BR112013005916B1

BR112013005916B1 - integrated process for biofuel production

Info

Publication number: BR112013005916B1
Application number: BR112013005916-8A
Authority: BR
Inventors: Aline Machado De Castro; Mariana Martins Pereira Teixeira; Daniele Fernandes Carvalho; Carolina Da Costa Lázaro; Denise Maria Guimarães Freire; Leda Dos Reis Castilho; Lidia Maria Melo Santa Anna; Danuza Nogueira Moyses; Absai Da Conceição Gomes; Claudia Julia Groposo Silveira; Vinicius Azevedo De Araujo; Bernardo Alves Cinelli; Jimmy Andrés López Jiménez
Original assignee: Universidade Federal Do Rio De Janeiro - Ufrj; Petróleo Brasileiro S.A. - Petrobrás
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2021-01-05
Also published as: WO2013163703A1; BR112013005916A2

Abstract

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMULAÇÕES ENZIMÁTICAS A PARTIR DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS E INTEGRADO PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS. A invenção trata da obtenção e aplicação de formulações enzimáticas visando à hidrólise de amido granular a partir de resíduos agroindustriais. Tais formulações são obtidas por processo de baixo custo e, após sua produção, encontram aplicação no co-processamento de matérias-primas com distintas composições, para a conversão de biomassas ricas em amido e também aquelas que contêm lignocelulose, em correntes ricas em açúcares que possam ser posteriormente fermentadas para produzir biocombustíveis, em particular etanol, e produtos químicos "verdes" - ácidos orgânicos, biopolímeros, antibióticos e polióis. O processo de obtenção de tais formulações é conduzido de forma integrada, visando reduzir o gasto energético envolvido nos processos dessa natureza.PROCESS OF PRODUCTION OF ENZYMATIC FORMULATIONS FROM AGRO-INDUSTRIAL WASTE AND INTEGRATED FOR PRODUCTION OF BIOFUELS. The invention deals with obtaining and applying enzymatic formulations aiming at the hydrolysis of granular starch from agro-industrial residues. Such formulations are obtained by a low cost process and, after their production, find application in the co-processing of raw materials with different compositions, for the conversion of biomasses rich in starch and also those containing lignocellulose, in chains rich in sugars that they can later be fermented to produce biofuels, in particular ethanol, and "green" chemicals - organic acids, biopolymers, antibiotics and polyols. The process of obtaining such formulations is conducted in an integrated manner, aiming to reduce the energy expenditure involved in processes of this nature.

Description

FIELD OF THE INVENTION

Trata a presente invenção da obtenção de formulações enzimáticas visando à hidrólise de amido granular a partir de resíduos agroindustriais. Tais formulações encontram aplicação para a conversão de biomassas ricas em amido, e também aquelas que contêm Iignocelulose, em correntes ricas em açucares que possam ser posteriormente fermentadas para produzir biocombustíveis, especialmente etanol, e produtos químicos “verdes”, como por exemplo ácidos orgânicos, biopolímeros, antibióticos e polióis. O processo de obtenção de tais formulações é conduzido de forma integrada, visando reduzir o gasto energético envolvido nos processos dessa natureza atualmente em uso, visto que as formulações obtidas possuem todas as enzimas necessárias ao processo de hidrólise do amido granular e conversão e etanol e outros produtos químicos.This invention deals with obtaining enzymatic formulations aiming at the hydrolysis of granular starch from agro-industrial residues. Such formulations find application for the conversion of biomass rich in starch, and also those containing Iignocellulose, in streams rich in sugars that can later be fermented to produce biofuels, especially ethanol, and "green" chemicals, such as organic acids, biopolymers, antibiotics and polyols. The process of obtaining such formulations is conducted in an integrated manner, aiming to reduce the energy expenditure involved in processes of this nature currently in use, since the formulations obtained have all the enzymes necessary for the process of hydrolysis of granular starch and conversion and ethanol and others Chemicals.

BACKGROUND OF THE INVENTION

Os métodos atuais para produção de etanol e partir da fermentação de materiais amiláceos utilizam etapas que demandam um gasto elevado de energia, sem o aproveitamento completo da matéria prima, gerando co-produtos que contêm ainda proteínas, fibras e amido não convertido. Por outro lado, o uso de enzimas especiais, comercialmente disponíveis, que podem ser utilizadas para melhoria do rendimento desses processos, onera ainda mais os custos para sua aplicação em escala industrial.Current methods for producing ethanol and starting with the fermentation of starchy materials use steps that demand a high energy expenditure, without the complete use of the raw material, generating co-products that still contain proteins, fibers and unconverted starch. On the other hand, the use of special enzymes, commercially available, which can be used to improve the performance of these processes, further burdens the costs for their application on an industrial scale.

De acordo com uma dessas tecnologias tradicionais, no início do processo grãos de milho moído são submetidos a uma etapa de cozimento na qual uma suspensão contendo cerca de 30% a 35% de material sólido é aquecida e mantida à temperatura de pelo menos 100°C durante cerca de 20 minutos na presença de hidróxido de cálcio e amônia - etapa de gelatinização. A solubilização do amido contido no material deixa-o mais exposto à ação das enzimas que são utilizadas nas etapas posteriores, quando se dá a hidrólise do amido. Emprega-se inicialmente um concentrado endoamilolítico, constituído de enzimas alfa-amilases produzidas por bactérias. A reação é conduzida à temperatura na faixa de 80°C a 90°C durante 30 minutos a 120 minutos. Os polissacarídeos do amido (moléculas apenas com ligações lineares tal como a amilose e com ligações lineares e ramificadas tal como a amilopectina) são atacados e liberam dextrinas (oligossacarídeos de glicose com grau de polimerização mediano). A seguir é adicionada ao meio uma solução de ácido sulfúrico, alterando-se o pH do meio de 6,0 para 4,5 e introduzindo-se outro grupo de enzimas, glucoamilases, em geral produzidas por fungos filamentosos, que têm a função de catalisar a hidrólise das dextrinas, liberando finalmente a glicose. A reação é conduzida à temperatura na faixa de 60°C a 70°C por pelo menos 5 horas. Obtém-se um xarope rico em glicose.According to one of these traditional technologies, at the beginning of the process, ground corn kernels are subjected to a cooking step in which a suspension containing about 30% to 35% of solid material is heated and maintained at a temperature of at least 100 ° C for about 20 minutes in the presence of calcium hydroxide and ammonia - gelatinization step. The solubilization of the starch contained in the material leaves it more exposed to the action of enzymes that are used in the later stages, when the starch hydrolysis occurs. Initially an endoamylolytic concentrate is used, consisting of alpha-amylase enzymes produced by bacteria. The reaction is conducted at a temperature in the range of 80 ° C to 90 ° C for 30 minutes to 120 minutes. Starch polysaccharides (molecules with only linear bonds such as amylose and with linear and branched bonds such as amylopectin) are attacked and release dextrins (glucose oligosaccharides with a medium degree of polymerization). Then a solution of sulfuric acid is added to the medium, changing the pH of the medium from 6.0 to 4.5 and introducing another group of enzymes, glucoamylases, generally produced by filamentous fungi, which have the function of catalyze the hydrolysis of dextrins, finally releasing glucose. The reaction is conducted at a temperature in the range of 60 ° C to 70 ° C for at least 5 hours. A glucose-rich syrup is obtained.

O xarope rico em glicose é então conduzido a um fermentador, onde é convertido em etanol por ação microbiológica. Comumente é empregada uma levedura, “Saccharomyces cerevisiae”, ou uma bactéria, “Zymomonas mobilis”. A fermentação é conduzida à temperatura de cerca de 32°C por um período de 48 horas a 72 horas, obtendo-se de 10% a 16% em volume de etanol no mosto fermentado, que corresponde em média a 389 litros de etanol por tonelada de grãos de milho processado, calculado em base seca. O co-produto principal contendo proteínas, fibras e amido não convertido (Distillers Dried Grains with Solubles - DDGS), é utilizado como ração animal.The glucose-rich syrup is then taken to a fermenter, where it is converted into ethanol by microbiological action. A yeast, “Saccharomyces cerevisiae”, or a bacterium, “Zymomonas mobilis”, is commonly used. Fermentation is carried out at a temperature of about 32 ° C for a period of 48 hours to 72 hours, obtaining 10% to 16% by volume of ethanol in the fermented wort, which corresponds on average to 389 liters of ethanol per ton of processed corn grains, calculated on a dry basis. The main co-product containing proteins, fibers and unconverted starch (Distillers Dried Grains with Solubles - DDGS), is used as animal feed.

O balanço energético do processo, igual a 1,3 (razão entre a energia obtida no processo e a energia demandada na planta industrial), é considerado pouco favorável (McAloon e colaboradores - NREL Techincal Report 580 - 28893, 2000), visto que o balanço energético para produção de etanol obtido a partir de cana-de-açúcar no Brasil é de 8,9 (Moreira - Energy Sust. Develop, 4:43, 2000).The energy balance of the process, equal to 1.3 (ratio between the energy obtained in the process and the energy demanded in the industrial plant), is considered to be unfavorable (McAloon and collaborators - NREL Techincal Report 580 - 28893, 2000), since the energy balance for the production of ethanol obtained from sugarcane in Brazil is 8.9 (Moreira - Energy Sust. Develop, 4:43, 2000).

Estudo mais recente considera bastante promissor o emprego de uma tecnologia para conversão de materiais amiláceos cujo processo de hidrólise é conduzido em baixa temperatura - abaixo da temperatura de solubilização do amido - chamada “hidrólise a frio”, o qual proporciona uma redução de até 17% da demanda energética (Mueller - An analysis of the projected energy use of future dry mill corn ethanol plants 2010/2030).A more recent study considers the use of a technology for converting starch materials whose hydrolysis process is conducted at a low temperature - below the starch solubilization temperature - called “cold hydrolysis”, which provides a reduction of up to 17% very promising. energy demand (Mueller - An analysis of the projected energy use of future dry mill corn ethanol plants 2010/2030).

Nesse processo o amido, em sua forma granular, é submetido a uma etapa prévia de sacarificação, de modo a se tornar mais susceptível à hidrólise. A reação é conduzida a 57°C de temperatura por 2 horas, em pH ácido e na presença de preparados enzimáticos contendo endoamilases e enzimas acessórias, como proteases e celulases, que auxiliam na degradação de proteínas e polissacarídeos associados ao amido. A suspensão, contendo ainda amido granular e algum teor de glicose livre, é conduzida a um fermentador e recebe a adição de um preparado enzimático contendo endoamilases e exoamilases, com capacidade de hidrolisar o amido em sua forma nativa, e uma levedura, de forma que a sacarificação das dextrinas e a fermentação dos açúcares liberados ocorrem simultaneamente.In this process, the starch, in its granular form, is submitted to a previous saccharification stage, in order to become more susceptible to hydrolysis. The reaction is carried out at a temperature of 57 ° C for 2 hours, at acid pH and in the presence of enzymatic preparations containing endoamylases and accessory enzymes, such as proteases and cellulases, which aid in the degradation of proteins and polysaccharides associated with starch. The suspension, still containing granular starch and some free glucose content, is taken to a fermenter and receives the addition of an enzyme preparation containing endoamylases and exoamylases, with the ability to hydrolyze the starch in its native form, and a yeast, so that saccharification of dextrins and fermentation of the released sugars occur simultaneously.

Apesar da tecnologia de hidrólise a frio proporcionar uma economia de energia, os preparados enzimáticos, constituídos por um ou poucos grupos de enzimas, ainda representam uma parcela significativa dos custos do processo. Além disso, pesquisas costumam ser direcionadas para o processamento de um tipo específico de biomassa. Wang e colaboradores (2010) estudaram a produção de FAN (Free Amino Nitrogen) pela hidrólise da proteína de colza, matéria-prima com alto teor de proteína, com o uso de proteases. Uma concentração de nitrogênio assimilável no meio de cultivo é necessária para suprir as células.Although cold hydrolysis technology provides energy savings, enzyme preparations, consisting of one or a few groups of enzymes, still represent a significant portion of the process costs. In addition, research is often directed at processing a specific type of biomass. Wang and colleagues (2010) studied the production of FAN (Free Amino Nitrogen) by hydrolysis of rapeseed protein, a raw material with a high protein content, using proteases. A concentration of assimilable nitrogen in the culture medium is necessary to supply the cells.

A literatura técnica especializada apresenta vários estudos e publicações de patentes que relatam os desenvolvimentos alcançados neste campo tecnológico. Em geral as enzimas empregadas são específicas a um determinado tipo de substrato. Quando ocorre a presença de mistura de substratos em um mesmo sistema reacional, enzimas específicas são adicionadas separadamente durante as diversas etapas do processamento. Podem ser citados como exemplo os seguintes documentos de patente:The specialized technical literature presents several studies and publications of patents that report the developments achieved in this technological field. In general, the enzymes used are specific to a particular type of substrate. When a mixture of substrates is present in the same reaction system, specific enzymes are added separately during the various stages of processing. The following patent documents can be cited as an example:

O documento US 2009/0017511 descreve um processo para produzir etanol a partir de amido granular que compreende uma primeira etapa na qual se obtém uma lama de água e amido solubilizado, a qual é submetida a um pré-tratamento a uma temperatura elevada na presença de uma alfa-amilase ácida e uma glicoamilase a uma temperatura entre 0°C e 20°C abaixo da temperatura inicial de gelatinização por um período de 5 minutos a 12 horas. Em uma segunda etapa, a lama é fermentada na presença de uma alfa-amilase, uma glicoamilase e uma levedura, a uma temperatura na faixa de 10°C a 35°C, durante 20 horas a 250 horas, para produzir o álcool, sendo preferível que a reação ocorra na presença de uma fitase. Neste processo podem ser utilizadas diversas matérias-primas, como milho, trigo, aveia, centeio, cevada, mandioca, sorgo, entre outros. As enzimas utilizadas no processo são enzimas comerciais, obtidas de linhagens de bactérias e fungos que sofreram algum tipo de modificação genética.US 2009/0017511 describes a process for producing ethanol from granular starch which comprises a first stage in which a slurry of water and solubilized starch is obtained, which is subjected to a pre-treatment at an elevated temperature in the presence of an acid alpha-amylase and a glycoamylase at a temperature between 0 ° C and 20 ° C below the initial gelatinization temperature for a period of 5 minutes to 12 hours. In a second stage, the sludge is fermented in the presence of an alpha-amylase, a glycoamylase and a yeast, at a temperature in the range of 10 ° C to 35 ° C, for 20 hours to 250 hours, to produce the alcohol, being preferable that the reaction occurs in the presence of a phytase. In this process, several raw materials can be used, such as corn, wheat, oats, rye, barley, cassava, sorghum, among others. The enzymes used in the process are commercial enzymes, obtained from strains of bacteria and fungi that have undergone some type of genetic modification.

A patente US 6,667,066 ensina a obtenção de um produto multienzimático com glicoamilase, protease e xilanase, obtido por fermentação de farelo de trigo com uma linhagem de “Aspergillus niger", estando as ditas atividades enzimáticas de glicoamilase, protease e xilanase presentes nos valores mínimos de pelo menos 100 unidades por grama de material seco. O produto tem aplicação para produzir etanol ou ração para animal monogástrico.US patent 6,667,066 teaches obtaining a multi-enzymatic product with glycoamylase, protease and xylanase, obtained by fermenting wheat bran with a strain of "Aspergillus niger", with the said enzyme activities of glycoamylase, protease and xylanase present in the minimum values of at least 100 units per gram of dry material The product is used to produce ethanol or monogastric animal feed.

Na publicação norte-americana US 2008/0003344, descreve-se um processo para produção de etanol a partir da hidrólise de amido contido em resíduo vegetal moído, utilizando uma combinação de enzimas exógenas, como fitase, glucoamilase e alfa-amilases de origem microbiológica, visando conseguir a realização da hidrólise a temperaturas abaixo da de gelatinização do amido. Entretanto, para a realização do processo completo, se faz necessário adicionar beta-glucosidade em combinação com outras enzimas. O resíduo final livre de toxinas pode ser usado como ração animal.In the North American publication US 2008/0003344, a process for ethanol production is described from the hydrolysis of starch contained in ground vegetable waste, using a combination of exogenous enzymes, such as phytase, glucoamylase and alpha-amylases of microbiological origin, in order to achieve hydrolysis at temperatures below that of starch gelatinization. However, in order to carry out the complete process, it is necessary to add beta-glucosity in combination with other enzymes. The final toxin-free residue can be used as animal feed.

O documento US 2011/0097446 descreve um método para produzir elevados teores de etanol a partir de materiais vegetais contendo amido (milho, trigo, aveia, sorgo, dentre outros). Em linhas gerais o método consiste em moer o material vegetal para atingir granulometria entre 0,1 mm e 0,5 mm, submeter o material a processo de sacarificação sem cozimento do amido em presença de enzimas específicas, fermentar o amido incubado na presença de uma levedura e recuperar o etanol do meio fermentado. Durante a fermentação a temperatura é variada. O método permite recuperar pelo menos 18% v/v de etanol. O processo faz uso de enzimas comerciais com atividades específicas para a hidrólise do amido.US 2011/0097446 describes a method for producing high levels of ethanol from plant materials containing starch (corn, wheat, oats, sorghum, among others). Generally speaking, the method consists of grinding the plant material to reach granulometry between 0.1 mm and 0.5 mm, subjecting the material to a saccharification process without cooking the starch in the presence of specific enzymes, fermenting the incubated starch in the presence of a yeast and recover ethanol from the fermented medium. During fermentation the temperature is varied. The method allows to recover at least 18% v / v of ethanol. The process makes use of commercial enzymes with specific activities for the hydrolysis of starch.

O documento WO 2011/017093 ensina o uso de misturas de alfa- amilases na liquefação e sacarificação de amido para produção de etanol. A mistura emprega enzimas utilizadas na proporção de 1 unidade de alfa- amilase termoestável a baixo pH para cada 5 Unidades Wohlgemuth Modificadas (MWU) de “Bacillus licheniforms”.WO 2011/017093 teaches the use of mixtures of alpha-amylases in the liquefaction and saccharification of starch for ethanol production. The mixture uses enzymes used in the proportion of 1 unit of low pH thermostable alpha-amylase for each 5 Modified Wohlgemuth Units (MWU) of “Bacillus licheniforms”.

Como se observa, a tentativa de melhoria dos processos está direcionada para a obtenção de enzimas com maior atividade enzimática, devido a modificações genéticas, e que quando aplicadas em conjunto, são utilizadas no máximo dois ou três tipos de enzimas, em geral provenientes de fontes distintas.As noted, the attempt to improve processes is aimed at obtaining enzymes with greater enzyme activity, due to genetic modifications, and that when applied together, a maximum of two or three types of enzymes are used, usually from sources different.

A presente invenção trata da obtenção de formulações enzimáticas, contendo enzimas produzidas por fermentação em estado sólido, processo de baixo custo, de forma que as referidas formulações possuam características que permitam ser aplicadas a diferentes materiais, visando especialmente à melhoria na produção de etanol a partir de diferentes fontes de biomassa adequadamente balanceadas. A presença de aminoácidos livres, de fácil assimilação pelas células constitui um importante diferencial da invenção.The present invention is about obtaining enzymatic formulations, containing enzymes produced by solid state fermentation, a low cost process, so that the said formulations have characteristics that allow them to be applied to different materials, aiming especially at improving the production of ethanol from from different sources of biomass properly balanced. The presence of free amino acids, easily assimilated by cells is an important differential of the invention.

SUMMARY OF THE INVENTION

Em um primeiro aspecto a invenção se refere à obtenção de formulações enzimáticas produzidas a partir de resíduos agroindustriais, em especial resíduos das indústrias de fabricação de óleos vegetais e de cervejarias. Mais particularmente, visa preparar igualmente formulações de meios de cultivo de microrganismos adequadamente balanceados para produção simultânea, via fermentação em estado sólido, de todos os grupos enzimáticos necessários à hidrólise de amido granular. As formulações enzimáticas obtidas são destinadas à conversão de biomassas ricas em amido, ou que contenham ainda lignocelulose, com vistas à geração de correntes ricas em açúcares fermentescíveis, para posterior produção de biocombustíveis, particularmente etanol, e produtos “químicos verdes” (ácidos orgânicos, biopolímeros, antibióticos e polióis, dentre outros).In a first aspect, the invention relates to obtaining enzymatic formulations produced from agro-industrial residues, especially residues from the vegetable oil and brewery industries. More particularly, it also aims to prepare formulations of properly balanced microorganism culture media for simultaneous production, via solid state fermentation, of all enzyme groups necessary for the granular starch hydrolysis. The enzymatic formulations obtained are intended for the conversion of biomasses rich in starch, or that still contain lignocellulose, with a view to the generation of currents rich in fermentable sugars, for later production of biofuels, particularly ethanol, and “green chemicals” (organic acids, biopolymers, antibiotics and polyols, among others).

Em um segundo aspecto a invenção objetiva a aplicação dessas formulações enzimáticas contendo amilases (alfa-amilases, glucoamilases, isoamilases), celulases (endoglucanases, beta-glucosidases, celobiohidro- lases), hemicelulases (xilanases, beta-xilosidases) e proteases (endopeptidases, exopeptidases) na hidrólise de amido granular presente em resíduos e outros materiais agroindustriais, em especial biomassas provenientes do processamento de frutos de oleaginosas e de grãos contendo amido, adequadamente balanceadas, para a conversão final em etanol e produtos químicos verdes, por meio de um processo integrado, com custo reduzido de energia.In a second aspect, the invention aims to apply these enzymatic formulations containing amylases (alpha-amylases, glucoamylases, isoamylases), cellulases (endoglucanases, beta-glucosidases, cellobiohydro-lases), hemicellulases (xylanases, beta-xylosidases) and proteases (endopeptidases, exopeptidases) in the hydrolysis of granular starch present in residues and other agro-industrial materials, especially biomasses from the processing of oilseed fruits and grains containing starch, properly balanced, for the final conversion into ethanol and green chemicals, through a process integrated, with reduced energy cost.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

A Figura 1 apresenta um diagrama de blocos do processo integrado da presente invenção.Figure 1 shows a block diagram of the integrated process of the present invention.

A Figura 2 apresenta perfis de consumo de glicose (quadrados vazados) e produção de etanol (quadrados preenchidos) obtidos a partir do processo fermentativo de farinha de babaçu, assim como a produção de glicerol (triângulos preenchidos). As concentrações das moléculas estão expressas em g/L.Figure 2 shows profiles of glucose consumption (hollow squares) and ethanol production (filled squares) obtained from the babassu flour fermentation process, as well as glycerol production (filled triangles). The concentrations of the molecules are expressed in g / L.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

A conversão enzimática realizada a baixas temperaturas de amido proveniente de biomassas vem sendo apontada como uma das principais tendências para a produção de etanol a partir de materiais amiláceos. No entanto, na condição de o amido não ser previamente gelatinizado, torna- se imprescindível o uso de diversos preparados enzimáticos para atender às necessidades das diferentes matérias primas, ou seja, preparados que contenham simultaneamente pelo menos enzimas como amilases, proteases, celulases e xilanases.The enzymatic conversion carried out at low temperatures of starch from biomass has been pointed out as one of the main trends for the production of ethanol from starchy materials. However, provided that the starch is not previously gelatinized, it is essential to use several enzymatic preparations to meet the needs of different raw materials, that is, preparations that contain at least simultaneously enzymes such as amylases, proteases, cellulases and xylanases .

O processo integrado da presente invenção visa estabelecer formulações balanceadas de meio de cultivo sólido para microrganismos com o objetivo de produzir simultaneamente todos os grupos de enzimas necessários à hidrólise do amido granular. Para tanto, são empregados, para produção dessas formulações enzimáticas, resíduos agroindustriais, particularmente resíduos originários da indústria de óleos de origem vegetal e de cervejarias, de modo que seu custo de produção se torna bastante reduzido.The integrated process of the present invention aims to establish balanced formulations of solid culture medium for microorganisms in order to simultaneously produce all groups of enzymes necessary for the hydrolysis of granular starch. For this purpose, agro-industrial residues are used to produce these enzyme formulations, particularly residues from the vegetable oil industry and from breweries, so that their production cost becomes very low.

O processo de preparação dos meios de cultivo deve considerar inicialmente as características dos diferentes resíduos agroindustriais a serem utilizados e a seguir aclimatar os microrganismos para a produção das enzimas desejadas.The process of preparing the culture media must initially consider the characteristics of the different agro-industrial residues to be used and then acclimatize the microorganisms for the production of the desired enzymes.

Basicamente o processo integrado compreende as seguintes etapas: - alimentar em um primeiro reator (100) para produção de enzimas, a matéria-prima resíduo agroindustrial (10), com granulometria na faixa de 0,05 mm - 2,00 mm, uma primeira corrente de água (15), para ajustar e manter o teor de umidade na faixa de 40% - 80%, e células de fungos filamentosos previamente propagadas (20) com concentração inicial de 103 - 107 ZmL, selecionadas entre linhagens de fungos, por exemplo do gênero “Aspergillus”, para formar uma matriz sólida (30); manter a fermentação (F1) em estado sólido (FES) durante 12 horas - 168 horas, à temperatura na faixa de 20°C - 55°C; - proceder à extração das enzimas produzidas da matriz sólida (30) para uma fase líquida, por meio de adição de uma segunda corrente de água (35), em um reator agitado (F2) mecanicamente em rotação entre 150 rpm - 1.500 rpm, na proporção líquido: sólido entre 5 (L/kg) e 15 (L/kg); - separar a matriz sólida (30) do líquido contendo o extrato enzimático (40), por meio de uma etapa de filtração e/ou sedimentação e/ou centrifugação (S), para retirar o resíduo da fermentação (50); - concentrar a corrente do líquido contendo o extrato enzimático (40), por meio de ultrafiltração com membranas ou liofilização (C), para obter uma corrente concentrada de extrato enzimático, que compreende a formulação enzimática (45), e água residual (50’) da etapa de extração. Em algumas circunstâncias, dependendo do rendimento da fermentação (F1), esta etapa pode não ser demandada e o extrato enzimático (40) pode ser remetido diretamente ao reator de hidrólise enzimática e fermentação submersa (F3); - conduzir uma nova corrente (M) de matéria prima, formada por resíduo e/ou material agroindustrial (10) rico em amido, tal como farinha de babaçu, grãos de milho, grãos de trigo, grãos de sorgo, torta de mamona, e formulação enzimática (45) para um segundo reator (200), para ser submetido a processo de hidrólise enzimática e fermentação submersa (F3), na presença da formulação enzimática (45) obtida, utilizando células microbianas (60) adequadas à produção do produto (70) desejado, ditas células microbianas selecionadas entre bactérias, actinomicetos, leveduras e fungos filamentosos.Basically, the integrated process comprises the following steps: - feeding in a first reactor (100) for the production of enzymes, the raw material agro-industrial residue (10), with granulometry in the range of 0.05 mm - 2.00 mm, a first stream of water (15), to adjust and maintain the moisture content in the range of 40% - 80%, and previously propagated filamentous fungus cells (20) with an initial concentration of 103 - 107 ZmL, selected among fungi strains, by example of the genus “Aspergillus”, to form a solid matrix (30); maintain fermentation (F1) in solid state (FES) for 12 hours - 168 hours, at a temperature in the range of 20 ° C - 55 ° C; - proceed with the extraction of the enzymes produced from the solid matrix (30) to a liquid phase, by adding a second stream of water (35), in a stirred reactor (F2) mechanically rotating between 150 rpm - 1,500 rpm, in the liquid: solid ratio between 5 (L / kg) and 15 (L / kg); - separate the solid matrix (30) from the liquid containing the enzymatic extract (40), by means of a filtration and / or sedimentation and / or centrifugation step (S), to remove the residue from the fermentation (50); - concentrate the liquid stream containing the enzymatic extract (40), by means of membrane ultrafiltration or lyophilization (C), to obtain a concentrated stream of enzymatic extract, which comprises the enzymatic formulation (45), and residual water (50 ' ) of the extraction step. In some circumstances, depending on the fermentation yield (F1), this step may not be required and the enzyme extract (40) may be sent directly to the enzymatic hydrolysis and submerged fermentation reactor (F3); - conduct a new stream (M) of raw material, formed by waste and / or agro-industrial material (10) rich in starch, such as babassu flour, corn kernels, wheat grains, sorghum grains, castor cake, and enzymatic formulation (45) for a second reactor (200), to be subjected to enzymatic hydrolysis and submerged fermentation (F3), in the presence of the enzymatic formulation (45) obtained, using microbial cells (60) suitable for the production of the product ( 70) desired, said microbial cells selected from bacteria, actinomycetes, yeasts and filamentous fungi.

Assim, em um primeiro momento, de acordo com o processo da invenção, a produção de enzimas é alcançada via fermentação em estado sólido. Linhagens fúngicas são mantidas durante 3 a 7 dias de cultivo estático em meio de cultivo sólido contendo polissacarídeos como fonte de carbono, visando à aclimatação das células para a produção de enzimas aptas a degradar tais moléculas. A seguir, os esporos, na proporção de 103/mL a 107/mL, são inoculados em meio líquido para propagação das células, a uma temperatura na faixa de 20°C a 40°C, sob agitação orbital na faixa de 100 rpm a 300 rpm, por um período de 10 horas a 48 horas. As células crescidas são, então, inoculadas em meios sólidos que são formulados a partir de resíduos agroindustriais, em geral resíduos de baixo valor econômico, provenientes das indústrias fornecedoras de óleo de origem vegetal e cervejeira. Podem ser citados como exemplo de matérias-primas: torta de babaçu, obtida da prensagem das amêndoas do babaçu, farinha de babaçu, obtida da prensagem do mesocarpo do babaçu, torta de mamona, torta de canola, torta de girassol, bagaço cervejeiro, amido de milho, melaço de cana-de-açúcar, melaço de soja, milhocina (água residual da maceração do milho), glicerina bruta do biodiesel de soja, caldo de cana-de-açúcar, entre outros.Thus, at first, according to the process of the invention, the production of enzymes is achieved via solid state fermentation. Fungal strains are maintained for 3 to 7 days of static culture in a solid culture medium containing polysaccharides as a carbon source, aiming to acclimatize the cells for the production of enzymes able to degrade such molecules. Then, the spores, in the proportion of 103 / mL to 107 / mL, are inoculated in liquid medium for cell propagation, at a temperature in the range of 20 ° C to 40 ° C, under orbital agitation in the range of 100 rpm at 300 rpm, for a period of 10 hours to 48 hours. The grown cells are then inoculated in solid media that are formulated from agro-industrial residues, in general residues of low economic value, coming from the industries that supply vegetable and beer oil. They can be cited as an example of raw materials: babassu pie, obtained from pressing babassu almonds, babassu flour, obtained from pressing babassu mesocarp, castor bean cake, canola cake, sunflower cake, beer bagasse, starch corn, sugar cane molasses, soy molasses, millet (residual water from corn maceration), crude glycerin from soy biodiesel, sugar cane juice, among others.

Os resíduos agroindustriais são misturados em diferentes proporções e combinações, a fim de induzir, de forma customizada, a síntese de formulações enzimáticas, com atividade balanceada entre as enzimas de interesse, para posterior hidrólise de diferentes biomassas e liberação de açúcares fermentescíveis, a serem utlizados no processo de obtenção do produto final.Agro-industrial residues are mixed in different proportions and combinations, in order to induce, in a customized way, the synthesis of enzymatic formulations, with balanced activity among the enzymes of interest, for later hydrolysis of different biomasses and release of fermentable sugars, to be used in the process of obtaining the final product.

As formulações balanceadas de meio de cultivo são estudadas, combinando-se a suplementação simultânea de materiais sólidos e 5 líquidos à torta de babaçu, de forma a customizar a composição da mesma.The balanced formulations of culture medium are studied, combining the simultaneous supplementation of solid materials and 5 liquids to the babassu cake, in order to customize the composition of the same.

Os resultados apresentados na Tabela 1 comprovam que a suplementação da torta de babaçu com farinha de babaçu, e com amido de milho, aumenta a produção de endoamilases em até 60%, após 120 10 horas de fermentação.

The results presented in Table 1 prove that the supplementation of babassu pie with babassu flour, and with corn starch, increases the production of endoamylases by up to 60%, after 120 10 hours of fermentation.

Para a condução do proceso são utilizados 1,62 metros cúbicos de suspensão contendo as células crescidas para cada tonelada de matéria- prima e volume de líquido suficiente para garantir uma umidade inicial na faixa de 40% a 80%, preferencialmente 62%, na torta de babaçu, com granulometria na faixa entre 0,05 mm e 2,00 mm. Bandejas são incubadas em um ambiente com cerca de 95% de umidade do ar. A fermentação em estado sólido (FES) transcorre por um período de tempo que varia na faixa de 10 minutos a 120 minutos a uma temperatura entre 20°C e 55°C, preferencialmente 23°C.To conduct the process, 1.62 cubic meters of suspension are used, containing the cells grown for each ton of raw material and enough liquid volume to guarantee an initial humidity in the range of 40% to 80%, preferably 62%, in the cake. babassu, with granulometry in the range between 0.05 mm and 2.00 mm. Trays are incubated in an environment with about 95% humidity. Solid state fermentation (FES) takes place over a period of time ranging from 10 minutes to 120 minutes at a temperature between 20 ° C and 55 ° C, preferably 23 ° C.

Os microrganismos utilizados são selecionados entre linhagens de fungos do gênero “Aspergillus”, particularmente “Aspergillus awamori”, “Aspergillus wentii” e “Aspergillus oryzae”.The microorganisms used are selected from strains of fungi of the genus "Aspergillus", particularly "Aspergillus awamori", "Aspergillus wentii" and "Aspergillus oryzae".

Durante a FES além da produção de diversas enzimas capazes de hidrolisar o amido, ocorre a hidrólise da proteína dos materiais agroindustriais, assim havendo uma produção de aminoácidos e pequenos peptídeos (FAN - Free Amino Nitrogen), que são quantificados pelo método colorimétrico proposto pela “European Brewery Convention” em 1987 (Lie, J. Inst. Brew., 79:37-41, 1973). Dessa forma, na etapa de extração, ao final da FES, se obtêm as enzimas e os aminoácidos e peptídeos livres, pois os mesmos estão presentes na fração solúvel.During FES, in addition to the production of several enzymes capable of hydrolyzing starch, protein hydrolysis occurs in agro-industrial materials, thus producing amino acids and small peptides (FAN - Free Amino Nitrogen), which are quantified by the colorimetric method proposed by “ European Brewery Convention ”in 1987 (Lie, J. Inst. Brew., 79: 37-41, 1973). Thus, in the extraction stage, at the end of the FES, free enzymes and amino acids and peptides are obtained, as they are present in the soluble fraction.

Após o tempo de 120 horas de FES em torta de babaçu, promove-se a etapa de extração das enzimas. Esta extração é feita com água destilada na proporção de 5:1 a 20:1 em relação à massa inicial de torta, seguindo- se de maceração do resíduo da fermentação. O material é então colocado sob agitação na faixa de 100 rpm a 300 rpm, por um período entre 10 minutos e 120 minutos, à temperatura na faixa de 20°C a 55°C, preferencialmente a 37°C. Em seguida, o material é centrifugado a 11.000 g e liofilizado. É obtido um extrato enzimático sob a forma de um pó solúvel de coloração castanha, o qual pode ser embalado sob vácuo e armazenado a -20°C.After 120 hours of FES in babassu cake, the enzyme extraction stage is promoted. This extraction is done with distilled water in the proportion of 5: 1 to 20: 1 in relation to the initial cake mass, followed by maceration of the fermentation residue. The material is then placed under agitation in the range of 100 rpm to 300 rpm, for a period between 10 minutes and 120 minutes, at a temperature in the range of 20 ° C to 55 ° C, preferably at 37 ° C. Then, the material is centrifuged at 11,000 g and lyophilized. An enzymatic extract is obtained in the form of a brown colored soluble powder, which can be vacuum packed and stored at -20 ° C.

A análise do material revela que além dos grupos principais de enzimas, tais como amilases (alfa-amilases, glucoamilases, isoamilases), celulases (endoglucanases, beta-glucosidases), hemicelulases (xilanases) e proteases (endopeptidases, exopeptidases), outras atividades enzimáticas são também observadas nos preparados obtidos, o que torna esses insumos aptos para aplicação no co-processamento de matérias- primas com distintas composições. Por exemplo, a presença de invertases contribui para a rápida assimilação da sacarose de caldo de cana; a beta- galactosidase permite que resíduos da indústria de laticínios, como o soro de leite, possam ser adicionados a materiais amiláceos e lignocelulósicos em um mesmo ambiente reacional. A presença da endoglucanase e beta- glicosidase indica que o preparado enzimático da invenção pode atuar para a completa solubilização de fibras celulósicas até a liberação da glicose, sua unidade fermentescível.Analysis of the material reveals that in addition to the main groups of enzymes, such as amylases (alpha-amylases, glucoamylases, isoamylases), cellulases (endoglucanases, beta-glucosidases), hemicellulases (xylanases) and proteases (endopeptidases, exopeptidases), other enzymatic activities they are also observed in the preparations obtained, which makes these inputs suitable for application in the co-processing of raw materials with different compositions. For example, the presence of invertases contributes to the rapid assimilation of sugarcane juice sucrose; beta-galactosidase allows residues from the dairy industry, such as whey, to be added to starch and lignocellulosic materials in the same reaction environment. The presence of endoglucanase and beta-glucosidase indicates that the enzymatic preparation of the invention can act for the complete solubilization of cellulosic fibers until the release of glucose, its fermentable unit.

Os experimentos para comprovação de hidrólise são realizados em diferentes temperaturas, na faixa de 30°C a 60°C. O extrato enzimático liofilizado é utilizado para preparar soluções com atividade amilolítica na faixa de 2 U/mL a 30 U/mL. Essas soluções são ajustadas para pH = 4,8 com ácido sulfúrico, quando necessário (o pH inicial do extrato enzimático encontra-se na faixa de 4,8 - 5,5). A farinha de babaçu é adicionada em concentrações variando na faixa de 3,33% a 25% (m/m), e a hidrólise é realizada em pequenos reatores com agitação. Azida de sódio (0,2 g/L) é adicionada em todos os experimentos de hidrólise para evitar a contaminação.The experiments to prove hydrolysis are carried out at different temperatures, in the range of 30 ° C to 60 ° C. The lyophilized enzymatic extract is used to prepare solutions with amylolytic activity in the range of 2 U / mL to 30 U / mL. These solutions are adjusted to pH = 4.8 with sulfuric acid, when necessary (the initial pH of the enzyme extract is in the range of 4.8 - 5.5). Babassu flour is added in concentrations ranging from 3.33% to 25% (w / w), and hydrolysis is carried out in small stirred reactors. Sodium azide (0.2 g / L) is added to all hydrolysis experiments to avoid contamination.

Os resultados obtidos nos experimentos são comparados com os resultados de um preparado comercial indicado para uso nesta mesma aplicação: hidrólise de amido não gelatinizado. É utilizada uma cepa de levedura “Saccharomyces cerevisiae”, de linhagem industrial denominada JP1, para a etapa de sacarificação simultânea à fermentação.The results obtained in the experiments are compared with the results of a commercial preparation indicated for use in this same application: hydrolysis of non-gelatinized starch. A yeast strain “Saccharomyces cerevisiae”, of an industrial lineage called JP1, is used for the saccharification stage simultaneously with fermentation.

A conversão do amido granular usando as formulações enzimáticas obtidas permite uma fermentação denominada “Very High Gravity” (VHG) de um meio com alto teor de sólidos pouco solúveis. Desta forma há uma redução significativa do estresse osmótico sobre a levedura. A diminuição da pressão osmótica exercida sobre a levedura também resulta em uma menor produção de produtos não desejáveis como glicerol, e a menor produção de glicerol possibilita uma maior conversão de glicose em etanol.The conversion of granular starch using the enzyme formulations obtained allows a fermentation called “Very High Gravity” (VHG) of a medium with a high content of poorly soluble solids. Thus, there is a significant reduction in osmotic stress on yeast. The decrease in the osmotic pressure exerted on yeast also results in a lower production of undesirable products such as glycerol, and the lower production of glycerol allows a greater conversion of glucose into ethanol.

Para que a invenção possa ser mais bem compreendida e avaliada, exemplos são apresentados a seguir, porém os mesmos têm caráter meramente ilustrativo e, de modo algum, devem ser considerados limitantes da invenção.For the invention to be better understood and evaluated, examples are presented below, but they are merely illustrative and in no way should they be considered as limiting the invention.

EXAMPLES Example: Use of commercial enzyme.

A- Preparação do inoculo para fermentação submersa (FS) As células de levedura JP1 (linhagem da levedura, proveniente da usina Japungu - Santa Rita - Paraíba), são mantidas em placas de Petri em meio YPD ágar (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 20 g/L glicose, 20 g/L agar-agar). Após 48 horas ou 72 horas neste meio a 30°C, as células são transferidas, assepticamente, para um tubo plástico com água destilada estéril, e assim calculada a concentração celular em massa seca. De posse da concentração celular, o meio YPD (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L peptona, 20 g/L glicose) é inoculado, fazendo-se o ajuste de pH para 5, com ácido sulfúrico.A- Preparation of the inoculum for submerged fermentation (FS) The JP1 yeast cells (yeast lineage, from the Japungu plant - Santa Rita - Paraíba), are kept in Petri dishes on YPD agar medium (10 g / L yeast extract , 20 g / L peptone, 20 g / L glucose, 20 g / L agar-agar). After 48 hours or 72 hours in this medium at 30 ° C, the cells are transferred, aseptically, to a plastic tube with sterile distilled water, and thus the dry cell mass concentration is calculated. With cell concentration, the YPD medium (10 g / L yeast extract, 20 g / L peptone, 20 g / L glucose) is inoculated, adjusting the pH to 5 with sulfuric acid.

B- Fermentação em estado sólido e obtenção do extrato enzimático De acordo com o processo da invenção, as células crescidas são inoculadas em meios sólidos, adequadamente formulados a partir de materiais agroindustriais.B- Solid state fermentation and obtaining the enzymatic extract According to the process of the invention, the grown cells are inoculated in solid media, properly formulated from agro-industrial materials.

Assim, no meio de fermentação empregado nos experimentos: torta de babaçu contendo 62% de umidade inicial com suplmentos, são geradas as enzimas, e estas são extraídas pela adição de água e agitação do sistema.Thus, in the fermentation medium used in the experiments: babassu cake containing 62% initial moisture with supplements, the enzymes are generated, and these are extracted by adding water and stirring the system.

C- Hidrólise enzimática e fermentação submersaC- Enzymatic hydrolysis and submerged fermentation

Pela adição de farinha de babaçu ao extrato enzimático na condição de 50°C por 4 horas são liberados açúcares fermentescíveis e aminoácidos livres ao meio reacional. A esse meio de fermentação são adicionadas as células previamente propagadas. A concentração do inoculo é de 10% em relação ao volume do meio de fermentação (correspondendo a 0,5 g/L de células). A etapa de fermentação submersa (FS) é conduzida a 32°C e sob agitação constante, por um tempo de até 72 horas.By adding babassu flour to the enzymatic extract at 50 ° C for 4 hours, fermentable sugars and free amino acids are released to the reaction medium. Previously propagated cells are added to this fermentation medium. The concentration of the inoculum is 10% in relation to the volume of the fermentation medium (corresponding to 0.5 g / L of cells). The submerged fermentation step (FS) is carried out at 32 ° C and under constant agitation, for a period of up to 72 hours.

As diversas enzimas presentes no extrato enzimático obtido atuam conjuntamente na hidrólise do amido na forma granular, liberando a glicose. Simultaneamente, as células de levedura “Saccharomyces cerevisiae” consomem a glicose produzindo o etanol. Além disso, no extrato enzimático obtido de acordo com a presente invenção, verifica-se a presença de enzimas acessórias, tais como xilanases, proteases e celulases, fato que representa vantagens técnica e econômica consideráveis.The various enzymes present in the obtained enzymatic extract act together in the hydrolysis of starch in granular form, releasing glucose. At the same time, the yeast cells “Saccharomyces cerevisiae” consume glucose to produce ethanol. In addition, in the enzymatic extract obtained according to the present invention, the presence of accessory enzymes, such as xylanases, proteases and cellulases, is verified, a fact that represents considerable technical and economic advantages.

Exemplo 2: Emprego do extrato enzimático da invenção.Example 2: Use of the enzymatic extract of the invention.

Como já descrito acima, após a fermentação em estado sólido (FES) em meio de cultivo customizado utilizando como base a torta de babaçu, inicia-se a etapa de extração, obtendo-se as enzimas e os aminoácidos e peptídeos livres.As already described above, after solid state fermentation (FES) in a customized culture medium using babassu cake as a base, the extraction stage begins, obtaining free enzymes and amino acids and peptides.

Em decorrência da extração de compostos nitrogenados, provenientes da FES, obtém-se formulação de um meio de cultivo propício para diversos processos fermentativos, contendo todas as fontes nutricionais básicas necessárias para o crescimento de diferentes microrganismos. As enzimas são utilizadas diretamente na forma líquida, ou o extrato líquido é liofilizado para posterior redissolução, ou a massa sólida fermentada ser submetida a tratamento de secagem e acondicionamento adequados.As a result of the extraction of nitrogenous compounds from FES, a formulation of a suitable culture medium for various fermentative processes is obtained, containing all the basic nutritional sources necessary for the growth of different microorganisms. The enzymes are used directly in liquid form, or the liquid extract is lyophilized for further redissolution, or the fermented solid mass is subjected to appropriate drying and conditioning treatment.

Neste exemplo, o extrato enzimático liofilizado é solubilizado em água proporcionando uma atividade exoamilolítica de 20 U/mL. Prepara-se uma suspensão com 19% de sólidos de farinha de babaçu. O pH é ajustado para 4,8 com ácido sulfúrico e o meio é termostatizado a 50°C por 4 horas, e em seguida mantido a 32°C por até 72 horas. Durante a incubação, a suspensão é agitada continuamente.In this example, the lyophilized enzymatic extract is solubilized in water providing an exoamylolytic activity of 20 U / mL. A suspension is prepared with 19% babassu flour solids. The pH is adjusted to 4.8 with sulfuric acid and the medium is thermostated at 50 ° C for 4 hours, and then maintained at 32 ° C for up to 72 hours. During the incubation, the suspension is continuously shaken.

Os resultados comparativos dos experimentos de hidrólise de farinha de babaçu utilizando a formulação enzimática produzida por fermentação no estado sólido com “Aspergillus awamori” IOC-3914 e utilizando um preparado enzimático comercial são apresentados na Tabela 2.The comparative results of the babassu flour hydrolysis experiments using the enzymatic formulation produced by solid state fermentation with “Aspergillus awamori” IOC-3914 and using a commercial enzymatic preparation are shown in Table 2.

A Tabela 2 mostra os teores de glicose e FAN observados durante os experimentos.

Table 2 shows the levels of glucose and ANA observed during the experiments.

A concentração de nitrogênio assimilável presente no meio hidrolisado consegue suprir toda necessidade nutricional de células de levedura, confirmando que o mesmo pode ser usado como meio de fermentação para subsequentes bioprocessos voltados à produção de etanol e outros produtos químicos. Verifica-se ainda que uma concentração de FAN entre 300 mg/L e 400 mg/L é consumida durante essas fermentações subsequentes.The concentration of assimilable nitrogen present in the hydrolyzed medium is able to supply all the nutritional needs of yeast cells, confirming that it can be used as a fermentation medium for subsequent bioprocesses aimed at the production of ethanol and other chemical products. It is also found that a concentration of FAN between 300 mg / L and 400 mg / L is consumed during these subsequent fermentations.

As enzimas usadas no processo da invenção, à baixa temperatura, atuam sobre o amido na forma granular, assim esse processo elimina a necessidade de alta demanda de energia para o processamento do amido, fornecendo maior produção de glicose para a conversão em etanol e outros bioprodutos de maior valor agregado. Exemplo 3: Emprego do extrato enzimático em baixa temperatura. 5 Em uma forma alternativa de conduzir o processo, um segundo experimento é realizado nas mesmas condições descritas no Exemplo anterior, porém, alterando-se a temperatura.The enzymes used in the process of the invention, at low temperature, act on the starch in granular form, thus this process eliminates the need for high energy demand for the processing of the starch, providing greater production of glucose for conversion into ethanol and other bioproducts higher added value. Example 3: Use of enzyme extract at low temperature. 5 In an alternative way of conducting the process, a second experiment is carried out under the same conditions as described in the previous Example, however, changing the temperature.

É também utilizada farinha de babaçu, variando-se apenas a temperatura, a qual é mantida desde o início a 32°C, com duração do 10 processo por até 24 horas.Babassu flour is also used, varying only the temperature, which is maintained from the beginning at 32 ° C, with the duration of the process for up to 24 hours.

Como se pode observar mesmo em baixa temperatura, após 24 horas ainda há liberação significativa de glicose correspondendo à conversão acima de 40% do amido contido no material.As can be seen even at low temperature, after 24 hours there is still a significant release of glucose corresponding to the conversion above 40% of the starch contained in the material.

Os resultados são apresentados na Tabela 3 a seguir.

15 Exemplo 4: Emprego do extrato enzimático em matéria-prima de milho.The results are shown in Table 3 below.

15 Example 4: Use of enzyme extract in corn raw material.

Neste exemplo o processo é conduzido nas mesmas condições descritas no Exemplo 2, mas utilizando-se como fonte de amido flocos de milho com granulometria menor do que 0,6 mm (28 mesh Tyler).In this example the process is carried out under the same conditions as described in Example 2, but using corn flakes with a grain size less than 0.6 mm (28 mesh Tyler) as the starch source.

Os teores de glicose e FAN são apresentados na Tabela 4 abaixo.

Exemplo 5: Emprego do extrato enzimático com variação da carga enzimática.Glucose and ANF levels are shown in Table 4 below.

Example 5: Use of enzyme extract with varying enzyme load.

O experimento é realizado nas mesmas condições do Exemplo anterior, com flocos de milho, porém a carga enzimática utilizada na 5 formulação enzimática produzida por fermentação no estado sólido com “Aspergillus awamori” IOC-3914 é de 4,5 U/mL.The experiment is carried out under the same conditions as in the previous Example, with corn flakes, however the enzymatic load used in the 5 enzymatic formulation produced by fermentation in the solid state with “Aspergillus awamori” IOC-3914 is 4.5 U / mL.

Os teores de glicose obtidos são apresentados na Tabela 5.

The glucose levels obtained are shown in Table 5.

Dessa forma, verifica-se que a formulação enzimática obtida da fermentação em estado sólido, após separação dos sólidos e sem passar 10 por processo de liofilização, com atividade final cinco vezes menor, é também capaz de produzir bons resultados. Exemplo 6: Aplicação do extrato enzimático empregando processo em batelada alimentada.Thus, it appears that the enzymatic formulation obtained from solid state fermentation, after separation of the solids and without going through 10 lyophilization process, with five times less final activity, is also capable of producing good results. Example 6: Application of the enzymatic extract using a fed batch process.

Nesse experimento o processo de hidrólise tem seu procedimento alterado. A matéria-prima fonte de amido é adicionada em diferentes 5 momentos da reação.In this experiment, the hydrolysis process has its procedure changed. The starch source raw material is added at different times of the reaction.

Teores de farinha de babaçu, na faixa entre 5% e 20% (em massa, em relação à massa total do sistema), são adicionados após 2 horas, 4 horas e 24 horas de sacarificação, totalizando uma adição entre 10% e 50% dos sólidos contidos na etapa inicial. 10 O experimento é conduzido nas mesmas condições descritas no Exemplo 2, utilizando-se a formulação enzimática produzida por fermentação em estado sólido com “Aspergillus awamori” IOC-3914, em presença de farinha de babaçu, sendo 10% do teor de sólidos inicial adicionados após 2 horas, 4 horas e 24 horas de sacarificação, totalizando 15 a adição 30% dos sólidos contidos no início.Babassu flour contents, in the range between 5% and 20% (by mass, in relation to the total mass of the system), are added after 2 hours, 4 hours and 24 hours of saccharification, totaling an addition between 10% and 50% of the solids contained in the initial stage. 10 The experiment is conducted under the same conditions described in Example 2, using the enzymatic formulation produced by solid state fermentation with “Aspergillus awamori” IOC-3914, in the presence of babassu flour, with 10% of the initial solids content added after 2 hours, 4 hours and 24 hours of saccharification, totaling 15 the addition 30% of the solids contained in the beginning.

Os resultados são mostrados na Tabela 6 a seguir.

Exemplo 7: Produção de etanol a partir de farinha de babaçu utilizando a formulação enzimática da invenção.The results are shown in Table 6 below.

Example 7: Production of ethanol from babassu flour using the enzyme formulation of the invention.

Neste experimento é aplicado o extrato enzimático obtido para a fermentação de farinha de babaçu visando à produção de etanol.In this experiment, the enzymatic extract obtained for the fermentation of babassu flour is applied in order to produce ethanol.

Prepara-se uma suspensão com 19% de farinha de babaçu. O pH é ajustado para 4,8 com solução de ácido sulfúrico 7 M, quando necessário. O meio é colocado a 50°C por 4 horas, e em seguida mantido a 32°C por até 72 horas.A suspension is prepared with 19% babassu flour. The pH is adjusted to 4.8 with a 7 M sulfuric acid solution, when necessary. The medium is placed at 50 ° C for 4 hours, and then maintained at 32 ° C for up to 72 hours.

A fermentação é conduzida sem qualquer adição de fonte de nitrogênio, pois o material proveniente das próprias biomassas utilizadas para a produção da formulação enzimática é hidrolisado pelas próprias enzimas e contém todas as enzimas necessárias para a fermentação final, incluindo amilases (alfa-amilases, glucoamilases, isoamilases), celulases (endoglucanases, beta-glicosidases), hemicelulases (xilanases) e proteases (endopeptidases, exopeptidases).Fermentation is carried out without any addition of nitrogen source, as the material from the biomasses used for the production of the enzyme formulation is hydrolyzed by the enzymes themselves and contains all the enzymes necessary for the final fermentation, including amylases (alpha-amylases, glucoamylases , isoamylases), cellulases (endoglucanases, beta-glycosidases), hemicellulases (xylanases) and proteases (endopeptidases, exopeptidases).

O gráfico apresentado na Figura 2 mostra o resultado do perfil cinético da produção de etanol durante a fermentação.The graph shown in Figure 2 shows the result of the kinetic profile of ethanol production during fermentation.

A conversão do amido granular usando a formulação enzimática permite realizar uma fermentação denominada “Very High Gravity” (VHG) de um meio com alto teor de sólidos pouco solúveis. A Tabela 7 a seguir mostra o resultado de experimentos de fermentação com a cepa JP1 de “Saccharomyces cerevisae”.

The conversion of granular starch using the enzymatic formulation allows a fermentation called “Very High Gravity” (VHG) to be carried out on a medium with a high content of poorly soluble solids. Table 7 below shows the result of fermentation experiments with the JP1 strain of “Saccharomyces cerevisae”.

Fica evidente que as formulações enzimáticas da invenção, além de serem produzidas a baixo custo, apresentam a vantagem de terem aplicação na conversão simultânea de oligossacarídeos e polissacarídeos de diferentes materiais visando à obtenção de biocombustíveis (etanol, butanol) e demais produtos químicos verdes (ácidos orgânicos, biopolímeros, antibióticos e polióis, dentre outros), viabilizando um processamento integrado de plantas industriais e, consequentemente, reduzindo os custos operacionais. Exemplo 8: Produção de etanol a partir de farinha de babaçu utilizando a formulação enzimática da invenção.It is evident that the enzymatic formulations of the invention, in addition to being produced at low cost, have the advantage of having application in the simultaneous conversion of oligosaccharides and polysaccharides of different materials in order to obtain biofuels (ethanol, butanol) and other green chemicals (acids organic, biopolymers, antibiotics and polyols, among others), enabling an integrated processing of industrial plants and, consequently, reducing operating costs. Example 8: Production of ethanol from babassu flour using the enzyme formulation of the invention.

Este experimento é conduzido de forma semelhante ao descrito no exemplo 7, porém com algumas alterações, pois a hidrólise ocorre em etapa separada da fermentação.This experiment is conducted in a similar way to that described in example 7, but with some changes, as the hydrolysis occurs in a separate step from the fermentation.

Prepara-se uma suspensão com 19% de farinha de babaçu. O pH é ajustado para 4,8 com ácido sulfúrico, quando necessário. O meio é colocado a 50°C por 24 horas, e em seguida o sólido residual é separado por filtração e/ou centrifugação. Ao líquido proveniente dessa separação, adiciona-se então as células de levedura e o processo de fermentação é conduzido por até 48 horas a 32°C. A Tabela 8 a seguir mostra o resultado de experimentos de fermentação com a cepa JP1 de “Saccharomyces cerevisae”.

Exemplo 9: Produção de etanol a partir de amido de milho utilizando a formulação enzimática da invenção.A suspension is prepared with 19% babassu flour. The pH is adjusted to 4.8 with sulfuric acid, when necessary. The medium is placed at 50 ° C for 24 hours, and then the residual solid is separated by filtration and / or centrifugation. Yeast cells are then added to the liquid from this separation and the fermentation process is conducted for up to 48 hours at 32 ° C. Table 8 below shows the result of fermentation experiments with the JP1 strain of “Saccharomyces cerevisae”.

Example 9: Production of ethanol from corn starch using the enzyme formulation of the invention.

Este experimento é conduzido sob as mesmas condições descritas no exemplo 7, substituindo-se a farinha de babaçu por amido de milho. A Tabela 9 a seguir mostra o resultado de experimentos de fermentação com a cepa JP1 de “Saccharomyces cerevisae”.

This experiment is conducted under the same conditions described in example 7, replacing babassu flour with corn starch. Table 9 below shows the result of fermentation experiments with the JP1 strain of “Saccharomyces cerevisae”.

Claims

1- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, characterized by using enzymatic formulations obtained from residues and agro-industrial materials to hydrolyze granular starch, which comprises the steps of: - feeding in a first reactor (100) for the production of enzymes to raw material agro-industrial waste (10), with granulometry in the range of 0.05 mm - 2.00 mm, a first stream of water (15), to adjust and maintain the moisture content in the range of 40% - 80%, and cells of filamentous fungi (20) grown, with concentration ranging from 1 gram to 7 grams of cells on a dry basis per liter of suspension selected from strains of fungi of the genus “Aspergillus”, to form a solid matrix (30); maintain fermentation (F1 ) in solid state (FES) for 12 hours - 168 hours, at a temperature in the range of 20 ° C - 55 ° C; - proceed with the extraction of the enzymes produced from the solid matrix (30), to a liquid phase, by means of addition of a second stream of water (35), in u m stirred reactor (F2) mechanically between 150 rpm and 1,500 rpm, in the liquid: solid ratio between 5 (L / kg) and 15 (L / kg); - separate the solid matrix (30) from the liquid containing the enzymatic extract (40), by means of a filtration step (S) and / or sedimentation and / or centrifugation (S), to remove the residue from the fermentation (50); - concentrate the liquid stream containing the enzymatic extract (40), by means of membrane ultrafiltration or lyophilization (C), to obtain a concentrated stream of enzymatic extract, which comprises the enzymatic formulation (45), and a concentrated residue (50 ') fermentation; - conduct a new stream (M) of raw material, formed by waste and / or agro-industrial material (10) and enzymatic formulation (45) to a second reactor (200), to be subjected to enzymatic hydrolysis and submerged fermentation (F3 ), in the presence of the enzyme formulation (45) obtained, using microbial cells (60) suitable for the production of biofuel or other desired chemical (70), said microbial cells selected from bacteria, actinomycetes, yeasts and filamentous fungi.

2- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized in that the raw material (10) comprises residues and agro-industrial materials selected from babassu pie; babassu flour; castor bean pie; canola pie; sunflower pie; beer pomace; maize starch; sugar cane molasses; soy molasses; millhocin; crude glycerin from soy biodiesel; sugar cane juice; corn grains, wheat grains, sorghum grains, among others.

3- INTEGRATED PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized in that the microorganism used to produce the said enzymatic formulation (40, 45) is selected among strands of filamentous fungi of the genus "Aspergillus", especially "Aspergillus awamori ”,“ Aspergillus wentii ”and“ Aspergillus oryzae ”.

4- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized by using a yeast strain “Saccharomyces cerevisiae" of industrial lineage for the process of enzymatic hydrolysis and submerged fermentation (F3), in the presence of the obtained enzymatic formulation .

5- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized by the concentration of solids added in the reaction medium, during the phases of hydrolysis and submerged fermentation (F2) being in the range of 15% to 35%, under the form of suspension.

6- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized by using said enzyme formulation directly in crude liquid form.

7- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized by using said enzyme formulation in the form of a concentrated enzyme extract (45), obtained through processes with membranes and / or by dissolving the enzyme preparation previously lyophilized.

8- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claims 1 and 7, characterized by using the lyophilized concentrated enzyme extract (45) to prepare suspensions with degrees of amylolytic activity in the range of 2 U / mL to 30 U / mL.

9- INTEGRATED PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized by the use of said enzymatic formulations to hydrolyze granular starch, for the production of ethanol, and other biofuels.

10- INTEGRATED PROCESS FOR PRODUCTION OF BIOFUELS, according to claim 1, characterized in that alternatively the raw material source of starch is added at different times of the reaction, in the range between 5% and 20%, added after 2 hours to 48 hours saccharification, totaling an addition between 10% and 70% of the solids contained in the initial stage.