ID NO: 21: Sequência de nucleotídeo de hTINA1-L3 SEQ ID NO: 22: Sequência de aminoácido de hTINA1-L3 SEQ ID NO: 23: Sequência de aminoácido de CDRH1 do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 24: Sequência de aminoácido de CDRH2 do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 25: Sequência de aminoácido de CDRH3 do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 26: Sequência de aminoácido de CDRL1 do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 27: Sequência de aminoácido de CDRL2 do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 28: Sequência de aminoácido de CDRL3 do anticorpo TINA1 SEQ ID NO: 29: Sequência de nucleotídeo de uma cadeia pesada do anticorpo hRS7 SEQ ID NO: 30: Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo hRS7 SEQ ID NO: 31: Sequência de nucleotídeo de uma cadeia leve do anticorpo hRS7 SEQ ID NO: 32: Sequência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo hRS7 SEQ ID NO: 33: Iniciador mG2aVR2 SEQ ID NO: 34: Iniciador mKVR2 SEQ ID NO: 35: Iniciador 3.3-F1 SEQ ID NO: 36: Iniciador 3.3-R1 SEQ ID NO: 37: Iniciador TINA1H-F SEQ ID NO: 38: Iniciador TINA1H-R SEQ ID NO: 39: Iniciador TINA1L-F SEQ ID NO: 40: Iniciador TINA1L-R SEQ ID NO: 41: Iniciador EG-Inf-F SEQ ID NO: 42: Iniciador EG1-Inf-R SEQ ID NO: 43: Iniciador CM-LKF SEQ ID NO: 44: Iniciador KCL-Inf-R[00681] Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 1: Nucleotide sequence of cDNA encoding a heavy chain variable region of the TINA1 antibody SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of the heavy chain variable region of the TINA1 antibody SEQ ID NO: 3: Nucleotide sequence of cDNA encoding a light chain variable region of the TINA1 antibody SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of the light chain variable region of the TINA1 antibody SEQ ID NO: 5: Nucleotide sequence encoding a signal human K chain secretion and a human K chain constant region SEQ ID NO: 6: Nucleotide sequence encoding a human heavy chain secretion signal and a human IgG1 constant region SEQ ID NO: 7: Nucleotide sequence of a chain cTINA1 antibody heavy chain SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of the cTINA1 antibody heavy chain SEQ ID NO: 9: Nucleotide sequence of a cTINA1 antibody light chain SEQ ID NO: 10: Amino acid sequence of the cTINA1 antibody light chain SEQ ID NO: 11: Nucleotide sequence of hTINA1-H1 SEQ ID NO: 12: Amino acid sequence of hTINA1-H1 SEQ ID NO: 13: Nucleotide sequence of hTINA1-H2 SEQ ID NO: 14: Amino acid sequence of hTINA1 -H2 SEQ ID NO: 15: Nucleotide sequence of hTINA1-H3 SEQ ID NO: 16: Amino acid sequence of hTINA1-H3 SEQ ID NO: 17: Nucleotide sequence of hTINA1-L1 SEQ ID NO: 18: Amino acid sequence of hTINA1-L1 SEQ ID NO: 19: Nucleotide sequence of hTINA1-L2 SEQ ID NO: 20: Amino acid sequence of hTINA1-L2 SEQ ID NO: 21: Nucleotide sequence of hTINA1-L3 SEQ ID NO: 22: Sequence amino acid sequence of hTINA1-L3 SEQ ID NO: 23: Amino acid sequence of CDRH1 of TINA1 antibody SEQ ID NO: 24: Amino acid sequence of CDRH2 of TINA1 antibody SEQ ID NO: 25: Amino acid sequence of CDRH3 of TINA1 antibody SEQ ID NO: 26: Amino acid sequence of CDRL1 of TINA1 antibody SEQ ID NO: 27: Amino acid sequence of CDRL2 of TINA1 antibody SEQ ID NO: 28: Amino acid sequence of CDRL3 of TINA1 antibody SEQ ID NO: 29: Nucleotide sequence of a heavy chain of the hRS7 antibody SEQ ID NO: 30: Amino acid sequence of the heavy chain of the hRS7 antibody SEQ ID NO: 31: Nucleotide sequence of a light chain of the hRS7 antibody SEQ ID NO: 32: Amino acid sequence of the light chain of the hRS7 antibody SEQ ID NO: 33: Primer mG2aVR2 SEQ ID NO: 34: Primer mKVR2 SEQ ID NO: 35: Primer 3.3-F1 SEQ ID NO: 36: Primer 3.3-R1 SEQ ID NO: 37: Primer TINA1H-F SEQ ID NO: 38: TINA1H-R Initiator SEQ ID NO: 39: TINA1L-F Initiator SEQ ID NO: 40: TINA1L-R Initiator SEQ ID NO: 41: EG-Inf-F Initiator SEQ ID NO: 42: EG1-Inf Initiator -R SEQ ID NO: 43: CM-LKF Initiator SEQ ID NO: 44: KCL-Inf-R Initiator

Claims

1. Antibody-drug conjugate, characterized by the fact that an antitumor compound represented by the following formula: Formula 1 is conjugated to an anti-TROP2 antibody by a thioether bond that is formed in a disulfide bond moiety present on a hinge part of the anti-TROP2 antibody by a linker having a structure represented by the following formula: in which the anti-TROP2 antibody is connected to the terminus of L1, the antitumor compound is connected to the carbonyl group of the -(CH2)n2-C(=O)- moiety with the nitrogen atom of the amino group at position 1 as the position connection, where n1 represents an integer from 0 to 6, n2 represents an integer from 0 to 5, L1 represents -(Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n3-C(=O)-, where n3 represents an integer from 2 to 8, L2 represents -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- or a single bond, where n4 represents an integer from 1 to 6, LP represents a tetrapeptide residue of -GGFG-, La represents -O- or a single bond, and -(Succinimid-3-yl-N)- has a structure represented by the following formula: Formula 2 which is connected to the anti-TROP2 antibody at position 3 thereof and is connected to a methylene group in the linker structure containing this structure at the nitrogen atom at position 1, wherein the anti-TROP2 antibody comprises CDRH1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, CDRH2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and CDRH3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 in its heavy chain variable region and CDRL1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, CDRL2 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and CDRL3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 in its light chain variable region.

2. Antibody-drug conjugate according to claim 1, characterized by the fact that the drug-ligand structure portion having a drug connected to -L1-L2-LP-NH- (CH2)n1-La-( CH2)n2-C(=O)- is a drug-ligand structure selected from the following group: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C (=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -( Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C( =O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(= O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N )-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid- 3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) , -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), and -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-O-CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX); where -(Succinimid-3-yl-N)- has a structure represented by the following formula: Formula 3 which is connected to the anti-TROP2 antibody in position 3 thereof and is connected to a methylene group in the ligand structure containing this structure on the nitrogen atom in position 1, -(NH-DX) represents a group represented by the following formula: Formula 4 wherein the nitrogen atom of the amino group at position 1 is a connecting position, and -GGFG- represents a -Gly-Gly-Phe-Gly- tetrapeptide residue.

3. Antibody-drug conjugate according to claim 2, characterized by the fact that the drug-ligand structure portion is a drug-ligand structure selected from the following groups: -(Succinimid-3-yl- N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O )-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), and -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O- CH2CH2- O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

4. Antibody-drug conjugate according to claim 3, characterized by the fact that the drug-ligand structure portion is: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).

5. Antibody-drug conjugate according to claim 3, characterized by the fact that the drug-ligand structure portion is: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).

6. Antibody-drug conjugate according to claim 3, characterized by the fact that the drug-ligand structure portion is: -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH -CH2CH2-O- CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

7. Antibody-drug conjugate according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the anti-TROP2 antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group: a heavy chain variable region consisting in the amino acid sequence of positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 18, a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 18, a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 20, and a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 20 to 140 of SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 22.

8. Antibody-drug conjugate according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the anti-TROP2 antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group: a heavy chain variable region consisting in the amino acid sequence of positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18, a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18, a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 20, and a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 20 to 470 of SEQ ID NO: 16 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 22.

9. Antibody-drug conjugate according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the anti-TROP2 antibody comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 20 to 140 of SEQ ID NO : 12 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 21 to 129 of SEQ ID NO: 18.

10. Antibody-drug conjugate according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the anti-TROP2 antibody comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 20 to 470 of SEQ ID NO : 12 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence from positions 21 to 234 of SEQ ID NO: 18.

11. Antibody-drug conjugate according to claim 8, characterized by the fact that the anti-TROP2 antibody does not have a lysine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain.

12. Antibody-drug conjugate according to claim 10, characterized by the fact that the anti-TROP2 antibody does not have a lysine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain.

13. Antibody-drug conjugate according to any one of claims 1 to 12, characterized in that an average number of units of a selected drug-ligand structure conjugated per antibody is in a range of 2 to 8.

14. Antibody-drug conjugate according to any one of claims 1 to 12, characterized in that an average number of units of a selected drug-ligand structure conjugated per antibody is in a range of 3 to 8.

15. Drug, characterized by the fact that it contains the antibody-drug conjugate as defined in any one of claims 1 to 14, a salt thereof or a hydrate thereof.

16. Antitumor drug and/or anticancer drug, characterized in that it contains the antibody-drug conjugate as defined in any one of claims 1 to 14, a salt thereof or a hydrate thereof.

17. Antitumor drug and/or anticancer drug according to claim 16, characterized in that it is for use in the treatment of lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, cancer ovarian, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, head and neck cancer, or esophageal cancer.

18. Pharmaceutical composition, characterized by the fact that it contains the antibody-drug conjugate as defined in any one of claims 1 to 14, a salt thereof or a hydrate thereof as an active component, and a pharmaceutically acceptable formulation component.

19. Pharmaceutical composition according to claim 18, characterized by the fact that it is for use in the treatment of lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, head and neck cancer, or esophageal cancer.

20. Use of an antibody-drug conjugate as defined in any one of claims 1 to 14, a salt thereof or a hydrate thereof; or of or a pharmaceutical composition, as defined in claim 18, characterized by the fact that it is for the preparation of an antitumor and/or anticancer drug or a pharmaceutical composition or medicine for treating tumor and/or cancer.