BR112015024538B1 - Composição terapêutica de ceramidase ácida e seu método de produção - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS DE CERAMIDASE ÁCIDA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E USO. A presente invenção refere-se a uma composição terapêutica incluindo uma mistura de ceramidase e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde a mistura de ceramidase inclui um precursor de ceramidase ácida inativo e uma ceramidase ácida ativa. A invenção também se refere a um método de tratamento com ceramidase ácida, incluindo formular a ceramidase ácida utilizada no referido tratamento como uma mistura de ceramidase, onde a mistura de ceramidase inclui um precursor de ceramidase ácida inativa e uma ceramidase ácida ativa. A invenção refere-se ainda a um método de produção de uma composição terapêutica incluindo o fornecimento de um meio contendo um precursor de ceramidase ácida inativa; incubar o meio sob condições eficazes para transformar uma parte do precursor de ceramidase ácida inativa para ceramida se ácida ativa; e recuperando o meio incubado como uma mistura de ceramidase compreendendo o precursor de ceramidase ácida inativa e uma ceramidase ácida ativa. A presente invenção também se refere à preparação de uma composição terapêutica de uma esfingomielinase ácida com falta de ceramidase.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório de No. de Série 61/784,594, depositado em 14 de março de 2013, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se a composições de ceramidase ácida terapêutica e métodos para produzi-las e utilizá-las.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Devido à sua participação no distúrbio genético humano Lipogranulomatose de Farber (FD), ceramidase ácida ("AC;"; deacilase de N-acilesfingosina, Enzima I.U.B.M.B. EC No. 3.5.1.23), é o membro mais extensivamente estudado da família da enzima ceramidase. A proteína foi purificada a partir de diversas fontes e os genes e cDNAs do camundongo e do homem foram obtidos (Bernardo et al., "Purification, Characterization, and Biosynthesis of Human Acid Ceramidase," J. Biol. Chem. 270: 11098102 (1995); Koch et al, "Molecular Cloning and Characterization of a Fulllength Complementary DNA Encoding Human Acid Ceramidase. Identification of the First Molecular Lesion Causing Farber Disease," J. Biol. Chem. 2711:33110-5 (1996); Li et al, "Cloning and Characterization of the Full-length cDNA and Genomic Sequences Encoding Murine Acid Ceramidase," Genomics 50:267-74 (1998); Li et al, "The Human Acid Ceramidase Gene (AS AH): Chromosomal Location, Mutation Analysis, and Expression," Genomics 62:223-31 (1999)). O crescente interesse na biologia dessas e outras ceramidases advém do fato de que essas enzinas desempenham um papel central no metabolismo da ceramida.

[004] A ceramida é um lipídio de sinalização produzido em resposta a vários estímulos e fatores extrínsecos, incluindo a carência de soro e o tratamento com várias drogas de quimioterapia, bem como em diversas doenças humanas (Hannun, "Function of Ceramide in Coordinating Cellular Responses to Stress," Science 274: 1855-9 (1996); Spiegel et al, "Signal Transduction Through Lipid Second Messengers," Curr. Opin. Cell. Biol. 8. 159-67 (1996)). Dentro das células, a ceramida pode influenciar o crescimento e a diferenciação, regular a secreção da proteína, induzir a fragmentação do DNA e a apoptose e aumentar a síntese e a secreção de citocinas. Normalmente presente em quantidades pequenas, em resposta a esses fatores, a ceramida é produzida rapidamente na superfície celular, levando à reorganização da membrana e à sinalização a jusante que resulta em apoptose. Após o estímulo, AC e/ou outras ceramidases podem então hidrolisar a ceramida em um ácido graxo individual e em componentes da esfingosina (Gatt, "Enzymic Hydrolysis and Synthesis of Ceramide," J. Biol. Chem. 238:3131-3 (1963); Gatt, "Enzymatic Hydrolysis of Sphingolipids. 1. Hydrolysis and Synthesis of Ceramides by an Enzyme from Rat Brain," J. Biol. Chem. 241:3724-31 (1966); Hassler & Bell, "Ceramidase: Enzymology and Metabolic Roles," Adv. Lip. Res. 26:49-57 (1993)). Visto que a degradação da ceramida é a única fonte da esfingosina intracelular (Rother et al., "Biosynthesis of Sphingolipids: Dihydro ceramide and Not Sphinganine Is Desaturated by Cultured Cells," Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 14-20 (1992)), essas enzimas também podem ser etapas de limitação de taxa na determinação dos níveis intracelulares do composto. Substancialmente, um derivado da esfingosina, esfigosina-1- fosfato ("SIP"), pode neutralizar os efeitos apoptóticos da ceramida (Cuvillier et al., "Suppression of Ceramide-mediated Programmed Cell Death by Sphingosine- 1 -phosphate," Nature 381 :800— 3 (1996)), levando à noção de que as ceramidases podem ser “reostatos” que mantêm um equilíbrio apropriado entre o crescimento e a morte celular (Spiegel & Merrill, "Sphingolipids Metabolism and Cell Growth Regulation," FASEB J.10: 1388-97 (1996)).

[005] AC hidroliza a ligação de amido que liga a esfingosina e as porções de ácido graxo da ceramida de lipídio (Park and Schuchman, "Acid Ceramidase and Human Disease," Biochim. Biophys. Acta. 1758(12): 2133-2138 (2006)). A ceramida e a esfingosina (e seu SIP derivado fosforilado) são lipídios bioativos e, assim, a atividade de AC deve ser cuidadosamente regulada nas células (Young et al, "Sphingolipids: Regulators of Crosstalk Between Apoptosis and Autophagy," J. Lipid Res. 54:5-19 (2013). Um importante mecanismo pelo qual a atividade de AC é regulada é a clivagem do polipeptídeo precursor inativo na enzima ativa que consiste em uma subunidade alfa e beta ligada às ligações de dissulfeto (Shtraizent et al.,"Autoproteolytic Cleavage and Activation of Human Acid Ceramidase," J. Biol. Chem. 283: 11253-11259 (2008)). Demonstrou-se anteriormente que o AC recombinante produzido nas células do ovário de hamster chinês ("CHO") e secretado no meio é uma mistura da enzina precursora inativa e ativa (clivada) (He et al., "Purification andCharacterization of Recombinant, Human Acid Ceramidase," J. Biol. Chem. 278:32978-32986 (2003)).

[006] A presente invenção é direcionada a superar estas e outras deficiências na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Um primeiro aspecto da presente invenção se relaciona a uma composição terapêutica que inclui uma mistura de ceramidase e um transportador farmaceuticamente aceitável. A mistura de ceramidase inclui um precursor de ceramidase ácida inativa e uma ceramidase ácida ativa.

[008] Um segundo aspecto da presente invenção se relaciona a um método de tratamento de ceramidase ácida, incluindo a formulação da ceramidase ácida usada em tal tratamento como uma mistura de ceramidase, em que a mistura de ceramidase inclui um precursor de ceramidase ácida inativa e uma ceramidase ácida ativa.

[009] Um terceiro aspecto da presente invenção se relaciona a um método de produção de uma composição terapêutica. O método inclui o fornecimento de um meio que contém um precursor de ceramidase ácida inativa e a incubação do meio sob condições efetivas para transformar uma parte do precursor de ceramidase ácida inativa em ceramidase ácida ativa. O meio incubado é recuperado como uma mistura de ceramidase que compreende o precursor de ceramidase ácida inativa e uma ceramidase ácida ativa.

[0010] A presente invenção descreve uma composição ideal de AC recombinante (rAC). A presente invenção descreve ainda a nova descoberta de que, diferentemente das expectativas, a forma completamente ativa da enzina não é a melhor forma de promover a sobrevivência da célula. As preparações de rAC purificada com maiores quantidades do precursor de ceramidase ácida (AC) inativa contra AC ativa processada são mais efetivas na promoção da sobrevivência celular e/ou melhorar o fenótipo celular. Foram obtidas duas preparações de AC recombinante contendo diferentes proporções do precursor e da enzina ativa. Eles então foram usados para avaliar os efeitos sobre a sobrevivência dos oócitos em cultivo. Diferentemente das expectativas, a preparação que contém uma maior proporção do precursor inativo teve um efeito maior sobre a sobrevivência celular. Levanta-se a hipótese de que isso se deve ao fato de que a enzina completamente ativa tem uma meia-vida mais curta nas células e em meio de cultivo celular. As mesmas duas preparações foram testadas utilizando condrócitos primários cultivados. Como com os oócitos, a preparação da AC recombinante com menos da forma ativa teve um efeito maior sobre a expressão de colágeno 2, um marcador de condrogênese.

[0011] A rAC tem sido usada experimentalmente em inúmeros sistemas celulares e modelos animais para desacelerar a morte de células relacionadas a ceramida e/ou melhorar o fenótipo de células usado para o transplante celular. Também tem sido estudada em diversos modelos de doença. A presente invenção descreve a preparação ideal de rAC a ser usada para esses fins, que possui inúmeras implicações práticas potenciais (por exemplo, fertilização in vitro, reparo de cartilagem e tratamento de fibrose cística).

[0012] Em outro derivado da presente invenção, um novo método de purificação da AC recombinante foi desenvolvido. Neste método, inativação de aquecimento foi usada para remover a esfingomielinase ácida e outras proteínas contaminadoras das preparações de AC recombinante. Uma obra anterior demonstrou que a esfingomielinase ácida, uma hidrolase relacionada ao lipídio, ligou-se firmemente à AC e copurificou-se com ele (Bernardo et al., "Purification, Characterization, and Biosynthesis of Human Acid Ceramidase," J. Biol. Chem. 270: 1109811102 (1995), que é incorporado a este instrumento por referência, na sua totalidade). Descobriu-se agora que, diferentemente da maioria das proteínas, a atividade da AC é totalmente estável quando aquecida a 60°C. Assim, após o aquecimento por cromatografia de coluna, a inativação pode ser usada para remover a atividade da esfingomielinase ácida da preparação de AC recombinante.

[0013] Juntas, essas duas novas descobertas sobre (i) a importância de manter uma proporção ideal do precursor e da AC ativa e (ii) o uso da inativação de calor para remover a atividade da esfingomielinase ácida e outras proteínas contaminadoras da preparação constituem observações únicas e importantes a respeito da composição da AC recombinante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] As figuras 1A-1C mostram que as preparações de rAC com menos caramidase ativa têm melhor desempenho do que aquelas com mais ceramidase ativa. A Figura 1 A é uma análise western blot que mostra quantidades relativas de rAC precursora ativa (alfa/beta) contra inativa em duas execuções de biorreator diferentes (Lote 6 e Lote 7). A Figura IB resume os resultados que mostram a capacidade dos Lotes 6 e 7 para formar embriões de camundongo saudáveis. A Figura 1C representa os resultados do Lote 6 e do Lote 7 após o teste utilizando condrócitos de rato cultivados. Em duas semanas, a quantidade de expressão de colágeno 2 foi analisada utilizando western blotting.

[0015] A Figura 2 ilustra uma curva tempo-resposta de AC d da atividade da esfingomielinase ácida no Lote 7. A atividade da esfingomielinase ácida foi removida sem afetar a atividade de AC.

[0016] A Figura 3 é uma representação gráfica da atividade da cera- midase ácida em (nmol/mL/hora) contra o tempo de incubação (em dias).

[0017] A Figura 4 é um western blot que mostra a conversão da ceramidase ácida inativa para ceramidase ácida ativa.

[0018] As Figuras 5A-B são um Western blot que mostra a conversão da ceramidase ácida inativa para ceramidase ácida ativa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] O primeiro aspecto da presente invenção se relaciona a uma composição terapêutica que inclui uma mistura de ceramidase e um transportador farmaceuticamente aceitável. A mistura de ceramidase inclui um precursor de AC inativa e uma AC ativa.

[0020] As ceramidases hidrolisam a ligação de amido das ceramidas para gerar ácidos graxos livres e bases esfingoides (Nikolova-Karakashian et al., "Ceramidases," Methods Enzymol. 311: 194 - 201 (2000); Hassler et al, "Ceramidases: Enzymology and Metabolic Roles," Adv. Lipid Res. 26:49-57 (1993), que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade). Há três tipos de ceramidases descritas até o momento para datar (Nikolova-Karakashian et al., "Ceramidases," Methods Enzymol. 311: 194-201 (2000), que é incorporado a este instrumento por referência, na sua totalidade). Elas são classificadas como ceramidases ácida, neutra e alcalina, de acordo com seu pH ideal de atividade enzimática.

[0021] ACs têm atividade enzimática ideal a pH <5. A AC humana foi a primeira ceramidase a ser clonada (Koch et al., "Molecular Cloning and Characterization ofa Full-Length Complementary DNA Encoding Human Acid Ceramidase. Identification Of the First Molecular Lesion Causing Farber Disease," J. Biol. Chem. 271:33110-33115 (1996), que é incorporado a este instrumento por referência, na sua totalidade). Ela se situa no lisossoma e é responsável principalmente pelo catabolismo da ceramida. A disfunção dessa enzima por conta de um defeito genético leva a uma doença de esfingolipidose chamada lipogranulomatose ou doença de Farber (Koch et al., "Molecular Cloning and Characterization of a Full-Length Complementary DNA Encoding Human Acid Ceramidase. Identification Of the First Molecular Lesion Causing Farber Disease," J. Biol. Chem. 271:33110-33115 (1996), Young et al, "Sphingolipids: Regulators of Crosstalk Between Apoptosis and Autophagy," J. Lipid. Res. 54:5-19 (2013), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0022] Os precursores de AC inativa e as ACs ativas apropriadas para uso nas misturas de ceramidase desse e de todos os aspectos da presente invenção podem ser homólogos (isto é, derivados da mesma espécie) ou heterólogos (isto é, derivados de espécies diferentes) ao tecido, às células e/ou ao indivíduo que está sendo tratado. As proteínas precursoras de ceramidase (por exemplo, AC) passam por clivagem autoproteolítica na forma ativa (composta de subunidades a e ß). O mecanismo de clivagem de AC humana e a ativação é relatado em Shtraizent et al., "Autoproteolytic Cleavage and Activation of Human Acid Ceramidase," J. Biol. Chem. 283(17): 11253-11259 (2008), que é incorporado a este instrumento por referência, na sua totalidade). Isso é promovido pelo ambiente intracelular e, com base em sequências altamente conservadas no local de clivagem das proteínas precursoras de ceramidase entre as espécies, espera-se que ocorra na maior parte dos tipos de célula, se não em todos. Assim, a ceramidase, conforme usada aqui, inclui as ceramidases ativas e as proteínas precursoras de ceramidase, onde as proteínas precursoras de ceramidase são convertidas em proteínas de ceramidase ativas através de clivagem autoproteolítica. São contempladas modalidades em que a proteína precursora é incorporada pela célula de interesse e convertida em ceramidase ativa, assim como as modalidades em que a proteína precursora é convertida em ceramidase ativa por uma célula diferente ou por um agente (presente, por exemplo, em um meio de cultivo).

[0023] A proteína de AC (N-acilesfingosina deacilase, Enzima de I.U.B.M.B. No. EC 3.5.1.23) foi purificada a partir de várias fontes e os genes e cDNAs de humano e de camundongos foram obtidos. Ver Bernardo et al., "Purification, Characterization, and Biosynthesis of Human Acid Ceramidase," J. Biol. Chem. 270: 11098-102 (1995); Koch et al., "Molecular Cloning and Characterization of a Full-length Complementary DNA Encoding Human Acid Ceramidase. Identification of the First Molecular Lesion Causing Farber Disease," J. Biol. Chem.2711 :33110-5 (1996); Li et al., "Cloning and Characterization of the Full-length cDNA and Genomic Sequences Encoding Murine Acid Ceramidase," Genomics 50:267-74 (1998); Li et al., "The Human Acid Ceramidase Gene (AS AH): Chromosomal Location, Mutation Analysis, and Expression," Genomics 62:223-31 (1999), todos eles sendo incorporados aqui por referência em sua totalidade. Ela é produzida através da clivagem da proteína precursora de AC (ver Ferlinz et al., "Human Acid Ceramidase: Processing, Glycosylation, and Lysosomal Targeting," J. Biol. Chem. 276(38):35352-60 (2001), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), que é o produto do gene Asahl (NCBI UniGene GenelD No. 427, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). A proteína de AC [Homo sapiens] (No. de Acesso AAC50907) é mostrada abaixo na SEQ ID NO: 1.

[0024] A subunidade alfa de AC começa no aminoácido na posição 22 e continua através da posição 142 (como mostrado em negrito na SED ID NO: 1), enquanto que a subunidade beta da AC começa com o aminoácido na posição 143 e continua através da posição 395 (como mostrado em itálico na SEQ ID NO: 1).

[0025] As ACs ativas e as proteínas precursoras de AC inativas que podem ser usadas nesse e em todos os aspectos da presente invenção incluem, sem limitação, aqueles apresentados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Membros da família da ceramidase ácida exemplificativos

[0026] A mistura de ceramidase da composição terapêutica pode, em algumas modalidades, contém uma maior quantidade do precursor de AC inativa do que AC ativa. Alternativamente, a mistura de ceramidase da composição terapêutica pode, em alguns casos, conter uma quantidade menor do precursor de AC inativa do que AC ativa.

[0027] Em algumas modalidades, uma quantidade efetiva do precur sor de AC inativa em comparação à AC ativa na mistura varia de aproxi-madamente 5 a 95% em peso do precursor de AC inativa e 95 a 5% em peso da AC ativa; de 20 a 80% em peso do precursor de AC inativa e 80 a 20% em peso da AC ativa; de 30 a 70% em peso do precursor de AC inativa e 70 a 30% em peso da AC ativa; de 40 a 60% em peso do precursor de AC inativa e 60 a 40% em peso da AC ativa; de 55 a 95% em peso do precursor de AC inativa e 45 a 5% em peso da AC ativa; de 70 a 95% em peso do precursor de AC inativa e 30 a 5% em peso da AC ativa; e pode, alternativamente, variar de 80 a 90% em peso do precursor de AC inativa e de 20 a 10% em peso da AC ativa. Uma quantidade efetiva do precursor de AC inativa é de 90% em peso, enquanto que a ceramidase ativa é de 10% em peso da mistura. Uma incorporação alternativa pode incluir 80% em peso do precursor inativo do ceramidase e 20% em peso da AC. ativa na mistura do ceramidase. Em outra modalidade, ainda, a mistura de ceramidase pode conter 60% em peso do precursor de ceramidase inativa e 40% em peso de ceramidase ativa.

[0028] A composição terapêutica pode incluir também adjutores, excipientes e/ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, e pode estar em forma líquida ou sólida, como em comprimidos, cápsulas, pós, soluções, suspensões ou emulsões. Os adjutores apropriados incluem, mas não são limitados a flagelina, adjuvante de Freund completo ou incompleto, hidróxido de alumínio, lisolecitina, polióis plurônicos, polianóis, peptídeos, emulsão de óleo, dinitrofenol, iscomatrix e partículas de DNA de policátion lipossômico.

[0029] Um segundo aspecto da presente invenção relaciona-se a um método do tratamento da AC, incluindo a formulação da AC usada no tratamento referido como uma mistura de ceramidase, em que a mistura de ceramidase inclui um precursor de AC inativa e uma AC ativa.

[0030] O tratamento, de acordo com este aspecto da presente invenção, é realizado utilizando os métodos que ficarão evidentes àqueles versados na técnica. Para uma discussão da AC no contexto da doença humana, ver Park et al., "Acid Ceramidase and Human Disease," Biochim. Phiophys. Act. 1758:2133-2138 (2006) e Zeidan et al., "Molecular Targeting of Acid Ceramidase:

[0031] Implications to Cancer Therapy," Curr. Drug Targets 9(8): 653-661 (2008), ambos estando incorporados aqui por referência em sua totalidade).

[0032] Em algumas modalidades, o tratamento é realizado introduzindo-se a proteína de ceramidase nas células. Uma abordagem para distribuição de proteínas ou agentes polipeptídicos (por exemplo, ceramidase ativa, proteínas precursoras de ceramidase inativa) envolve a conjugação da proteína desejada ou do polipeptídeo a um polímero que esteja estabilizado para evitar a degradação enzimática do polipeptídeo ou da proteína conjugada. Os polipeptídeos ou proteínas conjugadas desse tipo são descritos na Patente U.S. No. 5,681,811 para Ekwuribe, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[0033] Outra abordagem para a distribuição de agentes polipeptídicos ou de proteínas, ainda, envolve a preparação de proteínas quiméricas, de acordo com a Patente U.S. No. 5,817,789 para Heartlein et al., que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. A proteína quimérica pode incluir um domínio ligante e o agente polipeptídico (por exemplo, rAC, AC ativa, outra ceramidase, AC inativa, proteína precursora, outras proteínas precursora de ceramidase). O domínio ligante é específico para receptores situados em uma célula alvo. Assim, quando a proteína quimérica é distribuída à célula, a proteína quimérica absorverá para a célula alvejada e a célula alvejada internalizará a proteína quimérica.

[0034] Modalidades adicionais do presente aspecto se relacionam a métodos para tratar uma determinada doença ou distúrbio. Esses métodos envolvem a formulação da AC utilizada no tratamento como uma mistura de ceramidase que inclui um precursor de ceramidase inativa e uma AC ativa.

[0035] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio é um distúrbio ou doença de junta e a mistura de ceramidase, de acordo com os métodos da presente invenção, é administrada a um indivíduo para tratar o indivíduo contra o distúrbio ou doença de junta. Os tipos exemplificativos de distúrbio ou doença de junta incluem, sem limitação, osteoartrite, artrite reumatoide, mucopolissacaridose, doença degenerativa de junta, lesão na junta ou lipogranulomatose de Farber.

[0036] Em outra modalidade, a doença ou distúrbio é um distúrbio ou doença neurodegenerativa e a mistura de ceramidase, de acordo com os métodos da presente invenção, é administrada a um indivíduo para tratar o indivíduo contra o distúrbio ou doença neurodegenerativa.

[0037] Os tipos exemplificativos de distúrbios ou doenças neuro- degenerativas incluem, sem limitação, mal de Alzheimer, demência frontotemporal, demência com corpos de Lewy, doença de Prion, mal de Parkinson, doença de Huntington, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, atrofia sistêmica múltipla, esclerose lateral amiotrófica, miosite por corpos de inclusão, miopatia degenerativa, atrofia espinocerebelar, neuropatia metabólica, neuropatia diabética, neuropatia endócrina, hipertensão ortostática, lesão cerebral, lesão da medula espinhal, derrame e doenças de neurônio motor, como atrofia muscular da medula.

[0038] Em outra modalidade, a doença ou distúrbio é um distúrbio ou doença cardíaca e a mistura de ceramidase, de acordo com os métodos da presente invenção, é administrada a um indivíduo para tratar o indivíduo contra o distúrbio ou doença cardíaca. Os tipos exemplificativos de distúrbios ou doenças cardíacas incluem, sem limitação, doenças cardíacas, lesões cardíacas, aterosclerose, trombose, apoptose do cardiomiócito, hipercardia, infarto do coração, regurgitação mitral, regurgitação aórtica, defeito septal e síndrome de taquicardia-bradicardia.

[0039] Em outra modalidade, a doença ou distúrbio é diabetes e a mistura de ceramidase, de acordo com os métodos da presente invenção, é administrada a um indivíduo para tratar o indivíduo contra o diabetes.

[0040] Em outra modalidade, o distúrbio ou doença é uma infecção patogênica em um indivíduo que tem fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e/ou ferimento aberto, e a mistura de ceramidase, de acordo com os métodos da presente invenção, é administrada a um indivíduo para tratar o indivíduo contra a infecção patogênica. Os tipos exemplificativos de infecções patogênicas incluem, sem limitação, infecções virais, fúngicas, priônicas e bacterianas.

[0041] Os indivíduos que sofrem de fibrose cística, COPD, e/ou ferimento aberto podem ter uma elevada suscetibilidade para adquirir infecções patogênicas agudas e/ou crônicas, como, por exemplo, infecções patogênicas bacterianas, virais, fúngicas, protozoárias e/ou priônicas. Os patógenos bacterianos incluem, sem limitação, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium dipththeriae, Escherichia coli, enterohemorrhagic E. coli, enterotoxigenic E. coli, Haemophilus influenzae tipo B e sem tipo, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacterium spp., Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus B, Streptococcus hemolítica beta Grupo A, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Vibrio cholerae e Yersinia pestis. Em algumas modalidades, a infecção patogênica é uma infecção Pseudomonas.

[0042] Os patógenos virais incluem, sem limitação, vírus de RNA, vírus de DNA, adenoviridae (por exemplo, mastadenovírus e vírus aviadeno), herpesviridae (por exemplo, herpes simplex vírus 1, herpes simplex vírus 2, herpes simplex vírus 5 e herpes simplex vírus 6), leviviridae (por exemplo, levivirus, enterobacteriófago MS2, allolevirus), poxyiridae (por exemplo, chordopoxyirinae, parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, molluscipox virus e entomopoxyirinae), papovaviridae (por exemplo, poliomavírus e papillomavirus), paramyxoviridae (por exemplo, paramyxovirus, parainfluenza vírus 1, mobillivírus, como vírus da catapora, vírus da rubéola (como o vírus da caxumba), pneumonoviridae (por exemplo, pneumovirus, vírus sincitial respiratório humano), metapneumovírus (por exemplo, pneumovírus aviano e metapneumovírus humano), picornaviridae (por exemplo, enterovirus, rhinovirus, hepatovirus, como o vírus da hepatite A humano, cardiovírus e aftovírus), reoviridae (por exemplo, ortoreovírus, orbivirus, rotavirus, cipovirus, fijivirus, phytoreovirus e oryzavirus), retroviridae (por exemplo, retrovirus tipo B em mamíferos, retrovírus tipo C em mamíferos, retrovírus tipo C aviano, grupo de retrovírus de tipo D, retrovírus BLV-HTLV, lentivírus (como vírus da imunodeficiência humana 1 e vírus da imunodeficiência humana 2; e spumavirus), flaviviridae (por exemplo, vírus da hepatite C), hepadnaviridae (por exemplo, vírus da hepatite B), togaviridae (por exemplo, alphavirus - como sindbisvirus e rubivirus, como rubeolavirus), rhabdoviridae (por exemplo, vesiculovirus, lyssavirus, ephemera vírus, cytorhabdovirus e necleorhabdovirus), arenaviridae (por exemplo, arenavirus, choriomeningitis virus linfocítico, Ippy vírus e lassa vírus) e coronaviridae (por exemplo, coronavírus e torovírus), Citomegalovírus (mononucleose), vírus da dengue (febre da dengue, de choque da dengue), vírus Epstein-Barr (mononucleose, linfoma de Burkitt), vírus linfotrópico de célula T humano de tipo 1 (leucemia de célula T), Influenza A, B e C (doença respiratória), vírus japonês da encefalite (pneumonia, encefalopatia), Poliovírus (paralisia), Rhinovirus (gripe comum), vírus da Rubéola (má-formação fetal), vírus Vaccínia (infecção generalizada), vírus da febre amarela (icterícea, falha renal e hepática) e vírus Varicella zoster (catapora).

[0043] Os fungos patogênicos incluem, sem limitação, os gêneros Aspergillus (por exemplo, Aspergillus fumigatus), Blastomyces, Candida (por exemplo, Candida albicans), Coccidiodes, Cryptococcus, Histoplasma, Phycomyces, Tinea corporis, Tinea unguis, Sporothrix schenckii e Pneumocystis carinii. O protozoário patogênico inclui, sem limitação, Trypanosoma spp., Leishmania spp., Plasmodium spp., Entamoeba spp. e Giardia spp., como Giardia lambia.

[0044] Como descrito aqui, um "ferimento aberto" se refere a um tipo de lesão em que uma camada epitelial, por exemplo: pele, é rasgada, cortada e/ou perfurada. Em algumas modalidades, um ferimento aberto se refere a uma lesão acentuado que danifica a derme da pele e concomitantemente aumenta o risco de adquirir uma infecção. O termo "ferimento aberto"também abrange queimaduras.

[0045] Em outra modalidade, a doença ou distúrbio é uma infecção causada pelo acúmulo de ceramida e a mistura de ceramidase, de acordo com os métodos da presente invenção, é administrada a um indivíduo para tratar o indivíduo contra a infecção por acumulação de ceramida.

[0046] A presente invenção pode, em outras modalidades, ser usada para tratar a doença de Farber.

[0047] Em pelo menos uma modalidade, o tratamento é executado in vitro. Nesta modalidade, uma mistura de ceramidase pode ser obtida a partir do indivíduo ou de um segundo indivíduo e então administrada ao primeiro indivíduo (por exemplo, injetando-se a mistura no primeiro indivíduo). Em pelo menos uma modalidade, o tratamento é executado in vivo.

[0048] Os indivíduos mamíferos, de acordo com esses aspectos da presente invenção, incluem, por exemplo, indivíduos humanos, indivíduos equinos, indivíduos suínos, indivíduos felinos e indivíduos caninos. Os indivíduos humanos são especificamente preferíveis.

[0049] Em todas as modalidades que envolvem a administração de ceramidase a um indivíduo, qualquer combinação de ceramidase ativa, proteína precursora de ceramidase e/ou ceramidase de codificação de ácido nucleico/proteína precursora de ceramidase pode ser administrada. A administração pode ser realizada através da administração sistêmica a um indivíduo ou através de uma administração alvejada para tecidos, órgãos e/ou células afetados. A mistura de ceramidase pode ser administrada a uma área não-alvejada junto com um ou mais agentes que facilitam a migração da mistura de ceramidase para (e/ou a incorporação por parte de) um tecido alvejado ou célula. Adicionalmente e/ou alternativamente, a própria mistura de ceramidase pode ser modificada para facilitar seu transporte para (ou incorporação pelo) tecido, órgão ou célula desejado, como ficará evidente para alguém versado na técnica.

[0050] Tipicamente, a mistura de ceramidase será administrada a um indivíduo em um veículo que distribui a ceramidase à célula, ao tecido ou ao órgão alvejado. As vias de administração incluem, sem limitação, oral, por inalação, inoculação intratraqueal, aspiração, instilação por vias aéreas, aerossolização, nebulização, instilação intranasal, instilação oral ou nasogástrica, injeção intraperitoneal, injeção intravascular, topicamente, transdermicamente, parenteralmente, de maneira subcutânea, injeção intravenosa, injeção intraarterial (como através da artéria pulmonar), injeção intramuscular, instilação intrapleural, de maneira intraventricular, intralesionalmente, intratecalmente, por aplicação às membranas mucosas (como as do nariz, garganta, tubos bronquiais, genitais e/ou ânus) ou pela implantação de um veículo de liberação sustentada.

[0051] Em algumas modalidades, a mistura de ceramidase é administrada oralmente, topicalmente, intranasalmente, intraperitorial- mente, intravenosamente, subcutaneamente ou por inalação em aerossol. Em algumas modalidades, a mistura de ceramidase é administrada através de inalação em aerossol. Em algumas modalidades, a mistura de ceramidase pode ser incorporada em composições farmacêuticas apropriadas para administração, conforme descrito aqui.

[0052] A mistura de ceramidase pode ser administrada por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou com um transportador assimilável e comestível, pode ser colocada em cápsulas dura ou mole ou pode ser compactada em comprimidos ou pode ser incorporada diretamente com alimentos dietéticos. Para a administração terapêutica oral, a mistura de ceramidase pode ser incorporada com excipientes e usados sob a forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e similares. Essas composições e preparações devem conter pelo menos 0.1% de ceramidase. A porcentagem da mistura de ceramidase nessas composições pode, naturalmente, ser variada e pode ser convenientemente entre cerca de 2% a cerca de 60% do peso da unidade. A quantidade da mistura de ceramidase em tais composições terapeuticamente úteis é tal que uma dosagem adequada será obtida.

[0053] Os comprimidos, cápsulas e afins podem conter ainda um ligante como goma adragante, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; um agente se desintegrando tal como o amido de milho, fécula de batata ou ácido algínico; um lubrificante como estearato de magnésio; e um agente adoçante como sacarose, lactose ou a sacarina. Quando a forma de unidade de dosagem for uma cápsula, ela pode conter, além do material do tipo acima, um transportador líquido como óleo graxo.

[0054] A mistura de ceramidase pode também ser administrada parenteralmente. As soluções ou suspensões de ceramidase podem ser preparadas em água apropriadamente misturada com um surfactante, como hidroxipropilcelulosa. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos em óleos. Os óleos ilustrativos são aqueles do petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja ou óleo mineral. Em general, a água, o soro fisiológico, a dextrose aquosa ou soluções de açúcar relacionadas, e glicóis como glicol de propileno ou glicol de polietileno, são preferíveis como transportadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações podem conter um conservante para evitar o crescimento de microrganismos.

[0055] As formas farmacêuticas apropriadas para injeção podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, o formato deve ser estéril e deve ser fluida à medida que existir fácil seringabilidade. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), suas misturas apropriadas e óleos vegetais.

[0056] A mistura de ceramidase também pode ser administrada diretamente nas vias aéreas na forma de um aerossol. Para o uso como aerossóis, a ceramidase em solução ou suspensão pode ser empacotada em um contêiner de aerossol pressurizado juntamente com carburantes, por exemplo, carburantes de hidrocarbonetos, como propano, butano ou isobutano com adjuvantes convencionais. A mistura de ceramidase pode também ser administrada de uma forma não- pressurizada.

[0057] Os dispositivos exemplificativos incluem, sem limitação, nebulizadores, atomizadores, lipossomos (incluindo as técnicas de distribuição de droga ativa e passiva) (Wang et al, "pH- Sensitive Immunoliposomes Mediate Target-cell-specific Delivery and Controlled Expression of a Foreign Gene in Mouse," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7851-5 (1987); Bangham et al, "Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids," J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965); U.S. Patent No. 5,653,996 to Hsu; U.S. Patent No. 5,643,599 to Lee et al; U.S. Patent No. 5,885,613 to Holland et al; U.S. Patent No. 5,631,237 to Dzau et al; and U.S. Patent No. 5,059,421 to Loughrey et al; Wolff et al, "The Use of Monoclonal Anti-Thyl IgGl for the Targeting of Liposomes to AK R-A Cells in Vitro and in Vivo " Biochim. Biophys. Acta 802:259-73 (1984), cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade), emplastros transdérmicos, implantes, composições de depósito de proteína injetáveis ou implantáveis e seringas. Outros sistemas de distribuição que são conhecidas àqueles versados na técnica também podem ser administrados para obter a distribuição desejada de ceramidase ao órgão, tecido ou células desejados.

[0058] A administração pode ser realizada como frequentemente, conforme necessário e por uma duração que é apropriada para fornecer o tratamento efetivo. Por exemplo, a administração pode ser realizada com uma formulação de dosagem única de liberação sustentada ou com múltiplas dosagens diárias.

[0059] O tratamento, de acordo com este e todos os aspectos da presente invenção, pode ser realizado in vitro ou in vivo. Os tratamentos in vivo incluem, por exemplo, as modalidades em que a população de células está presente em um indivíduo mamífero. Em tais modalidades, a população de células pode ser autóloga (produzida pelo indivíduo), homóloga ou heteróloga. Os indivíduos apropriados, de acordo com essas modalidades, incluem, mamíferos, por exemplo, indivíduos humanos, indivíduos equinos, indivíduos suínos, indivíduos felinos e indivíduos caninos.

[0060] Em uma modalidade, um ou mais agentes adicionais que reduzem os níveis de ceramida pode(m) ser administrado(s) com a mistura de ceramida. Isso inclui, sem limitação, inibidores da esfingomielinase ácida (por exemplo, amitriptilina (Becker et al., "Acid Sphingomyelinase Inhibitors Normalize Pulmonary Ceramide and Inflammation in Cystic Fibrosis," Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 42:716 - 724 (2010), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade) e inibidores de sintase de ceramida e.g., Shiffmann et al,"Inhibitors of Specific Ceramide Synthases," Biochimie 94:558-565 (2012), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade)).

[0061] A quantidade eficaz de uma população celular/um agente terapêutico da presente invenção administrada ao indivíduo dependerá do tipo e da gravidade da doença ou distúrbio e das características do indivíduo, como a saúde em geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a drogas. Dependerá também do grau, da gravidade e do tipo da doença ou distúrbio. Versados na técnica serão capazes de determinar as dosagens adequadas dependendo destes e de outros fatores.

[0062] Em uma modalidade da presente invenção, o método inclui o tratamento de uma ou mais células de mamífero ex vivo com a mistura de ceramidase referida para promover a sobrevivência celular. As células cuja sobrevivência puder ser promovida de acordo com esse aspecto da presente invenção incluem, sem limitação, aquelas que utilizam a via de apoptose de ceramidase, que inclui uma ampla variedade de células (Obeid et al, "Programmed Cell Death Induced by Ceramide,"Science 259: 1769-71 (1993), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), por exemplo, hepatócitos (Arora et al., "Ceramide Induces Hepatocyte Cell Death Through Disruption of Mitochondrial Function in the Rat," Hepatol. 25:958-63 (1997), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, fibroblastos de pele (Mizushima et al., "Ceramide, a Mediator of Interleukin 1, Tumour Necrosis Factor a, as Well as Fas Receptor Signalling, Induces Apoptosis of Rheumatoid Arthritis Synovial Cells," Ann. Rheum. Dis. 57:495-9 (1998), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), concrócitos (MacRae et al., "Ceramide Inhibition of Chondrocyte Proliferation and Bone Growth Is IGF-IIndependent," J. Endocrinol. 191(2):369-77 (2006), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), epitélio pulmonar (Chan & Goldkorn, "Ceramide Path in Human Lung Cell Death," Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 22(4):460-8 (2000), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), eritrócitos (Lang et al., "Mechanisms of Suicidal Erythrocyte Death," Cell. Physiol. Biochem. 15: 195-202 (2005), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade), cardiomiócitos (Parra et al., "Changes in Mitochondrial Dynamics During Ceramide-induced Cardiomyocyte Early Apoptosis," Cardiovasc. Res. (2007), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade) e linfócitos (Gombos et al, "Cholesterol and Sphingolipids as Lipid Organizers of the Immune Cells' Plasma Membrane: Their Impact on the Functions of MHC Molecules, Effector T-lymphocytes and T-cell Death," Immunol. Lett. 104(1 -2): 59-69 (2006), que são incorporados aqui por referência em sua totalidade), ovários, embriões, neurônios, sêmens, fibroblastos sinoviais e células-tronco embrionárias. Os tipos preferidos de células são ovários (fertilizados ou não-fertilizados), embriões, células primárias (por exemplo, neurônicos), sêmen, fibroblastos sinoviais e células- tronco embrionárias. Ademais, a via de apoptose de ceramida parece ser conservada através das espécies de mamíferos (Lee & Amoscato, "TRAIL and Ceramide," Vitam. Horm. 67:229 - 55 (2004); ver também, Samadi, "Ceramide-induced Cell Death in Lens Epithelial Cells," Mol. Vis. 13: 1618-26 (2007) (humans); Parra et al, "Changes in Mitochondrial Dynamics During Ceramide-induced Cardiomyocyte Early Apoptosis," Cardiovasc. Res. (2007) (rat); de Castro E Paula et al, "Ceramide Inhibits Development and Cytokinesis and Induces Apoptosis in Preimplantation Bovine Embryos," Mol. Reprod. Devel, DOI No. 10.1002/mrd.20841 (2007) (cows), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Consequentemente, espera-se que, para cada um dos tipos de célula enunciados acima, as células apropriadas incluam aquelas de humanos, macacos, camundongos, ratos, porquinhos da Índia, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, cães e gatos. Esse método também pode ser usado para prolongar a sobrevivência de ovários e/ou embriões durante aos procedimentos de fertilização in vitro, facilitando a identificação e a seleção dos embriões saudáveis para reimplantação, especialmente para mulheres humanais mais velhas e para procedimentos de reprodução veterinária.

[0063] O tratamento, de acordo com este aspecto da presente invenção, pode ser proporcionado por métodos que ficarão evidentes àqueles versados na técnica. Por o exemplo, as células podem ser obtidas a partir de um animal ou de uma fonte ex vivo existente (por exemplo, uma amostra de tecido, um cultivo celular, etc.) usando técnicas padrão. O tratamento de células ex vivo inclui o tratamento das células presentes em um cultivo homogêneo, bem como células presentes em um cultivo heterogêneo (por exemplo, uma amostra de tecido).

[0064] Os precursores de AC inativa e as ACs ativas que podem ser usadas para preparar a mistura de ceramidase nesse e em todos os aspectos da presente invenção incluem, sem limitação, aqueles apresentados na Tabela 1 acima. Neste e em todos os aspectos da presente invenção (incluindo os métodos in vivo discutidos abaixo), a AC pode ser homóloga (isto é, derivada de todas as espécies iguais) ou heteróloga (isto é, derivada de espécies diferentes) para uma ou mais células a serem tratadas.

[0065] Uma modalidade do presente aspecto do tratamento com AC se relaciona a um método de produção de condrócitos com a mistura de ceramidase. Esse método envolve selecionar uma população de células com o potencial de diferenciar em condrócitos e tratar a população celular selecionada com a mistura de ceramidase para transformar uma ou mais das células da população selecionada em condrócitos.

[0066] As células que têm o potencial de diferenciar em condor- citos incluem células da medula óssea, fibroblastos, células-tronco mesenquimais e/ou fibroblastos (ver Mizushima et al, "Ceramide, a Mediator of Interleukin 1, Tumour Necrosis Factor a, as Well as Fas Receptor Signaling, Induces Apoptosis of Rheumatoid Arthritis Synovial Cells," Ann. Rheum. Dis. 57:495-9 (1998), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0067] Condrócitos, de acordo com este aspecto da presente invenção, incluem, sem limitação, condrócitos articulares, condrócitos nasais, condrócitos traqueais, condrócitos meniscais e condrócitos aurais. Esses incluem, por exemplo, condrócitos de mamíferos, por exemplo, condrócitos humanos, condrócitos equinos, condrócitos suínos, condrócitos felinos e condrócitos caninos. Preferivelmente, os condrócitos são condrócitos primários.

[0068] Células apropriadas, de acordo com esse e todos os outros aspectos da presente invenção, incluem células de mamíferos, por exemplo, células humanas, células equinas, células suínas, células felinas e/ou células caninas. Células humanas são particularmente preferíveis.

[0069] Nesta e em todos os aspectos da presente invenção envolvendo populações celulares, modalidades em que as células são todas de um tipo, bem como modalidades em que a população é uma mistura de dois ou mais tipos celulares, são contempladas.

[0070] A mistura de ceramidase e os métodos de tratamento das populações de células com mistura de ceramidase inclui todas aquelas apresentadas acima.

[0071] Outra modalidade do presente aspecto do tratamento com AC se relaciona a um método para promover condrogênese com a mistura de ceramidase. Em uma modalidade, este método inclui ainda a seleção de uma população de células-tronco em necessidade de diferenciação em condrócitos, o tratamento da população de células- tronco com a mistura de ceramidase para enriquecer as células-tronco mesenquimais na população de células-tronco e o tratamento da população de células-tronco mesenquimais enriquecidas com a mistura de ceramidase para promover a diferenciação das células-tronco mesenquimais em condrócitos.

[0072] Populações celulares apropriadas, de acordo com esse e todos os outros aspectos da presente invenção, incluem populações celulares de mamíferos, por exemplo, populações celulares humanas, populações celulares equinas, populações celulares suínas, populações celulares felinas e/ou populações celulares caninas. Populações celulares humanas são particularmente preferíveis.

[0073] As células-tronco, de acordo com este e com todos os outros aspectos da presente invenção, incluem células da medula óssea, adipócitos e células cutâneas. As células-tronco, de acordo com este aspecto da presente invenção, incluem, sem limitação, células-tronco embrionárias, células-tronco somáticas, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco totipotentes, células-tronco pluripotentes e células-tronco multipotentes. As células-tronco exemplificativas incluem, por exemplo, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco mesenqui- mais, células-tronco neurais, células progenitoras endoteliais, células- tronco epiteliais, células-tronco epidérmicas, adipócitos e células-tronco cardíacas. As células-tronco apropriadas incluem, mas não se limitam a, células de mamíferos, por exemplo, células humanas, equinas, suínas, felinas e caninas de medula óssea. Células humanas são particular-mentepreferíveis.

[0074] Os condrócitos apropriados são consistentes com aqueles descritos acima. As células-tronco mesenquimais diferenciadas podem ser, alternativamente, células primárias, como, sem se limitar a, neurônicos, hepatócitos, células ósseas, células pulmonares e células cardíacas.

[0075] Em pelo menos uma modalidade, o número de células diferenciadas na população celular é mantido. Em pelo menos uma modalidade, o número de células diferenciadas na população celular é aumentado. Como ficará evidente àquele versado na técnica, a manutenção ou o aumento no número geral de células diferenciadas na população podem ser obtidos diminuindo-se ou evitando-se a dediferenciação de células na população que já estejam diferenciadas, estimulando-se a diferenciação de células indiferenciadas na população, ou ambos.

[0076] A mistura de ceramidase e os métodos de tratamento das populações de células com mistura de ceramidase inclui todas aquelas apresentadas acima.

[0077] Um terceiro aspecto da presente invenção se relaciona a um método de produção de uma composição terapêutica. O método inclui o fornecimento de um meio contendo um precursor de AC ativa; a incubação do meio sob condições efetivas para transformar uma porção do precursor de AC inativa em AC ativa; e a recuperação do meio incubado como uma mistura de ceramidase que compreenda o precursor de AC inativa e uma AC ativa.

[0078] A composição terapêutica da presente invenção contém uma proteína recombinante que inclui o precursor de AC inativa e a AC ativa. A proteína recombinante da presente invenção pode ser preparada para uso nos métodos da presente invenção descritos acima utilizando-se métodos padrão de síntese conhecidos na técnica, incluindo síntese peptídica de fase sólida (estratégias Fmoc ou Boc) ou síntese peptídica de fase de solução. Alternativamente, as proteínas da presente invenção podem ser preparadas usando-se sistemas de expressão recombinantes.

[0079] Geralmente, o uso de sistemas de expressão recombi- nantes envolvem a introdução da molécula de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos do peptídeo desejado em um sistema de expressão ao qual a molécula é heteróloga (isto é, não normalmente presente). Aquela ou mais de uma moléculas de ácido nucleico desejada(s) que codifica(m) um peptídeo da invenção pode(m) ser inserida(s) no vetor. Quando as múltiplas moléculas de ácido nucleico são introduzidas, as múltiplas moléculas de ácido nucleico podem codificar o mesmo peptídeo ou diferentes peptídeos. A molécula heteróloga de ácido nucleico é introduzida no sistema de expressão ou vetor na orientação de sentido apropriada (5' - 3') em relação ao promotor e a qualquer outra molécula regulatória em 5' e corrige o quadro de leitura.

[0080] A preparação dos construtos de ácido nucleico pode ser realizada usando procedimentos padrão de clonagem bem conhecidos na técnica, conforme descrito por Joseph Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Harbor 1989). Patente U.S. No. 4,237,224 para Cohen e Boyer, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, descreve a produção dos sistemas de expressão na forma de plasmídeos recombinantes utilizando clivagem enzimática de restrição e ligação com DNA ligase. Esses plasmídeos recombinantes são então inseridos por meio de transformação em uma célula hospedeira apropriada.

[0081] Uma variedade de sinais genéticos e eventos de proces samento que controla vários níveis de expressão genética (por exemplo, transcrição do DNA e tradução do RNA mensageiro ("mRNA")) pode ser incorporada ao construto de ácido nucleico para maximizar a produção de peptídeos. Para a finalidade de expressar uma sequência de ácidos nucleicos clonados que codifica uma proteína recombinante desejada, é vantajoso usar promotores fortes para obter um alto nível de transcrição. Dependendo do sistema hospedeiro utilizado, qualquer um dentre um número adequado de promotores pode ser usado. Por exemplo, ao clonar em E. coli, seus bacteriófagos, ou plasmídeos, promotores, como o promotor de fago T7, promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor de RNA ribossomal, os promotores PR e PL de colifago lambda e outros, incluindo, não se litando a, lacUV5, ompF, bla, Ipp e afins, podem ser usados para direcionar altos níveis de transcrição de segmentos de DNA adjacentes. Adicionalmente, um promotor trp- lacUV5 (tac) híbrido ou outros promotores de E. coli produzidos por DNA recombinante ou outras técnicas de DNA sintético podem ser usados para fornecer a transcrição do gene inserido. Os promotores apropriados para direcionar a expressão em células de mamíferos incluem, sem limitação, SV40, MMTV, metalotioneína-1, adenovírus Ela, CMV, um potencializador e um promotor de cadeia pesada de imunoglobulina precoce imediato e RSV-LTR. As células de mamíferos que podem ser usadas para produzir a proteína recombinante da presente invenção incluem, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de vegetais, ovos de galinha e fibroblastos humanos.

[0082] Existem outros sinais de iniciação específicos necessários para a tradução e a transcrição genética eficientes em células procarióticas que podem ser incluídos no construto de ácido nucleico para maximizar a produção peptídica. Dependendo do sistema de vetor e do hospedeiro utilizados, qualquer número de elementos de tradução e/ou transcrição apropriados, incluindo promotores constitutivos, indutíveis e repressíveis, bem como elementos do promotor mínimo em 5', intensificadores ou sequências líderes podem ser utilizados. Para uma revisão sobre a maximização da expressão genética, ver Roberts and Lauer, "Maximizing Gene Expression On a PlasmidUsing Recombination In Vitro " Methods in Enzymology 68:473-82 (1979), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0083] Molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante da presente invenção, uma molécula promotora da escolha, incluindo, sem limitação, intensificadores e sequências líderes; uma região regulatória 3' apropriada para permitir a transcrição no hospedeiro e quaisquer componentes adicionais desejados, como genes de marcação ou repórteres, são clonados no vetor de escolha utilizando procedimentos de clonagem padrão na técnica, conforme descrito em Joseph Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Harbor 1989); Frederick M. Ausubel, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley 1999), and U.S. Patent No. 4,237,224 to Cohen and Boyer, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[0084] Uma vez que a molécula de ácido nucleico que codifica o peptídeo tiver sido clonada em um vetor de expressão, ela está pronta para ser incorporada a um hospedeiro. As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células, sem limitação, através de transfecção (se o hospedeiro for um eucariota), transdução, conjugação, mobilização ou eletroporação, lipofecção, fusão de protoplastos, mobilização ou bombardeiro de partícula utilizando procedimentos de clonagem conhecidos na técnica, conforme descrito por JOSEPH SAMBROOK et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Harbor 1989), incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0085] Uma variedade de sistemas hospedeiro-vetor apropriados pode ser usada para expressar o polipeptídeo ou proteína recombinante. Primeiramente, o sistema de vetor deve ser compatível com o hospedeiro utilizado. Os sistemas hospedeiro-vetor incluem, sem limitação, o seguinte: uma bactéria transformada com o DNA bacteriófago, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo; microrganismos, como leveduras, contendo vetores de leveduras; sistemas de células de mamíferos infectados com vírus (por exemplo, vírus vaccínia, adenovírus, etc.); sistemas de células de insetos infectados com vírus (baculovírus); e células vegetais infectadas por bactérias.

[0086] Os peptídeos purificados podem ser obtidos por vários métodos prontamente conhecidos na técnica, incluindo cromatografia por troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade, filtração em gel e cromatografia de fase reversa. O peptídeo é produzido, preferencialmente, no formato purificado (preferencialmente cerca de 80% ou 85% puro, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% ou 95% puro) por técnicas convencionais. Dependendo do fato de a célula hospedeira recombinante ser levada a secretar o peptídeo no meio de crescimento (ver Patente U.S. No. 6,596,509 para Bauer et al., que é incorporada aqui por referência em sua totalidade), o peptídeo pode ser isolado e purificado por centrifugação (para separar os componentes celulares do sobrenadante contendo o peptídeo secretado) seguido da precipitação de sulfato de amônio sequencial do sobrenadante. Em uma modalidade da presente invenção, as células podem ser transformadas com o DNA codificando a AC e então cultivadas sob condições efetivas para produzir o meio contendo o precursor de AC inativa. A fração que contém o peptídeo é submetida a filtragem em gel em uma coluna de poliacrilamida ou dextrano apropriadamente dimensionada para separar os peptídeos das outras proteínas. Se necessário, a fração de peptídeo pode ser purificada adicionalmente por outra cromatografia.

[0087] Em uma modalidade da presente invenção, a incubação é realizada sob condições efetivas para reduzir a taxa de transformação do precursor de AC inativa em AC ativa em comparação à taxa de transformação obtida quando tal incubação é realizada a um pH de 4 e uma temperatura de 4°C ou 37°C, por 24 horas, sob condições consistentes de outra maneira.

[0088] Alternativamente, a incubação pode ser realizada sob condições efetivas para potencializar a taxa de transformação do precursor de AC inativa para AC ativa em comparação a essas mesmas condições.

[0089] Em algumas modalidades, a mistura de ceramidase durante a incubação pode ter um pH acima de 4.0 e até 6.5. A mistura pode, por exemplo, ter um pH de 4.0, de 4.5, de 5.0, de 5.5, de 6.0 ou de 6.5. Em outras modalidades, a temperatura da mistura de ceramidase durante tal incubação pode ser de pelo menos -30 °C e abaixo de 37 °C. A temperatura da mistura pode ser, por exemplo, de -30 °C, -25 °C, -20 °C, -15 °C, -10 °C, -5 °C, 0°C, 5 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C ou 35 °C. Alternativamente, a mistura pode ser incubada sob conduções de -30 °C com um pH de 4.0, 4 °C ou 6.5 °C, 25 °C com um pH de 4.0 ou 37 °C com um pH de 4.0. A mistura não pode ser incubada por um período como de, mas sem se limitar a, aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 30 horas ou 300 horas.

[0090] Durante a incubação desse aspecto da presente invenção, o meio pode ser aquecido sob condições efetivas para remover a atividade da esfingomielinase ácida. Nessa modalidade, o meio pode ser aquecido a 60 °C por um período de tempo que inclui, mas não se limita a, menos do que 20 minutos, 20-40 minutos, 40-60 minutos ou de mais do que 60 minutos.

[0091] Deve-se observar que certos aspectos, modos, modalidades, variações e características da presente invenção são descritos em vários níveis de detalhe a fim de fornecer um entendimento substancial da presente tecnologia. As definições de determinados termos, conforme utilizados neste relatório descritivo, também são fornecidas. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento geralmente têm o mesmo significado como comumente compreendido por um indivíduo versado na técnica à qual pertence esta invenção.

EXEMPLOS

[0092] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar modalidades da presente invenção, mas de maneira alguma pretendem-se limitar seu escopo.

Exemplo 1 - Materiais e Métodos

[0093] A preparação da rAC (Lote 6 e Lote 7) - Células de ovário de hamster chinês com superexpressão do gene Asahl humano foram gerados e a rAC foi purificada a partir dos meios (He et al., "Purification and Characterization of Recombinant, Human Acid Ceramidase. Catalytic Reactions and Interactions With Acid Sphingomyelinase," J. Biol. Chem. 278:32978-32986 (2003), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Nenhuma manipulação in vitro foi realizada após a purificação do Lote 6 (quantidade elevada do precursor de AC inativa). Após a purificação da enzima do Lote 7, a rAC foi incubada em tampão de fosfato de citrato de pH 4 a 37°C por três horas.

[0094] Comparação do Lote 7 e do Lote 7 para produção de embrião de camundongo - Os métodos para uso da rAC para a produção de embrião de camundongo são descritos em Eliyahu et al, "Acid Ceramidase Improves the Quality of Oocytes and Embryos and the Outcome of In Vitro Fertilization," FASEB J. 24: 1229-1238 (2010), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0095] O sêmen e os oócitos maduros foram obtidos a partir do camundongo preto C57 e a fertilização in vitro foi realizada usando quantidades iguais da enzina do Lote 6 e do Lote 7.

[0096] Comparação do Lote 6 e do Lote 7 para melhorar o fenótipo condrogênico dos condrócitos articulares de rato - Quantidades iguais da rAC do Lote 6 e do Lote 7 foram adicionadas aos meios dos condrócitos articulares primários isolados dos fêmures. A cartilagem foi digerida e as células foram substituídas em cultivo com e sem suplementação da rAC. Após três dias, os meios foram trocados para meios sem rAC. As células foram criadas por duas semanas adicionais e os níveis de colágeno 2 (marcadores de condrócitos articulares maduros) foram determinados por western blotting.

Exemplo 2 - rAC com menos AC ativa têm desempenho melhor do que aqueles com mais AC ativa.

[0097] As preparações de rAC com menos caramidase ativa têm melhor desempenho do que aquelas com mais ceramidase ativa (Figuras 1A-1C). Conforme indicado na Figura 1 A, uma análise western blot apresentou quantidades relativas de rAC precursora ativa (alfa/beta) contra inativa em duas execuções de biorreator diferentes (Lote 6 e Lote 7). O Lote 7 teve mais rAC ativa do que no Lote 6. Os exemplos in vitro (IVF e condrócitos) em comparação com duas preparações de rAC com razões que foram de cerca de 90: 10 (inativa: ativa) (Lote 6) contra aproximadamente 80:20 (inativa: ativa) (Lote 7) (Figura 1A). A apoptose foi determinara em 24 horas utilizando métodos morfológicos padrão (por exemplo, integridade da membrana, etc.) (Eliyahu et al., "Acid Ceramidase Improves the Quality of Oocytes and Embryos and the Outcome of InVitro Fertilization," FASEB J. 24: 1229-1238 (2010), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0098] A Figura 1B resume os resultados que mostram a capacidade para formar embriões de camundongo saudáveis nos Lotes 6 e 7. O Lote 7 (contendo mais rAC ativa) produziu mais embriões apoptóticos do que o Lote 6 (contendo menos rAC ativa). Como pode ser visto na Figura 1B, a preparação com menos enzimas ativas (Lote 6) proporcionou resultados melhores em IVF (menos embriões apoptóticos). Isso era inesperado.

[0099] O Lote 6 e o Lote 7 também foram testados utilizado condrócitos de rato cultivados (Figura 1C). Em duas semanas, a quantidade de expressão de colágeno 2 foi analisada utilizando western blotting. As células cultivadas com o Lote 7 (mais rAC ativa) produziram menos colágeno 2. O Lote 6 foi melhor na manutenção do fenótipo do condrócito após a expansão (Figura 1C, com base na expressão de colágeno 2). Isso era inesperado.

[00100] O desempenho melhorado de rAC contendo menos AC ativa é, hipoteticamente, devido à meia-vida mais breve da enzima ativa em células cultivadas (por sua vez, a meia-vida mais longa do precursor).

[00101] A fim de manipular a razão de enzima inativa para ativa, o pH foi ajustado a 4.0 e a preparação foi incubada a 37°C. Sob essas condições, um aumento de aproximadamente 10% de enzima ativa foi obtido para cada 3 horas de incubação. Assim, para cobrir uma preparação que seja 90:10 inativa:ativa para 100% ativa, a preparação é incubada por 27 horas.

[00102] Uma variável importante aqui é a temperatura. Se as preparações forem mantidas (pH ajustado) congeladas, não há nenhuma conversão. Se as preparações forem mantidas em 4°C (em um refrigerador), a que a conversão prossegue, mas a 1% da eficiência de 37°C (o aumento de 10% na enzima ativa necessita de 300 contra 3 horas). Se a preparação for mantida à temperatura ambiente (25°C), ela prossegue em 10%> da eficiência (10%> de aumento requer 30 horas). Se o pH não for acidificado, não há nenhuma conversão em 4°C e apenas 1% de taxa de conversão (300 horas são necessárias para um aumento de 10%) à temperatura ambiente. Exemplo 3 - Remoção da atividade de esfingomielinase contaminante da rAC.

[00103] Métodos para remover a atividade de esfingomielinase ácida contaminante (ASM) das preparações de rAC foram desenvolvidos. Isso requer a incubação das preparações de rAC finais a 60°C por 10-20 minutos. Essa incubação não afeta a rAC (atividade ou razão de inativa para ativa), mas remove toda a atividade de ASM, o que é essencial para a produção (Figura 2).

Exemplo 4 - Incubação de meios contendo ceramidase humana recombinante a 37°C para extensões variáveis de tempo

[00104] Os meios condicionados (DMEM, pH 6.8 contendo 10% de soro fetal de bezerro) foram coletados a partir das células do ovário do hamster chinês superexpressando e secretando ceramidase ácida huma-na recombinante (rhAC) (He et al., "Purification and Characterization of Recombinant, Human Acid Ceramidase. Catalytic Reactions and Interactions With Acid Sphingomyelinase," J. Biol. Chem. 278:3297832986 (2003), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). As células foram cultivadas até -100% de confluência em frascos de T- 75mm e os meios foram coletados após 4 dias de cultivo adicional. Os meios coletados foram filtrados através de membranas de 0.22mm para os detritos removidos e colocados em um incubador a 37°C por períodos de tempo variáveis. No fim do período de incubação, os meios foram congelados a -20°C antes do ensaio. A atividade da AC (Figura 3) foi determinada como previamente descrito (He et al, Anal Biochem, 274:264 (1999), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade): as misturas de reação foram incubadas por uma hora a 37°C. Western Blot de AC (Figura 4): 6.5 µl/faixa foram desenvolvidos usando um anticorpo monoclonal de AC anti-humano de camundongo (1:300, #SC136275, Santa Cruz) contra a subunidade alfa. Esses dados mostram a incubação in vitro dos meios contendo rhAC a 37°C por 3-17 dias, resultando na conversão do precursor inativo em enzima ativa (representada pela subunidade alfa e um aumento na atividade enzimática).

Exemplo 5 - Conversão in vitro da ceramidase ácida humana recombinante, purificada, a 37°C

[00105] A AC humana recombinante purificada (rhAC; 4 µg/µl em EMEM, pH 6.8) foi isolada dos meios das células de ovário de hamster chinês em superexpressão, como previamente descrito (He et al, "Purification and Characterization of Recombinant, Human Acid Ceramidase. Catalytic Reactions and Interactions With Acid Sphingomyelinase," J. Biol. Chem. 278:32978-32986 (2003), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Western Blot de AC (Figura 5): 6.5 µl/faixa, foi desenvolvida usando um anticorpo monoclonal de AC anti-humano de camundongo (1:300, #SC136275, Santa Cruz) contra a subunidade alfa. Esses dados mostram que a incubação in vitro da rhAC purificada a 37°C por 24h (Figura 5A) resultou na conversão completa do precursor para a forma ativa. A incubação de 1-8 horas (Figura 5B) mostrou uma progressão linear de conversão.

[00106] Embora a invenção tenha sido descrita detalhadamente para finalidade de ilustração, entende-se que tal detalhamento é somente para essa finalidade e podem ser feitas variações por aqueles versados na técnica sem desviar do espírito e do escopo da invenção, que é definido pelas seguintes reivindicações.

Claims (12)

1. Método de produção de uma composição terapêutica, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um meio contendo um precursor de ceramidase ácida inativa recombinante; incubar o meio sob condições eficazes para transformar uma parte do precursor de ceramidase ácida inativa para ceramidase ácida ativa através de clivagem autoproteolítica, em que a referida incubação é realizada a um pH de 4 a 6,5 e uma temperatura de 30°C, 35°C ou 37°C durante 3 horas, e compreende ainda o aquecimento do referido meio sob condições eficazes para remover a atividade da esfingomielinase ácida, em que o referido aquecimento é realizado a uma temperatura de 60°C durante 10 a 20 minutos; e recuperar o meio incubado como uma mistura de ceramidase compreendendo o precursor de ceramidase ácida inativa e uma ceramidase ácida ativa, em que a mistura de ceramidase não tem atividade de esfingomielinase ácida detectável.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida incubação é realizada a um pH de 4 e a uma temperatura de 37°C.

3. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: uma mistura de ceramidase recombinante compreendendo: um precursor de ceramidase ácida inativa, e uma ceramidase ácida ativa; e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a mistura de ceramidase não apresenta atividade de esfingomielinase detectável.

4. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mistura de ceramidase compreende 55 a 95% em peso do precursor da ceramidase ácida inativa e 45 a 5% em peso da ceramidase ácida ativa, 70 a 95% em peso do precursor da ceramidase ácida inativa e 30 a 5% em peso da ceramidase ácida ativa, ou 80 a 90% em peso do precursor da ceramidase ácida inativa e 20 a 10% em peso da ceramidase ácida ativa.

5. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda: um adjuvante.

6. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em flagelina, adjuvante de Freund completo ou incompleto, hidróxido de alumínio, lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, dinitrofenol, iscomatrix e partículas de lipossomas policatiônicos de DNA.

7. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida mistura de ceramidase recombinante está em uma forma selecionada de comprimidos, cápsulas, elixires, suspensões, uma solução, uma dispersão ou xaropes.

8. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida mistura de ceramidase recombinante está na forma de aerossol.

9. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente adicional selecionado dentre inibidores de esfingomielinase ácida, inibidores de ceramida sintases ou uma combinação dos mesmos.

10. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mistura de ceramidase compreende Acesso NCBI AAC50907 de SEQ ID NO: 1.

11. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mistura de ceramidase compreende UniProt Q13510 de SEQ ID NO: 2.

12. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mistura de ceramidase compreende NCBI RefSeq NP_808592 de SEQ ID NO: 3.