BR112012009309B1

BR112012009309B1 - COMBINED VACCINE, USE OF MICRO-ORGANISMS CELLS, METHOD FOR THE PREPARATION OF A COMBINED VACCINE, AND, KIT OF PARTS

Info

Publication number: BR112012009309B1
Application number: BR112012009309-6A
Authority: BR
Inventors: Laura Labrie; Brian Sheehan; Yeng Sheng Lee; Wong Fong Sian
Original assignee: Intervet International B.V
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2010-10-18
Publication date: 2021-10-05
Also published as: CN107648600A; BR112012009309A2; TWI495478B; WO2011048041A1; TW201119671A; CN102740878A

Abstract

vacina combinada, uso de uma quantidade imunogênica de células de microrganismo, método para a preparação de uma vacina combinada, e, kit de partes. a presente invenção diz respeito a uma vacina combinada para a proteção de peixe contra infecção estreptocócica, o uso de estreptococos para a fabricação de uma tal vacina, a métodos para a preparação de uma tal vacina combinada e a um kit de partes que compreendem uma tal vacina.combined vaccine, use of an immunogenic quantity of microorganism cells, method for preparing a combined vaccine, and kit of parts. The present invention relates to a combined vaccine for the protection of fish against streptococcal infection, the use of streptococci for the manufacture of such a vaccine, to methods for preparing such a combined vaccine and to a kit of parts comprising such a vaccine. vaccine.

Description

[001] A presente invenção diz respeito a uma vacina combinada para a proteção de peixe contra infecção estreptocócica, o uso de estreptococos para a fabricação de uma tal vacina, a métodos para a preparação de uma tal vacina combinada e a um kit de partes que compreendem uma tal vacina.[001] The present invention relates to a combined vaccine for the protection of fish against streptococcal infection, the use of streptococci for the manufacture of such a vaccine, methods for preparing such a combined vaccine and a kit of parts that comprise such a vaccine.

[002] Nas últimas décadas, no mundo todo um aumento mais forte é visto no consumo de peixe. Este é o caso para ambos o consumo de peixe de água fria tal como salmão, rodovalho, hipoglosso e bacalhau, e peixe tropical tal como perca do mar Asiático, tilápia, peixe-leite, olho-de-boi, amberjack, garoupa e cobia. Como uma consequência, um aumento foi visto no número e o tamanho das fazendas de peixe, a fim de encontrar o aumento necessário do mercado.[002] In recent decades, worldwide a stronger increase is seen in fish consumption. This is the case for both consumption of cold water fish such as salmon, turbot, halibut and cod, and tropical fish such as Asian sea perch, tilapia, milkfish, manatee, amberjack, grouper and cobia . As a consequence, an increase was seen in the number and size of fish farms in order to meet the necessary increase in the market.

[003] Como é conhecido a partir de, por exemplo, criação animal, números amplos de animais que vivem próximos, juntos, são vulneráveis em todos os grupos de doenças, ainda as doenças raramente conhecidas ou vistas ou ainda não conhecidas, antes dos dias de criação comercial em ampla escala. É igualmente verdade para a criação de peixe.[003] As is known from, for example, animal husbandry, large numbers of animals that live close together are vulnerable to all disease groups, even diseases rarely known or seen or not yet known, before the days of commercial creation on a large scale. It is equally true for fish farming.

[004] Os exemplos de patogênios de peixe comercialmente importantes notórios são Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subespécies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Streptococcus sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, vírus da Necrose Viral, iridovírus e Herpesvírus de Koi.Examples of notorious commercially important fish pathogens are Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subspecies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Streptococcus sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri virus, E. ictaluri virus. , iridovirus and Koi Herpesvirus.

[005] Diversas espécies do gênero bacteriano Streptococcus são correntemente conhecidos para causar as infecções em peixe, mais especificamente no peixe que são mantidos na aquacultura. Exemplos de tais espécies estreptocócicas são Streptococcus iniae, S. difficile, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. phocae.[005] Several species of the bacterial genus Streptococcus are currently known to cause infections in fish, more specifically in fish that are kept in aquaculture. Examples of such streptococcal species are Streptococcus iniae, S. difficile, S. agalactiae, S. dysgalactiae and S. phocae.

[006] Tem recentemente algumas mudanças na opinião da nomeclatura correta de Streptococcus difficile e Streptococcus agalactiae. Vandamme et al (Int. J. Syst. Bacteriology 47: 81-85 (1995)) tem sugerido que Streptococcus difficile é de fato um Streptococcus agalactiae não hemolítico.[006] There have recently been some changes in the opinion of the correct naming of Streptococcus difficile and Streptococcus agalactiae. Vandamme et al (Int. J. Syst. Bacteriology 47: 81-85 (1995)) have suggested that Streptococcus difficile is in fact a non-hemolytic Streptococcus agalactiae.

[007] O Streptococcus iniae é frequentemente observado em tilápia,truta arco-íris, perca do mar europeu e brema, perca de mar asiática, Red drum, peixe-coelho, linguado japonês, olho-de-boi e perca listrado híbrido.[007] Streptococcus iniae is frequently observed in tilapia, rainbow trout, European sea perch and bream, Asian sea perch, Red drum, rabbitfish, Japanese sole, manatee and hybrid striped perch.

[008] O impacto anual de infecção Streptococcus iniae a aquaculture excede 100 milhões de dólares Americanos.[008] The annual impact of Streptococcus iniae infection to aquaculture exceeds US$100 million.

[009] Streptococcus dicile é frequentemente observado na tilápia, snapper e ainda raia.[009] Streptococcus dicile is often seen in tilapia, snapper and ray.

[0010] Streptococcus agalactiae, embora observado em muitas espécies de peixe, é correntemente observado para infectar a tilápia.[0010] Streptococcus agalactiae, although observed in many species of fish, is currently observed to infect tilapia.

[0011] As vacinas para o combate da infecção estreptocócica no peixe são conhecidas na técnica.Vaccines for combating streptococcal infection in fish are known in the art.

[0012] Muitas das vacinas de Streptococcus são baseadas nas células totais mortas. As vacinas Streptococcus agalactiae são i.a. descritas no Pedido de Patente U.S. 2005/0208077. As vacinas Streptococcus iniae são i.a. descritas na Patente U.S. 6.379.677. As vacinas para o combate da infecção Streptococcus iniae também são comercialmente disponíveis. Um exemplo é Norvax Strep Si, uma vacina contra a infecção Streptococcus iniae e vendido pela Intervet Int. B.V. Eldar et al (Vaccine 13: 867-870 (1995)) tem descrito uma vacina contra Streptococcus difficile na base das células totais mortas.[0012] Many of the Streptococcus vaccines are based on total dead cells. Streptococcus agalactiae vaccines are i.a. described in U.S. Patent Application 2005/0208077. Streptococcus iniae vaccines are i.a. described in U.S. Patent 6,379,677. Vaccines to fight Streptococcus iniae infection are also commercially available. One example is Norvax Strep Si, a vaccine against Streptococcus iniae infection and sold by Intervet Int. B.V. Eldar et al (Vaccine 13: 867-870 (1995)) has described a vaccine against Streptococcus difficile on the basis of total dead cells.

[0013] Para melhorar o conhecimento da doença estreptocócica no peixe tropical, mais especificamente em tilápia, os inventores têm realizado estudos epidemiológicos extensivos realizados em países produtores de tilápia maior na Ásia e América latina. Estes estudos têm produzido quase cinco centenas de isolados estreptocócicos recuperados a partir de aproximadamente cinquenta locais nos treze países nos últimos oito anos. Os isolados foram identificados usando-se bioquímica padrão e métodos de identificação bacteriológicos e subsequentemente analisados pela análise agrupadora (média do grupo com pares não pesados com base no percentual de desacordo). De maneira interessante, fora de quase 500 isolados estreptocócicos recuperados a partir de tilápia, 82 % foram identificados como Streptococcus agalactiae e 18 % foram identificados como Streptococcus iniae.[0013] To improve the knowledge of streptococcal disease in tropical fish, more specifically in tilapia, the inventors have carried out extensive epidemiological studies carried out in larger tilapia producing countries in Asia and Latin America. These studies have produced nearly five hundred streptococcal isolates recovered from approximately fifty sites in thirteen countries over the past eight years. Isolates were identified using standard biochemistry and bacteriological identification methods and subsequently analyzed by pool analysis (group mean with unweighed pairs based on percent disagreement). Interestingly, out of nearly 500 streptococcal isolates recovered from tilapia, 82% were identified as Streptococcus agalactiae and 18% were identified as Streptococcus iniae.

[0014] Streptococcus iniae é um patogênico de peixe significante que causa a doença e mortalidade em muitos espécies de peixe cultivado de água fresca e marinha nas áreas tropicais e sub-tropicais. As vacinas para combater a infecção S. iniae em uma variedade das espécies de peixe incluindo tilápia são disponíveis e existe um amplo corpo da literatura na patogênese deste organismo em uma variedade das espécies de peixes.[0014] Streptococcus iniae is a significant fish pathogen that causes disease and mortality in many freshwater and marine cultivated fish species in tropical and sub-tropical areas. Vaccines to fight S. iniae infection in a variety of fish species including tilapia are available and there is a large body of literature on the pathogenesis of this organism in a variety of fish species.

[0015] A informação menos considerável é disponível para S. agalactiae peixe-patogênico.[0015] Less considerable information is available for fish-pathogenic S. agalactiae.

[0016] S. agalactiae é um grupo B denominado streptococcus (GBS). É um patogênio importante para os humanos e animais. Embora mais comumente associado com doença em hospedeiros humanos e bovinos, S. agalactiae de peixe patogênico foi documentado a partir tão precoce quanto 1966 quando um grupo B de streptococcus não hemolítico foi identificado como a causa de dois epizoóticos nos shiners dourados (Notemigonus crysoleucas).[0016] S. agalactiae is a group B called streptococcus (GBS). It is an important pathogen for humans and animals. Although more commonly associated with disease in human and bovine hosts, pathogenic fish S. agalactiae was documented as early as 1966 when a group B of non-hemolytic streptococcus was identified as the cause of two epizootics in golden shiners (Notemigonus crysoleucas).

[0017] Hoje, com a intensificação da aquacultura, S. agalactiae é conhecido ser uma causa significante da mortalidade e morbidez tanto nas espécies cultivadas em água doce quanto marinha e em particular em tilápia. A análise detalhada de isolados de tilápia S. agalactiae como observados pelos inventores sugerem a presença de dois agrupadores distintos que diferem em uma variedade das características fenotípicas e bioquímicas. Estes agrupadores distintos são referidos como biotipos e nesta diferenciação da base pode ser feito entre S. agalactiae “clássico” (depois referido como biotipo 1 de S. agalactiae) e tipicamente S. agalactiae não hemolítico B (depois referido como biotipo 2 de S. agalactiae). Estas cepas posteriores foram previamente classificadas como S. dicile/S. dicilis mas tem subsequentemente re-classificados como variantes B não hemolíticas de S. agalactiae.[0017] Today, with the intensification of aquaculture, S. agalactiae is known to be a significant cause of mortality and morbidity in both freshwater and marine cultivated species and in particular in tilapia. Detailed analysis of tilapia S. agalactiae isolates as observed by the inventors suggest the presence of two distinct clusters that differ in a variety of phenotypic and biochemical characteristics. These distinct groupers are referred to as biotypes and in this basis differentiation can be made between "classic" S. agalactiae (later referred to as S. agalactiae biotype 1) and typically non-hemolytic B S. agalactiae (later referred to as S. agalactiae biotype 2). agalactiae). These later strains were previously classified as S. dicile/S. dicilis but has subsequently been reclassified as non-haemolytic B variants of S. agalactiae.

[0018] As infecções de Streptococcus agalactiae na tilápia criada agora são conhecidas ser responsáveis pela morbidez significante, mortalidade e perda econômica. As infecções com S. agalactiae resultam na septicemia e colonização de vários órgãos internos particularmente o cérebro que conduz os sinais clínicos. Os sinais clínicos da infecção S. agalactiae incluem nado anormal, postura corporal em forma de “C” e inapetência. S. agalactiae é predominante em toda parte das regiões temperadas e tropicais e os inventores tem recuperado a partir da tilápia doente na Europa, Central e América Latina e em toda parte da Ásia.[0018] Streptococcus agalactiae infections in created tilapia are now known to be responsible for significant morbidity, mortality and economic loss. Infections with S. agalactiae result in septicemia and colonization of various internal organs particularly the brain which drives clinical signs. Clinical signs of S. agalactiae infection include abnormal swimming, “C”-shaped body posture, and inappetence. S. agalactiae is prevalent throughout temperate and tropical regions and inventors have recovered from diseased tilapia in Europe, Central and Latin America and throughout Asia.

[0019] Os dois biotipos de S. agalactiae causam síndromes de doença sutilmente distintas, com o biotipo 1 que infecta o peixe em toda parte do ciclo de produção de juvenil a desenvolvido, enquanto o biotipo 2 causa a doença predominante em peixe maior.The two biotypes of S. agalactiae cause subtly distinct disease syndromes, with biotype 1 infecting fish throughout the production cycle from juvenile to developed, while biotype 2 causes the predominant disease in larger fish.

[0020] Nos inventores epidemiológicos examinam a data, com quase 500 isolados estreptocócicos de 13 países a maioria de todos os isolados estreptocócicos de tilápia são o biotipo 2 de S. agalactiae. Os inventores foram identificados de biotipo 2 de S. agalactiae no peixe doente de países que produzem mais tilápias incluindo Indonésia, China, Vietnã, Filipinas, Equador, Honduras, México e Brasil.[0020] In the epidemiological inventors examine the date, with nearly 500 streptococcal isolates from 13 countries the majority of all streptococcal tilapia isolates are biotype 2 of S. agalactiae. The inventors have identified S. agalactiae biotype 2 in diseased fish from countries that produce the most tilapia including Indonesia, China, Vietnam, the Philippines, Ecuador, Honduras, Mexico and Brazil.

[0021] A análise das cepas de biotipo 1 isoladas a partir do peixe revela que dois sorotipos existem: as cepas de sorotipo Ia e cepas de sorotipo III (Suanyuk, N. et al., Aquaculture 284: 35-40 (2008)). Ambas as cepas, entretanto, formam as mesmas características bioquímicas que fazem as cepas de biotipo 1 e estas são ambas hemolíticas.Analysis of biotype 1 strains isolated from fish reveals that two serotypes exist: serotype Ia strains and serotype III strains (Suanyuk, N. et al., Aquaculture 284: 35-40 (2008)) . Both strains, however, form the same biochemical characteristics that do biotype 1 strains and these are both hemolytic.

[0022] Mais importante, ambas as cepas contêm o gene que codifica a proteína de alfa C associado de superfície (bca). Para esta proteína foi extensivamente já mostrado em 1991 que induz a imunidade protetora contra S. agalactiae (Michel, J.L. et al., Inf. & Immun. 59: 2023-2028 (1991)). Ainda os anticorpos monoclonais foram elevados contra um epítopo de proteína alfa C protetora específica no grupo B de estreptococos, que foi capaz de matar o grupo B de Estreptococos (Madoff, L.C. et al., Inf. & Immun. 59: 204-210 (1991)).More importantly, both strains contain the gene encoding the surface-associated alpha C protein (bca). This protein has already been extensively shown in 1991 to induce protective immunity against S. agalactiae (Michel, J.L. et al., Inf. & Immun. 59: 2023-2028 (1991)). Furthermore, monoclonal antibodies were elevated against a specific protective alpha C protein epitope in group B streptococci, which was able to kill group B Streptococci (Madoff, LC et al., Inf. & Immun. 59: 204-210 ( 1991)).

[0023] A alfa-C-proteína é comumente observada nas cepas de sorotipo S. agalactiae Ia, mas não é incomum na superfície das cepas de sorotipo III S. agalactiae humano. Entretanto, tornou-se estar sempre presente na superfície de todas as cepas de sorotipo III S. agalactiae de peixe patogênico isolado até agora.Alpha-C-protein is commonly seen in S. agalactiae Ia serotype Ia strains, but is not uncommon on the surface of human S. agalactiae serotype III strains. However, it has become ever-present on the surface of all serotype III S. agalactiae strains of pathogenic fish isolated so far.

[0024] Portanto, deve ser seguramente concluído que as vacinas de células totais existentes, com base no sorotipo de, por exemplo, do sorotipo Ia de isolado Mullet são capazes de induzir uma resposta imune protetora contra ambas cepas de sorotipo 1a de S. agalactiae conhecido e as cepas de sorotipo III de S. agalactiae mais recentemente observado.[0024] Therefore, it must be safely concluded that existing whole cell vaccines, based on serotype of, for example, serotype Ia of the Mullet isolate are capable of inducing a protective immune response against both strains of S. agalactiae serotype 1a known and the more recently observed serotype III strains of S. agalactiae.

[0025] É supreendentemente observado, que a despeito de seu biotipo unido, as características B hemolíticas unidas e a proteína de alfa C associada a superfície unida, uma vacina de célula total com base na cepa de Mullet (Ia) conhecida não fornecer a proteção parcial contra as cepas de sorotipo III S. agalactiae mais recentemente observadas e vice-versa.[0025] It is surprisingly observed, that despite their close-knit biotype, the linked hemolytic B-characteristics and the joined-surface-associated alpha C protein, a whole cell vaccine based on the known Mullet (Ia) strain does not provide protection against the most recently observed serotype III S. agalactiae strains and vice versa.

[0026] Esta descoberta inesperada não foi noticiada permanentemente até agora.[0026] This unexpected discovery has not been permanently reported until now.

[0027] A consequência inesperada, igualmente, é que as vacinas correntes não são suficientemente efetivas para evitar ou tratar a infecção de S. agalactiae no peixe.[0027] The unintended consequence, too, is that current vaccines are not effective enough to prevent or treat S. agalactiae infection in fish.

[0028] É um objetivo da presente invenção fornecer uma solução a este problema, pelo fornecimento de uma vacina combinada para a proteção de peixe contra a infecção por S. agalactiae que tem uma característica que compreende as quantidades imunogênicas de duas cepas de biotipo 1 de S. agalactiae: um pertencente ao sorotipo Ia e um pertencente ao sorotipo III.[0028] It is an aim of the present invention to provide a solution to this problem, by providing a combined vaccine for the protection of fish against S. agalactiae infection that has a characteristic comprising the immunogenic amounts of two biotype 1 strains of S. agalactiae: one belonging to serotype Ia and one belonging to serotype III.

[0029] Uma primeira forma de realização da presente invenção deste modo diz respeito a uma vacina combinada para a proteção de peixe contra infecção estreptocócica, em que a dita vacina compreende uma quantidade imunogênica de células de sorotipo Ia de biotipo 1 Streptococcus agalactiae e uma quantidade imunogênica de células de sorotipo III de biotipo 1 de Streptococcus agalactiae e um carreador farmaceuticamente aceitável.[0029] A first embodiment of the present invention thus concerns a combined vaccine for the protection of fish against streptococcal infection, wherein said vaccine comprises an immunogenic amount of serotype Ia cells of biotype 1 Streptococcus agalactiae and an amount immunogenicity of Streptococcus agalactiae serotype III biotype 1 cells and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0030] Uma quantidade imunogênica das células Streptococcus agalactiae é a quantidade de células necessárias para introduzir um resposta imune que é pelo menos capaz de reduzir a gravidade da doença, comparada ao peixe não vacinado.[0030] An immunogenic amount of Streptococcus agalactiae cells is the amount of cells needed to introduce an immune response that is at least capable of reducing the severity of the disease, compared to unvaccinated fish.

[0031] Um carreador farmaceuticamente aceitável pode ser tão simples quanto a água ou um tampão, ou uma emulsão tal como, por exemplo, uma emulsão água em óleo ou emulsão óleo em água.[0031] A pharmaceutically acceptable carrier can be as simple as water or a buffer, or an emulsion such as, for example, a water-in-oil emulsion or an oil-in-water emulsion.

[0032] Embora tanto as células de sorotipo Ia de biotipo 1 de Streptococcus agalactiae quanto as células de sorotipo III de biotipo 1 de Streptococcus agalactiae são prontamente disponíveis pela pessoa habilitada, um exemplos de uma cepa de sorotipo III de Streptococcus agalactiae foi depositado com Collection Nationale de Culturas de Microrganismos (CNCM), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France, sob número de acessão CNCM I-4232, com o nome e endereço de Intervet International B.V., Wim de Korverstraat 35, 5831 AN, Boxmeer, The Netherlands.Although both Streptococcus agalactiae serotype Ia biotype 1 cells and Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype III cells are readily available to the skilled person, an example of a Streptococcus agalactiae serotype III strain has been deposited with Collection Nationale de Culturas de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France, under accession number CNCM I-4232, with the name and address of Intervet International BV, Wim de Korverstraat 35 , 5831 AN, Boxmeer, The Netherlands.

[0033] Em uma vacina combinada de acordo com a invenção, a bactéria pode estar presente em uma forma viva atenuada ou em uma forma inativada, por exemplo, como uma bacterina. É importante o fato que as propriedades imunogênicas da bactéria ainda estão presentes. Este pode facilmente ser garantido pelo uso das preparações bacterianas totais. Como dito acima, contanto que as propriedades imunogênicas da bactéria ainda estão presentes, não é imensamente importante se a bactéria na preparação está viva, morta ou ainda fragmentada (por exemplo, comprimindo-a através de um French Press).[0033] In a combined vaccine according to the invention, the bacteria may be present in a live attenuated form or in an inactivated form, for example, as a bacterin. Importantly, the immunogenic properties of the bacteria are still present. This can easily be guaranteed by the use of total bacterial preparations. As stated above, as long as the immunogenic properties of the bacteria are still present, it is not immensely important whether the bacteria in the preparation is alive, dead or still fragmented (for example, by compressing it through a French Press).

[0034] A bactéria atenuada viva é muito adequada, porque, por definição, carrega características imunogênicas. E a bactéria atenuada viva tem a vantagem sobre as bacterinas, que esta pode ser dada sem um adjuvante. Além disso, estas autoreplicam a até certo ponto até serem interrompidas pelo sistema imune, como um resultado de que um número inferior de células possa ser dado.[0034] Live attenuated bacteria is very suitable because, by definition, it carries immunogenic characteristics. And live attenuated bacteria have the advantage over bacterins that they can be given without an adjuvant. Furthermore, these self-replicate to some extent until stopped by the immune system, as a result of which fewer cells can be given.

[0035] De outra maneira, as características imunogênicas também estão presentes na bactéria quando estas bactérias estão na forma de uma bacterina. E as bacterinas tem a vantagem na bactéria atenuada viva que estes são muitos seguros.[0035] Otherwise, immunogenic characteristics are also present in the bacteria when these bacteria are in the form of a bacterin. And bacterins have the advantage on live attenuated bacteria that they are very safe.

[0036] Portanto, em uma forma preferida desta forma de realização, a invenção diz respeito a uma vacina combinada em que as células de Streptococcus agalactiae são inativadas. Preferivelmente, as células estão na forma de uma bacterina.[0036] Therefore, in a preferred form of this embodiment, the invention concerns a combined vaccine in which Streptococcus agalactiae cells are inactivated. Preferably the cells are in the form of a bacterin.

[0037] Uma bacterina é definida neste como bactéria em uma forma inativada. O método usado para a inativação parece não ser relevante pela atividade da bacterina. Os métodos clássicos para a inativação tal como tratamento por calor, tratamento com formalina, imina de etileno binário, timerosal e outros, todos bem conhecidos na técnica, são aplicados. A inativação de bactéria por meio da tensão física, usando, por exemplo, um French Press fornece um material de partida igualmente adequado para a fabricação de uma vacina de acordo com a invenção.[0037] A bacterin is defined in this as bacteria in an inactivated form. The method used for the inactivation appears not to be relevant due to the activity of the bacterin. Classical methods for inactivation such as heat treatment, formalin treatment, binary ethylene imine, thimerosal and others, all well known in the art, are applied. The inactivation of bacteria through physical tension, using, for example, a French Press provides an equally suitable starting material for the manufacture of a vaccine according to the invention.

[0038] As vacinas de acordo com a invenção podem ser preparadas de partida de uma cultura bacteriana de acordo com as técnicas bem conhecidas aquele médico habilitado.[0038] The vaccines according to the invention can be prepared starting from a bacterial culture according to techniques well known to that qualified physician.

[0039] Os artigos de revisão relacionam as vacinas de peixe e seus fabricantes são i.a. por Sommerset, I., Krossov, B., Biering, E. and Frost, P. in Expert Review of Vaccines 4: 89-101 (2005), by Buchmann, K., Lindenstrom, T. and Bresciani, in J. Acta Parasitologica 46: 71-81 (2001), by Vinitnantharat, S., Gravningen, K. and Greger, E. in Advances in veterinary medicine 41: 539-550 (1999) and by Anderson, D.P. in Developments in Biological Standardization 90: 257-265 (1997). Além disso, o médico habilitado observará a orientação nos exemplos abaixo.Review articles relating fish vaccines and their manufacturers are ia by Sommerset, I., Krossov, B., Biering, E. and Frost, P. in Expert Review of Vaccines 4: 89-101 (2005) , by Buchmann, K., Lindenstrom, T. and Bresciani, in J. Acta Parasitologica 46: 71-81 (2001), by Vinitnantharat, S., Gravningen, K. and Greger, E. in Advances in veterinary medicine 41: 539-550 (1999) and by Anderson, DP in Developments in Biological Standardization 90: 257-265 (1997). In addition, the qualified practitioner will observe the guidance in the examples below.

[0040] As vacinas de acordo com a invenção basicamente compreendem uma quantidade efetiva de uma bactéria e um carreador farmaceuticamente aceitável.[0040] Vaccines according to the invention basically comprise an effective amount of a bacterium and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0041] A quantidade das células administradas dependerá da vida de administração, a presença de um adjuvante e o momento de administração.[0041] The amount of cells administered will depend on the life of administration, the presence of an adjuvant and the time of administration.

[0042] De outra maneira, a pessoa habilitada na técnica observa a orientação suficiente nas referências mencionadas acima na informação dada abaixo, especificamente nos Exemplos.[0042] Otherwise, the person skilled in the art observes sufficient guidance in the references mentioned above in the information given below, specifically in the Examples.

[0043] Falando-se em geral, as vacinas fabricadas de acordo com a invenção que são baseadas nas bacterinas podem ser administradas pela injeção e geral em uma dosagem de 103 a 1010, preferivelmente 106 a 1010, mais preferivelmente entre 108 e 1010 bactérias. Uma dosagem excede 1010 bactérias, embora imunologicamente adequada, será menos atrativo pelas razões comerciais.[0043] Generally speaking, vaccines manufactured according to the invention which are based on bacterins can be administered by injection and generally in a dosage of 103 to 1010, preferably 106 to 1010, more preferably between 108 and 1010 bacteria. A dosage exceeding 1010 bacteria, although immunologically adequate, will be less attractive for commercial reasons.

[0044] Para a quantidade de bactéria na vacina fabricada de acordo com a invenção e pela aplicação oral, os exemplos abaixo fornecerão orientação ampla.[0044] For the amount of bacteria in the vaccine manufactured in accordance with the invention and by oral application, the examples below will provide broad guidance.

[0045] Os exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para o uso em uma vacina para o uso de acordo com a invenção são água estéril, solução salina, tampões aquosos tal como PBS e outros. Além disso, uma vacina de acordo com a invenção pode compreender outros aditivos tal como adjuvantes, estabilizadores, anti-oxidantes e outros, como descrito abaixo.[0045] Examples of pharmaceutically acceptable carriers which are suitable for use in a vaccine for use according to the invention are sterile water, saline solution, aqueous buffers such as PBS and others. Furthermore, a vaccine according to the invention may comprise other additives such as adjuvants, stabilizers, antioxidants and others, as described below.

[0046] As vacinas de acordo com a presente invenção, especialmente, as vacinas que compreendem uma bacterina, pode em uma apresentação preferida também conter uma substância imunoestimuladora, um adjuvante denominado. Os adjuvantes em geral compreendem as substâncias que intensificam a resposta imune do hospedeiro em uma maneira não específica. Diversos adjuvantes diferentes são conhecidos na técnica. Os exemplos de adjuvantes frequentemente usados na criação de peixe e de mariscos são dipeptídeos de muramila, lipopolissacarídeos, diversos glucanos e glicanos e Carbopol® . Um resumo extensivo de adjuvantes adequados para vacinas de peixes e moluscos é dado no relatório de resumo por Jan Raa (Reviews in Fisheries Science 4(3): 229-288 (1996)).[0046] Vaccines according to the present invention, especially vaccines comprising a bacterin, may in a preferred presentation also contain an immunostimulating substance, a so-called adjuvant. Adjuvants in general comprise substances that enhance the host's immune response in a non-specific manner. Several different adjuvants are known in the art. Examples of adjuvants frequently used in fish and shellfish farming are muramyl dipeptides, lipopolysaccharides, various glucans and glycans and Carbopol®. An extensive summary of suitable adjuvants for fish and shellfish vaccines is given in the summary report by Jan Raa (Reviews in Fisheries Science 4(3): 229-288 (1996)).

[0047] A vacina também pode compreender um "veículo" denominado. Um veículo é um composto em que a bactéria adere, sem ser covalentemente ligada a este. Tasi veículos são i.a. bio-microcápsulas, micro- alginados, lipossomos e macrossóis, todos conhecidos na técnica.[0047] The vaccine may also comprise a so-called "vehicle". A vehicle is a compound to which the bacterium adheres, without being covalently attached to it. Such vehicles are i.a. bio-microcapsules, micro-alginates, liposomes and macrosols, all known in the art.

[0048] Uma forma especial de um tal veículo, em que o antígeno é parcialmente fixo no veículo, é denominado ISCOM (Patentes Européias EP 109,942, EP 180,564, EP 242,380).[0048] A special form of such a vehicle, in which the antigen is partially affixed to the vehicle, is termed ISCOM (European patents EP 109,942, EP 180,564, EP 242,380).

[0049] Além disso, a vacina pode compreender um ou mais compostos ou emulsificadores ativos de superfície adequada, por exemplo, Span ou Tween.[0049] Furthermore, the vaccine may comprise one or more suitable surface active compounds or emulsifiers, for example, Span or Tween.

[0050] Os adjuvantes oleosos adequados para o uso em emulsões água em óleo são, por exemplo, óleos minerais ou óleos metabolizáveis. Os óleos minerais são, por exemplo, Bayol®, Marcol® e Drakeol®. Um exemplo de um adjuvante de óleo não mineral é, por exemplo, Montanida-ISA-763-A.[0050] Oily adjuvants suitable for use in water-in-oil emulsions are, for example, mineral oils or metabolizable oils. Mineral oils are, for example, Bayol®, Marcol® and Drakeol®. An example of a non-mineral oil adjuvant is, for example, Montanide-ISA-763-A.

[0051] Os óleos metabolizáveis são, por exemplo, óleos vegetais, tal como óleo de amendoim e óleo de soja, óleos de animais, tais como os óleos de peixe, esqualano e tocoferol e seus derivados.[0051] Metabolizable oils are, for example, vegetable oils such as peanut oil and soybean oil, animal oils such as fish, squalane and tocopherol oils and their derivatives.

[0052] Os adjuvantes adequados são, por exemplo, emulsões w/o, emulsões o/w e emulsões duplas w/o/w. Um exemplo de um adjuvantes de nano- partícula com base em água é, por exemplo, Montanida-IMS-2212.Suitable adjuvants are, for example, w/o emulsions, o/w emulsions and w/o/w double emulsions. An example of a water-based nanoparticle adjuvant is, for example, Montanida-IMS-2212.

[0053] Frequentemente, a vacina é misturada com estabilizadores, por exemplo, para proteger as proteínas propensa a degradação de ser degradada, para intensificar a vida de prateleira da vacina, ou para melhorar a eficiência de secagem por congelamento. Os estabilizadores úteis são i.a. SPGA (Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carboidratos, por exemplo, sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tais como albumina ou caseína ou produtos de degradação destes e tampões, tal como fosfatos de metais alcalinos. Além disso, a vacina pode ser recolocada em suspensão em um diluente fisiologicamente aceitável. Se contar, que outras maneiras de auxiliar, adicionar os compostos ou diluentes do veículo, emulsificar ou estabilizar uma proteína também são incorporados na presente invenção.[0053] Often, the vaccine is mixed with stabilizers, for example, to protect the degradation-prone proteins from being degraded, to enhance the vaccine's shelf life, or to improve the efficiency of freeze-drying. Useful stabilizers are ia SPGA (Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohydrates, for example, sorbitol, mannitol, trehalose, starch, sucrose, dextran or glucose, proteins such as albumin or casein or products of degradation of these and buffers such as alkali metal phosphates. In addition, the vaccine can be resuspended in a physiologically acceptable diluent. It should be noted that other ways to aid, add the compounds or carrier diluents, emulsify or stabilize a protein are also incorporated into the present invention.

[0054] É conhecido que especialmente as vacinas inativas, tal como bacterinas mostram a imunogenicidade melhorada quando dada como uma emulsão água em óleo.[0054] It is known that especially inactive vaccines such as bacterins show improved immunogenicity when given as a water-in-oil emulsion.

[0055] Portanto, em uma forma mais preferida desta forma de realização, a invenção diz respeito a uma vacina combinada em que a vacina é uma emulsão água em óleo.[0055] Therefore, in a more preferred form of this embodiment, the invention concerns a combined vaccine in which the vaccine is a water-in-oil emulsion.

[0056] A partir do ponto de aceitabilidade farmacêutica, existe uma relutância de desenvolvimento contra o uso de óleos minerais.[0056] From the point of pharmaceutical acceptability, there is a developmental reluctance against the use of mineral oils.

[0057] Deste modo, ainda em uma forma preferida desta forma de realização, a invenção diz respeito a uma vacina combinada em que o óleo é um óleo não mineral.[0057] Thus, still in a preferred form of this embodiment, the invention concerns a combined vaccine in which the oil is a non-mineral oil.

[0058] Em uma forma mais preferida desta forma de realização, a invenção diz respeito a uma vacina combinada em que o óleo é Montanida ISA 763 A.[0058] In a more preferred form of this embodiment, the invention relates to a combined vaccine in which the oil is Montanida ISA 763 A.

[0059] Muitas vias de administração, todas conhecidas na técnica podem ser aplicadas. A vacina de acordo com a invenção é preferivelmente administrada ao peixe por intermédio da injeção, imersão, ou pela via oral. Especialmente a aplicação oral e, por exemplo, aplicação intraperitoneal são maneiras atrativas de administração.[0059] Many routes of administration, all known in the art can be applied. The vaccine according to the invention is preferably administered to the fish via injection, immersion, or orally. Especially oral application and, for example, intraperitoneal application are attractive ways of administration.

[0060] Geralmente considerando: se a vacina pode ser melhorada pela adição de um adjuvante, a via de administração deve ser preferivelmente a via intraperitoneal. A partir de um ponto imunológico de vista, a vacinação intraperitoneal com uma bacterina é uma via muito efetiva de vacinação, especialmente por causa deste permite a incorporação de adjuvantes.Generally considering: if the vaccine can be improved by the addition of an adjuvant, the route of administration should preferably be the intraperitoneal route. From an immunological point of view, intraperitoneal vaccination with a bacterin is a very effective route of vaccination, especially because it allows for the incorporation of adjuvants.

[0061] O protocolo de administração pode ser otimizado de acordo com a prática de vacinação padrão. O técnico habilitado deve conhecer como este, ou deve observar a orientação no relatório mencionado acima.[0061] The administration protocol can be optimized according to standard vaccination practice. The qualified technician must know how to do this, or must observe the guidance in the report mentioned above.

[0062] A idade do peixe a ser vacinado não é crítico, embora claramente deve-se desejar vacinar contra a bactéria patogênica de peixe tão precocemente um estágio quanto possível, isto é, antes da exposição possível ao patogênio.The age of the fish to be vaccinated is not critical, although clearly one should wish to vaccinate against fish pathogenic bacteria as early one stage as possible, ie, before possible exposure to the pathogen.

[0063] Contudo, a vacinação de peixe muito menor é difícil e consume tempo. Falando-se em geral, o peixe de 5 gramas até pode, se necessário ou desejável, ser vacinado por meio de injeção.[0063] However, vaccination of much smaller fish is difficult and time consuming. Generally speaking, 5 gram fish can even, if necessary or desirable, be vaccinated by injection.

[0064] Para a administração oral a vacina é preferivelmente misturada com um carreador adequado pela aplicação oral isto é celulose, alimento ou uma substância metabolizável tal como alfa-celulose ou óleos diferentes de origem vegetal ou animal. Também um meio atrativo é a administração da vacina em concentrações altas dos organismos de alimentação viva, seguido pela alimentação de organismos de alimentação viva ao animal alvo, por exemplo, o peixe. Os carreadores alimentares particularmente preferidos para a liberação oral da vacina de acordo com a invenção são organismos de alimentação viva que são capazes de encapsular a vacina. Os organismos de alimentação viva adequados incluem alimentadores de filtro seletivo semelhantes a plâncton preferivelmente membros de Rotifera, Artemia e outros. Altamente preferido é o camarão de água salgada Artemia sp.[0064] For oral administration the vaccine is preferably mixed with a suitable carrier for oral application i.e. cellulose, food or a metabolizable substance such as alpha-cellulose or different oils of vegetable or animal origin. Also an attractive means is administering the vaccine in high concentrations of live feed organisms, followed by feeding live feed organisms to the target animal, eg fish. Particularly preferred food carriers for the oral delivery of the vaccine according to the invention are live feed organisms which are capable of encapsulating the vaccine. Suitable live feed organisms include plankton-like selective filter feeders preferably members of Rotifera, Artemia and others. Highly preferred is the saltwater shrimp Artemia sp.

[0065] Como seguem a partir dos Exemplos, o nível de proteção cruzada entre o biotipo 1 de S. agalactiae e o biotipo 2 de S. agalactiae é baixo, ou não existente.[0065] As follows from the Examples, the level of cross-protection between S. agalactiae biotype 1 and S. agalactiae biotype 2 is low, or non-existent.

[0066] Portanto, outra forma preferida da vacina combinada de acordo com a invenção compreende adicionalmente uma quantidade imunogênica de células de biotipo 2 de Streptococcus agalactiae, uma quantidade imunogênica de um antígeno de células de biotipo 2 de Streptococcus agalactiae ou material genético que codifica um tal antígeno.[0066] Therefore, another preferred form of the combined vaccine according to the invention further comprises an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 2 cells, an immunogenic amount of a Streptococcus agalactiae biotype 2 cell antigen or genetic material encoding a such an antigen.

[0067] Também, uma vacina de acordo com a invenção deve beneficiar-se da presença adicional de uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus iniae, uma quantidade imunogênica de um antígeno de Streptococcus iniae ou material genético que codifica um tal antígeno.[0067] Also, a vaccine according to the invention should benefit from the additional presence of an immunogenic amount of Streptococcus iniae cells, an immunogenic amount of a Streptococcus iniae antigen or genetic material encoding such an antigen.

[0068] Portanto, novamente, uma outra forma preferida da vacina combinada de acordo com a invenção compreende adicionalmente uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus iniae, uma quantidade imunogênica de um antígeno de Streptococcus iniae ou material genético que codifica um tal antígeno.[0068] Therefore, again, another preferred form of the combined vaccine according to the invention further comprises an immunogenic amount of Streptococcus iniae cells, an immunogenic amount of a Streptococcus iniae antigen or genetic material encoding such an antigen.

[0069] Claramente, uma vacina de acordo com a invenção também deve beneficiar-se da presença de uma outra quantidade imunogênica de um outro microrganismo patogênico de peixe ou um vírus patogênico de peixe, um antígeno de tal microrganismo ou vírus ou material genético que codifica um tal antígeno, para a fabricação da vacina.[0069] Clearly, a vaccine according to the invention should also benefit from the presence of another immunogenic amount of another fish pathogenic microorganism or a fish pathogenic virus, an antigen of such microorganism or virus or genetic material that encodes such an antigen, for the manufacture of the vaccine.

[0070] Desta maneira, uma outra forma preferida da primeira forma de realização diz respeito a uma vacina combinada de acordo com a invenção em que a vacina compreende adicionalmente uma quantidade imunogênica de um outro microrganismo patogênico de peixe ou um vírus patogênico de peixe, um antígeno de tal microrganismo ou vírus ou material genético que codifica um tal antígeno.[0070] In this way, another preferred form of the first embodiment concerns a combined vaccine according to the invention in which the vaccine additionally comprises an immunogenic amount of another fish pathogenic microorganism or a fish pathogenic virus, a antigen from such a microorganism or virus or genetic material encoding such an antigen.

[0071] Preferivelmente, o dito outro microrganismo ou vírus é selecionado do seguinte grupo de patogênios de peixe: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subespécies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Streptococcus dysgalactiae, Vírus da Septicemia Hemorrágica Viral, vírus da Necrose Viral, iridovírus, viremia Spring de Carpa e Herpesvírus de KoiPreferably, said other microorganism or virus is selected from the following group of fish pathogens: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subspecies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Streptococcus dysgalactiae, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, Viral Necrosis virus, iridovirus, Spring Carp viremia and Koi Herpesvirus

[0072] Desta maneira, em uma forma mais preferida, o outro microrganismo ou vírus é selecionado do seguinte grupo de patogênios de peixe: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subespécies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Streptococcus dysgalactiae, Vírus da Septicemia Hemorrágica Viral, vírus da Necrose Viral, iridovírus, viremia Spring de Carpa e Herpesvírus de Koi.[0072] Thus, in a more preferred form, the other microorganism or virus is selected from the following group of fish pathogens: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subspecies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Streptococcus dysgalactiae, Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, Viral Necrosis virus, iridovirus, Spring Carp viremia, and Herpes Koi virus.

[0073] Uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito ao uso de uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo Ia e uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo III para a fabricação de uma vacina para a proteção de peixe contra infecção estreptocócica.[0073] Another embodiment of the present invention concerns the use of an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype Ia cells and an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype III cells for the manufacture of a vaccine for protection of fish against streptococcal infection.

[0074] Ainda, uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um método para a preparação de uma vacina combinada de acordo com a invenção, em que aquele método compreende a etapa de misturar uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo Ia e uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo III e um carreador farmaceuticamente aceitável.[0074] Yet another embodiment of the present invention relates to a method for the preparation of a combined vaccine according to the invention, wherein that method comprises the step of mixing an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 cells serotype Ia and an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 cells serotype III and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0075] Novamente, uma outra forma de realização da presente invenção diz respeito a um kit de partes, que tem uma característica que compreende pelo menos dois frascos, em que estes frascos juntos compreendem uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo Ia e uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo III e um carreador farmaceuticamente aceitável. Um tal kit de partes, por exemplo, também inclui um kit de partes que compreende pelo menos dois frascos, em que um frasco compreende uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo Ia e uma quantidade imunogênica de células de Streptococcus agalactiae biotipo 1 sorotipo III e um outro frasco compreende células do Biotipo 2 e um carreador farmaceuticamente aceitável.[0075] Again, another embodiment of the present invention concerns a kit of parts, which has a feature that comprises at least two vials, these vials together comprising an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype Ia cells and an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype III cells and a pharmaceutically acceptable carrier. Such a kit of parts, for example, also includes a kit of parts comprising at least two vials, wherein one vial comprises an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype Ia cells and an immunogenic amount of Streptococcus agalactiae biotype 1 cells serotype III and another vial comprises Biotype 2 cells and a pharmaceutically acceptable carrier.

Examples: Example 1 Vaccination

[0076] Vacinas: Vacina-1: TI1428 S. agalactiae Biotipo 1, sorotipo III, também referido como Sa1 (X) Forma farmacêutica:Água em óleo: fase aquosa a 30 % e óleo Montanide ISA 762 a 70 % Concentração de antígeno:S. agalactiae 1 (X) em 1,36E+8 células/ml Vacina-2: TI1422 S. agalactiae Biotipo 1, sorotipo Ia, também referido como Sa1 (Y) Forma farmacêutica:Água em óleo: fase aquosa a 30 % e óleo Montanide ISA 762 a 70 % Concentração de antígeno:S. agalactiae 1 (Y) em 1,36E+8 células/ml[0076] Vaccines: Vaccine-1: TI1428 S. agalactiae Biotype 1, serotype III, also referred to as Sa1 (X) Pharmaceutical form: Water in oil: 30% aqueous phase and 70% Montanide ISA 762 oil Antigen concentration: S. agalactiae 1 (X) at 1.36E+8 cells/ml Vaccine-2: TI1422 S. agalactiae Biotype 1, serotype Ia, also referred to as Sa1 (Y) Pharmaceutical form: Water in oil: 30% aqueous phase and Montanide oil ISA 762 at 70% Antigen:S concentration. agalactiae 1 (Y) in 1.36E+8 cells/ml

Standard Vaccine Diluent Buffer (SVDB)

[0077] A Tabela 1 dá uma descrição das cepas de desafio usadas. Tabela 1: Cepas de desafio usadas para o desafio

*aglutinação de lâmina padronizada, o TI1425 é elevado contra o Biotipo 1 sorotipo III, o TI513 é elevado contra o Biotipo 2. Animais Espécies: Tilapia (Oreochromis sp) Peso médio na chegada: < 0,5 g Peso médio no início do Exp. 23 g Criação Água

[0077] Table 1 gives a description of the challenge strains used. Table 1: Challenge strains used for the challenge

*standardized slide agglutination, TI1425 is elevated against Biotype 1 serotype III, TI513 is elevated against Biotype 2. Animals Species: Tilapia (Oreochromis sp) Average weight at arrival: < 0.5 g Average weight at beginning of Exp 23 g Water Creation

food

[0078] Após a vacinação, o peixe foi alimentado em 2 a 4 % de peso corporal por dia. A taxa de alimentação de cada grupo de tratamento foi ajustado semanalmente. Após o desafio, os peixes foram alimentados de 1 % a 3 % de seu peso corporal por dia após o desafio se a alimentação for aceita.[0078] After vaccination, the fish were fed 2 to 4% of body weight per day. The feeding rate of each treatment group was adjusted weekly. After the challenge, the fish were fed 1% to 3% of their body weight per day after the challenge if the feed was accepted.

[0079] O peixe foi submetido a jejum por pelo menos 12 horas antes de qualquer manipulação, tal como transferência aos tanques, pesagem e 48 horas antes da injeção.[0079] The fish was fasted for at least 12 hours before any manipulation, such as transfer to tanks, weighing and 48 hours before injection.

tanks

[0080] Todos os tanques das instalações de laboratório úmidas têm um único código de numeração e este código foi usado por todos os experimentos e em todos as formas de registro usadas. Após a vacinação, o peixe foi colocado em um tanque de 500 litros. O tanque foi dividido em 2 metades por meio de uma rede colocada verticalmente no meio do tanque. As metades dos tanques foram identificados pelo número do tanque e uma letra (A e B). Esta numeração foi fixada ao tanque. O peixe desafiado foi alojado em tanques de 250 litros separados por duas redes colocadas verticalmente, dividindo-se os tanques em 3 compartimentos. Cada compartimento foi identificado pelo número do tanque e uma letra A, B ou C. Esta numeração foi fixada ao tanque.[0080] All wet laboratory facility tanks have a unique numbering code and this code was used for all experiments and in all recording forms used. After vaccination, the fish was placed in a 500 liter tank. The tank was divided into 2 halves by means of a net placed vertically in the middle of the tank. The tank halves were identified by the tank number and a letter (A and B). This numbering was fixed to the tank. The challenged fish were housed in 250 liter tanks separated by two vertically placed nets, dividing the tanks into 3 compartments. Each compartment was identified by the tank number and a letter A, B or C. This numbering was fixed to the tank.

Naming of animals to treatment groups

[0081] Um total de 285 peixes de um tamanho similar foi usado para este experimento. Os peixes foram agrupados em 3 grupos de 95 peixes, dois grupos vacinados e um grupo de controle.[0081] A total of 285 fish of a similar size were used for this experiment. The fish were grouped into 3 groups of 95 fish, two vaccinated groups and a control group.

Vaccination

[0082] A vacinação foi realizada por injeção de IP. Os peixes foram anestesiados com AQUI-S até sedado e IP injetado com 0,05 ml aproximadamente na extremidade e entre as pontas das barbatanas e peitorais. Imediatamente após a injeção, os peixes foram transferidos a seu tanque alocado e a recuperação seguida. O peixe de controle foi injetado com um volume similar de SVDB usando-se o mesmo procedimento. A Tabela 2 descreve os grupos usados bem como a alocação de tanque após a vacinação. Tabela 2: Lista de tratamento e alocação de tanques após a vacinação

[0082] Vaccination was performed by IP injection. The fish were anesthetized with AQUI-S until sedated and IP injected with 0.05 ml approximately at the extremity and between the tips of the fins and pectorals. Immediately after injection, the fish were transferred to their allocated tank and recovery followed. Control fish were injected with a similar volume of SVDB using the same procedure. Table 2 describes the groups used as well as tank allocation after vaccination. Table 2: List of treatment and allocation of tanks after vaccination

Challenge Inoculum Preparation

[0083] As cepas TI 1422 e TI 1428, foram recuperadas de estoque de glicerol congeladas a <-50° C em TSA e subsequentemente incubadas de 26 a 32° C por aproximadamente 24 horas.[0083] The TI 1422 and TI 1428 strains were recovered from glycerol stock frozen at <-50°C in TSA and subsequently incubated at 26 to 32°C for approximately 24 hours.

[0084] Para TI 1422, o desenvolvimento foi coletado em TSB até um OD660 de 0,134 a 0,147 ser atingido. As diluições de dez vezes foram realizadas até 10-6 usando-se NaCl estéril a 0,9 %. 0,4 % desta preparação foi inoculada em um volume maior de TSB. O broto foi incubado a 32° C por 16 a 17 horas. Quando o OD660 atingiu 0,879 a 0,904, a cultura foi usada para preparar a suspensão de desafio pela diluição da cultura de 200 vezes em NaCl estéril a 0,9 %. O CFU na suspensão usada resultante para o desafio foi determinado ser de 1,0E+7 CFU/ml e 1,3E+7 para os desafios da semana 3 e semana 6 respectivamente.[0084] For TI 1422, development was collected in TSB until an OD660 of 0.134 to 0.147 was reached. Ten-fold dilutions were made up to 10-6 using sterile 0.9% NaCl. 0.4% of this preparation was inoculated into a larger volume of TSB. The sprout was incubated at 32°C for 16 to 17 hours. When the OD660 reached 0.879 to 0.904, the culture was used to prepare the challenge suspension by diluting the culture 200-fold in sterile 0.9% NaCl. The CFU in the resulting suspension used for the challenge was determined to be 1.0E+7 CFU/ml and 1.3E+7 for the week 3 and week 6 challenges respectively.

[0085] Para o TI 1428, o desenvolvimento foi coletado em SGM até um OD660 nmde 0,162 a 0,170 ser atingido. A preparação foi inoculada em 100 ml de SGM em 1 % v/v e subsequentemente incubado a 32° C. Após aproximadamente 16 horas de incubação, o OD660nm de culturas foi de 1,339 a 1,362. Esta cultura foi usada para a preparação da suspensão de desafio pela diluição de 100 vezes em NaCl estéril a 0,9 %. O CFU na suspensão resultante usada para o desafio foi determinado ser de 9,0E+7 CFU/ml e 7,4E+7 para os desafios da semana 3 e semana 6 respectivamente.[0085] For the TI 1428, development was collected in SGM until an OD660 nm of 0.162 to 0.170 was reached. The preparation was inoculated into 100 ml of SGM at 1% v/v and subsequently incubated at 32°C. After approximately 16 hours of incubation, the OD660nm of cultures was from 1.339 to 1.362. This culture was used for the preparation of the challenge suspension by 100-fold dilution in sterile 0.9% NaCl. The CFU in the resulting suspension used for the challenge was determined to be 9.0E+7 CFU/ml and 7.4E+7 for the week 3 and week 6 challenges respectively.

[0086] Para TI016 (S. agalactiae Biotipo 2 (também referido como Sa2)), um frasco de 1 ml de semente de desafio foi tirado de < -50° C do congelador, descongelado e seu conteúdo inoculado em 100 ml de SGM. A cultura foi colocada no agitador orbital com uma série de velocidade de agitação a 150 RPM a 32° C. Após 21 h a 22 h, a cultura teve um OD660 de 0,181 - 0,177. Esta cultura foi usada para preparar a suspensão de desafio pela dissolução deste 1000 vezes em 0,9 % de NaCl estéril. O CFU na suspensão resultante usada para o desafio foi determinado ser 9,9E+5 CFU/ml e 4,2E+5 para os desafios na semana 3 e semana 6 respectivamente.[0086] For TI016 (S. agalactiae Biotype 2 (also referred to as Sa2)), a 1 ml vial of challenge seed was taken from < -50°C from the freezer, thawed and its contents inoculated into 100 ml of SGM. The culture was placed on the orbital shaker with a series of shaking speed at 150 RPM at 32°C. After 21 h to 22 h, the culture had an OD660 of 0.181 - 0.177. This culture was used to prepare the challenge suspension by dissolving it 1000 times in 0.9% sterile NaCl. The CFU in the resulting suspension used for the challenge was determined to be 9.9E+5 CFU/ml and 4.2E+5 for the week 3 and week 6 challenges respectively.

[0087] Diversas unidades que formam colônias em todas as culturas de desafio foram determinadas pela colocação disseminada padrão de alíquotas de 100 μl de suspensão bacterianas diluídas 10 vezes em TSA e incubação subsequente a 32° C por 24-48 horas.Several colony forming units in all challenge cultures were determined by standard spread placement of 100 μl aliquots of bacterial suspension diluted 10-fold in TSA and subsequent incubation at 32°C for 24-48 hours.

Challenge

[0088] Na semana 3 e semana 6, os peixes foram enfraquecidos por pelo menos 48 horas antes do desafio para garantir esvaziar-se por completo o trato gastro-intestinal e portanto evitar o dano no órgão interno como um resultado da injeção. Estes foram anestesiados usando AQUI-S e o desafio foi realizado através da injeção IP. Para cada ponto de tempo do desafio 15 peixes foram injetados por IP com 0,1 ml das suspensões de desafio descritas acima. Imediatamente após a injeção, os peixes foram transferidos novamente a seu tanque distribuído (metade) e a recuperação foi seguida (ver tabela 3 para a distribuição).Tabela 3: Grupos experimentais, número de peixes por grupo e tanques distribuídos após o desafio para os desafios na semana 3 e semana 6.

X: apenas aglutinação com anti-soro de Sa1, Y: apenas aglutinação com anti- soro de Sa2At week 3 and week 6, the fish were weakened for at least 48 hours prior to challenge to ensure complete emptying of the gastrointestinal tract and therefore avoid internal organ damage as a result of the injection. These were anesthetized using AQUI-S and challenged via IP injection. For each challenge time point 15 fish were injected by IP with 0.1 ml of the challenge suspensions described above. Immediately after injection, fish were transferred back to their allotted tank (half) and recovery was followed (see table 3 for distribution). Table 3: Experimental groups, number of fish per group and tanks allotted after challenge to challenges in week 3 and week 6.

X: only agglutination with Sa1 antiserum, Y: only agglutination with Sa2 antiserum

evaluation of results

[0089] A capacidade da vacina proteger o peixe contra as várias cepas de desafio foi avaliada pelo cálculo dos valores de proteção de porcentagem relativa (RPP). O valor RPP foi calculado de acordo com a seguinte fórmula:

* O peixe infectado inclui o peixe coletado morto durante a forma do período de observação que o organismo de desafio deve ser também o peixe coletado no final do estudo o qual o organismo de desafio deve ser isolado.[0089] The ability of the vaccine to protect the fish against the various challenge strains was evaluated by calculating relative percent protection values (RPP). The RPP value was calculated according to the following formula:

* Infected fish includes fish collected dead during the observation period form that the challenge organism should also be the fish collected at the end of the study from which the challenge organism should be isolated.

Water parameters and mortality after vaccination

[0090] Um peixe foi observado morto o grupo de Sa1 vacinado (Y), (TI 1422) no dia 8 pós-vacina. O peixe foi canibalizado. Nenhum desenvolvimento foi observado a partir dos órgãos internos colocados em placas. A causa da morte não deve ser confirmada. Nenhum comportamento anormal foi observado durante a pós-vacinação do período experimental.[0090] One dead fish was observed in the Sa1 vaccinated group (Y), (TI 1422) on day 8 post-vaccine. The fish has been cannibalized. No development was observed from the internal organs placed in plates. Cause of death must not be confirmed. No abnormal behavior was observed during the post-vaccination experimental period.

Post-development vaccination

[0091] O desenvolvimento dos grupos de controle e vacinados na observação de 6 semanas é dado na figura 1.[0091] The development of the control and vaccinated groups at the 6-week observation is given in figure 1.

[0092] A mortalidade foi similar nos grupos de controle e nos vacinados.[0092] Mortality was similar in the control and vaccinated groups.

Efficiency Mortality after the challenge

[0093] A mortalidade obtida após os desafios da semana 3 com as várias cepas de desafio são ilustradas nas figuras 2, 3, e 4 pelos desafios Sal - X, Sal -Y e Sa2 respectivamente. Após os desafios na semana 3, a mortalidade nos grupos de controle foi como esperado (% de mortalidade acumulativa de 87 %, 93 % e 80 % após os desafios Sa1-X, Sa1-Y e Sa2 respectivamente). Após o desafio com a mortabilidade da cepas Sa2 foi maior em ambos grupos de vacina (67 % e 87 %). Após o desafio com Sa1-X, os níveis de mortalidade foram inferiores no grupo vacinado Sa1-X sorologicamente homólogo (27 %) quando comparado ao grupo vacinado Sal -Y sorologicamente heterólogo (60 % de mortalidade).[0093] Mortality obtained after the week 3 challenges with the various challenge strains are illustrated in figures 2, 3, and 4 by the Sal - X, Sal -Y and Sa2 challenges respectively. After the challenges at week 3, mortality in the control groups was as expected (accumulative % mortality of 87%, 93% and 80% after Sa1-X, Sa1-Y and Sa2 challenges respectively). After challenge with Sa2 strain mortality was higher in both vaccine groups (67% and 87%). After challenge with Sa1-X, mortality levels were lower in the serologically homologous Sa1-X vaccinated group (27%) when compared to the serologically heterologous Sal -Y vaccinated group (60% mortality).

[0094] Após o desafio com Sa1-Y a mesma observação foi feita: os níveis de mortalidade foram inferiores no grupo vacinado Sa1-Y sorologicamente homólogo (6,7 %) quando comparado ao grupo vacinado Sa1-X sorologicamente heterólogo (40 % de mortalidade). Ver tabela 4 para um resumo da % da mortalidade confirmada acumulativa.Tabela 4: Resumo de % de mortalidade confirmada acumulativa, após o desafio da semana 3 (n = 15). Similarmente entre a vacina e a cepa de desafio

NA: Não aplicável[0094] After the challenge with Sa1-Y the same observation was made: the mortality levels were lower in the vaccinated group Sa1-Y serologically homologous (6.7%) when compared to the vaccinated group Sa1-X serologically heterologous (40% of mortality). See Table 4 for a summary of the % cumulative confirmed mortality. Table 4: Summary of the % cumulative confirmed mortality after the week 3 challenge (n = 15). Similarly between the vaccine and the challenge strain

NA: Not applicable

[0095] A mortalidade obtida após os desafios da semana 6 com as várias cepas de desafio são ilustradas nas figuras 5, 6, e 7 pelos desafios Sa1- X, Sa1-Y e Sa2 respectivamente. Ver Tabela 4 para um resumo da % da mortalidade confirmada acumulativa.[0095] Mortality obtained after the 6 week challenges with the various challenge strains are illustrated in figures 5, 6, and 7 by the Sa1-X, Sa1-Y and Sa2 challenges respectively. See Table 4 for a summary of the % cumulative confirmed mortality.

[0096] Após o desafio de semana 6, a mortalidade nos grupos de controle foi como esperada (% de mortalidade acumulativa de 86,7 %, 60 % e 66,7 % após os desafios Sa1-X, Sa1-Y e Sa2 respectivamente).[0096] After the 6 week challenge, mortality in the control groups was as expected (% cumulative mortality of 86.7%, 60% and 66.7% after Sa1-X, Sa1-Y and Sa2 challenges respectively ).

[0097] As observações feitas na semana 3 foram confirmadas após o desafio de semana 6: após o desafio com a mortalidade das cepas Sa2 foi maior em ambos grupos de vacina (66,7 % e 73,3 %). Após o desafio com Sa1-X, os níveis de mortalidade foram inferiores no grupo vacinado Sa1 -X sorologicamente homólogo (6,7 %) quando comparado ao grupo vacinado Sa1 -Y sorologicamente heterólogo (26,7 % de mortalidade).The observations made at week 3 were confirmed after the challenge at week 6: after the challenge with Sa2 strain mortality was higher in both vaccine groups (66.7 % and 73.3%). After the challenge with Sa1-X, mortality levels were lower in the vaccinated Sa1 -X serologically homologous group (6.7%) when compared to the vaccinated Sa1 -Y serologically heterologous group (26.7% mortality).

[0098] Após o desafio com Sa1-Y a mesma observação foi feita: os níveis de mortalidade foram inferiores no grupo vacinado Sa1-Y sorologicamente homólogo (6,7 %) quando comparado ao grupo vacinado Sa1-X sorologicamente heterólogo (53,3 % de mortalidade). Ver Tabela 5 por uma revisão da % da mortalidade acumulativa confirmada.[0098] After the challenge with Sa1-Y the same observation was made: the mortality levels were lower in the vaccinated group Sa1-Y serologically homologous (6.7%) when compared to the vaccinated group Sa1-X serologically heterologous (53.3 % mortality). See Table 5 for a review of the % confirmed cumulative mortality.

[0099] Os detalhes na mortalidade diária e re-isolamentos são dados no Anexo 3. Tabela 5: Resumo da % da mortalidade confirmada acumulativa, após o desafio da semana 6 (n = 15)

NA: não aplicável[0099] Details on daily mortality and re-isolations are given in Annex 3. Table 5: Summary of % cumulative confirmed mortality after week 6 challenge (n = 15)

NA: not applicable

RPP values

[00100] Os valores RPP foram calculados e são representados na Tabela 6. Tabela 6: Os valores RPP após os desafios de S. agalactiae na semana 3 e 6 pós-vacinação.

*inclui re-isolamento positivo no final do período de observação.The RPP values were calculated and are represented in Table 6. Table 6: The RPP values after S. agalactiae challenges at

week

3 and 6 post-vaccination.

*includes positive re-isolation at the end of the observation period.

[00101] Quando o desafio foi realizado com a cepa de desafio Sa2 na semana 3, a proteção foi fraca a não existente sem consideração com as vacinas (RPP de 16,7 % com vacina Sa1 (X), RPP de -8,3 % com vacina Sa1 (Y)). Esta observação foi confirmada após o desafio na semana 6 onde nenhuma proteção foi vista com a vacina (RPP de 0 % (vacina Sa1-X) e 10 % de vacina Sa1(Y)).[00101] When the challenge was performed with the Sa2 challenge strain at week 3, protection was weak to non-existent regardless of vaccines (RPP of 16.7% with Sa1(X) vaccine, RPP of -8.3 % with Sa1 (Y) vaccine). This observation was confirmed after the challenge at week 6 where no protection was seen with the vaccine (0% RPP (Vaccine Sa1-X) and 10% vaccine Sa1(Y)).

[00102] Quando a vacinação Sa1-X homólogo aos desafios Sa-l X foram realizados, a boa proteção foi obtida (RPP 69,2 % e 92,3 % na semana 3 e 6 respectivamente). Entretanto, quando vacinação dos desafios Sa1-X/Sal- Y heterólogos foram realizados pela proteção ser inferior (RPP de 57,1 % e 11,1 % na semana 3 e semana 6 respectivamente).[00102] When the Sa1-X vaccination homologous to the Sa-1 X challenges were performed, good protection was obtained (RPP 69.2% and 92.3% at week 3 and 6 respectively). However, when vaccination of heterologous Sa1-X/Sal-Y challenges were performed because protection was inferior (RPP of 57.1% and 11.1% at week 3 and week 6 respectively).

[00103] A mesma observação foi feita quando o desafio de vacinação Sa1-Y/Sa1-Y homóloga foi realizada. Quando o peixe Sa1-Y vacinado foram desafiados com uma cepa de desafio Sa1-Y, a boa proteção foi observada (RPP 92,9 % e 88,9 % na semana 3 e 6 respectivamente). Entretanto, quando o peixe Sa1-Y vacinado foi desafiado com as cepas de proteção Sa1-X foi inferior comparado aos desafios homólogos (RPP de 30,8 % e 69,2 % na semana 3 e semana 6 respectivamente).[00103] The same observation was made when the Sa1-Y/Sa1-Y homologous vaccination challenge was performed. When Sa1-Y vaccinated fish were challenged with a Sa1-Y challenge strain, good protection was observed (RPP 92.9% and 88.9% at week 3 and 6 respectively). However, when the vaccinated fish Sa1-Y was challenged with the protective strains Sa1-X it was inferior compared to homologous challenges (RPP of 30.8% and 69.2% at week 3 and week 6 respectively).

CONCLUSIONS

[00104] Na conclusão pode ser que a dita proteção seja obtida entre as cepas S. agalactiae bioquimicamente distintas: vacinas de biotina 1 de S. agalactiae não protegem contra infecções com Biotipo 2 de S. agalactiae. Entretanto, as vacinas de biotipo 1 de S. agalactiae fornecem a proteção contra as mudanças de biotipo 1 de S. agalactiae. Entretanto, uma redução na proteção foi vista quando as vacinas de biotipo 1 de S. galactiae foram desafiadas com cepas de desafio sorologicamente heterólogos (X-Y e Y-X). A excelente proteção deve ser fornecida com mudanças sorologicamente homólogas (X-X e Y-Y). Portanto, a vacina combinada que compreende as células de sorotipo Ia de biotipo 1 de Streptococcus agalactiae e células de sorotipo III de biotipo 1 de Streptococcus agalactiae fornece a excelente proteção contra ambos sorotipos de biotipo 1 de Streptococcus agalactiae. Abreviações usadas IP Intra peritoneal Pp tPartes por milhão RPP Sobrevivência de porcentagem relativa TSA Ágar de soja de triptona TSB Caldo de soja de triptona SGM Meio de desenvolvimento de Streptococcus[00104] In conclusion it may be that said protection is obtained between biochemically distinct S. agalactiae strains: S. agalactiae biotin 1 vaccines do not protect against infections with S. agalactiae Biotype 2. However, S. agalactiae biotype 1 vaccines provide protection against S. agalactiae biotype 1 changes. However, a reduction in protection was seen when S. galactiae biotype 1 vaccines were challenged with serologically heterologous challenge strains (X-Y and Y-X). Excellent protection must be provided with serologically homologous changes (X-X and Y-Y). Therefore, the combined vaccine comprising Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype Ia cells and Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype III cells provides excellent protection against both Streptococcus agalactiae biotype 1 serotypes. Abbreviations used IP Intra peritoneal Pp tParts per million RPP Relative Percent Survival TSA Tryptone Soy Agar TSB Tryptone Soy Broth SGM Streptococcus Development Medium

Legend of the figures:

[00105] Figura 1: A pós-vacinação de desenvolvimento no pós-desafio do período de observação de 6 semanas (n = 15 esperado na semana 3: n = 45 e semana 6: n = 50).[00105] Figure 1: Post-challenge developmental post-challenge 6-week observation period (n = 15 expected at week 3: n = 45 and week 6: n = 50).

[00106] Figura 2: Porcentagem (%) da mortalidade confirmada acumulativa confirma a mortalidade em vacinados (Vacc Sa1 (X), Vacc Sa1 (Y)) e grupos de controle (Ctr) após o desafio com Sa1-X (TI1428) realizado na semana 3 pós-vacinação (n = 15) inclusivo o peixe de re-isolamento positivo no final do pós-desafio do período de observação (pós).[00106] Figure 2: Percentage (%) of cumulative confirmed mortality confirms mortality in vaccinates (Vacc Sa1 (X), Vacc Sa1 (Y)) and control groups (Ctr) after challenge with Sa1-X (TI1428) performed at week 3 post-vaccination (n = 15) inclusive of the positive re-isolation fish at the end of the post-challenge observation period (post).

[00107] Figura 3: Porcentagem (%) da mortalidade confirmada acumulativa nos vacinados (Vacc Sa1 (X), Vacc Sa1 (Y)) e controle (Ctr) após o desafio com Sal -Y (TI1422) realizado na semana 3 pós-vacinação (n = 15) inclusivo o peixe de re-isolamento positivo no final do pós-desafio do período de observação (pós).[00107] Figure 3: Percentage (%) of cumulative confirmed mortality in vaccinates (Vacc Sa1 (X), Vacc Sa1 (Y)) and control (Ctr) after the challenge with Sal -Y (TI1422) performed at week 3 post- vaccination (n = 15) inclusive of the positive re-isolation fish at the end of the post-challenge observation period (post).

[00108] Figura 4: Porcentagem (%) da mortalidade confirmada acumulativa nos vacinados (Vacc) e os grupos de controle (Ctr) após o desafio com Sa2 (Y) (TI 016) realizado na semana 3 pós-vacinação (n = 15) inclusivo o peixe de re-isolamento positivo no final do pós-desafio do período de observação (pós).[00108] Figure 4: Percentage (%) of cumulative confirmed mortality in vaccinates (Vacc) and control groups (Ctr) after challenge with Sa2 (Y) (TI 016) performed at week 3 post-vaccination (n = 15 ) including the positive re-isolation fish at the end of the post-challenge of the observation period (post).

[00109] Figura 5: Porcentagem (%) da mortalidade confirmada acumulativa nos vacinados (Vacc) e grupos de controle (Ctr) após o desafio com Sa1-X (TI1428) realizado na semana 6 pós-vacinação (n = 15) inclusivo o peixe de re-isolamento positivo no final do pós-desafio do período de observação (pós).[00109] Figure 5: Percentage (%) of cumulative confirmed mortality in vaccinates (Vacc) and control groups (Ctr) after challenge with Sa1-X (TI1428) performed at week 6 post-vaccination (n = 15) inclusive o positive re-isolation fish at the end of the post-challenge observation period (post).

[00110] Figura 6: Porcentagem (%) da mortalidade confirmada acumulativa nos vacinados (Vacc) e grupos de controle (Ctr) após o desafio com Sa1-Y (TI1422) realizado na semana 6 pós-vacinação (n = 15) inclusivo o peixe de re-isolamento positivo no final do pós-desafio do período de observação (pós).[00110] Figure 6: Percentage (%) of cumulative confirmed mortality in vaccinates (Vacc) and control groups (Ctr) after challenge with Sa1-Y (TI1422) performed at week 6 post-vaccination (n = 15) inclusive o positive re-isolation fish at the end of the post-challenge observation period (post).

[00111] Figura 7: Porcentagem (%) da mortalidade confirmada acumulativa nos grupos vacinados (Vacc) e controle (Ctr) após o desafio com Sa2 (Y) (TI 016) na semana 6 pós-vacinação (n = 15) inclusivo o peixe re- isolamento positivo (pós).

[00111] Figure 7: Percentage (%) of cumulative confirmed mortality in the vaccinated (Vacc) and control (Ctr) groups after challenge with Sa2 (Y) (TI 016) at week 6 post-vaccination (n = 15) inclusive o fish re- isolation positive (post).

Claims

1. Combined vaccine for the protection of fish against streptococcal infection, characterized in that said vaccine comprises 103 to 1010 cells of Streptococcus agalactiae Biotype 1 serotype Ia and 103 to 1010 cells of Streptococcus agalactiae Biotype 1 serotype III and a pharmaceutically acceptable carrier .

2. Combined vaccine according to claim 1, characterized in that the Streptococcus agalactiae cells are inactivated.

3. Combined vaccine according to claim 1 or 2, characterized in that the vaccine is a water-in-oil emulsion.

4. Combined vaccine according to claim 3, characterized in that the oil is a non-mineral oil.

5. Combined vaccine according to claim 4, characterized in that the non-mineral oil is Montanide ISA 763.

6. Use of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype Ia cells and Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype III cells characterized by the fact that it is for the manufacture of a vaccine to protect fish against streptococcal infection as defined in any one of claims 1 to 5.

7. Method for the preparation of a combined vaccine as defined in any one of claims 1 to 5, characterized in that said method comprises the steps of mixing 103 to 1010 cells of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype Ia and 103 to 1010 Streptococcus dicile Biotype 1 cells serotype III cells and a pharmaceutically acceptable carrier.

8. Kit of parts, characterized in that it comprises at least two vials, said vials together comprising from 103 to 1010 cells of Streptococcus agalactiae Biotype 1 serotype Ia and from 103 to 1010 cells of Streptococcus agalactiae biotype 1 serotype III and a carrier pharmaceutically acceptable.