BR112015012310B1

BR112015012310B1 - HETERODIMER, HETERODIMERIC FC PROTEIN PAIR, BIOSPECIFIC ANTIBODY, MONOVALENT ANTIGEN BINDING ANTIBODY, FUSION PROTEIN, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND METHOD FOR PREPARING A HETERODIMERIC FC PROTEIN PAIR

Info

Publication number: BR112015012310B1
Application number: BR112015012310-4A
Authority: BR
Inventors: Yong Sung Kim; Hye Ji Choi; Eun Sil Sung
Original assignee: Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2023-05-23

Abstract

PAR VARIANTE DE DOMÍNIO CH3 INDUZINDO FORMAÇÃO DE HETERODÍMERO DE REGIÃO CONSTANTE DE CADEIA PESADA DO ANTICORPO EM ALTA EFICIÊNCIA, MÉTODO PARA PREPARAR O MESMO, E USO DO MESMO. A presente invenção relaciona-se a um par variante de domínio CH3 de um anticorpo, a um método para preparar o mesmo, e a um uso do mesmo, em que uma mutação é induzida no domínio CH3 de forma a melhorar a produção de formação de uma região constante de cadeia pesada heterodimérica de um anticorpo. O domínio CH3 do heterodímero de acordo com a presente invenção, forma uma região constante de cadeia pesada heterodimérica com uma alta eficiência de 90 a 95% ou mais e também tem excelente estabilidade de aquecimento. Uma região constante de cadeia pesada heterodimérica incluindo o domínio CH3 do heterodímero pode construir um anticorpo monoclonal biespecífico que simultaneamente reconhece dois tipos de antígenos. O domínio CH3 do heterodímero da presente invenção e o anticorpo biespecífico ou proteína de fusão de uma região constante de anticorpo compreendendo o mesmo podem ser úteis aplicados ao tratamento ou prevenção de uma doença associada com um antígeno alvo ou uma proteína alvo.CH3 DOMAIN VARIANT PAIR INDUCING ANTIBODY HEAVY CHAIN CONSTANT REGION HETERODIMER FORMATION IN HIGH EFFICIENCY, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND USE THEREOF. The present invention relates to a CH3 domain variant pair of an antibody, a method for preparing the same, and a use thereof, wherein a mutation is induced in the CH3 domain in order to improve the production of formation of antibodies. a heterodimeric heavy chain constant region of an antibody. The CH3 domain of the heterodimer according to the present invention forms a heterodimeric heavy chain constant region with a high efficiency of 90 to 95% or more and also has excellent heating stability. A heterodimeric heavy chain constant region including the CH3 domain of the heterodimer can construct a bispecific monoclonal antibody that simultaneously recognizes two types of antigens. The CH3 domain of the heterodimer of the present invention and the bispecific antibody or antibody constant region fusion protein comprising the same can be useful applied to the treatment or prevention of a disease associated with a target antigen or a target protein.

Description

Technical Field

[001] A presente invenção relaciona-se a um variante de domínio CH3 indu-zindo uma mutação em um domínio CH3 para melhorar um campo de formação de um heterodímero em uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo (imu- noglobulina G, IgG), um par proteico Fc heterodimérico usando o par de mutação CH3, um anticorpo biespecífico, e uma proteína de fusão.[001] The present invention relates to a CH3 domain variant inducing a mutation in a CH3 domain to improve a field of formation of a heterodimer in a constant region of the heavy chain of an antibody (immunoglobulin G, IgG ), a heterodimeric Fc protein pair using the CH3 mutation pair, a bispecific antibody, and a fusion protein.

[002] A presente invenção também se relaciona a uma composição farma-cêutica incluindo o heterodímero, um par Fc heterodimérico tendo o mesmo, um an-ticorpo biespecífico, e uma proteína de fusão.[002] The present invention also relates to a pharmaceutical composition including the heterodimer, a heterodimeric Fc pair having the same, a bispecific antibody, and a fusion protein.

[003] A presente invenção também se relaciona a um método para prepara-ção de um par variante de domínio CH3 e uma par proteico Fc heterodimérico em cuja formação do domínio heterodimérico CH3 do Fc do anticorpo é preferido.[003] The present invention also relates to a method for preparing a CH3 domain variant pair and a heterodimeric Fc protein pair in which formation of the CH3 heterodimeric domain of the Fc of the antibody is preferred.

Background of the Technique

[004] No final do século 19, o fato que quando soro de um animal experimen-tal ao qual difteria e tétano em uma dose não letal foram administrados foi adminis-trado a outros animais, foi descoberto que difteria e tétano puderam ser prevenidos. Após a descoberta, uso clínico do conceito de terapia sérica, isto é, terapia de anti-corpo foi gradualmente iniciada. Entretanto, o tratamento de anticorpo precoce teve praticabilidade limitada devido a problemas de obtenção um anticorpo de alta pureza e contaminação por agentes infecciosos transmissíveis pelo sangue. A fim de ende-reçar tais problemas no tratamento de anticorpo tradicional, um anticorpo monoclonal originado de roedor de uma forma pura foi produzido em larga escala em um custo relativamente baixo por uma técnica de fusão de hibridoma desenvolvida em 1975. Entretanto, devido a vários problemas e efeitos colaterais tal como uma média vida curta, uma resposta imune a um anticorpo anti-camundongo, eficácia reduzida e uma reação alérgica quando um anticorpo monoclonal originado de camundongo é administrado a um corpo humano, um uso clínico do mesmo foi limitado.[004] At the end of the 19th century, the fact that when serum from an experimental animal to which diphtheria and tetanus in a non-lethal dose was administered was administered to other animals, it was discovered that diphtheria and tetanus could be prevented. After the discovery, clinical use of the concept of serum therapy, that is, antibody therapy, was gradually initiated. However, early antibody treatment has had limited feasibility due to problems in obtaining a high-purity antibody and contamination from bloodborne infectious agents. In order to address such problems in traditional antibody treatment, a rodent-derived monoclonal antibody in a pure form was produced on a large scale at relatively low cost by a hybridoma fusion technique developed in 1975. However, due to several Problems and side effects such as a short half-life, an immune response to an anti-mouse antibody, reduced efficacy and an allergic reaction when a mouse-originated monoclonal antibody is administered to a human body, a clinical use thereof has been limited.

[005] Devido ao advento de uma técnica de gene recombinante, que foi um ponto de partida de uma revolução biotecnológica na década de 1980, um anticorpo humanizado em que um anticorpo monoclonal de camundongo é humanizado atra-vés da manipulação gênica pode ser preparado; vários efeitos colaterais imunológi- cos causados quando o anticorpo é administrado a um paciente foram mimetizados; e a fundação de um uso clínico ativo de um anticorpo terapêutico foi estabelecido. Entretanto, tecnologia fundamental com a qual um anticorpo monoclonal humano completo pode ser produzido com o auxílio de uma técnica de "phage display" ou um camundongo transgênico tem sido desenvolvido desde meados da década de 1990. Atualmente, muitas companhias farmacêuticas domésticas e internacionais entusias-ticamente conduzem grande quantidade de pesquisa e investimento para desenvol-vimento de uma nova droga usando um anticorpo. Hoje, Administração de Alimento e Droga dos Estados Unidos (US Food and Drug administration - FDA) aprovou as drogas de anticorpos numerando cerca de 26 que são comercialmente disponíveis ao redor do mundo, e 300 ou mais anticorpos terapêuticos estão em um passo de triagem clínica, que mostrarão a importância do anticorpo na indústria farmacêutica. Enquanto isso, resultados de triagem pré-clínica e clínica mostrando que, quando um anticorpo tendo seletividade alvo e um agente quimioterápico tendo nenhuma especificidade alvo são coadministrados, efeitos colaterais são suprimidos e um efei-to terapêutico é melhorado tem sido recentemente relatado. Então, utilidade do anti-corpo será ainda aumentada no tratamento anticâncer.[005] Due to the advent of a recombinant gene technique, which was a starting point of a biotechnology revolution in the 1980s, a humanized antibody in which a mouse monoclonal antibody is humanized through gene manipulation can be prepared; several immunological side effects caused when the antibody is administered to a patient have been mimicked; and the foundation of an active clinical use of a therapeutic antibody has been laid. However, fundamental technology with which a complete human monoclonal antibody can be produced with the aid of a "phage display" technique or a transgenic mouse has been developed since the mid-1990s. typically conduct a large amount of research and investment to develop a new drug using an antibody. Today, the US Food and Drug administration (FDA) has approved antibody drugs numbering about 26 that are commercially available around the world, and 300 or more therapeutic antibodies are in a clinical screening step. , which will show the importance of the antibody in the pharmaceutical industry. Meanwhile, preclinical and clinical screening results showing that when an antibody having target selectivity and a chemotherapeutic agent having no target specificity are co-administered, side effects are suppressed and a therapeutic effect is enhanced has been recently reported. Then, usefulness of the antibody will be further increased in anticancer treatment.

[006] Entretanto, atualmente, uma nova droga anticorpo está sendo desen-volvida principalmente para câncer e doenças autoimunes. Em particular, uma nova droga anticorpo na forma de IgG ou um anticorpo intacto não mostra um efeito tera-pêutico satisfatório para tumores sólidos, e alto custo da produção de anticorpo pode ser um obstáculo para desenvolver a nova droga de anticorpo. Então, o desenvolvi-mento de uma nova droga de anticorpo de uma forma de proteína recombinante que tem um efeito biológico mais melhorado que o anticorpo na técnica relacionada tem sido continuamente tentado. Uma dessas é um anticorpo biespecífico em que um anticorpo pode se ligar a pelo menos duas moléculas alvos, em que uma pesquisa tem sido iniciada desde meados da década de 1980 para uso do anticorpo, em parti-cular, para tratamento anticâncer.[006] However, currently, a new antibody drug is being developed mainly for cancer and autoimmune diseases. In particular, a new antibody drug in the form of IgG or an intact antibody does not show a satisfactory therapeutic effect for solid tumors, and high cost of antibody production can be an obstacle to develop the new antibody drug. Therefore, the development of a new antibody drug of a recombinant protein form which has a more improved biological effect than the antibody in the related art has been continuously attempted. One of these is a bispecific antibody in which an antibody can bind to at least two target molecules, where research has been initiated since the mid-1980s into the use of the antibody, in particular, for anticancer treatment.

[007] Anticorpos naturais (imunoglobulina G (IgG), IgM, IgD, IgE e IgA) têm uma forma em que duas cadeias pesadas tendo a mesma sequência aminoácida e duas cadeias leves tendo a mesma sequência são unidas. Neste caso, formação de um homodímero das mesmas duas cadeias pesadas é induzida através de uma inte-ração entre os domínios finais (isto é, um domínio CH3 na IgG, um domínio CH4 na IgM, um domínio CH3 na IgD, domínios CH2 e CH4 em IgE, e um domínio CH3 em IgA) de uma região constante (Fc, fragmento cristalizável) de um anticorpo. Então, uma ponte dissulfeto entre regiões da dobradiça é induzida, e um homodímero entre cadeias pesadas robustas é formado. Especificamente, uma união de uma cadeia pesada e uma cadeia leve é uma IgG1 humana é induzida por uma ligação dissulfe- to entre o 5o Cys na região de dobradiça da cadeia pesada ao 107o Cys em uma ca-deia leve kappa.[007] Natural antibodies (immunoglobulin G (IgG), IgM, IgD, IgE and IgA) have a form in which two heavy chains having the same amino acid sequence and two light chains having the same sequence are joined together. In this case, formation of a homodimer of the same two heavy chains is induced through an interaction between the final domains (i.e., a CH3 domain in IgG, a CH4 domain in IgM, a CH3 domain in IgD, CH2 and CH4 domains in IgE, and a CH3 domain in IgA) of a constant region (Fc, crystallizable fragment) of an antibody. Then, a disulfide bond between hinge regions is induced, and a homodimer between robust heavy chains is formed. Specifically, a union of a heavy chain and a light chain in human IgG1 is induced by a disulfide bond between the 5th Cys in the heavy chain hinge region to the 107th Cys in a kappa light chain.

[008] Então, um anticorpo monoclonal natural (mAb) tem uma característica de ligação bivalente a um tipo de um antígeno. Por outro lado, o anticorpo biespecí- fico refere-se a um anticorpo em uma forma de molécula única que pode simultane-amente ou alternadamente ligar a dois tipos de antígenos. Tal um anticorpo biespe- cífico é conhecido na técnica relacionada como uma proteína manipulada tal como um anticorpo multiespecífico que pode se ligar a dois ou mais antígenos, e pode ser preparado usando fusão celular, ligação química, e técnicas de DNA recombinante.[008] So, a natural monoclonal antibody (mAb) has a feature of bivalent binding to one type of an antigen. On the other hand, bispecific antibody refers to an antibody in a single molecule form that can simultaneously or alternately bind to two types of antigens. Such a bispecific antibody is known in the related art as an engineered protein such as a multispecific antibody that can bind two or more antigens, and can be prepared using cell fusion, chemical linkage, and recombinant DNA techniques.

[009] Na técnica relacionada, um anticorpo biespecífico foi preparado usando uma técnica quadroma em que a fusão de célula somática de duas linhagens de célula hibridoma diferentes expressando um anticorpo monoclonal de camundongo tendo especificidade desejada é utilizado (Milstein e Cuello, 1983). Neste caso, duas cadeias leves diferentes são aleatoriamente pareadas nas linhagens de células qua-dromas para produzir um máximo de 10 tipos de vários anticorpos, e é muita dificul-dade para separar e purificar um anticorpo biespecífico desejado a partir desta mis-tura de anticorpo. Em conformidade, processos de purificação de complexo foram necessários para obter somente um anticorpo biespecífico desejado desde que exista subprodutos que formam um pareamento errado e uma produção de rendimento diminuído (Morrison 2007).[009] In the related art, a bispecific antibody was prepared using a quadroma technique in which somatic cell fusion of two different hybridoma cell lines expressing a mouse monoclonal antibody having desired specificity is used (Milstein and Cuello, 1983). In this case, two different light chains are randomly paired in the quad-droma cell lines to produce a maximum of 10 types of various antibodies, and it is very difficult to separate and purify a desired bispecific antibody from this antibody mixture. . Accordingly, complex purification processes were necessary to obtain only a desired bispecific antibody since there are by-products that form mismatches and decreased yield production (Morrison 2007).

[0010] Como um método de endereçar tais problemas, uma forma de anti-corpo biespecífico em que fragmentos do sítio de ligação de antígeno de uma cadeia leve e uma cadeia pesada são conectadas por várias cadeias e expressas em uma construção única foi desenvolvida. Esta forma inclui formas de di-anticorpos de ca-deia simples, um fragmento variável de anticorpo de cadeia simples tandem (scFv) e semelhantes (Holliger e Hudson 2005). Também, um anticorpo biespecífico em que fragmentos de anticorpo de ligação de antígeno adicionais são fusionados ao N- terminal ou C-terminal de cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo, que tem uma forma similar a Ig, foi preparado (Miller, Meng e colaboradores; Lu, Zhang e colaboradores 2004).[0010] As a method of addressing such problems, a form of bispecific antibody in which fragments of the antigen binding site of a light chain and a heavy chain are connected by multiple chains and expressed in a single construct has been developed. This form includes forms of single-chain di-antibodies, a tandem single-chain antibody variable fragment (scFv), and the like (Holliger and Hudson 2005). Also, a bispecific antibody in which additional antigen-binding antibody fragments are fused to the N-terminus or C-terminus of a heavy chain or a light chain of an antibody, which has an Ig-like shape, has been prepared (Miller, Meng et al.; Lu, Zhang et al. 2004).

[0011] Entretanto, o anticorpo biespecífico baseado em tal um fragmento de anticorpo unido tem problemas em que um nível de expressão diminui devido à baixa estabilidade, agregação de anticorpo é formada, e imunogenicidade aumenta de acordo (Chan e Carter 2010). Também, o anticorpo biespecífico baseado em somente o fragmento de anticorpo unido não tem nenhuma região constante de cadeia pe- sada (Fc) do anticorpo. Assim, há um problema em que os seguintes estão ausentes: estabilidade que aumenta em associação com Fc, uma longa meia vida sérica dependendo de um tamanho aumentado e ligação a um receptor Fc (receptor Fc neonatal, FcRn), uma vantagem de preservação do sítio de ligação (proteína A e proteína G) em um processo de purificação, uma citotoxidade celular dependente de anticorpo e uma citotoxidade celular dependente de complemento (Chan e Carter 2010).[0011] However, bispecific antibody based on such a joined antibody fragment has problems in that an expression level decreases due to low stability, antibody aggregation is formed, and immunogenicity increases accordingly (Chan and Carter 2010). Also, the bispecific antibody based on only the joined antibody fragment has no heavy chain (Fc) constant region of the antibody. Thus, there is a problem where the following are absent: stability that increases in association with Fc, a long serum half-life depending on an increased size and binding to an Fc receptor (neonatal Fc receptor, FcRn), a site-preserving advantage binding (protein A and protein G) in a purification process, an antibody-dependent cellular cytotoxicity, and a complement-dependent cellular cytotoxicity (Chan and Carter 2010).

[0012] Então, idealmente, é necessário desenvolver um anticorpo biespecífi- co tendo uma estrutura que é muito similar a anticorpos de ocorrência natural (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) e tendo um desvio mínimo de sequência do mesmo.[0012] So, ideally, it is necessary to develop a bispecific antibody having a structure that is very similar to naturally occurring antibodies (IgG, IgM, IgA, IgD and IgE) and having a minimal sequence deviation from it.

[0013] A fim de resolver o problema acima, foi tentado desenvolver um anti-corpo biespecífico usando uma técnica "knob-into-hole". Nesta técnica, através de manipulação gênica, uma mutação é induzida em um domínio CH3 de duas cadeias pesadas Ig diferentes, uma estrutura inteira é feita em um domínio CH3 de uma ca-deia pesada de Ig, uma estrutura knob é feita em um domínio CH3 de uma cadeia pesada Ig, uma estrutura knob é feita no domínio CH3 de outra cadeia pesada de Ig, e duas cadeias pesadas de Ig são induzidas para formar um heterodímero (Patente Norte-Americana No. 7695936 B2; Pedido de Patente Em Aberto Coreano No. 10-2010-0087394). Neste caso, resíduos aminoácidos inclusos em um núcleo hidrofóbi- co contribuindo para formação do homodímero entre domínios CH3 de cadeia pesa-da de Ig humana são Leu351, Thr368, e Tyr407 de acordo com o número EU do número de aminoácidos da cadeia de anticorpo (Cunningham, Pflumm et al. 1969). Na técnica "knob-into-hole", foi relatado que, com respeito aos resíduos posicionados ao núcleo hidrofóbico em uma interface do domínio CH3, uma estrutura inteira é feita em um domínio CH3 de cadeia pesada tal que resíduos aminoácidos hidrofóbi- cos tendo uma grande cadeia lateral são substituídos com aminoácidos hidrofóbicos tendo uma cadeia lateral pequena (Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val), uma estrutu- ra knob é feita a fim de outro domínio CH3 de cadeia pesada tal que resíduos ami- noácidos hidrofóbicos tendo uma pequena cadeia lateral pequena são substituídos com aminoácidos hidrofóbicos tendo uma cadeia lateral grande (Thr366Trp), e quando dois pares de mutação, isto é, pares de mutação de região constante de ca-deia pesada em que CH3A (Thr366Ser, Leu368Ala, e Tyr407Val) e CH3B (Thr366Trp) são introduzidos foram co-expressos, formação do Fc heterodimérico é preferido mais que a formação da região constante de cadeia pesada homodimérica (Ridgway, Presta et al. 1996). Entretanto, na técnica "knob-into-hole", é relatado que um rendimento de formação do Fc heterodimérico (heterodímero Fc heterodimérico) é cerca de 80% (Ridgway, Presta et al. 1996). A fim de promover a estabilização do heterodímero, existe um caso onde um phago display e uma ponte dissulfeto são introduzidos para ainda aumentar a interação (Atwell, Ridgway e colaboradores 1997; Merchant, Zhu e colaboradores 1998, e Patente Norte-Americana No. 5731168A).[0013] In order to solve the above problem, it was attempted to develop a bispecific antibody using a "knob-into-hole" technique. In this technique, through gene manipulation, a mutation is induced in a CH3 domain of two different Ig heavy chains, an entire structure is made in a CH3 domain of an Ig heavy chain, a knob structure is made in a CH3 domain of an Ig heavy chain, a knob structure is made in the CH3 domain of another Ig heavy chain, and two Ig heavy chains are induced to form a heterodimer (US Patent No. 7695936 B2; Korean Laid-Open Patent Application No. 10-2010-0087394). In this case, amino acid residues included in a hydrophobic core contributing to homodimer formation between human Ig heavy chain CH3 domains are Leu351, Thr368, and Tyr407 according to the EU number of the antibody chain amino acid number ( Cunningham, Pflumm et al 1969). In the "knob-into-hole" technique, it has been reported that, with respect to residues positioned to the hydrophobic core at an interface of the CH3 domain, an entire structure is made in a heavy-chain CH3 domain such that hydrophobic amino acid residues having a large side chain are replaced with hydrophobic amino acids having a small side chain (Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val), a knob structure is made in order to another heavy chain CH3 domain such that hydrophobic amino acid residues having a small side chain are replaced with hydrophobic amino acids having a large side chain (Thr366Trp), and when two mutation pairs, i.e. heavy-chain constant region mutation pairs in which CH3A (Thr366Ser, Leu368Ala, and Tyr407Val) and CH3B (Thr366Trp ) are introduced were co-expressed, heterodimeric Fc formation is preferred over homodimeric heavy chain constant region formation (Ridgway, Presta et al. 1996). However, in the "knob-into-hole" technique, a yield of formation of heterodimeric Fc (heterodimeric Fc heterodimer) is reported to be about 80% (Ridgway, Presta et al. 1996). In order to promote heterodimer stabilization, there is a case where a phage display and a disulfide bridge are introduced to further enhance the interaction (Atwell, Ridgway et al. 1997; Merchant, Zhu et al. 1998, and US Patent No. 5731168A ).

[0014] Como outro método em que a formação do Fc heterodimérico (hete- rodímero Fc heterodimérico) é aumentado, existe um exemplo onde uma mutação é induzida em um aminoácido carregado em uma interface entre domínios CH3. Espe-cificamente, um domínio CH3 em uma região constante é induzida para ter aminoá- cidos de cadeia lateral positivamente carregados, e um domínio CH3 na outra região constante é induzido para ter aminoácidos de cadeia lateral negativamente carrega-da, assim inibindo a formação do homodímero devido a repulsão eletrostática, e au-mentando formação do heterodímero devido a interação eletrostática (Gunasekaran, Pentony e colaboradores. 2010, e Pedido de Patente em Aberto Norte-Americano No. 2010/0286374 A1). Isto é, Lys392Asp e Lys409Asp são introduzidos em um domínio CH3, Glu356Lys e Asp399Lys são introduzidos em outro domínio CH3, e então, formação do heterodímero foi induzida. Uma produção de formação do Fc hete- rodimérico da mutação do domínio CH3 é cerca de 90%.[0014] As another method in which the formation of heterodimeric Fc (heterodimeric Fc heterodimer) is enhanced, there is an example where a mutation is induced in a charged amino acid at an interface between CH3 domains. Specifically, a CH3 domain in one constant region is induced to have positively charged side-chain amino acids, and a CH3 domain in the other constant region is induced to have negatively charged side-chain amino acids, thus inhibiting the formation of the homodimer due to electrostatic repulsion, and increasing heterodimer formation due to electrostatic interaction (Gunasekaran, Pentony et al. 2010, and US Patent Application No. 2010/0286374 A1). That is, Lys392Asp and Lys409Asp are introduced into one CH3 domain, Glu356Lys and Asp399Lys are introduced into another CH3 domain, and thus, heterodimer formation was induced. A heterodimeric Fc formation yield of the CH3 domain mutation is about 90%.

[0015] Como ainda outro método em cuja formação do Fc heterodimérico (heterodímero Fc heterodimérico) é aumentado, existe um exemplo onde uma muta-ção complementar é induzida em uma região formadora de uma região do núcleo hidrofóbico de uma interface CH3 devido a uma diferença de tamanho entre cadeias laterais aminoácidas hidrofóbicas, e então, formação do heterodímero é aumentada (Moore, Bautista et al. 2011, e Pedido de Patente em Aberto Norte-Americano No. US 2011/0054151 A1). Especificamente, Ser364His e Phe495Ala são introduzidos em um domínio CH3, Tyr349Thr e Thr394Phe são introduzidos em outro domínio CH3, e então, formação do heterodímero foi induzida. Um rendimento de formação do Fc heterodimérico da mutação no domínio CH3 é cerca de 80 a 90%.[0015] As yet another method in which formation of the heterodimeric Fc (heterodimeric Fc heterodimer) is increased, there is an example where a complementary mutation is induced in a region forming a hydrophobic core region of a CH3 interface due to a difference in size between hydrophobic amino acid side chains, and thus, heterodimer formation is increased (Moore, Bautista et al. 2011, and US Laid-Open Patent Application No. US 2011/0054151 A1). Specifically, Ser364His and Phe495Ala are introduced into one CH3 domain, Tyr349Thr and Thr394Phe are introduced into another CH3 domain, and thus, heterodimer formation was induced. A heterodimeric Fc formation yield from CH3 domain mutation is about 80 to 90%.

[0016] Entretanto, o Fc heterodimérico incluindo o par variante de domínio CH3 desenvolvido tem uma estabilidade termodinâmica inferior e rendimento de ex-pressão que aquele de um anticorpo selvagem.[0016] However, the heterodimeric Fc including the developed CH3 domain variant pair has a lower thermodynamic stability and expression yield than that of a wild-type antibody.

[0017] Então, é necessário desenvolver o Fc heterodimérico tendo um ren-dimento de formação do heterodímero tão alto quanto possível, tendo uma estabili-dade termodinâmica e rendimento de expressão que é similar a um ou mais aumen-tado que aquele de um selvagem, mas não existe ainda relatos que satisfaçam tal necessidade.[0017] Therefore, it is necessary to develop the heterodimeric Fc having as high a heterodimer formation yield as possible, having a thermodynamic stability and expression yield that is similar to one or more increased than that of a wild-type , but there are still no reports that satisfy this need.

Revelation Technical problem

[0018] A presente invenção é elaborada para desenvolver uma técnica para estavelmente aumentar um rendimento de formação de um Fc heterodimérico de um anticorpo a 90% ou mais, e provê um heterodímero CH3 em que uma mutação é induzida em um domínio CH3 a fim de aumentar um rendimento de formação do Fc heterodimérico, e um método de preparar o mesmo.[0018] The present invention is designed to develop a technique for stably increasing a heterodimeric Fc formation yield of an antibody to 90% or more, and provides a CH3 heterodimer in which a mutation is induced in a CH3 domain in order to increasing a yield of heterodimeric Fc formation, and a method of preparing the same.

[0019] A presente invenção também provê um par Fc heterodimérico incluin-do o heterodímero CH3, um anticorpo biespecífico, e uma proteína de fusão.[0019] The present invention also provides a heterodimeric Fc pair including the CH3 heterodimer, a bispecific antibody, and a fusion protein.

[0020] A presente invenção também provê um anticorpo biespecífico ou uma proteína fusionada a região constante do anticorpo incluindo o heterodímero CH3 e tendo um nível de expressão, um rendimento de produção e uma estabilidade ter-modinâmica que são similares a ou mais melhoradas que um anticorpo selvagem original.[0020] The present invention also provides a bispecific antibody or a protein fused to the constant region of the antibody including the CH3 heterodimer and having an expression level, a production yield and a thermodynamic stability that are similar to or more improved than a original wild antibody.

[0021] A presente invenção também provê um anticorpo ou uma proteína fu-sionada a região constante do anticorpo incluindo o heterodímero CH3, mantendo uma função intrínseca de uma região constante de cadeia pesada (Fc) de um anti-corpo selvagem original, isto é, uma habilidade de ligação ao FcRn (receptor Fc ne-onatal) e FcRs (receptores Fc gama), tendo uma meia vida sérica longa, mantendo uma função efetora, e preservando um sítio de ligação (proteína A e proteína G) em um processo de purificação.[0021] The present invention also provides an antibody or protein fused to the antibody constant region including the CH3 heterodimer, maintaining an intrinsic function of a heavy chain (Fc) constant region of an original wild-type antibody, i.e. , an ability to bind FcRn (neonatal Fc receptor) and FcRs (Fc gamma receptors), having a long serum half-life, maintaining an effector function, and preserving a binding site (protein A and protein G) in a process of purification.

[0022] A presente invenção também provê um anticorpo biespecífico ou uma proteína fusionada a região constante de anticorpo incluindo o heterodímero CH3, e capaz de simultaneamente ter como alvo dois tipos de antígenos diferentes.[0022] The present invention also provides a bispecific antibody or a protein fused to the constant region of an antibody including the CH3 heterodimer, and capable of simultaneously targeting two different types of antigens.

[0023] A presente invenção também provê um método para preparar uma proteína par variante de domínio CH3 (CH3 heterodimérico) e um par Fc heterodimé- rico dobradiça-CH2-CH3A e dobradição-CH2-Ch3B) em cuja formação do Fc hete- rodimérico é preferido.[0023] The present invention also provides a method for preparing a protein pair CH3 domain variant (CH3 heterodimeric) and a heterodimeric Fc pair hinge-CH2-CH3A and fold-CH2-Ch3B) in which formation of the Fc heterodimeric is preferred.

[0024] O objetivo da presente invenção não é limitado aos objetos descritos acima, e outros objetos não mencionados podem ser claramente entendido por aqueles versados na técnica a partir das seguintes descrições.[0024] The object of the present invention is not limited to the objects described above, and other objects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following descriptions.

Technical Solution

[0025] A presente invenção provê um heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo incluindo o seguinte ligante (a): (a) em um primeiro grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consistindo de Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 e Lys409, um ligante entre i) um aminoácido sele- cionado a partir do grupo consistindo de alanina (A), treonina (T) serina (S), valina (V), metionina (M), e glicina (G), que é substituído em pelo menos uma posição do primeiro grupo, e ii) um aminoácido selecionado a partir o grupo consistindo de feni- lalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W), que é substituído em pelo menos uma posi-ção do primeiro grupo (em que, as posições são numeradas de acordo com o índice EU).[0025] The present invention provides a heterodimer including CH3 domains of antibody including the following linker (a): (a) in a first group of CH3 domain selected from the group consisting of Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392 , Asp399, Phe405, and Lys409, a linker between i) an amino acid selected from the group consisting of alanine (A), threonine (T), serine (S), valine (V), methionine (M), and glycine ( G), which is substituted in at least one position of the first group, and ii) an amino acid selected from the group consisting of phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W), which is substituted in at least a position from the first group (in which the positions are numbered according to the EU index).

[0026] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo pode ainda in-cluir o seguinte ligante (b): (b) em um segundo grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consistindo de Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 e Ser400, um ligante entre i) lisina (K) ou arginina (R), que é substituído em pelo menos uma posição do segundo grupo, e ii) ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E), que é substituído em pelo menos uma posição do segundo grupo (em que, as posições são numeradas de acordo com o índice EU).[0026] The heterodimer including antibody CH3 domains may further include the following linker (b): (b) in a second CH3 domain group selected from the group consisting of Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364 , Asn390, Thr394, Pro395, Val397 and Ser400, a linker between i) lysine (K) or arginine (R), which is substituted in at least one position of the second group, and ii) aspartic acid (D) or glutamic acid ( E), which is substituted in at least one position of the second group (in which, the positions are numbered according to the EU index).

[0027] De acordo com um aspecto da presente invenção, a posição do pri-meiro grupo pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 e Lys409.[0027] According to one aspect of the present invention, the position of the first group may be selected from the group consisting of Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 and Lys409.

[0028] De acordo com outro aspecto da presente invenção, Lus409 de um domínio CH3 pode ser substituído com triptofano (W), e Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 podem ser substituídos com valina (V) e treonina (T), respectivamente.[0028] According to another aspect of the present invention, Lus409 of one CH3 domain can be replaced with tryptophan (W), and Asp399 and Phe405 of the other CH3 domain can be replaced with valine (V) and threonine (T), respectively.

[0029] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, Tyr349 de um domínio CH3 pode ser substituído com serina (S), e Glu357 do outro domínio CH3 pode ser substituído com triptofano (W).[0029] According to yet another aspect of the present invention, Tyr349 from one CH3 domain can be replaced with serine (S), and Glu357 from the other CH3 domain can be replaced with tryptophan (W).

[0030] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, a posição do segundo grupo pode ser Gln347 e Lys360.[0030] According to yet another aspect of the present invention, the position of the second group can be Gln347 and Lys360.

[0031] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, Lys360 de um domínio CH3 pode ser substituído com ácido glutâmico (E), e Gln347 do outro domínio CH3 pode ser substituído com arginina (R).[0031] According to yet another aspect of the present invention, Lys360 of one CH3 domain can be replaced with glutamic acid (E), and Gln347 of the other CH3 domain can be replaced with arginine (R).

[0032] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, Gln347 de um domínio CH3 pode ser substituído com ácido glutâmico (E).[0032] According to yet another aspect of the present invention, Gln347 of a CH3 domain can be replaced with glutamic acid (E).

[0033] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, Lys360 e Lys409 de um domínio CH3 podem ser substituídos com ácido glutâmico (E) e tripto- fano (W), respectivamente, e Gln347, Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 pode ser substituído com arginina (R), valina (V) e treonina (T), respectivamente.[0033] According to yet another aspect of the present invention, Lys360 and Lys409 of one CH3 domain can be replaced with glutamic acid (E) and tryptophan (W), respectively, and Gln347, Asp399 and Phe405 of the other CH3 domain can be replaced with arginine (R), valine (V) and threonine (T), respectively.

[0034] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, Gln347, Lys360 e Lys409 de um domínio CH3 pode ser substituído com ácido glutâmico (E), ácido glutâmico (E) e triptofano (W), respectivamente, e Gln347, Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 podem ser substituídos com arginina (R), valina (V) e treonina (T), respectivamente.[0034] According to yet another aspect of the present invention, Gln347, Lys360 and Lys409 of a CH3 domain can be replaced with glutamic acid (E), glutamic acid (E) and tryptophan (W), respectively, and Gln347, Asp399 and Phe405 of the other CH3 domain can be replaced with arginine (R), valine (V) and threonine (T), respectively.

[0035] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, Tyr349 e Lys409 de um domínio CH3 podem ser substituídos com serina (S) e triptofano (W), respectivamente, e Glu357, Asp399 e Phe405 de outro domínio CH3 podem ser substituídos com triptofano (W), valina (V) e treonina (T), respectivamente.[0035] According to yet another aspect of the present invention, Tyr349 and Lys409 from one CH3 domain can be replaced with serine (S) and tryptophan (W), respectively, and Glu357, Asp399 and Phe405 from another CH3 domain can be replaced with tryptophan (W), valine (V) and threonine (T), respectively.

[0036] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, o hetero- dímero incluindo domínios CH3 de anticorpo podem ainda incluir o seguinte ligante (c): (c) em um terceiro grupo do domínio CH3 selecionado a partir do grupo consis-tindo de Tyr349 e Ser354, um ligante entre i) cisteína (C) substituída em pelo menos uma posição do terceiro grupo, e ii) cisteína (C) substituída em pelo menos uma po-sição do terceiro grupo (em que as posições são numeradas de acordo com o índice EU).[0036] According to yet another aspect of the present invention, the heterodimer including antibody CH3 domains may further include the following linker (c): (c) in a third group of the CH3 domain selected from the group consisting of of Tyr349 and Ser354, a linker between i) cysteine (C) substituted in at least one position of the third group, and ii) cysteine (C) substituted in at least one position of the third group (where the positions are numbered from according to the EU index).

Advantageous Effects

[0037] Em um heterodímero de domínio CH3 de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo de acordo com a presente invenção, uma mutação é induzida usando um método diferente a partir do método convencional, formação do heterodímero é minimizado, e o heterodímero pode ser formado em um alto rendi-mento de 90 a 95% ou mais. Quando uma proteína de par Fc heterodimérico prepa-rado usando o heterodímero de domínio CH3 é expresso em células animais, a pro-teína tem um nível de expressão, um rendimento de produção e uma estabilidade termodinâmica que são similares a um ou mais melhorado que um anticorpo selva-gem original.[0037] In a CH3 domain heterodimer of a heavy chain constant region of an antibody according to the present invention, a mutation is induced using a different method from the conventional method, formation of the heterodimer is minimized, and the heterodimer can be formed at a high yield of 90 to 95% or more. When a heterodimeric Fc pair protein prepared using the CH3 domain heterodimer is expressed in animal cells, the protein has an expression level, production yield, and thermodynamic stability that are similar to one or more improved than a original wild antibody.

[0038] Também, uma proteína do par Fc heterodimérico preparada usando um domínio heterodímero CH3 de uma região constante de cadeia pesada (Fc hete- rodimérico) de um anticorpo de acordo com a presente invenção tem vantagens em que uma função intrínseca de uma região constante de cadeia pesada (Fc) de um anticorpo selvagem original, isto é, uma habilidade de ligação ao FcRn (receptor Fc neonatal) e FcRs (receptores Fc gama) é mantida, uma meia vida sérica longa é provida, um sítio ligante (proteína A e proteína G) é conservado em um processo de purificação, e uma citotoxidade celular dependente de anticorpo e uma citotoxidade celular dependente de complemento pode ser mantida.[0038] Also, a heterodimeric Fc pair protein prepared using a CH3 heterodimer domain of a heavy chain constant region (heterodimeric Fc) of an antibody according to the present invention has advantages in that an intrinsic function of a constant region chain (Fc) binding of an original wild-type antibody, i.e., an ability to bind FcRn (neonatal Fc receptor) and FcRs (Fc gamma receptors) is maintained, a long serum half-life is provided, a binding site (protein A and protein G) is conserved in a purification process, and an antibody-dependent cellular cytotoxicity and a complement-dependent cellular cytotoxicity can be maintained.

[0039] Também, em uma proteína do par Fc heterodimérico preparado usando um heterodímero do domínio CH3 de uma região constante de cadeia pesa-da (Fc heterodimérico) de um anticorpo de acordo com a presente invenção, varian-tes de domínio CH3 não são individualmente expressos e sintetizados novamente, mas são simultaneamente expressos em uma célula. Então, uma região constante heterodímera (Fc heterodimérico) pode ser produzido em um alto rendimento de cer-ca de 90 a 95% ou mais com alta eficiência.[0039] Also, in a heterodimeric Fc pair protein prepared using a CH3 domain heterodimer of a heavy-chain constant region (heterodimeric Fc) of an antibody according to the present invention, CH3 domain variants are not individually expressed and synthesized again, but are simultaneously expressed in a cell. Then, a heterodimeric constant region (heterodimeric Fc) can be produced in a high yield of about 90 to 95% or more with high efficiency.

[0040] Em adição, é possível preparar um anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção em uma forma scFv-Fc em que dois tipos de fragmentos de anticorpos (scFvs) tendo diferentes especificidades de antígenos são fusionados ao N-terminal ou C-terminal de uma proteína do par da região constante heterodíme- ra (Fc heterodimérico), em ums forma scIg (scFac-Fc) em que dois tipos de scFabs são fusionados, e em uma forma (Fv)2-Fc em que dois tipos de um par de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL), que formam ligação de antígeno Fv, são fusionados ao N-terminal e C-terminal de um Fc hetero- dimérico, respectivamente, em um alto rendimento com alta eficiência. Também, é possível preparar um anticorpo biespecífico em uma forma de anticorpo mAb-Fv úni-co fusionado a região variável biespecífica em que um domínio de ligação de antí- geno variável único (VH ou VL) é fusionado ao C-terminal de uma cadeia de IgG pe-sada típica de duas regiões constantes de cadeia pesada (Fcs) onde um par variante de domínio CH3 é incluso em um alto rendimento com alta eficiência. Também, é possível preparar um anticorpo de ligação de antígeno monovalente em uma forma Fv-Fc em que uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que ligam a um antígeno único, são fusionados ao N-terminal e C- terminal de duas regiões constantes de cadeia pesada (Fcs) onde um par variante de domínio CH3 é incluso em um alto rendimento com alta eficiência. Também, é possível preparar uma proteína fusionada com região constante do anticorpo (Prote- ína-Fc) em cujo domínio extracelular do receptor de membrana celular capaz de ligar a uma proteína específica, um peptídeo, um anticorpo de domínio único, um ligante, uma toxina e semelhantes são fusionados, e que podem especificamente reconhe-cer um tipo ou dois tipos de proteínas em uma alta produção com alta eficiência.[0040] In addition, it is possible to prepare a bispecific antibody according to the present invention in an scFv-Fc form in which two types of antibody fragments (scFvs) having different antigen specificities are fused at the N-terminus or C-terminus of a heterodimeric constant region pair protein (heterodimeric Fc), into a scIg form (scFac-Fc) in which two types of scFabs are fused, and into a (Fv)2-Fc form in which two types of one pair of heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL), which form Fv antigen binding, are fused to the N-terminus and C-terminus of a heterodimeric Fc, respectively, in a high yield with high efficiency. Also, it is possible to prepare a bispecific antibody in a form of a single mAb-Fv antibody fused to a bispecific variable region in which a single variable antigen binding domain (VH or VL) is fused to the C-terminus of a chain. of heavy IgG typical of two heavy chain constant regions (Fcs) where a CH3 domain variant pair is included in high yield with high efficiency. Also, it is possible to prepare a monovalent antigen-binding antibody in an Fv-Fc form in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), which bind a single antigen, are fused to the N-terminus and C-terminus of two heavy chain constant regions (Fcs) where a CH3 domain variant pair is included in high yield with high efficiency. It is also possible to prepare a protein fused with the constant region of the antibody (Protein-Fc) in whose extracellular domain of the cell membrane receptor capable of binding to a specific protein, a peptide, a single domain antibody, a ligand, a toxin and the like are fused, and which can specifically recognize one type or two types of proteins in high production with high efficiency.

[0041] Também, desde que um anticorpo biespecífico ou uma proteína fusi-onada a região constante do anticorpo (Proteína-Fc) que pode simultaneamente ter alvo em dois tipos de antígenos de acordo coma presente invenção podem simulta-neamente ter alvo em dois tipos de antígenos relacionados a tumores ou doenças imunológicas causadas por operações redundantes, indiretas e graduais de várias proteínas não causadas por uma proteína, é possível aumentar um efeito terapêutico comparado a um anticorpo monoclonal com alvo somente em um tipo de uma prote-ína alvo.[0041] Also, since a bispecific antibody or a protein fused to the constant region of the antibody (Fc-protein) that can simultaneously target two types of antigens according to the present invention can simultaneously target two types of antigens related to tumors or immunological diseases caused by redundant, indirect and stepwise operations of several proteins not caused by one protein, it is possible to enhance a therapeutic effect compared to a monoclonal antibody targeting only one type of a target protein.

[0042] Em adição, um anticorpo (Fv-Fc) preparado de acordo com a presente invenção em que uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que ligam a um antígeno único, são fusionados para ser ca-pazes de forma monovalente se ligarem a um antígeno único pode efetivamente ter como alvo um antígeno alvo quando o antígeno é direcionado com um anticorpo de ligação monovalente (mAb) que quando o antígeno é direcionado com um anticorpo de ligação monovalente (mAb). Então, um alto efeito para tratar doenças relaciona-das ao antígeno alvo podem ser esperadas.[0042] In addition, an antibody (Fv-Fc) prepared according to the present invention in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), which bind to a single antigen, are fused to be able to monovalently bind a single antigen can effectively target a target antigen when the antigen is targeted with a monovalent binding antibody (mAb) than when the antigen is targeted with a monovalent binding antibody ( mAb). So, a high effect to treat diseases related to the target antigen can be expected.

[0043] Em adição, uma proteína fusionada a região constante do anticorpo (Proteína-Fc) preparada de acordo com a presente invenção em que cujos domínios extracelulares do receptor de membrana celular capazes de ligar a uma proteína específica, um peptídeo, um anticorpo de domínio único, um ligante, uma toxina e semelhantes são fusionados a Fc pode especificamente reconhecer um tipo ou dois tipos de proteínas e pode efetivamente ter como alvo uma proteína alvo que pode ser direcionada usando uma região constante de cadeia pesada homodímera (Fc homodimérico). Então, um alto efeito para tratar doenças relacionadas a proteínas alvos podem ser esperadas.[0043] In addition, a protein fused to the constant region of the antibody (Fc-Protein) prepared according to the present invention in which the extracellular domains of the cell membrane receptor capable of binding to a specific protein, a peptide, an antibody of single domain, a linker, a toxin and the like are fused to Fc can specifically recognize one type or two types of proteins and can effectively target a target protein which can be targeted using a homodimeric heavy chain constant region (homodimeric Fc). So, a high effect to treat diseases related to target proteins can be expected.

Description of Drawings

[0044] FIG. 1 é um diagrama esquematicamente ilustrando uma estrutura de um anticorpo específico IgG1 a um antígeno. Um anticorpo IgG1 selvagem tem uma forma em que duas cadeias pesadas tendo a mesma sequência aminoácida e duas cadeias leves tendo a mesma sequência são unidas. A fim de para dois pares de cadeias pesadas para formar um dímero, formação do dímero é induzido por uma interação entre domínios CH3. Então, uma ligação dissulfeto entre regiões da do-bradiça é induzida, e um homodímero entre cadeias pesadas robustas é formado. A união da cadeia pesada e a cadeia leve é induzida por uma ligação dissulfeto entre o 5o Cys em uma região da dobradiça de cadeia pesada e o 107o Cys na cadeia leve kappa.[0044] FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a structure of an antigen-specific IgG1 antibody. A wild-type IgG1 antibody has a form in which two heavy chains having the same amino acid sequence and two light chains having the same sequence are joined together. In order for two pairs of heavy chains to form a dimer, dimer formation is induced by an interaction between CH3 domains. Then, a disulfide bond between hinge regions is induced, and a homodimer between robust heavy chains is formed. The joining of the heavy chain and the light chain is induced by a disulfide bond between the 5th Cys in a heavy chain hinge region and the 107th Cys in the kappa light chain.

[0045] FIG. 2 é um diagrama esquematicamente ilustrando uma interface en-tre domínios CH3 em um anticorpo IgG1 selvagem. Um interior da interface inclui resíduos relacionados à interação hidrofóbica e resíduos tendo uma interação ele-trostática. Esses resíduos contribuem para formação de um dímero do domínio CH3. Também, existem resíduos que existem na interface, mas não têm interação com resíduos adjacentes ao mesmo. Esses resíduos não contribuem para formação do dímero, ou participam na interação com uma interação não covalente relativamente fraca.[0045] FIG. 2 is a diagram schematically illustrating an interface between CH3 domains in a wild-type IgG1 antibody. An interior of the interface includes residues related to hydrophobic interaction and residues having an electrostatic interaction. These residues contribute to the formation of a CH3 domain dimer. Also, there are residues that exist at the interface, but do not interact with residues adjacent to it. These residues do not contribute to dimer formation, or participate in the interaction with a relatively weak non-covalent interaction.

[0046] FIG. 3 é um diagrama ilustrando uma interação entre cadeias laterais aminoácidas em que uma mutação é introduzida em uma interface entre domínios CH3 da estrutura de cadeia pesada de um anticorpo IgG1 humano. Uma interface entre os domínios CH3 foi analisada baseada em uma estrutura de fragmento Fc (código PDB: 1FC1 (Deisenhofer 1981), 1L6X (Idusogie, Presta et al. 2000), e 3AVE (Matsumiya, Yamaguchi et al. 2007)) do anticorpo humano conhecido. Uma interação entre cadeias aminoácidas em que uma mutação é introduzida em uma interface entre domínios CH3 é ilustrada baseada em uma estrutura 3AVE.[0046] FIG. 3 is a diagram illustrating an interaction between amino acid side chains in which a mutation is introduced at an interface between CH3 domains of the heavy chain structure of a human IgG1 antibody. An interface between the CH3 domains was analyzed based on an Fc fragment structure (PDB code: 1FC1 (Deisenhofer 1981), 1L6X (Idusogie, Presta et al. 2000), and 3AVE (Mtsumiya, Yamaguchi et al. 2007)) of the antibody known human. An interaction between amino acid chains in which a mutation is introduced at an interface between CH3 domains is illustrated based on a 3AVE structure.

[0047] FIG. 3A é um diagrama ilustrando cadeias aminoácidas Lys360 e Lys409 em um domínio CH3A e cadeias aminoácidas laterais Gln347, Asp399 e Phe405 em um domínio CH3B em um domínio CH3 de um anticorpo IgG1 humano selvagem. Um aminoácido K360 existente em um domínio CH3 é adjacente ao ami- noácido Gln347 do outro domínio CH3, mas não existe interação contribuindo para a formação do dímero do domínio CH3. Também, Lys409 em um domínio CH3 e Asp399 em outro domínio CH3 são resíduos aminoácidos que significativamente contribuem para formação do dímero do domínio CH3 devido a interação eletrostáti-ca.[0047] FIG. 3A is a diagram illustrating amino acid chains Lys360 and Lys409 in a CH3A domain and amino acid side chains Gln347, Asp399 and Phe405 in a CH3B domain in a CH3 domain of a wild-type human IgG1 antibody. A K360 amino acid existing in one CH3 domain is adjacent to the Gln347 amino acid in the other CH3 domain, but there is no interaction contributing to the formation of the CH3 domain dimer. Also, Lys409 in one CH3 domain and Asp399 in another CH3 domain are amino acid residues that significantly contribute to CH3 domain dimer formation due to electrostatic interaction.

[0048] FIG. 3B é um diagrama ilustrando um modelo predito de uma estrutu- ra de um domínio CH3 de uma mutação de domínio CH3. Mutações Lys360Glu e Lys409Trp foram introduzidas em um domínio CH3, e mutações Gln347Arg, Asp399Val, e Phe405Thr foram introduzidas no outro domínio CH3. Então, Lys360 e Gln347 existentes foram substituídos com Lys360Glu e Gln347Arg de forma que interação eletrostática seletiva pode ser gerada entre resíduos não tendo interação. Esta estratégia de mutação pode contribuir para seletivamente formar um heterodí- mero do domínio CH3. Também, mutações de Lys409Trp e Asp399Val e Phe405Thr no outro domínio CH3 foram introduzidas de forma que a interação hidrofóbica com-plementar ao invés da interação eletrostática existente pode ser induzida. Isto é uma estratégia de mutação em cuja formação do homodímero tal como CH3A:CH3A, e CH3B:CH3B é inibido e formação do heterodímero de CH3A:CH3B é induzido.[0048] FIG. 3B is a diagram illustrating a predicted model of a structure of a CH3 domain from a CH3 domain mutation. Lys360Glu and Lys409Trp mutations were introduced in one CH3 domain, and Gln347Arg, Asp399Val, and Phe405Thr mutations were introduced in the other CH3 domain. Then, existing Lys360 and Gln347 were replaced with Lys360Glu and Gln347Arg so that selective electrostatic interaction can be generated between residues having no interaction. This mutation strategy may contribute to selectively forming a CH3 domain heterodimer. Also, mutations of Lys409Trp and Asp399Val and Phe405Thr in the other CH3 domain were introduced so that the complementary hydrophobic interaction instead of the existing electrostatic interaction could be induced. This is a mutation strategy in which homodimer formation such as CH3A:CH3A, and CH3B:CH3B is inhibited and heterodimer formation of CH3A:CH3B is induced.

[0049] FIG. 4 ilustra uma interação entre Lys409 em um domínio CH3A e re-síduos Asp399 e Phe405 em um domínio CH3B na estratégia de mutação. Em uma interface do domínio CH3 selvagem, Lys409 em um domínio liga eletrostaticamente aos resíduos Asp399 no outro domínio, que contribui à formação do dímero entre os domínios. Então, por introdução das mesmas mutações de Lys409Trp em um domínio CH3 e Asp399Val e Phe405Thr em outro domínio CH3, uma mutação capaz de induzir interação hidrofóbica complementar entre somente heterodímeros ao invés da interação eletrostática existente foi induzida. Está é uma estratégia de mutação em que a formação do homodímero tal como CH3A:CH3A, e CH3B:CH3B é inibido e formação do heterodímero de CH3A:CH3B é induzida.[0049] FIG. 4 illustrates an interaction between Lys409 in a CH3A domain and Asp399 and Phe405 residues in a CH3B domain in the mutation strategy. At an interface of the wild-type CH3 domain, Lys409 in one domain electrostatically binds to Asp399 residues in the other domain, which contributes to the formation of the dimer between the domains. Then, by introducing the same mutations of Lys409Trp in one CH3 domain and Asp399Val and Phe405Thr in another CH3 domain, a mutation capable of inducing complementary hydrophobic interaction between only heterodimers instead of the existing electrostatic interaction was induced. This is a mutation strategy in which homodimer formation such as CH3A:CH3A, and CH3B:CH3B is inhibited and CH3A:CH3B heterodimer formation is induced.

[0050] FIG. 5 ilustra uma interação entre mutações de Lys360Glu em um domínio CH3A e Gln347Arg em um domínio CH3B na estratégia de mutação. Resí-duos de mutação são adjacentes em um selvagem, mas não há interação através da qual um domínio CH3 existente contribui para formar um dímero. Aqui, mutações Lys360Glu e Gln347Arg que podem induzir uma interação eletrostática de longo al-cance entre somente heterodímeros foram induzidos. Isto é uma estratégia de muta- ção em que a formação do homodímero tal como CH3A:CH3A e CH3B:CH3B é ini-bida, e formação do heterodímero de CH3A:CH3B é induzido.[0050] FIG. 5 illustrates an interaction between mutations of Lys360Glu in a CH3A domain and Gln347Arg in a CH3B domain in the mutation strategy. Mutation residues are adjacent in a wild-type, but there is no interaction whereby an existing CH3 domain contributes to form a dimer. Here, Lys360Glu and Gln347Arg mutations that can induce a long-range electrostatic interaction between only heterodimers were induced. This is a mutational strategy in which homodimer formation such as CH3A:CH3A and CH3B:CH3B is inhibited, and CH3A:CH3B heterodimer formation is induced.

[0051] FIG. 6 ilustra uma interação entre uma mutação Gln347E em um do-mínio CH3A e resíduos Lys360 em um domínio CH3B na estratégia de mutação. Esses resíduos são posicionados em uma região simétrica com uma região de inte-ração Lys360Glu-Gln347Arg ilustrada na FIG. 5 na interface do domínio CH3. Similar à região de interação Lys360Glu-Gln347Arg acima, resíduos de Gln347 no domínio CH3A e Lys360 no domínio CH3B são adjacentes no selvagem, mas não há intera-ção através da qual um domínio CH3 contribui para formar um dímero. Aqui, uma mutação Gln347Glu foi introduzida para induzir interação eletrostática seletiva com o resíduo Lys360 no outro domínio CH3. Isto é uma estratégia de mutação em que a formação do homodímero tais como CH3A:CH3A e CH3B:CH3B é inibida, e forma-ção do heterodímero de CH3A:CH3B é induzida.[0051] FIG. 6 illustrates an interaction between a Gln347E mutation in a CH3A domain and Lys360 residues in a CH3B domain in the mutation strategy. These residues are positioned in a symmetrical region with a Lys360Glu-Gln347Arg interaction region illustrated in FIG. 5 on the CH3 domain interface. Similar to the Lys360Glu-Gln347Arg interaction region above, residues from Gln347 in the CH3A domain and Lys360 in the CH3B domain are adjacent in the wild, but there is no interaction whereby a CH3 domain contributes to form a dimer. Here, a Gln347Glu mutation was introduced to induce selective electrostatic interaction with the Lys360 residue in the other CH3 domain. This is a mutation strategy in which homodimer formation such as CH3A:CH3A and CH3B:CH3B is inhibited, and CH3A:CH3B heterodimer formation is induced.

[0052] FIG. 7 ilustra uma interação entre Glu357 em um domínio CH3A e re-síduos Tyr349 e Lys370 em um domínio CH3B na estratégia de mutação. Em uma interface do domínio CH3 selvagem, Glu357 em um domínio se liga eletrostatica- mente a resíduos Lys370 no outro domínio, que contribui para a formação do dímero entre os domínios, e é adjacente aos resíduos Tyr349 no outro domínio. Então, pela introdução de mutações nos mesmos de Glu357Trp em um domínio CH3 e Tyr349Ser no outro domínio CH3, uma mutação capaz de induzir interação hidrofó- bica complementar entre somente heterodímeros ao invés de existir interação eletrostática entre Glu357 e Lys370 foi induzida. Isto é uma estratégia de mutação em que a formação do homodímero tais como CH3A:CH3A e CH3B:CH3B é inibida, e formação do heterodímero de CH3A:CH3B é induzida.[0052] FIG. 7 illustrates an interaction between Glu357 in a CH3A domain and residues Tyr349 and Lys370 in a CH3B domain in the mutation strategy. At an interface of the wild-type CH3 domain, Glu357 in one domain electrostatically binds to Lys370 residues in the other domain, which contribute to the dimer formation between the domains, and is adjacent to Tyr349 residues in the other domain. Then, by introducing mutations in the same of Glu357Trp in one CH3 domain and Tyr349Ser in the other CH3 domain, a mutation capable of inducing complementary hydrophobic interaction between only heterodimers instead of existing electrostatic interaction between Glu357 and Lys370 was induced. This is a mutational strategy in which homodimer formation such as CH3A:CH3A and CH3B:CH3B is inhibited, and CH3A:CH3B heterodimer formation is induced.

[0053] FIG. 8 é um diagrama esquematicamente ilustrando um caso em que um par de mutação do domínio CH3 (CH3A e CH3B) no qual a mutação de acordo com a presente invenção é introduzida inibe a formação de um homodímero da regi- ão constante de cadeia pesada de acordo com uma interação de CH3A:CH3A ou CH3B:CH3B e induz formação de um Fc heterodimérico de acordo com uma intera-ção de CH3A:CH3B.[0053] FIG. 8 is a diagram schematically illustrating a case where a CH3 domain mutation pair (CH3A and CH3B) into which the mutation according to the present invention is introduced inhibits the formation of a heavy chain constant region homodimer according to with a CH3A:CH3A or CH3B:CH3B interaction and induces formation of a heterodimeric Fc according to a CH3A:CH3B interaction.

[0054] FIG. 9 é um diagrama esquematicamente ilustrando um anticorpo bi- específico e uma proteína de fusão Fc que pode ser preparado usando um Fc hete- rodimérico gerado por conectar um par de mutação de CH3 de formação heterodi- mérica (CH3A:CH3B) de acordo com a presente invenção ao C-terminal de um do-mínio dobradiça-CH2 de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo. É possível preparar um fragmento de anticorpo de cadeia simples biespecífica de imu- noglobulina (scFv-Fc) em cujos dois tipos de um fragmento de cadeia simples variá-vel (scFv) de anticorpos tendo diferentes especificidades de ligação de antígeno são fusionados a cada terminal amino (N-terminal) em um Fc heterodimérico; uma imu- noglobulina de cadeia simples biespecífica (scFab-Fc) em que dois tipos de frag-mentos de ligação de antígeno de cadeia simples (Fabs) tendo especificidade de ligação de antígeno diferente são fusionados a cada amino terminal (N-terminal); uma imunoglobulina fusionada da região variável biespecífico (Fv)2-Fc em que dois tipos de domínio de ligação de antígeno variável único (VH ou VL) de uma cadeia pesada e uma cadeia leve derivada a partir de um anticorpo que reconhece diferen-tes antígenos são fusionados em um par ao N-terminal e C-terminal da região cons-tante de cadeia pesada, respectivamente; um anticorpo simples fusionado a região variável biespecífico mAb-Fv em que um domínio de ligação de antígeno variável simples (VH ou VL) é fusionado ao C-terminal de uma cadeia pesada de IgG típica; uma imunoglobulina fusionada a região variável ligante de antígeno monovalente (Fv-Fc) em que um domínio de ligação de antígeno variável único (VH ou VL) de uma cadeia pesada e uma cadeia leve derivado a partir de um anticorpo que reconhece um tipo de um antígeno é fusionado ao N-terminal de uma região constante de cadeia pesada; e uma proteína fusionada da região constante de anticorpo (Pro- teína-Fc) em que dois tipos de um domínio extracelular de proteína de membrana celular especificamente reconhecendo um ligante, um peptídeo, um anticorpo de domínio único reconhecendo um tipo de um antígeno, um anticorpo de domínio sim-ples, um peptídeo, uma proteína ligante, uma proteína toxina e semelhantes são fu-sionados ao N-terminal de uma região constante de cadeia pesada.[0054] FIG. 9 is a diagram schematically illustrating a bispecific antibody and an Fc fusion protein that can be prepared using a heterodimeric Fc generated by connecting a CH3 mutation pair of heterodimeric formation (CH3A:CH3B) according to the present invention to the C-terminus of a hinge-CH2 domain of an antibody heavy chain constant region. It is possible to prepare a bispecific single-chain immunoglobulin (scFv-Fc) antibody fragment in which two types of a single-chain variable (scFv) fragment of antibodies having different antigen-binding specificities are fused at each end. amino (N-terminus) on a heterodimeric Fc; a bispecific single-chain immunoglobulin (scFab-Fc) in which two types of single-chain antigen-binding fragments (Fabs) having different antigen-binding specificity are fused at each amino terminus (N-terminus); a bispecific variable region (Fv)2-Fc fused immunoglobulin in which two types of single variable antigen binding domain (VH or VL) from a heavy chain and a light chain derived from an antibody that recognizes different antigens are fused in a pair to the N-terminus and C-terminus of the heavy chain constant region, respectively; a bispecific mAb-Fv variable region fused single antibody in which a single variable antigen binding domain (VH or VL) is fused to the C-terminus of a typical IgG heavy chain; an immunoglobulin fused to a monovalent antigen-binding variable region (Fv-Fc) in which a single variable antigen-binding domain (VH or VL) of a heavy chain and a light chain derived from an antibody that recognizes one type of a antigen is fused to the N-terminus of a heavy chain constant region; and an antibody constant region fusion protein (Fc-Protein) in which two types of a cell membrane protein extracellular domain specifically recognizing a ligand, a peptide, a single domain antibody recognizing one type of an antigen, a single domain antibody, a peptide, a linker protein, a toxin protein and the like are fused to the N-terminus of a heavy chain constant region.

[0055] FIG. 10 mostra uma sequência de comparação de domínios CH3 de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 de anticorpos humanos com IgG1, IgG2A, IgG2B e IgG3 de anticorpos de camundongos. Resíduos Gln347, Lys360, Asp399, Phe405,Lys409, que são enfatizados na fonte negrito, são resíduos em que uma mutação é introduzida. Pode ser observado que os resíduos em que uma mutação é introduzida são quase resíduos similares independente do anticorpo humano e um subtipo de um anticorpo IgG de camundongo. Então, pode ser entendido que a mutação induzi-da para formar um par de mutação CH3 heterodímero na presente invenção não é limitado ao anticorpo IgG1 humano.[0055] FIG. 10 shows a sequence comparison of CH3 domains of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 of human antibodies with IgG1, IgG2A, IgG2B, and IgG3 of mouse antibodies. Residues Gln347, Lys360, Asp399, Phe405, Lys409, which are emphasized in bold font, are residues where a mutation is introduced. It can be seen that the residues where a mutation is introduced are almost similar residues independent of the human antibody and a subtype of a mouse IgG antibody. So, it can be understood that the mutation induced to form a heterodimer CH3 mutation pair in the present invention is not limited to the human IgG1 antibody.

[0056] FIGS. 11 e 12 são diagramas esquematicamente ilustrando 5 pares de mutação CH3 cuja rendimento de formação é comparado em um Fc heterodimé- rico que é expresso e purificado na presente invenção.[0056] FIGS. 11 and 12 are diagrams schematically illustrating 5 CH3 mutation pairs whose formation yield is compared in a heterodimeric Fc that is expressed and purified in the present invention.

[0057] FIGS. 13 e 14 são diagramas esquemáticos e mapas de vetores de-signados para clonagem scFv-Fc em que um anticorpo variável de fragmento de ca-deia simples (scFv) construído para avaliar um rendimento de formaç!ao do hetero- dímero de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo através de um par de mutação CH3 preparado é fusionado e um Fc artificial em um vetor pcDNA3.1 servindo como um vetor de expressão de célula animal.[0057] FIGS. 13 and 14 are schematic diagrams and maps of vectors designed for scFv-Fc cloning in which a single-chain fragment variable antibody (scFv) is constructed to evaluate a constant region heterodimer formation yield. heavy chain DNA from an antibody through a prepared CH3 mutation pair is fused and an artificial Fc into a pcDNA3.1 vector serving as an animal cell expression vector.

[0058] FIG. 15 é um diagrama ilustrando um caso em que, quando o scFv-Fc e o Fc artificial de vetor de expressão de célula animal construído em FIGS. 13 e 14 são co-transfectados e expressos em células animais, um rendimento de produção do heterodímero devido ao par de mutação CH3 pode ser avaliado através de análi- se de tamanho e forma de união desde que um homodímero e um heterodímero são expressos como anticorpos de tamanhos diferentes.[0058] FIG. 15 is a diagram illustrating a case where, when the scFv-Fc and the artificial Fc of animal cell expression vector constructed in FIGS. 13 and 14 are co-transfected and expressed in animal cells, a production yield of the heterodimer due to the CH3 mutation pair can be evaluated through analysis of size and form of splicing since a homodimer and a heterodimer are expressed as antibodies of different sizes.

[0059] FIGS. 16 e 19 mostram os resultados obtidos por introdução do par de mutação CH3 preparado nas FIGS. 13 e 14 no vetor de expressão da célula animal a fim de avaliar uma maleabilidade do heterodímero descrito na FIG. 15, temporalmente expressando e purificando o par de mutação CH3 nas células HEK293F através da co-transformação, e analisando um tamanho e forma de união em um SDS-PAGE sob condições não redutoras a fim de avaliar uma maleabilidade de anticorpo heterodímero. Neste caso, um anticorpo em que um CH3 selvagem é empregado foi usado como um grupo controle negativo, um anticorpo biespecífico "knob- into-hole" foi usado como um grupo controle positivo, e uma quantidade de proteínas usadas para análise foi cerca de 10 μg.[0059] FIGS. 16 and 19 show the results obtained by introducing the CH3 mutation pair prepared in FIGS. 13 and 14 into the animal cell expression vector in order to assess a malleability of the heterodimer depicted in FIG. 15, temporally expressing and purifying the CH3 mutation pair in HEK293F cells through co-transformation, and analyzing a size and shape of the splice on an SDS-PAGE under non-reducing conditions in order to assess a heterodimer antibody malleability. In this case, an antibody in which a wild-type CH3 is employed was used as a negative control group, a "knob-into-hole" bispecific antibody was used as a positive control group, and the amount of proteins used for analysis was about 10 µg.

[0060] FIGS. 17 e 18 mostra os resultados obtidos por expressão temporal do par de mutação CH3 preparado nas FIGS. 13 e 14 nas células HEK293F através de co-transformação, e então analisando um tamanho e uma forma de união de um anticorpo heterodímero purificado são analisados usando um anticorpo que especifi-camente reconhece uma região Fc humana em um western blot. Neste caso, um anticorpo em que um CH3 selvagem é empregado foi usado como um grupo controle negativo, e um anticorpo "knob-into-hole" biespecífico foi usado como um controle positivo. FIG. 17 mostra o resultado obtido sob condições não redutoras, enquanto FIG. 18 mostra o resultado obtido sob condições redutoras. Uma quantidade de pro-teínas usadas para análise foi 0,1 μg.[0060] FIGS. 17 and 18 show the results obtained by temporal expression of the CH3 mutation pair prepared in FIGS. 13 and 14 in HEK293F cells through co-transformation, and then analyzing a size and shape of a purified heterodimer antibody are analyzed using an antibody that specifically recognizes a human Fc region in a western blot. In this case, an antibody in which a wild-type CH3 is employed was used as a negative control group, and a bispecific "knob-into-hole" antibody was used as a positive control. FIG. 17 shows the result obtained under non-reducing conditions, while FIG. 18 shows the result obtained under reducing conditions. A quantity of proteins used for analysis was 0.1 µg.

[0061] FIG. 20 mostra o resultado obtido por expressão selvagem, uma mu-tação EW-RVT, e um dímero Fc do "knob-into-hole" (grupo controle positivo) nas formas construídas na FIG. 13, e então medindo dicroísmo circular a fim de confirmar se uma estrutura secundária de uma proteína dimérica Fc em que uma mutação do domínio CH3 é introduzida é preservada da forma como aquele de um selvagem. Como um resultado, foi confirmado que o dímero Fc em que a mutação CH3 é intro-duzida tem o mesmo dicroísmo circular como o dímero Fc selvagem, e a estrutura secundária da proteína é mantida sem modificação.[0061] FIG. 20 shows the result obtained by wild-type expression, an EW-RVT mutation, and a knob-into-hole Fc dimer (positive control group) in the forms constructed in FIG. 13, and then measuring circular dichroism in order to confirm whether a secondary structure of an Fc dimeric protein into which a CH3 domain mutation is introduced is preserved as that of a wild type. As a result, it was confirmed that the Fc dimer in which the CH3 mutation is introduced has the same circular dichroism as the wild-type Fc dimer, and the secondary structure of the protein is maintained without modification.

[0062] FIG. 21 mostra o resultado obtido por expressão da mutação EW- RVT na forma heterodímera ilustrada na FIG. 14, e então fazendo ressonância de plasmon de superfície (SPR) a fim de confirmar se um dímero Fc em que uma muta-ção do domínio CH3 é introduzida preserva uma habilidade de ligação ao FcRn. Foi confirmado que o anticorpo incluindo a mutação do domínio CH3 mantém a habili-dade de ligação ao FcRn, similar ao anticorpo incluindo o domínio CH3 selvagem. Neste caso, Remicade (Infliximab, Janssen Biotech), que é um anticorpo incluindo um anticorpo IgG1 humano, foi usado como um grupo controle positivo.[0062] FIG. 21 shows the result obtained by expressing the EW-RVT mutation in the heterodimer form illustrated in FIG. 14, and then performing surface plasmon resonance (SPR) in order to confirm whether an Fc dimer into which a CH3 domain mutation is introduced preserves an ability to bind to FcRn. It was confirmed that the antibody including the CH3 domain mutation retains the FcRn binding ability, similar to the antibody including the wild-type CH3 domain. In this case, Remicade (Infliximab, Janssen Biotech), which is an antibody including a human IgG1 antibody, was used as a positive control group.

[0063] FIG. 22A é um diagrama esquematicamente ilustrando um anticorpo biespecífico em que o par de mutação preparado na presente invenção é introduzido em uma forma scFv-Fc. Um anticorpo hAY4a scFv humanizado (Lee, Park e colabo-radores 2010) especificamente de liga a um antígeno DR4 alvo e um anticorpo AU5H scFv de afinidade melhorada de um anticorpo HW1 scFv humano (Park, Lee e colaboradores 2007) especificamente liga a um antígeno DR5 alvo foram fusionados ao N-terminal do Fc em que o domínio variante CH3 foi usado para constante um anticorpo DR4 x DR5 biespecífico em uma forma de scFv-Fc. FIG. 22B mostra o re-sultado por células HEK293F co-transformantes com um vetor expressando um anti-corpo scFv-Fc, temporariamente expressando e purificando o anticorpo, e então analisando o anticorpo através de SDS-PAGE sob condições não redutoras. O par de mutação EW-RVT do domínio CH3 construído foi introduzido em uma cadeia pesada, e anticorpo biespecífico "knob-into-hole" foi usado como um grupo controle positivo. FIG. 22 C mostra o resultado obtido por fazer uma cromatografia de exclusão de tamanho para confirmar um tamanho de um anticorpo scFv-Fc expresso e purificado biespecífico em um estado nativo. Foi confirmado que somente uma prote- ína desejada de um tamanho de 103 kD foi detectada, que é idêntica ao grupo con-trole.[0063] FIG. 22A is a diagram schematically illustrating a bispecific antibody in which the mutation pair prepared in the present invention is introduced in an scFv-Fc form. A humanized hAY4a scFv antibody (Lee, Park et al. 2010) specifically binds to a DR4 target antigen, and an affinity-enhanced AU5H scFv antibody from a human HW1 scFv antibody (Park, Lee et al. 2007) specifically binds to an antigen. DR5 targets were fused to the N-terminus of the Fc in which the CH3 variant domain was used to constant a bispecific DR4 x DR5 antibody in an scFv-Fc form. FIG. 22B shows the result by co-transforming HEK293F cells with a vector expressing an scFv-Fc antibody, temporarily expressing and purifying the antibody, and then analyzing the antibody by SDS-PAGE under non-reducing conditions. Constructed CH3 domain EW-RVT mutation pair was introduced into a heavy chain, and "knob-into-hole" bispecific antibody was used as a positive control group. FIG. 22 C shows the result obtained by performing a size exclusion chromatography to confirm a size of a bispecific expressed and purified scFv-Fc antibody in a native state. It was confirmed that only one desired protein of a size of 103 kD was detected, which is identical to the control group.

[0064] FIG. 23A é um diagrama esquematicamente ilustrando um anticorpo biespecífico em que o par de mutação CH3 preparado na presente invenção é intro-duzido em uma forma scFab-Fc (scIgG). Um anticorpo parental usado inclui um anti-corpo hAY4a humanizado e um anticorpo AU5H, que são os mesmos que aqueles utilizados no anticorpo biespecífico da forma scFv-Fc na FIG. 20. Uma forma de ca-deia Fab simples (scFab) em que um domínio VH-CH e um domínio VL-CL são co-nectados a através de 26 ligantes de cadeias aminoácidas foram fusionados ao N- terminal de uma região Fc à construção do anticorpo biespecífico DR4 x DR5 em uma forma de scFab-Fc. FIG. 23B mostra o resultado obtido por co-transformação de células HEK293F com um vetor de expressão do anticorpo scFab-Fc biespecífico, temporariamente expressando e purificando o anticorpo e então, analisando o anti-corpo através de SDS-PAGE sob condições não redutoras e condições redutoras. O par de mutação EW-RVT do domínio CH3 foi introduzido em uma cadeia pesada, e um anticorpo "knob-into-hole" biespecífico foi usado como um grupo controle positi-vo. Pode ser observado que um anticorpo biespecífico desejado é principalmente gerado, que é idêntico ao grupo controle. FIG. 23C mostra o resultado obtido por fazer um ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) a fim de confirmar a habilidade de ligação e especificidade do anticorpo scFv-Fc DR4xDR5 biespecífico purificado na FIG. 20 e o anticorpo scFab-Fc DR4xDR5 biespecífico na FIG. 21 com respeito a antígenos DR4 e DR5. Como um resultado, foi confirmado que o anticorpo biespecífico preparado tem especificidade ao antígeno DR4 e DR5. Neste caso, como antígenos similares de DR4 e DR5, DcR1 e DcR2 foram usados como antígenos controles.[0064] FIG. 23A is a diagram schematically illustrating a bispecific antibody in which the CH3 mutation pair prepared in the present invention is introduced in a scFab-Fc (scIgG) form. A parent antibody used includes a humanized hAY4a antibody and an AU5H antibody, which are the same as those used in the scFv-Fc form bispecific antibody in FIG. 20. A form of single-chain Fab (scFab) in which a VH-CH domain and a VL-CL domain are connected via 26 amino acid chain linkers were fused to the N-terminus of an Fc region to the construct of the DR4 x DR5 bispecific antibody in a scFab-Fc form. FIG. 23B shows the result obtained by co-transforming HEK293F cells with a bispecific scFab-Fc antibody expression vector, temporarily expressing and purifying the antibody, and then analyzing the antibody by SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions . The CH3 domain EW-RVT mutation pair was introduced into a heavy chain, and a bispecific "knob-into-hole" antibody was used as a positive control group. It can be seen that a desired bispecific antibody is mostly generated which is identical to the control group. FIG. 23C shows the result obtained by doing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to confirm the binding ability and specificity of the purified bispecific scFv-Fc DR4xDR5 antibody in FIG. 20 and the bispecific scFab-Fc DR4xDR5 antibody in FIG. 21 with respect to DR4 and DR5 antigens. As a result, it was confirmed that the prepared bispecific antibody has specificity for DR4 and DR5 antigen. In this case, as similar antigens of DR4 and DR5, DcR1 and DcR2 were used as control antigens.

[0065] FIG. 24 mostra o resultado obtido por fazer um experimento de citoto- xidade (ensaio MTT) em linhagens de célula HCT116 e HeLa a fim de confirmar uma atividade de morte de célula cancerígena do anticorpo scFv-Fc DR4-DR5 biespecífi- co na FIG. 20 e o anticorpo scFab-Fc DR4xDR5 biespecífico na FIG. 21. É observado que os anticorpos biespecíficos preparados de duas formas têm uma citotoxidade maior que seus anticorpos parentais, hAY4 IgG e AU5H scFv, e tem uma citotoxida- de que é similar a um ou mais excelente que TRAIL usado como um grupo controle positivo.[0065] FIG. 24 shows the result obtained by doing a cytotoxicity experiment (MTT assay) on HCT116 and HeLa cell lines in order to confirm a cancer cell killing activity of the bispecific scFv-Fc DR4-DR5 antibody in FIG. 20 and the bispecific scFab-Fc DR4xDR5 antibody in FIG. 21. It is observed that bispecific antibodies prepared in two ways have a higher cytotoxicity than their parent antibodies, hAY4 IgG and AU5H scFv, and have a cytotoxicity that is similar to one or more excellent than TRAIL used as a positive control group.

Modes of Invention

[0066] Uma cadeia pesada de um anticorpo existe como um homodímero em um estado nativo. Neste caso, formação de um dímero entre cadeias pesadas é es-tabilizada devido a uma ligação dissulfeto de uma região de dobradiça quando o dí- mero é gerado por uma interação não covalente entre domínios CH3-CH3 de uma região constante de cadeia pesada (Schroeder e Cavacini 2010) (ver FIG. 1). O dí- mero entre domínios CH3 da região constante de cadeia pesada é gerado quando resíduos de folha beta de uma cadeia pesada que se liga não covalentemente a ca-deias laterais dos resíduos de folha beta opostos, e consequentemente, um homo- dímero termodinamicamente estabilizado é formado (Schroeder e Cavacini 2010).[0066] A heavy chain of an antibody exists as a homodimer in a native state. In this case, formation of a dimer between heavy chains is stabilized due to a disulfide bond of a hinge region when the dimer is generated by a non-covalent interaction between CH3-CH3 domains of a heavy chain constant region (Schroeder and Cavacini 2010) (see FIG. 1). The dimer between CH3 domains of the heavy chain constant region is generated when beta sheet residues of a heavy chain that non-covalently bind to side chains of opposite beta sheet residues, and hence a thermodynamically stabilized homodimer is formed (Schroeder and Cavacini 2010).

[0067] Uma interação entre domínios CH3 formando o homodímero de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo IgG foi analisada por observação de uma estrutura cristalinas de raio X. Uma estrutura usada é código PDB = 1FC1, 1L6X e 3AVE.[0067] An interaction between CH3 domains forming the homodimer of a heavy chain constant region of an IgG antibody was analyzed by observing an X-ray crystal structure. One structure used is PDB code = 1FC1, 1L6X and 3AVE.

[0068] De acordo com o resultado de análise de resíduos de uma interface entre domínios CH3, uma estrutura de núcleo de interação hidrofóbico que significa-tivamente contribui para formação do homodímero devido a interação hidrofóbica está presente dentro da interface, e esta inclui resíduos Leu351, Thr366, Leu368, e Tyr407. Também, existem resíduos Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399,Lys409, e Lys439 que contribuem para formação do dímero entre domínios CH3 através de uma interação eletrostática na interface. Em particular, interações eletros- táticas entre resíduos Lys409 do domínio CH3 de uma cadeia pesada e resíduos Asp399 do domínio CH3 do oposto, cadeia pesada diferente e interações eletrostáti-cas entre resíduos Glu357 do domínio CH3 de uma cadeia pesada e resíduos Lys370 do domínio CH3 do oposto, cadeia pesada diferente ocorre dentro entre os domínios CH3 contribuem para aumentar a formação do homodímero através de interações eletrostáticas.[0068] According to the result of residue analysis of an interface between CH3 domains, a hydrophobic interaction core structure that significantly contributes to homodimer formation due to hydrophobic interaction is present within the interface, and this includes Leu351 residues , Thr366, Leu368, and Tyr407. Also, there are Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399, Lys409, and Lys439 residues that contribute to dimer formation between CH3 domains through an electrostatic interaction at the interface. In particular, electrostatic interactions between residues Lys409 of the CH3 domain of one heavy chain and residues Asp399 of the CH3 domain of the opposite, different heavy chain and electrostatic interactions between residues Glu357 of the CH3 domain of a heavy chain and residues Lys370 of the CH3 domain on the contrary, different heavy chain occurs within between CH3 domains contribute to increase homodimer formation through electrostatic interactions.

[0069] Também, existem resíduos Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, 400S que estão presentes na interface mas que não têm interação para significativamente contribuir para formação do dí- mero entre domínios CH3 tal como interação hidrofóbica ou uma interação eletrostá-tica com resíduos aminoácidos adjacentes (ver FIG. 2). Alguns desses resíduos con-tribuem para uma interação entre domínios com uma interação não covalente relati-vamente fraca.[0069] Also, there are residues Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, 400S that are present at the interface but that do not interact to significantly contribute to dimer formation between CH3 domains such as a hydrophobic interaction or an electrostatic interaction with adjacent amino acid residues (see FIG. 2). Some of these residues contribute to a cross-domain interaction with a relatively weak non-covalent interaction.

[0070] Neste caso, o termo "interação não covalente" refere-se a uma intera-ção tendo uma força de ligação fraca quando átomos ou moléculas formam um agregado devido a uma interação outra que uma interação covalente, e inclui intera-ções de uma interação eletrostática, uma interação hidrofóbica, ligação de hidrogê-nio, e uma interação Van der Waals.[0070] In this case, the term "non-covalent interaction" refers to an interaction having a weak binding strength when atoms or molecules form an aggregate due to an interaction other than a covalent interaction, and includes interactions of an electrostatic interaction, a hydrophobic interaction, hydrogen bonding, and a Van der Waals interaction.

[0071] O termo "interação eletrostática" refere-se a uma interação dependen-te de atração elétrica entre íons opostamente carregados. O termo "interação hidro- fóbica" refere-se a uma interação em que uma interação com um solvente polar é excluído e que é causado por uma tendência termodinamicamente estabilizante de moléculas hidrofóbicas. O termo "ligação de hidrogênio" refere-se a uma interação entre um dipolo e um dipolo que é gerado entre moléculas de interação covalente polar geradas quando há o encontro de hidrogênio, flúor, oxigênio e nitrogênio. Também, o termo "interação Van der Waals" refere-se a uma interação em que mo-léculas têm polaridade devido a força de Van der Waals e uma força atrativa e uma força repulsiva que atua entre elas.[0071] The term "electrostatic interaction" refers to an interaction dependent on electrical attraction between oppositely charged ions. The term "hydrophobic interaction" refers to an interaction in which an interaction with a polar solvent is excluded and which is caused by a thermodynamically stabilizing tendency of hydrophobic molecules. The term "hydrogen bond" refers to an interaction between a dipole and a dipole that is generated between polar covalently interacting molecules generated when hydrogen, fluorine, oxygen, and nitrogen meet. Also, the term "Van der Waals interaction" refers to an interaction in which molecules have polarity due to the Van der Waals force and an attractive force and a repulsive force acting between them.

[0072] Também, o termo "homodímero" refere-se a um dímero de um domínio de anticorpo tendo a mesma sequência aminoácida ou incluindo uma parte de ou um anticorpo inteiro incluindo o mesmo, e especificamente, refere-se a um dímero entre domínios CH3 de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo ou um dímero de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo incluindo o mesmo domínio CH3.[0072] Also, the term "homodimer" refers to a dimer of an antibody domain having the same amino acid sequence or including a part of or an entire antibody including the same, and specifically, it refers to a dimer between domains CH3 of an antibody heavy chain constant region or a dimer of an antibody heavy chain constant region including the same CH3 domain.

[0073] Também, o termo "Fc homodimérico" refere-se a um dímero entre re-giões constantes de cadeia pesada (dobradiça-CH2-CH3) tendo a mesma sequência aminoácida.[0073] Also, the term "homodimeric Fc" refers to a dimer between heavy chain constant regions (hinge-CH2-CH3) having the same amino acid sequence.

[0074] Na presente invenção, resíduos aminoácidos contribuindo para uma interação entre domínios CH3 são modificados, e formação de um par (CH3A:CH3B) em que um domínio CH3 (CH3A) de uma cadeia pesada e um domínio CH3 (CH3B) de outra cadeia pesada pode seletivamente interagir através da interação não cova-lente é induzida. Os presentes inventores têm se esforçado para aumentar uma pro-dução de formação de um Fc heterodimérico em um par de região constante de ca-deia pesada e que um par de mutação CH3 é fusionado ao C-terminal da dobradiça- CH2, isto é, entre dobradiça-CH2-CH3A e dobradiça-CH2-CH3B, e completar a pre-sente invenção.[0074] In the present invention, amino acid residues contributing to an interaction between CH3 domains are modified, and formation of a pair (CH3A:CH3B) in which a CH3 domain (CH3A) of one heavy chain and a CH3 domain (CH3B) of another heavy chain can selectively interact through non-covalent interaction is induced. The present inventors have endeavored to increase a production of formation of a heterodimeric Fc in a heavy chain constant region pair and that a CH3 mutation pair is fused to the C-terminus of the CH2-hinge, i.e. between hinge-CH2-CH3A and hinge-CH2-CH3B, and complete the present invention.

[0075] Neste caso, o termo "heterodímero" refere-se a um dímero incluindo dois tipos de domínios de anticorpos tendo sequências aminoácidas diferentes, ou incluindo uma parte de ou um anticorpo inteiro incluindo o mesmo, e especificamen-te, um dímero incluindo um par domínio CH3 tendo sequências diferentes de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo ou incluindo uma parte de ou um anticorpo inteiro incluindo um par de domínio CH3 tendo sequências diferentes.[0075] In this case, the term "heterodimer" refers to a dimer including two types of antibody domains having different amino acid sequences, or including a part of or an entire antibody including the same, and specifically, a dimer including a CH3 domain pair having different sequences than an antibody heavy chain constant region or including a part of or an entire antibody including a CH3 domain pair having different sequences.

[0076] Também, o termo "Fc heterodimérico" refere-se a um dímero entre regiões constantes de cadeia pesada (dobradiça-CH2-CH3) incluindo CH3A e CH3B respectivamente tendo sequências aminoácidas diferentes.[0076] Also, the term "heterodimeric Fc" refers to a dimer between heavy chain constant regions (hinge-CH2-CH3) including CH3A and CH3B respectively having different amino acid sequences.

[0077] Também, o termo "rendimento de formação do Fc heterodimérico" re-fere-se a uma proporção (percentagem) de uma região constante de cadeia pesada como um heterodímero para um dímero de região constante de cadeia pesada total (homodímero e heterodímero) ou uma soma de monômeros quando um par de região constante de cadeia pesada incluindo um par de mutação de domínio CH3 foi simultaneamente transformada em células de animal HEK293F, expressas e purifi-cadas.[0077] Also, the term "heterodimeric Fc formation yield" refers to a ratio (percentage) of a heavy chain constant region as a heterodimer to a total heavy chain constant region dimer (homodimer and heterodimer ) or a monomer sum when a heavy chain constant region pair including a CH3 domain mutation pair was simultaneously transformed into HEK293F animal cells, expressed and purified.

[0078] A presente invenção provê um heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpos incluindo o seguinte ligante (a): em um primeiro grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consistindo de Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 e Lys409, uma ligação entre i) um aminoácido se-lecionado a partir do grupo consistindo de alanina (A), treonina (T), serina (S), valina (V), metionina (M), e glicina (G), que é substituído em pelo menos uma posição do primeiro grupo, e ii) um aminoácido selecionado a partir do grupo consistido de feni- lalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W), que é substituído em pelo menos uma posi-ção do primeiro grupo (em que, as posições são numeradas de acordo com o índice EU).[0078] The present invention provides a heterodimer including CH3 domains of antibodies including the following linker (a): in a first group of CH3 domain selected from the group consisting of Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 and Lys409, a bond between i) an amino acid selected from the group consisting of alanine (A), threonine (T), serine (S), valine (V), methionine (M), and glycine (G) , which is substituted in at least one position of the first group, and ii) an amino acid selected from the group consisting of phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W), which is substituted in at least one position -tion of the first group (in which the positions are numbered according to the EU index).

[0079] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo pode ainda in-cluir o o seguinte ligante (b): (b) em um segundo grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consistindo de Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 e Ser400, um ligante entre i) lisina (K) ou arginina (R), que é substituído em pelo menos uma posição do segundo grupo, e ii) ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E), que é substituído em pelo menos uma posição do segundo grupo (em que, as posições são numeradas de acordo com o índice EU).[0079] The heterodimer including antibody CH3 domains may further include the following linker (b): (b) in a second CH3 domain group selected from the group consisting of Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364 , Asn390, Thr394, Pro395, Val397 and Ser400, a linker between i) lysine (K) or arginine (R), which is substituted in at least one position of the second group, and ii) aspartic acid (D) or glutamic acid ( E), which is substituted in at least one position of the second group (in which, the positions are numbered according to the EU index).

[0080] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que a posi- ção do primeiro grupo é selecionada a partir do grupo consistindo em Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 e Lys409 é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0080] The heterodimer including antibody CH3 domains in which the position of the first group is selected from the group consisting of Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 and Lys409 is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0081] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que Lys409 de um domínio CH3 é substituído com triptofano (W), e Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 são substituídos com valina (V) e treonina (T), é preferível, mas a pre-sente invenção não é limitada a ele.[0081] The heterodimer including antibody CH3 domains in which Lys409 of one CH3 domain is replaced with tryptophan (W), and Asp399 and Phe405 of the other CH3 domain are replaced with valine (V) and threonine (T), is preferable, but the present invention is not limited to it.

[0082] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que Tyr349 de um domínio CH3 é substituído com serina (S), e Glu357 do outro domínio CH3 é substituído com triptofano (W) é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0082] The heterodimer including antibody CH3 domains in which Tyr349 of one CH3 domain is replaced with serine (S), and Glu357 of the other CH3 domain is replaced with tryptophan (W) is preferable, but the present invention is not limited thereto .

[0083] Também, o heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que a posição do segundo grupo é Gln347 ou Lys360 é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0083] Also, the heterodimer including antibody CH3 domains in which the position of the second group is Gln347 or Lys360 is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0084] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que Lys360 de um domínio Ch3 é substituído com ácido glutâmico (E), e Gln347 do outro domínio CH3 é substituído com arginina (R) é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0084] The heterodimer including antibody CH3 domains in which Lys360 of one Ch3 domain is replaced with glutamic acid (E), and Gln347 of the other CH3 domain is replaced with arginine (R) is preferable, but the present invention is not limited to the same.

[0085] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que Gln347 de um domínio CH3 é substituído com ácido glutâmico (E) é preferível, mas a pre-sente invenção não é limitada ao mesmo.[0085] Heterodimer including antibody CH3 domains in which Gln347 of one CH3 domain is replaced with glutamic acid (E) is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0086] O heterodímero incluindo domínios CH3 do anticorpo em que Lys360 e Lys409 de um domínio CH3 são substituídos com ácido glutâmico (E) e triptofano (W), respectivamente, e Gln347, Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 são substi-tuídos com arginina (R), valina (V) e treonina (T), respectivamente, é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0086] The heterodimer including CH3 domains of the antibody in which Lys360 and Lys409 of one CH3 domain are replaced with glutamic acid (E) and tryptophan (W), respectively, and Gln347, Asp399 and Phe405 of the other CH3 domain are replaced with arginine (R), valine (V) and threonine (T), respectively, is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0087] O heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que Gln347, Lys360 e Lys409 de um domínio CH3 são substituídos com ácido glutâmico (E), ácido glutâmico (E) e triptofano (W), respectivamente, e Gln347, Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 são substituídos com arginina (R), valina (V) e treonina (T) respectivamente, é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0087] The heterodimer including CH3 domains of antibody in which Gln347, Lys360 and Lys409 of one CH3 domain are replaced with glutamic acid (E), glutamic acid (E) and tryptophan (W), respectively, and Gln347, Asp399 and Phe405 of other CH3 domain are replaced with arginine (R), valine (V) and threonine (T) respectively, it is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0088] Também, o heterodímero incluindo domínios CH3 de anticorpo em que Tyr349 e Lys409 de um domínio CH3 são substituídos com serina (S) e triptofa- no (W), respectivamente, e Glu347, Asp399 e Phe405 do outro domínio CH3 são substituídos com triptofano (W), valina (V) e treonina (T), respectivamente, é preferí-vel, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo.[0088] Also, the heterodimer including antibody CH3 domains in which Tyr349 and Lys409 of one CH3 domain are replaced with serine (S) and tryptophan (W), respectively, and Glu347, Asp399 and Phe405 of the other CH3 domain are replaced with tryptophan (W), valine (V) and threonine (T), respectively, is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0089] O heterodímero incluindo domínios CH3 do anticorpo pode ainda in-cluir o seguinte ligante (c): (c) em um terceiro grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consistindo de Tyr349 e Ser354, um ligante entre i) cisteína (C) subs-tituída me pelo menos uma posição do terceiro grupo, e ii) cisteína (C) substituída em pelo menos uma posição do terceiro grupo (em que as posições são numeradas de acordo com o índice EU).[0089] The heterodimer including CH3 domains of the antibody may further include the following linker (c): (c) in a third CH3 domain group selected from the group consisting of Tyr349 and Ser354, a linker between i) cysteine ( C) substituted in at least one position of the third group, and ii) cysteine (C) substituted in at least one position of the third group (where the positions are numbered according to the EU index).

[0090] Também, o heterodímero incluindo domínios CH3 do anticorpo que é incluso em uma região Fc de uma imunoglobulina selecionada a partir do grupo con-sistindo em IgG, IgM, IgA, IgD e IgE é preferível, mas a presente invenção não é li-mitada ao mesmo. O heterodímero incluindo domínio CH3 de anticorpo em que o IgG é um IgG humano é preferível, mas a presente invenção não é limitada ao mesmo. O heterodímero incluindo domínio CH3 de anticorpo em que o IgG humano é selecionado a partir do grupo consistindo em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 é preferível, mas a presente invenção não limitada ao mesmo.[0090] Also, the heterodimer including CH3 domains of the antibody which is included in an Fc region of an immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgM, IgA, IgD and IgE is preferable, but the present invention is not limited to -mitated to the same. Heterodimer including antibody CH3 domain in which the IgG is a human IgG is preferable, but the present invention is not limited thereto. The heterodimer including antibody CH3 domain in which human IgG is selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 is preferable, but the present invention is not limited thereto.

[0091] Em um exemplo da presente invenção, em um par de mutação indu-zido em domínios CH3 heterogêneos (CH3A e CH3B), um rendimento de formação do heterodímero aumenta usando um método a partir de uma estratégia convencio-nal. A fim de formar um Fc heterodimérico estabilizado, um par variante de domínio CH3 foi desenhado.[0091] In an example of the present invention, in a mutation-induced pair in heterogeneous CH3 domains (CH3A and CH3B), a heterodimer formation yield increases using a method from a conventional strategy. In order to form a stabilized heterodimeric Fc, a CH3 domain variant pair was designed.

[0092] Especificamente, entre os resíduos aminoácidos que estão posicio-nados dentro da interface entre domínios CH3 e não expostos do lado de fora, um núcleo hidrofóbico tendo uma alta contribuição para formação do dímero entre do-mínios CH3 foi mantido, e uma mutação foi induzida nos resíduos Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399, e Lys409 que estão presentes dentro da interface e contri-buem a formação de um homodímero entre domínios CH3 devido a uma interação eletrostática. Um par de mutação tendo uma mutação de interação espaço comple- mentar-hidrofóbica foi preparada tal que um resíduo hidrofóbico de uma interface de uma cadeia pesada ser inserida entre resíduos hidrofóbicos de uma interface de uma cadeia pesada oposta diferente. Quando esta abordagem é usada, uma malea-bilidade aumentada adicional do heterodímero pode ser esperada por remoção de uma interação contribuindo para formação do homodímero entre domínios CH3 exis-tentes, e substituindo a interação com uma interação que pode induzir formação de uma atração hidrofóbica somente no heterodímero. Também, neste abordagem, a quantidade máxima de resíduos aminoácidos de um núcleo hidrofóbico de uma inter-face do domínio CH3 selvagem é conservado e estabilidade do heterodímero a ser gerado através do mesmo pode ser aumentado. Esta abordagem é uma estratégica diferente a partir da técnica "knob-into-hole" (Ridgway, Presta e colaboradores. 1996) e que uma interação hidrofóbica seletiva é formada em uma parte do núcleo hidrofóbico existente para preparar um anticorpo heterodímero.[0092] Specifically, among the amino acid residues that are positioned inside the interface between CH3 domains and not exposed outside, a hydrophobic core having a high contribution to dimer formation between CH3 domains was maintained, and a mutation was induced on Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399, and Lys409 residues that are present within the interface and contribute to the formation of a homodimer between CH3 domains due to an electrostatic interaction. A mutation pair having a space-complementary-hydrophobic interaction mutation was prepared such that a hydrophobic residue from one interface of one heavy chain was inserted between hydrophobic residues from an interface of a different opposite heavy chain. When this approach is used, further increased malleability of the heterodimer can be expected by removing an interaction contributing to homodimer formation between existing CH3 domains, and replacing the interaction with an interaction that can induce formation of a hydrophobic attraction only in the heterodimer. Also, in this approach, the maximum amount of amino acid residues of a hydrophobic core of a wild-type CH3 domain interface is conserved and stability of the heterodimer to be generated therethrough can be increased. This approach is a different strategy from the "knob-into-hole" technique (Ridgway, Presta et al. 1996) and that a selective hydrophobic interaction is formed on a part of the existing hydrophobic core to prepare a heterodimer antibody.

[0093] Também, em resíduos Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, Ser400 que estão presentes na interface entre domínios CH3 mas não contribuem significativamente para aumentar formação do dímero entre domínios CH3 por uma interação hidrofóbica ou uma interação ele-trostática com resíduos aminoácidos adjacentes, um par de mutação de interação eletrostática seletivo em que uma carga de um resíduo aminoácido de uma cadeia pesada e uma carga de um resíduo de uma cadeia pesada oposta diferente são opostas foi induzidas. Como um resultado, a interação entre domínios CH3 homogê-neos foi excluída, e uma interação eletrostática de longo alcance de aumento de formação do heterodímero foi induzida. Nesta abordagem, uma interação eletrostática é introduzida tal que resíduos aminoácidos podem interagir com resíduos do domínio CH3 oposto em uma distância relativamente longa. Consequentemente, uma nova interação é gerada, e esta interação contribui para formação seletiva do hete- rodímero.[0093] Also, in residues Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, Ser400 that are present at the interface between CH3 domains but do not contribute significantly to increasing dimer formation between CH3 domains by a hydrophobic interaction or an electrostatic interaction with adjacent amino acid residues, a pair of selective electrostatic interaction mutation in which a charge of an amino acid residue of one heavy chain and a charge of a residue of a different opposite heavy chain are opposite was induced. As a result, the interaction between homogeneous CH3 domains was excluded, and a long-range electrostatic interaction of increased heterodimer formation was induced. In this approach, an electrostatic interaction is introduced such that amino acid residues can interact with residues of the opposite CH3 domain over a relatively long distance. Consequently, a new interaction is generated, and this interaction contributes to the selective formation of the heterodimer.

[0094] Também, na abordagem acima, um par variante de domínio CH3 he- terodímero em que uma parte do núcleo hidrofóbico posicionado dentro da interface entre domínios CH3 é conservado pode manter uma estabilidade termodinâmica, imunogenicidade, e produtividade de expressão nas células animais, que são simila-res àqueles de um tipo selvagem.[0094] Also, in the above approach, a heterodimer CH3 domain variant pair in which a part of the hydrophobic core positioned within the interface between CH3 domains is conserved can maintain thermodynamic stability, immunogenicity, and expression productivity in animal cells, which are similar to those of a wild type.

[0095] Também, Thr250, Met252, Ile253, Ser254, Thr256, Thr307, His310, Glu380, Met428, His433, Asn434, His435, e Tyr436, que são sítios aos quais se ligam a FcRn (receptor Fc neonatal), e Leu234, Leu235, Gly236, e Gly237 que são sítios aos quais ligam FcgR (receptores fc gama), são conservados. Então, é possível prover uma meia vida sérica longa de acordo com uma ligação entre um anticorpo de cadeia pesada e FcRn ou FcgR, e mantendo atividade intrínsecas de um anticorpo tal como uma citotoxidade celular dependente de anticorpo e uma citotoxidade celular dependente de complemento (Wines, Powell e colaboradores. 2000; Roope- nian and Akilesh 2007).[0095] Also, Thr250, Met252, Ile253, Ser254, Thr256, Thr307, His310, Glu380, Met428, His433, Asn434, His435, and Tyr436, which are sites to which FcRn (neonatal Fc receptor) binds, and Leu234, Leu235, Gly236, and Gly237, which are sites to which FcgR (fc gamma receptors) bind, are conserved. Therefore, it is possible to provide a long serum half-life consistent with binding between a heavy chain antibody and FcRn or FcgR, and maintaining intrinsic activities of an antibody such as antibody-dependent cellular cytotoxicity and complement-dependent cellular cytotoxicity (Wines , Powell et al. 2000; Roopenian and Akilesh 2007).

[0096] Também, em outro exemplo da presente invenção, um sistema para avaliar a maleabilidade heterodímera do variante do domínio CH3 desenhado foi construído. Especificamente, o sistema expressa e purifica um anticorpo em que uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo incluindo cada par de mutação de domínio CH3 é fusionado em células animais. Neste caso, no par de muta- ção, um anticorpo variável do fragmento de cadeia simples (scFv) foi fusionado e expresso em somente uma região constante de cadeia pesada em que o domínio CH3A é incluso, e uma região constante de cadeia pesada em que o domínio CH3B é incluso foi expresso sozinho sem fusão de fragmento de anticorpo. Como um re-sultado, a cadeia pesada em que o domínio CH3A é inclusa é incluso tem um peso molecular maior que a cadeia pesada em que o domínio CH3B é incluso. Então, o heterodímero (scFv-Fc:Fc) e o homodímero (scFv-Fc:scFv-Fc, Fc:Fc) tem taxas de movimento diferentes em SDS-PAGE sob condições não redutoras de forma que uma quantidade do heterodímero entre os anticorpos expressos e purificados podem ser relativamente comparados (ver FIG. 15).[0096] Also, in another example of the present invention, a system for evaluating the heterodimer malleability of the designed CH3 domain variant was constructed. Specifically, the system expresses and purifies an antibody in which a heavy chain constant region of an antibody including each CH3 domain mutation pair is fused in animal cells. In this case, in the mutation pair, a single-chain fragment variable antibody (scFv) was fused and expressed in only one heavy chain constant region in which the CH3A domain is included, and one heavy chain constant region in which the CH3B domain is included was expressed alone without antibody fragment fusion. As a result, the heavy chain in which the CH3A domain is included has a higher molecular weight than the heavy chain in which the CH3B domain is included. Thus, the heterodimer (scFv-Fc:Fc) and the homodimer (scFv-Fc:scFv-Fc, Fc:Fc) have different rates of movement on SDS-PAGE under non-reducing conditions so that an amount of the heterodimer among the antibodies expressed and purified can be relatively compared (see FIG. 15).

[0097] Também, em ainda outro exemplo da presente invenção, quando o sistema construído para avaliar a maleabilidade do heterodímero é usado, foi confir-mado que o anticorpo incluindo o par variante de domínio CH3 de acordo com a pre-sente invenção tem um rendimento de formação de cerca de 90 a 95%, que é signi-ficativamente maior que um rendimento de formação do heterodímero usando a téc-nica de "knob-into-hole"convencional (ver FIGS. 16 e 17).[0097] Also, in yet another example of the present invention, when the constructed system for evaluating the malleability of the heterodimer is used, it was confirmed that the antibody including the CH3 domain variant pair according to the present invention has a about 90 to 95% formation yield, which is significantly higher than a heterodimer formation yield using the conventional "knob-into-hole" technique (see FIGS. 16 and 17).

[0098] Ainda, a presente invenção provê um par Fc heterodimérico incluindo o heterodímero contendo um domínio CH3 e um anticorpo biespecífico incluindo o heterodímero contendo um domínio CH3.[0098] Furthermore, the present invention provides a heterodimeric Fc pair including the heterodimer containing a CH3 domain and a bispecific antibody including the heterodimer containing a CH3 domain.

[0099] Preferivelmente, o anticorpo biespecífico tem uma forma selecionada a partir do grupo consistindo em scFv-Fc, scIgG (scFab-Fc), (Fv)2-Fc, mAb-Fv e Fv- Fc, mas não é limitado ao mesmo. A proteína de fusão é preferivelmente na forma de uma proteína-Fc, mas não é limitada a mesma.[0099] Preferably, the bispecific antibody has a form selected from the group consisting of scFv-Fc, scIgG (scFab-Fc), (Fv)2-Fc, mAb-Fv and Fv-Fc, but is not limited thereto . The fusion protein is preferably in the form of an Fc-protein, but is not limited thereto.

[00100] O heterodímero CH3 de acordo com a presente invenção em que uma mutação é induzida no domínio CH3 da região constante de cadeia pesada do anticorpo pode formar uma proteína do par Fc heterodimérico. A proteína do par Fc heterodimérico pode ter uma forma de um anticorpo biespecífico, e que pode simul- taneamente se liga a dois antígenos diferentes, em que anticorpos tendo especifici-dade de antígeno diferente são fusionados na forma de uma região variável de ca-deia pesada (VH), uma região variável de cadeia leve (VL), e um fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo ou um fragmento Fab do anticorpo de cadeia simples (scFab), várias formas de um anticorpo simples fusionado à região variável biespecífico (mAb-Fv) em que um domínio de ligação de antígeno variável simples (VH ou VL) é fusionado ao C-terminal de uma cadeia IgG pesada típica, um anticorpo (Fv-Fc) em que uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que se liga a um antígeno simples, são fusionados para ligar de forma monovalente ao antígeno simples, ou uma forma de uma proteína fusionada a região constante de anticorpo (Proteína-Fc) em que os domínios extracelulares do receptor de membrana celular capazes de ligar a uma proteína específica, um peptí- deo, um anticorpo de domínio simples, um ligante, uma toxina e semelhantes são fusionados para especificamente reconhecer um tipo ou dois tipos de proteínas.[00100] The CH3 heterodimer according to the present invention in which a mutation is induced in the CH3 domain of the heavy chain constant region of the antibody can form a heterodimeric Fc pair protein. The heterodimeric Fc pair protein can have a form of a bispecific antibody, and which can simultaneously bind to two different antigens, in which antibodies having different antigen specificity are fused together in the form of a chain variable region. heavy chain (VH), a light chain variable region (VL), and an antibody single chain variable fragment (scFv) or a single chain antibody Fab fragment (scFab), various forms of a single antibody fused to the variable region bispecific (mAb-Fv) in which a single variable antigen binding domain (VH or VL) is fused to the C-terminus of a typical IgG heavy chain, an antibody (Fv-Fc) in which a heavy chain variable region ( VH) and a light chain variable region (VL), which binds to a single antigen, are fused together to monovalently bind to the single antigen, or a form of a protein fused to an antibody constant region (Fc-Protein) in that cell membrane receptor extracellular domains capable of binding a specific protein, a peptide, a single domain antibody, a ligand, a toxin, and the like are fused to specifically recognize one type or two types of proteins.

[00101] Especificamente, em um exemplo da presente invenção, o par vari-ante de domínio CH3 de acordo com a presente invenção foi usada para preparar um anticorpo biespecífico anti-DR4 x DR5 na forma de scFv e scFab, e foi confirmado que o anticorpo biespecífico tem especificidade para moléculas alvos DR4 e DR5 (ver FIGS. 22 e 23). Como um resultado, pode ser entendido que o anticorpo bies- pecífico preparado usando o par variante de domínio CH3 da presente invenção mantém a habilidade para um sítio de ligação do antígeno sem mudança.[00101] Specifically, in an example of the present invention, the CH3 domain variant pair according to the present invention was used to prepare a bispecific anti-DR4 x DR5 antibody in the form of scFv and scFab, and it was confirmed that the bispecific antibody has specificity for DR4 and DR5 target molecules (see FIGS. 22 and 23). As a result, it can be understood that the bispecific antibody prepared using the variant CH3 domain pair of the present invention retains the ability for an antigen binding site without change.

[00102] Neste caso, o termo "fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo" é um polipeptídeo VH-L-VL a VL-L-VH em que um VH e um VL são co-nectados usando um ligador de peptídeo (L) apropriado de 12 ou mais resíduos e refere a um fragmento de anticorpo tendo uma atividade ligadora de antígeno.[00102] In this case, the term "antibody single-chain variable fragment (scFv)" is a VH-L-VL to VL-L-VH polypeptide in which a VH and a VL are connected using a peptide linker (L) appropriate of 12 or more residues and refers to an antibody fragment having antigen-binding activity.

[00103] Também, o termo "fragmento do anticorpo Fab de cadeia simples (scFab)" é um polipeptídeo VL-CL-L-VH-CH1 a VH-CH1-L-VL-CL em que um frag-mento de cadeia pesada expresso a partir de um VH e CH1 e uma cadeia leve inclu-indo um Vl ou uma parte CL são conectadas usando um ligador de peptídeo apropri-ado (L) de 34 ou mais resíduos, e refere-se a um fragmento de anticorpo tendo uma atividade de ligação de antígeno.[00103] Also, the term "single chain Fab antibody (scFab) fragment" is a VL-CL-L-VH-CH1 to VH-CH1-L-VL-CL polypeptide in which a heavy chain fragment expressed from a VH and CH1 and a light chain including a Vl or a CL part are connected using an appropriate peptide (L) linker of 34 or more residues, and refers to an antibody fragment having an antigen-binding activity.

[00104] Também, o termo "fragmento variável (Fv)" refere-se a um fragmento de anticorpo mínimo incluindo um sítio de ligação de antígeno completo. O termo "Fv-Fc" usados aqui refere-se a um anticorpo em que uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que liga a um antígeno sim-ples, são fusionados ao N-terminal ou C-terminal da proteína do par Fc heterodimé- rico e que podem de forma monovalente se ligar ao antígeno simples.[00104] Also, the term "variable fragment (Fv)" refers to a minimal antibody fragment including a complete antigen-binding site. The term "Fv-Fc" used herein refers to an antibody in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), which bind to a single antigen, are fused to N -terminal or C-terminal of the heterodimeric Fc pair protein and which can monovalently bind single antigen.

[00105] Também, o termo "mAb-Fv" aqui usado refere-se a um anticorpo em que uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) são fusionadas ao C-terminal de uma cadeia pesada IgG típica e que pode de forma trivalente ligar a um antígeno, ou um anticorpo biespecífico que pode ligar de forma bivalente a um antígeno mAb e ligar monovalente a um antígeno Fv.[00105] Also, the term "mAb-Fv" used herein refers to an antibody in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) are fused to the C-terminus of a chain typical heavy IgG that can trivalently bind to an antigen, or a bispecific antibody that can bivalently bind to a mAb antigen and monovalently bind to an Fv antigen.

[00106] Também, o termo "proteína fusionada a região constante do anti-corpo (Proteína-Fc)" usados aqui refere-se a uma proteína de fusão em que domínios extracelulares do receptor de membrana celular capazes de ligar a uma proteína específica, um peptídeo, um anticorpo de domínio simples, um ligante, uma toxina e semelhantes são fusionados ao N-terminal e o C-terminal da proteína do par Fc heterodimérico de acordo com a presente invenção e que pode especificamente re-conhecer um tipo de dois tipos de proteínas.[00106] Also, the term "antibody constant region fusion protein (Fc-Protein)" used herein refers to a fusion protein in which extracellular domains of the cell membrane receptor capable of binding to a specific protein, a peptide, a single domain antibody, a linker, a toxin and the like are fused to the N-terminus and the C-terminus of the Fc heterodimeric pair protein according to the present invention and which can specifically recognize one type of two types of proteins.

[00107] Em adição, a presente invenção provê uma composição farmacêutica incluindo anticorpo biespecífico ou uma proteína de fusão incluindo a proteína do par Fc heterodimérico.[00107] In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition including bispecific antibody or a fusion protein including heterodimeric Fc pair protein.

[00108] Desde que o anticorpo biespecífico ou a proteína de fusão preparado na presente invenção pode especificamente ter como alvo um antígeno ou uma proteína relacionada a tumores ou doenças imunológicas, o anticorpo biespecífico ou a proteína de fusão pode ser proveitosamente utilizado para uma composição farmacêutica que pode tratar ou prevenir as doenças.[00108] Since the bispecific antibody or fusion protein prepared in the present invention can specifically target an antigen or protein related to tumors or immunological diseases, the bispecific antibody or fusion protein can be fruitfully used for a pharmaceutical composition that can treat or prevent disease.

[00109] Neste caso, uma composição farmacêutica incluindo o anticorpo bi- específico ou a proteína de fusão preparada na presente invenção pode simultane-amente ter como alvo dois tipos de antígenos relacionados aos tumores ou doenças imunológicas que se desenvolvem a partir de ações redundantes, indiretas e gradu-ais de várias proteínas, ao invés da patogênese induzida por uma proteína. Então, ela pode aumentar um efeito terapêutico da doença comparada a uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo monoclonal com alvo somente em um tipo de uma proteína alvo.[00109] In this case, a pharmaceutical composition including the bispecific antibody or the fusion protein prepared in the present invention can simultaneously target two types of antigens related to tumors or immunological diseases that develop from redundant actions, indirect and gradual effects of various proteins, rather than pathogenesis induced by one protein. So, it can enhance a disease therapeutic effect compared to a pharmaceutical composition including a monoclonal antibody targeting only one type of a target protein.

[00110] Especificamente, em um exemplo da presente invenção, a fim de in-vestigar uma atividade de morte de célula cancerígena de anticorpos anti-DR4 x DR5 scFv-Fc e scFab-Fc biespecíficos preparados na presente invenção, um experimento de citotoxidade (ensaio de MTT) foi feito em linhagens celulares de uma célula de câncer derivada de humano HCT116 (carcinoma coloretal) e HeLa (adeno-carcinoma). Pode ser entendido que as duas formas dos anticorpos biespecíficos têm uma atividade de morte de célula cancerígena maior que anticorpos parentais, um anticorpo humanizado hAY4a IgG e um anticorpo humano AU5H-scFv, e têm um a citotoxidade similar ou levemente melhor que TRAIL suado como um grupo controle positivo (ver FIG. 24).[00110] Specifically, in an example of the present invention, in order to investigate a cancer cell killing activity of bispecific anti-DR4 x DR5 scFv-Fc and scFab-Fc antibodies prepared in the present invention, a cytotoxicity experiment ( MTT assay) was done on cell lines of a human-derived cancer cell HCT116 (colorectal carcinoma) and HeLa (adenocarcinoma). It can be understood that the two forms of the bispecific antibodies have a greater cancer cell killing activity than parental antibodies, a humanized hAY4a IgG antibody and a humanized AU5H-scFv antibody, and have similar or slightly better cytotoxicity than TRAIL sweat as a positive control group (see FIG. 24).

[00111] O termo "tratamento" aqui utilizado refere-se a uma melhoria de sin-tomas de doença ou todas atividades que são beneficamente mudadas por adminis-tração da composição da presente invenção.[00111] The term "treatment" used herein refers to an improvement of disease symptoms or all activities that are beneficially changed by administering the composition of the present invention.

[00112] Quando a composição farmacêutica de acordo com a presente in-venção é formulada, um diluente ou um agente diluente tal como um enchimento, um agente extensor, um agente ligante, um agente umectante, um agente desintegrante e um tensoativo, que são comumente usados, é usado para preparação.[00112] When the pharmaceutical composition according to the present invention is formulated, a diluent or a diluent agent such as a filler, an extender agent, a binding agent, a wetting agent, a disintegrating agent and a surfactant, which are commonly used, is used for preparation.

[00113] Uma preparação sólida para administração oral inclui comprimidos, pílulas, pós, grânulos, cápsulas, pastilhas e semelhantes. Tais preparações sólidas são preparadas quando pelo menos um agente diluente, por exemplo, amigo, carbo-nato de cálcio, sacarose, lactose ou gelatina, são misturadas com um ou mais com-postos de acordo com a presente invenção. Em adição ao agente de diluição simples, lubrificantes tais como estearato de magnésio e talco são também utilizados. Uma preparação líquida para administração oral inclui um agente de suspensão, uma solução oral, uma emulsão, um xarope e semelhantes. Em adição à água e para fina líquida que são comumente usadas como diluentes simples, vários agentes diluentes, por exemplo, um agente umectante, um adoçante, uma fragrância, e um conservante podem ser inclusos.[00113] A solid preparation for oral administration includes tablets, pills, powders, granules, capsules, lozenges and the like. Such solid preparations are prepared when at least one diluting agent, for example, friend, calcium carbonate, sucrose, lactose or gelatin, are mixed with one or more compounds according to the present invention. In addition to the simple thinning agent, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. A liquid preparation for oral administration includes a suspending agent, an oral solution, an emulsion, a syrup and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used as simple diluents, various diluting agents, for example, a wetting agent, a sweetener, a fragrance, and a preservative, may be included.

[00114] Uma preparação para administração parenteral inclui uma solução esterilizada aquosa, um solvente não aquoso, um solvente de suspensão, uma emulsão, uma preparação liofilizada, um supositório e semelhantes.[00114] A preparation for parenteral administration includes a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspending solvent, an emulsion, a lyophilized preparation, a suppository, and the like.

[00115] Como o solvente não aquoso e o solvente de suspensão, óleos ve-getais tais como propileno glicol, polietileno glicol, e óleo de oliva, um éster injetável tal como oleato de etila e semelhantes podem ser usados. O supositório pode usar bases tais como Witepsol, macrogol, Tween 61, manteiga de cacau, manteiga de laurina, glicerol e gelatina.[00115] As the non-aqueous solvent and the suspending solvent, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol, and olive oil, an injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. The suppository can use bases such as Witepsol, macrogol, Tween 61, cocoa butter, laurine butter, glycerol and gelatin.

[00116] A composição da presente invenção pode ser administrada oralmen-te ou parenteralmente (por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente ou local-mente) de acordo com um método desejado. A dose é mudada de acordo com uma condição do paciente, peso corpóreo, e um grau de doença, uma forma de droga, e vias de administração, e tempo, e aqueles versados na técnica podem apropriada-mente selecionada a dose.[00116] The composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously or locally) according to a desired method. The dose is changed according to a patient's condition, body weight, and a degree of disease, a drug form, and routes of administration, and time, and those skilled in the art can appropriately select the dose.

[00117] A composição da presente invenção é administrada em uma quanti- dade farmaceuticamente efetiva. Na presente invenção, o termo "quantidade farma- ceuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade que é suficiente para tratar doença em uma proporção benefício/risco razoável aplicável para tratamento médico. Um nível da dose efetiva pode ser determinado por fatores incluindo um tipo de doença de paciente e severidade de doença, uma atividade de droga, sensibilidade da droga, um tempo de administração, vias de administração, uma proporção de descarga, um período de tratamento, e uma droga usada simultaneamente, e outros fatores bem conhecidos no campo de medicina. A composição da presente invenção pode ser administrada como um agente terapêutico individual ou em combinação com outros agentes terapêuticos. A composição da presente invenção pode ser sequencialmente o simultaneamente administrada com um agente terapêutico na técnica relacionada, ou administrada em uma única vez ou múltiplas vezes. É importante administrar uma quantidade em que um efeito máximo pode ser obtido com uma quantidade mínima que não causa efeitos colaterais em consideração de tdos os fatores acima, que podem ser facilmente determinados por aqueles versados na técnica.[00117] The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount that is sufficient to treat disease in a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment. An effective dose level can be determined by factors including a patient's disease type and disease severity, drug activity, drug sensitivity, time of administration, routes of administration, rate of discharge, period of treatment, and a drug used simultaneously, and other factors well known in the field of medicine. The composition of the present invention can be administered as a single therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents. The composition of the present invention can be sequentially or concurrently administered with a therapeutic agent in the related art, or administered at a single time or multiple times. It is important to administer an amount at which a maximum effect can be obtained with a minimum amount that does not cause side effects in consideration of all of the above factors, which can easily be determined by those skilled in the art.

[00118] Especificamente, a quantidade efetiva do composto de acordo com a presente invenção pode ser mudada de acordo com uma idade, sexo e peso corpóreo do paciente, e geralmente administrado em 0,01 g a 100 mg por kg de peso corpóreo, e preferivelmente 0,01 g a 10 mg diariamente ou dias alternados, ou podem ser divididos em um a três vezes por dia. Entretanto, desde que a quantidade possa ser aumentada ou diminuída de acordo com as vias de administração, severidade de obesidade, sexo, peso corpóreo, idade e semelhantes, a presente invenção não é limitada para a dose.[00118] Specifically, the effective amount of the compound according to the present invention can be changed according to a patient's age, sex and body weight, and generally administered in 0.01 g to 100 mg per kg of body weight, and preferably 0.01 g to 10 mg daily or every other day, or can be divided into one to three times a day. However, since the amount can be increased or decreased according to the routes of administration, severity of obesity, gender, body weight, age and the like, the present invention is not limited to the dose.

[00119] A presente invenção também provê um método para preparar um par variante de domínio CH3 (CH3 heterodimérico) incluindo os seguintes passos.[00119] The present invention also provides a method for preparing a CH3 domain variant pair (heterodimeric CH3) including the following steps.

[00120] O método inclui: (a) preparação de um par de mutação por i) em um primeiro grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consistindo de Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 e Lys409, substituindo pelo menos um aminoácido posicionado no primeiro grupo com um aminoácido sele-cionado a partir do grupo consistindo de alanina (A), treonina (T), serina (S), valina (V), metionina (M) e glicina (G); e ii) substituindo pelo menos um aminoácido posici-onado no primeiro grupo com um aminoácido selecionado a partir do grupo consis-tindo de fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W); (b) preparando par de mutação por i) em um segundo grupo de domínio CH3 selecionado a partir do grupo consis-tindo de Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 e Ser400, substituindo pelo menos um aminoácido posicionado no segundo grupo com lisina (K) ou arginina (R); e ii) substituindo pelo menos um aminoácido posicionado no segundo grupo com ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E); e (c) ligando os pares de mutação no Passo (a) e (b).[00120] The method includes: (a) preparing a mutation pair by i) in a first group of CH3 domain selected from the group consisting of Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 and Lys409 , replacing at least one amino acid positioned in the first group with an amino acid selected from the group consisting of alanine (A), threonine (T), serine (S), valine (V), methionine (M) and glycine (G ); and ii) replacing at least one amino acid positioned in the first group with an amino acid selected from the group consisting of phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W); (b) preparing mutation pair by i) in a second CH3 domain group selected from the group consisting of Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 and Ser400, substituting for least one amino acid positioned in the second group with lysine (K) or arginine (R); and ii) replacing at least one amino acid positioned in the second group with aspartic acid (D) or glutamic acid (E); and (c) linking the mutation pairs in Step (a) and (b).

[00121] A presente invenção também provê um método para preparar uma proteína de par Fc heterodimérico (dobradiça-CH2-CH3A e dobradiça-CH2-CH3B), o método incluindo: (d) preparando um vetor de expressão da proteína par Fc recom- binante incluindo ácidos nucléicos em que o par variante de domínio CH3 preparado é fusionado ao C-terminal de um domínio dobradiça-CH2 selvagem de região cons-tante de cadeia pesada de um anticorpo; (e) expressando a proteína do par Fc re- combinante por co-transformação do vetor de expressão preparado com células; e (f) purificando e recuperando a proteína de par do Fc recombinante co-expresso.[00121] The present invention also provides a method for preparing a heterodimeric Fc pair protein (hinge-CH2-CH3A and hinge-CH2-CH3B), the method including: (d) preparing a recom- mended Fc pair protein expression vector binary including nucleic acids in which the prepared CH3 domain variant pair is fused to the C-terminus of a wild-type hinge-CH2 domain of an antibody heavy chain constant region; (e) expressing the recombinant Fc pair protein by co-transforming the prepared expression vector with cells; and (f) purifying and recovering the co-expressed recombinant Fc pair protein.

Examples

[00122] De agora em diante, exemplos preferidos da invenção serão descri-tos para promover um entendimento da invenção. Entretanto, os seguintes exemplos devem ser considerados em um senso descritivo somente e o objetivo da invenção não é limitado aos seguintes exemplos.[00122] Hereafter, preferred examples of the invention will be described to further an understanding of the invention. However, the following examples are to be considered in a descriptive sense only and the scope of the invention is not limited to the following examples.

Example 1. CH3 domain variant design to increase the malleability of antibody heavy chain constant region heterodimer

[00123] A fim de induzir uma mutação de domínio CH3 para formação de um heterodímero de uma região constante de cadeia pesada (Fc) de uma anticorpo hu-mano IgG1, como descrito acima, primeiro, resíduos de um par aminoácido (interação não covalente) que principalmente atura em uma interação entre domínios CH3 foram analisados. Baseados nos resultados da análise, um par de mutação em cuja formação do homodímero entre domínios CH3 é excluído e formação do heterodíme- ro é termodinamicamente preferido foi desenhado. Isto é, a fim de aumentar uma interação seletiva entre o domínio CH3 (CH3A) de uma cadeia pesada e o domínio CH3 (CH3B) de outra cadeia pesada através de modificação de resíduos aminoáci- dos contribuindo para uma interação entre os domínios CH3, substituições da intera-ção não covalente formando resíduos aminoácidos foram induzidos em CH3A e CH3B, e assim formação de Fc heterodimérico CH3A:CH3B foi induzido. Neste caso, um par de mutação induzido em CH3A:CH3B heterogêneo foi desenhado tal que CH3A:CH3B seja formado em um alto rendimento e estavelmente mantido por em-pregar uma estratégia diferente que foi usada para um par de mutação para aumen-tar a formação do heterodímero de região constante de cadeia pesada revelado no documento ou patente relacionado. Também, a fim de minimizar o potencial de imu- nogenicidade, mutação de resíduos aminoácidos foi restrita aos resíduos na interface entre domínios CH3. Uma mutação em resíduos do sítio de ligação FcRn e FcRs foi excluída para manter uma função intrínseca de uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo (Roopenian e Akilesh 2007). Também, por avaliação de um rendimento de formação do Fc heterodimérico formado de CH3A:CH3B tendo um par de mutação mínima e CH3A:CH3B tendo uma combinação do mesmo, o desen-volvimento de um par de mutação CH3A:CH3B tendo o rendimento mais alto de for-mação do Fc heterodimérico foi tentado.[00123] In order to induce a CH3 domain mutation to form a heterodimer of a heavy chain constant region (Fc) of a human IgG1 antibody, as described above, first, residues of an amino acid pair (non-covalent interaction ) that mainly abides in an interaction between CH3 domains were analyzed. Based on the analysis results, a mutation pair in which homodimer formation between CH3 domains is excluded and heterodimer formation is thermodynamically preferred was designed. That is, in order to enhance a selective interaction between the CH3 domain (CH3A) of one heavy chain and the CH3 domain (CH3B) of another heavy chain through modification of amino acid residues contributing to an interaction between CH3 domains, substitutions of non-covalent interaction forming amino acid residues were induced in CH3A and CH3B, and thus formation of heterodimeric Fc CH3A:CH3B was induced. In this case, a heterogeneous CH3A:CH3B mutation-induced pair was designed such that CH3A:CH3B is formed in a high yield and stably maintained by employing a different strategy than was used for a mutation pair to enhance formation. of the heavy chain constant region heterodimer disclosed in the related document or patent. Also, in order to minimize potential immunogenicity, mutation of amino acid residues was restricted to residues at the interface between CH3 domains. A mutation in FcRn and FcRs binding site residues was deleted to maintain an intrinsic function of an antibody heavy chain constant region (Roopenian and Akilesh 2007). Also, by evaluating a yield of formation of the heterodimeric Fc formed from CH3A:CH3B having a minimal mutation pair and CH3A:CH3B having a combination thereof, the development of a CH3A:CH3B mutation pair having the highest yield of heterodimeric Fc formation was attempted.

[00124] Para este propósito, entre os resíduos aminoácidos posicionados na interface entre domínios CH3, pares de mutação 1) e 2) foram desenhados e cons- truídos; 1) o par de mutação em cujos resíduos contribuindo para formação de um homodímero domínio CH3 devido a uma interação eletrostática dentro da interface de domínio CH3 são substituídos com um par de mutação de resíduo aminoácido capaz de gerar um espaço complementar-interação hidrofóbica, e então formação do homodímero é excluído e formação do heterodímero é preferida, e 2) o par de muta-ção CH3 em que resíduos aminoácidos que não contribuem significativamente para formação do dímero entre domínios CH3 são substituídos com um par de mutação de resíduo aminoácido em que uma interação eletrostática de longa duração é sele-tivamente formada, e então formação do homodímero é excluído e formação do he- terodímero é termodinamicamente preferida.[00124] For this purpose, among the amino acid residues positioned at the interface between CH3 domains, mutation pairs 1) and 2) were designed and constructed; 1) the mutation pair whose residues contributing to formation of a CH3 domain homodimer due to an electrostatic interaction within the CH3 domain interface are replaced with an amino acid residue mutation pair capable of generating a complementary space-hydrophobic interaction, and then homodimer formation is excluded and heterodimer formation is preferred, and 2) the CH3 mutation pair in which amino acid residues that do not significantly contribute to dimer formation between CH3 domains are replaced with an amino acid residue mutation pair in which one long-term electrostatic interaction is selectively formed, and then homodimer formation is excluded and heterodimer formation is thermodynamically preferred.

[00125] Isto é, a fim de induzir um par de mutação espaço complementar- interação hidrofóbica seletivo dentro da interface de domínio CH3, posições e intera-ções dos resíduos aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos posicionados dentro da interface entre domínios CH3 foram analisados, e um par de mutação em cuja for-mação de uma interação hidrofóbica espacialmente seletiva para formação do hete- rodímero é preferido entre esses foi introduzido em CH3A:CH3B.[00125] That is, in order to induce a pair of complementary space mutation-selective hydrophobic interaction within the CH3 domain interface, positions and interactions of hydrophilic and hydrophobic amino acid residues positioned within the interface between CH3 domains were analyzed, and a mutation pair whose formation of a spatially selective hydrophobic interaction for heterodimer formation is preferred among these was introduced in CH3A:CH3B.

[00126] Também, a fim de induzir um novo par de mutação de interação ele-trostática de longa duração na interface de domínio CH3, exceto resíduos em uma região de ligação hidrofóbica dentro da interface e resíduos que tenha já participado na interação eletrostática, posições e interações de resíduos que estão na interface CH3 mas não têm interação com resíduos adjacentes, resíduos que interagem devido a uma ligação hidrogênio relativamente fraca ou uma interação de Van der Waals, e resíduos que têm uma distância de cadeia inter-lateral longa a partir de um resíduo relativamente adjacente e são inapropriados para a interação foram analisados. Um par mutacional em cuja formação de uma interação eletrostática de longa duração seletiva para formar o heterodímero entre esses é preferido foi introduzido em CH3A:CH3B, e então formação do heterodímero foi induzido.[00126] Also, in order to induce a new long-lasting electrostatic interaction mutation pair in the CH3 domain interface, except for residues in a hydrophobic binding region within the interface and residues that have already participated in the electrostatic interaction, positions and interactions of residues that are at the CH3 interface but have no interaction with adjacent residues, residues that interact due to a relatively weak hydrogen bond or a Van der Waals interaction, and residues that have a long inter-lateral chain distance from a relatively adjacent residue and are inappropriate for the interaction were analyzed. A mutational pair in which the formation of a selective long-lasting electrostatic interaction to form the heterodimer between these is preferred was introduced into CH3A:CH3B, and then heterodimer formation was induced.

[00127] Outro que resíduos aminoácidos de núcleo de interação hidrofóbica dentro da interface de domínio CH3, um par de mutação aminoácida capaz de gerar uma interação seletiva no lugar da interação eletrostática e um par de mutação ami- noácida em que uma nova interação eletrostática é introduzida na interface foram analisados e construídos como segue.[CH3A (Lys409Trp) : CH3B (Asp399Val, Phe405Thr)][00127] Other than core amino acid residues of hydrophobic interaction within the CH3 domain interface, an amino acid mutation pair capable of generating a selective interaction in place of electrostatic interaction and an amino acid mutation pair in which a new electrostatic interaction is introduced in the interface were analyzed and constructed as follows.[CH3A (Lys409Trp) : CH3B (Asp399Val, Phe405Thr)]

[00128] Lys409 em CH3A é posicionado dentro da interface do domínio CH3, e é adjacente a Leu368, Asp399, Phe405, e Tyr407 em CH3B. Entre esses, uma interação eletrostática entre Lys409 e Asp399 da oura cadeia contribui para uma interação entre domínios CH3. Asp399 em CH3B é adjacente a Lys393 e Lys409 em CH3A, e uma interação eletrostática entre eles contribui para a interação entre domínios CH3. Quando a interação eletrostática adjacente a um núcleo de interação hidrofóbica entre domínios CH3 é substituído para formar uma interação hi- drofóbica seletiva, a interação eletrostática existente que tenha contribuído para formação do homodímero entre domínios CH3 é removido, formação do heterodímero entre domínios CH3 é seletivamente induzido devido a um espaço de interação hi- drofóbica complementar, e então um aumento na maleabilidade do heterodímero pode ser esperada. Para este propósito, um par de mutação foi induzido em Lys409Trp em CH3A e Asp399Val em CH3B (FIG. 4).[00128] Lys409 in CH3A is positioned within the interface of the CH3 domain, and is adjacent to Leu368, Asp399, Phe405, and Tyr407 in CH3B. Among these, an electrostatic interaction between Lys409 and Asp399 of the other chain contributes to an interaction between CH3 domains. Asp399 in CH3B is adjacent to Lys393 and Lys409 in CH3A, and an electrostatic interaction between them contributes to the interaction between CH3 domains. When the electrostatic interaction adjacent to a core of hydrophobic interaction between CH3 domains is replaced to form a selective hydrophobic interaction, the existing electrostatic interaction that contributed to homodimer formation between CH3 domains is removed, heterodimer formation between CH3 domains is selectively removed. induced due to a complementary hydrophobic interaction space, and so an increase in heterodimer malleability can be expected. For this purpose, a mutation pair was induced in Lys409Trp in CH3A and Asp399Val in CH3B (FIG. 4).

[00129] Também, Phe405 em CH3B é adjacente a Lys392, Thr394, e Lys409 em CH3A, e formação do heterodímero pode ser inibida devido a uma colisão espacial entre uma cadeia lateral de Lys409Trp de CH3A em que uma mutação é induzida e uma grande cadeia lateral hidrofóbica de Phe405 é CH3B. Então, uma mutação Phe405Thr foi induzida para manter uma interação hidrofóbica enquanto senso espacialmente disposta com uma cadeia lateral.[00129] Also, Phe405 in CH3B is adjacent to Lys392, Thr394, and Lys409 in CH3A, and heterodimer formation may be inhibited due to a spatial collision between a side chain of Lys409Trp of CH3A in which a mutation is induced and a large chain hydrophobic side of Phe405 is CH3B. Then, a Phe405Thr mutation was induced to maintain a hydrophobic interaction while sensing spatially arranged with a side chain.

[00130] Quando Lys409 no domínio CH3A é substituído com triptofano (W), geração do homodímero entre domínio CH3A é inibida. Isto é porque não é possível manter a interação eletrostática existente de Lys409:Asp399 e uma disposição de espaço na interface do domínio CH3 é difícil devido a cadeias laterais de Phe405 e Tyr407 de outras cadeias adjacentes.[00130] When Lys409 in the CH3A domain is replaced with tryptophan (W), homodimer generation between CH3A domain is inhibited. This is because it is not possible to maintain the existing electrostatic interaction of Lys409:Asp399 and an arrangement of space at the interface of the CH3 domain is difficult due to side chains of Phe405 and Tyr407 of other adjacent chains.

[00131] Quando Asp399 no domínio CH3B é substituído com valina (V), a in-teração eletrostática existente de pares Asp399:Lys392 e Asp399:Lys409 é removida e então geração do homodímero pode ser relativamente inibida.[00131] When Asp399 in the CH3B domain is replaced with valine (V), the existing electrostatic interaction of Asp399:Lys392 and Asp399:Lys409 pairs is removed and thus homodimer generation can be relatively inhibited.

[00132] Também, quando Phe405 no domínio CH3B é substituído com treo- nina (T), não existe efeito de geração de inibição relativa do homodímero, mas a substituição pode contribuir para uma interação hidrofóbica com Lys409Trp no do-mínio CH3A quando o heterodímero é formado.[00132] Also, when Phe405 in the CH3B domain is replaced with threonine (T), there is no relative inhibition generation effect of the homodimer, but the substitution may contribute to a hydrophobic interaction with Lys409Trp in the CH3A domain when the heterodimer It is formed.

[00133] Então uma combinação de substituição de Lys409Trp no domínio CH3A e substituição Asp399Val no CH3B, e uma combinação de substituição Lys409Trp no domínio CH3A e substituição Phe405Thr no domínio CH3B mantém a distância mais apropriada entre uma interface de interação entre domínios CH3, e mantém uma interação hidrofóbica complementar. Então, geração do heterodímero de CH3A:CH3B é preferida.[CH3A (Lys360Glu) : CH3B (Gln347Arg)][00133] So a combination of Lys409Trp substitution in CH3A domain and Asp399Val substitution in CH3B, and a combination of Lys409Trp substitution in CH3A domain and Phe405Thr substitution in CH3B domain maintains the most appropriate distance between an interaction interface between CH3 domains, and maintains a complementary hydrophobic interaction. Therefore, CH3A:CH3B heterodimer generation is preferred.[CH3A (Lys360Glu) : CH3B (Gln347Arg)]

[00134] Lys360 em CH3A é posicionado fora da interface de domínio Ch3, e é adjacente às cadeias laterais de Gln347 e Tyr349 em CH3B. Lys360 contribui para a interação entre domínios CH3 com ligação de hidrogênio muito fraca devido a uma longa distância. Então, quando resíduo de Lys360 em CH3A e Gln347 em Ch3B são mudados para resíduos aminoácidos opostamente carregados tendo uma grande cadeia lateral, formação do heterodímero é preferido devido a interação eletrostática de longa duração. Então, quando Lys360 em CH3A é substituído com Glu, e Gln347 em CH3B é substituída com arginina (R), formação de CH3A:CH3B é preferido devi-do a uma interação entre Glu360 em CH3A e Arg347 em CH3B. Entretanto, em CH3B, formação do homodímero é inibida devido a repulsão eletrostática do par Lys360:Gln347Arg (FIG. 5). [CH3A (Gln347Glu) : CH3B (Lys360)][00134] Lys360 in CH3A is positioned outside the Ch3 domain interface, and is adjacent to the side chains of Gln347 and Tyr349 in CH3B. Lys360 contributes to the interaction between CH3 domains with very weak hydrogen bonding due to a long distance. Therefore, when residue Lys360 in CH3A and Gln347 in Ch3B are changed to oppositely charged amino acid residues having a large side chain, heterodimer formation is preferred due to long-term electrostatic interaction. So, when Lys360 in CH3A is substituted with Glu, and Gln347 in CH3B is substituted with arginine (R), formation of CH3A:CH3B is preferred due to an interaction between Glu360 in CH3A and Arg347 in CH3B. However, in CH3B, homodimer formation is inhibited due to the electrostatic repulsion of the Lys360:Gln347Arg pair (FIG. 5). [CH3A (Gln347Glu) : CH3B (Lys360)]

[00135] Similar a interação fraca entre as cadeias laterais de Lys360 no do-mínio CH3A e Gln347 no domínio CH3B, ligação de hidrogênio fraca de longa dura-ção entre uma cadeia lateral Gln347 no domínio CH3A e uma cadeia lateral Lys360 no domínio CH3B contribui para a interação entre domínios CH3. Então, quando re-síduos são mudados para resíduo aminoácido carregado opostamente, uma intera-ção eletrostática de relativamente longa duração é introduzida para ajudar na forma-ção do heterodímero. Neste caso, a fim de usar junto com o par de mutação de Lys360Glu no domínio CH3A e Gln347Arg no domínio CH3B, Gln347 no domínio CH3A foi substituído com Glu para interagir com Lys360 no domínio CH3B (FIG. 6).[00135] Similar to the weak interaction between the side chains of Lys360 in the CH3A domain and Gln347 in the CH3B domain, long-term weak hydrogen bonding between a Gln347 side chain in the CH3A domain and a Lys360 side chain in the CH3B domain contributes for the interaction between CH3 domains. Then, when residues are changed to the oppositely charged amino acid residue, a relatively long-term electrostatic interaction is introduced to aid in heterodimer formation. In this case, in order to use together with the mutation pair of Lys360Glu in the CH3A domain and Gln347Arg in the CH3B domain, Gln347 in the CH3A domain was replaced with Glu to interact with Lys360 in the CH3B domain (FIG. 6).

[00136] Então, no par de mutação de Lys360Glu no domínio CH3A e Gln347Arg no domínio CH3B e o par de mutação de Gln347Glu no domínio CH3A e Lys360 no domínio CH3B, formação do heterodímero é preferida devido a cada inte-ração eletrostática, formação do homodímero é inibido entre domínios CH3A devido a uma força eletrostática repulsiva entre Gln347Glu e Lys360Glu, e formácão do homodímero é inibido entre domínios CH3B devido a uma força repulsiva eletrostáti-ca entre Gln347Arg e Lys360.[CH3A (Tyr349Ser) : CH3B (Glu357Trp)][00136] So, in the mutation pair of Lys360Glu in the CH3A domain and Gln347Arg in the CH3B domain and the mutation pair of Gln347Glu in the CH3A domain and Lys360 in the CH3B domain, heterodimer formation is preferred due to each electrostatic interaction, formation of the Homodimer formation is inhibited between CH3A domains due to a repulsive electrostatic force between Gln347Glu and Lys360Glu, and homodimer formation is inhibited between CH3B domains due to a repulsive electrostatic force between Gln347Arg and Lys360.[CH3A (Tyr349Ser) : CH3B (Glu357Trp)]

[00137] Tyr349 em CH3A é posicionado fora da interface domínio CH3, e é adjacente às cadeias laterais de Ser354, Asp356, Glu357, e Lys360 em CH3B. Glu357 em CH3B é posicionado fora da interface domínio CH3, é adjacente às ca-deias laterais de Tyr459 e Lys370 em CH3A e participa na interação entre domínios CH3 de acordo com uma interação eletrostática de longa duração com Lys370.[00137] Tyr349 in CH3A is positioned outside the CH3 domain interface, and is adjacent to the side chains of Ser354, Asp356, Glu357, and Lys360 in CH3B. Glu357 in CH3B is positioned outside the CH3 domain interface, is adjacent to the side chains of Tyr459 and Lys370 in CH3A, and participates in the interaction between CH3 domains according to a long-term electrostatic interaction with Lys370.

[00138] Então, quando Tyr349 em CH3A é substituído com serina (S), e Glu357 em CH3B é substituído com triptofano (W), a interação eletrostática existente entre GLu357 em CH3B e Lys370 em CH3A é removido e formação de CH3A:CH3B é preferido devido a uma interação complementar dependendo dos tamanhos das cadeias laterais entre Tyr349Ser e Glu357Trp em CH3A (FIG. 7).[00138] So, when Tyr349 in CH3A is replaced with serine (S), and Glu357 in CH3B is replaced with tryptophan (W), the existing electrostatic interaction between Glu357 in CH3B and Lys370 in CH3A is removed and formation of CH3A:CH3B is preferred due to a complementary interaction depending on the sizes of the side chains between Tyr349Ser and Glu357Trp in CH3A (FIG. 7).

[00139] Também, Glu357Trp é Ch3B remove a interação eletrostática com Lys370 em CH3A, e é adjacente ao Tyr349 em CH3B. Então, uma disposição espa-cial na interface do domínio se torna difícil, e então formação do homodímero entre domínios CH3B pode ser inibida.[CH3A (Ser354Cys) : CH3B (Tyr349Cys) / CH3A (Tyr349Cys) : CH3B (Ser354Cys)][00139] Also, Glu357Trp is Ch3B removes electrostatic interaction with Lys370 in CH3A, and is adjacent to Tyr349 in CH3B. Then, spatial arrangement at the domain interface becomes difficult, and then homodimer formation between CH3B domains can be inhibited.

[00140] Ser354 no domínio CH3A é adjacente ao Tyr349 no domínio CH3B, e quando os dois resíduos são substituídos com cisteína (C), uma ponte dissulfeto entre os domínios é formada. Quando a ponte de dissulfeto é introduzida, o hetero- dímero formado pode ser estabilizado. Desde que uma ponte de dissulfeto introduzi-da é posicionada assimetricamente na interface domínio CH3, ela ajuda a aumentar um rendimento de produção de heterodímero. Substituição do resíduo Tyr349 no domínio CH3A e resíduo Ser354 no domínio CH3B com cisteína (C) pode funcionar similarmente ao acima.[00140] Ser354 in the CH3A domain is adjacent to Tyr349 in the CH3B domain, and when the two residues are replaced with cysteine (C), a disulfide bridge between the domains is formed. When the disulfide bridge is introduced, the formed heterodimer can be stabilized. Since an introduced disulfide bridge is positioned asymmetrically at the CH3 domain interface, it helps to increase a heterodimer production yield. Replacement of residue Tyr349 in the CH3A domain and residue Ser354 in the CH3B domain with cysteine (C) may work similarly to the above.

Example 2. Construction method of CH3 domain mutation to increase the malleability of the antibody heavy chain constant region heterodimer

[00141] O par de mutação do domínio CH3 desenhado no Exemplo 1 foi construída como CH3A:CH3B composto sozinho ou em uma combinação do mesmo, e 5 tipos de pares heterodímeros CH3A:CH3B foram construídos. A fim de estabilizar o par heterodímero construído e aumentar o rendimento de produção heterodí- mera, dois tipos de mutações em que a ponte dissulfeto é introduzida foram construídas (FIG. 11 e Tabela 1).[00141] The CH3 domain mutation pair drawn in Example 1 was constructed as CH3A:CH3B compound alone or in a combination thereof, and 5 types of CH3A:CH3B heterodimer pairs were constructed. In order to stabilize the constructed heterodimer pair and increase the yield of heterodimer production, two types of mutations in which the disulfide bridge is introduced were constructed (FIG. 11 and Table 1).

[00142] Em mutações CH3A e CH3B, DNA foi sintetizado (Bioneer, Coréia) para induzir a mutação desenhada baseada nas sequências bases do domínio CH3 da região constante de cadeia pesada de IgG1. As sequências bases foram avaliadas através de sequenciamento (Macrogen, Coréia), e os pares de mutação CH3A:CH3B construídos são mostrados na seguinte Tabela 1.Tabela 1 Pares de mutação (CH3A: CH3B) construídos para formar heterodímeros de domínio CH3 humano e pares de mutação introduzidos em cada domínio.

[00142] In CH3A and CH3B mutations, DNA was synthesized (Bioneer, Korea) to induce the mutation designed based on the base sequences of the CH3 domain of the constant region of the heavy chain of IgG1. The base sequences were evaluated by sequencing (Macrogen, Korea), and the CH3A:CH3B mutation pairs constructed are shown in the following Table 1.Table 1 Mutation pairs (CH3A:CH3B) constructed to form human CH3 domain heterodimers and pairs of mutation introduced in each domain.

Example 3. Construction of the system to evaluate the malleability of the CH3 domain variant heterodimer prepared in the present invention

[00143] A fim de avaliar o rendimento da formação do heterodímero da mu-tação do domínio CH3 preparado no Exemplo, clonando em um vetor de expressão animal foi feito tal que o domínio CH3A construído pode ser expresso em uma forma scFv-Fc e o dominio CH3B pode ser expresso em uma forma de Fc-artificial (FIGS. 13 e 14). Um anticorpo scFv usado é um anticorpo em que as regiões VH e VL de hAY4a, que é um anticorpo humanizado de afinidade melhorada hAY4 especifica-mente ligando a DR4, são conectados (Lee, Park e colaboradores, 2010).[00143] In order to evaluate the yield of heterodimer formation from the CH3 domain mutation prepared in the Example, cloning into an animal expression vector was done such that the constructed CH3A domain could be expressed in an scFv-Fc form and the CH3B domain can be expressed in an artificial-Fc form (FIGS. 13 and 14). A scFv antibody used is an antibody in which the VH and VL regions of hAY4a, which is an affinity-enhanced humanized antibody hAY4 specifically binding DR4, are connected (Lee, Park et al., 2010).

[00144] O hAY4a scFv-Fc e o Fc-artificial foram clonados em pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, EUA), que é um vetor de expressão de célula animal tendo um promotor CMV, para ter uma sequência sinal-hAY4a-scFv-dobradiça-CH2-CH3 ou uma se-quência sinal-dobradiça-CH2-CH3 usando um SacI/XbaI in-frame.[00144] The hAY4a scFv-Fc and the Fc-artificial were cloned into pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, USA), which is an animal cell expression vector having a CMV promoter, to have a signal sequence-hAY4a- scFv-hinge-CH2-CH3 or a signal-hinge-CH2-CH3 sequence using an in-frame SacI/XbaI.

[00145] Como descrito acima, quando o domínio CH3A é expresso na forma scFv-Fc e o domínio CH3B é expresso na forma Fc-artificial, pode ser entendido que rendimentos de formação do homodímero e o heterodímero no anticorpo purificado podem ser avaliados por SDS-PAGE. Este usa um princípio que desde que a forma scFv-Fc tem um peso molecular maior que a forma Fc-artificial, o homodímero scFc- Fv, scFv-Fc/Fc-artificial, e o homodímero Fc-artifical tem pesos moleculares diferen-tes, e que podem ser distinguidos dependendo em uma diferença de uma distância do movimento de banda em SDS-PAGE (FIG. 15). A seguinte Tabela 2 mostra os pares de domínio variante CH3 scFv-Fc/Fc-artifical. Formas de expressão scFv-Fc e Fc-artifical para avaliar a maleabilidade do heterodímero da região constante de ca-deia pesada incluindo o par de mutação de domínio CH3 construído são mostradas. kiH foi usado como um grupo controle.Tabela 2 Pares de mutação usados para sistema para avaliar a maleabilidade do he- terodímero.

[00145] As described above, when the CH3A domain is expressed in the scFv-Fc form and the CH3B domain is expressed in the Fc-artificial form, it can be understood that yields of formation of the homodimer and the heterodimer in the purified antibody can be evaluated by SDS -PAGE. This uses a principle that since the scFv-Fc form has a higher molecular weight than the Fc-artificial form, the scFc-Fv homodimer, scFv-Fc/Fc-artificial, and the Fc-artificial homodimer have different molecular weights , and which can be distinguished depending on a difference of a distance of band movement in SDS-PAGE (FIG. 15). The following Table 2 shows the scFv-Fc/Fc-artificial CH3 variant domain pairs. Artificial scFv-Fc and Fc-Fc expression forms for assessing the malleability of the heavy-chain constant region heterodimer including the constructed CH3 domain mutation pair are shown. kiH was used as a control group.Table 2 Mutation pairs used for system to assess heterodimer malleability.

Example 4. Example and purification of antibody including CH3 domain variant

[00146] Usando um sistema HEK293-F (Invitrogen), uma cadeia pesada in- cluindo cada variante de plasmídeo CH3A construído no Exemplo 3 e uma cadeia pesada incluindo o variante CH3B foram transientemente transfectados para gerar um anticorpo biespecífico. EM um frasco de agitação ou um fermentador com agitação, células HEK293-F (Invitrogen) que são suspensas e crescem em um meio de expressão FreeStyle 293 sem soro (Invitrogen) foram transfectadas com uma mistura de dois plasmídeos de expressão e polietilenimina (PEI, Polyscience). Células HEK293-F foram plaqueadas nos frascos de agitação de 1 L (Corning) em uma densidade de 1,0E*6 células/mL em 200 mL, e cultivadas a 120 rpm, 8% de CO2. Um dia depois, em uma densidade celular de 2,0E*6 células/mL na mesma proporção molar, as células foram transfectadas com cerca de 21 mL de mistura de 10 mL de meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen) e 10 mL de meio de expressão FreeStyle 293 + 800 PEI (4/mL), que contém um total de 400 (2/mL) de plamídeos de DNAs codificando uma cadeia pesada incluindo o variante CH3A e uma cadeia pesada incluindo o variante CH3B. Um sobrenadante foi coletado cinco dias depois.[00146] Using a HEK293-F system (Invitrogen), a heavy chain including each CH3A plasmid variant constructed in Example 3 and a heavy chain including the CH3B variant were transiently transfected to generate a bispecific antibody. In a shake flask or a stirred fermenter, HEK293-F cells (Invitrogen) that are suspended and grown in serum-free FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen) were transfected with a mixture of two expression plasmids and polyethylenimine (PEI, Polyscience). HEK293-F cells were plated into the 1 L shake flasks (Corning) at a density of 1.0E*6 cells/ml in 200 ml, and grown at 120 rpm, 8% CO2. One day later, at a cell density of 2.0E*6 cells/ml at the same molar ratio, the cells were transfected with about 21 ml of a mixture of 10 ml of FreeStyle 293 expression medium (Invitrogen) and 10 ml of medium expression tube FreeStyle 293 + 800 PEI (4/ml), which contains a total of 400 (2/ml) plasmid DNAs encoding one heavy chain including the CH3A variant and one heavy chain including the CH3B variant. A supernatant was collected five days later.

[00147] Com referência a um protocolo padrão, uma proteína foi purificada a partir do sobrenadante de cultura de célula coletada. Anticorpos foram aplicados a uma coluna de Sefarose A de proteína (GE Healthcare), e lavados com PBS (pH 7.4). Os anticorpos foram eluídos em pH 3.0 usando solução tampão de glicina 0,1 M, e então a amostra foi imediatamente neutralizada usando uma solução tampão Tris 1 M. Frações de anticorpo eluídas foram concentradas usando uma centrífuga concentradora MILLIPORE Amicon Ultra (10 MWCO) após a solução tampão ser mudada para PBS (pH 7.4) usando uma Coluna Pierce Dextran Desalinizada (5K MWCO). Anticorpos variantes Fc purificados foram quantificados através da técnica BCA.[00147] With reference to a standard protocol, a protein was purified from the collected cell culture supernatant. Antibodies were applied to a protein Sepharose A column (GE Healthcare), and washed with PBS (pH 7.4). Antibodies were eluted at pH 3.0 using 0.1 M glycine buffer solution, and then the sample was immediately neutralized using 1 M Tris buffer solution. Eluted antibody fractions were concentrated using a MILLIPORE Amicon Ultra concentrator centrifuge (10 MWCO) after the buffer solution is changed to PBS (pH 7.4) using a Pierce Dextran Desalted Column (5K MWCO). Purified Fc variant antibodies were quantified using the BCA technique.

Example 5. Evaluation of malleability of antibody heterodimer including CH3 domain variant, yield comparison, and analysis of protein secondary structure and FcRn binding ability.

[00148] 10 g do anticorpo em que o par de mutação CH3 purificado no Exemplo 4 é introduzido foi analisado por SDS-PAGE sob condições não redutoras de 12% (FIG. 16). O homodímero da variante CH3A foi observado a 103 kD, o ho- modímero da variante CH3B foi observado a 53 kD, o monômero do variante Ch3B foi observado a 25 kD, e o heterodímero da variante CH3A e variante CH3B foi ob-servado em 78 kD.[00148] 10 g of the antibody into which the purified CH3 mutation pair in Example 4 is introduced was analyzed by SDS-PAGE under 12% non-reducing conditions (FIG. 16). CH3A variant homodimer was observed at 103 kD, CH3B variant homodimer was observed at 53 kD, Ch3B variant monomer was observed at 25 kD, and CH3A variant and CH3B variant heterodimer was observed at 78 kD. kd.

[00149] Foi confirmado que, quando os plasmídeos de DNA incluindo a ca-deia pesada incluindo o variante CH3A e a cadeia pesada incluindo o variante CH3B foram transientemente transfectados na mesma concentração molar, e expressos e purificados, maleabilidade do heterodímero do mutante aumentou comparada ao grupo controle (o heterodímero em que o domínio CH3 selvagem é introduzido). Foi confirmado que variantes EW-RVT e EEW-RVT em que dois pares foram unidos ti-veram a maleabilidade do heterodímero que ainda aumentou em cerca de 91% comparado ao variante E-R e o variente W-VT. Os dois variantes mostraram uma maleabilidade do heterodímero mais aumentada que aquela do grupo controle, cerca de 86% de "knob-into-hole" (Tabela 3). Também, uma quantidade pequena de um monômero Fc foi observada em todos os variantes incluindo um anticorpo selvagem. Isto é considerado ser causado por uma diferença do grau de expressão entre as cadeias pesadas.[00149] It was confirmed that when DNA plasmids including the heavy chain including the CH3A variant and the heavy chain including the CH3B variant were transiently transfected at the same molar concentration, and expressed and purified, malleability of the mutant heterodimer increased compared to to the control group (the heterodimer into which the wild-type CH3 domain is introduced). It was confirmed that EW-RVT and EEW-RVT variants in which two pairs were joined had heterodimer malleability which further increased by about 91% compared to the E-R variant and the W-VT variant. The two variants showed a greater malleability of the heterodimer than that of the control group, about 86% of "knob-into-hole" (Table 3). Also, a small amount of an Fc monomer was seen in all variants including a wild-type antibody. This is considered to be caused by a difference in the degree of expression between the heavy chains.

[00150] Também, foi confirmado que o variante E-R tem maleabilidade do heterodímero scFv-Fc/Fc de cerca de 53%, e o variante W-VT tem uma maleabilidade do heterodímero scFv-Fc/Fc de cerca de 77%. Uma interação eletrostática de longa duração recém adicionada pode contribuir a um aumento na maleabilidade do heterodímero. Entretanto, pode ser entendido que uma estratégia que a interação existente aplicada para maleabilidade do homodímero dentro da interface é removida e um espaço complementar-interação hidrofóbica seletiva é adicionada e relati-vamente contribui consideravelmente para um aumento na maleabilidade do hetero-dímero.[00150] Also, it was confirmed that the E-R variant has a scFv-Fc/Fc heterodimer malleability of about 53%, and the W-VT variant has a scFv-Fc/Fc heterodimer malleability of about 77%. A newly added long-term electrostatic interaction may contribute to an increase in heterodimer malleability. However, it can be understood that a strategy that the existing interaction applied for homodimer malleability within the interface is removed and a complementary space-selective hydrophobic interaction is added and relatively contributes considerably to an increase in heterodimer malleability.

[00151] Também, foi confirmado que, quando duas estratégias são simulta-neamente feitas, maleabilidade do heterodímero é ainda promovida que quando a estratégia que um espaço complementar-interação hidrofóbica adicional é introduzi-da na interface do domínio CH3 ou a estratégia que um novo par de interação ele-trostática de longa duração é adicionalmente introduzida na interface é feita sozinha.[00151] Also, it was confirmed that when two strategies are simultaneously made, malleability of the heterodimer is further promoted than when the strategy that a complementary space-additional hydrophobic interaction is introduced at the interface of the CH3 domain or the strategy that a new pair of long-lasting electrostatic interaction is additionally introduced into the interface is done alone.

[00152] Também, a proteína do dímero Fc da região constante da cadeia pesada em que o par de mutação CH3 construído é introduzido é bem purificado com uma resina proteína A similar à região constante da cadeia pesada Fc selvagem. Isto indica o fato que a mutação introduzida no par da mutação CH3 não tem influência a interação entre a proteína A e a região constante da cadeia pesada.[00152] Also, the Fc dimer protein of the heavy chain constant region into which the constructed CH3 mutation pair is introduced is well purified with a protein A resin similar to the wild-type Fc heavy chain constant region. This indicates the fact that the mutation introduced in the CH3 mutation pair does not influence the interaction between protein A and the constant region of the heavy chain.

[00153] Também, um anticorpo selvagem e o heterodímero purificados inclu-indo a mutação do domínio CH3 de 0,1 g foram observados em um western blot sob condições não redutoras e redutoras (FIGS. 17 e 18). Um gel em que SDS-PAGE é feito por método acima foi movido em um filme PVDF, e um IgG anti-humano de ca-bra (Sigma) e um IgG anti-cabra HRP (SantaCruz) foram marcados, detectados por um reagente PowerOpti-ECL (Animal Genetics Inc), e analisados por ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare). Formação do heterodímero foi observada em um western blot. Pode ser entendido a partir do resultado que, similar ao resultado ob-servado por SDS-PAGE (FIG. 16), comparado ao variante E-R, o variante W-VT e "knob-into-hole" (grupo controle), a formação do homodímero do variante EW-RVT e EEW-RVT em que dois pares são unidos foi inibida.[00153] Also, a wild-type antibody and purified heterodimer including the 0.1 g CH3 domain mutation were observed in a western blot under non-reducing and reducing conditions (FIGS. 17 and 18). A gel on which SDS-PAGE is done by the above method was moved onto a PVDF film, and a goat anti-human IgG (Sigma) and a goat anti-human IgG HRP (SantaCruz) were stained, detected by a PowerOpti reagent. -ECL (Animal Genetics Inc), and analyzed by ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare). Heterodimer formation was observed on a western blot. It can be understood from the result that, similar to the result observed by SDS-PAGE (FIG. 16), compared to the E-R variant, the W-VT variant and "knob-into-hole" (control group), the formation of the EW-RVT and EEW-RVT variant homodimer in which two pairs are joined was inhibited.

[00154] Foi confirmado no experimento acima que, quando a interação exis-tente aplicada para maleabilidade do homodímero dentro da interface é removida e um espaço complementar-interação hidrofóbica seletiva é adicionado, esta estratégia relativamente ainda contribui para um aumento na maleabilidade do heterodíme- ro que quando uma interação eletrostática de longa duração é recém adicionada (FIG. 16). Então, um variante SW-WVT em que um par de ligação do espaço com-plementar adicional (Tyr349Ser:Glu357Trp) é unido ao variante W-VT construído e maleabilidade do heterodímero foi observada (FIG. 19). Foi confirmado que o variante SW-WVT tem levemente menos maleabilidade do homodímero que o variante EW-RVT, mas tem maleabilidade do heterodímero de cerca de 89% devido ao mo- nômero Fc observado (Tabela 3). Isto é causado por uma diferença de grau de expressão entre cadeias pesadas. Se uma proporção molar de um plasmídeo é regulada quando a transfecção é feita, um aumento na maleabilidade do heterodímero pode ser esperada.[00154] It was confirmed in the above experiment that when the existing interaction applied for homodimer malleability within the interface is removed and a complementary space-selective hydrophobic interaction is added, this strategy relatively still contributes to an increase in heterodimer malleability. than when a long-term electrostatic interaction is just added (FIG. 16). Then, a SW-WVT variant in which an additional complementary space binding pair (Tyr349Ser:Glu357Trp) is joined to the W-VT variant constructed and malleability of the heterodimer was observed (FIG. 19). It was confirmed that the SW-WVT variant has slightly less homodimer malleability than the EW-RVT variant, but has a heterodimer malleability of about 89% due to the observed Fc monomer (Table 3). This is caused by a difference in the degree of expression between heavy chains. If a molar ratio of a plasmid is regulated when transfection is done, an increase in heterodimer malleability can be expected.

[00155] Também, a ponte de dissulfeto foi introduzida no variante EW-RVT e o variante SW-WVT, e maleabilidade do heterodímero foi comparada (FIG. 19). No variante EW-RVT, uma interação eletrostática de longa duração por par de mutação E-R introduzido (Lys360Glu:Gln347Arg) é assimetricamente provido para a região externa da interface do domínio CH3. Então, a fim de introduzir a ponte dissulfeto em uma região oposta em que não há interação eletrostática, uma mutação Tyr349Cys foi introduzida no domínio CH3A, e uma mutação Ser354Cys foi introduzida no do-mínio CH3B. Quando a ponte dissulfeto é introduzida no variante SW-WVT, a fim de não influenciar a ligação do espaço complementar introduzida pelo par de mutação S-W (Tyr349Ser:Glu357W), uma mutação Ser354Cys foi introduzida no domínio CH3A, e uma mutação Tyr349Cys foi introduzida no domínio CH3B. A ponte dissul- feto foi gerada na interface do domínio CH3 oposto a uma posição do par de mutação S-W.[00155] Also, the disulfide bridge was introduced in the EW-RVT variant and the SW-WVT variant, and malleability of the heterodimer was compared (FIG. 19). In the EW-RVT variant, a long-lasting electrostatic interaction per introduced E-R mutation pair (Lys360Glu:Gln347Arg) is asymmetrically provided to the outer region of the CH3 domain interface. Then, in order to introduce the disulfide bridge in an opposite region where there is no electrostatic interaction, a Tyr349Cys mutation was introduced in the CH3A domain, and a Ser354Cys mutation was introduced in the CH3B domain. When the disulfide bridge is introduced in the SW-WVT variant, in order not to influence the binding of the complementary space introduced by the S-W mutation pair (Tyr349Ser:Glu357W), a Ser354Cys mutation was introduced in the CH3A domain, and a Tyr349Cys mutation was introduced in the CH3B domain. The disulphide bridge was generated at the interface of the CH3 domain opposite a position of the S-W mutation pair.

[00156] O variante em que a ponte dissulfeto é introduzida tem maior capa-cidade de formação de heterodímero que o variante em que nenhuma ponte dissul- feto é introduzida, em cerca de 3% em EW-RVT, e cerca de 9% em SW-WVT (Tabela 3). Foi confirmada que introdução da ponte de dissulfeto contribui a um aumento na capacidade de formação de heterodímero. Foi observado por SDS-PAGE que o variante e que a ponte de dissulfeto é introduzido tem um tamanho menor que o va-riante em que nenhuma ponte dissulfeto é introduzida. É determinado que isto é porque o heterodímero tem uma forma relativamente densa devido a ponte dissulfeto sob condições SDS desnaturantes e então mostra uma diferença de habilidade de movimento em PAGE, não por causa de uma diferença de tamanho real do hetero- dímero em um estado natural.[00156] The variant in which the disulphide bridge is introduced has a greater capacity for heterodimer formation than the variant in which no disulphide bridge is introduced, in about 3% in EW-RVT, and about 9% in SW-WVT (Table 3). It was confirmed that introduction of the disulfide bridge contributes to an increase in heterodimer forming capacity. It was observed by SDS-PAGE that the variant in which the disulfide bridge is introduced has a smaller size than the variant in which no disulfide bridge is introduced. It is determined that this is because the heterodimer has a relatively dense shape due to disulfide bonding under denaturing SDS conditions and therefore shows a difference in movement ability on PAGE, not because of an actual size difference of the heterodimer in a natural state. .

[00157] Também, o heterodímero em que cada mutação é inclusa é repeti-damente expressa e purificada, e uma densidade de cada banda em SDS-PAGE foi analisado usando um programa ImageJ (Wayne Rasband, NIH). Como um resultado, pode ser entendido que uma produção de formação do heterodímero incluindo a mu-tação EW-RVT e EEW-RVT é cerca de 90 a 95%, que é maior que aquela do rendi-mento de um heterodímero "knob-into-hole" (o grupo controle positivo existente), isto é, cerca de 85 a 90% (Tabela 3). No seguinte Tabela 3, maleabilidade do heterodí- mero das regiões constantes de cadeia pesada incluindo o par de mutação de domí-nio CH3 é comparada, KiH foi usado como um grupo controle, e valores resultantes foram representados como um erro padrão da média (média S.E.M.) após o experi-mento ser independentemente feito três ou mais vezes.Tabela 3 Rendimen to de Heterodímero (análise do resultado de SDS-PAGE)

[00157] Also, the heterodimer in which each mutation is included is repeatedly expressed and purified, and a density of each band on SDS-PAGE was analyzed using an ImageJ program (Wayne Rasband, NIH). As a result, it can be understood that a yield of heterodimer formation including EW-RVT and EEW-RVT mutation is about 90 to 95%, which is higher than that of a "knob-into" heterodimer yield. -hole" (the existing positive control group), i.e. about 85 to 90% (Table 3). In the following Table 3, heterodimer malleability of the heavy chain constant regions including the CH3 domain mutation pair is compared, KiH was used as a control group, and resulting values were plotted as a standard error of the mean (mean SEM) after the experiment is independently done three or more times.Table 3 Heterodimer Yield (SDS-PAGE result analysis)

[00158] Um rendimento de expressão de uma proteína heterodímera incluin-do o variante do domínio CH3 foi observado (Tabela 4). Transfecção transiente com células HEK293 foi feita, e expressão foi feita em uma solução de cultura (verca de 20 mL) por 5 dias. Uma concentração e um volume da proteína sob término do pro-cesso de purificação foram quantificados para calcular um rendimento de expressão da proteína. O experimento foi repetido 3 a 5 vezes e resultados foram representados como um erro padrão da média (média S.E.M.).[00158] An expression yield of a heterodimer protein including the CH3 domain variant was observed (Table 4). Transient transfection with HEK293 cells was done, and expression was done in a culture solution (20 ml verca) for 5 days. A concentration and a volume of the protein upon completion of the purification process were quantified to calculate a protein expression yield. The experiment was repeated 3 to 5 times and results were represented as a standard error of the mean (mean S.E.M.).

[00159] O resultado mostrou que a proteína heterodímera incluindo o varian-te domínio CH3 tem um rendimento que é levemente menos que o heterodímero incluindo o domínio CH3 selvagem e é similar a ou levemente maior que o "knob- into-hole" (grupo controle). Consequentemente, pode ser determinado que o par de mutação introduzido no domínio CH3 não significativamente inibe a estabilidade da proteína, comparado ao anticorpo selvagem.Tabela 4 Rendimento da proteína total (scFc-Fc/Fc-heterodímero, célula HEK293, ~5 dias de expressão)

[00159] The result showed that the heterodimer protein including the CH3 domain variant has a yield that is slightly less than the heterodimer including the wild-type CH3 domain and is similar to or slightly greater than the "knob-into-hole" (group control). Consequently, it can be determined that the mutation pair introduced in the CH3 domain does not significantly inhibit protein stability, compared to the wild-type antibody.Table 4 Total protein yield (scFc-Fc/Fc-heterodimer, HEK293 cell, ~5 days of expression )

[00160] Dicroísmo circular foi medido a fim de avaliar se uma estrutura de proteína secundária do domínio CH3 incluindo o par de mutação é conservado o mesmo como uma proteína de estrutura secundária do domínio CH3 selvagem. Cada do domínio CH3A e o domínio CH3B foi construído como um vetor Fc-artificial, e um dímero de domínio Fc foi produzido e usado para análise (FIG. 14). O espectrô- metro Chirascan plus (Applied Photophysics, RU) foi usado, e uma análise de temperatura foi 25o C. Como uma medida da solução tampão, PBS (pH 7.4) foi usado. Análise foi feita em uma variação de 195 nm a 260 nm.[00160] Circular dichroism was measured in order to assess whether a CH3 domain secondary structure protein including the mutation pair is conserved the same as a wild-type CH3 domain secondary structure protein. Each of the CH3A domain and the CH3B domain was constructed as an artificial Fc-vector, and an Fc domain dimer was produced and used for analysis (FIG. 14). The Chirascan plus spectrometer (Applied Photophysics, UK) was used, and a temperature analysis was 25o C. As a measure of the buffer solution, PBS (pH 7.4) was used. Analysis was done in a range from 195 nm to 260 nm.

[00161] Como um resultado, pode ser entendido que o dímero Fc incluindo o domínio CH3 em que o par de mutação EW-RVT é introduzido tem a mesma elipci- dade do resíduo médio como o dímero Fc incluindo o domínio CH3 selvagem. Isto indica que não existe mudança na estrutura secundária da proteína mesmo quando o par de mutação é introduzido (FIG. 20).[00161] As a result, it can be understood that the Fc dimer including the CH3 domain into which the EW-RVT mutation pair is introduced has the same average residue ellipcity as the Fc dimer including the wild-type CH3 domain. This indicates that there is no change in the secondary structure of the protein even when the mutation pair is introduced (FIG. 20).

[00162] Também, a fim de avaliar se o anticorpo incluindo o domínio CH3 em que o par de mutação é introduzido mantém a habilidade de ligação ao FcRn comparado ao anticorpo incluindo o domínio CH3 selvagem, ressonância de plas-mon de superfície (SPR) foi feita. Biacore 2000 (GE Healthcare, EUA) foi usado. Uma habilidade de ligação ao scFcRn (Feng e colabodores, 2011) foi analisada com respeito ao anticorpo heterodímero incluindo o variante CH3 do par de mutação EW- RVT e o grupo controle, isto é, Remicade (Inflilximab, Janssen Biotech) que é um anticorpo IgG1 incluindo o domínio CH3 selvagem. scFcRn foi diluído em uma solu-ção tampão Na-acetato 10 mM (pH 4.0), e fixado a um chip sensor CM5 (GE Heal-thcare, EUA) em cerca de 1000 unidades de resposta (UR). Como uma solução tampão de corrida, um PBS (pH 6.0) em que 0,005% de Tween 20 foi incluso e uma solução tampão HBS-EP (pH 7.4) foram usados. A mutação CH3 foi analisada em concentrações de 0,625, 1,25, 2,5 e 5 μM.[00162] Also, in order to assess whether the antibody including the CH3 domain into which the mutation pair is introduced maintains the FcRn binding ability compared to the antibody including the wild-type CH3 domain, surface plasmon resonance (SPR) was made. Biacore 2000 (GE Healthcare, USA) was used. An ability to bind to scFcRn (Feng et al., 2011) was analyzed with respect to the heterodimer antibody including the CH3 variant of the EW-RVT mutation pair and the control group, i.e., Remicade (Inflilximab, Janssen Biotech) which is an antibody IgG1 including wild-type CH3 domain. scFcRn was diluted in a 10 mM Na-acetate buffer solution (pH 4.0), and fixed to a CM5 sensor chip (GE Healthcare, USA) at approximately 1000 response units (RU). As a running buffer, a PBS (pH 6.0) in which 0.005% Tween 20 was included and an HBS-EP buffer solution (pH 7.4) were used. The CH3 mutation was analyzed at concentrations of 0.625, 1.25, 2.5 and 5 μM.

[00163] Como um resultado, foi confirmado que o anticorpo incluindo o do-mínio CH3 em que o par de mutação é introduzido mantém a habilidade de ligação ao FcRn, similar ao anticorpo incluindo o domínio CH3 selvagem (FIG. 21).[00163] As a result, it was confirmed that the antibody including the CH3 domain in which the mutation pair is introduced retains the FcRn binding ability, similar to the antibody including the wild-type CH3 domain ( FIG. 21 ).

Example 6. Expression analysis and purification of bispecific anti-DR4 x DR5 scFv-Fc antibody using CH3 domain variant in which the antibody forms scFv anti-DR4 x DR5 is fused

[00164] Um anticorpo hAY4a scFv humanizado (Lee, Park e colaboradores. 2010) especificamente se liga a um antígeno alvo DR4, e um anticorpo AU5H scFv de afinidade melhorada de um anticorpo HW1 scFv humano (Park, Lee e colabora-dores, 2007) especificamente se liga a um antígeno alvo DR5 foram fusionados ao N-terminal de Fc em que o variante do domínio CH3 é usado para construir o anti-corpo biespecífico (FIG. 22A).[00164] A humanized hAY4a scFv antibody (Lee, Park et al. 2010) specifically binds to a DR4 target antigen, and an affinity-enhanced AU5H scFv antibody of a human HW1 scFv antibody (Park, Lee et al., 2007 ) specifically binds to a DR5 target antigen were fused to the N-terminus of the Fc in which the CH3 domain variant is used to construct the bispecific antibody (FIG. 22A).

[00165] Neste caso, o par de mutação usado foi o par EW-RVT, o anticorpo biespecífico na forma scFv-Fc construída foi expresso e purificado usando o método como no Exemplo 5, e uma proteína foi analisada por SDS-PAGE. Foi confirmado que, comparado ao anticorpo na forma scFv-Fc em que o "knob-into-hole" é introdu-zido (grupo controle), o anticorpo biespecífico na forma scFv-Fc anti-DR4 x DR5 e que o par mutacional é introduzido enquanto sendo unido na forma de um dímero ou sem cortes de subprodutos devido à instabilidade da proteína (FIG. 22B).[00165] In this case, the mutation pair used was the EW-RVT pair, the bispecific antibody in the constructed scFv-Fc form was expressed and purified using the method as in Example 5, and a protein was analyzed by SDS-PAGE. It was confirmed that, compared to the antibody in scFv-Fc form in which the "knob-into-hole" is introduced (control group), the bispecific antibody in scFv-Fc form anti-DR4 x DR5 and that the mutational pair is introduced while being joined in the form of a dimer or uncut by-products due to protein instability ( FIG. 22B ).

[00166] Também, a fim de medir um estado de ligação do anticorpo biespe- cífico, HPLC (The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, USA) foi usado para fazer cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 10/300GL, GE Healthcare, Suécia). Como uma solução tampão de eluição, PBS (pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Fosfato, 2,7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., EUA) foi usado e uma ta xa de fluxo foi de 0,5 mL/min. Um marcador de tamanho de proteína, IgG (150 kD), albumina (66 kDa), e proteína anidrase carbônica (29 kDa) foram utilizados. Foi con-firmado que, comparado ao anticorpo na forma scFv-Fc em que o knob-into-hole é introduzido (grupo controle), o anticorpo na forma scFv-Fc anti-DR4-DR5 biespecífi- co em que o par mutacional M7 é introduzido foi purificado enquanto sendo unido na forma de um dímero ou sem cortes de subprodutos devido à instabilidade da proteína na cromatografia de tamanho de exclusão (FIG. 22C).[00166] Also, in order to measure a bispecific antibody binding state, HPLC (The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, USA) was used to perform size exclusion chromatography (Superdex 10/300GL, GE Healthcare, Sweden). As an elution buffer, PBS (pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA) was used and a flow rate was 0.5 mL/min . A protein size marker, IgG (150 kDa), albumin (66 kDa), and protein carbonic anhydrase (29 kDa) were used. It was confirmed that, compared to the antibody in scFv-Fc form in which the knob-into-hole is introduced (control group), the antibody in scFv-Fc form anti-DR4-DR5 bispecific in which the mutational pair M7 is introduced was purified while being joined in the form of a dimer or uncut by-products due to instability of the protein on size exclusion chromatography (FIG. 22C).

Example 7. Preparation of scFab-Fc anti-DR4 x DR5 bispecific antibody using a CH3 domain variant in which an antibody in scFab form anti-DR4 x DR5 is fused and analysis of the antigen-binding ability of the bispecific antibody

[00167] O par de mutação CH3 preparado foi introduzido para construir um anticorpo biespecífico na forma de scFab-Fc (scIgG). Os anticorpos parentais usados foram o anticorpo humanizado hAY4a e o anticorpo AU5H, que são os mesmos como aqueles no anticorpo na forma scFv-Fc biespecífica no Exemplo 6. Uma cadeia Fab simples (scFab) em que um domínio VH-CH e um domínio VL-CL são conectados por 26 cadeias aminoácidas foi fusionada no N-terminal de Fc (FIG. 23A).[00167] The prepared CH3 mutation pair was introduced to construct a bispecific antibody in the form of scFab-Fc (scIgG). The parental antibodies used were the humanized hAY4a antibody and the AU5H antibody, which are the same as those in the antibody in bispecific scFv-Fc form in Example 6. A single chain Fab (scFab) in which a VH-CH domain and a VL domain -CL are connected by 26 amino acid chains was fused at the N-terminus of Fc (FIG. 23A).

[00168] Neste caso, o par de mutação usado foi o par EW-RVT. O anticorpo na forma scFab-Fc biespecífico construído foi expresso e purificado usando o método como no Exemplo 6, e a proteína foi analisada por SDS-PAGE. Foi confirmado que, sob condições não redutoras, o anticorpo na forma scFab-Fc biespecífico em que o par mu- tacional é introduzido foi purificado principalmente como um anticorpo unido na forma de um bivalente desejado, similar ao anticorpo biespecífico em que o "knob-into-hole" é introduzido (grupo controle), e sob condições redutoras, o monômero do anticorpo bies- pecífico desejado foi purificado sem agregação ou clivagem 9FIG. 23B).[00168] In this case, the mutation pair used was the EW-RVT pair. The constructed antibody in bispecific scFab-Fc form was expressed and purified using the method as in Example 6, and the protein was analyzed by SDS-PAGE. It was confirmed that, under non-reducing conditions, the antibody in the bispecific scFab-Fc form in which the mutational pair is introduced was purified mainly as a joined antibody in the form of a desired bivalent, similar to the bispecific antibody in which the "knob- into-hole" is introduced (control group), and under reducing conditions, the desired bispecific antibody monomer was purified without aggregation or cleavage 9FIG. 23B).

[00169] A fim de medir uma habilidade de ligação biespecífica do anticorpo variante Fc biespecífico purificado, uma ensaio de imunoadsorção enzimático (ELISA) foi feito. Moléculas alvos BSA, DR4, e DR5 e os grupos controles DcR1 e DcR2 foram unidos em uma placa EIA/RIA de 96 poços (COSTAR Corning In., EUA) a 37o C por 1 hora, e então lavada com 0,1% PBST (0,1% Tween 20, pH 7.4, 137 mM de NaCl, 10 mM de Fosfato, 2,7 mM de KCl, SIGMA-ALDRICH co. EUA) três vezes por 10 minutos. A mostra foi combinada com 5% de leite desnatado (5% de leite desnatado, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM de Fosfato, 2,7 mM de KCl, SIGMA-ALDRICH co., EUA) por 1 hora, e então lavada com 0,1% de PBST (0,1% de Tween 20, pH 7.4, 137 mM de NaCl, 10 mM de Fosfato, 2,7 mM de KCl, SIGMA-ALDRICH co., EUA) três vezes por 10 minutos. O anticorpo Fc variante biespecífico purificado foi unido e então lavado com 0,1% PBST três vezes por 10 minutos. A amostra foi combinada com mAb anti-humano conjugado a fosfatase (Sigma, EUA), e então reagido com pNPP (palmitato de p-nitrofenila, SIGMA- ALDRICH co. EUA) e absorbância a 405 nm foi medida. De acordo com o resultado do ELISA, foi confirmado que a forma scFv-Fc expressa e purificada e anticorpos na forma scFab-Fc biespecíficos têm especificidade para moléculas alvo DR4 e DR5, respectivamente (FIG. 23C). Os anticorpos na forma scFv-Fc e forma scFab-Fc biespecíficos em que o par mutacional M7 é introduzido teve uma força de ligação às moléculas alvo DR4 e DR5 que é similar ao anticorpo biespecífico em que o "knob-into-hole" é introduzido (grupo controle). Especificidade às moléculas alvo foi mantida sem reatividade cruzada em DcR1 e DcR2. Consequentemente, foi confirmado que introdução do par de mutação de domínio CH3 melhorado não teve influência na habilidade de ligação de um sítio de ligação de antígeno.[00169] In order to measure a bispecific binding ability of the purified bispecific variant Fc antibody, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was done. BSA, DR4, and DR5 target molecules and DcR1 and DcR2 control groups were pooled in a 96-well EIA/RIA plate (COSTAR Corning In., USA) at 37°C for 1 hour, then washed with 0.1% PBST (0.1% Tween 20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co. USA) three times for 10 minutes. The sample was combined with 5% skim milk (5% skim milk, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA) for 1 hour, then washed with 0.1% PBST (0.1% Tween 20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA) three times for 10 minutes . Purified bispecific variant Fc antibody was pooled and then washed with 0.1% PBST three times for 10 minutes. The sample was combined with phosphatase-conjugated anti-human mAb (Sigma, USA), and then reacted with pNPP (p-nitrophenyl palmitate, SIGMA-ALDRICH co. USA) and absorbance at 405 nm was measured. According to the ELISA result, it was confirmed that the expressed and purified scFv-Fc form and bispecific scFab-Fc form antibodies have specificity for DR4 and DR5 target molecules, respectively ( FIG. 23C ). Antibodies in the bispecific scFv-Fc form and scFab-Fc form in which the M7 mutational pair is introduced had a binding strength to target molecules DR4 and DR5 that is similar to the bispecific antibody in which the "knob-into-hole" is introduced (group control). Specificity to target molecules was maintained without cross-reactivity in DcR1 and DcR2. Consequently, it was confirmed that introduction of the enhanced CH3 domain mutation pair had no influence on the binding ability of an antigen binding site.

Example 8. Evaluation of the cytotoxicity of a scFv-Fc and scFab-Fc bispecific anti-DR4 x DR5 antibody using CH3 domain variant in which the anti-DR4 x DR5 antibody is fused

[00170] A fim de verificar uma atividade de morte de célula cancerígena dos anticorpos scFv-Fc e scFab-Fc anti-DR4 x DR5 preparados no Exemplo 6 e Exemplo 7, um experimento de citotoxidade (ensaio MTT) foi feito em linhagens celulares de uma célula cancerígena derivada de humano HCT116 (carcinoma coloretal) e HeLa (adenocarcinoma).[00170] In order to verify a cancer cell killing activity of the scFv-Fc and scFab-Fc anti-DR4 x DR5 antibodies prepared in Example 6 and Example 7, a cytotoxicity experiment (MTT assay) was performed on cell lines of a human-derived cancer cell HCT116 (colorectal carcinoma) and HeLa (adenocarcinoma).

[00171] Especificamente, linhagens de células cancerígenas foram plaquea- das em uma placa de 96 poços em uma densidade de 1x104 células por poço, culti-vadas em um incubador com 5% de CO2 a 37oC por 1,5 dias, e os anticorpos paren-tais, anticorpo hAY4a IgG anti-DR4 humanizado e anticorpo AU5H-scFv anti-DR5 humano, anticorpos nas formas scFv-Fc e scFab-Fc biespecíficos preparados, e Li- gante indutor de apoptose relacionado a receptor de TNF (TRAIL) que é um ligante de DR4 e DR5 servindo como um grupo controle positivo foram cultivados em uma incubadora por 20 horas. Neste caso, o TRAIL expresso e purificado em E. coli foi usado. Então, um tratamento de uma solução de MTT (Sigma) de 5 mg/mL foi apli-cada a 20 μL por poço, a amostra foi cultivada por 34 horas, a solução de cultura no poço foi removida, formazan foi dissolvido em DMSO (100 μL), a absorbância do formazan dissolvido foi medida a 595 nm para quantificar a citotoxidade.[00171] Specifically, cancer cell lines were plated in a 96-well plate at a density of 1x104 cells per well, cultured in a 5% CO2 incubator at 37oC for 1.5 days, and the antibodies parenteral antibodies, humanized hAY4a IgG anti-DR4 antibody and AU5H-scFv anti-human DR5 antibody, antibodies in prepared bispecific scFv-Fc and scFab-Fc forms, and TNF receptor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) that is a DR4 ligand and DR5 serving as a positive control group were grown in an incubator for 20 hours. In this case, TRAIL expressed and purified in E. coli was used. Then, a 5 mg/mL MTT (Sigma) solution treatment was applied at 20 μL per well, the sample was cultured for 34 hours, the culture solution in the well was removed, formazan was dissolved in DMSO ( 100 μL), the absorbance of dissolved formazan was measured at 595 nm to quantify cytotoxicity.

[00172] Como um resultado, pode ser entendido que os anticorpos biespecí- ficos de duas formas tiveram atividade de morte de célula cancerígena qua os anti-corpos parentais, anticorpo hAY4 IgG humanizado e um anticorpo AU5G-scFv hu-mano, e tiveram uma citotoxidade que é similar a outra mais excelente que o TRAIL usado como controle positivo (FIG. 24).[00172] As a result, it can be understood that the bispecific antibodies of two forms had cancer cell killing activity as the parental antibodies, humanized hAY4 IgG antibody and a human AU5G-scFv antibody, and had a cytotoxicity which is similar to one more excellent than TRAIL used as a positive control (FIG. 24).

[00173] A seguinte Tabela 5 mostra heterodímeros dos domínios CH3 de an-ticorpo e sequência de informação dos pares heterodiméricos da presente invenção.Tabela 5

[00173] The following Table 5 shows antibody CH3 domain heterodimers and sequence information of the heterodimeric pairs of the present invention.Table 5

[00174] Enquanto a invenção tem sido descrita com respeito às modalidades específicas acima, deve ser reconhecido que várias modificações e mudanças podem ser feitas à invenção por aqueles versados na técnica que também estão dentro do objetivo da invenção como definido pelas reivindicações em anexo.[00174] While the invention has been described with respect to the specific embodiments above, it should be recognized that various modifications and changes can be made to the invention by those skilled in the art which are also within the scope of the invention as defined by the appended claims.

Claims

1. Heterodimer CHARACTERIZED in that it comprises a first peptide chain and a second peptide chain of human IgG1, said first peptide chain comprising a first CH3 domain and said second peptide chain comprising a second CH3 domain, wherein Lys409 of the first CH3 domain is replaced by tryptophan (W), and Asp399 and Phe405 of the second CH3 domain are replaced by valine (V) and threonine (T), respectively, and the heterodimer comprises a bond between said W and an amino acid selected from said V and said T, and (a) Tyr349 of one of the CH3 domains is replaced by serine (S), and Glu357 of the other CH3 domain is replaced by tryptophan (W), and the heterodimer comprises a bond between said W and said S; (b) Lys360 of one of the CH3 domains is replaced by glutamic acid (E), and Gln347 of the other CH3 domain is replaced by arginine (R), and the heterodimer comprises a bond between said E and said R; or (c) Gln347 and Lys360 of one of the CH3 domains are each replaced by glutamic acid (E), and Gln347 of the other CH3 domain is replaced by arginine (R), and the heterodimer comprises a bond between one of said E and the says R; and wherein the positions are numbered according to the EU index with reference to human IgG1.

2. Heterodimer, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that the first domain CH3 comprises substitutions of Lys360Glu and Lys409Trp and the second domain CH3 comprises substitutions of Gln347Arg, Asp399Val and Phe405Thr.

3. Heterodimer according to claim 2, CHARACTERIZED by the fact that the first CH3 domain comprises substitutions of Gln347Glu, Lys360Glu and Lys409Trp, and the second CH3 domain comprises substitutions of Gln347Arg, Asp399Val and Phe405Thr.

4. Heterodimer, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that Tyr349 and Lys409 of the first CH3 domain are replaced by serine (S) and tryptophan (W), respectively, and Glu357, Asp399 and Phe405 of the second CH3 domain are replaced by tryptophan (W), valine (V) and threonine (T), respectively.

5. Heterodimer, according to claim 1, CHARACTERIZED by the fact that it further comprises the following amino acid substitutions: a substitution of position Tyr349 of one of the CH3 domains by cysteine (C), and a substitution of position Ser354 of the other CH3 domain by cysteine (C), in which the heterodimer comprises a bond between the cystines, and in which the positions are numbered according to the EU index.

6. Heterodimeric Fc protein pair CHARACTERIZED by the fact that it comprises the heterodimer, as defined in claim 1.

7. Bispecific antibody CHARACTERIZED by the fact that it comprises the heterodimeric Fc protein pair, as defined in claim 6, in which the antibody is selected from the group consisting of: (a) scFv-Fc having a structure in which two scFvs, each having an antigen specificity different from the other, are fused to the N-terminus or C-terminus of the heterodimeric Fc protein pair; (b) scIgG(scFab-Fc) having a structure in which two different scFabs are fused to the heterodimeric Fc protein pair; (c) (Fv)2-Fc having a structure in which a heavy chain variable region and a light chain variable region that pair to bind a first antigen are fused to the N-terminus of the heterodimeric Fc protein pair, and a variable region from another heavy chain and a variable region from another light chain that pair to bind a second antigen are fused to the C-terminus of the heterodimeric Fc protein pair, and (d) mAb-Fv being a monoclonal antibody fused to the variable region bispecific in which a single variable antigen binding domain of a heavy chain or a single variable antigen binding domain of a light chain are fused to the C-terminus of the IgG heavy chains of the heterodimeric Fc protein pair.

8. Monovalent antigen binding antibody CHARACTERIZED by the fact that it comprises the heterodimeric Fc protein pair, as defined in claim 6, the antibody being in an Fv-Fc form in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), where it binds to a single antigen, are fused to the N-terminus or C-terminus of the heterodimeric Fc protein pair, and where the monovalent antigen-binding antibody is capable of monovalently binding to the single antigen.

9. Fusion protein CHARACTERIZED by the fact that it comprises at least two proteins and the Fc heterodimeric protein pair, as defined in claim 6, in which at least two proteins are linked to the N-terminus or the C-terminus of the protein pair Heterodimeric Fc.

10. Pharmaceutical composition CHARACTERIZED by the fact that it comprises the heterodimeric Fc protein pair, as defined in claim 6, and a pharmaceutically acceptable vehicle.

11. Pharmaceutical composition CHARACTERIZED by the fact that it comprises the biospecific antibody, as defined in claim 7, and a pharmaceutically acceptable vehicle.

12. Pharmaceutical composition CHARACTERIZED by the fact that it comprises the monovalent antigen binding antibody, as defined in claim 8, and a pharmaceutically acceptable vehicle thereof.

13. Pharmaceutical composition CHARACTERIZED by the fact that it comprises the fusion protein, as defined in claim 9, and a pharmaceutically acceptable vehicle.

14. Method for preparing a heterodimeric Fc protein pair, CHARACTERIZED by the fact that the method comprises: transforming a host cell with the expression vector encoding the heterodimeric Fc protein pair, as defined in claim 6; culturing the transformed host cell to produce the heterodimeric Fc protein pair as defined in claim 6; and purifying and recovering the heterodimeric Fc protein pair.