BR112014014756B1 - Método in vitro, e, uso in vitro de um ou mais organoides - Google Patents

Abstract

ENSAIO PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA OU AFLIÇÃO, USO DE UM OU MAIS ORGANOIDES, E, ENSAIO PARA VARREDURA DE UMA BIBLIOTECA DE COMPOSTO. A invenção refere-se a um ensaio para diagnosticar uma doença ou aflição que afeta a absorção ou a secreção de fluido ou para estudar a eficácia de uma ou mais drogas para tratar a doença ou aflição em que o ensaio compreende medir a dilatação de um ou mais o organoides.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se a um ensaio para a homeostase de fluido e eletrólito em um método de cultura com base em organoide.

FUNDAMENTO

[0002] As funções de regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR) como um canal de ânion e é essencial para a homeostase de fluido e eletrólito em superfícies epiteliais de muitos órgãos, incluindo pulmão e intestino. O distúrbio recessivo autossômico fibrose cística (CF) é causado por mutações do gene CFTR. A doença CF é altamente variável e os pacientes têm uma expectativa de vida média de aproximadamente 40 anos. As mutações de perda de função causam transporte de íon e fluido alterado, que resulta no acúmulo de muco viscoso no trato pulmonar e gastrointestinal. Isto é associado com as infecções bacterianas, inflamação e má nutrição aberrante. Mais de 1.500 mutações foram descritas, mas a mutação mais dominante (~67 % dos alelos mutantes totais em todo o mundo) é uma anulação de fenilalanina na posição 508 (CFTR-delF508). Isto causa má dobra, retenção de ER e degradação precoce da proteína CFTR que evita a função na membrana plasmática. Outras mutações no gene de CFTR foram observadas em pacientes com CF também prejudicam a dobra de proteína ou prejudicam a produção de proteína, passagem, condutância, união e/ou interações com outras proteínas.

[0003] A terapia corrente contra CF é principalmente sintomática e foca na redução da pressão bacteriana, inflamação e normalização da absorção de nutriente e desenvolvimento físico. Recentemente, os compostos múltiplos foram identificados alvejando os defeitos específicos de mutação da proteína de CFTR por si só. Os ensaios clínicos são correntemente realizados usando-se os compostos que induzem i) leitura de códon de interrupção de prematuro, ii) correção do tráfego de membrana de plasmade CFTR (corretores) e iii) intensificar a passagem de CFTR (potenciadores). Recentemente, um ensaio clínico de fase III foi completado de maneira bem sucedida por um potenciador em pacientes com CF com uma mutação de CFTR-G551D, demonstrando que o alvejamento de fármaco específico de mutação é praticável em CF. As combinações de corretores e potenciadores são correntemente estimados em um ensaio de fase II para o grupo de paciente dominante que abriga a mutação de CFTR-delF508.

[0004] Embora estes desenvolvimento recentes são muito promissores, o nível de restauração funcional de CFTR por estes fármacos em sistemas de modelo in vitro adicionalmente é limitado. Além disso, os pacientes mostram respostas variáveis para estas terapias devido adicionalmente a mecanismos não definidos. A incapacidade de selecionar estes subgrupos que não respondem limitam a eficácia clínica e o registro de fármaco. Juntos, isto indica que o desenvolvimento de novos compostos e avaliações eficientes de eficácia de fármaco no nível de pacientes individuais, bem como a avaliação de bibliotecas grandes para identificar novos compostos são urgentemente necessários. Desta maneira, não existem modelos celulares preliminares disponíveis para avaliar como os compostos que restauram a função CFTR mutante, apenas as linhas celulares transformadas foram usadas para identificar os compostos e sua eficácia. Um modelo in vitro que permite a expansão e a manutenção de células humanas primárias permitirão a análise da resposta de fármaco de pacientes individuais e identificar subgrupos de pacientes responsivos para cada tratamento. Além disso, isto permitirá a avaliação de bibliotecas de novos fármacos para seu efeito em células primárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A invenção fornece um ensaio para diagnosticar uma doença ou aflição que afeta a absorção ou secreção de fluido e para o estudo da eficácia de uma ou mais fármacos para tratar a doença ou aflição, em que o ensaio compreende medir a dilatação de um ou mais organoides.

[0006] O termo “ensaio” é pretendido ser equivalente ao “método”. Desta maneira, a invenção também fornece um método para diagnosticar uma doença ou aflição que afeta a absorção ou secreção de fluido e para o estudo da eficácia de uma ou mais fármacos para tratar a doença ou aflição, em que o método compreende medir a dilatação de um ou mais organoides.

[0007] A invenção fornece um ensaio quantitativo rápido e simples para a função de CFTR (ou outras doenças ou aflição que afeta a absorção ou secreção de fluido) em um método de cultura fundamentado em cripta intestinal primário15-17. Este método de cultura permite que as células tronco intestinais expandam em organoides fechados contendo estruturas semelhantes a cripta e um lúmen interno revestido por células diferenciadas, recapitulando a arquitetura de tecido in vivo. O CFTR intestinal é predominantemente expressado na membrana apical das células de cripta onde sua ativação conduz a secreção de eletrólitos e fluidos18-20. A Forscolina21 foi observada induzir a dilatação rápida de controle saudável tanto humano (HC) quanto organoides do tipo selvagem de murino que depende completamente do CFTR, como demonstrado pelo estímulo de organoides intestinais derivados de camundongos deficientes em CFTR ou pacientes com CF ou na inibição química de CFTR do tipo selvagem. Os nívies de dilatação induzida por forscolina por organoides retais expandidos in vitro são comparáveis com as correntes de ânion induzidas por forscolina medidas em biópsias retais humanas ex vivo. A temperatura e a correção química da função de F508del-CFTR foi facilmente detectada pela medição de transporte de fluido com base em organoide e respostas a um painel de fármacos que restauram CFTR foram variáveis entre os organoides retais derivados de pacientes homozigotos F508del diferentes. Este ensaio robusto é a primeira leitura funcional desenvolvida em organoides humanos e facilitará o diagnóstico, estudos funcionais, desenvolvimento de fármaco e medicina personalizada para CF e outras doenças e aflições relacionadas.

Organoides

[0008] O termo “organoide” refere-se a uma coleta in vitro de células que assemelham-se com suas contra-partes in vivo e formam estruturas 3D. Desta maneira, o ensaio é um ensaio ex vivo ou um ensaio in vitro.

[0009] Em algumas formas de realização, os organoides do ensaio são organoides de mamífero, por exemplo, organoides humanos ou murinos, isto é, estes são derivados de células retiradas de um mamífero. O mamífero pode ser qualquer mamífero de interesse, por exemplo, um ser humano ou camundongo. Em algumas formas de realização os organoides são não humanos. Em uma forma de realização preferida, os organoides são humanos.

[0010] Em algumas formas de realização, os organoides do ensaio são organoides epiteliais ou organoides endoteliais. Em uma forma de realização preferida os organoides são organoides epiteliais. Em algumas formas de realização, os organoides não compreendem células não epiteliais, isto é, o único tipo celular presente no organoide é uma célula epitelial.

[0011] Os organoides do ensaio tipicamente compreendem um lúmen, preferivelmente um lúmen fechado. As células do organoide tipicamente formam uma camada epiteliais ou camada endotelial em torno do lúmen e das células da camada epitelial ou camada endotelial são polarizados. Por polarizado é entendido que a camada epitelial ou endotelial imita a funcionalidade de uma camada epitelial ou camada endotelial in vivo tal que este tem uma lateral basolateral (revestimento exterior) e uma lateral apical funcional (revestimento do lúmen). Uma disposição polarizada funcional é importante para o ensaio porque isto significa que todos os canais de íon são orientados na mesma direção de modo que a absorção ou a secreção de fluido ocorre de uma maneira consistente, permitindo que a dilatação ocorra.

[0012] Em algumas formas de realização, os organoides do ensaio são organoides gástricos, intestinais (por exemplo, de intestino delgado, colônico, reto, duodeno ou íleo), pancreático, próstata, pulmão, mama, rim, vaso sanguíneo ou de vaso linfático. Isto tipicamente significa que os organoides são derivados de células gástricas, intestinais (por exemplo, de intestino delgado, colônico, reto, duodeno ou íleo), pancreático, próstata, pulmão, mama, rim, vaso sanguíneo ou de vaso linfático respectivamente. Entretanto, a pessoa habilitada entenderá que estas podem ser maneiras alternativas de geração de um organoide tendo um genotipo e fenotipo in vivo. Desta maneira, um organoide que tem o genotipo e o fenotipo in vivo do intestino, é, para os propósitos desta invenção compreendidos dentro da definição de um organoide intestinal. O mesmo aplica-se a outros tipos de organoide listados acima. Em algumas formas de realização, o um ou mais organoides são organoides intestinais ou de pulmão.

[0013] O termo “assemelha-se” significa que o organoide tem características genéticas e fenotípicas que permitem que isto seja reconhecido pela pessoa habilitada como sendo de ou associado com o tipo de tecido particular (tal como os tecidos listados acima). Isto não significa que o organoide deve ser necessariamente ser genética e fenotipicamente idêntico (ou mais ou menos assim) ao tipo de célula de tecido in vivo correspondente. Entretanto, em uma forma de realização preferida, os organoides usados no ensaio compreendem células que são genética e fenotipicamente estáveis com relação à célula ou células in vivo que o organoide foi derivado. Por genética e fenotipicamente estável, é entendido que não existe manipulação genética envolvida, apenas um número mínimo de mutações (isto é, próximo ao número normal que deve ser esperado em células in vivo, por exemplo, durante a replicação e a síntese de DNA).

[0014] As linhas celulares e as células iPS não são genética e fenotipicamente estáveis de acordo com esta definição, por exemplo, células MDCK (por exemplo, como descrito em Yang et al., J am Soc Nephrol 19(7) 1300-1310, 2008) não são genética e fenotipicamente estáveis. Tradicionalmente, as linhas celulares são mais recentemente células iPS cells que foram usadas como modelo de célula/órgão ex vivo (por exemplo, Currid et al. J. Physiol. 555, 241-250, 2003) e/ou modelos de doença (por exemplo, ver Robinton et al. Nature 481, 295, 2012; Yang et al., J am Soc Nephrol 19(7) 1300-1310, 2008). Entretanto, tradicionalmente, estas células sofreram diversos desafios e desvantagens. Por exemplo, as linhas celulares não podem sempre ser obtidas a partir de todos os pacientes (apenas certas biópsias resultam em linhas celulares bem sucedidas porque apenas de maneira infrequente ou frequente após períodos prolongados de tempo, as células começarão a proliferar permitindo que estas sejam passadas para se tornarem uma linha celular; estas linhas celulares, tipicamente, compreendem mutações que compreendem tipicamente mutações que permitem imortalidade) e, portanto, as linhas celulares não podem ser usadas em diagnóstico e medicina personalizados e são, em geral, prognosticadores deficientes de resposta terapêutica, por exemplo, na avaliação de fármaco. As células de iPS, usualmente, também requerem algum nível de manipulação genética para reprogramar as células em fatos celulares específicos. Alternativamente, estes estão sujeitos às condições de cultura que afetam a integridade carotípica ou genética e assim, o tempo na cultura deve ser mantido a um mínimo (este também é o caso para células tronco embriônicas humanas). Isto significa que as células iPS não podem representar a situação in vivo mas, em vez disso, são uma tentativa de imitar o comportamento de células in vivo. As linhas celulares e as células iPS também sofrem de instabilidade genética. Os organoides preferidos para o uso no ensaio da invenção fornecem uma plataforma genética e fenotipicamente estável que representa fielmente a situação in vivo. A integridade genética das células tronco da invenção pode ser confirmada, por exemplo, pela análise carotípica ou análise de sequenciamento. As células podem ser cariotipadas usando-se os métodos conhecidos como descrito em Sato, T et al., (células tronco Lgr5 simples construíram as estruturas de cripto-villus in vitro sem um nicho mesenquimal. Nature 459, 262-265, 2009). um “cariotipo normal” é um onde todos os cromossomos estão presentes (isto é euploidia) sem alterações perceptíveis. Consequentemente, em formas de realização preferidas, mais do que 50 %; mais do que 70 %; mais do que 80 %; mais do que 90 %; mais do que 95 % ou mais do que 99 % das células em um organoide apresenta cariotipos normais. Um “fenotipo normal” refere-se às células que apresentam, em uma primeira aproximação, as mesmas características visuais, expressão genética e comportamento como a célula de contraparte in vivo média. Em formas de realização preferidas da invenção mais do que 50 %; mais do que 70 %; mais do que 80 %; mais do que 90 %; mais do que 95 %; ou mais do que 99 % das células em um organoide cultivado de acordo com a invenção apresenta fenotipos normais. Os exemplos de organoides genética e fenotipicamente adequados para o uso com o ensaio da invenção e métodos de obter tais organoides são fornecidos no WO2010/090513, WO2012/168930 e Sato et al., GASTROENTEROLOGY 2011;141:1762-1772. As células destes organoides têm um genoma particularmente estável e têm uma taxa mutacional baixa. Por exemplo, os organoides intestinais podem ser expandiso, mantidos e diferenciados de acordo com os métodos descritos nestas aplicações.

[0015] Em algumas formas de realização, os organoides intestinais (tais como organoides de intestino delgado) são obtidos usando-se um meio de cultura para criptas de intestino delgado, tais como criptas de intestino delgado humano, que compreende ou consiste de um meio basal, (por exemplo, que consiste de Advanced DMEM/F12 suplementado com penicilina/estreptomicina, 10 mM de HEPES, Glutamax, 1x N2, 1x B27 (todos da Invitrogen) e 1 mM de N-acetilcisteína (Sigma)) e que compreende, adicionalmente: um fator de desenvolvimento mitogênico tal como EGF; um inibidor BMP, tal como Noggin; e qualquer um ou mais de Rspondin 1-4, tal como Rspondin-1 ou 4. Em algumas formas de realização, este meio de cultura adicionalmente compreende um inibidor TGF-beta (tal como A83-01) e/ou um inibidor p38 (tal como SB202190). Em algumas formas de realização, organoides intestinais (tal como organoides colônicos) são obtidos usando um meio de cultura para criptas colônicas, tal como criptas colônicas humanas, que compreendem ou que consistem de um meio basal, por exemplo, como descrito acima, adicionalmente que compreende: um agonista Wnt, tal como meio condicionado Wnt-3A ou Wnt-3A recombinante; fator de desenvolvimento mitogênico, tal como EGF; um inibidor BMP, tal como Noggin; e qualquer um de Rspondin 1-4, tal como Rspondin-1 ou 4 humano. Em algumas formas de realização, este meio de cultura adicionalmente compreende um inibidor TGF-beta (tal como A83-01) e/ou um inibidor p38 (tal como SB202190). Em algumas formas de realização, o meio de cultura para as células troncos intestinais humanas, criptas do intestino delgado humanas ou criptas colônicas humanas (também conhecida como o meio de cultura HISC), compreende ou consiste de um meio basal, por exemplo, como descrito acima, adicionalmente que compreende: um agonista Wnt, tal como meio condicionado Wnt-3A ou Wnt-3A humano recombinante; EGF; um inibidor BMP, tal como Noggin; Rspondin1-4, tal como Rspondin-1 humano; um inibidor TGF-beta, tal como A83-01; um inibidor p38, tal como SB202190; gastrino; e nicotinamida. Em algumas formas de realização, o inibidor p38 e/ou gastrino pode ser excluído a partir do meio de cultura HISC. Em algumas formas de realização, a invenção fornece um meio de cultura para cultura das células intestinais, que compreende ou que consiste de um meio basal, Wnt-3a, EGF, Noggin, qualquer um de Rspondin 1-4, um inibidor TGF-beta, nicotinamida e preferivelmente um inibidor p38. Em algumas formas de realização, o meio de cultura para expandir as células tronco de cólon ou intestino delgado, por exemplo, células de cólon ou intestino delgado humano, compreende ou consiste de um meio basal (por exemplo, compreende Advanced DMEM/F12, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1 mM) e glutamina/glutamax), Wnt3A (opcionalmente o meio condicionado), qualquer um de Rspondin 1-4 (preferivelmente 1 ug/ml), Noggin (preferivelmente 50-100 ng/ml), nicotinamida (preferivelmente 10 mM), EGF (preferivelmente 10-50 ng/ml), gastrino (preferivelmente 10 nM), um inibidor TGF-beta, por exemplo, A83-01 (preferivelmente 500 nM). Em uma forma de realização adicional, este meio de cultura adicionalmente compreende um inibidor p38, por exemplo, SB202190 (preferivelmente 100 nM). Em uma forma de realização adicional, este meio de cultura adicionalmente compreende um inibidor Rock, por exemplo, LY2157299. Em algumas formas de realização, o meio de cultura para diferenciar as células intestinais, compreende ou consiste de um meio basal, EGF, Noggin, um inibidor TGF-beta e um inibidor p38. Em algumas formas de realização, o meio de cultura para diferenciar as células tronco de cólon ou intestino delgado, por exemplo, células de cólon ou intestino delgado humano, compreende ou consiste de um meio basal (por exemplo, compreende Advanced DMEM/F12, B27 (50x), n-Acetilcisteína (1 mM) e glutamin/glutamax), Noggin (preferivelmente 50-100 ng/ml), EGF (preferivelmente 10-50 ng/ml), gastrino (preferivelmente 10 nM), um inibidor TGF-beta, por exemplo, A83-01 (preferivelmente 500 nM) e um inibidor p38, por exemplo, SB202190 (preferivelmente 100 nM). Em algumas formas de realização, gastrino pode ser excluído a partir deste meio de diferenciação. Em algumas formas de realização, um inibidor de secretase gama pode ser adicionado ao meio de diferenciação (preferivelmente em uma concentração de 1 μM). Os inibidores de secretase de gama podem influenciar as decisões de fato celular durante a diferenciação, por exemplo, células secretórias avançadas, tal como células goblet. Em algumas formas de realização, um RANKL pode ser adicionado ao meio de diferenciação (por exemplo, em uma concentração de 100 ng/ml). RANKL pode influenciar decisões de fato celular durante a diferenciação, por exemplo, células M avançadas. Também ver Exemplo 2, por uma descrição de como um pode gerar organoides para o uso em uma invenção.

[0016] Em algumas formas de realização, os organoides são organoides de “doença”. Similarmente aos organoides “normais”, organoides de doença imitam o genotipo e fenotipo da doença in vivo. Este tipicamente significa que estes são derivados das células in vivo com os fenotipos da doença. Entretanto, aqui pode ser outros meios para obter os organoides de doença, por exemplo, pela mutação de um organoide normal. Deste modo em algumas formas de realização, os organoides tem uma doença ou aflição. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é caracterizada pelo íon alterado e/ou transporte de fluido. Por exemplo, em algumas formas de realização a doença de aflição é fibrose cística ou cólera. Um organoide tem um genotipo de fibrose cística e fenotipo é referido neste como um “organoide de fibrose cística”. Outros organoides da doença são referidos na mesma maneira. Diversas doenças e/ou aflições são descritas em mais detalhes na seção das “doenças ou aflições”. Todas as doenças ou aflições listadas nesta seção são relevantes para os organoides da doença.

[0017] Em formas de realização preferidas, os organoides do ensaio são gerados a partir de células primárias, por exemplo, a partir de células humanas primárias. Para “primária”, é significa que a célula é geneticamente substancialmente idêntica a uma célula in vivo. Por exemplo, uma célula primária deve ser uma célula retirada diretamente a partir de um paciente de interesse. Em uma forma de realização alternativa, a célula primária é retirada a partir de uma cultura celular, preferivelmente um organoide e em que a taxa do acúmulo de mutações nas células é substancialmente a mesma como uma taxa do acúmulo de mutations das células in vivo. Em formas de realização preferidas, os organoides são gerados a partir das células troncos, preferivelmente células tronco adultas, mais preferivelmente células tonco adultas expressando Lgr5 (Barker et al., Cell Stem Cell 7, 656 2010, WO2010/090513, WO2012/168930 e Sato et al., GASTROENTEROLOGY 2011;141:1762-1772). Em formas de realização preferidas, os organoides são gerados e mantidos usando o meio de cultura e métodos descritos no WO2010/090513, WO2012/168930 e/ou Sato et al. GASTROENTEROLOGY 2011;141:1762-1772.

[0018] Em uma forma de realização, os organoides não são derivados a partir de linhas da célula imortalizada derivada do tumor ou uma célula deste. Em uma forma de realização, os organoides não são derivados a partir da população clonal da população das células ou uma célula deste. Em uma forma de realização, os organoides não são derivados a partir da linha celular ou uma célula a partir da linha celular.

[0019] Em algumas formas de realização, o ensaio da invenção adicionalmente compreende a geração de um ou mais organoides pela expansão das células tronco em organoides fechados que incluem um lúmen fechado na membrana apical das células.

[0020] Em algumas formas de realização, o ensaio da invenção adicionalmente compreende a geração de um ou mais organoides a partir da célula primária.

[0021] Em algumas formas de realização, o ensaio da invenção adicionalmente compreende gerar um ou mais organoides intestinais pela expansão de células tronco intestinais em organoides fechados que incluem um lúmen fechado na membrana apical das células.

Inchaço

[0022] Em algumas formas de realização, a dilatação de um ou mais organoides compreende uma mudança no tamanho, tal como uma mudança na área de superfície, diâmetro e/ou volume, e/ou em que a dilatação compreende uma mudança no teor do organoide.

[0023] Mostrou-se que os organoides normais observáveis e medidos de fenotipos diferentes aos organoides de doença. Esta diferença pode elevar a partir das mutações nos canais de íon e proteínas reguladoras que regulam absorção de fluido e secreção. Tipicamente, absorção de fluido e secreção é regulada pelo transporte ativo de íons cruzado as membranas celulares ou camadas que levam as mudanças na pressão osmótica e movimento de água dentro/fora do lúmen. Por exemplo, no epitélio secretório normal, secreção de fluido no lúmen é conduzido pela saída de cloreto cruzado a membrana apical da célula que resulta no sódio transepitelial e secreção de água. Este acúmulo do fluido luminal é imitado pelos organoides e, como foi observado pelo primeiro tempo pelos inventores, causa “inchaço” dos organoides normais. Este resulta nos organoides com pressão interna relativamente alta (por exemplo, no lúmen) que força os organoides em uma forma inchada ampla, tipicamente resultando no estiramento da célula que promove a divisão e afinamento.

[0024] Em contraste, um organoide de doença caracterizado pelo íon alterado e/ou transporte de fluido apresenta “inchaço anormal”. Em algumas formas de realização, um organoide de doença pode ter inchaço reduzido (quando comparado a um organoide normal), que é caracterizado por uma redução em uma ou mais das características descritas acima, por exemplo, pressão interna inferior, organoide menor, turgidez inferior, forma semelhante à esfera reduzida, estiramento reduzido etc. quando comparado a um organoide normal. Estas características resultam em uma estrutura mais dobrada (mais extrusões ou estruturas semelhantes a dobra formando a superfície do organoide). Um exemplo de um organoide de doença com inchaço reduzido é um organoide de fibrose cística. O estímulo dos organoides com certas fármacos e/ou compostos também podem resultar no inchaço reduzido. Exemplos dos compostos que resultam no inchaço reduzido são CFTRinh172 e GlyH-101 (por exemplo, ver as figuras 3 e 4). Nas formas de realização alternativas, um organoide de doença pode ter inchaço aumentado (quando comparado a um organoide normal), que são caracterizados por uma intensificação de um ou mais das características descritas acima, por exemplo, pressão interna maior, organoide mais amplo, turgidez maior, forma semelhante à esfera intensificada, estiramento aumentado etc. quando comparado a um organoide normal. Um exemplo de um organoide de doença com inchaço aumentado é um organoide de cólera. O estímulo dos organoides com certos fármacos e/ou compostos também podem resultar no inchaço intensificado. Exemplos dos compostos que resultam no inchaço intensificado são forscolina, salbutamol, epinefrina, ritodrina, dopamina ou toxina de cólera. Um exemplo de um fármaco que resulta no inchaço intensificado (particularmente quando estimular um organoide de fibrose cística) é genisteína (por exemplo, ver figura 7). Outros fármacos contra fibrose cística que devem resultar no inchaço intensificado dos organoides de fibrose cística são listados na Tabela 2.

[0025] Consequentemente, como mencionado acima, a extensão do inchaço de organoide pode ser determinado para medir a mudança no tamanho ou a mudança no conteúdo de um ou mais organoide no ensaio. A “mudança” pode referir-se a diferença quando um organoide normal é comparado a um organoide de doença e/ou quando um organoide controle está em comparação com um organoide que foi estimulado por um ou mais fármaco ou composto. Alternativamente, a “mudança” pode referir-se a diferença no inchaço de um organoide antes e depois do estímulo com um fármaco e/ou composto.

[0026] Deste modo em algumas formas de realização, a mudança no tamanho e/ou a mudança no teor é a mudança no tamanho comparado com um organoide de controle saudável. Em uma forma de realização preferida, o organoide de controle saudável é similar ou substancialmente idêntico a um organoide de doença, exceto que este não tem uma doença de interesse. Por exemplo, em uma forma de realização preferida, o controle e organoides de doença são derivados do mesmo tipo de tecido (por exemplo, o tamanho de um organoide gerado a partir de uma biopsia intestinal CF deve ser comparada ao tamanho de um organoide gerado a partir de uma biopsia intestinal saudável). Deve ser entendido por aquela pessoa habilitada que os organoides são preferivelmente da mesma “idade”, isto é as células tem cultivada e/ou passada em um número similar de vezes e/ou o tamanho de partida é substancialmente o mesmo.

[0027] Em uma forma de realização alternativa, a mudança no tamanho e/ou a mudança no teor é a mudança no tamanho comparado a um organoide de controle que foi estimulado com um ou mais fármacos. Em uma forma de realização preferida, o organoide de controle é similar ou substancialmente idêntico ao organoide que foi estimulado com um ou mais fármacos, exceto que este não foi estimulado com uma ou mais fármacos. Por exemplo, em uma forma de realização preferida é derivado a partir do mesmo tipo de tecido. Será entendido por aquela pessoa habilitada que os organoides são preferivelmente da mesma “idade”, isto é as células foram cultivadas e/ou passadas em um número similar de vezes e/ou o tamanho de partida é substancialmente o mesmo.

[0028] Em uma forma de realização adicional, a mudança no tamanho e/ou a mudança no teor é a mudança no inchaço de um organoide antes e depois da estimulação com um fármaco e/ou composto.

[0029] Em algumas formas de realização, a mudança no tamanho do organoide pode ocorrer concorrentemente com uma mudança no diâmetro ou volume do lúmen. Entretanto, uma das vantagens do ensaio da invenção é que este permite o tamanho do organoide, antes do que o tamanho do lúmen a ser usado como indicação dos organoides tratados bem sucedidos versus doença versus saúde. Currid et al., (2003) descreve a observação que o tratamento de forscolina das linhas da célula derivadas do tumor (com estruturas semelhantes ao organoide) resultam na formação de uma estrutura semelhante ao lúmen. Entretanto, os autores não fazem a conexão que esta formação de lúmen deve ser inibida pelas doenças de aflições que inibem a função do CFTR (ou outras proteínas envolvidas no transporte de fluido e secreção). Além disso, os “organoides” Currid não mudam em tamanho na resposta ao estímulo do tratamento com forscolina; apenas a mudança parece ser a formação do lúmen (em particular ver figura 1 de Currid et al.). Em contraste o ensaio da presente invenção envolve a observação do inchaço dos organoides por si só. Este é vantajoso por causa do tamanho do organoide total (por exemplo, diâmetro/volume/área de superfície) é mais fácil de medir. Por exemplo, como descrito em os presentes exemplos, sob certas condições de rotulação, software de quantificação não foi capaz de discriminar entre as células e o lúmen devido a perda do contraste. Portanto, não é sempre possível observar as mudanças no tamanho do lúmen. Em contraste, é possível usar os métodos de quantificação automáticos para determinar as mudanças totais no tamanho do organoide.

[0030] A mudança pode ser avaliada pela medição manual ou automática do organoide, como descrito abaixo.

[0031] Em algumas formas de realização, medir compreende quantitativamente medir a mudança no tamanho do organoide. Para mudança no tamanho, é significado que existe uma mudança na área de superfície e/ou diâmetro e/ou volume do organoide. Em algumas formas de realização, a mudança no tamanho será uma mudança de pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 50 % ou mais da área de superfície e/ou diâmetro e/ou volume do organoide. Em algumas formas de realização, a mudança no tamanho é uma mudança de pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes pelo menos 7 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes ou mais da área de superfície e/ou diâmetro e/ou volume do organoide. A mudança pode ser um aumento no tamanho (inchaço intensificado) ou uma diminuição no tamanho (inchaço reduzido). Por exemplo, figura 8 mostra que a forscolina e toxina de cólera causam os organoides humanos a mais do que duplos no tamanho no espaço de 120 minutos.

[0032] Em outras formas de realização, medir compreende observa-se o inchaço de organoide. Este pode envolver, por exemplo, determinar uma mudança no conteúdo do organoide. Para mudança no conteúdo, é significado que as mudanças do conteúdo ou estrutura do organoide. Em algumas formas de realização, a mudança no teor é caracterizada por uma mudança na forma de organoide (por exemplo, mais semelhante à esfera ou mais dobrado ou menos semelhante à esfera ou menos dobrado); mudança no tamanho celular e estiramento e/ou mudança na pressão interna e/ou rigidez. Deste modo em algumas formas de realização, medir a mudança no conteúdo ou estrutura compreende observar se o organoide torna-se mais ou menos dobrado, ou, por exemplo, determinando se um organoide de interesse (um organoide de doença ou um organoide tratado por fármaco, respectivamente) é maior ou menor do que um organoide de controle (por exemplo, um organoide saudável ou um organoide não tratado por fármaco, respectivamente). Em algumas formas de realização, se existe um inchaço reduzido, observando uma dilatação pode envolver a determinação se este torna-se mais vazio e dobrado. A mudança no conteúdo e estrutura também pode ser quantitativamente medida.

[0033] Em algumas formas de realização, o inchaço de organoide pode ser visivelmente observado tal que uma ou mais das características descritas acima podem ser vistas. É entendido que “visivelmente” não requer a visibilidade usando o olho nu, mas inclui, por exemplo, o uso das técnicas de microscopia, formação de imagem e/ou tingimento.

[0034] Várias técnicas conhecidas na técnica devem ser usadas para determinar o tamanho ou conteúdo do organoide.

[0035] Em uma forma de realização preferida, o tamanho ou conteúdo do organoide é determinado usando a formação de imagem da célula viva, por exemplo, usando um microscópio, tal como um microscópio confocal. Em algumas formas de realização os organoides são tingidos antes para formação da imagem para melhorar o contraste da imagem. Em uma forma de realização adicional os organoides são tingidos com pigmentos permeáveis à célula que opcionalmente apresentam fluorescência na conversão metabólica pelas células vivas, por exemplo, Traçador celular-laranja, Traçador celular- verde, Calceína-verde (todos disponíveis comercialmente de Invitrogen). Em uma forma de realização, os organoides são tingidos com Calceína-verde, opcionalmente em aproximdamente 10 μM por aproximadamente 60 minutos. Deste modo em algumas formas de realização o ensaio da invenção compreende a etapa do tingimento dos organoides, por exemplo, pela incubação com o agente de tingimento.

[0036] Em algumas formas de realização, a mudança no tamanho pode ser quantificada, por exemplo, usando software de formação de imagem tal como “Software de quantificação de Volocity”. Em algumas formas de realização, um aumento de área organoide total relativo a T=0 (tempo de estimulação) é calculado e opcionalmente medido a partir dos organoides múltiplos. A área sob a curva (AUC) pode ser calculada, por exemplo, usando Graphpad Prism, para mostrar uma mudança na área do organoide.

[0037] Em algumas formas de realização, os organoides podem sofrer de inchaço rápido, (por exemplo, na resposta ao estímulo por fármacos ou compostos) que pode ser detectado dentro de horas, minutos ou adicionalmente segundos. Deste modo, em algumas formas de realização do ensaio, o inchaço de organoide é medido em menos do que 48 horas, menos do que 36 horas, menos do que 24 horas, menos do que 18 horas, menos do que 12 horas, menos do que 6 horas, menos do que 1 hora, menos do que 45 minutos, menos do que 30 minutos, menos do que 15 minutos, menos do que 10 minutos, menos do que 9 minutos, menos do que 8 minutos, menos do que 7 minutos, menos do que 6 minutos, menos do que 5 minutos, menos do que 4 minutos, menos do que 3 minutos, menos do que 2 minutos, menos do que 1 minuto ou menos do que 30 segundos.

[0038] Em algumas formas de realização, os organoides podem sofrer inchaço lento, (por exemplo, quanto determinar a diferença entre organoide normal e doente que não foi estimulado por fármacos ou compostos) que podem ser detectados dentro de semanas ou dias. Deste modo, em algumas formas de realização do ensaio, o inchaço de organoide é medido em menos do que 4 semanas, menos do que 3 semanas, menos do que 2 semanas, menos do que 1 semana, menos do que 6 dias, menos do que 5 dias, menos do que 4 dias ou menos do que 3 dias.

Estimulação do inchaço de organoide

[0039] Em algumas formas de realização, o ensaio compreende estímulo de um ou mais organoides com um composto que é capaz de incluir o inchaço, por exemplo, uma mudança no tamanho, dos organoides.

[0040] Mostrou-se que certos compostos resultaram nos inchaço de organoide intensificado. Por exemplo, forscolina, que é conhecida para elevar o cAMP intracelular e portanto ativar o receptor de transmembrana de fibrose cística (CFTR) resultando no inchaço de organoide intensificado, presumidamente devido a absorção de fluido aumentado no lúmen organoide. O efeito é dependente de CFTR, como demonstrado usando os inibidores CFTR que evitam o inchaço induzido por forscolina. Deste modo os inventores tem demonstrados que os organoides estimulados por forscolina, ou outros ativadores CFTR, intensificam o fenotipo inchado visto nos organoides normais e também inchaço nos organoides de doença tratados bem sucedidos. Este efeito pode ser usado para intensificar a “mudança” no tamanho ou conteúdo do organoide medido no ensaio da invenção e para atingir as respostas do organoide rápidos, que devem ser úteis pelo diagnóstico rápido, teste de fármaco ou medicina personalizada.

[0041] A forscolina é um labdano diterpeno, com a fórmula química C22H34O7, que é produzida pela planta Indian Coleus. Deste modo este é um inibidor de molécula menor com uma massa molecular de 410,5 g/mol. Seu UPAC ID é: acetato de (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b- triidróxi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1-oxo-3-vinildodecaidro-1H- benzo[f]cromen-5-ila. A forscolina é comumente usada para elevar os níveis do AMP cíclico no estudo e busca da fisiologia celular. Salbutamol, epinefrina, ritodrina, dopamina e toxina de cólera foi mostrada ter um efeito similar para forscolina nos organoides.

[0042] Deste modo em algumas formas de realização, o ensaio compreende estímulo de um ou mais organoides com um composto que é capaz de induzir uma mudança no tamanho dos organoides, em que o composto indiretamente ativa o CFTR, por exemplo, por intermédio do caminho cAMP-PKA. Em algumas formas de realização, o composto é forscolina, salbutamol, epinefrina, ritodrina, dopamina ou toxina de cólera.

[0043] Em algumas formas de realização, o composto é um receptor de proteína ligado por G (GCPR) que intensifica os níveis cAMP. Em algumas formas de realização, o composto é uma molécula menor que intensifica os níveis cAMP, por exemplo, forscolina. Em algumas formas de realização, o composto é um diterpeno ou diterpenóide, opcionalmente um ladano diterpeno e/ou um diterpeno semelhante a forscolina de diterpenóide como descrito, por exemplo, em Rijo P et al. (Magn Reson Chem. 2005 Jul;43(7):595-8).

[0044] Todos os agentes associados com a modulação da secreção de fluido ou absorção pela modulação da sinalização celular que é geralmente aceitável para regular a função de canal de íon CFTR. Estes incluem os moduladores de cAMP, cGMP, proteína cinase A, proteína cinase C, fosforilação de CFTR e atividade CFTR ATP-ase.

[0045] Em algumas formas de realização, o composto é um composto que gera cAMP, tal como um estímulo do receptor adrenérgico. Exemplos do estímulo adrenérgico inclui mas não é limitado a isoproperenol, salbutamol, epinefrina; prostaglandina E2, VIP e substância P. Em algumas formas de realização, o composto é um composto que gera cGMP, tal como uma guanilina ou ácido biliar. Em algumas formas de realização, o composto é um inibidor de fosfodiesterases, por exemplo, milrinona, IBMX, sildenafil (Viagra). Em algumas formas de realização, o composto é um modulador de cálcio, por exemplo, ionomicina, acetil colina ou carbacol. Em algumas formas de realização, o composto é um modulador da sinalização celular, tal como PI3K, Syk ou p38. Em algumas formas de realização, o composto é um modulador da dobra CFTR e tráfego, por exemplo, Vertex-809 e Vertex-661, SAHA, miRNA-138. Em algumas formas de realização, o composto é um modulador epigenético, por exemplo, de SAHA ou TSA. Em algumas formas de realização, o composto é um modulador da expressão CFTR, tal como miRNA-138, IL-1, TNF-alfa, ou regulador p38. Em algumas formas de realização, o composto é um modulador de degradação CFTR, tal como a inibidor de proteassomo incluindo bortezimib ou um modulador de retículo endoplásmico associado a degradação por intermédio dos caminhos dependentes de ubiquitina. Em algumas formas de realização, o composto é um inibidor CFTR adaptado de JR Tiagarajah et al. (Clin Pharmacol Ther, 2012 CFTR Inhibitors for Treating Diarrheal Disease), por exemplo, um dos compostos mostrados abaixo:

[0046] Qualquer composto adequado pode ser usado para estimular um ou mais organoides no ensaio da invenção. Por exemplo, todos os reagentes associados com a modulação da secreção de fluido ou absorção pela modulação da sinalização celular pode ser usada para estimular um ou mais organoides no ensaio da invenção. Exemplos dos compostos que podem ser usados para estimular um ou mais organoides no ensaio da invenção incluem moduladores de cAMP, cGMP, proteína cinase A, proteína cinase C, fosforilação de CFTR e atividade CFTR ATP-ase. Por exemplo, outros compostos que ativam o CFTR e deste modo devem substituir a forscolina no ensaio incluem a toxina de cólera e salbutamol e imitadores e derivados destes.

[0047] Em algumas formas de realização, o ensaio compreende estímulo de um ou mais organoides com um composto que é capaz de induzir uma mudança no tamanho dos organoides, em que o composto é forscolina ou um imitador ou um derivado deste. Em uma forma de realização adicional, inchaço induzido por forscolina dos organoides pode ser reverso na remoção da forscolina pela lavagem. Similarmente, inchaço dos organoides causados por outros compostos pode ser reverso pela lavagem para remover o composto.

[0048] Um número de canais de íons não CFTR e outras proteínas são envolvidos na transferência do organoide e substâncias inorgânicas cruzadas as membranas celulares nas membranas apicais e basolaterais e deste modo afetam a secreção de fluido ou absorção. Deste modo, em algumas formas de realização, o composto ativa indiretamente o CFTR ou outro canal de íon ou proteína reguladora envolvida na regulação da absorção de fluido e secreção. Em uma forma de realização alternativa, o composto diretamente ativa o CFTR ou outro canal de íon ou proteína reguladora envolvida na regulação da absorção de fluido e secreção.

[0049] Os canais de íons outros do que o CFTR e outras proteínas envolvidas na regulação de canal de íon nas células, também são importantes para a regulação de homeostase de fluido e eletrólito nas células. Por exemplo, todos dos canais de íons mostrados nas tabelas 1 e 2 são envolvidos na regulação da secreção de fluido e absorção nas células. Adicionalmente em um exemplo, o CFTR é predito para ajudar a regular um número de outros canais de íons incluindo mas não limitados a: ORCC, ROMKK+, ENaC e o trocador Cl-/HCO3-. Os moduladores destes canais de íons e proteínas reguladoras, tal como os ativadores e inibidores listados nas tabelas 1 e 2 (adaptados de Toczylowska-Maminska et al, 2012, J of Cell Biochem 113:426:-432), são hipotéticos para funcionar em uma maneira similar a forscolina para intensificar ou reduzir a dilatação dos organoides. Deste modo, em algumas formas de realização da invenção, o composto do ensaio que é capaz de induzir uma mudança no tamanho dos organoides diretamente ou indiretamente ativa ou inibe qualquer um ou mais dos canais de íons nas tabelas 1 ou 2 e/ou qualquer um ou mais do trocador de íon NHE3, DRA, SGLT1, transportadores de ácido graxo de cadeia curta, ORCC, ROMKK+, ENaC, ou o trocador Cl-/HCO3-.

[0050] Em algumas formas de realização, o composto do ensaio que é capaz de induzir uma mudança no tamanho dos organoides pode ser qualquer um ou mais dos ativadores ou inibidores listados nas Tabelas 1 ou 2.Tabela I. Ativadores e inibidores de proteínas de transporte na membrane apical do epitélio bronquial humano

Tabela II. Ativadores e inibidores de proteínas de transporte na membrane basolateral do epitélio bronquial humano

[0051] Em algumas formas de realização, os compostos capazes de induzir uma mudança no tamanho para o uso no ensaio da invenção pode ser, por exemplo, proteínas, peptídeos, moléculas menores sintéticas, aptâmeros, ácidos nucleicos (tal como compostos antissentido) ou anticorpos (ou fragmentos destes).

[0052] Em uma forma de realização adicional, alguns organoides, tal como organoides CFTR-delF508 de camundongo tem atividade CFTR residual maior do que as contrapartes humanas (por exemplo, ver figura 6) e respondem a correção CFTR pela temperatura bem como compostos para inchaço aumentado induzido por forscolina.

[0053] As mutações nos canais de íons (tal como aqueles mencionados acima ou listados nas tabelas 1 e 2) e proteínas reguladoras podem causar o íon alterado e transporte de fluido resultando nos fenotipos da doença incluindo, mas não limitado a: diarreia induzida por bactéria (por exemplo, causada por cólera, ou outras toxinas bacterianas); infecção por rotavírus; E. Coli entero-hemorrágica; adrenoleucodistrofia; asma, doença de Tangier; resistência a multifármaco (muitos cânceres, bem como alguma bactéria resistente à antibiótico); colestase obstrética e doença do rim policístico. Deste modo em algumas formas de realização, a doença ou aflição diagnosticados ou estudados pelo ensaio da invenção é selecionado de: diarreia induzida por batéria (por exemplo, causada por cólera, ou outras toxinas bacterianas); infecção por rotavírus; E. Coli enterohemorrágica; adrenoleucodistrofia; asma, doença de Tangier; resistência a multifármaco (muitos cânceres, bem como alguma bactéria resistente a antibiótico); colestase obstrética e doença do rim policístico. A pessoa habilitada deve entender que os canais de íons e que as mutações ao alvo dependem da doença a ser estudada.

[0054] A invenção fornece um ensaio de acordo com a invenção, que compreende o estímulo de um ou mais organoides com um composto que alveja o CFTR e formação de imagem do dito um ou mais organoides, por meio do qual dilatação induzida por composto do um ou mais organoides é dependente de CFTR.

[0055] A invenção também fornece um ensaio para avaliar uma biblioteca de composto para identificar os compostos que afetam a absorção e/ou secreção de fluido, em que o ensaio compreende:

[0056] Estimulação de um ou mais organoides com a biblioteca do composto;

[0057] Formação de imagem do inchaço do dito um ou mais organoides; e

[0058] Identificação de um composto que é capaz de induzir a dilatação dos organoides.

[0059] Será entendido que qualquer um dos compostos listados nesta seção podem ser igualmente aplicáveis como exemplos das fármacos para a avaliação de fármaco e medicina personalizada. Reciprocamente, qualquer um dos exemplos de fármacos fornecidos em uma seção da avaliação de fármaco e medicina personalizada podem ser igualmente aplicáveis como exemplos dos compostos para induzir o inchaço de organoide. Uma diferença que pode existir entre os compostos apropriados para estimular o inchaço de organoide no ensaio versus os fármacos que devem ser testados no ensaio é que os compostos tipicamente atuam a montante dos canais de íons e/ou proteínas que regulam a secreção de fluido e absorção em uma célula e portanto intensificam (ou reduzem) o inchaço de organoide. Em contraste, os fármacos tipicamente atuam em e/ou a jusante dos canais de íons disfuncionais e/ou proteínas para corrigir a secreção de fluido normal e absorção.

Doença ou aflição

[0060] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um ensaio para diagnosticar uma doença ou aflição que afeta a absorção ou secreção de fluido (dos organoides e/ou as células dos organoides) e para o estudo da eficácia de um ou mais fármacos para tratar a doença ou aflição, por exemplo, em que a doença é preferivelmente fibrose cística ou cólera.

[0061] Deste modo, em uma forma de realização a invenção fornece um ensaio de acordo com a invenção em que a dilatação do um ou mais organoides é uma medição do efeito de mutação de CFTR e/ou tratamento com fármaco.

[0062] Outras doenças ou aflições, além disso, a fibrose cística e cólera, que são relevantes para uso com o ensaio da invenção incluem, mas não é limitado a: diarreia induzida por bactéria (por exemplo, E. coli enteroemorrágica ou causadas por toxina de cólera ou outras toxinas bacterianas); infecção por rotavírus; adrenoleucodistrofia; asma, doença de Tangier; resistência a multifármaco (muitos cânceres, bem como alguma bactéria resistente ao antibiótico); colestase obstétrica, COPD, fumo, sinusite, insuficiência pancreática, pancreatite, infertilidade, deficiência de nutrição, doenças inflamatórias, doença renal incluindo doença do rim policístico, doença alérgica, osteoporose, diabetes, hipertensão, hipotensão, diarreia induzida por patogênio (cólera, E.coli), secagem, cirrose hepática, mau funcionamento do fígado, tumorigênese. O fumo pode reduzir a função CFTR e deste modo, tosse de fumante ou outros efeitos colaterais do fumo dão outras aflições que são relevantes para o uso com o ensaio da invenção.

[0063] O CFTR também desempenha um papel importante na patogênese da doença do rim policístico, particularmente doença do rim policístico dominante autossomal (Li et al., Am J Phsiol Renal Physiol 303, 1176-1186, 2012). As mutações nas proteínas policísticas levam a formação dos cistos epiteliais contendo uma cavidade enchida por fluido envolvida por uma camada simples das células epiteliais renais imaturas (por exemplo, Sullivan et al., J. Am Soc Nephrol 9, 903-916, 1998). Acúmulo de fluido dentro destes cistos envolve os movimentos Cl- transepiteliais estimulados por cAMP similares aqueles observados no epitélio secretório afetado pela fibrose cística (por exemplo, Torres et al., Lancet 369, 1287-1301, 2007). Foi mostrado que a mutação F508del-CFTR rompe a formação do cisto renal. Este mostra que o ensaio deve também ser adequado para diagnóstico da doença do rim policístico e para o estudo da efetividade de um ou mais fármacos para tratamento da doença do rim policístico. O ensaio também deve ser adequado para outras doenças, tal como aquelas listadas acima, que resultam na disfunção do transporte de fluido similar.

[0064] Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com uma mutação de perda-da-função de um canal de íon, por exemplo, CFTR, ORCC, ROMKK+, ENaC, ou o trocador Cl-/HCO3-, ou é associado com a mutação da perda-da-função de outras proteínas associadas com o regulamento destes canais de íons. Em algumas formas de realização a doença ou aflição é associado com uma anulação de fenilalanina na posição 508 (CFTR-delF508). Este causa má dobra, retenção por ER e degradação precoce da proteína CFTR que evita a função na membrana de plasma. Deste modo, em algumas formas de realização, a doença ou aflição é caracterizada por má dobra, retenção por ER e/ou degradação precoce da proteína CFTR. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com uma ou mais mutações no gene CFTR que prejudicam dobra de proteína, produção de proteína, passagem, condutância, união e/ou interações com outras proteínas. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com a mutação CFTR-G551D. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com a mutação CFTR-G542X. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com a mutação CFTR-L927P. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com a mutação CFTR-E60X. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com a mutação CFTR-4015delATTT. Em algumas formas de realização, a doença ou aflição é associada com a mutação CFTR-A455E (ver, por exemplo, figura 14a), Em algumas formas de realização, a doença ou aflição pode ser causada pelo alelo homozigoto de qualquer uma das mutações mencionadas acima. Em uma forma de realização alternativa, a doença ou aflição pode ser causada pelo alelo heterozigoto de qualquer combinação das mutações acima ou uma combinação da mutação acima com um gene CFTR normal (não mutante). Em algumas formas de realização, a perda da mutação da função em CFTR leva a fibrose cística e esta doença pode ser detectada e/ou diagnosticada pela observação da redução no inchaço de organoide comparado a um organoide saudável normal.

[0065] Em uma forma de realização alternativa, a funcionalidade de CFTR é alterada por uma toxina, tal como a toxina bacteriana, tal como a toxina de cólera e deste modo toxina de cólera pode ser detectada e/ou diagnosticada pela observação do inchaço de organoide intensificado comparado a um organoide saudável normal.

[0066] As doenças e/ou aflições mencionadas acima também são relevantes pelos tipos de organoide de doença que são mencionados acima. Um organoide de doença pode ser usado como um modelo da doença para estudar o efeito dos fármacos em um fenotipo e/ou genotipo da doença particular, opcionalmente para descoberta do fármaco para medicina personalizada, tal como escolha do tratamento do fármaco, como explicado em mais detalhes abaixo.

[0067] A invenção fornece um ensaio de acordo com a invenção que adicionalmente compreende correlacionar a dilatação de um ou mais organoides com:a presença ou gravidade da doença ou aflição, ou a responsividade do organoide para o tratamento com um fármaco conhecido ou putativo

[0068] ou a eficácia de um fármaco conhecida ou putativa.

Uso do ensaio no diagnóstico

[0069] A invenção também fornece um ensaio de acordo com a invenção, para o uso no diagnóstico de uma doença ou aflição. A doença ou aflição pode ser qualquer doença ou aflição mencionada neste ou qualquer doença ou aflição que afeta a absorção ou secreção de fluido.

[0070] A invenção também fornece um ensaio de acordo com a invenção, que compreende medir a dilatação em um ou mais organoides de um paciente sendo diagnóstico, por exemplo, para fibrose cística ou cólera e comparação deste com a dilatação em um ou mais organoides a partir de um controle saudável.

[0071] Em algumas formas de realização, o ensaio adicionalmente compreende estímulo de um ou mais organoides com um composto, tal como forscolina, que intensifica o fenotipo de inchaço normal.

[0072] Em algumas formas de realização, a mudança no inchaço do organoide de paciente comparado ao organoide saudável indica a presença da doença ou aflição. Além disso, quantificação da mudança no tamanho pode demonstrar a presença de uma doença ou aflição e/ou sua severidade. Por exemplo, inchaço reduzido de um organoide de paciente deve indicar a presença de um CFTR disfuncional (ou outro canal de íon ou proteína reguladora que afeta a absorção do fluido ou secreção). Por exemplo, em algumas formas de realização, a mudança é exemplificada em comparação com o inchaço induzido por forscolina nos organoides desenvolvidos a partir de um controle saudável ou um paciente com CF realizando as mutações F508del homozigotas (por exemplo, ver figura 5a). Em algumas formas de realização, este deve indicar um diagnóstico positivo para fibrose cística. Alternativamente, inchaço aumentado de um organoide de paciente deve indicar a presença de um CFTR demasiadamente ativo (ou outro canal de íon ou proteína reguladora que afeta a absorção do fluido ou secreção). Em algumas formas de realização, este deve indicar um diagnóstico positivo para cólera. O diagnóstico da doença ou aflição, tal como fibrose cística ou cólera, pode então levar ao tratamento do paciente para a doença ou aflição relevante.

[0073] A invenção também fornece o uso de um ou mais organoides para o diagnóstico de uma doença ou aflição tal como fibrose cística ou cólera, em que o dito diagnóstico compreende uso de um ensaio de acordo com a invenção.

[0074] A invenção também fornece um método para o tratamento de um paciente, em que o método compreende uso do ensaio da invenção pelo diagnóstico, em que se um diagnóstico positivo é obtido o paciente é tratado pela doença ou aflição.

[0075] Um agente terapêutico para o uso no tratamento de uma doença ou aflição em que o dito tratamento compreende diagnosticar um paciente para a presença de uma doença ou aflição usando um ensaio da invenção e em que se um diagnóstico positivo for obtido, o paciente é tratado pela doença ou aflição.

[0076] Em algumas formas de realização, o paciente é tratado usando um ou mais fármacos identificados usando um ensaio de avaliação de fármaco da invenção como descrito below.

Uso do ensaio na avaliação da fármaco

[0077] A invenção também fornece um ensaio de acordo com a invenção para o uso na avaliação do fármaco, por exemplo, para avaliar uma biblioteca de fármacos potenciais.

[0078] Em algumas formas de realização, o ensaio é um ensaio de avaliação de produção alta. Por exemplo, em algumas formas de realização, os organoides são cultivados em um formato de ensaio, por exemplo, nas placas de multirreservatórios, tal como placas de 96 reservatórios ou placas de 384 reservatórias.

[0079] Em algumas formas de realização, os organoides na avaliação do fármaco, por exemplo, no ensaio, são derivados de um paciente individual. Em algumas formas de realização, os organoides na avaliação do fármaco, por exemplo, no ensaio, são derivados de pacientes diferentes. Em outras formas de realização, a avaliação do fármaco, por exemplo, o ensaio, compreende organoides derivados de um ou mais pacientes doentes em adição aos organoides derivados de um ou mais controles saudáveis.

[0080] As bibliotecas das moléculas podem ser usadas para identificar uma molécula que afeta os organoides. As bibliotecas preferidas compreendem as bibliotecas de fragmento de anticorpo, bibliotecas de apresentação de peptídeo, bibliotecas de peptídeo (por exemplo, LOPAP™, Sigma Aldrich), bibliotecas de lipídeo (BioMol), bibliotecas de composto sintético (por exemplo, LOP AC™, Sigma Aldrich) bibliotecas de composto natural (Specs, TimTec) ou bibliotecas de molécula menor. Além disso, bibliotecas genéticas podem ser usadas que induzem ou reprimem a expressão de um de mais genes na progênie das células troncos. Estas bibliotecas genéticas compreendem as bibliotecas de cDNA, bibliotecas antissentido e siRNA ou outras bibliotecas de RNA não codificadoras. As células podem ser expostas as concentrações múltiplas de um agente de teste por um certo período de tempo. No final do período de exposição, as culturas são avaliadas. O termo "afetar" é usado para cobrir qualquer mudança em uma célula, incluindo, mas não limitado a, uma redução em, ou perda de, proliferação, uma mudança morfológica e morte celular.

[0081] Em algumas formas de realização, os organoides podem ser usado no ensaio para testar as bibliotecas dos produtos químicos, anticorpos, produto natural (extratos vegetais), etc para adequabilidade para o uso como fármacos, cosméticos e/ou medicinas preventivas. Por exemplo, em algumas formas de realização, uma biopsia celular a partir do paciente de interesse, tal como células intestinais a partir de um paciente de fibrose cística, pode ser cultivado usando o meio de cultura e métodos da invenção e então tratado com um fármaco ou uma biblioteca de avaliação. É então possível determinar que os fármacos efetivamente restauram a função ao canal de íon defeituoso ou outra proteína reguladora. Este permite a receptividade do paciente específico em um fármaco particular a ser testado deste modo permitindo a ser feito sob encomenda em um paciente específico. Deste modo, este permite um método de medicina personalizada, que é descrito em mais detalhes abaixo.

[0082] A vantagem adicionada do uso dos organoides para identificar os fármacos nesta maneira é que também é possível avaliar os organoides normais (organoides derivados a partir do tecido saudável) para verificar quais fármacos e compostos tem efeito mínimo no tecido saudável. Este permite a avaliação para fármacos com a atividade de alvo mínimo ou efeitos colaterais indesejados.

[0083] Em algumas formas de realização, o ensaio é para testar o efeito de novos fármacos na restauração funcional dos canais de íons mutantes ou outras proteínas envolvidas na regulação da absorção do fluido ou secreção. Em algumas formas de realização, a restauração funcional compreende a restauração da tradução, transcrição, do local do gene ou interadores biológicos, para tratamento das doenças e aflições associadas com absorção do fluido ou secreção.

[0084] Por exemplo, observou-se o inchaço induzido por forscolina nos organoides CF na adição dos fármacos que são conhecidos para corrigir a função CFTR in vitro (Figura 5b). Deste modo, em algumas formas de realização, o ensaio da invenção pode ser usado para medir o efeito do tratamento novo ou existente para CFTR.

[0085] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um método ou ensaio usando os organoides para testar o efeito de novos fármacos para tratar a deficiência CFTR através da correção da função CFTR.

[0086] Em algumas formas de realização, o ensaio é para testar o efeito de novos fármacos na restauração funcional de proteína CFTR mutante ou restauração funcional de tradução CFTR, transcrição, local do gene CFTR ou interadores biológicos de CFTR, por exemplo, para o tratamento de fibrose cística ou toxinas microbianas, tal como cólera. Em algumas formas de realização os fármacos são potenciadores ou corretores, por exemplo, em algumas formas de realização o potenciador é genisteína (ver por exemplo, figura 7, no qual mostra que genisteína pode induzir o inchaço de organoide rápido).

[0087] A restauração funcional de CFTR compreende restauração funcional da proteína CFTR mutante, restauração funcional da tradução CFTR (por exemplo, códons de interrupção prematuros), transcrição (por exemplo, defeitos da união) ou restauração funcional do gene CFTR (por exemplo, terapia do gene) ou o interactoma CFTR (algumas mutações impactam as interações de proteína-proteína requeridas pela função CFTR).

[0088] Em algumas formas de realização, o ensaio para a avaliação de fármaco é para identificar os fármacos que alvejam os defeitos específicos por mutação nos canais de íons ou outras proteínas envolvidas na regulação da absorção do fluido ou secreção, por exemplo, defeitos específicos por mutação da proteína CFTR própria. Por exemplo, em algumas formas de realização, o ensaio para a avaliação de fármaco é para identificar os fármacos que induzem i) leitura através do códon de interrupção prematura, ii) correção da membrana de plasma tráfego de CFTR (corretores), e/ou iii) intensificar a passagem de CFTR (potenciadores). Em algumas formas de realização, o ensaio para a avaliação de fármaco é para identificar as combinações de corretores de potenciadores, por exemplo, para tratamento do grupo de paciente dominante CFTR-delF508.

[0089] Em algumas formas de realização, o ensaio para a avaliação de fármaco compreende estímulo de um ou mais organoides com um fármaco conhecida para tratar uma doença ou aflição de interesse, ou sendo testada para sua eficácia no tratamento de uma doença ou aflição de interesse, em que a intensificação ou redução do inchaço de organoide é indicativo de uma fármaco efetiva para tratamento da dita doença ou aflição.

[0090] Em algumas formas de realização, o fármaco sendo testada é selecionado a partir de uma molécula menor sintética, proteína, peptídeo, anticorpo (ou derivado deste), apatâmero e ácido nucleico (tal como um composto antissentido).

[0091] Em uma forma de realização adicional, o ensaio para a avaliação de fármaco adicionalmente compreende estímulo de um ou mais organoides com um composto, tal como forscolina, que é capaz de intensificar o inchaço dos organoides.

[0092] Em algumas formas de realização, o ensaio para a avaliação de fármaco compreende estimulação de um ou mais organoides com um composto que é capaz de induzir a dilatação dos organoides; estimulação de um ou mais organoides com um fármaco conhecido para afetar a função de CFTR ou com um fármaco sendo testado para esta eficácia em afetar a função de CFTR; e

[0093] Formação de imagem da dilatação de um ou mais organoides e comparação opcional da dilatação do organoide a uma dilatação de um organoide que foi estimulado com o composto mas não foi estimulado com o fármaco;em que a dilatação do um ou mais organoides na resposta ao estímulo pelo fármaco indica que o fármaco eficaz para o tratamento de restauração funcional de CFTR mutante.

[0094] Em algumas formas de realização, o ensaio adicionalmente compreende a etapa de seleção do fármaco efetivo e opcionalmente usando o dita fármaco para tratamento.

[0095] A invenção também fornece o uso de um ou mais organoides para a avaliação de fármaco, em que a avaliação de fármaco compreende usar um ensaio de acordo com a invenção.

Uso do ensaio na medicina personalizada

[0096] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um ensaio em que os organoides são pacientes derivados de organoides de intestino delgado para uma estimativa da receptividade individual a certas opções de tratamento.

[0097] Em algumas formas de realização, o ensaio compreende estímulo de um ou mais organoides com um ou mais fármacos, por exemplo, para o uso na medicina personalizada.

[0098] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um ensaio para o uso na medicina personalizada, por exemplo, para testar a resposta de paciente individual aos fármacos para a doença ou aflição de interesse.

[0099] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um método usando os organoides para testar a resposta do paciente individual aos fármacos tal como corretores ou potenciadores ou outros fármacos usadas para tratar CF, por exemplo, quaisquer uma dos fármacos mostradas na Tabela 3 ou Tabela 4.Tabela 3: Exemplos de fármacos conhecidas para fibrose cística

Tabela 4: Compostos usados para tratar outras doenças caracterizadas por impactar a secreção de fluido

[00100] Exemplos de fármacos CFTR conhecidos que devem ser usados em um ensaio para a medicina personalizada inclui os corretores CFTR e potenciadores, tal como aqueles listados na tabela 3 e/ou tabela 4 e/ou VRT-325, VX809, VX770, C8 (http://cftrfolding.org) e/ou corr-4a. Por exemplo, em uma forma de realização o ensaio compreende a etapa de pré- incubação dos organoides de fibrose cística com corretores CFTR ou potenciadores, tal como VRT-325, VX809, VX770, C8 (http://cftrfolding.org) e corr-4a. Será entendido que quando estes resultados de pré-incubação no inchaço intensificado e/ou inchaço induzido pela forscolina intensificada dos organoides, este demonstra que os corretores tem função CFTR prosperamente restaurada. Os fármacos identificados pela avaliação da fármaco usando o ensaio da invenção também podem ser usados em um ensaio para a medicina personalizada. Tais fármacos são descritos na seção de avaliação de fármaco acima.

[00101] Em algumas formas de realização, a invenção fornece um ensaio da invenção para o uso em comparação da atividade dos fármacos entre os pacientes diferentes in vitro para avaliar as respostas individuais aos fármacos de restauração CFTR para os propósitos da medicina personalizada adaptada ao paciente.

[00102] Em algumas formas de realização, o ensaio para o uso na medicina personalizada, é usada para testar a resposta do paciente individual aos fármacos em que a doença de interesse é fibrose cística e em que o ensaio compreende estímulo de um ou mais organoides derivados a partir de um paciente de interesse com um composto que é capaz de induzir o inchaço dos organoides; estímulo de um ou mais organoides com um fármaco conhecida para afetar a função CFTR ou com um fármaco sendo testada pela sua eficiência em afetar a função CFTR; e formação de imagem de um ou mais organoides e opcionalmente comparando o inchaço do organoide ao inchaço de um organoide que foi estimulado com o composto mas não foi estimulado com o fármaco;em que um aumento no inchaço de um ou mais organoides em resposta ao estímulo por um fármaco indicando que o paciente é responsivo ao tratamento com o fármaco.

[00103] Exemplos 2 e 3 claramente demonstram que inchaço induzido por forscolina pode ser restaurado pelos fármacos com capacidade de restauração CFTR conhecida. De maneira interessante, foi observado que as respostas do fármaco dos organoides são variáveis entre os pacientes com CF, adicionalmente entre organoides homozigotos F508del-CFTR. Este eleva a possibilidade que este ensaio in vitro pode predizer na receptividade do fármaco in vivo dos pacientes individuais. Um modelo terapêutico ideal para CF deve ser para avaliar a efetividade dos fármacos de restauração CFTR disponíveis diretamente após o diagnóstico de CF para otimizar o tratamento no nível pessoal antes do início da doença. Os métodos da medicina personalizada também podem facilitar o desenvolvimento e aprovação dos fármacos em que apenas a resposta dos subgrupos dos pacientes e limita os riscos econômicos associados com uma busca do fármaco. Além disso, o ensaio da invenção pode ser usado pela aprovação das fármacos em pacientes que são genotipicamente emparelhados com fármacos que foram validados por um genotipo CFTR específico. Os resultados da fase II temporária de um ensaio corrente publicados nos websites de North American Cystic Fibrosis Foundation (www.cff.org) e Vertex (www.vrtx.com) indica que as respostas do fármaco a VX-809 e VX770, ou VX-770 monotratamento14, em pacientes CFTR F508del são altamente variáveis entre os pacientes.

[00104] Deste modo, a invenção também fornece o uso de um ou mais organoides para avaliação da receptividade e uma opção do tratamento particular, em que a avaliação compreende o uso de um ensaio de acordo com a invenção e em que o inchaço de organoide é indicativo do tratamento bem sucedido.

[00105] A invenção também fornece um método de tratar uma doença ou aflição, que compreende o uso do ensaio da invenção para identificação do fármaco para a doença ou uma aflição que um paciente é responsivo a e tratamento do paciente com o dito fármaco. Em algumas formas de realização, o fármaco é qualquer fármaco conhecido ou putativo para tratar uma doença ou aflição associada com absorção de fluido ou secreção (ver seção nas doenças ou aflição que lista as doenças ou aflições que aplicam-se igualmente a esta seção). Em algumas formas de realização, o fármaco é uma fármaco conhecido ou putativo pela fibrose cística, diarreia bacteriamente induzida (por exemplo, E. coli enterohemorrágica ou causada pelas toxinas de cólera ou outras toxinas bacterianas); infecção de rotavírus; adrenoleucodistrofia; asma, doença de Tangier; resistência ao fármaco múltiplo (muitos cânceres, bem como alguma bactéria resistente ao antibiótico); colestase obstétrica, COPD, fumo, sinusite, insuficiência pancreática, pancreatite, infertilidade, má nutrição, doenças inflamatórias, doença renal incluindo doença renal policística, doença alérgica, osteoporose, diabéticos, hipertensão, hipotensão, diarreia induzida pelo patogênio (cólera, E.coli), ‘secagem’, cirrose hepática, mau funcionamento do fígado, tumorigênese. Em algumas formas de realização, o fármaco é qualquer fármaco listado na Tabela 3 e/ou Tabela 4.

[00106] Em algumas formas de realização, os métodos de coleta de dados e cultura assistidos por robô ou computador são utilizados para aumentar a produção da avaliação.

[00107] Em algumas formas de realização, o organoide é obtido a partir de uma biopsia do paciente. Em algumas formas de realização, a molécula candidata que causa um efeito desejado no organoide é administrada ao dito paciente.

FIGURAS

[00108] Figura 1. Expansão volumétrica rápida e retorno a morfologia da linha de base foi observada quando os organoides foram estimulados com forscolina para 30 minutos e na remoção de forscolina pela lavagem (dois exemplos representativos). Este indica que expansão volumétrica rápida ou diminuição pode ser a medida pela secreção do fluido (ou eletrólito) ou absorção, respectivamente, por intermédio da membrana apical. A forscolina foi usada como ativador CFTR, sugere por um papel para este canal na secreção do fluido.

[00109] Figura 2. O RNA foi preparado a partir dos organoides humanos e expressão CFTR foi avaliada pelo RT-PCR quantitativo. Um limiar do ciclo para CFTR de 23 indica a expressão alta de CFTR. b2m e GAPDH foram controles positivos para o procedimento.

[00110] Figura 3: Expansão volumétrica nos organoides de murino é CFTR dependente. O desenvolvimento volumétrico dos organoides é medido pela medição da área de superfície de organoide total na incubação com forscolina pelos pontos de tempo indicados. A pré-incubação dos organoides com inibidores CFTR CFTRinh172, GlyH-101 ou combinada foi realizada por 1 hora.

[00111] Figura 4: Expansão Volumétrica nos organoides é dependente de CFTR. A) desenvolvimento volumétrico dos organoides humanos na incubação com forscolina pelos pontos de tempo indicados. As imagens fluorescentes calceína-verde e contraste de interferência diferencial de um exemplo representativo são mostrados. B) Aumento relativo da expansão volumétrica na incubação de forscolina é inibida pela pré-incubação dos organoides com inibidores CFTR CFTRinh172, GlyH-101 ou combinados. A expansão volumétrica é monitorada pela medição da área de superfície do organoide em tempo pela microscopia confocal vivo.

[00112] Figura 5. A) Expansão induzida pela forscolina da área de superfície de organoide é ausente em um paciente com fibrose cística (CF) mas presente em um controle saudável (HC). B) 24 horas de pré-incubação dos corretores CFTR que ajuda para dobrar a proteína CFTR (VRT-325 + corr-4a) aumenta o inchaço induzido por forscolina dos organoides de um paciente com CF.

[00113] Figura 6. A) Organoides de murino de camundongos CFTR- F508del mostram algum inchaço dependente de CFTR induzido por forscolina (FIS) que pode ser aumentado com compostos de restauração CFTR (VRT-325). A inibição CFTR como previamente descrito reduz FIS em CFTR-F508del murino antes ou após a restauração CFTR. B) FIS aumentado em organoides de CFTR F508del murino pelos compostos VRT-325, Corr 4a ou sua combinação. C) FIS aumentado nos organoides CFTR F508del de murino pela incubação das células na temperatura baixa (27C, 24 horas). D) Inchaço forte induzido pela forscolina em organoides de tipo selvagem de murino é ausente nos organoides de murino deficiente por CFTR.

[00114] Figura 7. Genisteína foi adicionada a cultura de organoide e expansão rápida foi formada imagem pelos pontos de tempo indicados (min).

[00115] Figura 8. Organoides humanos foram estimulados com forscolina ou toxina de cólera para estimular a secreção do fluido. Ambos estímulos induzem a expansão volumétrica organoide rápida indicada pelas medições da área de superfície.

[00116] Figura 9. Imagem confocal de fluorescência de um organoide rotulado por calceína-verde com reconhecimento objetivo (linha verde) pela software de análise de imagem volocity no início ou após 30 minutos do estímulo da forscolina.

[00117] Figura 10. Quantificação do inchaço de organoide de murino induzido pela forscolina. (a) análise de microscopia de luz dos organoides estimulada com forscolina ou DMSO. Exemplos representativos pelos pontos de tempo indicados após início do estímulo são mostrados. (b) Imagem confocal de fluorescência de um organoide rotulado por calceína-verde com reconhecimento objetivo (linha verde) pelo software de análise de imagem. (c) Exemplo representativo de um organoide rotulado por calceína-verde estimulado por forscolina. Contraste de interferência diferencial (DIC) e fluorescência foi formado imagem usando microscopia confocal de célula viva. A área de superfície relativa a t = 0 é indicativa no ângulo superior- esquerdo. (d) A área de superfície relativa a t = 0 (área normalizada) de toda resposta de organoides individuais de um recipiente simples. (e) A área de superfície de organoide total normalizado a T = 0 a partir de três recipientes independentes. A resposta média dos recipientes individuais é indicada em negrito (média ± s.e.m). (f) Aumento dependente da dosagem da área de superfície pela forscolina. Cada linha representa a resposta média a partir de três reservatórios individuais como ilustrada em (e) (média ± s.e.m). As barras da escala (a-c) 30 μm. Todos os resultados são representativos por pelo menos três experimentos independentes.

[00118] Figura 11. Inchaço induzido por forscolina de organoides de murino é dependente de CFTR. (a) Curvas de inchaço normalizadas de organoides rotulados por calceína-verde estimulados por forscolina pré- incubados com DMSO, CFTR-inh172, GlyH-101 ou tanto CFTR-inh172 quanto GlyH-101 (média ± s.e.m.). (b,c) Imagens de microscopia confocal representativas dos organoides deficientes CFTR rotulados por calceína-verde (b) ou F508del-CFTR (c) e seus tipos selvagens correspondentes em resposta a forscolina. As barras de escala 50 μm. (d,e) Quantificação do inchaço induzido por forscolina nos Organoides deficiente de CFTR (d) ou F508del- CFTR (e) e seus tipos selvagens correspondentes (média ± s.e.m.) (f) Inchaço induzido por forscolina dos organoides F508del-CFTR rotulados por calceína- verde cultivados por 24 horas a 37° C ou 27° C com ou sem inibição CFTR (média ± s.e.m.). Nota-se que a escala de tempo em f+g é maior. (g) inchaço induzido por forscolina normalizado de organoides F508del-CFTR pré- tratado por 24 horas com DMSO, VRT-325, Corr-4a ou ambos corretores com ou sem inibição CFTR (média ± s.e.m.). Todos os resultados são representativos por pelo menos três experimentos independentes.

[00119] Figura 12. Inchaço induzido por forscolina em organoides humanos é dependente de CFTR. a) A análise Western blot de expressão de CFTR e E-caderina (controle de carregamento) em HC retal humano (n = 2), E60X/4015delATTT (n = 1) ou organoides homozigotos F508del-CFTR (n = 2; painel superior) e expressão de CFTR e ezrina (controle de carregamento) em lisados de célula total em organoides retais humanos que não foram tratados (controle) ou tratados com as enzimas de desglicozilação Endo H ou PNGase F (painel inferior). (b) a detecção de CFTR por M3A7 em um HC retal ou organoide F508del-CFTR, cotingido com falloidin-FITC (actina) e DAPI (núcleo). O contraste de interferência diferencial (DIC) e a fluorescência foram submetidas à formação de imagem usando-se microscopia confocal de célula viva. As barras de escala: 20 μm. (c) Quantificação de controles saudáveis induzidos por forscolina de inchaço de organoide pré-incubado com DMSO, CFTRinh-172, GlyH-101 ou tanto CFTRinh-172 quanto GlyH-101 (média ± s.e.m.). (d) Inchaço induzido por forscolina de organoides retais derivados de 3 controles saudáveis individuais, 2 pacientes com um genotipo F brando (F508del/A455E) e 9 pacientes com um genotipo CF grave (1x E60X/4015ATTTdel; 1x F508del/G542X; 1x F508del/L927P; 6x F508del/F508del). A dilatação média dos grupos diferentes indicados em preto (média ± s.e.m.). (e) respostas FIS de organoides HC ou organoides CF expressadas como área absoluta sob a curva (AUC) calculada a partir dos lapsos de tempo como ilustrado em (d) (linha de base = 100 %, T = 60 min). Cada barra representa os valores AUC proporcionados a partir de pelo menos três experimentos independentes por indivíduo (média ± s.e.m.). (f) Comparação de atividade de CFTR medida por FIS de organoides HC ou CF ou pelas mediçõs correntes intestinais (ICM) das biópsias retais correspondentes. As barras ICM dos grupos indicados diferentes representam secreção de cloreto cumulativo dependente de CTFR induzido por forscolina (μAmp/cm2) relativa à resposta de HC média (apresentada em 100 %) e as barras FIS representam inchaço induzido por forscolina expressado como área sob a curva (AUC) proporcionados a partir de pelo menos três experimentos independentes por indivíduo como ilustrado em (f) relativa à resposta de HC média (100 %). (HC n = 3; CF brando n = 2; CF grave (F508del/F508del) n = 5; CF grave (Other; E60X/4015ATTTdel e F508del/G542X) n = 2; média ± s.d.). todos os resultados são para pelo menos três experimentos independentes. ICMs foram realizados em 4 biópsias retais.

[00120] Figura 13. A correção de CFTR química em organoides de CF retais humanos. (a) a dilatação normalizada de organoides induzidos por forscolina F508del-CFTR rotulados por calceína-verde cultivados por 24 horas a 37° C ou 27° C com ou sem inibição CFTR (média ± s.e.m.). (b) EC50 de organoides F508del para VX-809 ou VX-770. As linhas representam FIS expressado como a área sob a curva (AUC; linha de base 100 %, T = 60 min) calculado a partir de lapsos de tempo como representado em (f) relativa a DMSO (0 %) tratado e VX-809 log(0.5) μM ou VX-770 log(1,5) μM (100 %) organoides tratados. (n = 6 F508del organoides homozigotos; média ± s.e.m.) (c) Imagens de microscopia confocal representativas de controle saudável rotulado com calceína verde (HC) ou organoides F508del-CFTR em resposta à forscolina na restauração farmacológica de CFTR. As barras de escala 100 μm. (d-f) os lapsos de tempo de inchaço normalizado induzido por forscolina de organoides F508del-CFTR pré-tratados por 24 horas com DMSO, VRT-325 (10μM), Corr-4a (10μM) ou ambos os corretores com ou sem inibição CFTR (d), com DMSO, C8 (10μM), Corr-4a (10μM) ou ambos os corretores com ou sem inibição CFTR (f) ou estimulado com o corretor VX-809 (24 horas de pré-tratamento, 3 μM), o potenciator VX-770 (simultâneo com forscolina, 3 μM) ou tratamento de composto combinado com ou sem inibição CFTR (f) (média ± s.e.m.).

[00121] Figura 14. FIS Diferencial de organoides CF na restauração química de CFTR. (a-c) Quantificação de FIS em organoides derivados de 9 pacientes CF individuais pré-tratados por 24 horas com VRT-325 (10 μM), Corr-4a (10 μM) ou ambos os corretores (a), com C8 (10μM), Corr-4a (10μM) ou ambos os corretores (b) ou estimulado com VX-809 (24h de pré- tratamento, 3μM), VX-770 (simultâneo com forscolina, 3μM) ou ambos os compostos (c). As barras corresponem às barras descritas na Fig. 12e do painel de ‘CF grave’. Cada barra representa FIS expressado como a área absoluta sob a curva (AUC) calculado a partir de lapsos de tempo como representado na Fig. 13d-f (linha de base = 100 %, T = 60 min) corrigido a partir do FIS de DMSO-organoides tratados e proporcionados a partir de pelo menos três experimentos independentes realizados com intervalos semanais (média ± s.e.m.). (d) As respostas FIS médias dos organoides F508del/F508del tratados com composto (n = 6 de a-c) e organoides F508del/A455E tratado com DMSO (n = 2) com relação ao FIS médio de organoides de HC tratado com DMSO (n = 3) expressado em AUC calculado a partir de lapsos de tempo como ilustrado na Fig. 13d-f (linha de base = 100 %; T = 60 min; média ± s.e.m.).

[00122] Figura 15. Análise de microscopia de luz de organoides de murino do tipo selvagem estimulado com forscolina ou DMSO. Os exemplos representativos para os pontos de tempo indicados após o início do estímulo são mostrados. O inchaço induzido por forscolina (FIS) de organoides foi revertido na remoção de forscolina pela lavagem. Barra de escala 30 μm.

[00123] Figura 16. Inchaço de organoide em resposta à forscolina. (a) Os exemplos de quantificação de área de superfície de organoide total usando-se software de formação de imagem Volocity. Uma imagem confocal representativa é mostrada de organoides retais rotulados com calceína verde F508del-CFTR pré-tratados por 24h com VX-809 em um reservatório de uma placa de 96 reservatórios nos pontos de tempo indicados a partir do tratamento de forscolina. As barras de escala 520 μm. (b) As porcentagens de objetos que respondem ou que não respondem a forscolina a partir da origem diferente com ou sem tratamento com fármaco calculada a partir de três experimentos independentes. (c) as imagens confocais representativas de organoides irregularmente formados (que não respondem) ou normalmente formados (que respondem) nos pontos de tempo indicados de simulação de forcolina. (d) Quantificação de FIS expressado na área absoluta sob a curva (AUC) calculada a partir dos espaços de tempo como ilustrado na Fig. 13d-f (linha de base = 100 %, T = 60 min) com ou sem pré-seleção das estruturas de resposta. NS = não significante.

[00124] Figura 17. Espaços de tempo do inchaço induzido por forscolina em murino e organoides humanos. O aumento da área de superfície normalizada dos organoides HC estimulado por forscolina individual (a) tipo selvagem, (b) F508del-CFTR (resgatado por temperatura) e (c) intestino delgado humano HC. O inchaço médio induzido por forscolina de tipos de organoides diferentes foi analisado pelos pontos de tempo diferentes para evitar medição do colapso de organoides (linhas tracejadas).

[00125] Figura 18. Expressão CFTR mRNA em murino e organoides humanos. As barras mostram os valores limiares do ciclo PCR de tempo real (CT) representando os níveis mRNA de CFTR, β2m ou GAPDH isolado a partir dos organoides intestino delgado F508del-CFTR (gráfico esquerdo) ou Cftr-/- (gráfico médio) e seus tipos selvagens correspondentes, ou organoides HC de intestino delgado humano.

[00126] Figura 19. Inchaço induzido por forscolina nos organoides HC e CF (a) Inchaço estimulado por forscolina dos organoides intestinais derivados de 7 controles saudáveis individuais (2x duodeno, 1x íleo, 1x cólon, 3x reto), 2 pacientes com um genotipo F brando (F508del/A455E; reto) e 12 pacientes com um genotipo CF grave (duodeno: F508del/F508del e F508del/Exon17del; Íleo: F508del/F508del; reto: 1x E60X/4015delATTT; 1x F508del/G542X; 1x F508del/L927P; 6x F508del/F508del). (b+c) o inchaço induzido por forscolina expressado em AUC calculado a partir dos espaços de tempo do aumento da área de organoide (linha de base = 100 %, T = 60) dos organoides retais com um genotipo CF grave ou brando com ou sem inibição CFTR. (CF grave: F508del/G542X, F508del/L927P e F508del/F508del (6x); CF brando: F508del/A455E n = 2); média ± s.e.m.).

[00127] Figura 20. Medição em pares da função CFTR por FIS ou ICM. (a) Traçagem da medição corrente intestinal representativa (ICM) das biópsias retais F508del-CFTR. (b) Resumo das respostas FIS e ICM em pares dos indivíduos diferentes. FIS é expressado como área absoluta sob a curva (AUC) calculada a partir dos espaços de tempo como ilustrado na Fig. 13d-f (linha de base = 100 %, T = 60 min) e é proporcionado a partir de pelo menos três experimentos independentes realizados com intervalo semanal. Os valores ICM representam respostas correntes induzidas por forscolina média a partir de 4 biópsias retais do mesmo indivíduo. (c) Plotagem de correlação dos valores FIS e ICM de (b). R ( = coeficiente de correlação) e valor p foram calculados por SPSS usando um teste de correlação de classificação de Spearman.

[00128] Figura 21. Correção CFTR química dos organoides CF intestinais não retais. (a,b) Espaços de tempo do inchaço normalizado induzido por forscolina dos organoides de intestino delgado pré-tratados por 24 horas com DMSO, VRT-325, Corr-4a ou ambos os corretores (a) ou estimulados com VX-809 (24 h de pré-tratamento), VX-770 (simultâneo com forscolina) ou seu tratamento combinado (b) (média ± s.e.m.).

[00129] Figura 22. Comparação das respostas medidas (barras totais) e respostas aditivas (barras internas) nos organoides retais no tratamento de fármaco simples ou combinado como indicado na Fig. 14.

[00130] Figura 23. Correção química dos organoides F508del/A455E retais. Inchaço normalizado induzido por forscolina de organoides F508del/A455E retais estimulados com VX-809 (24 h de pré-tratamento) ou VX-770 (simultâneo com forscolina) (média ± s.e.m.).

[00131] Figura 24. Inchaço de organoide induzido por toxina de cólera nos organoides retais humanos é dependente de CFTR. Forscolina e toxina de cólera induz o inchaço dos organoides derivados de HC. A resposta de toxina de cólera é atrasada comparado a forscolina (média ± s.e.m.). os resultados são representativos por três experimentos diferentes.

[00132] Figura 25. Quantificação de inchaço de organoide de murino induzido por forscolina. (a) análise de microscopia de luz dos organoides estimulados com forscolina ou DMSO. Exemplos representativos pelos pontos de tempo indicados após início do estímulo são mostrados. A linha vermelha indica o lúmen organoide interno. (b) Imagem confocal de fluorescência de um organoide rotulado por calceína-verde com reconhecimento objetivo (linha verde) pelo software de análise de imagem. (c) Exemplo representativo de um organoide rotulado por calceína-verde estimulado por forscolina. Contraste de interferência diferencial (DIC) e fluorescência foi formado imagem usando microscopia confocal de célula viva. A área de superfície relativa a t = 0 é indicativa no ângulo superior- esquerdo. (d) Aumento na área de superfície normalizada de 11 organoides individuais em um reservatório simples. A média é indicativa em preto (média ± s.e.m.). (e) Aumento dependente da dosagem da área de superfície por forscolina (5 μM (n = 4 número de organoides analisados), 5 x 10-2 μM (n = 11), 5 x 10-4 μM (n = 10), DMSO n = 9)). As barras de escala (a-c) 30 μm. Todo o dado é representativo de pelo menos três experimentos independentes.

[00133] Figura 26. Inchaço induzido por forscolina de organoides de murino é dependente de CFTR. (a) Curvas de inchaço normalizadas de organoides rotulados por calceína-verde estimuladas por forscolina pré- incubadas com DMSO (n = 8), CFTR-inh172 (n = 7), GlyH-101 (n = 9) tanto CFTR-inh172 quanto GlyH-101 (n = 11) (média ± s.e.m.). (b) Imagens de microscopia confocal representativas de organoides deficientes em CFTR ou tipo selvagem rotulado por calceína-verde em resposta a forscolina. As barras de escala 50 μm. (c) Quantificação de inchaço induzido por forscolina nos organoides de tipo selvagem (n = 6) ou deficientes em CFTR (n = 11) (média ± s.e.m.) (d) tamanho absoluto dos organoides de tipo selvagem ou deficientes em CFTR quantificados em (c) a t = 0 (média ± s.e.m.). (e-g) Similar a b-d mas para organoides de tipo selvagem (n = 8) e CFTR-delF508 (n = 12). As barras de escala 30 μm. (h) Inchaço estimulado por forscolina dos organoides CFTR-delF508 rotulados por calceína-verde cultivados a 37° C com (n = 20) ou sem (n = 15) inibição CFTR ou cultivados a 27° C por 24 horas com (n = 31) ou sem (n = 27) inibição CFTR (média ± s.e.m.). Todo o dado é representativo de pelo menos três experimentos independentes.

[00134] Figura 27. Inchaço induzido por forscolina de organoides humanos é dependente de CFTR. (a) Imagens de microscopia leve dos organoides humanos cultivados as concentrações (WCM) do meio condicionado normal Wnt3a (50 %, painel esquerdo) ou reduzido (5 %, painel direito). As barras de escala 400 μm. (b) Exemplos representativos do inchaço induzido por forscolina nas condições Wnt3a normais ou reduzidas. A área de superfícies relativa a t = 0 são indicadas. As barras de escala 50 μm. A linha tracejada descreve a quantificação de forscolina de lúmen interno (c+d) induzida por inchaço de organoide nos níveis Wnt3a normais (c) ou reduzidos (d) pré-incubados com DMSO, CFTR-inh172, GlyH-101 tanto CFTR-inh172 quanto GlyH-101 (wnt3a normal: n = 29, n = 41, n = 26, n = 15; Wnt3a reduzido: n = 5, n = 7, n = 8, n = 10) (média ± s.e.m.). Todo o dado é representativo de pelo menos três experimentos independentes.

[00135] Figura 28. Ausência do inchaço induzido por forscolina nos organoides a partir de um paciente com CF pode ser resgatado pelos fármacos que corrigem CFTR. (a) Inchaço induzido por forscolina nos organoides a partir de um paciente com CF contendo CFTR-F508del homozigoto é ausente. HC é controle saudável. (b) FIS aumenta nos organoides CF na incubação por 24 h com corretores VRT-325 e corr 4a.

[00136] Figura 29. Análise de microscopia de luz de organoides de tipo selvagem de murino estimulados com forscolina ou DMSO. Exemplos representativos pelos pontos de tempo indicados após início do estímulo são mostrados. O inchaço induzido por forscolina (FIS) dos organoides foi revertido na remoção da forscolina pela lavagem.

[00137] Figura 30. CFTR mRNA é expressado em camundongo e organoides humanos. As barras mostram valores PCR CT em tempo real representando os níveis mRNA de CFTR, β2m ou GAPDH isolado a partir dos organoides CFTR-delF508 (gráfico esquerdo) ou CFTR-/- (gráfico médio) e seus organoides de tipo selvagem ou humanos correspondentes.

[00138] Figura 31. Inchaço gradual induzido por forscolina evita a colisão organoide. Aumento na área de superfície normalizada dos organoides estimulados por forscolina individual (a) tipo selvagem, (b) CFTR-delF508 (resgatado por temperatura) e (c) humano (5 % do meio condicionado Wnt3a, WCM). O inchaço médio induzido por forscolina dos tipos de organoides foi analisado até pontos de tempo diferentes (linha tracejada).

[00139] Figura 32. Inchaço semelhante a Forscolina também ocorreu em resposta a dopamina, ritodrina, epinefrina e salbutamol. A figura mostra o AUC relativo para cada um destes compostos relativos a forscolina.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00140] Aqui demonstramos um ensaio quantitativo rápido para função CFTR em um método de cultura com base em cripta intestinal primária humana. Este método de cultura capaz das células troncos intestinais para expandir nos organoides próximos que imitam a estrutura do intestino in vivo incluindo um lúmen fechado na membrana apical das células. CFTR intestinal é predominantemente expressado na membrana apical das células de cripta onde sua ativação conduz a secreção dos eletrólitos e fluidos. Temos mostrado que a forscolina, que eleva o cAMP intracelular e portanto ativa CFTR, deve mediar o transporte do fluido no lúmen organoide. Usando a microscopia de célula viva, observamos uma expansão rápida do lúmen e área de superfície de organoide total quando a forscolina foi adicionada, enquanto os organoides DMSO tratados de murino não foram afetados (Figura 1). O inchaço induzido por forscolina de organoides foi reverso na remoção de forscolina pela lavagem (Figura 1). CFTR mRNA é expressado em murino e organoides humanos (Figura 2) e inchaço induzido por forscolina foi observado dependente de CFTR pelo uso dos inibidores químicos (camundongo Figura 3; humano Figura 4).

[00141] A parte acima de sua invenção descreve o uso dos organoides intestinais (intestino delgado e cólon) para medir a absorção do fluido e secreção resultando em um tamanho aumentado ou diminuído do organoide. Esta mudança de tamanho é medida pela formação de imagem de organoide e medição manual ou automática da área de superfície, diâmetro ou conteúdo. A quantificação da mudança no tamanho pode ser usada para demonstrar a doença e sua gravidade. Este é exemplificado em comparação de inchaço induzido por forscolina nos organoides desenvolvidos a partir do controle saudável ou um paciente com CF realizando mutações F508del homozigotas (Figura 5a). Este mantém as implicações importantes para o uso deste ensaio como teste diagnóstico para demonstrar a fibrose cística.

[00142] Seu ensaio também pode ser usado para medir o efeito dos tratamentos novos ou existentes, como observamos o inchaço induzido por forscolina nos organoides CF na adição dos fármacos que são conhecidos para corrigir a função CFTR in vitro (Figura 5b). Este sugere que seu ensaio pode ser usado para comparar a atividade dos fármacos entre os pacientes diferentes in vitro para avaliar as respostas individuais aos fármacos de restauração CFTR para os propósitos da medicina personalizada feita sob encomenda ao paciente.

[00143] Os organoides CFTR-delF508 de camundongo tem atividade residual de CFTR maior do que as contrapartes humanas (mas é ausente em camundongos deficientes por CFTR) (Figura 6) e respondem a correção CFTR pela temperatura e compostos para aumento do inchaço induzido por forscolina. Este mostra que seu ensaio também pode ser aplicado pelos fármacos de restauração CFTR-F508del nos organoides derivados das especíes não humanas.

[00144] Também observamos que genisteína, um potenciador CFTR conhecido, pode induzir o inchaço de organoide rápido, adicionalmente indicando que os compostos com atividade potenciadora CFTR pode ser identificada usando este ensaio (Figura 7).

[00145] O método pode ser usado para avaliar as bibliotecas do composto para novos compostos que afetam a absorção do fluido e/ou secreção das células epiteliais.

[00146] O método descrito acima também pode ser usado por outros órgãos tal como estômago ou epitélio do pulmão.

[00147] O método também pode ser usado para estudar o efeito de outras doenças que afetam absorção do fluido ou secreção do epitélio do intestino delgado, cólon, estômago, ou pulmão. Um exemplo deste é o efeito da toxina de cólera (Figura 8).

Aplicações potenciais:

[00148] Aplicação da tecnologia descrita é exemplificada, mas não limitada a:

[00149] O uso do tecido do intestino delgado derivado dos organoides pela avaliação de fármaco. O efeito dos fármacos pelo tratamento de CF é medido pela mudança do tamanho dos organoides em resposta a forscolina ou qualquer outro agente resultante em uma mudança de tamanho dos organoides devido a absorção do fluido ou secreção.

[00150] Medicina personalizada. O uso de organoides de intestino delgado derivados de pacientes para avaliação da receptividade individual a certas opções de tratamento.

[00151] Diagnóstico de CF. Diagnóstico de CF pode ser estabelecido pela medição da mudança de tamanho dos organoides em resposta a forscolina ou qualquer outro agente.

[00152] O método usando os organoides pode ser usado para estudar a gravidade ou efeito da mutação resultando em CF. A resposta dos organoides especídos do paciente aos corretores que assistem a dobra CFTR mutante ou potenciadores que auxiliam na passagem de CFTR e/ou probabilidade de abertura ou outros fármacos usados para tratar CF.

[00153] O método usando os organoides podem ser usados para testar resposta do paciente individual aos fármacos tal como corretores ou potenciadores ou outros fármacos usados para tratar CF.

[00154] O método usando os organoides podem ser usados para testar o efeito de novos fármacos para tratar deficiência de CFTR através da correção da função CFTR.

[00155] O método usando os organoides podem ser usados para testar o efeito de novos fármacos para tratar a deficiência de CFTR por meio não diretamente influenciando a função CFTR.

[00156] O método usando os organoides pode ser usado para medir o aumento rápido no volume medido após poucos minutos a 48 horas (por exemplo, 10 min).

[00157] O método usando os organoides pode ser usado para medir um aumento lento no volume medido após poucos dias em poucas semanas.

[00158] O método usando os organoides pode ser usado para outras doenças ou aflições resultando no fluido alterado e absorção de eletrólito ou secreção do epitélio do intestino delgado.

[00159] As aplicações descritas em 1-10 também podem ser usadas em combinação com cólon ou epitélio do pulmão, ou células a partir de outros tecidos humanos.

[00160] As aplicações descritas em 1-10 também podem ser usadas em combinação com organoides derivados de espécies não humanos.

INOVAÇÃO

[00161] O método descreve fazer uso dos organoides como previamente descrito (Sato 2009, Sato 2011) que contém as células primárias derivadas dos pacientes. A nova observação é o aumento rápido no lúmen e a área de superfície total dos organoides do intestino delgado em resposta aos fármacos alvejando CFTR. Este aumento no tamanho é afetado pela mutação do gene CFTR e os fármacos CF que controlam CFTR. Este nos deixou desenvolver uma nova técnica pela medição da expansão dos organoides como uma medição do efeito da mutação CFTR e tratamentos de fármaco. Este permite para o uso deste método para avaliar eficientemente o tratamento do fármaco e ou pacientes para o efeito na absorção e secreção do fluido, o controle de que é efetuado e, diversas doenças tal como CF e cólera.

PROCEDIMENTO Isolamento de cripta e cultura de organoide

[00162] Os organoides de murino e humanos foram gerados a partir do intestino delgado isolado ou criptas colônicas e mantidos na cultura pelos métodos previamente descritos por Sato et al em 2009 e 2011.

Rotulação organoide

[00163] Para os experimentos formadores de imagem de célula viva confocal, organoides foram rotulados com pigmentos permeáveis de célula diferente que ganham fluorescência na conversão metabólica pelas células vivas, incluindo Traçador e célula laranja, Traçador e célula verde e Calceína- verde (todos de Invitrogen). Enquanto a incubação com Traçador e célula laranja e Traçador e célula verde resultou no tingimento da célula fraca, tingimento de fundamento alto e acúmulo do pigmento em um lúmen organoide observamos excelente rotulação dos organoides com os níveis de fundamento baixo usando Calceína-verde. Testamos condições de rotulação diferentes e observam o ótimo tingimento celular na incubação de calceína- verde 10 μM por 60 minutos.

Formação de imagem da célula viva

[00164] Testamos as apresentações do ensaio diferente e observamos que os organoides foram mais adequados para análise do inchaço induzido por forscolina um a dois dias após passagem, colocado em uma placa de 96 reservatórios em matrigel 5 μl. Para melhorar a penetração dos compostos no matrigel, usamos as diluições de matrigel até 50 %. Os organoides de murino foram pré-incubados com inibidores CFTR (50 μM) por 60 minutos, simultaneamente com Calceína-verde. Para os ótimos efeitos de inibição CFTR nos organoides humanos, estendemos o tempo de incubação a 3 horas com tingimento de calceína-verde simultânea durante a última hora. Os compostos químicos (10 μM) foram pré-incubados por 24 horas tanto nos organoides de camundongos quanto humanos. Os organoides rotulados por calceína-verde foram estimulados com 5 μM de forscolina e diretamente analisados pela formação de imagem da célula viva confocal usando o microscópio LSM Zeiss.

Quantificação de inchaço de organoide

[00165] Usamos o software de quantificação Volocity para analisar os organoides durante o estímulo de forscolina. Iniciamos a análise da expansão do lúmen junto com o aumento na altura da célula da monocamada epitelial. Sob suas condições de rotulação, o software não foi capaz de discriminar entre a camada celular e lúmen devido a perda do contraste. Portanto, o aumento da área de organoide normalizado e total foi analisado durante o inchaço induzido por forscolina, facilmente medido pelo software (Figura 9).

Referências, por exemplo, 1

[00166] Células tronco Lgr5 simples formaram estruturas de cripto- villus in vitro sem um nicho mesenquimal.

[00167] Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5

[00168] Expansão de termo longo dos organoides epiteliais a partir do cólon humano, adenoma, adenocarcinoma e epitélio de Barrett. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, Van Es JH, Van den Brink S, Van Houdt WJ, Pronk A, Van Gorp J, Siersema PD, Clevers H. Gastroenterology. 2011 Nov;141(5):1762-72.

Exemplo 2

[00169] Temos recentemente estabelecidos condições que permitem a expansão do termo longo dos organoides epiteliais a partir das características essenciais de recapitulação do intestino humano da arquitetura do tecido in vivo. Visto que aplicamos esta tecnologia para estudar os organoides intestinais primários dos pacientes que sofreram a partir de fibrose cística (CF), uma doença causada pelas mutações do gene regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR). A forscolina induz o inchaço rápido dos organoides derivados dos controles saudáveis (HC) ou camundongos de tipo selvagem, que é fortemente reduzido em pacientes com CF ou camundongos mutantes F508del e é ausente nos organoides nulos Cftr. Este fenômeno é fenocopiado pelos inibidores específicos por CFTR. O inchaço induzido por forscolina do HC retal expandido in vitro e organoides CF correspondentes quantitativamente com correntes de ânion induzidas por forscolina nas biópsias retais taxadas recentemente ex vivo. A função de F508del-CFTR é restaurada na incubação em temperatura baixa, bem como pelos compostos que restauram CFTR. Este ensaio relativamente simples e robusto facilitará o dignóstico, estudos funcionais, desenvolvimento do fármaco e métodos da medicina personalizada em CF.

Introdução

[00170] As funções de proteína reguladora de condutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR) como um canal de ânion e é essencial para homeostase de fluido e eletrólito nas superfícies epiteliais de muitos órgãos, incluindo pulmão de intestino. A fibrose cística de distúrbio recessivo-autossomal (CF) é causada pelas mutações no gene CFTR1-3. A doença de CF é altamente variável e os pacientes tem uma expectativa de vida média de aproximadamente 40 anos. As mutações de perda de função causam o íon alterado e transporte de fluido que resultam no acúmulo do muco viscoso no trato gastrointestinal e pulmonar. Este é associado com as infecções bacterianas, inflamação aberrante e deficiência de nutrição4. Nas mutações 1900 foram identificados, mas a mutação mais dominante (~67 % de alelos mutantes totais no mundo todo) é uma anulação de fenilalanina na posição 508 (F508del-CFTR) (www.genet.sickkids.on.ca). Este causa má dobra, retenção de ER e degradação precoce da proteína CFTR que evita sua função na membrana de plasma5. Outras mutações no gene CFTR que foi observado em pacientes com CF também prejudicam a dobra de proteína ou produção, gating, condutância, união e/ou interações com outras proteínas6.

[00171] As terapias correntes por CF são principalmente sintomáticas e foco na redução da pressão bacteriana, inflamação e normalização da absorção de nutriente e desenvolvimento físico. Nos últimos anos, compostos múltiplos foram identificados que os defeitos específicos de mutação alvos da própria proteína CFTR6,7. Os ensaios clínicos são correntemente realizados usando os compostos que induzem (i) leitura através do códon de parada prematuro, (ii) correção do tráfego de membrana de plasma de CFTR (corretores) e (iii) intensificação de passagem de CFTR (potenciadores). Recentemente, um ensaio clínico de fase III foi finalizado bem sucedido pelo potenciador VX-770 (Ivacaftor, Kalydeco) nos pacientes com CF com uma mutação G551D-CFTR, demonstrando que o alvejamento de fármaco específico por mutação é praticável em CF8. A terapia de combinação de um corretor (VX-809) e potenciador (VX-770) é correntemente avaliado em um ensaio clínico da fase II para o grupo de paciente dominante abrigando a mutação F508del-CFTR.

[00172] Embora estes desenvolvimentos recentes sejam muito promissores, o nível de restauração funcional de CFTR por estes fármacos adicionalmente é limitada9-11. Além disso, os pacientes mostram as respostas variáveis a estas terapias devido aos mecanismos já indefinidos 8,12-14. A incapacidade de predizer a receptividade do paciente em um compostos corretor que limita-se a eficácia clínica e registro de fármaco. Juntos, este indica que o desenvolvimento de novos compostos e avaliação da eficácia do fármaco no nível dos pacientes individuais seja urgentemente necessária. Deste modo existe apenas um número limitado dos modelos de célula primária disponíveis para avaliar os compostos que restauram a função da mutação CFTR. Quando um tal modelo in vitro adicionalmente pode ser expandido para permitir a análise das respostas do fármaco dos pacientes individuais, podem melhorar a eficácia do fármaco para seleção dos subgrupos de pacientes que respondem.

[00173] Aqui, demonstramos um ensaio quantitativo simples e rápido para Função CFTR em um método de cultura com base em cripta intestinal primário humano e murino que foi recentemente desenvolvido15-17. Este método de cultura capacita as células troncos intestinais expandirem nos organoides fechados contendo estruturas semelhantes a cripta e um lúmen interno revestido pelas células diferenciais, recapitulando a arquitetura do tecido in vivo. O CFTR intestinal é predominantemente expressado na membrana apical das células de cripta onde sua ativação conduz a secreção dos eletrólitos e fluidos18-20. Quando observado que forscolina21 induz o inchaço rápido tanto do controle saudável humano (HC) quanto órganóides de tipo selvagem de murino que completamente depende de CFTR, como demonstrado pelo estímulo de organoides intestinais derivado de camundongo deficientes de CFTR ou pacientes com CF, na inibição química de CFTR de tipo selvagem. Os níveis do inchaço induzido por forscolina pelos organoides retais expandidos in vitro são comparáveis com correntes de ânion induzidas por forscolina medidas nas biopsias retais humanas ex vivo. A correção de temperatura e química da função F508del-CFTR foi facilmente detectada pelas medições de transporte de fluido com base organoide e respostas em um painel de fármacos de restauração de CFTR foram variáveis entre os organoides retais derivados dos pacientes homozigotos F508del diferentes. Estes ensaio robusto é a primeira leitura funcional desenvolvida nos organoides humanos e facilitará o diagnóstico, estudos funcionais, desenvolvimento de fármaco e medicina personalizada por CF.

Resultados

[00174] Quantificação do inchaço de organoide induzido por forscolina

[00175] Primeiro avaliamos se a forscolina, que eleva cAMP intracelular e portanto ativa CFTR, deve mediar a secreção do fluido no lúmen dos organoides intestinais menores derivados dos camundongos de tipo selvagem. Usando a microscopia de célula viva, observamos uma expansão rápida do lúmen e área de superfície de organoide total quando a forscolina foi adicionada, enquanto organoides tratados com DMSO não foram afetados (Fig. 10a). Este inchaço induzido por forscolina (FIS) de organoides foi reverso na remoão da forscolina pela lavagem (Fig. 15).

[00176] À seguir, quantificamos estas respostas pela análise de imagem imparcial. Observamos excelente rotulação de célula enquanto os níveis fundamentais do matrigel circundante permaneceu negativo usando calceína- verde, um pigmento permeável da célula que ganha fluorescência e é retido dentro da célula na conversão metabólica pelas células vivas. A intensidade fluorescente dos objetivos rotulados por calceína-verde foi na média >100 vezes mais abundante como comparado aos níveis fundamentais. Os FIS quantificados dos organoides usando microscopia confocal de célula viva e software formador de imagem que calcula o aumento relativo na área total de todos os objetivos fluorescentes para cada ponto de tempo na adição de forscolina por reservatório (exemplos representativos do reconhecimento objetivo e FIS para organoides simples são indicados na Fig. 10b,c; Fig. 16a). A maioria dos organoides respondem ao estímulo da forscolina (Fig. 10d). Aproximadamente 5-10 % das estruturas que são muito menores, ou organoides não viáveis irregularmente formados não respondem a forscolina (Fig. 16b,c). Visto que estes representam uma fração menor da área de superfície de organoide total em um recipiente, quantification de FIS não foi diferente com ou sem pré-seleção das estruturas de resposta (Fig. 16d). As medições de três recipientes independentes mostram a variação limitada (Fig. 10e). Observamos uma relação dependente da dosagem entre forscolina e aumento da área de superfície durante o período (Fig. 10f). FIS dos organoides de murino é mostrada pelos primeiros 10 minutos, como alguma ruptura dos organoides de tipo selvagem e colapsado quando estímulos mais longos do que 10 minutos foram realizados (Fig. 17a). Juntos, estes resultados mostram que o inchaço de organoide induzido por forscolina pode ser quantificado pela análise de imagem fluorecente imparcial.

[00177] O inchaço induzido por forscolina de organoides de murino são níveis altos dependentes de CFTR de Cftr mRNA nestes organoides suportados por um papel possível para CFTR no inchaço induzido por forscolina (Fig. 18). Para demonstrar que FIS é dependente de CFTR, usamos os inibidores químicos de CFTR22,23 e Cftr-/-24 bem como camundongos mutantes F508del-CFTR 25,26. A pré-incubação (2 horas) com os inibidores CFTR CFTRinh-17222 e GlyH-10123 FIS independentemente reduzidos respectivamente ~90 % e ~75 % comparado ao tratamento de veículo (Fig. 11a). Sua ação combinada FIS totalmente evitada nos pontos de tempo analisados. Adicionalmente FIS dependente de CFTR confirmado usando os organoides isolados a partir do camundongo deficiente de Cftr. FIS estava ausente quando os organoides dos camundongos deficientes de Cftr foram submetidos ao ensaio (Fig. 11b,d). A rotulação de calceína-verde foi comparável entre oeganóides mutantes e tipo selvagem, indicando que células deficientes Cftr foram viáveis. Os organoides dos camundongos que expressam F508del-CFTR apresentou baixos, mas FIS detectável, sugerindo a atividade CFTR residual, consiste com observações precoces neste modelo de camundongo25,26 (Fig. 11c,e). Em suporte deste, o FIS atenuado de organoides F508del-CFTR foi sensível a CFTRinh-172 (Fig. 11f). Junto, estes dados demonstram que FIS em organoides de murino é completamente dependente de CFTR.

[00178] Temperatura e correção química de F508del-CFTR murino

[00179] Adicionalmente para indicar que o ensaio é sensível a correção da função CFTR, realizamos experimentos de resgate de temperatura, um método amplamento aceitável para aumentar função F508del-CFTR27. F508del-CFTR má dobra é reduzido a direção 27° C aos níveis intensificados de CFTR funcional na membrana de plasma. Observamos níveis aumentados de FIS na incubação durante a noite a 27° C (Fig. 11f). A inição química da atividade CFTR fortemente FIS reduzido nos organoides desenvolvidos a temperatura reduzida e normal (Fig. 11f). À seguir usamos corretores químicos VRT-32528 e Corr-4a29 para restaurar função F508del-CFTR. A pré- incubação (24 horas) com VRT-325 intensificado FIS considerando Corr-4a apenas FIS levemente melhorado e foi aditivo a correção por VRT-325 (Fig. 11g). A inibição química de CFTR indicado que o FIS induzido por VRT- 325- e Corr-4a- foi totalmente dependente de CFTR. Colapso dos organoides F508del-CFTR resgatados foi raramente observados (Fig. 17b). Coletivamente, estes resultados demonstram que FIS dos organoides de murino podem revelar a restauração funcional de F508del-CFTR pelos métodos de correção.

[00180] Inchaço induzido por forscolina dos organoides humanos é dependente de CFTR

[00181] À seguir aplicamos suas condições de ensaio as culturas de organoide intestinal humano. Enquanto tanto CFTR maduro (grupo C, 170 kDa) quanto CFTR imaturo (grupo B, 130 kDa) foi detectado pela análise Western blot nos organoides HC humanos, apenas CFTR imaturo detectados nos organoides CF. Nenhum grupo CFTR B- ou C foi observado nos organoides realizando E60X30 e um alelo não relatado que induz uma mudança de estrutura em NBD2 no resíduo 1250 (4015delATTT). E60X e a mutação 4015delATTT novamente identificado mais igualmente resultado na produção de uma proteína truncado, não funcional. A especificidade grupo CFTR B- e grupo C adicionalmente foi indicado pelo tratamento Endo H e PNGase F5, respectivamente (Fig. 12a). A expressão CFTR na membrana apical foi demonstrada nos organoides de controle saudável pela imunocitoquímica, mas não em organoides CF, como indicado pela colocalização com actina apical (Fig. 12b). No entendimento com os experimentos de murino, observamos o inchaço estimulado por forscolina rápido de organoides de controle saudável que foi reduzido em 3 horas de pré- incubação com CFTRinh-172 ou GlyH-101 e completamente inibido pelo tratamento combinado com estes inibidores (Fig. 12c). Os organoides humanos mostram alguns cinéticos inferiores quando comparado aos organoides de murino e raramente colapsa durante o tratamento de forscolina de período longo (Fig. 12c; Fig. 17c).

[00182] Analisamos FIS em um número amplo de organoides intestinais principalmente derivados do reto, mas também de duodeno, íleo e cólon. Observamos FIS forte nos organoides derivados dos pacientes com HC (organoides retais a partir dos pacientes HC ou CF são mostrados na Fig. 11d, todos os organoides são apresentados na Fig. 19a). Os organoides retais derivados dos pacientes que são heterozigoto composto por F508del e A455E31, um genotipo que é associado com CF32 brando, claramente apresenta os níveis FIS reduzidos comparados aos organoides de controle saudável. Os pacientes com genotipos CF graves (homozigotos por F508del; heterozigoto composto por F508del e L927P33, ou G542X31) apresentou muito menos, mas adicionalmente FIS detectável que foi variável entre os pacientes individuais (Fig. 12e). Nenhum FIS foi medido nos organoides E60X/4015delATTT. A inibição química de CFTR abole todas as respostas FIS dos organoides CF (Fig. 19b+c).

[00183] As medições FIS dos organoides HC retais expandidos in vitro ou organoides CF subdivididos em genotipos graves e brandos firmemente correlacionados com medições da corrente intestinal induzida por forscolina (ICM) realizada nas biopsias de sucção retais34,35 de que estes organoides originam (Fig. 12f). Mais traços ICM das biopsias a partir dos pacientes individuais mostraram as correntes de ânion induzidas por forscolina residual que correspondem com uma resposta de forscolina dependente de CFTR quantitativamente similar no ensaio FIS (um traço ICM representativo, uma análise em pares de FIS e ICM para pacientes individuais e análise de correlação de classificação de Spearman (R=0,84, p=0,001) é fornecida na Fig. 20a-c, respectivamente). Juntos, estes dados indicam que FIS nos organoides humanos podem exatamente mede a Função CFTR e mostra que a função CFTR residual nos organoides retais intestinais podem diferenciar entre os homozigotos individuais pela mutação F508del-CFTR.

[00184] Correção CFTR química em organoides CF retais humanos

[00185] À seguir avaliamos se a função F508del-CFTR deve ser aumentada nos organoides humanos pela incubação da temperatura baixa, ou pelos corretores químicos conhecidos VRT-325, Corr-4a, C8 (http://cftrfolding.org), VX-80936 e o potenciador VX-7709. A incubação dos organoides homozigotos F508del na temperatura baixa FIS aumentada como esperado e foi inibida pelos inibidores CFTR químicos (Fig. 13a). À seguir estabilizamos as curvas de resposta-dosagem estabelecidas pelo tratamento simples de VX-809 (na pré-incubação 24h) ou VX-770 (simultaneamente adicionado com forscolina) nos organoides a partir dos 6 pacientes F508del homozigotos (Fig. 13b) e valores EC50 medidos de 135 ± 40 nM e 161 ± 39 nM, respectivamente. Estas curvas de resposta-dosagem estão dentro das faixas previamente relacionadas nas células epiteliais bronqueiais humanas9,36. A combinação dos níveis aumentados induzidos por VX809 e VX770 de FIS, que foi abolido pela inibição CFTR química (exemplos representativos são mostrados na Fig. 13c). Próximo a capacidade de vários corretores para restaurar FIS na pré-incubação 24h foi analiado nos organoides homozigotos F508del. Todos os corretores FIS aumentados embora com uma eficácia diferente (Fig 13d-f; ver Fig. 21 pelas respostas nos organoides não retais). As respostas FIS aumentadas pelas terapias de combinação foram completamente inibidas pela presença dos inibidores CFTR. Observamos que VRT-325/Corr-4a ou C8/Corr-4a sinergisticamente FIS aumentado (ver também Fig. 22), que estava em contraste claro com o efeito aditivo do tratamento VRT-325/Corr-4a observado nos organoides de murino (Fig. 11g). Estes dados indicam que FIS podem com segurança medir a correção ou potencialidade de F508del-CFTR.

[00186] Respostas diferenciais aos fármacos que restauram CFTR nos organoides retais

[00187] À seguir estudamos as respostas FIS em um painel de fármacos de restauração CFTR nos organoides retais derivado de 9 indivíduos que abrigam várias mutações CFTR graves, incluindo 6 pacientes homozigotos F508del. Entre os organoides homozigotos F508del, observamos diferenças no FIS induzido por fármaco (Fig. 14a-c). em geral, FIS estava variável entre os organoides na incubação com os fármacos simples e a distribuição de respondedores altos e baixos foi única por um método de restauração (Fig. 14a-c; ordem do paciente é similar a Fig. 12e no painel ‘CF grave’). CF5 parece ser um respondedor baixo geral em qualquer corretor ou VX-770, mas mostrou uma resposta excepcionalmente menor a VRT-325. Organoides CF3 e CF5 tem respostas similares a VX-809, mas diferem-se em sua resposta a C8. Observamos que as combinações de VRT-325 e Corr-4a em geral sinergizadas mais fortemente induzem FIS do que C8 e Corr-4a. O FIS medido em FIS esperado (valores aditivos do tratamento simples; ilustrado na Fig. 22) é antes constante entre mais pacientes. Todos os organoides heterozigotos do composto F508del também respondem a correção (ver Fig. 23 pelos organoides F508del/A455E), mas nenhuma correção ou potenciação foi observada nos organoides E60X/4015delATTT (Fig.14a-c). No caso de falha o CFTR correto é esperado por causa de nenhum grupo CFTR B- ou C foi detectado nestes organoides por Western blot (Fig. 12a). À seguir comparamos as respostas do fármaco dos organoides F508del aos níveis FIS dos organoides CF ou HC brandos tratados por simulação (Fig. 14d). Esta comparação indica que VX-809 é o corretor mais potente e que o tratamento combinado com VX-809 e VX-770 induz FIS além dos níveis observados nos organoides F508del/A455E, atingindo ~60 % dos níveis HC. Juntos, estes resultados demonstram que a potência dos compostos de alvejamento CFTR para restaurar a função CFTR varia amplamente entre os organoides dos pacientes CF individuais, incluindo homozigotos para F508del-CFTR.

Debate

[00188] Coletivamente, seus resultados indicam que o inchaço induzido por forscolina tanto pelos organoides intestinais humanos quanto de camundongos é dependente de CFTR. O aumento rápido na área de superfície induzido pelos resultados semelhantes a forscolina a partir das características fisiológicas próximas dos organoides intestinais. Os dados prévios indicam que a forscolina pode aumentar a expansão luminal nas estruturas semelhantes ao organoide desenvolvidas de MDCK renal, linhas celulares LIM1863 colônicas ou esferóides intestinais de murino20,37,38, mas a amplitude maior e taxa da resposta FIS igualmente resulta a partir dos níveis de expressão CFTR maiores no modelo de cultura de tecido primário usado aqui.

[00189] O transporte de fluido medido por FIS nos organoides retais correlacionados ao ICM realizados nas biopsias de sucção retal correspondentes. Este ensaio de transporte de fluido pode ser portanto um suplemento valioso pelas medições elétricas da função CFTR correntemente realizadas nos centros CF e podem servir para complementar os dados obtidos por ICM. Usando ICM e FIS, observamos que mais pacientes F508del-CFTR mostraram alguma função CFTR residual, sugerindo que F508del-CFTR é expressado na superfície apical nos níveis baixos39-41. Este também é suportado pela indução de FIS pelo potenciador VX-770 na ausência dos corretores, um efeito que foi previamente relacionado pelas células epiteliais bronqueiais humanas9. Os dados clínicos também suportam o conceito que F508del-CFTR é expressado nos níveis baixos na membrana apical do epitélio de pacientes homozigotos F508del CF42,43.

[00190] O FIS e ICM em pares permitem a comparação das taxas permite a comparação das taxas de secreção de fluido e fluxos de íons são medidos por ICM. Com base na geometria dos organoides durante FIS e as suposições que o lúmen organoide médio é uma esfera e que o inchaço médio é similar em todas as três dimensões e linear no curso de tempo de um experimento, calculamos uma taxa de secreção de fluido de 26 ± 23 μl h-1 cm2 nos organoides HC (correspondentes com um estimado 1,0 x 102 μAmp/cm-2 com base na seção de cloreto isotônico). Quando assumimos a secreção do cloreto isotônico durante ICM, estimamos que os conteúdos medidos correspondem com uma taxa de secreção do fluido aproximado de 12 μl h-1 cm-2. Esta taxa amplamente excede os valores relacionados previamente pelos cistos a partir das células MDCK44 e pelo epitélio das vias aéreas45.

[00191] Este estudo claramente demonstra que FIS pode ser restaurado pelos fármacos com a capacidade de restauração CFTR conhecida. De maneira interessante, observamos que as respostas do fármaco dos organoides são variáveis entre os pacientes com CF, adicionalmente entre organoides homozigotos F508del-CFTR. Este eleva a possibilidade que este ensaio in vitro pode predizer a receptividade de fármaco in vivo dos pacientes individuais. Um modelo terapêutico ideal por CF deve ser para avaliar a efetividade dos fármacos de restauração CFTR disponíveis diretamente após diagnóstico CF para otimizar o tratamento no nível pessoal antes do início da doença. Os métodos de medicina personalizada também podem facilitar o desenvolvimento e aprovação dos fármacos em que apenas os subgrupos dos pacientes respondem e limitam os riscos econômicos associados com a busca do fármaco. Além disso, este pode ser usado pela aprovação dos fármacos em pacientes que são genotipicamente mal emparelhados com fármacos que tem validado por um genotipo CFTR específico. Os resultados da fase II de interim de um ensaio corrente publicado nos websites de North American Fibrose cística Foundation (www.cff.org) and Vertex (www.vrtx.com) indicam que as respostas do fármaco ao monotratamento VX-809 e VX770, ou VX-77014, nos pacientes com CFTR F508del que são altamente variáveis entre os pacientes. Entretanto, o potencial predito das medições da função CFTR com base em organoide pela receptividade de fármaco in vivo permanece ser estabelecida.

[00192] Consequentemente, as respostas do fármaco específicas pelo paciente podem ser preditas usando biopsias retais ex vivo46 ou modelos de cultura do tecido das vias áreas primárias47. Comparado com estas técnicas, as culturas de organoides parecem superior permitindo a geração das séries de dados robustos e amplos a partir dos pacientes individuais. A análise da função CFTR nas culturas de organoides é relativamente fácil, rápido e robusto. Os organoides autodiferenciam nas estruturas de recapitulação do tecido nas placas 96 reservatórios que permitem a medição de até 80 organoides por reservatório e até 96 condições por experimento. Neste formato, as curvas de resposta-dosagem médias em triplicatas pelo fármacos múltiplos pelo paciente individual podem ser facilmente geradas nos pontos de tempo de cultura múltipla como demonstrado neste estudo.

[00193] Usando o método de análise de imagem descrito aqui, os métodos de produção maiores para identificar os novos compostos que restauram a função CFTR podem ser desenvolvidos quando a galvanização automática e estímulos de organoide é praticável. Quando comparamos as respostas do fármaco em organoides com os dados clínicos limitados que foram publicados nos pacientes homozigotos F508del-CFTR13,14 (www.cff.org), apenas o tratamento de combinação de VX-809 e VX-770 foram relacionados para melhorar a função pulmonar em aproximadamente 50 % dos pacientes homozigotos F508del. Esta combinação induz aproximadamente 1,5 vezes os níveis FIS maiores nos organoides homozigotos F508del-CFTR como comparado aos organoides F508del/A455E não tratados e até 60 % dos níveis FIS de organoides HC. Não é incomum os efeitos do tratamento nos modelos in vitro que são superiores para efetuar in vivo medido, mas a correção da dobra no ensaio FIS também excede a correção no epitélio bronquial humano cultivado por aproximadamente 2 vezes9,36. Este pode indicar que os fatores específicos podem controlar a eficácia corretora. Também é igualmente que as taxas FIS são superestimadas em HC quando a expressão CFTR não é a taxa mais longa limitada por FIS além de um limiar particular, por exemplo, transporte de íon basolateral. Estes dados podem sugerir que os novos fármacos de restauração CFTR podem ter um impacto clínico quando FIS atinge os níveis até ~60 % de FIS de tipo selvagem.

[00194] Dois aspectos importantes das culturas de organoide rende esta tecnologia altamente adequada pelos seguintes estudos. Primeiramente, organoides podem ser mais expandidos enquanto mantém os compartimentos da célula tronco intactos durante a cultura de termo longo (em 40 passagens)16. A geração dos números de células maiores ajudarão os estudos bioquímicos e biológicos da célula das alterações celulares dependentes de CFTR e é um pré-requisito pelas avaliações da produção altas. Secundariamente, os organoides podem ser armazenados no nitrogênio líquido, permitindo a geração dos bancos celulares primários a partir dos pacientes com CF. Estes podem ser usados para identificar e estudar os fatores celulares associados com fenotipos clínicos em pacientes com CF e devem permitir pela análise específica do paciente dos novos fármacos desenvolvidas usando os materiais que foram previamente adquiridos.

[00195] Além disso as aplicações possíveis na busca CF, este ensaio pode ser adequado pelo desenvolvimento dos fármacos para tratar a diarreia secretória, uma condição de ameaçadora da vida que resulta de hiper-ativação CFTR nas toxinas patogênicas tal como toxina de cólera48 (Fig. 24) e pelos estudos de homeostase de eletrólito em geral.

[00196] Em resumo, descrevemos um ensaio rápido e robusto para a quantificação da função CFTR usando o modelo de cultura intestinal primário que recapitula as características essenciais da arquitetura do tecido in vivo. Este ensaio relativamente simples facilitará diagnóstico, estudos funcionais, desenvolvimento de fármaco bem como métodos de medicina personalizada em CF.

Métodos Camundongos

[00197] Camundongos nocaute Cftrtm1Cam (Cftr-/-)24 foram cruzados novamente com camundongos FVB e Cftrtm1eur (F508del-CFTR)25,26 foram cruzados novamente com camundongos C57Bl/6 (F12). Os camundongos FVB Cftr-/- congênicos ou camundongos C57Bl/6 F508del-CFTR foram usados com seus companheiros de liteira do tipo selvagem. Os camundongos foram mantidos em uma instalação ambientalmente controlada no Erasmus Medical Center Rotterdam e aprovada pelo local Ethical Committee.

Material humano

[00198] A aprovação para este estudo foi obtida pelo Ethics Committee of the University Medical Centre Utrecht and the Erasmus Medical Centre Rotterdam. Os organoides HC e CF retais foram gerados a partir de quatro biopsias de sucção retais após medições de correte intestinal (ICM) obtidas (i) durante o cuidado CF padrão (E60X/4015ATTTdel; F508delG542X; F508del/L927P; 5x F508del/F508del), (ii) para os propósitos diagnósticos (1x HC) ou (iii) durante a participação voluntária nos estudos CF aprovados pelo local Ethics Committee (2x HC, 1x F508del/F508del). O material a partir de um paciente CF homozigoto F508del-CFTR e um controle saudável foi derivado das seções em repouso de íleo proximal na cirurgia devido ao íleo mecônio (Material foi agrupado fornecido por Dr K. Tenbrock, Department of Pediatrics, the RWTH Aachen University). Quatro biopsias duodenais foram obtidas de 2 pacientes com CF pela gastroduodenoscopia flexível para gerar organoides F508del/F508del e F508del/Exon17del. O mesmo procedimento foi usado para obter 4 biopsias de 2 pacientes com doença celíaca suspeita. As biopsias foram macroscopicamente e patologicamente normais e usadas para gerar os organoides HC.

[00199] Isolamento de cripta e cultura de organoide a partir do intestino de murino

[00200] Os organoides de murino foram gerados a partir das criptas intestinais menores isoladas (SI) e mantidos em cultura como previamente descritos15. O meio condicionado Rspo1 (estavelmente transfectado pelas células Rspo-1 HEK293T foram agrupados fornecidos por Dr. C. J. Kuo, Department of Medicine, Stanford, CA) foi usado em vez do Rspo-1 recombinante e adicionado ao meio de cultura em uma diluição 1:10. Os organoides Cftr-/- e F508del-CFTR foram obtidos a partir dos segmentos SI próximos e distais, respectivamente. Os organoides a partir da passagem 1-10 foram usados pela formação de imagem confocal.

[00201] Isolamento de cripta e cultura de organoide a partir das biopsias humanas

[00202] O isolamento de cripta e cultura das células intestinais humanas foram previamente descritas16. De fato, as biopsias foram lavadas com solução de quelação completa fria e incubada com 10 mM de EDTA por 30 (intestino delgado) ou 60 (reto) minutos a 4° C. O sobrenadante foi coletado e EDTA foi sempre lavado. As criptas foram isoladas pela centrifugação e embebidas em matrigel (fator de desenvolvimento reduzido, livre de fenol, BD bioscience) e semeadas (50-200 criptas por 50 μl matrigel por reservatório) em placas de 24 reservatórios. O matrigel foi polimerizado por 10 minutos a 37° C e submetidos em imersão no meio de cultura completo: DMEM/F12 avançado suplementado compenicilina/estreptomicina, 10 mM de HEPES, Glutamax, N2, B27 (todos de Invitrogen), 1 μM de N-acetilcisteína (Sigma) e fatores do desenvolvimento: 50 ng/ml de mEGF, 50 % do meio condicionado Wnt3a (WCM) e 10 % meio condicionado Noggin (NCM), 20 % do meio condicionado Rspo1, 10 μM de Nicotinamida (Sigma), 10 nM de Gastrin (Sigma), 500 nM de A83-01 (Tocris) e 10 μM de SB202190 (Sigma). O meio foi reabastecido a cada 2-3 dias e os organoides foram passados 1:4 a cada 7-10 dias. Os organoides a partir da passagem 1-10 foram usados pela formação de imagem da célula viva confocal. Para a produção de WCM e NCM, as células L produzem Wnt3a (ATCC, nr: CRL-264) foram selecionadas pelos sub-clones de expressão alta e conteúdo de comprimento total humano foi estavelmente transfectado nas células HEK293T, respectivamente (ambos foram agrupados fornecidos por Clevers Laboratory). As quantidades e atividade dos fatores expressados em cada batelada foram avaliadas usando os dot blots e plasmídeos repórteres de luciferase (TOPflash and FOPflash; Millipore) como previamente descritos 49,50.

Ensaios de estimulação

[00203] Os organoides humanos ou de camundongo a partir da cultura de 7 dias de idade foram semeados em uma placa de cultura de 96 reservatórios de fundo plano (Nunc) em 5 μl matrigel comumente contendo 20-80 organoides e 100 μl meio de cultura. Um dia após a semeadura, organoides foram incubados por 60 minutos com 100 μl de meio de cultura padrão contendo 10 μM de calceína-verde (Invitrogen). Para a ótima inibição CFTR, os organoides foram pré-incubados por 2h (camundongo) ou 3h (humano) com 50 μM de CFTRinh-172, 50 μM de GlyH-101 ou seu tratamento combinado (ambos de Fibrose cística Foundation Therapeutics, Inc). Após tratamento com calceína-verde (com ou sem inibição CFTR), 5 μM de forscolina foi adicionado e os organoides foram diretamente analisados pela microscopia de célula viva confocal (LSM710, Zeiss, 5x objectivo). Três reservatórios foram usados para estudar uma condição e até 60 reservatórios foram analisados pelo experimento. Pela correção CFTR, organoides foram pré-incubados por 24 horas com 10 μM de VRT-325, 10 μM de Corr-4a, 10 μM de C8 (todos de Fibrose cística Foundation Therapeutics, Inc), 3 μM de VX-809 (Selleck Chemicals LLC, Houston, USA) ou combinações como indicado. Para potenciação CFTR, 3 μM de VX-770 (Selleck Chemicals LLC) foi simultaneamente adicionado com forscolina. As diluições de VX-809 e VX-770 foram usadas como indicadas na Fig. 13b.

Quantificação da área de superfície de organoide

[00204] O inchaço de organoide estimulado por forscolina foi automaticamente quantificado usando software formador de imagem Volocity (Improvision). A área de organoide total (plano XY) aumenta relativa a T=0 do tratamento de forscolina foi calculada e medida a partir de três reservatórios individuais pela condição. A área sob a curva (AUC) foi calculada usando Graphpad Prism.

Análise estatística

[00205] Um teste Kolmogorov-Smirnov foi usado para testar se os dados ICM e FIS foram normalmente distribuídos. Um teste T de student formado pares foi usado para comparar FIS com ou sem pré-seleção dos organoides correspondentes (Fig 16d). Um teste de correlação de classificação Spearman foi usado para correlacionar as medições ICM com o inchaço de organoide (Fig 20c). Um valor p < 0,05 foi considerado como estatisticamente significante. Todos os dados foram analisados nos estatísticos SPSS versão 20.0 para Windows.

Isolamento RNA e qPCR

[00206] A partir dos organoides duodenais humanos que foram cultivados por >12 semanas, RNA foi isolado com o RNeasy minikit (Qiagen) e quantificado pela densidade óptica. cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA para realização de um PCR de transcrição reversa (Invitrogen). A partir dos organoides intestinais menores de murino que são cultivados por >6 semanas, RNA foi isolado usando Trizol (Invitrogen) e quantificado pela densidade óptica. O cDNA foi gerado de 500 ng pelo kit da síntese de cDNA iScriptTM (Bio Rad). Os níveis de RNA mensageiro (mRNA) do CFTR humano e Cftr de camundongo foram determinados pelo RT-PCR de tempo real quantitativo com o método SYBR Green (Bio-Rad). A desidrogenase de Gliceraldeído-3-fosfato (GADPH) ou abundância de β2M mRNA foi usada para medir a entrada de cDNA.

Análise Western blot

[00207] Para detecção de proteína CFTR, os organoides HC ou CF foram lisados no tampão Laemmli suplementados com tabletes inibidores de protease completos (Roche). Os lisados foram analisados por SDS-PAGE e eletroforeticamente transferidos em uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore). A membrana foi bloqueada com 5 % da proteína do leito em TBST (0,3 % de Tween, 10 mM de Tris pH8 e 150 mM de NaCl em H2O) e sondado durante a noite a 4° C com uma combinação dos anticorpos anti-CFTR monoclonais de camundongo 450, 769 e 596 (1:5000, Fibrose cística Folding consortium), seguido pela incubação com os anticorpos secundários conjugados por HRP e desenvolvimento ECL. Pela desglicosilação CFTR, os organoides HC foram lisados no tampão RIPA (50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,1 % de SDS, 0,5 % de desoxicolato de sódio e 1 % de triton) suplementado com tabletes inibidores de protease completos e incubados com PNGase F e Endo H por 3h a 33° C (ambos de New England BioLabs).

Imunocitoquímica

[00208] Os organoides completos a partir da cultura de 5 dias foram incubados com metanol (sigma) por 10 minutos a -20° C. Os organoides foram sondados com o anticorpo anti-CFTR monoclonal de camundongo M3A7 (1:25; de Abcam) por 16 horas a 4° C, seguido pela incubação simultânea de anticorpos secundários conjugados por alexa flúor 649- (1:500; de Sigma) e faloidin-FITC por 1 hora a 4° C (1:200; de Sigma). Os organoides foram embebidos em Mowiol contendo DAPI (1:10000) e analisados pela microscopia confocal como previamente descrito51.

Medição corrente intestinal (ICM)

[00209] A secreção de cloreto transepitelial nas biopsias de sucção retal humanas (4 por paciente) foi medida como previamente descrita35 usando uma emenda recente (pré-lavagem repetitiva)36 que melhora acentuar as respostas correntes de ânion induzidas por forscolina pela redução dos níveis cAMP basais. De fato, as biopsias foram coletadas na solução salina tamponada de fosfato em gelo e diretamente montada nas câmaras micro-Ussing adaptadas (abertura 1,13 ou 1,77 mm2). Após o equilíbrio, os seguintes compostos foram adicionados em uma ordem padronizada ao lado mucosal (M) ou serosal (S) do tecido: amilorida (0,01 mM, M), para inibir absorção Na+ eletrogênica sensível a amilorida; carbacol (0,1 mM, S), para iniciar a secreção Cl- ligada por C cinase de proteína e Ca2+ colinérgica; DIDS (0,2 mM, M), para inibir canais sensíveis a DIDS, não CFTR Cl- semelhantes aos canais Cl- dependentes de Ca2+ (CaCCs); histamina (0,5 mM, S), para reativar o caminho secretório dependente de Ca2+ e para medir o componente insensível a DIDS de secreção Cl- dependente de Ca2+; forscolina (0,01 mM, S), para ativar totalmente a secreção de ânion mediada por CFTR. Os valores Isc brutos (μA) foram covertidos a μA/cm2 com base na área de superfície da abertura.

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Observações adicionais

[00261] Observação adicional 1. Organoides do tipo selvagem de murino mostram inchaço rápido no tratamento com forscolina.

[00262] Observação adicional 2. Inchaço induzido por forscolina está ausente em roganóides derivados de camundongos deficientes em CFTR.

[00263] Observação adicional 3. Organoides de camundongos que expressam F508del-CFTR apresentam FIS baixo mas detectável, siugrindo atividade de CFTR residual.

[00264] Observação adicional 4. Organoides de controle saudáveis humanos mostram inchaço rápido no tratamento com forscolina.

[00265] Observação adicional 5. Inchaço induzido por forscolina em organoides derivados de um paciente com CF com um genotipo brando (F508del/A455E).

[00266] Observação adicional 6. FIS baixo é observado em organoides derivados de um paciente homozigoto F508del.

[00267] Observação adicional 7. Nenhum FIS é detectado em organoides retais derivados de um paciente E60X/4015ATTTdel.

[00268] Observações adicionais de 8 a 16. Restauração de FIS em organoides homozigotos F508del retais por VRT-325 (8), Corr-4a (9), C8 (10), VX-809 (11), VX-770 (12), VRT-325+Corr-4a (13), C8+Corr-4a (14), VX-809+VX-770 (15) or VX-809+VX-770 e inibição de CFTR (16).

Exemplo 3

[00269] O regulador de condutância da transmembrana de fibrose cística (CFTR) funciona como um canal de íon e é essencial para a homeostase de fluido e eletrólito em superfícies epiteliais de muitos órgãos, incluindo pulmão e instestino. O distúrbio recessivo autossômico fibrose cística (CF) é causado por mutações do gene CFTR. A doença CF e altamentwe variável e os pacientes têm uma expectativa de de vida média de aproximadamente 40 anos. As mutações de perda de função causam íon alterado e transporte de fluido que resulta no acúmulo de muco viscoso no trato pulmonar e gastrointestinal. Este está associado com infecções bacterianas, inflamação aberrante e deficiência de nutrição. Mais de 1500 mutações foram descritas, mas a mutação mais dominante (~67 % de alelos mutantes totais no mundo todo) é uma anulação de fenilalanina na posição 508 (CFTR-delF508). Ito causa a má dobra, retenção por ER e degradação precoce da proteína CFTR que evita a função na mambrana plasmática. Outras jutações no gene CFTR que foi observada em pacientes com CF também comunica a dobra de proteína or impair produção de proteína, passagem, condutância, união e/ou interações com outras proteínas {Riordan:2008dp}.

[00270] A terapia corrente contra CF é, principalmente, sintomática e foca na redução da pressão bacteriana, inflamação e normalização da absorção de nutriente e desenvolvimento físico. Recentemente, compostos múltiplos foram identificados alvejando defeitos específicos da mutação da proteína CFTR por si só {Accurso:2010jx, Clancy:2011ic}. Ensaios químicos são correntemente realziados usando-se compostos que induzem i) leitura de códon de imterrupção prematuro, ii) correção do tráfego de membrana plasmática de CFTR (corretores) e iii) intensificam a passagem de CFTR (potenciadores) {Rogan:2011es}. Recentemente, um ensaio clínico de fase III foi completado de maneira bem sucedida quanto a um potenciador em pacientes com CF com uma mutação CFTR-G551D, demonstrando que o alvejamento de fármaco específico de mutaçãoé praticável em CF {Shah:2011gu}. As combinações de corretores e potenciadores são correntemente estimadas em um ensaio de fase II para o grupo de paciente dominante que abriga a mutação CFTR-delF508.

[00271] Embora estes desenvolvimentos recentes sejam muitp promissores, o nível de restauração funcional de CFTR por estes fármacos em sistemas de modelo in vitro aina é limitado. Além disso, os pacientes mostram respostas variáveis a estas terapias devido a mecanismos adicionalmente indefinidos. A incapacidade de selecionar estes sub-grupos não respondedores limita a eficácia clínica e o registro do fármaco. Juntos, isto indica que o desenvolvimento de novos compostos e a avaliação da eficácia do fármaco no nível de pacientes individuais são urgentemente necessários. Deste modo, existem apenas modelos de célula primária limitados disponíveis para a avaliação quanto a compostos que restauram a função de CFTR mutante. Quando um tal modelo in vitro adicionalmente pode ser expandido para permitir a análise de resposta a fármacos de pacientes individuais, isto pode melhorar a eficácia do fármaco selecionando-se subgrupos de pacientes respondedores.

[00272] Aqui demonstramos um ensaio quantitativo rápido, quanto à função de CFTR em um método de cultura com base em cripta intestinal primária de murino ou humana. Este método de cultura permite que as células tronco intestinais expsndam-se em organoides fechados contendop estruturas semelhantes a cripta e um lúmen interno {Sato:2011fy, Sato:2009jg}. O CFTR intestinal é predominantemente expressado na membrana apical das células de cripta onde sua ativação conduz a secreção de eletrólitos e fluidos {Venkatasubramanian:2010jc, Currid:2004ck}. Neste estudo, estimamos a forscolina, que aumenta o cAMP intracelualr e, desse modo, ativa o CFTR, pode mediar o transporte de fluido no lúmen do organoide. Usando-se a microscopia de célula viva, observamos uma expansão rápida do lúmen e a área de superfície de organoide total quando a forscolina foi adicionada, enquanto os organoides tratados com DMSO não foram afetados (Fig. 25a). Este inchaço induzido por forscolina (FIS) dos organoides foi revertido na remoção da forscolina pela lavagem (Fig. 29). Os níveis altos de CFTR mRNA nestes organoides adicionalmente suportou um papel possível contra CFTR em FIS dos organoides (Fig. 30).

[00273] A seguir, quantificamos estes respostas pela análise de imagem não desviada. Observamos rotulação celular excelente enquanto os níveis fundamentais do matrigel circundante permaneceu negativo usando-se calceína-verde, um fármaco permeável na célula que, na conversão metabólica por células viventes ganha fluorescência e é retido dentro da célula. Quantificamos FIS de organoides individuais usando-se microscopia confocal de célula viva e software de formação de imagem que calculou a área de superfície do objeti fluorescente para cada ponto de tempo na adição de forscolina (Fig. 25b,c). Os organoides múltiplos em um reservatório simples foram simultaneamente simulados e analisados (Fig. 25d). Observamos uma relação dependente de dose entre forscolina e aumento de área de superfície durante o tempo (Fig. 25d). O FIS de organoides murinos é mostrado durante os primeiros 10 minutos, quando alguns organoides do tipo selvagem entraram em colapso quando estímulos de até 30 minutos foram realizados (Fig. 31a). Juntos, estes resukltados mostram que a expansão de organoide induzido por forscolina pode ser quantificada por análise de imagem fluorescente não desviada.

[00274] Para demonstrar um papel de CFTR no inchaço induzido por forscolina, usamos inibidores químicos de CFTR e CFTR-delF508 mutante bem como camundongos de nocaute CFTR mice {French:1996hb, Ratcliff:1993ik}. Pré-incubação com os inibidores de CFTR CFTRinh-172 {Tiagarajah:2004ck} e GlyH-101 {Muanprasat:2004fx} FIS independenteemnte reduzido em ~80 % comparado com o tratamento de veículo (Fig. 26a). Sua ação combinada evitou totalmente FIS nos pontos de tempo analisados. Adicionalmente confirmamos o FIS dependente de CFTRusando-se organoides isolados de camundongos deficientes em CFTR. O FIS esteve completamente ausente quando os organoides de camundongos deficientes em CFTR-foram estimados (Fig. 26b,c). A rotulação com calceína verde foi similar indicando que as células deficientes em CFTR foram viáveis. Os tamanhos absolutos dos organoides selecionados no início dos experimentos não foram diferentes (Fig. 26d,g). Os organoides de camundongos que expressam CFTR-delF508 apresentaram FIS baixo, mas detectável, sugerindo atividade residual de CFTR, consistente com observações anteriores neste modelo de camundongo {French, 1996, Wilke 2011} e em uma sub-categoria de pacientes com F508del CFTR {Bronsveld/Veeze} (Fig. 26e,f). No suporte deste, o FIS em camundongos CFTR-delF508 é pacialmente sensível a CFTRinh-172 (Fig. 26h).

[00275] Para adicionalmente indicar que nosso ensaio é sensível à correção da função de CFTR, realizamos experimentos de resgate de tempoeratura, um método amplamente aceito para aumentar a função de CFTR-delF508 {Denning:1992hs}. A má dobra de CFTR-delF508 é reduzida a 27° C levando-se a níveis intensificados de CFTR funcional na membrana plasmática. Observamos os níveis aumentados de FIS na incubação durante a noite a 27° C (Fig. 26h). Embora o FIS de organoides de CFTR-delF508 sob estas condições atinge níveis comparáveis com os organoides do tipo selvagem, o colapso de organoide dentro de 30 minutos raramente ocorre (Fig. 31b). A inibição química de atividade de CFTR reduziu gravemente o FIS em organoides desenvolvidos em temperatura normal e reduzida (Fig. 26h). Coletivamente, estes resultados demonstraram que o FIS em organoides de murino é toalmente dependente de CFTR e é sensível para detectar a função aumentada de CFTR-delF508 por um método de correção padrão descrito na literatura.

[00276] A seguir, aplicamos nossas condições de ensaio à culturas de organoide humano. As condições de cultura para organoides de camundongo e humanos diferem de maneira significante, levando a um fenotipo semelhante a cisteína de organoides humanos em comparação com organoides de camundongo (Fig. 27a, painel esquerdo). Este fenotipo semelhante a cisto a partir de quantidades altas de Wnt3a no meio de cultura padrão {Barker:2010cp, Sato:2011fy}. Observamos que os organoides reforma-se a um fenotipo de formação de embrião quando cultivado sob as concentrações de Wnt3a baixas (Fig. 27a, painel direito), uma condição que evita a expansão a longo prazo da cultura de organoide organoide, mas não afeta imediatamente a viabilidade celular. Estimulamos os organoides cultivados em concentrações de Wnt3a altas (Fig. 27b,c) e baixas (Fig. 27b,d) com forscolina e observou FIS maior em condições de Wnt3a baixas, atingindo-se níveis comparáveis com os organoides de murino. Em contraste com os organoides de murino, organoide humano que dificilmente colide durante FIS dentro de 40 minutos (Fig. 31c). Tanto em condições de Wnt3a altas quanto baixas, o FIS foi totalmente inibido por inibidores de CFTR. Estes dados indicam que o FIS em organoides humanos é mediado por CFTR.

[00277] A seguir, estimamos organoides humanos derivados de um paciente com F508del CFTR homozigoto. Nenhum inchaço induzido por forscolina foi observado em organoides CF (Fig 28a). Entretanto, o FIS foi induzido em organoides CF no tratamento com corretores de CFTR VRT-325 e corr-4a (Fig 28b). isto adicionalmente indicou que o FIS em organoides humanos é dependente de CFTR e que nosso ensaio pode ser usado para medir fármacos que impactam a função de CFTR F508del.

[00278] Coletivamente, nossos resultados indicam que o inchaço induzido por forscolina de estruturas de organoides intestinais pequenos tanto de camundongo quanto humano é dependente de CFTR. Nosso ensaio recentemente desenvolvido que mede a atividade de CFTR adicionalmente deve ser desenvolvido para o diagnóstico de CF e realiza avaliações de rendimento alto para identificar novos compostos que restauram a função de CFTR. Além disso, este ensaio pode ser adequado para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento de diarreia secretora, uma condição que ameaça a vida que resulta de hiper-ativação de CFTR por toxinas patogênicas e para os estudos de homeostase de eletrólito em geral. Os organoides dilatados reverteram ao fenotipo normal na lavagem da forscolina (Fig. 29) e, portanto, pode ser possivelmente usado como modelo paraa (re)absorção intestinal.

[00279] Dois aspectos importantes das culturas de organoide tornam-os altamente adequados para seguir os estudos. Primeiramente, os organoides podem ser grandemente expandidos enquanto mantém-se tronco durante a cultura de longo prazo (mais de >30 passagens). A geração de números celulares grandes é requerida para gerar critério nas alterações celulares dependentes de CFTR no nível de biologia dos sistemas e um pré-requisito para avaliações de rendimento alto. Em segundo lugar, os organoides podem ser armazenados em nitrogênio líquido, permitindo a geração de bancos de células primárias de pacientes com CF. Estes podem ser usados para identificar e estudar os fatores celulares associados com os fenotipos clínicos em pacientes com CF. Uma outra possibilidade excitante deve ser o uso de nosso ensaio in vitro para predizer a responsividade de fármaco in vivo no nível de pacientes individuais e pode ser especialmente adaptado para fármacos que alvejam o CFTR mutante diretamente. Isto pode facilitar o desenvolvimento de fármacos e a aprovação de fármacos aos quais apenas sub-grupos de pacientes respondem.

Métodos Camundongos

[00280] Camundongos de nocaute Cftrtm1Cam (CFTR-/-) {Ratcliff:1993ik} foram cruzados novamente com camundongos FVB e Cftrtm1eur (CFTR-delF508) {French:1996hb} foram cruzados novamente com camundongos C57Bl/6 (F12). Camundongos Congenic FVB CFTR-/- ou camundongos C57Bl/6 CFTR-delF508 foram usados com seus companheiros de liteira. Os camundongos foram mantidos em uma instalação ambientalmente controlada no Erasmus Medical Center Rotterdam and approved by the local Ethical Committee.

Material de paciente

[00281] Duas biópsias de 3 a 5 mm de diâmetro foram obtidas do bolo e os pars horizontalis do duodeno de um paciente com doença celíaca suspeita usando-se gastroduodenoscopia flexível. As biópsias foram macroscópica e patologicamente normais. A aprovação para este estudo também foi obtida pelo Ethics Committee local.

O isolamento de cripta e cultura de organoide de intestino de murino

[00282] Os organoides de murino foram gerados a partir de criptas intestinais pequenas isoladas e mantidas na cultura como descrito previamente {Sato:2009jg}. Meio condicionado com Rspo1 (As células foram gentilmente fornecidas por A. Ootani) foi usado em vez de Rspo-1 recombinante e adicionado ao meio de cultura em uma diluição de 1:10. Os organoides de CFTR-/- e CFTR-delF508 foram obtidos a partir de segmentos SI proximal e distal, respectivamente. Os organoides da passagem de 1 a 9 foram usados para a formação de imagem confocal.

Isolamento de cripta e cultura de organoide a partir das biópsias humanas

[00283] Isolamento de cripta e cultura de células intestinais humanas foram descritos previamente {Sato, gastro 2011}. Em resumo, as biópsias foram lavadas com solução de quelação completa e incubadas com 10 mM de EDTA por 5 a 15 minutos a 4° C. O sobrenadanete foi coletado e o EDTA foi lavado. As criptas foram isoladas por rotação e incluídas em matrigel (fator de desenvolvimento reduzido, isento de fenol, BD bioscience) e semeados (500 cripatas por 50 μl de matrigel por reservatório) em ppacas de 24 reservatórios. O matrigel foi polimerizado por 10 minutos a 37° C e imerso em meio de cultura completo: advanced DMEM/F12 suplementado com penicilina/estreptomicina, 10 mM de HEPES, Glutamax, N2, B27 (todos da Invitrogen), 1 μM de N-acetilcisteína (Sigma) e fatores de desenvolvimento: 50 ng/ml de mEGF, meio condicionado de Wnt3a a 50 % e meio condicionado de Noggin a 10 % (ambos gentilmente cedidos pelo labortório do Dr. H. Clevers), meio condicionado de Rspo1 a 20 %, 10 μM Nicotinamida (Sigma), 10 nM Gastrin (Sigma), 500 nM A83-01 (Tocris) e 10 μM de SB202190 (Sigma). O meio foi renovado a cada 2 a 3 dias e os organoides foram passados 1:4 a cada 7 a 10 dias. A partir da passagem 6 em diante, os organoides foram cultivados com quantidades normais (50 %) ou reduzidas (5 %) de meio condicionado de Wnt3a por 5 dias. Os organoides da passagem 6 e 7 foram usados para a formação de imagem conocal da célula viva.

Ensaios de estímulo

[00284] Organoides humanos ou de camundongo de uma cultura de 7 dias de idade froam semeados em placa de cultura de 96 reservatórios de fundo plano (Nunc) em 5 μl de matrigel contendo de 10 a 40 organoides e 100 μl de meio de cultura normal. Um ou dois dias após a semeadura, os organoides foram incubados por 60 com 100 μl de meio de tingimento (advanced DMEM/F12 suplementado com penicilina / estreptomicina, 10 mM de HEPES e Glutamax) contendo 10 μM de calceína-verde (Invitrogen). Para a inibição de CFTR, os organoides foram simultaneamente incubados por 60 minutos com 10 μM de calceína-verde e 50 μM de CFTRinh-172 (Sigma), 50 μM de GlyH-101 (Calbiochem) ou tratamento combinado de 50 μM de CFTRinh-172 e 50 μM de GlyH-101. Após 60 minutos de tratamento com calceína-verde (com ou sem a inibição de CFTR), de 5 μM de forscolinb foi adicionado e os organoides foram diretamente analisados pela microscopia de célula viva confocal (LSM710, Zeiss, 5x objetiva). A área de superfície do organoide foi calculada pelo software de formação de imagem Volocity.

Isolamento de RNA e qPCR

[00285] A partir dos organoides duodenais humanos que foram cultivados por >12 semanas, o RNA foi isolado com o minikit RNeasy (Qiagen) e quantificada por densidade ótica. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA pela realização de um PCR de transcrição reversa (Invitrogen). a partir de organoides intestinais pequenos que foram cultivados por > 6 semanas, o RNA was foi isolado usando-se Trizol (Invitrogen) e quantificada por densidade ótica. O cDNA foi gerado a partir de 500 μg pelo kit de síntese de DNA iScriptTM (Bio Rad). Os níveis de RNA (mRNA) de CFTR humano e de camundongo foram determinados por RT-PCR de tempo real quantitativo com o método SYBR Green (Bio-Rad). Gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GADPH) ou a abundância de β2M mRNA foi usada para indicar a entrada de cDNA. Referências para a Tabela 3: 1 Ma, T., J. R. Thiagarajah, H. Yang, N. D. Sonawane, C. Folli, L. J. V. Galietta and A. S. Verkman. 2002. 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Claims (25)

1. Método in vitro, caracterizado pelo fato de que o método é para: (a) estudar a eficácia de um ou mais fármacos para tratar fibrose cística, doença do rim policístico ou cólera, em que o método compreende a estimulação de um ou mais organoides de fibrose cística, doença do rim policístico ou cólera gerados a partir de células primárias com ditos um ou mais fármacos; ou (b) varredura de uma biblioteca de composto para identificar compostos que afetam a absorção e/ou a secreção de fluido, em que o método compreende: estímulo de um ou mais organoides com a biblioteca de composto; e identificar um composto que é capaz de induzir a dilatação do um ou mais organoides; ou (c) diagnosticar fibrose cística, doença do rim policístico ou cólera, em que o método usa um ou mais organoides, em que o um ou mais organoides são gerados a partir de células primárias, e em que o método compreende medir a dilatação do um ou mais organoides, em que dilatação significa uma mudança no tamanho do um ou mais organoides devido à absorção ou secreção do fluido.

2. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a) ou 1(b), caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente o estímulo do um ou mais organoides com um composto que é capaz de induzir uma mudança no tamanho dos organoides.

3. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(b) ou reivindicação 2 como dependente diretamente ou indiretamente da reivindicação 1(b), caracterizado pelo fato de que o método compreende estímulo do um ou mais organoides com um ou mais fármacos.

4. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que os organoides são gerados a partir de células primárias humanas.

5. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que os organoides são organoides epiteliais.

6. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1(a) ou 1(b), caracterizado pelo fato de que a mudança no tamanho é comparada com um organoide de controle saudável.

7. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a) ou reivindicação 3, caracterizado a mudança no tamanho é uma mudança no tamanho em comparação com o organoide que não foi estimulado com o um ou mais fármacos.

8. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 2 ou qualquer uma das reivindicações 3 a 7 como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende o estímulo de um ou mais organoides com um composto que alveja o receptor de transmembrana fibrosa cística (CFTR) e mede os ditos um ou mais organoides, por meio do qual a dilatação induzida com o composto do um ou mais organoides é dependente de CFTR.

9. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1(a) ou 1(b), caracterizado pelo fato de que a dilatação do um ou mais organoides é uma medição do efeito de mutação de CFTR e/ou tratamento com fármaco.

10. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 2, ou qualquer uma das reivindicações 3 a 9 como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto é forscolina.

11. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que o um ou mais organoides são organoides intestinais ou pulmonares.

12. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que compreende gerar o um ou mais organoides intestinais expandindo-se as células tronco intestinais em organoides fechados que incluem um lúmen fechado na membrana apical das células.

13. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que a doença é fibrose cística ou cólera.

14. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença é fibrose cística.

15. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que compreende medir IN VITRO a mudança no tamanho em um ou mais organoides a partir de um paciente sendo diagnosticado, por exemplo, para fibrose cística ou cólera e comparar isto IN VITRO com a mudança no tamanho em um ou mais organoides a partir de um controle saudável.

16. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a), 1(b), ou qualquer uma das reivindicações anteriores como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a) ou 1 (b), caracterizado pelo fato de que compreende testar a resposta de paciente individual IN VITRO a um fármaco para fibrose cística, doença do rim policístico ou cólera.

17. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o método compreende estímulo de um ou mais organoides gerados a partir de células primárias derivados de um paciente de interesse com um composto que é capaz de induzir a dilatação dos organoides, em que dilatação significa uma mudança no tamanho do um ou mais organoides devido à absorção ou secreção do fluido; estímulo do um ou mais organoides com um fármaco conhecido por afetar a função de CFTR ou com um fármaco sendo testado quanto à eficácia em afetar a função de CFTR; e medição do um ou mais organoides; em que um aumento na dilatação do um ou mais organoides em resposta ao estímulo por um fármaco indica que o paciente é responsivo ao tratamento com o fármaco.

18. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente comparar a dilatação do organoide à dilatação do organoide que foi estimulado com o composto, mas não foi estimulado com o fármaco.

19. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a) ou qualquer uma das reivindicações 2, 4 a 14, ou 16 a 18 como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a), caracterizado pelo fato de que o um ou mais fármacos são uma biblioteca de fármacos potenciais.

20. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a) ou qualquer uma das reivindicações 2, 4 a 14, ou 16 a 19 como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1(a), caracterizado pelo fato de que o método compreende o teste do efeito de novos fármacos na restauração funcional da proteína de CFTR mutante, ou restauração funcional da tradução de CFTR, transcrição, locais de gene de CFTR ou interadores biológicos de CFTR.

21. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a) ou qualquer uma das reivindicações 2, 4 a 14, ou 16 a 20 como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a), caracterizado pelo fato de que o método compreende estudar a eficácia de um ou mais fármacos para tratar fibrose cística, em que o método compreende estímulo de um ou mais organoides de fibrose cística gerados a partir de células primárias com ditos um ou mais fármacos.

22. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(a) ou qualquer uma das reivindicações 2, 4 a 14, ou 16 a 21 como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1 (a), caracterizado pelo fato de que o método compreende estímulo do um ou mais organoides gerados a partir de células primárias com um composto que é capaz de induzir a dilatação dos organoides, em que dilatação significa uma mudança no tamanho do um ou mais organoides devido à absorção ou secreção do fluido; estímulo do um ou mais organoides com um fármaco conhecido por afetar a função de CFTR ou com um fármaco sendo testado quanto à sua eficácia em afetar a função de CFTR; e medir a dilatação do um ou mais organoides; em que a dilatação do um ou mais organoides em resposta ao estímulo pelo fármaco indica que o fármaco é eficaz para o tratamento da restauração funcional de CFTR mutante.

23. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente comparar a dilatação do organoide à dilatação de um organoide que foi estimulado com o composto, mas não foi estimulado com o fármaco.

24. Uso in vitro de um ou mais organoides, caracterizado pelo fato de ser em um método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores.

25. Método IN VITRO de acordo com a reivindicação 1(b), ou qualquer uma das reivindicações precedentes como dependentes diretamente ou indiretamente da reivindicação 1(b), caracterizado pelo fato de que o método é para varredura de uma biblioteca de composto para identificar compostos que afetam a absorção e/ou a secreção de fluido, em que o método compreende: estímulo de um ou mais organoides com a bliblioteca de composto; e identificar um composto que é capaz de induzir dilatação do um ou mais organoides; em que o composto que é capaz de induzir dilatação do um ou mais organoides é um fármaco para fibrose cística, doença do rim policístico ou cólera.

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