BR112016011583B1 - Receptores de célula t humana de alta afinidade geneticamente modificados e seus usos - Google Patents

Abstract

RECEPTORES DE CÉLULA T HUMANA DE ALTA AFINIDADE GENETICAMENTE MODIFICADOS. Trata-se de receptores de célula T (TCRs) que têm afinidade maior para o antígeno de survivina. Os TCRs de alta afinidade foram modificados geneticamente através da geração de bibliotecas de mutação de TCRs em um formato de cadeia única, seguida da seleção por afinidade e estabilidade aprimorada, sobre a superfície de levedura (isto é, evolução dirigida). Nas modalidades, os TCRs geneticamente modificados podem ser usados na forma solúvel para a entrega alvejada in vivo, ou como genes introduzidos em células T em uma configuração de célula T adotiva.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício, sob o 35 U.S.C. § 119(e), do pedido de patente provisório n° US 61/907.887, depositado em 22 de novembro de 2013, e esse pedido provisório está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO RELACIONADA A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS A NÍVEL FEDERAL

[0002] Esta revelação foi feita com o apoio do Governo dos Estados Unidos sob os números de concessão R01 GM55767 e T32 GM070421, outorgados pelos Institutos Nacionais de Saúde. O Governo dos Estados Unidos tem certos direitos nessa revelação.

DECLARAÇÃO RELACIONADA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0003] A listagem de sequências associada a esse pedido é fornecida no formato de texto em vez de uma cópia de papel e está aqui incorporada ao presente documento a título de referência nesse relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequências é IMMU_003_01 WO_ST25.txt. O arquivo de texto tem 12 KB, foi criado em 21 de novembro de 2014 e está sendo apresentado eletronicamente através de EFS- Web.

CAMPO DA INVENÇÃO:

[0004] A revelação refere-se a receptores de célula T de alta afinidade (TCR), geneticamente modificados por meio de técnicas in vitro, contra o antígeno de survivina, assim como a métodos de produção de TCRs modificados e TCRs de cadeia única e os usos correspondentes dos TCRs para métodos terapêuticos, de diagnóstico e de imaginologia.

ANTECEDENTES

[0005] Os receptores de célula T (TCRs) e anticorpos são moléculas que evoluíram para reconhecer classes diferentes de antígenos (ligantes) ((Murphy (2012), xix, 868 p.)). Os TCRs são moléculas específicas quanto a antígeno que são responsáveis pelo reconhecimento de peptídeos antigênicos apresentados no contexto de um produto do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) sobre a superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs) ou qualquer célula nucleada (por exemplo, todas as células humanas no corpo, exceto os glóbulos vermelhos). Em contrapartida, os anticorpos tipicamente reconhecem antígenos de superfície de célula ou solúveis e não exigem apresentação do antígeno por um MHC. Esse sistema confere a células T, através de TCRs, a capacidade potencial para reconhecer a matriz inteira de antígenos intracelulares expressados por uma célula (incluindo proteínas de vírus) que são processados de maneira intercelular em peptídeos curtos, ligados a uma molécula de MHC intracelular e entregues para a superfície como um complexo de peptídeo-MHC (pepMHC). Esse sistema permite que virtualmente qualquer proteína estranha (por exemplo, proteína de vírus ou antígeno de câncer mutante) ou proteína expressa de maneira anormal sirva como um alvo para células T (analisado em Davis e Bjorkman (1988) Nature, 334, 395 a 402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523 a 544; Murphy (2012), xix, 868 p.).

[0006] A interação de um TCR e um pepMHC pode acionar a célula T em diversos estados de ativação, dependendo da afinidade (ou taxa de dissociação) de ligação. O processo de reconhecimento de TCR permite que uma célula T discrimine entre uma célula saudável normal e, por exemplo, uma célula que se transformou através de um vírus ou malignidade, mediante o fornecimento de um repertório diverso de TCRs, em que há uma alta probabilidade de que um ou mais TCRs estejam presentes com uma afinidade de ligação para o peptídeo estranho ligado a uma molécula de MHC que está acima do limite para a estimulação da atividade de célula T (Manning e Kranz (1999) Immunology Today, 20, 417 a 422).

[0007] Até o presente momento, os TCRs do tipo selvagem isolados a partir de clones de célula T de camundongo ou humana que foram identificados por meio de cultura in vitro têm demonstrado ter afinidades de ligação relativamente baixas (Kd = 1 - 300 μM) (Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523 a 544). Parte da explicação para isso se refere ao fato de que parece que as células T que se desenvolvem no timo são negativamente selecionadas (indução de tolerância) em ligantes de auto-pepMHC, de modo que as células T com uma afinidade alta demais sejam deletadas (Starr et al. (2003) Annu Rev Immunol, 21, 139 a 176). Para compensar essas afinidades relativamente baixas, as células T fizeram um sistema correceptor evoluir na medida em que as moléculas de superfície celular CD4 e CD8 se ligam às moléculas de MHC (classe II e classe I, respectivamente) e sinergizam com o TCR na mediação da atividade de sinalização. A CD8 é particularmente eficaz nesse processo, permitindo que os TCRs com afinidade muito baixa (por exemplo, Kd = 300 μM) mediem a atividade potente específica quanto a antígeno.

[0008] In vitro, a evolução dirigida foi usada para gerar TCRs com afinidade maior para um pepMHC específico. Os três métodos de exibição diferentes que foram usados são de exibição em levedura (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55 a 62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5.387 a 5.392), exibição em bacteriófago (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349 a 354) e exibição em célula T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175 a 184). Em todas as três abordagens, o processo envolve modificação ou modificação genética de um TCR que exibe a afinidade baixa normal do TCR do tipo selvagem, de modo que a afinidade de mutantes do TCR tenha afinidade aumentada para o pepMHC cognato (o antígeno original para o qual as células T foram específicas). Dessa forma, o TCR do tipo selvagem foi usado como um modelo para a produção de bibliotecas submetidas à mutagênese em uma ou mais das CDRs e mutantes com maior afinidade foram selecionados mediante a ligação ao antígeno de peptídeo-MHC cognato.

[0009] Na presente revelação, são revelados receptores de célula T de alta afinidade específicos para um antígeno de câncer de survivina geneticamente modificado por exibição em levedura. A proteína survivina promove a oncogênese mediante a inibição da sinalização que leva à apoptose normal (Dohi et al. (2004) Journal of Clinical Investigation 114, 1.117 a 1.127). A survivina é regulada de maneira ascendente em tecido canceroso (Ambrosini et al. (1997) Nat Med 3, 917 a 921). Tem sido o alvo de esforços de vacina e diversas abordagens de célula T adotiva o uso de células T com receptores de célula T do tipo selvagem.

[0010] O antígeno de peptídeo survivina foi classificado com número 21 em uma lista de priorização dos 75 principais antígenos de câncer pelo Instituto Nacional do Câncer (Cheever et al. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5.323 a 5.337). Consequentemente, há uma necessidade de identificar agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, que alvejem especificamente esse antígeno de câncer. A presente invenção fornece TCRs geneticamente modificados in vitro e com maior afinidade que podem ser usados, por exemplo, na forma solúvel para a entrega alvejada in vivo ou como genes introduzidos em células T em uma configuração de célula T adotiva.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção se refere a receptores de célula T geneticamente modificados in vitro (TCR) que se ligam ao antígeno de survivina com afinidade aprimorada. Mais especificamente, a presente revelação se refere a mutações de estabilização e de afinidade selecionadas através da exibição de bibliotecas sobre a superfície de levedura, bacteriófago ou células de mamífero; a proteínas de TCR selecionadas a partir dessas bibliotecas para a ligação a um antígeno com afinidade aumentada; e ao uso de derivados de TCR selecionados in vitro para aplicações terapêuticas, de diagnóstico ou de imaginologia.

[0012] Um aspecto da invenção se refere a um receptor de célula T modificado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um Vα e um Vβ derivado a partir de um receptor de célula T do tipo selvagem, em que o Vα, o Vβ, ou ambos, compreendem uma mutação em uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) em relação ao receptor de célula T do tipo selvagem, em que o receptor de célula T modificado se liga ao antígeno de peptídeo/MHC conhecido como survivina/HLA-A2 (o peptídeo survivina LMLGEFLKL (SEQ ID NO:5), ligado ao produto MHC conhecido como HLA-A2).

[0013] Em uma modalidade, o receptor de célula T modificado compreende um Vα modificado que compreende uma sequência de aminoácidos que tem ao menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos Vα apresentada em SEQ ID NO:3, em que o receptor de célula T modificado se liga a survivina/HLA-A2 com uma afinidade (valor KA) maior em 106 M .

[0014] Em outra modalidade, o receptor de célula T modificado compreende um Vα modificado que compreende uma sequência de aminoácidos que tem ao menos 80% de identidade com s sequência de aminoácidos Vα apresentada em SEQ ID NO:4, em que o receptor de célula T modificado se liga a survivina/HLA-A2 com uma afinidade (valor KA) maior em 106 M .

[0015] Em outra modalidade, o receptor de célula T é um receptor de célula T de cadeia única que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:6.

[0016] Em outra modalidade, o receptor de célula T é um receptor de célula T de cadeia única que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:7.

[0017] Em outra modalidade, o receptor de célula T contém ao menos uma dentre as mutações em CDR3α selecionada dentre N92S, N100K, A101 G, R102Y e L103K da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3.

[0018] Em outra modalidade, o receptor de célula T contém ao menos uma dentre as mutações em CDR3α selecionada dentre N92H, N100G, A101 W, R102Y e L103T da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:4.

[0019] Em uma modalidade, o receptor de célula T modificado é gerado por meio de seleção in vitro de uma biblioteca de exibição em levedura de receptores de célula T mutantes.

[0020] Em outra modalidade, o receptor de célula T modificado é expresso como uma proteína solúvel que se liga a seu antígeno alvo.

[0021] Em outra modalidade, o receptor de célula T modificado é expresso sobre a superfície de células T a fim de mediar a atividade de células T CD4+ ou CD8+.

[0022] Um aspecto da invenção se refere a um agente terapêutico que alveja células de câncer que expressam o antígeno de survivina, em que o agente terapêutico compreende um receptor de célula T modificado descrito no presente documento. Em uma modalidade, um agente terapêutico que alveja células de câncer que expressam o antígeno de survivina, em que o agente terapêutico compreende uma célula T humana que expressa um receptor de célula T modificado descrito no presente documento.

[0023] Uma modalidade fornece um método para o tratamento de um indivíduo que tem um câncer que expressa o antígeno de survivina que compreende administrar um agente terapêutico descrito no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A Figura 1 é um diagrama que mostra um método para modificar geneticamente TCRs de cadeia única para afinidade aprimorada contra um peptídeo:HLA.A2. O processo geral usado para modificar geneticamente o TCRs de alta afinidade é mostrado.

[0025] A Figura 2A é um diagrama tridimensional que mostra uma vista lateral do complexo TCR:pepMHC (A6; PDB:1AO7). As regiões variável (V) e constante (C) da cadeia α e da cadeia β são indicadas. A estrutura mostrada não inclui a região Cα do TCR. HLA-A2 (α1, α2, α3 e β2m) é mostrado em cinza e o peptídeo Tax (LLFGYPVYV, SEQ ID NO:6) é mostrado em preto. Os TCRs A6 e survivina examinados na presente invenção usam o segmento Vα2 (também chamado de TRAV12 com base na nomenclatura de IMGT).

[0026] A Figura 2B é um diagrama tridimensional que mostra a vista de cima para baixo da área de projeção de TCR (CDR) sobre o peptídeo-MHC (Tax/HLA-A2). Embora nenhuma estrutura de cristal tenha sido descrita para o TCR de survivina usado na presente revelação, essa orientação de ancoragem diagonal, com a região Vα posicionada sobre a hélice de α2 MHC e a extremidade N-terminal do peptídeo, e a região Vβ posicionada sobre a hélice de α1 MHC e extremidade C-terminal do peptídeo, foi observada em virtualmente todos os complexos até o presente momento.

[0027] A Figura 3 é uma representação esquemática do sistema de exibição em levedura para modificar geneticamente fragmentos de receptor de célula T de cadeia única (Vα-ligante Vβ ou Vβ-ligante- Vα).

[0028] As Figuras 4A e 4B mostram histogramas de citometria de fluxo da biblioteca propensa a erros de survivina após a seleção com um anticorpo que reconhece um epítopo de conformação de Vβ20. A biblioteca propensa a erros foi selecionada sequencialmente com uma diluição de 1:10 de BC hVβ20 FITC IgG, seguido de anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo AlexaFluor® 488 (1:100), para um total de 3 seleções. As alíquotas de células de levedura após cada seleção foram incubadas com uma diluição de 1:10 de BC hVβ20 (Figura 4A). Cinza indica células de levedura manchadas com anticorpo secundário apenas. Os clones estáveis K2 manchados com uma diluição de 1:20 de hVβ20 FITC IgG, seguido de anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo AlexaFlour 647 (1:100) (Figura 4B).

[0029] As Figuras 5A e 5B mostram histogramas de citometria de fluxo da biblioteca de survivina CDR3α após a seleção com BC hVβ20 e SurvT2M:HLA-A2, e a ligação de dois TCRs de alta afinidade a SurvT2M:HLA- A2. A biblioteca de survivina CDR3α foi selecionada primeiramente com BC hVβ20 (1:10), seguido de anticorpo secundário MB anti-IgG de camundongo em microesferas (1:25), com o uso de colunas magnéticas. As bibliotecas de survivina CDR3α foram, então, selecionadas com 100 nM de dímero de SurvT2M:HLA-A2 (DimerX; obtido junto à BD Pharmingen), seguido de anticorpo secundário MB anti-IgG de camundongo em microesferas (1:25), para um total de três seleções magnéticas. A levedura isolada foi subsequentemente selecionada com o uso de seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) com 100 nM de dímero de SurvT2M:HLA-A2 (DimerX; obtido junto a BD Pharmingen), seguido de anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo AlexaFluor® 647 (1:100). As alíquotas de células de levedura após cada seleção foram, então, incubadas com 100 nM de dímero de SurvT2M:HLA- A2 (DimerX; obtido junto à BD Pharmingen), seguido de anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo AlexaFluor® 647 (1:100) (Figura 5A). Cinza indica células de levedura manchadas com anticorpo secundário apenas. Os clones de ligação aprimorados K2.4.1 (Figura 5B, painel esquerdo) e K2.4.6 (Figura 5B, painel direito), isolados após a 4a seleção com o uso de FACS, são manchados com 100 nM de dímero de SurvT2M:HLA-A2 (DimerX; obtido junto à BD Pharmingen), seguido de anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo AlexaFluor® 647 (1:100) (Figura 5B).

[0030] As Figuras 6A e 6B mostram as propriedades de ligação de um TCR de alta afinidade, K2.4.1, para monômeros de SurvT2M:HLA-A2. A Figura 6A é um histograma de citometria de fluxo que mostra o scTCR de alta afinidade K2.4.1 manchado com diversas concentrações de monômero de SurvT2M:HLA-A2, seguido de anticorpo secundário SA-PE (1:100). A Figura 6B é um gráfico de linhas que mostra valores de intensidade de fluorescência média (MFI) de histogramas na Figura 6A plotados versus concentração de monômero de SurvT2M:HLA-A2.

[0031] A Figura 7 representa as sequências dos TCRs de alta afinidade específicos quanto a survivina (K2.4.1 e K2.4.6). As variantes de cadeia única de alta afinidade foram isoladas a partir de bibliotecas de CDR que foram, então, submetidas à triagem acerca de maturação de afinidade. As mutações isoladas a partir de bibliotecas de estabilidade estão sublinhadas e em negrito; as mutações isoladas a partir de bibliotecas de maturação de afinidade estão em caixa e em negrito. A sequência de regiões V do tipo selvagem com as mutações de “estabilização” no clone exibido em levedura K2 também é mostrada. As sequências de aminoácidos mostradas para a cadeia de Vβ correspondem a SEQ ID NO:12, e a sequência de ligante representada é SEQ ID NO:7. As sequências de aminoácidos mostradas para a cadeia Vα correspondem a SEQ ID NOs:13, 1 e 2, a partir do topo ao fundo.

[0032] As Figuras 8A a 8C mostram os resultados de um ensaio de célula T em que as células T foram transduzidas com o TCR K2.4.1 TCR. As células T foram isoladas a partir de camundongos transgênicos AAD (esses são camundongos que têm um gene híbrido de classe I que consiste nos domínios α1 e α2 de HLA-A2 e no domínio α3 do Dbde camundongo; esses camundongos AAD estão disponíveis junto à Jackson Laboratories). As células foram ativadas com esferas acopladas com esferas anti-CD3/anti-CD28 durante 24 horas. As células T foram transduzidas de maneira retroviral com o uso do vetor pMP71 contendo os domínios Vα e β do TCR K2.4.1 ligados aos domínios Cα e Cβ do 2C TCR murídeo (Figura 8A). As células T (linha preta) transduzidas por K2.4.1 e simuladas (cinza) foram, então, manchadas com tetrâmero de SurvT2M:HLA- A2 a uma concentração de 20 nM (Figura 8B). As células T foram, então, incubadas em um 1:1 E:T com células T2 humanas que expressam HLA-A2, e diversas concentrações de peptídeo survivina durante 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados e a liberação de IFN-Y foi medida com o uso de um ELISA (Figura 8C).

[0033] As Figuras 9A e 9B são diagramas que ilustram aplicações terapêuticas exemplificadoras dos TCRs de cadeia única de alta afinidade isolados a partir das bibliotecas de arcabouço principal. A Figura 9A representa cinco exemplos de formatos de TCR para o uso como produtos terapêuticos solúveis: 1) TCR de cadeia única em uma orientação Vα-Vβ ou orientação Vβ- Vα (domínios V de alta afinidade mutantes são mostrados com um asterisco); 2) TCR de cadeia única fundido em quadro com os domínios de região constante de um anticorpo; 3) fusão de imunoglobulina em quadro à região constante da cadeia leve ou da cadeia pesada; 4) TCR de cadeia única (ou as fusões de imunoglobulina mostradas em 2 e 3) diretamente acoplado a um fármaco; e 5) TCR de cadeia única ligado em quadro com um Fv de cadeia única (VL-ligante- VH) para gerar um agente biespecífico. A Figura 9B representa dois exemplos de terapias com base celular que usariam os domínios variáveis de alta afinidade (V) isolados por exibição em levedura, clonados em vetores de célula de mamífero, para a expressão por células T em terapia de célula T adotiva como: 1) receptores de cadeia única em receptores de antígeno quimérico (CAR) e 2) TCRs de comprimento total α e β.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0034] SEQ ID NO:1 É a sequência de aminoácidos de uma região Vα modificada do TCR (Survivina-K2.4.1) que se liga com alta afinidade a survivina/HLA-A2.

[0035] SEQ ID NO:2 É a sequência de aminoácidos de outra região Vα modificada do TCR (Survivina-K2.4.6) que se liga com alta afinidade a survivina/HLA-A2.

[0036] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácidos de um TCR de cadeia única (survivina- K2.4.1) que se liga com alta afinidade a survivina/HLA- A2.

[0037] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos de outro TCR de cadeia única (survivina- K2.4.6) que se liga com alta afinidade a survivina/HLA-A2.

[0038] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácidos do antígeno de survivina.

[0039] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos do antígeno de Tax.

[0040] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácidos do ligante.

[0041] SEQ ID NO:8 é a sequência de polinucleotídeos do emenda de iniciador 4L.

[0042] SEQ ID NO:9 é a sequência de polinucleotídeos do iniciador T7.

[0043] SEQ ID NO:10 é a sequência de polinucleotídeos do iniciador inverso usado para gerar PreSOE no 1 da biblioteca de Surv CDR3α.

[0044] SEQ ID NO:11 é a sequência de polinucleotídeos do iniciador direto usado para gerar PreSOE no 2 da biblioteca de Surv CDR3α.

[0045] SEQ ID NO:12 é a sequência de aminoácidos da região Vb do TCR (survivina-K2) que se liga a survivina/HLA-A2.

[0046] SEQ ID NO:13 é a sequência de aminoácidos da região Va do TCR (survivina-K2) que se liga a survivina/HLA-A2.

[0047] SEQ ID NO:14 é a sequência de aminoácidos do antígeno de WT1.

[0048] SEQ ID NO:15 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo de influenza A.

[0049] SEQ ID NO:16 é a sequência de aminoácidos de um peptídeo de influenza A variante.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0050] A descrição a seguir é destinada a facilitar o entendimento da revelação, porém sem limitação.

[0051] Em geral, os termos e frases usados no presente documento têm seu significado reconhecido na técnica, que pode ser encontrado mediante a referência a textos padrão, referências de jornal e contextos conhecidos por aqueles elementos versados na técnica. As definições a seguir são fornecidas para esclarecer seu uso específico no contexto da revelação.

[0052] Para uso na presente invenção, “ligado” se refere a uma associação entre dois grupos, que pode ser uma associação covalente ou não covalente. Os grupos podem ser ligados com o uso de uma cadeia de peptídeo de comprimento variável, um grupo químico não aminoácido ou outros meios conforme conhecido na técnica. Uma região de ligante pode ser uma sequência de aminoácidos que liga de maneira operacional dois domínios estruturais ou funcionais de uma proteína ou peptídeo.

[0053] Para uso na presente invenção, o termo “agente quimioterápico” se refere a qualquer substância capaz de reduzir ou impedir o crescimento, proliferação ou espalhamento de uma célula de câncer, uma população de células de câncer, tumor ou outro tecido maligno. O termo tem também por objetivo abranger qualquer agente antitumoral ou anticâncer.

[0054] Para uso na presente invenção, o termo “quantidade eficaz” tem por objetivo abranger contextos como uma quantidade farmaceuticamente eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz. Por exemplo, em determinadas modalidades, a quantidade eficaz tem capacidade para alcançar um estado benéfico, resultado benéfico, atividade funcional em um ensaio de triagem, ou aprimoramento de uma condição clínica.

[0055] Para uso na presente invenção, o termo “célula de câncer” tem por objetivo abranger definições conforme amplamente compreendido na técnica. Em uma modalidade, o termo se refere a uma célula regulada de maneira anormal que possa contribuir para uma condição clínica de câncer em um ser humano ou animal. Em uma modalidade, o termo pode se referir a uma linhagem de células cultivada ou uma célula dentro ou derivada a partir de um corpo de ser humano ou animal. Uma célula de câncer pode ser de uma ampla variedade de tipos de órgãos, tecidos ou células diferenciadas conforme é compreendido na técnica. Os exemplos particulares de células de câncer incluem câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pele, câncer de ovário, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer testicular, câncer do esôfago e outros tipos de câncer.

[0056] Para uso na presente invenção, “tratar” ou “tratamento” se refere a uma abordagem para a obtenção de resultados desejados ou benéficos, incluindo e de preferência resultados clínicos. O tratamento pode se referir à melhora de sintomas da doença ou afecção, ou ao atraso da progressão da doença ou afecção.

[0057] Para uso na presente invenção, “prevenção” ou “prevenir” se refere a uma abordagem para prevenir, inibir ou reduzir a probabilidade de, o início ou recorrência de uma doença ou afecção. Também se refere à prevenção, inibição ou redução da probabilidade de, da ocorrência ou recorrência dos sintomas de uma doença ou afecção, e inclui também a redução da intensidade, efeito, sintomas e/ou carga de uma doença ou afecção antes do início ou recorrência da doença ou afecção.

[0058] Para uso na presente invenção, “inibição de crescimento celular” ou “inibição de proliferação de células” se refere à redução ou interrupção da taxa de crescimento de células. Por exemplo, mediante a inibição do crescimento de células de tumor, a taxa de aumento em tamanho do tumor pode diminuir. Em outras modalidades, o tumor pode permanecer com o mesmo tamanho ou diminuir de tamanho, isto é, regredir. Em modalidades particulares, a taxa de crescimento celular ou proliferação celular é inibida em ao menos 20%, ao menos 30%, ao menos 40%, ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80% ou ao menos 90%.

[0059] Os termos “tipo selvagem” e “wt” são usados de forma intercambiável no presente documento e são usados em referência a um TCR que tem uma sequência de aminoácidos ou um polinucleotídeo que codifica as regiões variáveis isoladas a partir de um TCR não modificado ou de ocorrência natural, por exemplo, o clone de célula T parental ou original, com especificidade para o antígeno.

[0060] Nas Figuras e Tabelas que apresentam as sequências de aminoácidos, o tipo selvagem é designado com “wt”. Nas sequências apresentadas abaixo da sequência de topo, um traço indica que o aminoácido é igual àquele presente no wt ou sequência de topo do alinhamento. Uma letra indica que uma substituição foi feita naquela posição a partir da sequência de topo.

[0061] Para uso na presente invenção, os termos receptor de célula T “modificado”, “variante”, “mutante” e “derivado” se referem a sequências de TCR das regiões variáveis que têm uma ou mais mutações em comparação com o clone de célula T do tipo selvagem ou original. Os exemplos de TCRs modificados incluem TCRs de maior afinidade.

[0062] Uma sequência de codificação é a parte de um gene ou cDNA que codifica a sequência de aminoácidos de uma proteína ou um RNA funcional como um tRNA ou rRNA.

[0063] A sequência complementar ou de complemento se refere a uma sequência de nucleotídeos que forma um duplex ligado a hidrogênio com outra sequência de nucleotídeos de acordo com as regras de pareamento de bases de Watson-Crick.

[0064] À jusante se refere a uma posição relativa em DNA ou RNA e é a região em direção à extremidade 3’ de um filamento.

[0065] Expressão se refere à transcrição de um gene em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou RNA mensageiro (mRNA) e tradução subsequente de um mRNA em uma proteína.

[0066] Duas sequências de ácidos nucleicos são heterólogas entre si se as sequências forem derivadas a partir de organismos separados, se tais organismos forem ou não de espécies diferentes, contanto que as sequências não ocorram naturalmente em conjunto na mesma disposição no mesmo organismo.

[0067] Homologia se refere à extensão de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos.

[0068] Uma sequência de aminoácidos que é funcionalmente equivalente a uma sequência de TCR especificamente exemplificada é uma sequência de aminoácidos que foi modificada por meio de substituições de aminoácidos múltiplas ou únicas, por meio de adição e/ou deleção de aminoácidos ou em que um ou mais aminoácidos foram quimicamente modificados, mas que, no entanto, retêm a especificidade de ligação e atividade de ligação de alta afinidade de uma proteína de TCR solúvel ou ligado à célula da presente revelação. As sequências de nucleotídeos funcionalmente equivalentes são aquelas que codificam polipeptídeos que têm substancialmente a mesma atividade biológica que uma proteína de TCR solúvel ou ligado à célula especificamente exemplificada. No contexto da presente revelação, uma proteína de TCR solúvel é desprovida das porções de um TCR ligado à célula nativo e é estável em solução (isto é, não se agrega, em geral, em solução quando manuseado conforme descrito no presente documento e sob condições padrão para soluções de proteína).

[0069] O termo “isolado” se refere a uma composição, composto, substância ou molécula alterada pela mão do homem a partir do estado natural. Por exemplo, uma composição ou substância que ocorre na natureza é isolada se a mesma tiver sido alterada ou removida de seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é isolado, à medida que o termo é empregado no presente documento.

[0070] Um construto de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que é isolada a partir do gene de ocorrência natural ou que foi modificada para conter segmentos de ácido nucleico que são combinados e justapostos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza.

[0071] Molécula de ácido nucleico se refere a um polinucleotídeo linear de filamento duplo ou único que contém desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos que são ligados por ligações de 3’-5’-fosfodiéster.

[0072] Duas sequências de DNA são ligadas de maneira operacional se a natureza da ligação não interferir com a capacidade das sequências para afetar suas funções normais uma em relação à outra. Por exemplo, uma região de promotor seria ligada de maneira operacional a uma sequência de codificação se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de codificação.

[0073] Um polipeptídeo é um polímero linear de aminoácidos que são ligados por ligações de peptídeo.

[0074] O termo “promotor” se refere a uma sequência de DNA de ação cis, em geral, 80 a 120 pares de base de comprimento e localizada à montante do sítio de iniciação de um gene, a qual a polimerase de RNA pode se ligar e iniciar a transcrição correta. Podem existir sequências reguladoras de transcrição adicionais associadas que forneçam regulação ligada/desligada de transcrição e/ou que acentuem (aumentem) a expressão da sequência de codificação à jusante.

[0075] Uma molécula de ácido nucleico recombinante, por exemplo, uma molécula de DNA recombinante, é uma sequência de ácidos nucleicos inovadora formada in vitro através da ligação de duas ou mais moléculas de DNA não homólogas (por exemplo, um plasmídio recombinante que contém uma ou mais inserções de DNA estranho clonado em ao menos um sítio de clonagem).

[0076] Os termos “transformação” e “transfecção” se referem à modificação dirigida do genoma de uma célula por meio da aplicação externa de DNA recombinante purificado a partir de outra célula de genótipo diferente, conduzindo a sua absorção e integração no genoma da célula do indivíduo. Em bactérias, o DNA recombinante tipicamente não está integrado no cromossomo, mas em vez disso replica de maneira autônoma como um plasmídio. Os termos "transformado” e “transfectado” são usados de forma intercambiável no presente documento. Por exemplo, uma célula T pode ser transfectada com uma sequência de DNA que codifica um TCR de alta afinidade ou modificado descrito no presente documento, antes do tratamento de célula T adotiva.

[0077] À montante significa no lado 5’ de qualquer sítio em DNA ou RNA.

[0078] Um vetor é uma molécula de ácido nucleico que tenha capacidade para replicar de maneira autônoma em uma célula hospedeira e possa aceitar DNA estranho. Um vetor carrega sua própria origem de replicação, um ou mais sítios de reconhecimento exclusivos para endonucleases de restrição que podem ser usadas para a inserção de DNA estranho e normalmente marcadores selecionáveis, como genes que codificam resistência a antibióticos, e muitas vezes sequências de reconhecimento (por exemplo, promotor) para a expressão do DNA inserido. Os vetores comuns incluem vetores de plasmídio e vetores de bacteriófago.

[0079] Um receptor de célula T (TCR) de alta afinidade é um TCR geneticamente modificado com ligação mais forte a um ligante alvo do que o TCR do tipo selvagem. Alguns exemplos de alta afinidade incluem uma constante de ligação de equilíbrio para um ligante alvo de entre cerca de 10-6 M e 10-12 M e todos os valores individuais e faixas nos mesmos. Essa faixa abrange afinidades entre aquelas relatadas como afinidades do tipo selvagem (10-4 a 106 M) e aquelas que foram isoladas por evolução dirigida (cerca de 10-12M).

[0080] Uma citocina é uma proteína, peptídeo ou glicoproteína produzida por células que afetam outras células.

[0081] Mamífero inclui tanto mamíferos humanos como não humanos.

[0082] Aqueles elementos versados na técnica observarão que, devido à degenerescência do código genético, inúmeras sequências de nucleotídeos funcionalmente equivalentes codificam a mesma sequência de aminoácidos.

RECEPTORES DE CÉLULA T

[0083] O receptor de célula T (TCR) é composto de duas cadeias (αβ ou Yδ) que pareiam sobre a superfície da célula T para formar um receptor heterodimérico. O TCR αβ é expresso na maioria das células T no corpo e é conhecido por estar envolvido no reconhecimento de antígenos restritos por MHC. A genética molecular, estrutura e bioquímica de TCRs αβ foram agora estudados de maneira minuciosa. Cada cadeia α e β é composta de dois domínios: Domínios constantes (C) que ancoram a proteína na membrana celular e que associam com subunidades invariáveis do aparelho de sinalização de CD3 e domínios variáveis (V) que conferem o reconhecimento de antígeno através de seis laços, chamados de regiões determinantes de complementaridade (CDR). Cada um dos domínios V tem três CDRs. Essas CDRs interagem com um complexo entre um peptídeo antigênico ligado a uma proteína codificada pelo complexo principal de histocompatibilidade (pepMHC) (Davis e Bjorkman (1988) Nature, 334, 395 a 402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523 a 544; Murphy (2012), xix, 868 p.).

[0084] A genética molecular do TCR tem revelado um processo de recombinação genética entre múltiplos genes que combinam para formar a região de codificação dos domínios V. O processo é análogo ao desenvolvimento de anticorpos em que os genes de cadeia pesada e leve se reorganizam para gerar a diversidade enorme exibida por anticorpos derivados de célula B (Tonegawa (1988) In Vitro Cell Dev Biol, 24, 253 a 265). No caso de células T, o domínio V de cadeia α é formado pela redisposição de uma região V (entre cerca de 75 em seres humanos) para um segmento de gene de junção (J) (entre cerca de 61 em seres humanos) (Figura 5.8, Janeway, 8a edição). O domínio V de cadeia β é formado pela redisposição de uma região V (entre cerca de 52 em seres humanos) para um gene de diversidade (D) (entre 2 em seres humanos) para um segmento de gene de junção (J) (entre 13 em seres humanos) (Figura 5.8, (Murphy (2012), xix, 868 p.)). As junções das redisposições de gene VαJα e VβDβJβ codificam os laços de CDR3 de cada cadeia e contribuem para a diversidade enorme do TCR αβ, com um limite teórico de acima de 1015 TCRs diferentes (Davis e Bjorkman (1988) Nature, 334, 395 a 402), bem acima da diversidade alcançável em um ser humano devido ao fato de que existem apenas cerca de 1011 células T totais (Mason (1998) Immunol Today, 19, 395 a 404). A diversidade possível de CDR1 e CDR2 de cada cadeia é representada pelo número de genes V, à medida que esses laços são codificados dentro do gene V e os TCRs não se submetem à mutação somática in vivo. Embora a diversidade de laços de CDR1 e CDR2 seja relativamente limitada em comparação com os laços de CDR3, há uma série de exemplos em que tem existido seleção para regiões V particulares com base no produto de MHC e/ou antígeno de peptídeo.

[0085] Os produtos de MHC classe I se ligam a peptídeos de 8 a 10 aminoácidos de comprimento e são expressos em todas as células nucleadas no corpo (analisado por (Rock e Goldberg (1999) Annu Rev Immunol, 17, 739 a 779)). Enquanto toda a energia de ligação de uma interação de anticorpo- antígeno está focalizada no antígeno estranho, uma fração substancial da energia de ligação do TCR-peptídeo:MHC é direcionada para a molécula auto- MHC (Manning e Kranz (1999) Immunology Today, 20, 417 a 422). De fato, os estudos mais recentes têm sugerido que resíduos particulares dos laços de CDR1 e/ou CDR2 evoluíram para interagir com resíduos particulares nas hélices de MHC, fornecendo, assim, uma afinidade basal para MHC, respondendo pelo processo de restrição de MHC (Garcia et al. (2009) Nat Immunol, 10, 143 a 147; Marrack et al. (2008) Annu Rev Immunol, 26, 171 a 203).

[0086] Tem existido interesse no uso de TCRs que têm afinidades para um antígeno de peptídeo-MHC (classe I) acima da faixa normal (chamados de TCRs de maior afinidade) a fim de: 1) acionar a atividade de células T auxiliares de CD4 (que são desprovidas do co-receptor CD8) ou 2) desenvolver TCRs solúveis que poderiam ser usados para o alvejamento direto de uma célula, mediante a fixação de uma molécula “efetora” (por exemplo, regiões Fc de anticorpo, um fármaco tóxico ou um scFv de anticorpo, como um anticorpo anti-CD3, para formar uma proteína biespecífica)((Ashfield e Jakobsen (2006) IDrugs, 9, 554 a 559; Foote e Eisen (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 10.679 a 10.681; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5.387 a 5.392; Molloy et al. (2005) Curr Opin Pharmacol, 5, 438 a 443; Richman e Kranz (2007) Biomol Eng, 24, 361 a 373). Essa abordagem poderia também superar um problema enfrentado por alguns pacientes de câncer, pelo qual suas células T não expressam TCRs com especificidade e afinidade de ligação adequada com antígenos de tumor potenciais (em parte, devido aos processos tímicos e periféricos de tolerância). Por exemplo, mais de 300 antígenos de tumor definido por célula T e restrito por MHC foram agora identificado (cancerimmunity.org/peptide/) (Boon e Old (1997) Curr Opin Immunol, 9, 681 a 683; Cheever et al. (2009) Clin Cancer Res, 15, 5.323 a 5.337). Esses antígenos de tumor incluem peptídeos mutantes, antígenos de diferenciação e antígenos superexpressados, todos os quais poderiam servir como alvos para terapias. Devido ao fato de que a maior parte dos antígenos de câncer descritos foi derivada a partir de proteínas intracelulares que podem ser apenas alvejadas na superfície celular no contexto de uma molécula de MHC, os TCRs produzem o candidato ideal para agentes terapêuticos visto que os mesmos evoluíram para reconhecer essa classe de antígeno.

[0087] De modo similar, os TCRs podem detectar peptídeos derivados a partir de proteínas virais que foram naturalmente processadas em células infectadas e exibidas por uma molécula de MHC sobre a superfície celular. Muitos alvos de antígeno viral foram identificados no decorrer dos últimos 25 anos, incluindo peptídeos derivados a partir de genomas virais em HIV e HTLV (por exemplo, Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321; Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1.283 a 1.293; Utz et al. (1996) J Virol, 70, 843 a 851). Entretanto, os pacientes com essas doenças podem ser desprovidos dos TCRs ideais para a ligação e destruição das células infectadas. Finalmente, é possível que os TCRs pudessem ser usados como antagonistas do receptor de alvos autoimunes, ou como agentes de entrega para imunossuprimir a resposta de célula imune local, em um processo que seria altamente específico, evitando, assim, a supressão imunológica em geral ((Molloy et al. (2005) Curr Opin Pharmacol, 5, 438 a 443; Stone et al. (2012) Protein Engineering)).

RECEPTORES DE CÉLULA T MODIFICADOS

[0088] A evolução dirigida foi usada para gerar TCRs com afinidade maior para um pepMHC específico. Os três métodos de exibição diferentes que foram usados são de exibição em levedura (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55 a 62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5.387 a 5.392), exibição em bacteriófagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349 a 354) e exibição em célula T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175 a 184). Em todas as três abordagens, o processo envolve a modificação genética de um TCR que exibe a baixa afinidade normal do TCR do tipo selvagem, assim, mutantes do TCR tiveram afinidade aumentada para pepMHC específico (isto é, para o antígeno original que as células T foram específicas). Dessa forma, o TCR do tipo selvagem foi usado como um modelo para a produção de bibliotecas mutagenizadas em uma ou mais CDRs, seguido da seleção de mutantes com maior afinidade, mediante a ligação ao antígeno de peptídeo-MHC cognato. É bem conhecido na técnica que tal evolução dirigida in vitro é necessária para modificar geneticamente afinidades que são mais do que apenas poucas vezes acima da afinidade do tipo selvagem.

[0089] A exibição em levedura permite que a proteína de interesse seja expressa sobre a superfície como uma fusão Agα2 (Boder e Wittrup (1997) Nat. Biotech., 15, 553 a 557; Boder e Wittrup (2000) Methods Enzymol, 328, 430 a 444). Esse sistema foi usado com sucesso na modificação genética de TCRs de maior afinidade, anticorpos de cadeia única, fibronectina e outras proteínas. No sistema de exibição em levedura, o TCR foi exibido como uma proteína de cadeia única estabilizada, em formas Vβ-ligante-Vα ou Vα-ligante-Vβ (Aggen et al. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361 a 372; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5.387 a 5.392; Kieke et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 5.651 a 5.656; Richman et al. (2009) Mol Immunol, 46, 902 a 916; Weber et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 19.033 a 19.038), ou como um heterodímero de cadeia dupla (Aggen et al. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361 a 372; Richman et al. (2009) Mol Immunol, 46, 902 a 916). Dois TCRs de camundongo foram modificados geneticamente para maior afinidade com o uso desse sistema: 2C (restrito por MHC classe l) e 3.L2 (restrito por MHC classe ll) (Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5.387 a 5.392; Weber et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 19.033 a 19.038). Os fragmentos VαVβ de cadeia única de TCR humano (chamados de scTv ou scTCR) também foram recentemente desenvolvido aproveitando a estabilidade excepcional da região Vα humana chamada de Vα2, também conhecida como TCRA12 pela nomenclatura IMGT (Aggen et al. (2011) Protein Engineering, Design, & Selection, 24, 361 a 372). Nesse caso, os receptores de célula T de alta afinidade modificados geneticamente in vitro em um formato de cadeia única foram usados para isolar fragmentos scTv estabilizados humanos (Vβ-ligante- Vα), que poderiam ser expressos como proteínas estáveis, ambos sobre a superfície da levedura e na forma solúvel a partir de E. coli. Os TCRs incluíram dois fragmentos scTv humanos estabilizados, o A6 scTv que é específico para um peptídeo derivado a partir da proteína Tax do vírus linfotrófico de célula T humana e o 868 scTv que é específico para um peptídeo derivado a partir da proteína Gag do vírus da imunodeficiência humana (peptídeo: SL977-85). Ambos desses TCRs usaram o gene Vα2 (família IMGT: TRAV12), mas tinham resíduos CDR3α, CDR1β, CDR2β e CDR3β derivados a partir do clone de célula T original a partir do qual os TCRs foram isolados. Dessa forma, os mutantes de maior afinidade desses scTCRs foram, cada um, derivados a partir de seu TCR original (parental) contra seus antígenos de peptídeo-MHC cognato.

[0090] Em um segundo sistema, a exibição em bacteriófago, a proteína de interesse é fundida à terminação N de uma proteína de revestimento viral (Scott e Smith (1990) Science, 249, 386 a 390). Diversos TCRs, inclusive aqueles denominados A6, 868 e 1G4 (restrito por MHC classe l), foram geneticamente modificados para maior afinidade com o uso desse método (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349 a 354; Sami et al. (2007) Protein Eng Des Sel, 20, 397 a 403; Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med, 14, 1.390 a 1.395). A exibição em bacteriófago desses TCRs foi possível mediante a introdução de uma ligação de dissulfeto não nativa entre os dois domínios C a fim de promover o pareamento das cadeias α e β. Esse sistema usa, dessa forma, proteínas heterodiméricas de comprimento total (VαCα/VβCβ) derivadas a partir dos clones de célula T originais para modificar geneticamente contra seu peptídeo- MHC cognato.

[0091] Um terceiro sistema que foi relatado para a modificação genética de TCRs é a exibição em célula de mamífero (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175 a 184; Kessels et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 14.578 a 14.583). Esse sistema usa um vetor retroviral para introduzir as cadeias α e β de TCR em um hibridoma de célula T negativo de TCR. Em um estudo (Kessels et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 14.578 a 14.583), o TCR mutante selecionado foi mostrado ligar-se a um peptídeo que foi estruturalmente muito similar ao peptídeo cognato (ASNENMDAM versus ASNENMETM, SEQ ID NOs:15 e 16, respectivamente). No outro estudo, a afinidade do TCR mutante foi mostrada como aumentada para o pepMHC cognato (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175 a 184). Foi mostrado em muitos estudos que tais TCRs de maior afinidade exibem também maiores afinidades contra variantes estruturalmente similares do peptídeo cognato (por exemplo, (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55 a 62)). No sistema de exibição em célula de mamífero, os TCRs introduzidos foram expressos sobre a superfície em sua conformação nativa, em complexo com subunidades de CD3, permitindo uma célula T completamente funcional (competente de sinalização). Os TCRs heterodiméricos de comprimento total em seu hospedeiro nativo foram, dessa forma, geneticamente modificados com o uso desse método.

TCRS DE ALTA AFINIDADE QUE SE LIGAM A SURVIVINA/HLA- A2

[0092] A presente invenção fornece TCRs de alta afinidade contra o antígeno de câncer bem conhecido survivina/HLA-A2. Em certas modalidades, os TCRs geneticamente modificados podem ser usados na forma solúvel para a entrega alvejada in vivo, ou como expressado de maneira recombinante por células T em um tratamento ou método de transferência adotiva. Em uma modalidade particular, uma forma VαVβ de cadeia única do arcabouço principal de TCR (scTCR) pode ser preparada e usada com uma carga útil como uma citocina, toxina, radioisótopo, agente quimioterápico ou fármaco (similares a conjugados de anticorpo-fármaco) para entregar a molécula efetora para o local em que o TCR se liga (por exemplo, tumor). O TCR pode também ser usado em terapias de célula, como transferência adotiva de células T CD4+, células T CD8+ e/ou células "natural killer" (NK), para mediar uma resposta contra células de câncer que expressam survivina. Os arcabouços principais de scTCR fornecidos no presente documento podem também ser usados para o diagnóstico de, por exemplo, células infectadas virais ou malignas através da identificação de, por exemplo, antígenos de superfície de célula associados a vírus ou neoplásticos por meio de ligação covalente, por exemplo, através de cadeias laterais de aminoácido reativo a sulfidrila ou reativo a amina do TCR, a um grupo detectável, como radioisótopo ou porção química fluorescente.

[0093] Em uma modalidade, as proteínas scTCR descritas no presente documento são exibíveis sobre a superfície de levedura, bacteriófago ou células de mamífero e podem ser usadas para modificar geneticamente TCRs com afinidade até maior com o antígeno de survivina. Em uma modalidade, as proteínas scTCR descritas no presente documento podem ser expressadas em uma célula procariótica, como Escherichia coli, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, células de inseto (por exemplo, Drosophila melanogaster), células de mamífero que incluem linhagens de células como linhagens de célula de ovário de hamster chinês (CHO), ou espécies vegetais (por exemplo, canola, soja, milho, batata, cevada, centeio, trigo), por exemplo, ou outras fontes de expressão de proteína conhecidas na técnica e produzidas em grandes quantidades. O TCR pode também ser usado, por exemplo, e somente a título de exemplo, para detectar o peptídeo/MHC específico sobre a superfície de uma célula. Em uma modalidade, os genes de scTCR revelados podem ser ligados com o uso de sequências de peptídeos adequadas, codificadas dentro do construto de DNA, aos genes para a sinalização de domínios e introduzidos em células T que possam eliminar as células-alvo. Esses construtos foram denominados receptores de antígeno quimérico CARs), que são agora amplamente usados no campo, incluindo o uso de CARs que contêm um scTCR.

[0094] Nas proteínas de TCR VαVβ de cadeia única fornecidas, as cadeias alfa variáveis e beta variáveis são conectadas com o uso de qualquer ligante de peptídeo adequado, inclusive aqueles conhecidos na técnica, como com as ligações de Fv de cadeia única de anticorpo(Bird et al. (1988) Science, 242, 423 a 426; Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6.444 a 6.448; Hoogenboom (2005) Nat Biotechnol, 23, 1.105 a 1.116; Turner et al. (1997) J Immunol Methods, 205, 43 a 54). Em uma modalidade, é fornecido um TCR de cadeia única humano solúvel que tem a estrutura: Vα-L-Vβ ou Vβ-L-Vα, em que L é um peptídeo ligante que liga Vβ com Vα, Vβ é uma região β variável de TCR, e Vα é uma região α variável de TCR.

[0095] Em uma modalidade, o TCR VβVα é chamado de survivina K2.4.1, em que Vβ é uma região β variável de TCR do grupo 20, e Vα2 é uma região α variável de TCR do grupo 2 (Utz, U., et al., 1996)(Aggen, D.A., et al., 2011). Em uma modalidade, o TCR VβVα é chamado de survivina K2.4.6, em que Vβ é uma região β variável de TCR do grupo 20 e Vα2 é uma região α variável de TCR do grupo 2.

[0096] Em uma modalidade, o peptídeo ligante contém mais de 5 resíduos de lisina. Em uma modalidade, o peptídeo ligante contém entre 5 e 30 aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo ligante tem uma sequência de aminoácidos de GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO:7). Em uma modalidade, o sc VβVα TCR fornecido não contém uma região constante. Quando a terminologia sc VβVα TCR é usada no presente documento, compreende-se que sc VβVα TCR também está incluído, à medida que a terminologia é compreendida e usada na técnica. Dessa forma, as cadeias Vβ e Vα podem ser conectadas umas às outras em qualquer configuração através do ligante.

[0097] Em um aspecto da revelação, o TCR VβVα da revelação se liga especificamente a um ligante com uma constante de ligação de equilíbrio KD entre cerca de 10-6 M e 10-12 M. Em uma modalidade desse aspecto da revelação, o ligante é um ligante de peptídeo/MHC. Em uma modalidade, o TCR VβVα da revelação tem afinidade acentuada em direção a um ligante, em comparação com as afinidades de TCRs do tipo selvagem normais.

GRUPOS BIOLOGICAMENTE ATIVOS

[0098] Também são fornecidas proteínas de TCR VβVα conforme descrito no presente documento, que incluem um grupo biologicamente ativo. Para uso na presente invenção, “grupo biologicamente ativo” é um grupo que causa um efeito mensurável ou detectável em um sistema biológico. Em uma modalidade, o grupo biologicamente ativo é selecionado dentre: um agente antitumoral, como, porém sem limitação, inibidores de angiogênese, inibidores de enzimas, inibidores de microtúbulo, reticuladores ou intercaladores de DNA, inibidores de síntese de DNA; uma citocina, como, porém sem limitação, IL-2, IL- 15, GM-CSF, IL-12, TNF-α, IFN-Y ou LT-α (Schrama et al. (2006) Nat Rev Drug Discov, 5, 147 a 159; Wong et al. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 373 a 383); um grupo anti-inflamatório, como, porém sem limitação, TGF-β, IL-37, IL-10 (Nold et al. (2010) Nat Immunol, 11, 1.014 a 1.022; Stone et al. (2012) Protein Engineering), um radioisótopo, como, porém sem limitação, 90Y ou 131I (Reichert e Valge-Archer (2007) Nat Rev Drug Discov, 6, 349 a 356); uma toxina, como, porém sem limitação, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de difteria ou a cadeia A de ricina (Pastan et al. (2006) Nat Rev Cancer, 6, 559 a 565; Schrama et al. (2006) Nat Rev Drug Discov, 5, 147 a 159); um fármaco ou um anticorpo, como Fv de cadeia única.

[0099] Em uma modalidade desse aspecto da revelação, o grupo biologicamente ativo é uma molécula citotóxica, às vezes mencionada como um fármaco (por exemplo, no termo “conjugado de fármaco de anticorpo”). Para uso na presente invenção, “citotóxica” significa tóxica para células. Os exemplos de moléculas citotóxicas incluem, mas não se limitam a, doxorrubicina, metotrexato, mitomicina, 5-fluorouracil, duocarmicina, auristatinas, maitansinas, calicheamicinas e análogos das moléculas acima (Jarvis (2012) Chemical and Engineering News, 90, 12 a 18; Litvak-Greenfeld e Benhar (2012) Adv Drug Deliv Rev; Ricart e Tolcher (2007) Nat Clin Pract Oncol, 4, 245 a 255). As moléculas citotóxicas não precisam causar a morte celular completa, mas, de preferência, uma inibição mensurável ou detectável de crescimento ou diminuição de atividade celular.

[0100] Em uma modalidade, um TCR descrito no presente documento é ligado a uma enzima capaz de converter um pró-fármaco em um fármaco. Isso é útil, por exemplo, por permitir que a forma ativa do fármaco seja criada no local alvejado pelo TCR (por exemplo, no sítio de um tumor).

[0101] Em uma modalidade, o grupo biologicamente ativo é ligado ao TCR de cadeia única através de um ligante, que pode ser realizado através de reações químicas padrão como grupos amina livre ou grupos sulfidrila do TCR.

[0102] Em outra modalidade, o TCR é fixado a um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) para gerar um agente biespecífico. Os anticorpos biespecíficos que contêm um scFv contra um antígeno de tumor e um contra a molécula CD3 da célula T foram usados agora com sucesso na clínica (Bargou et al. (2008) Science, 321, 974 a 977). Além disso, um agente biespecífico que contém um TCR e um scFv contra CD3 também foi relatado (Liddy et al. (2012) Nat Med, 18, 980 a 987).

[0103] É também fornecido um TCR VβVα de cadeia única, conforme descrito no presente documento, que inclui um grupo detectável. Em uma modalidade, o grupo detectável é aquele que pode ser detectado por meio de métodos baseados em enzima ou espectroscopia. Em uma modalidade, o grupo detectável é um grupo fluorescente, como, porém sem limitação, fluoresceína, R-ficoeritrina (PE), PE-Cy5, PE-Cy7, vermelho Texas ou aloficocianina (APC); um grupo radiomarcado como, porém sem limitação, 1251, 32P, 99mTc; um grupo absorvente ou uma enzima com propriedades que geram produtos detectáveis, como, porém sem limitação, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina.

[0104] Conforme conhecido na técnica, um grupo biologicamente ativo, grupo detectável ou outro grupo fixado ao TCR pode ser fixado com o uso de um ligante de peptídeo flexível ou por meio de conjugação química, e pode ser fixado de maneira covalente ou não covalente ao TCR.

[0105] É também fornecido no presente documento um TCR humano para o uso em um método para tratamento ou prevenção de câncer em um mamífero, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um TCR modificado ligado a uma molécula terapeuticamente eficaz a um mamífero. Em uma modalidade particular, o mamífero é ser humano. Em outra modalidade, o mamífero é um animal de estimação (por exemplo, um cachorro, um gato, coelho, roedor, cavalo) ou um animal de fazenda (por exemplo, vaca, cavalo, porco).

[0106] É também fornecido um TCR de cadeia única isolado (scTCR), conforme descrito no presente documento, e um método para a produção do TCR de cadeia única em E. coli. É também fornecida uma composição farmacêutica que compreende um scTCR, conforme descrito no presente documento, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0107] São também fornecidos os sc VαVβ TCRs descritos no presente documento que foram ligados a domínios de sinalização que rendem um TCR ativo sobre a superfície de uma célula T. Em uma modalidade, esse scTCR pode ser usado em um método para tratamento de câncer em um mamífero, que compreende: clonar o TCR em um vetor, introduzir o vetor em células T de um paciente e transferir de forma adotiva as células T de volta para um paciente.

POLINUCLEOTÍDEOS E POLIPEPTÍDEOS DE TCR MODIFICADOS

[0108] A revelação contempla um vetor de DNA que inclui ao menos um segmento de DNA que codifica um receptor de célula T de cadeia única (scTCR).

[0109] Aqueles elementos versados na técnica, através de técnicas de mutagênese padrão, em conjunto com os ensaios descritos no presente documento, podem obter sequências de TCR alteradas e testá-las acerca da especificidade e/ou afinidade de ligação particular. As técnicas de mutagênese úteis conhecidas na técnica incluem, sem limitação, síntese de genes de novo, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese específica quanto a região, mutagênese de varredura de ligante e mutagênese sítio-dirigida por PCR (consulte, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1999)).

[0110] Na obtenção de sequências de codificação de TCR modificado, aqueles elementos versados na técnica reconhecerão que as proteínas derivadas de TCR podem ser modificadas por meio de determinadas modificações pós-traducionais, deleções, adições e substituições de aminoácidos, sem perda ou redução da atividade biológica. Em particular, é bem conhecido que as substituições de aminoácidos conservadoras, isto é, substituição de um aminoácido por outro aminoácido de tamanho, carga, polaridade e conformação similar, são improváveis de alterar significativamente a função da proteína. Os 20 aminoácidos padrão que são os constituintes de proteínas podem ser amplamente categorizados em quatro grupos de aminoácidos conservadores conforme exposto a seguir: o grupo não polar (hidrofóbico) inclui alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano e valina; o grupo polar (não carregado, neutro) inclui asparagina, cisteína, glutamina, glicina, serina, treonina e tirosina; o grupo positivamente carregado (básico) contém arginina, histidina e lisina; e o grupo negativamente carregado (ácido) contém ácido aspártico e ácido glutâmico. A substituição em uma proteína de um aminoácido por outro dentro do mesmo grupo é improvável de ter um efeito adverso sobre a atividade biológica da proteína.

[0111] Em uma modalidade, um scTCR da revelação pode conter mutações adicionais em qualquer região ou regiões do domínio variável que resulte em uma proteína estabilizada. Em uma modalidade, uma ou mais mutações adicionais é em um ou mais dentre CDR1, CDR2, HV4, CDR3, FR2 e FR3. As regiões usadas para a mutagênese podem ser determinadas por evolução dirigida, em que estruturas de cristal ou modelos moleculares são usados para gerar regiões do TCR que interagem com o ligante de interesse (antígeno, por exemplo). Em outros exemplos, a região variável pode ser reconformada, mediante a adição ou deleção de aminoácidos para modificar geneticamente uma interação desejada entre o scTCR e o ligante.

[0112] Os polipeptídeos da invenção incluem TCRs modificados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, scTCR), e receptores de antígeno quiméricos (CARs). Os termos “polipeptídeo”, “proteína” e “peptídeo” e “glicoproteína” são usados de forma intercambiável e se refere a um polímero de aminoácidos não se limitando a qualquer comprimento particular. O termo não exclui modificações, como miristilação, sulfatação, glicosilação, fosforilação e adição ou deleção de sequências de sinais. Os termos “polipeptídeo” ou “proteína” se referem a uma ou mais cadeias de aminoácidos, em que cada cadeia compreende aminoácidos ligados de maneira covalente por ligações de peptídeo, e em que o dito polipeptídeo ou proteína pode compreender uma pluralidade de cadeias ligadas de maneira covalente e/ou não covalente em conjunto por ligações de peptídeo, que tem a sequência de proteínas nativas, isto é, proteínas produzidas por células de ocorrência natural e especificamente não recombinantes, ou células recombinantes ou geneticamente modificadas, e compreendem moléculas que têm a sequência de aminoácidos da proteína nativa, ou moléculas que têm deleções a partir de, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” abrange especificamente os TCRs modificados, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, da presente revelação, ou sequências que têm deleções a partir de, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um TCR modificado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Dessa forma, um “polipeptídeo” ou uma “proteína” pode compreender uma (denominada “um monômero”) ou uma pluralidade (denominada “um multímero”) de cadeias de aminoácido.

[0113] O termo “proteína isolada” mencionado no presente documento significa que uma presente proteína (1) é isenta de ao menos algumas outras proteínas com as quais a mesma seria tipicamente encontrada na natureza, (2) é essencialmente isenta de outras proteínas a partir da mesma fonte, por exemplo, a partir da mesma espécie, (3) é expressada por uma célula a partir de uma espécie diferente, (4) foi separada de ao menos cerca de 50 por cento de polinucleotídeos, lipídios, carboidratos ou outros materiais aos quais a mesma está associada na natureza, (5) não está associada (por meio de interação covalente ou não covalente) a porções de uma proteína às quais a “proteína isolada” está associada na natureza, (6) está associada de maneira operacional (por meio de interação covalente ou não covalente) a um polipeptídeo com o qual não está associado na natureza ou (7) não ocorre na natureza. Tal proteína isolada pode ser codificada por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, pode ser de origem sintética ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a proteína isolada é substancialmente isenta de proteínas ou polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que iriam interferir com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou de outro modo).

[0114] Em modalidades particulares, um presente TCR modificado pode ter: a) uma região variável de cadeia alfa de TCR que tem uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80% idêntica, ao menos 85% idêntica, ao menos 90%, ao menos 95% ou ao menos 98% ou 99% idêntica à região variável de cadeia alfa de um TCR modificado descrito no presente documento; e b) uma região variável de cadeia beta que tem uma sequência de aminoácidos que é ao menos 80% idêntica, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95% ou ao menos 98% ou 99% idêntica à região variável de cadeia beta de um TCR modificado descrito no presente documento.

[0115] Em modalidades particulares, o TCR modificado pode compreender: a) uma região variável de cadeia alfa de TCR que compreende: i. uma região CDR1 que é idêntica em sequência de aminoácidos à região CDR1 de cadeia alfa de um TCR selecionado descrito no presente documento; ii. uma região CDR2 que é idêntica em sequência de aminoácidos à região CDR2 de cadeia alfa do TCR selecionado; e iii. uma região CDR3 que é idêntica em sequência de aminoácidos à região CDR3 de cadeia alfa do TCR selecionado; e b) uma região variável de cadeia beta que compreende: i. uma região CDR1 que é idêntica em sequência de aminoácidos à região CDR1 de cadeia beta do TCR selecionado; ii. uma região CDR2 que é idêntica em sequência de aminoácidos à região CDR2 de cadeia beta do TCR selecionado; e iii. uma região CDR3 que é idêntica em sequência de aminoácidos à região CDR3 de cadeia beta do TCR selecionado; em que o TCR especificamente liga um antígeno não cognato selecionado. Em uma modalidade adicional, o TCR modificado, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é um TCR modificado variante em que a variante compreende uma cadeia alfa e uma cadeia beta idênticas ao TCR modificado selecionado, exceto por até 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais substituições de aminoácido nas regiões CDR das regiões V alfa e V beta. Sob esse aspecto, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou em certas modalidades, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mais substituições de aminoácidos nas regiões CDR do TCR modificado variante selecionado. As substituições podem ser em CDRs nas regiões V alfa e/ou regiões V beta. (Consulte, por exemplo, Muller, 1998, Structure 6:1.153 a 1.167).

[0116] Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que codifica um TCR modificado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em outras modalidades relacionadas, o polinucleotídeo pode ser um variante de um polinucleotídeo que codifica o TCR modificado. As variantes de polinucleotídeo podem ter identidade substancial com uma sequência de polinucleotídeos que codifica um TCR modificado descrito no presente documento. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que compreende ao menos 70% de identidade de sequência, de preferência ao menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais, de identidade de sequência em comparação com uma sequência de polinucleotídeos de referência, como uma sequência que codifica um TCR descrito no presente documento, com o uso dos métodos descritos no presente documento, (por exemplo, análise BLAST com o uso de parâmetros padrão, conforme descrito abaixo). Um elemento versado na técnica irá reconhecer que esses valores podem ser adequadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeos levando-se em conta a degenerescência de códon, similaridade de aminoácido, posicionado do quadro de leitura e similares.

[0117] Tipicamente, as variantes de polinucleotídeo irão conter uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, de preferência, de modo que a afinidade de ligação do TCR codificado pelo polinucleotídeo variante não seja substancialmente diminuída em relação a um anticorpo codificado por uma sequência de polinucleotídeos especificamente apresentada no presente documento.

[0118] Mediante a comparação de sequências de polinucleotídeos, duas sequências são consideradas “idênticas” se a sequência de nucleotídeos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para correspondência máxima, conforme descrito abaixo. As comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas mediante a comparação das sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma “janela de comparação”, para uso na presente invenção, se refere a um segmento de ao menos cerca de 20 posições contíguas, normalmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências são alinhadas de maneira ideal.

[0119] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido com o uso do programa Megalign no conjunto Lasergene de software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), com o uso de parâmetros padrão. Esse programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, páginas 345 a 358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, páginas 626 a 645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., CABIOS 5:151 a 153 (1989); Myers, E.W. e Muller W., CABIOS 4:11 a 17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406 a 425 (1987); Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726 a 730 (1983).

[0120] Alternativamente, o alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de identidade local de Smith e Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa por métodos de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2.444 (1988), por implantações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) ou por inspeção.

[0121] Um exemplo preferencial de algoritmos que são adequados para a determinação da porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3.389 a 3.402 (1977), e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 a 410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser usados, por exemplo, com os parâmetros descritos no presente documento, para determinar a porcentagem de identidade de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos. O software para a realização de análises por BLAST está disponível para o público em geral através do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia. Em um exemplo ilustrativo, as pontuações cumulativas podem ser calculadas com o uso, para sequências de nucleotídeos, dos parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correlacionados; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correlacionados; sempre <0). A extensão das palavras coincidentes (word hits) em cada direção é parada quando: a pontuação de alinhamento cumulativo diminui pela quantidade X a partir de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa chega a zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou o final de qualquer sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação entre ambos os filamentos.

[0122] Em certas modalidades, a “porcentagem de identidade de sequência” é determinada mediante a comparação de duas sequências alinhadas de maneira ideal em uma janela de comparação de ao menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, vãos) de 20 por cento ou menos, normalmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, em comparação com as sequências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada mediante a determinação do número de posições nas quais as bases de ácido nucleico idênticas ocorrem em ambas as sequências, para render o número de posições correlacionadas, dividindo-se o número de posições correlacionadas pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando-se os resultados por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência.

[0123] Será observado por aqueles elementos versados na técnica que, como resultado da degenerescência do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeos que codificam um TCR conforme descrito no presente documento. Alguns desses polinucleotídeos contêm identidade de sequência mínima com a sequência de nucleotídeos da sequência de polinucleotídeos nativa ou original que codifica TCRs modificados que se ligam, por exemplo, ao mesmo antígeno. Entretanto, os polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso de códon são expressamente contemplados pela presente revelação. Em certas modalidades, as sequências que foram otimizadas por códon para a expressão de mamífero são especificamente contempladas.

[0124] As técnicas padrão para clonagem, isolamento de DNA, amplificação e purificação, para reações enzimáticas que envolvem ligase de DNA, polimerase de DNA, endonuclease de restrição e similares, e diversas técnicas de separação são aquelas conhecidas e comumente empregadas pelos versados na técnica. Várias técnicas padrão são descritas em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nova Iorque; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nova Iorque; Wu (ed.) (1993) Meth. 387:50 (2004), de Zalipsky, S. 218, Parte I; Wu (ed.) (1979) Meth Enzymol. 68; Wu et al. (eds.) (1983) Meth. 387:50 (2004), de Zalipsky, S. 100 e 101; Grossman e Moldave (eds.) Meth. 387:50 (2004), de Zalipsky, S. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Old e Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif e Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames e Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; e Setlow e Hollaender (1979) Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1 a 4, Plenum Press, Nova Iorque. As abreviações e nomenclatura, onde empregadas, são consideradas padrão no campo e comumente usadas em jornais especializados, como aqueles citados no presente documento.

[0125] A homologia entre sequências de nucleotídeos pode ser determinada por meio de análise de hibridização de DNA, em que a estabilidade do híbrido de DNA de filamento duplo é dependente da extensão do pareamento de bases que ocorre. As condições de temperatura alta e/ou baixo teor de sal reduzem a estabilidade do híbrido e podem ser variadas para impedir o anelamento de sequências que têm menos do que um grau selecionado de homologia. Por exemplo, para sequências com cerca de 55% de teor de G - C, as condições de lavagem e hibridização de 40 a 50 °C, 6 X SSC (tampão de cloreto de sódio/citrato de sódio) e 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) indicam cerca de 60 a 70% de homologia, as condições de lavagem e hibridização de 50 a 65 °C, 1 X SSC e 0,1% de SDS indicam cerca de 82 a 97% de homologia, e as condições de lavagem e hibridização de 52 °C, 0,1 X SSC e 0,1% de SDS indicam cerca de 99 a 100% de homologia. Uma ampla gama de programas de computador para a comparação de sequências de aminoácidos e nucleotídeos (e medição do grau de homologia) estão também disponíveis, e uma lista que fornece fontes tanto de software gratuito como comercialmente disponível é encontrada em Ausubel et al. (1999). A comparação de sequência e múltiplos algoritmos de alinhamento de sequências prontamente disponíveis são, respectivamente, a ferramenta de pesquisa por alinhamento local básico (BLAST - "Basic Local Alignment Search Tool") (Altschul et al., 1997) e programas ClustalW. BLAST está disponível na Internet em ncbi.nlm.nih.gov e uma versão de ClustalW está disponível em www2.ebi.ac.uk.

[0126] As cepas industriais de micro-organismos (por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis), espécies de inseto (Drosophila), mamífero (por exemplo, linhagens de células de ovário de hamster chinês, CHO) ou vegetal (por exemplo, canola, soja, milho, batata, cevada, centeio, trigo) podem ser usadas como células hospedeiras para a produção recombinante das proteínas TCR. Em certas modalidades, a primeira etapa na expressão heteróloga de uma proteína solúvel ou proteína TCR de alta afinidade, um construto de expressão é montado para incluir o TCR ou sequência de codificação de TCR solúvel e sequências de controle, como promotores, acentuadores e terminadores. Outras sequências, como sequências de sinais e marcadores selecionáveis também podem estar incluídos. Para alcançar a expressão extracelular do TCR, o construto de expressão pode incluir uma sequência de sinais de secreção. Nas modalidades, a sequência de sinais não está incluída no construto de expressão se a expressão citoplasmática for desejada. Nas modalidades, o promotor e sequência de sinais são funcionais na célula hospedeira e fornecem a expressão e secreção do TCR ou proteína TCR solúvel. Os terminadores transcricionais podem estar incluídos para assegurar a transcrição eficaz. As sequências auxiliares que acentuam a expressão ou purificação da proteína também podem estar incluídas no construto de expressão.

[0127] Diversos promotores (região reguladora de iniciação transcricional) podem ser usados de acordo com a revelação. A seleção do promotor adequado pode depender do hospedeiro de expressão proposto. Os promotores a partir de fontes heterólogas podem ser usados, contanto que os mesmos sejam funcionais no hospedeiro escolhido.

[0128] A seleção de promotor depende também da eficiência desejada e do nível de produção de proteína ou peptídeo. Os promotores induzíveis, como tac, são muitas vezes empregados a fim de aumentar drasticamente o nível de expressão de proteína em E. coli. A superexpressão de proteínas pode ser prejudicial para as células hospedeiras. Consequentemente, o crescimento de célula hospedeira pode ser limitado. O uso de sistemas de promotor induzível permite que as células hospedeiras sejam cultivadas a densidades aceitáveis antes da indução da expressão de genes, facilitando, assim, os rendimentos maiores do produto.

[0129] Diversas sequências de sinais podem ser usadas de acordo com a revelação. Uma sequência de sinais que é homóloga à sequência de codificação de TCR pode ser usada. Alternativamente, uma sequência de sinais que foi selecionada ou projetada para a secreção e processamento eficaz no hospedeiro de expressão também pode ser usada. Por exemplo, os pares adequados de sequência de sinais/célula hospedeira incluem a sequência de sinais B. subtilis sacB para a secreção em B. subtilis, e o fator de correspondência α de Saccharomyces cerevisiae ou sequências de sinais phol fosfatase ácida de P. pastoris para a secreção de P. pastoris. A sequência de sinais pode ser unida diretamente através da sequência que codifica o sítio de clivagem de peptídeo de sinal à sequência de codificação de proteína, ou através de uma ponte de nucleotídeo curta que consiste normalmente em menos que dez códons, em que a ponte assegura o quadro de leitura correto da sequência de TCR à jusante.

[0130] Os elementos para acentuar a transcrição e tradução foram identificados para sistemas de expressão de proteína eucariótica. Por exemplo, o posicionamento do promotor do vírus mosaico de couve-flor (CaMV) 1.000 bp em qualquer lado de um promotor heterólogo pode elevar os níveis transcricionais em 10 a 400 vezes em células vegetais. O construto de expressão deveria incluir também as sequências de iniciação translacional adequadas. A modificação do construto de expressão para incluir uma sequência consenso de Kozak para a iniciação translacional adequada pode aumentar o nível de tradução em 10 vezes.

[0131] Um marcador seletivo é muitas vezes empregado, o qual pode ser parte do construto de expressão ou separado do mesmo (por exemplo, carregado pelo vetor de expressão), de modo que o marcador possa integrar em um sítio diferente do gene de interesse. Os exemplos incluem marcadores que conferem resistência a antibióticos (por exemplo, bla confere resistência à ampicilina para células hospedeiras de E. coli, nptll confere resistência à canamicina para uma ampla variedade de células eucarióticas e procarióticas) ou que permitem que o hospedeiro cresça em meio mínimo (por exemplo, HIS4 possibilita que P. pastoris ou His- S. cerevisiae cresça na ausência de histidina). O marcador selecionável tem suas próprias regiões reguladoras de terminação e iniciação traducional e transcricional para permitir a expressão independente do marcador. Se a resistência a antibióticos for empregada como um marcador, a concentração do antibiótico para seleção irá variar dependendo do antibiótico, em geral, na faixa de 10 a 600 μg do antibiótico/ml de meio.

[0132] O construto de expressão é montado empregando-se técnicas de DNA recombinante conhecidas (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999). A ligação e digestão de enzima de restrição são as etapas básicas empregadas para unir dois fragmentos de DNA. As extremidades do fragmento de DNA podem exigir modificação antes da ligação, e isso pode ser realizado mediante o preenchimento em projeções, deleção de porções terminais do(s) fragmento(s) com nucleases (por exemplo, Exolll), mutagênese sítio-dirigida ou por meio da adição de novos pares de bases por PCR. Os poliligantes e adaptadores podem ser empregados para facilitar a junção de fragmentos selecionados. O construto de expressão é tipicamente montado em estágios que empregam ciclos de restrição, ligação e transformação de E. coli. Inúmeros vetores de clonagem adequados para a construção do construto de expressão são conhecidos na técnica (ÀZAP e pBLUESCRIPT SK-1, Stratagene, LaJolla, CA; pET, Novagen Inc., Madison, Wl - citado em Ausubel et al., 1999) e a escolha particular não é importante para a revelação. A seleção de vetor de clonagem será influenciada pelo sistema de transferência de gene selecionado para a introdução do construto de expressão na célula hospedeira. No final de cada estágio, o construto resultante pode ser analisado acerca de restrição, sequência de DNA, hibridização e análises de PCR.

[0133] O construto de expressão pode ser transformado no hospedeiro como um construto de vetor de clonagem, linear ou circular, ou pode ser removido do vetor de clonagem e usado tal como é ou introduzido em um vetor de entrega. O vetor de entrega facilita a introdução e manutenção do construto de expressão no tipo de célula hospedeira selecionada. O construto de expressão é introduzido nas células hospedeiras por meio de qualquer um dentre uma série de sistemas de transferência de gene conhecidos (por exemplo, competência natural, transformação quimicamente mediada, transformação de protoplasto, eletroporação, transformação biolística, transfecção ou conjugação) (Ausubel et al., 1999; Sambrook et al., 1989). O sistema de transferência de gene selecionado depende das células hospedeiras e dos sistemas de vetor usados.

[0134] Por exemplo, o construto de expressão pode ser introduzido em células de S. cerevisiae por meio de eletroporação ou transformação de protoplasto. A eletroporação de S. cerevisiae é prontamente realizada e rende eficiências de transformação comparáveis à transformação de esferoplasto.

[0135] Os anticorpos monoclonais ou policlonais, de preferência, monoclonais, que reagem especificamente com uma proteína TCR em um sítio diferente do sítio de ligação de ligantes podem ser produzidos com o uso de métodos conhecidos na técnica, e muitos são comercialmente disponíveis. Consulte, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2a. Edição, Academic Press, Nova Iorque; e Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque.

[0136] Os TCRs na forma solúvel ou ligada à célula que são específicos para um ligante alvo particular são úteis, por exemplo, como sondas de diagnóstico para a triagem de amostras biológicas (como células, amostras de tecido, material de biópsia, fluidos corporais e similares) ou para a detecção da presença do ligante alvo em uma amostra de teste. Frequentemente, os TCRs são marcados por meio da união, de maneira covalente ou não covalente, de uma substância que fornece um sinal detectável. Os identificadores adequados incluem, mas não se limitam a, radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares. Adicionalmente, o TCR pode ser acoplado a um ligante para uma segunda ligação de moléculas: por exemplo, o TCR pode ser biotinilado. A detecção do TCR ligado a uma molécula ou célula alvo pode ser, então, efetuada pela ligação de uma estreptavidina detectável (uma estreptavidina a qual uma molécula fluorescente, radioativa, quimioluminescente ou outra molécula detectável é fixada ou a qual uma enzima em que há um substrato cromóforo disponível). As patentes dos Estados Unidos que descrevem o uso de tais identificadores e/ou compostos tóxicos a serem ligados de maneira covalente ao scTCR incluem, mas não se limitam a, nos 3.817.837; 3.850.752; 3.927.193; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; 4.331.647; 4.348.376; 4.361.544; 4.468.457; 4.444.744; 4.640.561; 4.366.241; RE 35.500; 5.299.253; 5.101.827; 5.059.413.

[0137] Os TCRs identificados podem ser detectados com o uso de um dispositivo de monitoramento ou método adequado para a identificação usada. A microscopia de fluorescência ou seleção de célula ativada por fluorescência pode ser usada, em que a identificação é uma porção química fluorescente, e em que a identificação é um radionuclídeo, contagem gama, autorradiografia ou contagem por cintilação líquida, por exemplo, podem ser usadas, desde que o método seja adequado para a amostra que é analisada e o radionuclídeo usado. Além disso, pode existir partícula ou moléculas de detecção secundárias empregadas, em que há uma partícula ou molécula detectável que reconheceu a porção do TCR que não é parte do sítio de ligação para o ligante alvo na ausência de um componente MHC, conforme observado no presente documento. A técnica tem conhecimento de compostos úteis para imaginologia de diagnóstico in situ; consulte, por exemplo, patente n° U.S. 5.101.827; 5.059.413. Os radionuclídeos úteis para terapia e/ou imaginologia in vivo incluem 111Índio, 97Rubídio, 125lodo, 131Iodo, 123lodo, 67Gálio, 99Tecnécio. As toxinas incluem toxina de difteria, ricina e toxina de semente de mamona, entre outras, desde que, uma vez que o complexo TCR-toxina é ligado à célula, a porção química tóxica seja internalizada de modo que possa exercer seu efeito citotóxico. A tecnologia de imunotoxina é bem conhecida na técnica e as moléculas tóxicas adequadas incluem, sem limitação, fármacos quimioterápicos, como vindesina, antifolatos, por exemplo, metotrexato, cisplatina, mitomicina, antrociclinas, como daunomicina, daunorrubicina ou adriamicina, e proteínas citotóxicas, como proteínas de inativação de ribossoma (por exemplo, toxina de difteria, proteína antiviral de caruru-de-cacho, abrina, ricina, endotoxina A de pseudomonas ou seus derivados recombinantes. Consulte, em geral, por exemplo, Olsnes e Pihl (1982) Pharmac. Ther. 25:355 a 381 e Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Eds. Baldwin e Byers, páginas 159 a 179, Academic Press, 1985.

[0138] A estrutura geral de moléculas de TCR e métodos para produzir e usar, incluindo a ligação a um peptídeo:complexo de histocompatibilidade principal foram revelados. Consulte, por exemplo, os documentos sob os nos PCT/US98/04274; PCT/US98/20263; WO99/60120.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E AGENTES TERAPÊUTICOS

[0139] Os TCRs específicos para um ligante alvo particular são úteis no tratamento de animais e mamíferos, incluindo seres humanos em que se acredita sofre de uma doença associada ao antígeno particular, por exemplo, uma doença ou distúrbio neoplástico, como câncer. Os exemplos de tipos de cânceres que podem ser tratados de acordo com os métodos descritos no presente documento incluem, mas não se limitam a, tumor de Wilm, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinomas do esôfago, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, neuroblastoma, carcinoma de pulmão de célula não pequena, câncer oral, osteosarcoma, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer renal, câncer de pele, carcinoma de pulmão de célula pequena e câncer testicular.

[0140] Os produtos terapêuticos podem ser produzidos com o uso dos materiais mostrados no presente documento. As quantidades eficazes de produtos terapêuticos são a dose mínima que produz um efeito mensurável em um indivíduo. Os produtos terapêuticos são facilmente preparados por um elemento versado na técnica. Em uma modalidade, um TCR da revelação é administrado diretamente a um paciente. Em uma modalidade, um TCR da revelação é ligado a PEG ou a regiões constantes de imunoglobulina, conforme conhecido na técnica. Essa modalidade prolonga o espaço livre de soro. Em uma modalidade, o TCR é ligado a um fármaco ou agente quimioterápico a fim de entregar o fármaco para uma célula alvo, como uma célula de câncer. Em uma modalidade, o scTCR é ligado a uma molécula efetora biológica, como uma citocina (Tayal e Kalra (2008) Eur J Pharmacol, 579, 1 a 12). Em uma modalidade, o TCR é ligado a uma citocina com atividade antitumoral, como IL- 2, IL-12 ou TNFα (Wong et al. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 373 a 83). Em uma modalidade, o TCR é ligado a uma citocina imunoinibitória, como IL-10 ou IL-13 (Stone et al. (2012) Protein Engineering). Em uma modalidade, o TCR é ligado a outra molécula de ligação a antígeno para formar um agente biespecífico (Miller et al. (2010) Protein Eng Des Sel, 23, 549 a 557; Thakur e Lum (2010) Curr Opin Mol Ther, 12, 340 a 349). Em uma modalidade, a molécula biespecífica é compreendida de um TCR ligado a um Fv de cadeia única, como um anti-CD3 ((Bargou et al. (2008) Science, 321, 974 a 977; Liddy et al. (2012) Nat Med, 18, 980 a 987), para reticular células T e células doentes. Em uma modalidade, o TCR é ligado a domínios de sinalização de TCR, como CD3, para formar um receptor de antígeno quimérico ((Porter et al. (2011) N Engl J Med, 365, 725 a 733; Sadelain et al. (2009) Curr Opin Immunol, 21, 215 a 223; Stroncek et al. (2012) J Transl Med, 10, 48). Esses métodos e outros métodos para administração, como de maneira intravenosa, são conhecidos na técnica. As dosagens úteis podem ser determinadas por um elemento versado na técnica.

[0141] As composições de TCR podem ser formuladas por qualquer um dos meios conhecidos na técnica. As mesmas podem ser tipicamente preparadas como injetáveis, especialmente para a administração intravenosa, intraperitoneal ou sinovial (com a via determinada pela doença particular) ou como formulações para a administração oral ou intranasal, como suspensões ou soluções líquidas. As formas sólidas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou outra administração podem também ser preparadas. A preparação pode também ser, por exemplo, emulsificada ou a(s) proteína(s)/peptídeo(s) encapsulado(s) em lipossomas.

[0142] Os ingredientes ativos são muitas vezes misturados com aditivos farmacêuticos opcionais, como excipientes ou carreadores que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados incluem, mas não se limitam a, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou similares e combinações dos mesmos. A concentração do scTCR em formulações injetáveis, aerossol ou nasal se situa normalmente na faixa de 0,05 a 5 mg/ml. A seleção das dosagens eficazes particulares é conhecida e realizada sem experimentação indevida por um elemento versado na técnica. As dosagens similares podem ser administradas em outras superfícies mucosas.

[0143] Além disso, se for desejado, as vacinas que poderiam incluir um scTCR podem conter quantidades menores de aditivos farmacêuticos, como substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH e/ou adjuvantes que acentuam a eficácia da vacina. Os exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, mas não se limitam a: hidróxido de alumínio; N-acetil-muramil-L-treonil-Disoglutamina (thr-MDP); N- acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, mencionado como nor- MDP); N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 ‘-2’-dipalmitoil-sn- glicero-3hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, mencionado como MTP-PE); e RIBI, que contém três componentes extraídos a partir de bactérias: monofosforil lipídio A, dimicolato de trealose e esqueleto de parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de 2% de esqualeno/Tween® 80. Tais formulações e modos de administração adicionais, conforme são conhecidos na técnica, podem também ser usados.

[0144] Os TCRs da presente revelação e/ou fragmentos de ligação que têm estrutura primária similar (mais de 90% de identidade) às regiões variáveis de TCR e que mantêm a alta afinidade para o ligante alvo, podem ser formulados em vacinas como formas de sal ou neutras. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, sais de adição ácidos (formados com grupos amino livres do peptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico ou ácidos fosfóricos; e ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, oxálico, tartárico ou maleico. Os sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados a partir de bases inorgânicas, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas, por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, 2- etilamino-etanol, histidina e procaína.

[0145] Os TCRs para uso terapêutico são administrados de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade e maneira em que sejam profilática e/ou terapeuticamente eficazes, de acordo com o que é conhecido na técnica. A quantidade que deve ser administrada, que se situa, em geral, na faixa de cerca de 100 a 20.000 μg de proteína por dose, mais geralmente, na faixa de cerca de 1.000 a 10.000 μg de proteína por dose. As composições similares podem ser administradas em formas similares com o uso de TCRs identificados para o uso em imaginologia, por exemplo, para detectar células às quais um ligante alvo está ligado. As quantidades precisas do ingrediente ativo exigidas para serem administradas podem depender do discernimento do médico ou veterinário e pode ser peculiar para cada indivíduo, mas tal determinação está no âmbito da prática de tal profissional.

[0146] O produto de TCR pode ser dado em uma dose única; cronograma de duas doses, por exemplo, duas a oito semanas separadas; ou um cronograma de múltiplas doses. Um cronograma de múltiplas doses é aquele em que um curso primário de tratamento pode incluir 1 a 10 ou mais doses separadas, seguido de outras doses administradas em intervalos de tempo subsequentes, conforme exigido para manter e/ou reforçar a resposta.

[0147] Cada formulação ou combinação de componentes descrita no presente documento ou exemplificada pode ser usada para praticar a revelação, exceto onde especificado em contrário. Os nomes específicos de substâncias são destinados a serem exemplificadores, conforme é de conhecimento que um elemento versado na técnica pode nomear as mesmas substâncias de maneira diferente. Quando um composto é descrito na presente invenção, de modo que um isômero ou enantiômero particular do composto não seja especificado, por exemplo, em uma fórmula ou em um nome químico, essa descrição destina-se a incluir cada isômero e enantiômero do composto descrito individualmente ou em qualquer combinação. Um elemento versado na técnica irá observar que os métodos, ligantes alvo, grupos biologicamente ativos, materiais de partida e métodos sintéticos além daqueles especificamente exemplificados podem ser empregados na prática da revelação, sem recorrer à experimentação indevida. Todos os equivalentes funcionais conhecidos na técnica, de quaisquer tais métodos, ligantes-alvo, grupos biologicamente ativos, materiais de partida e métodos sintéticos são destinados a serem incluídos nessa revelação. Sempre que uma faixa é dada nesse relatório descritivo, por exemplo, uma faixa de temperatura, uma faixa de tempo ou uma faixa de composição, todas as faixas intermediárias e subfaixas, assim como valores individuais incluídos nas faixas dadas, são destinadas a serem incluídas nessa revelação.

[0148] A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual em vista da condição do paciente (consulte, por exemplo, Fingl et. al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Cap. 1, página 1).

[0149] Deve-se observar que o médico responsável saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade, ou devido às disfunções do órgão. De modo contrário, o médico responsável saberia também ajustar o tratamento para níveis maiores se a resposta clínica não fosse adequada (eliminando a toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no gerenciamento do distúrbio de interesse irá variar com a severidade da afecção a ser tratada e com a via de administração. A severidade da afecção pode, por exemplo, ser avaliada, em parte, por métodos de avaliação de prognóstico padrão . Adicionalmente, a dose e talvez a frequência de dose também irão variar de acordo com a idade, peso corporal e resposta do paciente individual. Um programa comparável a esse discutido acima pode também ser usado em medicina veterinária.

[0150] Dependendo das afecções específicas que são tratadas e do método de alvejamento selecionado, tais agentes podem ser formulados e administrados de maneira sistêmica ou local. As técnicas para formulação e administração podem ser encontradas em Alfonso e Gennaro (1995). As vias adequadas podem incluir, por exemplo, administração oral, retal, transdérmica, vaginal, transmucosa ou intestinal; entrega parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas ou intramedulares, assim como injeções intratecais, intravenosas ou intraperitoneais.

[0151] Para injeção, os agentes da revelação podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência, em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão de solução salina fisiológica. Para administração transmucosa, os penetrantes adequados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são, em geral, conhecidos na técnica.

[0152] O uso de carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formular os compostos no presente documento, revelados para a prática da revelação, em dosagens adequadas para a administração sistêmica, é abrangido pelo escopo da revelação. Com a escolha adequada de carreador e prática de fabricação adequada, as composições da presente revelação, em particular, aquelas formuladas como soluções, podem ser administradas de maneira parenteral, como por meio de injeção intravenosa. Os compostos adequados podem ser formulados prontamente com o uso de carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica, em dosagens adequadas para a administração oral. Tais carreadores possibilitam que os compostos da revelação sejam formulados como comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas, suspensões e similares, para a ingestão oral por um paciente a ser tratado.

[0153] Os agentes destinados a serem administrados de maneira intracelular podem ser administrados com o uso de técnicas bem conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, tais agentes podem ser encapsulados em lipossomas e, então, administrados conforme descrito acima. Os lipossomas são bicamadas de lipídio esféricas com interiores aquosos. Todas as moléculas presentes em uma solução aquosa no momento da formação de lipossoma são incorporadas no interior aquoso. Os conteúdos lipossômicos são ambos protegidos contra o microambiente externo e, devido ao fato de que os lipossomas se fundem com as membranas celulares, são entregues de maneira eficaz para o citoplasma celular. Adicionalmente, devido a sua hidrofobicidade, as moléculas orgânicas pequenas podem ser diretamente administradas de maneira intracelular.

[0154] As composições farmacêuticas adequadas para o uso na presente revelação incluem as composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o propósito ao qual se destina. A determinação das quantidades eficazes está dentro da capacidade daqueles elementos versados na técnica, especialmente à luz da revelação detalhada fornecida no presente documento.

[0155] Adicionalmente aos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados que compreendem excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. As preparações formuladas para a administração oral podem ser sob a forma de comprimidos, drágeas, cápsulas ou soluções, inclusive aquelas formuladas para a liberação retardada ou apenas para serem liberadas quando o produto farmacêutico alcança o intestino grosso ou delgado.

[0156] As composições farmacêuticas da presente revelação podem ser fabricadas de uma maneira que seja conhecida por si própria, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levitação, emulsificação, encapsulação, captura ou liofilização.

[0157] As formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos na forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas adequadas. Os veículos ou solventes lipofílicos adequados incluem óleos graxos, como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. As suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetil celulose sódica, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode conter, também, estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[0158] As preparações farmacêuticas para o uso oral podem ser obtidas mediante a combinação dos compostos ativos com excipiente sólido, opcionalmente, com a trituração de uma mistura resultante, e o processamento da mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se for desejado, para obter núcleos de drágea ou comprimidos. Os excipientes adequados são, em particular, cargas como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, como, por exemplo, amido de milho maís, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanta, metil celulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se for desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico, ou um sal do mesmo, como alginato de sódio.

[0159] Os núcleos de drágea são dotados de revestimentos adequados. Para esse propósito, as soluções de açúcar concentradas podem ser usadas, as quais podem conter, opcionalmente, goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel à base de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e misturas de solvente ou solventes orgânicos adequados. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de drágea ou comprimidos para a identificação ou para caracterizar combinações diferentes de doses de compostos ativos.

[0160] As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de ajuste de encaixe produzidas a partir de gelatina, assim como cápsulas vedadas macias produzidas a partir de gelatina e um plastificante, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de ajuste de encaixe podem conter os ingredientes ativos em mistura por adição com carga, como lactose, aglutinantes, como amidos e/ou lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, como óleos graxos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, os estabilizantes podem ser adicionados.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0161] Os TCRs de alta afinidade e composições farmacêuticas que compreendem um TCR de alta afinidade podem ser usados, por exemplo, para tratar um paciente que tem um câncer, tumor, malignidade ou doença ou distúrbio neoplástico. Em uma modalidade, um método para tratamento de um paciente que tem câncer compreende administrar um TCR de alta afinidade descrito no presente documento. Em outra modalidade, o TCR de alta afinidade é específico para survivina. Em uma modalidade, o TCR compreende um Vα que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, o TCR compreende um Vα que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, o TCR de alta afinidade é um TCR de cadeia única que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3. Em outra modalidade, o TCR de alta afinidade é um TCR de cadeia única que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:4. Em outra modalidade, o TCR de alta afinidade é administrado em combinação com um agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterápico. Em ainda outra modalidade, o TCR de alta afinidade é conjugado a um grupo biologicamente ativo.

[0162] outro aspecto da invenção fornece um método para a transferência adotiva de células T para um paciente que necessita desse tratamento, que compreende a administração de células T que expressam um TCR de alta afinidade descrito no presente documento. Em uma modalidade, as células T foram transfectadas com um polinucleotídeo que codifica um TCR de alta afinidade que é específico para survivina. Em uma modalidade, o TCR compreende um Vα que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, o TCR compreende um Vα que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, o TCR de alta afinidade é um TCR de cadeia única que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, o TCR de alta afinidade é um TCR de cadeia única que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:4.

EXEMPLOS

[0163] Os exemplos a seguir descrevem, adicionalmente, os exemplos não limitadores da revelação.

EXEMPLO 1 MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE TCRS PARA MAIOR AFINIDADE PARA ANTÍGENOS DE PEPTÍDEO/HLA-A2

[0164] A estratégia geral usada para descobrir ou gerar TCRs de cadeia única para afinidade e estabilidade aprimorada é mostrada na Figura 1. O processo envolve seis etapas, conforme ilustrado:

[0165] 1) Clonagem dos genes de TCR Vα e Vβ a partir de um clone de célula T que reconhece um peptídeo antigênico restrito por MHC de interesse em um formato de TCR de cadeia única para exibição. Na presente invenção, os genes de TCR a partir de um clone de célula T humana que foi reativo com o antígeno de survivina (disponível junto à Delores Schendel, Thomas Blankenstein, e Wolfgang Uckert; consulte, por exemplo, Leisegang et al. (2010) J Clin Invest. 120(11), 3.869) foram clonados como um formato de cadeia única (Vβ-ligante-Vα) e introduzidos em um vetor de exibição de levedura para a expressão sobre a superfície de levedura. A descrição adicional do TCR do tipo selvagem reativo com o antígeno de survivina, consulte o documento sob o no US 2012/0128704.

[0166] 2) Geração de uma biblioteca propensa a erros e FACs ou seleção por esfera magnética para variantes estabilizadas com um anticorpo anti-Vβ. Devido ao fato de que os TCRs Vα e Vβ de cadeia única são muitas vezes instáveis devido à perda das regiões constantes de estabilização, as bibliotecas de mutagênese propensa a erros são geradas para selecionar mutações de estabilização que permitam a expressão estável sobre a superfície da levedura, embora outros formatos de exibição, incluindo, porém sem limitação, exibição em bacteriófago e mamífero, possam ser usados. Os vetores de exibição em bacteriófago e a clonagem têm rendido tamanhos de biblioteca de 1011, enquanto os vetores de exibição de levedura e etapas de recombinação homóloga têm rendido tamanhos de biblioteca de 1010 ((Benatuil et al. (2010) Protein Eng Des Sel, 23, 155 a 159). Diversos métodos foram usados para a seleção de variantes, incluindo ligação à base de afinidade a ligantes imobilizados (exibição em bacteriófago) ou seleções por partícula magnética com antígenos (exibição em levedura) ou seleção de célula ativada por fluorescência com antígenos de peptídeo-MHC identificados (exibição em levedura). A utilização de anticorpos contra o TCR Vβ que reconhecem epítopos dobrados, seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) ou seleção por esfera magnética são usadas para isolar variantes com ligação de anticorpo aprimorada no presente exemplo.

[0167] 3) Clones de scTCR isolados a partir da seleção da biblioteca propensa a erros são avaliados acerca da estabilidade térmica e uma variante estável é escolhida para um modelo para maturação de afinidade, e sequenciada. Tipicamente, são identificadas mutações de sítio único que contribuem para níveis de superfície aumentados sobre a levedura e estabilidade maior em solução.

[0168] 4) As sequências de scTCR estabilizadas são usadas como um modelo para a geração de bibliotecas de CDR, usualmente na CDR1α, CDR3α, CDR3β, embora outras regiões, incluindo, mas não se limitando a, CDR1β, CDR2α, CDR2β e HV4, possam também ser usadas. Na presente revelação, as variantes exibidas em levedura são selecionadas acerca da ligação aprimorada ao peptídeo:MHC, a partir das bibliotecas de CDR, com o uso de seleções por esfera magnética e/ou seleção de células ativadas por fluorescência (FACS), embora as seleções que utilizam outros métodos que incluem, porém sem limitação, panning (aderência celular) com exibição em bacteriófago ou seleções magnéticas ou FACS com exibição em mamífero, possam ser usadas.

[0169] 5) Clones de scTCR isolados a partir da seleção das bibliotecas de CDR são avaliados acerca da ligação específica ao peptídeo:MHC contra o qual os mesmos foram geneticamente modificados. Os plasmídios são resgatados a partir dos clones de levedura e sequenciados.

[0170] 6) Se forem exigidos aprimoramentos adicionais de afinidade, o clone de scTCR selecionado na etapa 5 pode ser usado como um modelo para a geração de bibliotecas adicionais em outros laços ou regiões que não selecionaram mutações, como CDR1α, CDR3α, CDR3β, embora outras regiões, que incluem, porém sem limitação, CDR1β, CDR2α, CDR2β e HV4, possam também ser usadas. Os exemplos de cada uma dessas etapas são descritos com mais detalhes abaixo.

EXEMPLO 2 ANÁLISE DO TCR A6 HUMANO, QUE USA O Vα2, EM COMPLEXO COM TAX:HLA.A2

[0171] Todos os TCRs adotam um ângulo de ancoragem (Docking) e dobramento de Ig similares, e o reconhecimento de TCR de pepMHC é totalmente mediado por resíduos específicos em laços de CDR (Garcia et al. (2009) Nat Immunol, 10, 143 a 7; Marrack et al. (2008) Annu Rev Immunol, 26, 171 a 203; Rudolph et al. (2006) Annu Rev Immunol, 24, 419 a 466)). Embora as estruturas de cristal para TCRs de survivina não estejam disponíveis no momento da presente revelação, é mostrada a estrutura do complexo A6:peptídeo Tax:HLA-A2 (PDB: 1AO7) (Garboczi et al. (1996) Nature, 384, 134 a 141), que usou o mesmo domínio Vα2 que o TCR de survivina. A vista lateral do complexo mostrou que as extremidades dos domínios variáveis que continham as seis CDRs ancoraram na molécula Tax:HLA.A2, com a região central do sítio de ligação posicionada sobre o peptídeo Tax (Figura 2A). A estrutura de cristal não inclui a região constante α, embora as regiões constantes ajudem a estabilizar o construto de comprimento total. As mutações de estabilização selecionadas na etapa 2 descrita acima são muitas vezes selecionadas em regiões de estrutura, como a interfase Vα/Vβ ou aonde as junções da interfase Cα/Vα ou Cα/Vβ ocorrem no TCR de comprimento total.

[0172] A vista de cima para baixo do complexo Tax:HLA.A2, com o TCR “removido”, exceto os seis laços de CDR, é mostrada (Figura 2B). Essa vista mostra que o TCR adota uma posição diagonal sobre o peptídeo-MHC, uma descoberta foi observada agora para todas as estruturas de TCR: peptídeo- MHC. Nessa orientação, os dois laços de CDR3 são posicionados sobre o peptídeo, embora existam diversos resíduos a partir dos laços de CDR1 e CDR2 que interagem predominantemente com as hélices da molécula de MHC. Para os propósitos de maturação de afinidade nas etapas 4 e 6, esses laços são muitas vezes alvejados para a geração de bibliotecas de maturação de afinidade, embora outras regiões possam ser usadas.

EXEMPLO 3 EXIBIÇÃO EM LEVEDURA DE TCRs DE SURVIVINA

[0173] Com a finalidade de realizar seleções acerca de estabilidade aprimorada (etapa 2) ou afinidade aprimorada (etapa 5), é necessário usar um sistema de exibição em que uma biblioteca de mutantes de TCR pode ser triada acerca da ligação a um anticorpo que reconhece um epítopo de conformação ou um ligante de peptídeo:MHC, respectivamente. Três sistemas de exibição foram usados para modificar geneticamente TCRs para maior afinidade, e poderiam ser usados para esse processo: exibição em levedura, exibição em bacteriófago e exibição em célula T (célula de mamífero). Os métodos alternativos de exibição, como exibição em ribossoma, RNA, DNA e CIS, podem também ser adequados para esse processo. Em todos esses casos, o TCR do tipo selvagem com baixa afinidade para o antígeno foi clonado no sistema e usado como um modelo para modificar geneticamente TCRs com afinidade e estabilidade otimizada contra o ligante de peptídeo:MHC. Qualquer um desses sistemas poderia ser aplicado à abordagem aqui descrita, em que um único TCR é usado como um modelo para bibliotecas e a seleção de TCRs com propriedades de ligação otimizadas.

[0174] No presente exemplo, a exibição em levedura foi usada como a plataforma (Figura 3). O TCR de survivina foi usado como o modelo para mutações de estabilização através de mutagênese propensa a erros e clones estabilizados isolados das seleções foram usados como modelos para a maturação de afinidade.

EXEMPLO 4 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA PROPENSA A ERROS E SELEÇÃO DE UM TCR DE SURVIVINA ESTABILIZADO, SURV-K2

[0175] A biblioteca propensa a erros de survivina foi gerada conforme anteriormente descrito (Richman et al. (2009) Methods Mol Biol, 504, 323 a 350) utilizando-se um TCR reativo a survivina obtido a partir de um colaborador chamado de Survivina 71 como um modelo. A biblioteca propensa a erros de survivina humana foi introduzida no vetor de exibição em levedura mediante a combinação do vetor pCT302 linearizado, produto de PCR propenso a erros de survivina e células de levedura EBY 100 competentes. A biblioteca resultante foi julgada por plaqueamento de alíquotas de diluição limitadoras de levedura após a eletroporação e conteve aproximadamente 8,25 x 106 clones independentes. A biblioteca foi selecionada acerca da ligação a um anticorpo que reconhece Vβ20 humano, anti-hV 20 FITC IgG (Beckman Coulter), através de FACS de acordo com a Tabela 4. TABELA 4 CONDIÇÕES DE SELEÇÃO

[0176] Com o uso de estudos de desnaturação térmica, identificou- se esse anticorpo para reconhecer epítopos dobrados em Vβ20 (dados não mostrados). Os sinais foram amplificados com o uso do anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo AlexaFluor® 488 (Life Technologies). Durante 3 seleções iterativas, surgiu uma população positivamente manchada Vβ20 (Figura 4A). Após a 3a seleção, um clone chamado Surv-K2 foi isolado acerca da fluorescência de Vβ20 aprimorada (Figura 4B). O clone SurvK2 foi usado como um modelo para a maturação de afinidade.

EXEMPLO 5 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE CDR3α E SELEÇÃO DE DOIS TCRS DE SURVIVINA COM LIGAÇÃO OTIMIZADA A SURVIVINA:HLA.A2, SURV-K2.4.1 E SURV-K2.4.6

[0177] O clone Surv-K2 estabilizado isolado a partir da seleção de bibliotecas de PCR propensas a erros foi usado como um modelo para a geração de uma biblioteca de CDR3α que transpõe 5 resíduos através de emenda por extensão de sobreposição (SOE). A biblioteca de Surv-K2 CDR3α scTCR humano foi, dessa forma, introduzida no vetor de exibição em levedura mediante a combinação do vetor pCT302 linearizado, produto de PCR de biblioteca de Surv-K2 CDR3β e células de levedura EBY100 competentes. A biblioteca resultante foi julgada por plaqueamento de alíquotas de diluição limitadoras de levedura após a eletroporação e conteve 2,98 x 107 clones independentes. A biblioteca de Surv-K2 CDR3α foi selecionada três vezes consecutivas com o uso de colunas magnéticas e uma vez com o uso de FACS de acordo com a Tabela 5. TABELA 5. CONDIÇÕES DE SELEÇÃO

[0178] Após duas seleções com o uso de esferas magnéticas, uma população manchada de maneira modestamente positiva começou a surgir (Figura 5A). Os clones Surv-K2.4.1 e Surv-K2.4.6 foram isolados após a quarta seleção. Surv-K2.4.1 e SurvK2.4.6 mostraram ligação otimizada a SurvT2M (LMLGEFLKL, SEQ ID NO:5)/HLA-A2 (Figura 5B).

EXEMPLO 6 ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE TCR DE SURVIVINA DE ALTA AFINIDADE, SURV-K2.4.1

[0179] Com a finalidade de avaliar a ligação do clone de Surv- K2.4.1 isolado a partir das seleções de bibliotecas de CDR3α, a levedura que exibe Surv-K2.4.1 foi titulada com monômeros de SurvT2M (LMLGEFLKL, SEQ ID NO:5)/HLA-A2 em 6,4 nM, 32 nM, 160 nM, 800 nM e 4 μM e analisada por meio de citometria de fluxo (Figura 6A). Os valores foram normalizados com o uso de análise de regressão não linear e um KD, app de 279 ± 44,5 nM foi determinado (Figura 6B).

EXEMPLO 7 ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DOS TCRS ISOLADOS ACERCA DA AFINIDADE APRIMORADA CONTRA O ANTÍGENO DE SURVIVINA

[0180] As sequências do clone K2 de scTCR estabilizado e as variantes de cadeia única de alta afinidade específicas quanto à survivina (K2.4.1 e K2.4.6) isoladas a partir das bibliotecas de maturação de afinidade foram determinadas. Conforme mostrado na Figura 7, houveram mutações em regiões CDR dos dois clones de alta afinidade derivados a partir das bibliotecas de exibição de levedura. As posições sublinhadas na Figura 7 indicam mutações que surgiram a partir de seleções de biblioteca propensa a erros acerca de mutações de estabilização. As posições em caixas mostram as mutações acentuadoras de afinidade que foram selecionadas a partir de bibliotecas de CDR.

EXEMPLO 8 ATIVIDADE IN VITRO DO TCR K2.4.1 EM CÉLULAS T

[0181] Para avaliar a atividade do TCR K2.4.1 em células T, as células T CD8 foram isoladas a partir de camundongo transgênico AAD. Essas células T foram, então, ativadas com esferas anti-CD3/anti-CD28 durante 24 horas. As células T foram transduzidas de maneira retroviral com vetor pMP71 contendo os domínios Vα e β do TCR K2.4.1 ligados aos domínios Cα e Cβ do 2C TCR murídeo (Figura 8A). Para confirmar a expressão do TCR K2.4.1, as células T foram manchadas 48 horas após a transdução com tetrâmero de SurvT2M:HLA-A2 a uma concentração de 20 nM (Figura 8B). As células T transduzidas em K2.4.1 (Preto) mostraram ligação aumentada de SurvT2M:HLA- A2 em relação às células T transduzidas simuladas (Cinza), confirmando a expressão de superfície do TCR de alta afinidade. As células T foram então incubadas em um 1:1 de E:T com células T2 carregadas de maneira exógena com concentrações de titulação de peptídeo de survivina. As células T que expressam o TCR K2.4.1 se ativaram na presença de peptídeo SurvT2M e não se ativaram quando apresentadas com um peptídeo de controle chamado de WT1 (RMFPNAPYL, SEQ ID NO:14), sugerindo que esse TCR é ativo e específico em células T CD8.

EXEMPLO 9 FORMATOS TERAPÊUTICOS DA SURVIVINA, SURV-K2.4.1 E SURV-K2.4.6, TCRs

[0182] É de conhecimento agora que os TCRs de maior afinidade podem ser usados em diversos formatos para o alvejamento de células que expressam o antígeno correspondente. Dessa forma, é evidente que os TCRs gerados a partir das estratégias de modificação genética mostradas acima podem ser usados na forma solúvel ou em terapia gênica de TCR para terapias de célula T adotivas, conforme ilustrado na Figura 9.

MATERIAIS E MÉTODOS ANTICORPOS, PEPTÍDEO:HLA-A2, MACS E REAGENTES DE CITOMETRIA DE FLUXO

[0183] Os anticorpos usados para detectar expressão de superfície de levedura incluíram: etiqueta anti-HA epítopo (Clone HA.11; Covance), anticorpo anti-hV 3 FITC (Clone CH92; Beckman-Coulter), anticorpo anti-hV 3.1 FITC (Clone 8F10; Thermo Scientific), anticorpo anti-hVβ20 (Clone ELL1.4; Beckman-Coulter), anticorpo monoclonal anti-Vα2 gerado no presente laboratório (dados não mostrados), cabra anti-IgM de camundongo APC (Life Technologies), anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo F(ab’)2 AlexaFluor® 647 (Invitrogen), Estreptavidina-ficoeritrina (SA:PE, BD Pharmingen) e microesferas MACS (Miltenyl Biotec).

[0184] Os peptídeos que se ligam a HLA-A2 SurvT2M: LMLGEFLKL (SEQ ID NO:5) resíduo âncora 2 modificado a partir de T para M para ligação de HLA-A2 aprimorada (Andersen et al, 2001, Cancer Research 61, 5.964 a 5.968) foram sintetizados por química de F-moc padrão (N-(9- fluorenil)metoxicarbonil) no Macromolecular Core Facility at Penn State University College of Medicine (Hershey, PA, EUA). Para análise de citometria de fluxo e FACS, a proteína de fusão de HLA-A2:lg dimérica solúvel recombinante (BD™ DimerX) foi usada. Adicionalmente, um reagente de HLA.A2-biotina monomérico gerado pela troca de um peptídeo clivável em UV por outro peptídeo restrito por HLA.A2 na presença de luz UV foi utilizado para a citometria de fluxo e seleções de MACS (Rodenko et al. (2006) Nat Protoc, 1, 1.120 a 1.132; Toebes et al. (2006) Nat Med, 12, 246 a 251).

CLONAGEM E EXPRESSÃO DE scTv EM VETORES DE EXIBIÇÃO EM LEVEDURA

[0185] Os fragmentos de região variável de TCR (scTv) foram expressos em plasmídio de exibição em levedura pCT302 (Vβ-L-Vα) (Boder e Wittrup (2000) Methods Enzymol, 328, 430 a 444), que contém uma fusão AGα2 induzível por galactose que permite o crescimento em meios Trp. A indução do gene scTv envolve o crescimento das células de levedura EBY100 transformadas para fase estacionária em meios de seleção seguido da transferência para meios contendo galactose. O modelo de genes de TCR de cadeia única de survivina foi sintetizado por Genscript (Piscataway, NJ, EUA) com uma mutação F49S no domínio Vα2 do construto (Aggen et al. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 361 a 372).

[0186] Os genes de TCR específicos quanto à survivina foram isolados a partir de clones CTL (genes de TCR contra survivina disponíveis junto à Delores Schendel, Thomas Blankenstein, e Wolfgang Uckert; por exemplo, Leisegang et al. (2010) J Clin Invest. 120(11), 3.869), os genes foram sintetizados por Genscript, clonados como um formato de cadeia única (Vβ- ligante-Vα), introduzidos em um vetor de exibição em levedura para a expressão sobre a superfície de levedura. O scTvs consistiu na variável fixada pela região de ligante GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO:7) (Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci EUA, 89, 4.759 a 4.763; Weber et al. (2005) Proc Natl Acad Sci EUA, 102, 19.033 a 19.038; Aggen et al. (2011) Protein Eng Des Sel, 24, 361 a 372). O scTv foi introduzido nos sítios de restrição Nhel e Xhol de pCT302.

GERAÇÃO, EXIBIÇÃO E SELEÇÃO DE BIBLIOTECAS DE EXIBIÇÃO EM LEVEDURA DE SCTV MUTANTE

[0187] O PCR propenso a erros foi usado para gerar mutações aleatórias, conforme anteriormente descrito (Richman et al. (2009) Mol Immunol, 46, 902 a 916). As bibliotecas de CDR1 e 3 foram geradas com o uso de PCR de emenda por extensão de sobreposição (SOE) sobrepondo 4 a 5 códons adjacentes em um momento (Horton et al. (1990) Biotechniques, 8, 528 a 535).

[0188] Para a biblioteca de Surv CDR3α, os produtos de PCR pré- SOE foram gerados utilizando-se os pares de iniciadores a seguir: 5’ - GGC AGC CCC ATA AAC ACA CAG TAT -3’ (emenda 4L) (SEQ ID NO:8) e 5’ - CAC AGC GCA CAG ATA GGT AGC -3’ (SEQ ID NO:10) e 5’ - CTG ATT CAG CTA CCT ATC TGT GCG CTG TGN NSN NSN NSN NSN NSA TGT TTG GCG ATG GTA CTC AGC TGG TTG TG -3’ (SEQ ID NO:11) e 5’ - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3’ (T7) (SEQ ID NO:9). SOE PCR foi realizado com cada Pré-SOE correspondente juntamente com T7 e emenda 4L.

[0189] As bibliotecas de levedura foram feitas por meio de recombinação homóloga em levedura EBY100 pela eletroporação de produtos de PCR SOE ou propenso a erros juntamente com pCT302 digerido por Nhel e Xhol (Horton et al. (1990) Biotechniques, 8, 528 a 535). As bibliotecas foram induzidas em meios contendo galactose (SG-CAA) durante 48 h, lavadas com 1 ml de PBS/BSA a 1% e manchadas com anticorpos ou reagentes de peptídeo:MHC nas concentrações indicadas nas Figuras 4A, 5A, 6A, 8A e 9A. As células foram lavadas (1 ml, PBS/BSA a 1%), e as células mais fluorescentes foram selecionadas com o uso de um selecionador de alta velocidade FACS Aria (BD Bioscience) ou através de colunas MACS LS em um separador QuadroMACS™ (Miltenyl Biotec). Com a finalidade de testar a estabilidade térmica de clones isolados, a levedura foi incubada em temperatura elevada durante 30 min., antes do protocolo de manchamento (dados não mostrados).

ISOLAMENTO E MANCHAMENTO DE CLONES DE ALTA AFINIDADE

[0190] Após as seleções, os clones de biblioteca foram isolados por plaqueamento de diluições limitadoras. As colônias foram expandidas e induzidas em meios contendo galactose (SG-CAA) durante 48 horas, lavadas com 1 ml de PBS/BSA a 1% e manchadas com diversas concentrações de peptídeo/HLA.A2 DimerX, anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo F(ab’)2 AlexaFluor® 647 ou diversas concentrações de peptídeo/HLA.A2 trocado por UV, SA-PE. As células foram lavadas (1 ml, PBS/BSA a 1%) e analisadas em um aparelho de citometria de fluxo Accuri C6.

[0191] Os plasmídios foram recuperados com o uso de Zymoprep™ Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research) e introduzidos de volta em E. coli através da transformação de choque térmico em células competentes Subcloning Efficiency™ DH5α™ (Invitrogen). As células de E. coli foram expandidas e os plasmídios foram isolados com o uso do kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). As sequências de clones individuais foram determinadas por sequenciamento de Sanger

DECLARAÇÕES RELACIONADAS À INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA E VARIAÇÕES

[0192] Todas as referências citadas no presente documento, por exemplo, documentos de patente incluindo patentes concedidas ou expedidas, ou equivalentes; publicações de pedido de patente; e documentos de literatura não patente ou outro material de fonte; estão aqui incorporados, por referência em suas totalidades, como se fossem individualmente incorporados por referência, até o ponto em que cada referência é ao menos parcialmente não inconsistente com a revelação nesse pedido (por exemplo, uma referência que é parcialmente inconsistente está incorporada a título de referência, exceto a porção parcialmente inconsistente da referência).

[0193] Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis de habilidade daqueles elementos versados na técnica a qual a revelação pertence. As referências citadas no presente documento estão aqui incorporadas por referência, em sua totalidade, para indicar o estado da técnica, em alguns casos, na sua data de depósito, e pretende-se que essas informações possam ser empregadas no presente documento, se necessário, para excluir (por exemplo, para renunciar) modalidades específicas que estão na técnica anterior ou para usar métodos ou materiais que estão no estado da técnica, sem a inclusão específica dos métodos ou materiais na revelação no presente documento. Por exemplo, quando um composto é reivindicado, deve-se compreender que os compostos conhecidos na técnica anterior, incluindo determinados compostos revelados nas referências reveladas no presente documento (particularmente em documentos de patente mencionados), não são destinados a serem incluídos na reivindicação.

[0194] Quando um grupo Markush ou outro agrupamento é usado no presente documento, todos os membros individuais do grupo e todas as combinações e subcombinações possíveis do grupo são destinados a serem individualmente incluídos na revelação.

[0195] Em que os termos “compreendem”, “compreende”, “compreendido” ou “compreendendo” são usados no presente documento, os mesmos devem ser interpretados como especificando a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes indicados, mas não exclui a presença ou adição de um ou mais outros recursos, número inteiro, etapa, componente ou grupo dos mesmos. As modalidades separadas da revelação são também destinadas a serem abrangidas, em que os termos “compreendendo” ou “compreende(m)” ou “compreendido” são opcionalmente substituídos pelos termos, análogos na gramática, por exemplo, “consistindo/consiste(m)” ou “consistindo essencialmente em/consiste(m) essencialmente em" para descrever, assim, modalidades adicionais que não são necessariamente coextensivas. Para esclarecimento, como usado na presente invenção, “compreender” é sinônimo de “ter”, “incluir”, “conter” ou “caracterizado por” e é inclusivo ou não é limitado e não exclui etapas do método ou elementos não citados adicionais. Para uso na presente invenção, “consistir em" exclui qualquer elemento, etapa, componente ou ingrediente não especificado no elemento de reivindicação. Para uso na presente invenção, “consistindo essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e inovadoras da reivindicação (por exemplo, que não afetam um ingrediente ativo). Em cada caso no presente documento, qualquer um dos termos “compreender”, “consistir essencialmente em" e “consistir em" pode ser substituído por qualquer um dentre os outros dois termos. A revelação ilustrativamente descrita no presente documento pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, que não especificamente revelado no presente documento.

[0196] A revelação foi descrita com referência a diversas técnicas e modalidades preferenciais e específicas. Entretanto, deve-se compreender que muitas variações e modificações podem ser feitas permanecendo-se dentro do espírito e escopo da revelação. Será observado por um elemento versado na técnica que as composições, métodos, dispositivos, elementos de dispositivo, materiais, recursos opcionais, procedimentos e técnicas além daquelas especificamente descritas no presente documento podem ser aplicados à prática da revelação, conforme amplamente revelado no presente documento, sem recorrer à experimentação indevida. Todos os equivalentes funcionais conhecidos na técnica de composições, métodos, dispositivos, elementos de dispositivo, materiais, procedimentos e técnicas descritas no presente documento; e porções dos mesmos; são destinados a ser abrangidos por essa revelação. Sempre que uma faixa é revelada, todas as subfaixas e valores individuais são destinados a serem abrangidos. Essa revelação não deve ser limitada pelas modalidades reveladas, incluindo qualquer uma mostrada nos desenhos ou exemplificada no relatório descritivo, que são dadas a título de exemplo ou ilustração e não como limitação. Algumas referências fornecidas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência para fornecer detalhes relacionados a materiais de partida adicionais, métodos adicionais de síntese e métodos adicionais de análise e usos adicionais da revelação.

[0197] Um elemento versado na técnica observaria prontamente que a presente revelação é bem adaptada para realizar os objetivos e obter os fins e vantagens mencionadas, assim como aqueles inerentes na mesma. As composições, métodos e métodos adicionais descritos no presente documento como presentemente representativos de modalidades preferenciais são exemplificadores e não são destinados como limitações no escopo da revelação. As alterações no presente documento e outros usos irão ocorrer para aqueles elementos versados na técnica, as quais são abrangidas pelo espírito da revelação. REFERÊNCIAS 1. Addo M. M., Draenert R., Rathod A., Verrill C. L, Davis B. T., Gandhi R. T., Robbins G. K., Basgoz N. O., Stone D. R., Cohen D. E., Johnston M. N., Flynn T., Wurcel A. G., Rosenberg E. S., Altfeld M. e Walker B. D. (2007) Fully Differentiated HIV-1 Specific CD8+ T Effector Cells Are More Frequently Detectable in Controlled than in Progressive HIV-1 Infection. PLoS ONE 2, e321. 2. Aggen D. 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Claims (7)

1. Receptor de célula T modificado, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado por compreender um Vα e um Vβ derivado de um receptor de célula T do tipo selvagem, em que Vα compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR-1) com a sequência de aminoácidos YSDRGSQSF, a região determinante de complementaridade 2 (CDR-2) com uma sequência de aminoácidos IYSNGDK e uma região determinante de complementaridade 3 (CDR-3) com uma sequência de aminoácidos VSKGYKM ou VHGWYTM; em que Vβ compreende a região determinante de complementaridade 1 (CDR-1) com uma sequência de aminoácidos GTSNP, a região determinante de complementaridade 2 (CDR-2) com a sequência de aminoácidos YSVGIG, a região determinante de complementaridade 3 (CDR-3) com a sequência de aminoácidos AWSIGAEQFFG; e em que o receptor de célula T modificado se liga a um complexo do peptídeo survivina e à molécula HLA-A2 com um valor KD de 10-6 M a 10-12 M.

2. Receptor de célula T modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de célula T modificado compreende a sequência de aminoácidos Vα apresentada na SEQ ID NO:1.

3. Receptor de célula T modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de célula T modificado compreende a sequência de aminoácidos Vα apresentada na SEQ ID NO:2.

4. Receptor de célula T modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de célula T modificado compreende o receptor de célula T de cadeia única com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:3.

5. Receptor de célula T modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de célula T modificado compreende o receptor de célula T de cadeia única com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.

6. Receptor de célula T modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na forma solúvel.

7. Uso de um receptor de célula T modificado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar um indivíduo que tem um câncer que expressa o antígeno de survivina.