BR112013033129B1 - Compósito que compreende um epítopo específico de vírus da hepatite b (hbv), composições de vacina e para detecção de hbv que incluem dito compósito e kit de detecção de hbv - Google Patents
Compósito que compreende um epítopo específico de vírus da hepatite b (hbv), composições de vacina e para detecção de hbv que incluem dito compósito e kit de detecção de hbv Download PDFInfo
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Abstract
EPÍTOPO E SEU USO EM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DO VÍRUS DA HEPATITE B. Descritos são um epítopo específico para vírus da hepatite B (HBV) e uso do mesmo. O epítopo descrito é uma posição conservadora em que mutagênese não ocorre e, portanto, uma composição incluindo um anticorpo para o epítopo anterior ou uma composição de vacina incluindo o epítopo tem muito baixa possibilidade de causar degradação de eficácia de cura devido a mutação de HBV, desse modo sendo muito útil para tratamento de HBV.
Description
[001]A presente invenção refere-se a um epítopo específico para vírus da Hepatite B (em seguida, referido como ‘HBV ') e uso do mesmo. Visto que o epítopo descrito aqui é uma posição conservadora, em que a modificação devido à mutação (‘mutagênese’) não ocorre, uma composição incluindo um anticorpo contra o epítopo ou uma composição de vacina incluindo o epítopo descrito acima tem muito baixa possibilidade de causar degradação de eficácia de cura por mutação de HBV, desse modo sendo muito útil para o tratamento de HBV.
[002]A presente invenção da mesma forma refere-se a um método para pro-dução de um anticorpo específico de antígeno para o epítopo descrito acima e tal anticorpo específico de antígeno para o epítopo produzido de acordo com a presente invenção exibe especificidade excelente quando administrado in vivo.
[003]HBV é um vírus tendo genomas de DNA pertencendo à família de He- padnaviridae e causa hepatite aguda e/ou crônica. Em geral, HBV é classificado em oito genótipos tendo pelo menos 8% de sequência de gene diferentes uma das ou-tras ou, de outra maneira, divididas em nove sorotipos (isto é, adw, adr, ayw, ayr, ou similar) na base de dois determinantes antigênicos (isto é, epítopos) (d/y, w/r) de antígeno de superfície de HBV (HBsAg). 350 milhões de pessoas no mundo foram infectadas com HBV crônico e, especificamente, cerca de 5 a 8% da população na Coreia e a China tem infecção por HBV crônica. Infecção por HBV é uma causa principal de doenças do fígado e câncer de fígado nestas regiões. No momento, em-bora a infecção acima pode ser protegida um pouco pelo desenvolvimento de vaci-nas, muitos pacientes ainda sofrem de infecção por Hepatite B crônica causada por HBV. Infecção crônica causada por HBV pode induzir hepatite bem como cirrose do fígado e câncer de fígado e, em comparação às pessoas não infectadas, pessoas com infecção crônica mostram um aumento em câncer de fígado cerca de 300 vezes mais alto. De acordo com investigação de WHO, hepatite B crônica é considerada como uma causa principal de cerca de 80% de cânceres de fígado.
[004]Medicamentos de hepatite B crônica desenvolvidos recentemente como um análogo de nucleosídeo e disponível no mercado podem incluir, por exemplo, lanivudina, adefovir dipivoxil, etc. Estes medicamentos podem interferir com uma transcriptase reversa de HBV polimerase, por sua vez inibindo replicação de DNA de HBV. Entretanto, no caso onde qualquer um dos medicamentos anteriores é admi-nistrado a longo prazo tal como 3 anos, cerca de 75% dos pacientes têm vírus de resistência de fármaco, desse modo ocasionando um problema de deterioração na eficácia de cura. Para prevenir transmissão vertical ou infecção depois de transplan-te de fígado, os medicamentos anteriores são geralmente usados com imunoglobuli- na de hepatite B (HBIG).
[005]Atualmente HBIG é fabricada por purificação de troca iônica e inativa- ção de vírus de plasma de doadores com titulação de anticorpo anti-HBsAg alta.
[006]Entretanto, o HBIG atualmente disponível não é uma fonte ideal de an-ticorpo terapêutico devido a sua disponibilidade limitada, baixa atividade específica e possível contaminação de agentes infecciosos.
[007]É conhecido que anticorpos gerados in vivo por vacinas agora usadas na técnica são principalmente anticorpos que reconhecem um epítopo de HBV. En-tretanto, mutantes que escapam tais anticorpos, por exemplo, um mutante de G145R gerado substituindo-se glicina em 145 do HBsAg com arginina foi informado recentemente. Adicionalmente, uma variedade de mutantes de escape foi da mesma forma encontrada, portanto, medicamentos de HBV existentes envolvem limitações em prestar eficácia de cura satisfatória. Desta maneira, há uma demanda crescente por anticorpos de tratamento de HBV e/ou que vacinas de HBV especificamente li-gadas a epítopos que corresponde a sítios necessários para a sobrevivência de HBV em associação com replicação de HBV e não causa mutação, desse modo não cau-sando deterioração eficácia de cura devido a mutação.
[008]Para resolver os problemas descritos acima, a presente invenção for-nece epítopos específicos de HBV incluindo RFLWE (SEQ ID NO: 4) ou KFLWE (SEQ ID NO: 5) e, em particular, um epítopo tendo uma sequência de aminoácido tal como FARFLWEWASVRFSW (SEQ ID NO: 6) ou FGKFLWEWASARFSW (SEQ ID NO: 7) que é um sítio necessário para a sobrevivência de HBV, desse modo corres-pondendo a uma posição conservadora em que mutação não ocorre.
[009]Outro objetivo da presente invenção é fornecer métodos para produção do epítopo descrito acima, uma composição de vacina de HBV ou vacina compreen-dendo o epítopo e um anticorpo capaz de especificamente ligar-se ao epítopo apli-cando-se o epítopo anterior, bem como uma composição de tratamento de HBV ou o agente de cura incluindo o anticorpo produzido como descrito acima.
[0010]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer uma compo-sição ou kit para detecção de HBV tendo o epítopo descrito acima ou uma sequência de polinucleotídeo codificando o epítopo.
[0011]Os inventores da presente invenção constataram que; epítopos de um anticorpo humano especificamente ligando-se a um antígeno de superfície de HBV (veja PCT/KR2010/004445, em seguida referido como o ‘anticorpo inventivo') cor-responde a sequência incluindo RFLWE (SEQ ID NO: 4) ou KFLWE (SEQ ID NO: 5) e, em particular, sequência derivada de FARFLWEWASVRFSE (SEQ ID NO: 6) ou FGKFLWEWASARFSE (SEQ ID NO: 7) ou uma parte da mesma; e tais sítios de epí- topo são favoravelmente conservadores, significantes para replicação de HBV e ne-cessário para sobrevivência de HBV. Portanto, a presente invenção foi completada sob a descrição anterior. Entre os epítopos mencionados acima, os epítopos tendo SEQ ID NO. 4 e SEQ ID NO. 6 são epítopos de subtipos adr (SEQ ID NO: 1) de HBV enquanto os epítopos tendo SEQ ID NO. 5 e SEQ ID NO. 7 correspondem a epíto- pos de subtipos ayw (SEQ ID NO: 2) de HBV.
[0012]O epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 de acordo com a presente invenção pode reter uma estrutura tridimensi-onal ou pode ser usado como uma forma conjugada com um veículo, para melhorar eficiência quando usado para uma composição tal como uma vacina. O veículo usa-do aqui pode incluir qualquer um, que está biodisponível e torna efeitos desejados da presente invenção, e será selecionado a partir de peptídeo, albumina de soro, imunoglobulina, hemocianina, polissacarídeos, ou similar, sem ser particularmente limitado a isso.
[0013]O epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 como tal ou um compósito do mesmo combinado com um veículo pode ser usável como uma composição de vacina para tratamento de HBV. Sob este as-pecto, a composição de vacina pode também incluir um adjuvante farmaceuticamen- te aceitável ou excipiente. Um tal adjuvante serve para facilitar formação de um anti-corpo injetando-se in vivo o adjuvante, e pode incluir qualquer um que permita ob-tenção de propósitos da presente invenção, mais particularmente, pelo menos um selecionado a partir de sais de alumínio (Al(OH)3, ALPO4), esqualeno, sorbitano, po- lissorbato 80, CpG, lipossoma, colesterol, monofosforil lipídio A (MPL) e glicopirano- sil lipídio A (GLA), sem estar particularmente limitado a isso.
[0014]Um polinucleotídeo codificando o epítopo específico de HBV definido por SEQ ID NOS. 4 a 7 e fornecido de acordo com a presente invenção pode ser usado como vacina de DNA. Aqui, o polinucleotídeo pode ser usado como tal sem qualquer vetor ou, de outra maneira, suportado em um vetor viral ou não viral. O vetor viral ou não viral usado aqui pode incluir qualquer um geralmente disponível na técnica (a qual a presente invenção pertence). O vetor viral inclui adenovírus, ade- novírus associado, preferivelmente lentivírus, letrovírus, etc., enquanto o vetor não viral pode incluir um polímero catiônico, um polímero não iônico, lipossoma, lipídio, fosfolipídeo, um polímero hidrofílico, um polímero hidrofóbico e uma combinação de pelo menos um selecionado a partir dos materiais anteriores, sem estar particular-mente limitado a isso.
[0015]A presente invenção fornece um vetor recombinante incluindo um po- linucleotídeo que codifica o epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 de acordo com a presente invenção, uma célula hospedeira in-cluindo o vetor recombinante, e um método para produção do epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 de acordo com a presente invenção, usando o vetor recombinante ou célula hospedeira descritos acima.
[0016]Na presente invenção, o ‘vetor recombinante' é um vetor de expressão que representa uma proteína alvo de uma célula hospedeira adequada que é um produto de gene contendo um elemento de regulação necessário operativamente ligado a uma inserção de gene para expressar a inserção de gene. Na presente in-venção, o termo ‘operativamente ligado’ refere-se a uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico funcionalmente ligada a uma sequência de ácido nu- cleico codificando a proteína alvo, para realizar funções gerais. A ligação operável com o vetor recombinante pode ser realizada por tecnologias de recombinação de gene bem conhecidas na técnica a qual a presente invenção pertence. Clivagem de DNA sítio-específica e ligação pode da mesma forma ser facilmente realizada usando enzimas geralmente conhecidas na técnica a qual a presente invenção pertence.
[0017]Vetores de expressão apropriados utilizáveis na presente invenção podem incluir sequência de sinal para alvejamento de membrana ou secreção bem como elementos de controle de expressão tal como um promotor, um códon de par-tida, um códon de parada, um sinal poliadenilado, um realçador, ou similar. O códon de partida e códon de interrupção são geralmente considerados como uma parte de uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína alvo imunogênica e, ao administrar um produto de gene, deve exibir uma ação em um indivíduo enquanto estando na estrutura com uma sequência de codificação. O promotor geral pode ser estrutural ou indutivo. Uma célula procariótica pode incluir, por exemplo, promotores de lac, tac, T3 e T7, sem estar particularmente limitado a isso. Uma célula eucarióti- ca, por exemplo, pode incluir vírus de macaco 40 (SV40), um promotor de vírus de tumor de mama de camundongo (MMTV), vírus da imunodeficiência humana (HIV) e, em particular, um promotor de repetição terminal longa (LTR) de HIV, vírus de Molo-ney, citomegalovírus (CMV), vírus Epstein bar (EBV), promotor de vírus do sarcoma de Rous (RSV), bem como o promotor de β-actina, hemoglobina humana, ceratina de músculo humana, promotor derivado de metalotioneína humana, sem estar parti-cularmente limitado a isso.
[0018]O vetor de expressão pode incluir um marcador de seleção para sele-cionar uma célula hospedeira contendo um vetor. O marcador de seleção funciona para ordenar células transformadas em vetores e pode incluir marcadores fornecen-do fenótipos selecionáveis tais como resistência de fármaco, exigências de nutriente, tolerância a citotoxicidade celular, expressão de proteína de superfície, etc. Visto que células que expressam o marcador de seleção sob condições tratadas por agente seletivo só estão vivas, células transformadas podem ser submetidas à varredura. Para um vetor de expressão replicável, o vetor pode ter uma origem de replicação como uma sequência de ácido nucleico particular em que replicação começa. O vetor recombinante expressado pode incluir uma variedade de vetores tal como plas- mídeo, vírus, cosmídeo, etc. O vetor recombinante não é particularmente limitado já que várias células hospedeiras de procariotos e eucariotos expressam genes dese- jdos e produzem proteínas desejadas, entretanto, é preferivelmente um vetor produzir uma grande quantidade de proteínas estrangeiras similares a uma natural, que possuem um promotor tendo atividade forte enquanto atingindo expressão forte.
[0019]Em particular para expressar epítopos específicos de HBV definidos por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, uma variedade de combinações de vetor hospedeiro de expressão pode ser usada. Um vetor de expressão adequado para eucarioto podem incluir sequências de controle de expressão derivadas de; por exemplo, SV40, papiloma vírus bovino, adenovírus, adenovírus associado, citome- galovírus, lenti-vírus e/ou retro-vírus, sem estar particularmente limitado a isso. O vetor de expressão usado para hospedeiros de bactéria pode incluir, por exemplo: plasmídeos bacterianos obtidos a partir de Escherichiacoli tal como pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, vetor de pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, e derivados dos mesmos; plamídeos tais como RP4 com uma ampla faixa de hospedeiros; fago de DNA exemplificado como vários derivados lambda de fago tal como XgtlG e Agt11, NM980, etc.; outros fagos de DNA tais como fago de DNA tipo de filamento de fila-mento único, M13, ou similar. Um vetor útil para células de inseto pode ser pVL941.
[0020]O vetor recombinante é inserido em uma célula hospedeira para for-mar um transformante e a célula hospedeira adequadamente usada aqui pode inclu-ir, por exemplo: procarootos tal como E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteusmirabilis ou Staphylococcus sp.; fungos tal como Asper-gillus sp.; leveduras tal como Pichiapastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosac- charomyces sp., Neurosporacrassa, etc.; células eucarióticas tais como células eu- carióticas inferiores, células eucarióticas superiores, isto é, células de inseto, ou si-milar. A célula hospedeira é preferivelmente derivada de plantas e/ou mamíferos e, em particular, derivadas de células de rim de macaco 7 (COS7), células de NSO, SP2/O, células de ovário de hamster chinês (CHO), W138, células de rim de hamster bebê (BHK), MDCK, linhagem celular de mieloma, HuT 78 e/ou de células de HEK293, sem estar particularmente limitado a isso. Mais preferivelmente, células de CHO são usadas.
[0021]Na presente invenção, o termo transformação de em células hospedei-ras inclui qualquer técnica para introdução de ácido nucleico em orgânicos, células, tecidos e/ou órgãos e, como bem conhecido na técnica convencional, uma técnica padrão pode ser selecionada que depende das células de hospedeiro para realizar a transformação. Entre tais técnicas, eletroporação, fusão de protoplasma, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), agitação usando fibras de carboneto de silício, transformação mediada por agro-bactérias, transformação mediada com PEG, sulfato de dextrano e lipofectamina e através de secagem/inibição, sem estar particularmente limitado a isso. Incubando-se um trans- formante em que o vetor recombinante é expressado em um meio de cultura, o epí- topo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 pode ser formado em quantidades grandes. O meio de cultura e condições de cultivo podem ser adequadamente selecionadas entre aquelas geralmente usadas dependendo das células hospedeiras que são usadas. Durante cultivo, algumas condições tal como uma temperatura, pH do meio, um tempo de cultura, etc., podem ser controla-das para permitir crescimento celular apropriado e produção de massa de proteínas. Como descrito acima, o epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 pode ser coletado a partir do meio ou produto de decomposição de célula por uma meneira de recombinação e separado ou purificado por qualquer técnica de separação bioquímica convencional (Sambrook e outro, Molecular Clo-ning: A Laboratoty Manual, 2a Ed., Cold Spring harbor Laboratory Press (1989); Deuscher, M., Guie to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990)). Para este propósito, vários métodos tais como electroforese, centrifugação, filtração de gel, precipitação, diálise, cromatografia (cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de imuno- absorção, cromatografia de exclusão de tamanho, etc.), focalização de ponto isoelé- trico, e várias variações e combinações dos mesmos podem ser utilizadas, sem estar particularmente limitado a isso.
[0022]A presente invenção fornece um método para expressar epítopo es-pecífico para o HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 na superfície de microrganismos ou vírus. Neste caso, um vetor recombinante incluindo uma se-quência que codifica um promotor de indução ou uma proteína de sinal, bem como vários microrganismos ou vírus tendo o vetor recombinante acima podem ser usados. Mais particularmente, E. coli recombinante, levedura e/ou bacteriófago são mi-crorganismos apropriados e/ou vírus, sem estar particularmente limitado a isso. Para expressar o epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 na superfície dos microrganismos anteriores ou vírus, técnicas de apresentação bem conhecidas na técnica a qual a presente invenção pertence podem ser usadas. Especificamente, uma sequência de polinucleotídeo codificando o epítopo específico de HBV definida por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 podem ser combinadas com (ou ligadas a) uma sequência codificando um promotor ou uma proteína de sinal que deriva expressão na superfície de uma célula de microrganismo ou vírus, desse modo expressando epítopo específico de HBV. Alternativamente, depois de deletar uma parte de sítios de gene aos quais a superfície expressando proteína é codificada, uma sequência de polinucleotídeo codificando o epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 podem ser inseridos na parte deletada. Entretanto, a presente invenção não é particularmente limitada aos métodos anteriores. De acordo com os métodos mencionados acima, o epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, que é expres-sada na superfície do microrganismo ou vírus, pode ser separado como tal e pode ser purificado para usos desejados de acordo com a presente invenção. Além disso, o epítopo inventivo pode ser usado para fazer uma varredura por um anticorpo es- pecificamente ligado ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, que é expressada na superfície e em seguida obtendo o anti-corpo submetido à varredura.
[0023]Além disso, a presente invenção fornece um método para produção de um anticorpo específico ligado ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, ou fragmentos do anticorpo, que inclui usar o epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, um compósito contendo o epítopo anterior ou um polinucleotídeo codificando o epítopo anterior. Tal anticorpo pode ser um anticorpo de policlonal ou anticorpo monoclonal e, contanto que fragmentos dos mesmos tenham características de ser ligados ao epítopo espe-cífico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, eles da mesma forma estão incluídos dentro do escopo da presente invenção. Mais particularmente, o anticorpo inventivo ou fragmentos do mesmo pode incluir, por exemplo: anticorpos de cadeia simples; diacorpos; triacorpos; tetracorpos; fragmentos de Fab; fragmentos de F(ab')2; Fd; scFv; anticorpos de domínio; anticorpos específicos duais; mini- corpos; scap; anticorpos de IgD; anticorpos de IgE; anticorpos de IgM; anticorpos de IgG1; anticorpos de IgG2; anticorpos de IgG3; anticorpos de IgG4; derivados em re-giões invariáveis de anticorpo; e anticorpos sintéticos com base em sustentações de proteína, todos dos quais têm a capacidade de ligação ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, sem estar particularmente limitado a isso. Contanto que características do anticorpo inventivo sejam retidas, anticorpos mutados em regiões variáveis podem da mesma forma ser incluídos dentro do esco-po da presente invenção. Isto pode ser exemplificado por substituição conservadora de um aminoácido em uma região variável. Aqui, tal substituição conservadora nor-malmente refere-se a substituição de um aminoácido em outro resíduo de aminoáci- do tendo propriedades similares à sequência de aminoácido original. Por exemplo, lisina, arginina e histidina têm cadeias laterais básicas, sucessivamente mostrando propriedades similares. Por outro lado, igualmente ácido aspártico e ácido glutâmico têm cadeias laterais ácidas e exibem propriedades similares um ao outro. Além disso, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína e triptofano são similares um ao outro visto que eles não carregaram cadeias laterais polares, en-quanto alanina, valina, leucina, treonina, isoleucina, prolina, fenilalanina e metionina são similares um ao outro visto que eles têm cadeias laterais não polares. Além disso, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina são similares um ao outro visto que eles têm cadeias laterais aromáticas. Consequentemente, será óbvio para aqueles versados na técnica que, ainda embora substituição de aminoácido ocorra dentro de um dos grupos anteriores tendo propriedades similares, mudança significante em características pode não ser encontrada. Portanto, se propriedades específicas do anticorpo inventivo são retidas, um método para produção de anticorpos tendo mu- tado devido a substituição conservadora em uma região variável pode da mesma forma ser incluído dentro do escopo da presente invenção.
[0024]O anticorpo ligado ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 pode ser preparado por qualquer método convencional conhecido na técnica (a qual a presente invenção pertence). Mais particularmente, depois de inocular um animal com o epítopo específico de HBV definido por qual-quer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, um compósito incluindo o epítopo ou um polinu- cleotídeo codificando o epítopo descrito acima, um anticorpo especificamente ligado ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 é produzido e submetido à varredura a partir do animal inoculado, sucessivamente sendo em obtenível.
[0025]O animal usado aqui pode incluir um animal transgênico, em particu-lar, um camundongo transgênico capaz de produzir o mesmo anticorpo como uma sequência derivada humana. O denominado anticorpo completamente humano ten-do imunogenicidade diminuído, que é obtida usando um camundongo transgênico pode ser produzido de acordo com qualquer um dos métodos descrito em: Patente US Nos. 5,569,825; 5,633,425; e 7,501,552, ou similar. No caso onde o animal men-cionado acima não foi preferivelmente transformado para permitir produção do mesmo anticorpo como a sequência derivada humana, uma humanização ou pro-cesso de desimunização pode ser também implementado, usando o anticorpo obtido a partir do animal, de acordo com qualquer um dos métodos descritos em: Patente US Nos. 5,225,539; 5,859,205; 6,632,927; 5,693,762; 6,054,297; 6,407,213; e WO Patente Depositada em Aberto No. 1998/52976, desse modo adequadamente pro-cessando o anticorpo para ser útil para tratamento in vivo. Mais particularmente, tal humanização ou desimunização pode incluir enxerto de CDR para enxertar uma se-quência de CDR de um anticorpo produzido a partir de um animal em uma estrutura de um anticorpo humano e, para aumentar afinidade ou diminuir imunogenicidade, também inclui um processo de caminhar CDR para substituir, inserir e deletar pelo menos uma sequência de aminoácido.
[0026]Em vez do epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, um compósito incluindo o epítopo e/ou um polinucleotídeo codi-ficando o epítopo, se o HBV total é usado como um imunógeno, um processo de predominantemente fazer a varredura (frequentemente paniculação de anticorpos tendo capacidade de ligação de HBV às vezes abreviado para ligação) e em seguida adicionalmente paniculação de anticorpos para especificamente reconhecer o epíto- po específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, entre os anticorpos principalmente submetidos à varredura pode ser usado. Alternativamente, um método para fazer varredura de anticorpos, que não têm ligação ou ligação dimi-nuída a HBVs mutados em sítios importantes do epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, entre anticorpos de ligação de HBV princi-palmente submetidos à varredura, em que o método inclui mutação de derivação nos sítios importantes do epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, pode da mesma forma ser usado.
[0027]Enquanto isso, de acordo com técnicas de apresentação bem conhe-cidas na técnica, anticorpos humanos ligados ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID No. 4 a 7 pode ser produzido e submetido à varredura. Tais técnicas de apresentação podem ser selecionadas a partir de uma apresentação por fago, uma apresentação por bactéria ou uma apresentação por ribossoma, sem estar particularmente limitado a isso. Produção e apresentação de bibliotecas podem facilmente ser realizadas de acordo com a técnica convencional descrita em, por exemplo; Patente US No. 5,733,743, 7,063,943, 6,172,197, 6,348,315, 6,589,741, ou similar. Especialmente, as bibliotecas usadas na apresentação anterior podem ser designadas para ter as sequência de anticorpos derivados de humano. Mais particularmente, o método descrito acima pode ser caracterizado fazendo uma varredura (screening) (ou paniculando-se) anticorpos especificamente ligados ao epítopo específico de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 apenas, aplicando-se o epítopo de HBV definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7 ou um compósito incluindo o epítopo.
[0028]Finalmente, a presente invenção fornece uma composição ou kit de detecção de HBV, que incluem o epítopo definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, um compósito incluindo o epítopo ou um polinucleotídeo codificando o epítopo. A composição ou kit de detecção de HBV de acordo com a presente invenção podem ter méritos de permitir diagnóstico rápido e parecido de infecção por HBV enquanto não sob influência significante de mutação por HBV. O kit de detecção de HBV, que inclui o epítopo definido por qualquer uma de SEQ ID NOS. 4 a 7, um compósito incluindo o epítopo ou um polinucleotídeo codificando o epítopo, pode ser fabricado para utilizar uma variedade de métodos incluindo, por exemplo, um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima geral (ELISA), um método de classificação de cé-lula ativada por fluorescência (FACS), ou similar. Além disso, no caso onde o polinu- cleotídeo codificando o epítopo da presente invenção é usado, hibridação pode ser detectada por técnicas de hibridação comuns
[0029]Como é aparente a partir da descrição detalhada, o epítopo específico de HBV fornecido de acordo com a presente invenção é substancialmente uma posi-ção conservadora em que mutagênese não ocorre. Portanto, uma composição ou composição de vacina incluindo um anticorpo contra o epítopo anterior têm possibili-dade relativamente baixa de causar deterioração em eficácia d cura por tal mutação de HBV, desse modo sendo efetivamente usado em tratamento e/ou diagnóstico de HBV.
[0030]Os objetivos acima e outros, características e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição de modalidades prefe-ridas determinadas juntamente com os desenhos acompanhantes em que: FIG. 1 ilustra resultados de análise de variação em capacidade de ligação para mutantes de proteína de antígeno de superfície de HBV para identificar epíto- pos do anticorpo inventivo; FIG. 2 mostra uma estrutura de alça em proteína de antígeno de superfície de HBV incluindo o epítopo inventivo; FIG. 3 ilustra uma estrutura genômica de HBV em que o genoma S ORF co-dificando a proteína de antígeno de superfície é parcialmente sobreposto com o ge- noma P ORF codificando uma polimerase; FIG. 4 ilustra um processo de preparar mutantes do HBV polimerase; FIG. 5 ilustra um processo de teste de complementação realizado infectan-do-se célula de HepG2 com um réplicon livre de HBV Pol e um mutante de HBV po- limerase, simultaneamente; FIG. 6 mostra resultados de teste de capacidade de replicação de HBV de cada mutante de HBV polimerase através de análise de mancha do Sul (comparação de intermediários de replicação de DNA de HBV, isto é, RC, DL, SS DNA no lado direito do gráfico); FIG. 7 mostra resultados de teste de influências em empacotamento de RNA pré-genômico por mutantes de HBV polimerase respectivos através de ensiao de proteção de RNase; e FIG. 8 mostra um mapa de ligação de vetor de gene de HBV usado em inje-ção hidrodinâmica para gerar partículas de vírus de HBV em um camundongo.
[0031]Em seguida, modalidades preferidas da presente invenção serão des-critas em detalhes com referência aos exemplos, entretanto, tais exemplos são ape-nas para propósitos ilustrativos e não pretenderam limitar o escopo da presente in-venção.
[0032]Para identificar o epítopo do anticorpo inventivo, depois de causar mu- tagênese aleatória na proteína de antígeno de superfície de subtipos de HBV adr (veja SEQ ID NO. 1), ligação do anticorpo inventivo a mutantes respectivos foi inves-tigada. Aqui, preparação dos mutantes e ensaio da ligação do anticorpo inventivo foram implementadas de acordo com mutagênese shotgun disponível a partir de In-tegral Molecular (J Am Chem Soc. 2009; 131(20): 6952~6954). Características de bibliotecas de mutação usadas para identificar o epítopo na seguinte Tabela 1. De-pois de infectar células de HEK-293T com clones tendo as bibliotecas acima, a liga-ção do anticorpo inventivo foi analisada por ensaio de imunofluorescência.
[0033]A ligação do anticorpo inventivo foi determinada calculando-se resul-tados a partir de testes repetidos três vezes e submetida a normalização com base na ligação de uma proteína de antígeno de superfície de HBV tipo silvestre. Neste caso, usando um anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de antígeno de superfície de HBV, expressão da proteína de antígeno de superfície mutada e a liga- ção do anticorpo inventivo para tal expressão foi investigada. [TABELA 1] - Características de biblioteca usadas para identificação de epí-topo
[0034]A partir da tabela, foi constatado que o anticorpo inventivo perdeu a capacidade de ligação a oito (8) clones tendo mutação ocorrendo em três resíduos de aminoácido (AAs) da proteína de antígeno de superfície de HBV (veja FIG. 1). Isto é, para os oito clones mostrados na FIG. 1, foi confirmado que o anticorpo poli- clonal de coelho exibiu a capacidade de ligação, sucessivamente normalmente expressando a proteína de antígeno de superfície de HBV mutado, entretanto, o anticorpo inventivo não foi ligado a isso.
[0035]Como um resultado de analisar os oito clones, foi constatado que cada tem pelo menos uma mutação a 160R (160R significa o aminoácido que R localizado na posição 160, em seguida o mesmo como acima), 163W e 164E (SEQ ID NO. 1), respectivamente. Isto é, a sequência acima pode ser determinada como um sítio cor-respondendo ao epítopo do anticorpo inventivo. A partir de tal resultado, foi constatado que o epítopo do anticorpo inventivo contém RFLWE (SEQ ID NO. 4) e o epíto- po em subtipo ayw de HBV com a capacidade de ligação contém KFLWE (SEQ ID NO. 5).
[0036]Especificamente, o epítopo tendo a sequência definida por SEQ ID NOS. 4 ou 5 pode ser FARFLWEWASVRFSW (SEQ ID NO. 6) ou FGKFLWEWASARFSW (SEQ ID NO. 7) correspondendo a uma alça menor entre duas alças no sítio de superfície de HBV em que o epítopo acima está presente (veja FIG. 2).
[0037]Epítopos do anticorpo inventivo incluem 160K, 163W e 164E (SEQ ID NO. 2) no antígeno de superfície ORF (S ORF) do subtipo ayw de HBV, em que a sequência de ORF do antígeno de superfície de HBV codificando os epítopos sobrepõe com HBV P ORF codificando o HBV polimerase. Em particular, 504I, 506M, 507G e 508V (veja SEQ ID NO. 3) do HBV polimerase pode corresponder aos sítios em que o epítopo é codificado por genes no OFR codificando o epítopo (veja FIG. 3). Brevemente, mutação nos sítios anteriores no HBV S ORF da mesma forma envolve mutação do HBV P ORF.
[0038]O HBV polimerase tem características notavelmente diferentes de outras polimerases virais. Primeiro, o HBV polimerase tem atividade de transcriptase reversa que sintetiza seu DNA a partir de RNA (RNA pré-genômico: pgRNA); segundo, durante iniciação de transcrição reversa, o HBV polimerase usa ele mesmo como o iniciador para conduzir preparação de proteína; e terceiro, translocação de iniciador e troca modelo são realizados durante replicação, embora o mecanismo cor- reto ainda não seja identificado.
[0039]Enquanto isso, como descrito acima, uma estrutura de leitura aberta (‘ORF') que codifica o sítio de epítopo do anticorpo inventivo neutralizando HBV, isto é, o sítio de epítopo do anticorpo inventivo no antígeno de superfície de HBV, pode sobrepor com outra ORF codificando o HBV polimerase. Portanto para pesquisar influência pelo sítio de HBV polimerase, que é codificado pelo HBV P ORF sobrepondo com o ORF codificando o epítopo do anticorpo inventivo em replicação de HBV vírus, possibilidade de mutação do epítopo anterior foi investigada.
[0040]Para este propósito, um mutante substituindo um aminoácido, que está presente no sítio que sobrepõe com o epítopo do anticorpo inventivo no HBV P ORF em uma alanina, foi preparado através de manipulação e submetido a pesquisa de influência do mutante preparado em atividade de transcriptase reversa de um HBV polimerase (‘HBV Pol '). Primeiro, os mutantes tal como K503A (K503A siginifi- ca que o aminoácido K no sítio 503 é mutado em A, em seguida o mesmo como acima) 1504A, M506A, G507A e V508A, que são obtidos substituindo-se 503K 504I, 506M, 507G e 508V do HBV Pol polimerase com alaninas, bem como um mutante naturalmente gerado V508L foram preparados como mostrado na FIG. 4. Em seguida, a variação em função de replicação de genoma do HBV polimerase tendo um mutante no sítio de epítopo anterior, foi investigado através de testes de comple- mentação. Em particular, réplicon de HBV Pol nulo como um mutante de HBV em que mutação de troca de estrutura é derivada em HBV P ORF e para que o HBV polimerase mostra falta de atividade, bem como um plasmídeo expressando o HBV polimerase em que mutação é derivada como descrito acima, células de HepG2 foram infectadas (veja FIG. 5). Depois disso, replicação de denoma de HBV foi analisada por análise de macha do Sul e ensaio de proteção de RNase (RPA).
[0041]Como descrito acima, o réplicon de HBV Pol-null e o mutante derivan- do mutação do HBV polimerase simultaneamente célula de HepG2 infectada, seguido por coleção de DNAs de vírus replicado depois de 4 dias. Os materiais coletados foram submetidos a avaliação de replicação de DNA de HBV.
[0042]Como um resultado, para mutante de K503A, replicação de DNA de vírus foi cerca de 17%, comparados a tipo silvestre. Este resultado indica que sítio de 503K no HBV polimerase significativamente participa em um mecanismo de repli- cação de vírus de DNA. Pelo contrário, mutantes de M506A e G507A raramente mostraram replicação de vírus de DNA. Este fato demonstra que 506M e 507G são sítios essenciais para mecanismo de replicação de DNA de vírus do HBV polimera- se. Mutantes de 1504A, V508A e V508L exibiram respectivamente cerca de 65%, 70% e 82% de replicação de DNA de vírus, comparado ao tipo silvestre. Isto é, foi observado que estes mutantes receberam replicação de DNA de vírus substancialmente similar aquele do tipo silvestre. Consequentemente, foi determinado que os mutantes acima têm participação relativamente baixa em replicação de DNA de HBV (veja FIG. 6).
[0043]Como um pré-estágio antes da replicação de DNA, encapsidação de RNA (RNA pré-genômico: pgRNA) foi avaliado por meio de um método de RPA (veja Kim e outro, 2009, J., Virol. 83: 8032-8040).
[0044]Como descrito acima, o réplicon de HBV Pol-null e o mutante derivando mutação do HBV polimerase simultaneamente infectou célula de HepG2, seguido por coleção de núcleos do vírus e pgRNAs total em células depois de 3 dias. Os materiais coletados foram submetidos a ensaio quantitativo de extensão de empacotamento de pgRNA em que o pgRNA é usado como um modelo para replicação de DNA de HBV.
[0045]A partir dos resultados, mutantes de K503A e G507A mostraram cerca de 25% de empacotamento de pgRNA, comparado ao tipo silvestre. Isto indica que 503K e 507G significativamente participam no empacotamento do pgRNA em partículas de núcleo do vírus. Por outro lado, mutante de M506A exibiu cerca de 71% de empacotamento de pgRNA, comparado ao tipo silvestre. Isto é, foi constatado que participação de 506M para empacotamento de pgRNA é relativamente baixa. Outros mutantes, isto é, mutantes de I504A, V508A e V508L mostraram empacotamento de pgRNA substancialmente igual ao tipo silvestre, portanto, é considerado que estes sítios participam muito pouco em empacotamento de pgRNA (veja FIG. 7).
[0046]Para mutante de K503A do HBV polimerase, apenas 25% de empaco-tamento de pgRNA resultou, comparado ao tipo silvestre. Como um resultado de quantificar o DNA de vírus como um produto final da replicação de vírus, foi constatado que a replicação foi realizada apenas à extensão do empacotamento de pgR- NA. Desta maneira, é julgado que o sítio de 503K principalmente participa no empacotamento de pgRNA inicial (veja TABELA 2). Por outro lado, mutante de M506A do polimerase de HBA exibiu cerca de 71% de empacotamento de pgRNA, que é substancialmente similar aquele do tipo silvestre. Entretanto, resultados de quantificação de DNAs de vírus como um produto final da replicação de vírus não revelou replica- ção. Este fato significa que, embora M506 do HBV polimerase nunca participa em empacotamento de pgRNA, o M506 pode significativamente participar em um mecanismo de replicação de DNA de vírus para sintetizar (-)- filamentos DNAs usando pgRNA como um modelo, isto é, um mecanismo de transcrição reversa tal como preparação de proteína ou translocação de iniciador.
[0047]Para mutantes de G507A do HBV polimerase, empacotamento de pgRNA foi apenas 24% do tipo silvestre e a replicação de DNA de vírus foi realizada muito pouco e, portanto, pode ser considerado que sítio de M507 tem funções importantes igualmente em ligação de pgRNA e a transcrição reversa da polimerase. Além disso, o sítio de M507 pode ter um papel em interação com uma proteína tal como Hsp90 como um fator hospedeiro e/ou uma proteína de núcleo do HBV, durante en- capsidação.
[0048]Enquanto isso, os mutantes restantes I504A, V508A e V508L do HBV polimerase mostram empacotamento de pgRNA e/ou replicação de DNA de vírus substancialmente similar aqueles do tipo silvestre. Desta maneira, entre sequência do HBV polimerase que é codificada por HBV P ORF sobrepondo com HBV S ORF que codifica sítios de proteína de antígeno de superfície de HBV 160K, 163W e 164E encontram como o epítopo do anticorpo inventivo, sítios 160K e 163W estão em associação íntima com a replicação de vírus. No caso onde mutação é derivada nestes sítios, replicação de vírus pode não ser executada, desse modo sendo posições conservadoras altas. Desta maneira, os dois mutantes acima não existem e um anticorpo de ligação específico para os sítios anteiores pode ser eficaz tratando-se mutantes naturalmente gerados e/ou mutantes exibindo tolerância por medicamentos antivirais.[TABELA 2] - Capacidade de Replicação e características de empacotamento de RNA de mutantes de HBV polymerase
(*) Comparou ao tipo silvestre, +++: 70 a 100%; ++: 30 a 70%; +: 10 a 30%; e -: < 1%
[0049]Pelo menos um de 163W e 164E (SEQ ID NO. 1) da proteína de antí- geno de superfície de HBV (HBsAg), que são epítopos do anticorpo inventivo, foi substituído por alanina, preparando um mutante. Visto que 160K relevante a soroti- pos tem um problema em mutação, mutantes do mesmo foram excluídos. Além disso, mutantes obtidos por mutação de 164E em 164D foram recentemente relatados, portanto, mutantes de E164D foram da mesma forma preparados e usados. Visto que os mutantes foram obtidos como descrito acima, mutação foi da mesma forma derivada a 506M, 507G e 508V (SEQ ID NO. 2) do HBV polimerase codificado por HBV P ORF sobrepondo com HBV S ORF que codifica os mutantes anteriores. Aqui, ainda quando a mesma mutação de aminoácido ocorre dependendo de códons variantes a 163W e 164E da proteína de antígeno de superfície de HBV, mutantes do HBV polimerase têm sequências de aminoácido diferentes (veja TABELA 3).[TABELA 3] - Mutantes de HBsAg e Mutação de HBV Polimerase Corres-pondente
[0050]Injetando-se o HBV DNA em um camundongo C57BL6 através de injeção hidrodinâmica para derivar sintomas similares para hepatite B aguda, o camundongo tratado foi usado para investigar ligação do anticorpo inventivo, ligação de HBV e/ou capacidade de neutralização de HBV no sangue do camundongo onde mutação de epítopo foi derivada como descrito acima. O camundongo C57BL6 usado foi uma fêmea de 6 semanas de idade com cerca de um peso de 20g, que é comprados a partir de Charles Liver Laboratory (the United States). Como mostrado na TABELA 4, um total de 12 grupos com cinco camundongos por grupo foram testados.[TABELA 4] - Condições de teste usando camundongo C57BL6
[0051]Cada camundongo foi tratado injetando-se 20 μg de vetor pHBV-MBRI (Shin e outro, Virus Research 119, 146-153, 2006; veja FIG. 8) que contém sequência de DNA de HBV inserida em pcDNA3.1 (Invitrogen, the United States) através de uma veia da cauda do camundongo a 0,3 mL/min com uma relação de 9,5% em volume por peso do camundongo, desse modo causando hepatite B aguda. Depois de 48 horas, como mostrado na TABELA 4, 0,2 mL do anticorpo inventivo foi intraveno-samente (IV) administrado através da veia da cauda do camundongo. Antes da injeção do anticorpo inventivo (24 horas, 48 horas) e depois da injeção do mesmo (72 horas, 96 horas), o soro foi separado e diluído em 10 vezes em um soro de cabra, seguido medindo-se uma concentração no sangue da proteína de antígeno de superfície de HBV (HBsAg) através de Genedia HBsAg ELISA 3.0 (Green Cross Corp. MS, korea). Com respeito a DNA de HBV, antes (48 horas) e depois (72 horas) da injeção do anticorpo inventivo, o sangue foi separado e analisado por PCR de tempo real para realizar ensaio quantitativo de DNA de HBV em sangue, e em seguida, ensaio comparativo de capacidade de neutralização de HBV do anticorpo inventivo.
[0052]Como um resultado de detectar HBsAg em sangue por meio de Gene- dia HBsAg ELISA 3,0, foi confirmado que, se 10 mutantes são inseridos, todos os HBsAgs são adequadamente expressados. Quando 10 HBsAgs tipo variante foram avaliados em ligação ao anticorpo inventivo, o HBsAg variante em que igualmente 163W e 164E foram substituídos com alanina, não mostra ligação ao anticorpo inventivo. Por outro lado, foi constatado que o HBsAg variante em que 163W apenas foram substituído com alanina, mostra a capacidade de ligação de 70% ou mais alto, comparado ao tipo silvestre. Além disso, o HBsAg variante tendo 164E substituído com alanina exibiu a capacidade de ligação de cerca de 30%, comparado ao tipo silvestre. Para E164D características variantes, de ligação foram substancialmente similares ao tipo silvestre (veja TABELA 5).
[0053]Mutação em HBsAg influencia as sequências do HBV polimerase como descrito acima. Portanto, influências de uma variante de polimerase, que pode ser criada por substituição de resíduos de aminoácido de HBsAg com alaninas, em replicação de DNA de HBV, foi analisada. Os resultados avaliados revelaram que nenhuma replicação de de DNA de HBV ocorre se 163W e 164E são todos mutados. Em particular, como um resultado de estudar replicação de DNA de HBV quando ambos 163W e 164E foram substituídos respectivamente com alanina, o 164E variante teve replicação de DNA de HBV de cerca de 30 a 70% enquanto a 163W variante não mostrou nenhuma replicação. Portanto, foi identificado que sítios de ami- noácido na polimerase correspondendo a sítio de 163W são muito importantes para replicação.
[0054]164E variantes com expressão de HBsAg e replicação de DNA de HBV foram avaliadas para identificar capacidade de neutralização de HBV do anticorpo inventivo. A partir de resultados do mesmo, foi confirmado que a capacidade de neutralização de HBV é consideravelmente diminuída porque o anticorpo inventivo tem uma capacidade de ligação reduzida a cerca de 70%, comparado ao tipo silvestre. Entretanto, para a 164D variante como uma variante natural conhecida na técnica, o anticorpo inventivo exibiu capacidade de ligação similar como o tipo silvestre.[TABELA 5] - Eficácia de neutralização de anticorpo inventivo em relação a mutação de HBsAg e infl uência do mesmo em replicação de DN A de HBV
(*) Em comparação ao tipo silvestre, +++: 70 a 100%; ++: 30 a 70%; +: 10 a 30%; e -: < 1% ND: Teste de verificação de capacidade de neutralização não foi implementado (não Determinado)
[0055]Como descrito na descrição anterior, epítopos do anticorpo inventivo em HBsAg incluem 160K (ayw) ou 160R(adr), 163W e 164E. Mais particularmente, o sítio 164E foi identificado como a posição mais influente para ligar o anticorpo inventivo, através de experiências usando variantes de substituição de alanina. No momento, esta posição é conhecida por ser ser mutada em 164D e o anticorpo inventivo da mesma forma mostrou capacidade de neutralização à 164D variante. Por outro lado, embora o sítio 163W não significativamente participe em ligação do anticorpo inventivo, mutação neste sítio causa mutação da sequência de polimerase que importantemente serve para replicar, que sucessivamente influencia replicação de DNA de HBV. Portanto, pode ser predito que o sítio anterior é uma posição altamente conservadora, isto é, uma posição em que mutação ocorre muito pouco. Na realidade, qualquer mutação a 163W não foi ainda relatado. Ultimamente, 160K (para subtipo de ayw) ou 160R (para subtipo de adr) são sítios de aminoácido para determinar sorotipos. A partir de resultados de ensaio funcional, estes foram identificados estar em associação íntima com replicação de HBV, desse modo sendo predito como posições altamente conservadoras em que mutação ocorre muito pouco. Listagem de Sequência SEQ ID NO. 1 Denota uma sequência de aminoácido (subtipo de adr) de uma proteína de antígeno de superfície de HBV SEQ ID NO. 2 Denota uma sequência de aminoácido (subtipo de ayw) de uma proteína de antígeno de superfície de HBV SEQ ID NO. 3 Denotam uma sequência de aminoácido de uma proteína HBV polimerase SEQ ID NO. 4 Denotam um epítopo (subtipo de adr) do anticorpo inventivo RFLWE SEQ ID NO. 5 Denotam um epítopo (subtipo de ayw) do anticorpo inventivo KFLWE SEQ ID NO. 6 Denotam um epítopo (subtipo de adr) do anticorpo inventivo FARFLWEWASVRFSW SEQ ID NO. 7 Denotam um epítopo (subtipo de ayw) do anticorpo inventivo FGKFLWEWASARFSW
Claims (4)
1. Compósito CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma combi-nação de um epítopo específico de vírus da hepatite B (HBV), selecionado a partir do grupo que consiste em RFLWE (SEQ ID NO: 4), KFLWE (SEQ ID NO: 5), FARFLWEWASVRFSW (SEQ ID NO: 6) e FGKFLWEWASARFSW (SEQ ID NO: 7), com um veículo, em que o veículo é pelo menos um selecionado a partir de albumi-na sérica, imunoglobulina, hemocianina e polissacarídeos.
2. Composição de vacina CARACTERIZADA pelo fato de que inclui o com-pósito, como definido na reivindicação 1, compreendendo um epítopo específico de HBV definido por qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 7, ainda compreende um adju-vante farmaceuticamente aceitável para facilitar a formação de um anticorpo quando injetado in vivo, preferivelmente em que o adjuvante é pelo menos um selecionado a partir de sais de alumínio (Al(OH)3, AlPO4), esqualeno, sorbitano, polissorbato 80, CpG, lipossoma, colesterol, monofosforil lipídio A (MPL) e glicopiranosil lipídio A (GLA).
3. Composição para detecção de HBV CARACTERIZADA pelo fato de que inclui o compósito, como definido na reivindicação 1, incluindo um epítopo específico de HBV definido por qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 7.
4. Kit de detecção de HBV CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmentos de anticorpo ligando especificamente a um epítopo es-pecífico de HBV definido por qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 7 capaz de detectar um epítopo selecionado a partir do grupo que consiste em RFLWE (SEQ ID NO: 4), KFLWE (SEQ ID NO: 5), FARFLWEWASVRFSW (SEQ ID NO: 6) e FGKFLWEWASARFSW (SEQ ID NO: 7), ou o compósito, como definido na reivindi-cação 1, incluindo o epítopo, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo especifi-camente se liga aos aminoácidos 160R/K, 163W e 164E, com a numeração de ami- noácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1.
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