BR102022013277A2 - CHIMERIC PROTEINS, PROCESS FOR OBTAINING, METHOD AND KIT FOR DIAGNOSING DELTA HEPATITIS, AND USES - Google Patents
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Abstract
proteínas quiméricas, processo de obtenção, método e kit para diagnóstico da hepatite delta, e usos. a presente tecnologia refere-se à área de biotecnologia. trata-se da construção de proteínas quiméricas, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas ao vírus da hepatite delta, além de um método e kit para diagnóstico in vitro de hepatite delta, que utiliza como antígeno uma proteína quimérica. as proteínas quiméricas foram construídas a partir de epítopos antigênicos triados por bioinformática e podem ser empregadas como antígenos para diagnóstico da infecção por hdv. além disso, as quimeras possuem potencial para uso na produção de anticorpos e vacinas.chimeric proteins, process of obtaining, method and kit for diagnosing hepatitis delta, and uses. The present technology refers to the area of biotechnology. it concerns the construction of chimeric proteins, their process of obtaining and their applications related to the hepatitis delta virus, as well as a method and kit for in vitro diagnosis of hepatitis delta, which uses a chimeric protein as an antigen. The chimeric proteins were constructed from antigenic epitopes screened by bioinformatics and can be used as antigens for diagnosing HDV infection. Furthermore, chimeras have potential for use in the production of antibodies and vaccines.
Description
[01] A presente tecnologia refere-se à área de Biotecnologia. Trata-se da construção de proteínas quiméricas, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas ao vírus da Hepatite Delta, além de um método e kit para diagnóstico in vitro de Hepatite Delta, que utiliza como antígeno uma proteína quimérica. As proteínas quiméricas foram construídas a partir de epítopos antigênicos triados por bioinformática e podem ser empregadas como antígenos para diagnóstico da infecção por HDV. Além disso, as quimeras possuem potencial para uso na produção de anticorpos e vacinas.[01] This technology refers to the area of Biotechnology. It involves the construction of chimeric proteins, their obtaining process and their applications related to the Hepatitis Delta virus, as well as a method and kit for in vitro diagnosis of Hepatitis Delta, which uses a chimeric protein as an antigen. The chimeric proteins were constructed from antigenic epitopes screened by bioinformatics and can be used as antigens for diagnosing HDV infection. Furthermore, chimeras have potential for use in the production of antibodies and vaccines.
[02] A hepatite delta é uma doença inflamatória do fígado causada pela infecção por hepatite vírus do tipo D (HDV) que pertence ao gênero Deltavirus. Apesar de causar a forma mais grave de hepatite viral, o HDV ainda é um patógeno negligenciado que possui distribuição mundial. Contudo, sua prevalência varia nas diferentes regiões geográficas, sendo mais prevalente em países com populações de baixo nível socioeconômico. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO, 2018) estima-se que pelo menos 5% das pessoas com a infecção crônica por HBV estejam co-infectados com HDV, o que resulta em 15 a 20 milhões de pessoas infectadas em todo mundo.[02] Delta hepatitis is an inflammatory liver disease caused by infection with type D hepatitis virus (HDV) that belongs to the Deltavirus genus. Despite causing the most serious form of viral hepatitis, HDV is still a neglected pathogen that has a worldwide distribution. However, its prevalence varies in different geographic regions, being more prevalent in countries with populations of low socioeconomic status. According to the World Health Organization (WHO, 2018), it is estimated that at least 5% of people with chronic HBV infection are co-infected with HDV, resulting in 15 to 20 million infected people worldwide. .
[03] O HDV possui oito genótipos distintos (HDV-1 a HDV-8), sendo o HDV1 o sorotipo com distribuição mais ampla na Europa, Oriente Médio, Leste Asiático, América e África. Cepas isoladas de HDV-3 são encontradas exclusivamente na América do Sul (Bacia Amazônica do Brasil, Peru e Venezuela). No Brasil, 3.833 casos de HDV foram confirmados entre 1999-2017, dos quais 75% dos casos são oriundos da região norte do país (BRASIL, 2018), nos estados do Acre e Amazonas.[03] HDV has eight distinct genotypes (HDV-1 to HDV-8), with HDV1 being the serotype with the widest distribution in Europe, the Middle East, East Asia, America and Africa. Isolated strains of HDV-3 are found exclusively in South America (Amazon Basin of Brazil, Peru and Venezuela). In Brazil, 3,833 cases of HDV were confirmed between 1999-2017, of which 75% of cases come from the northern region of the country (BRASIL, 2018), in the states of Acre and Amazonas.
[04] O HDV é um patógeno de RNA circular de fita simples, senso negativo, com aproximadamente 1,7 pares de bases. A estrutura viral é formada, no exterior, por um envelope esférico de lipoproteína contendo HBsAg e em seu interior há uma ribonucleoproteína composta pelo genoma viral complexado com HDAg. O genoma do HDV codifica apenas uma única proteína estrutural, o antígeno da hepatite delta (HDAg), que é uma fosfoproteína que pode ser encontrada em duas formas, uma curta chamada de HDAg-S (25 kDa -195 aminoácios), e uma grande HDAg-L (27 kDa - 214 aminoácidos). HDAg-S tem sido associada a replicação do RNA enquanto HDAg-L suprime a replicação viral e é necessário para o empacotamento do vírus. A proteína S-HDAg, contém todos os epítopos do antígeno HDV e, portanto, é considerada um bom candidato para uso como marcador diagnóstico.[04] HDV is a single-stranded, negative-sense, circular RNA pathogen with approximately 1.7 base pairs. The viral structure is formed, on the outside, by a spherical lipoprotein envelope containing HBsAg and inside there is a ribonucleoprotein composed of the viral genome complexed with HDAg. The HDV genome encodes only a single structural protein, the hepatitis delta antigen (HDAg), which is a phosphoprotein that can be found in two forms, a short one called HDAg-S (25 kDa -195 amino acids), and a large HDAg-L (27 kDa - 214 amino acids). HDAg-S has been associated with RNA replication while HDAg-L suppresses viral replication and is required for virus packaging. The S-HDAg protein contains all the epitopes of the HDV antigen and is therefore considered a good candidate for use as a diagnostic marker.
[05] O HDV só é transmitido caso ocorra uma infecção concomitante com o vírus da hepatite B (HBV), exibindo dois padrões de infecção, que podem ser: a infecção simultânea (coinfecção com HBV / HDV) ou a infecção de indivíduo já infectado cronicamente pelo HBV por HDV (superinfecção). A coinfecção está associada a uma hepatite leve a grave ou fulminante, sendo considerada mais grave do que a monoinfecção aguda por HBV. Já a superinfecção, por HDV em um portador de HBV pode se manifestar como hepatite aguda e resultar em uma infecção crônica. Em pacientes portadores crônicos de HBV assintomáticos, a superinfecção pode se manifestar como exacerbação da doença. Além disso, a coinfecção crônica por HDV e HBV está associada a um elevado risco de desenvolvimento de cirrose e descompensação hepática, levando ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelular.[05] HDV is only transmitted if there is a concomitant infection with the hepatitis B virus (HBV), showing two patterns of infection, which can be: simultaneous infection (co-infection with HBV / HDV) or infection of an already infected individual chronically caused by HBV by HDV (superinfection). Coinfection is associated with mild to severe or fulminant hepatitis and is considered more serious than acute HBV monoinfection. HDV superinfection in an HBV carrier can manifest as acute hepatitis and result in chronic infection. In asymptomatic chronic HBV carriers, superinfection may manifest as an exacerbation of the disease. Furthermore, chronic co-infection with HDV and HBV is associated with a high risk of developing cirrhosis and liver decompensation, leading to the development of hepatocellular carcinoma.
[06] Uma vez que o HDV só causa infecção na presença do HBV, acreditava-se que a introdução da vacina contra o HVB poderia diminuir a prevalência do VHD, entretanto, estudos atuais demonstram que a prevalência ainda é alta em diferentes partes do mundo. Diante disso, deve-se considerar a necessidade de realização do rastreamento de HDV em pacientes crônicos de HBV por meio de exames laboratoriais, uma vez que constituem um grupo risco. Diante do exposto, fica evidenciado a necessidade de se investigar novos antígenos que possam permitir um diagnóstico com elevada sensibilidade e especificidade.[06] Since HDV only causes infection in the presence of HBV, it was believed that the introduction of the HVB vaccine could reduce the prevalence of HDV, however, current studies demonstrate that the prevalence is still high in different parts of the world . In view of this, the need to carry out HDV screening in chronic HBV patients through laboratory tests should be considered, as they constitute a risk group. In view of the above, the need to investigate new antigens that can allow a diagnosis with high sensitivity and specificity is evident.
[07] O diagnóstico da hepatite D pode ser feito pela detecção do antígeno HDV (HDVAg), pela presença de anticorpos específicos resultantes da resposta humoral e a presença da replicação de RNA viral. Na infecção simultânea, há o aparecimento de anticorpos IgM e posteriormente, de anticorpos IgG, e apresenta níveis elevados de RNA de HDV. Já na superinfecção, aparecem anticorpos IgM Anti-HDV que podem permanecer em baixos níveis em casos crônicos, seguido da soroconversão para IgG. A presença do HBV é baixa ou negativa na infecção crônica, uma vez que, o HDV suprime a replicação de HBV.[07] The diagnosis of hepatitis D can be made by detecting the HDV antigen (HDVAg), the presence of specific antibodies resulting from the humoral response and the presence of viral RNA replication. In simultaneous infection, there is the appearance of IgM antibodies and later IgG antibodies, and there are high levels of HDV RNA. In superinfection, IgM Anti-HDV antibodies appear, which may remain at low levels in chronic cases, followed by seroconversion to IgG. The presence of HBV is low or negative in chronic infection, since HDV suppresses HBV replication.
[08] O monitoramento do RNA quantitativo para HDV é útil para determinar a presença de RNA viral no soro de pacientes infectados e a resposta ao tratamento por meio de ensaios de PCR de transcrição reversa (RT-PCR), porém, este método é restrito a centros de estudos e ainda não foram totalmente padronizados, o que torna o resultado de diferentes laboratórios não comparável devido à diferentes sensibilidades do ensaio, variação dos primers e a região do RNA amplificada.[08] Monitoring quantitative RNA for HDV is useful for determining the presence of viral RNA in the serum of infected patients and the response to treatment through reverse transcription PCR (RT-PCR) assays, however, this method is restricted to study centers and have not yet been fully standardized, which makes the results from different laboratories not comparable due to different assay sensitivities, primer variation and the amplified RNA region.
[09] Uma alternativa ao uso de ensaios moleculares consiste no uso de ensaios sorológicos. O diagnóstico da hepatite D utilizando ensaios imunoenzimáticos (ELISA) é uma técnica simples e alguns testes estão disponíveis comercialmente, entretanto, a maior parte desses testes utilizam o antígeno HDV bruto derivado animais infectados ou soro de humanos infectados. A utilização de antígenos brutos além de apresentar risco aos manipuladores possui a desvantagem de ser um suprimento limitado, que pode variar de acordo com lote produzido e comprometer a qualidade do teste.[09] An alternative to the use of molecular assays is the use of serological assays. Diagnosis of hepatitis D using enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) is a simple technique and some tests are commercially available, however, most of these tests use crude HDV antigen derived from infected animals or serum from infected humans. The use of crude antigens, in addition to posing a risk to handlers, has the disadvantage of being a limited supply, which can vary according to the batch produced and compromise the quality of the test.
[010] Para contornar essas limitações, proteínas recombinantes têm sido desenvolvidas por meio da engenharia genética com auxílio da bioinformática. A utilização da imunobionformática vem ganhando destaque entre os pesquisadores, pois, permite a previsão de regiões de superfícies de proteínas, que podem ser reconhecidas por anticorpos (epítopos antigênicos), auxiliando no projeto/desenvolvimento de reagentes de imunodiagnóstico e componentes de vacinas que possuam estrutura/função similar de um epítopo genuíno.[010] To overcome these limitations, recombinant proteins have been developed through genetic engineering with the aid of bioinformatics. The use of immunobioinformatics has been gaining prominence among researchers, as it allows the prediction of protein surface regions, which can be recognized by antibodies (antigenic epitopes), assisting in the design/development of immunodiagnostic reagents and vaccine components that have a structure / similar function of a genuine epitope.
[011] Os programas de bioinformática conseguem prever epítopos de células B e T, baseando-se em propriedades já conhecida dos aminoácidos, como hidrofobicidade, carga, flexibilidade, área de superfície exposta e estrutura secundária. Estudos recentes têm utilizado esta ferramenta para o desenvolvimento de vacinas e no desenvolvimento de novos biomarcadores para o diagnóstico de doenças.[011] Bioinformatics programs can predict B and T cell epitopes, based on already known properties of amino acids, such as hydrophobicity, charge, flexibility, exposed surface area and secondary structure. Recent studies have used this tool for the development of vaccines and the development of new biomarkers for the diagnosis of diseases.
[012] O desenvolvimento de proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli (E. coli) é uma estratégia promissora para suprir o uso de antígenos brutos em kits de diagnóstico para HDV. A utilização da E. coli como sistema de expressão oferece diversas vantagens, uma vez que, é um sistema bem compreendido e caracterizado, de fácil manuseio, simples fermentação, rápido crescimento, com capacidade de produzir grandes quantidades de proteínas recombinantes com baixo custo e a rápida e fácil transformação da célula com o DNA exógeno.[012] The development of recombinant proteins expressed in Escherichia coli (E. coli) is a promising strategy to supply the use of crude antigens in diagnostic kits for HDV. The use of E. coli as an expression system offers several advantages, since it is a well-understood and characterized system, easy to handle, simple fermentation, fast growth, with the capacity to produce large quantities of recombinant proteins at low cost and the quick and easy transformation of the cell with exogenous DNA.
[013] Nesse sentido, a produção de proteínas recombinantes visando o diagnóstico de HDV em E. coli se torna-se uma alternativa atraente, pois, permite o escalonamento da produção, viabilizando o seu uso como insumo no desenvolvimento, padronização e comercialização de teste de diagnóstico utilizando ensaios de ELISA ou outros métodos imunológicos.[013] In this sense, the production of recombinant proteins aimed at diagnosing HDV in E. coli becomes an attractive alternative, as it allows production to be scaled, enabling its use as an input in the development, standardization and commercialization of tests. diagnostic using ELISA assays or other immunological methods.
[014] Com o avanço da tecnologia recombinante, novos antígenos foram desenvolvidos com o intuito de melhorar a sensibilidade e especificidade dos ensaios em relação aos antígenos brutos. Portanto, alvos antigênicos como quimeras recombinantes podem sanar os problemas de padronização de ensaios imunoenzimáticos, além de elevar a sensibilidade e especificidade por combinar diferentes epítopos em uma proteína.[014] With the advancement of recombinant technology, new antigens were developed with the aim of improving the sensitivity and specificity of assays in relation to crude antigens. Therefore, antigenic targets such as recombinant chimeras can solve the problems of standardizing immunoenzymatic assays, in addition to increasing sensitivity and specificity by combining different epitopes in a protein.
[015] A presente invenção fundamenta-se na produção de uma proteína quimérica, contendo epítopos antigênicos isolados ou combinados, capaz de reconhecer anticorpos de diferentes genótipos virais de HDV. A produção de um polipeptídio com esta estratégia permite elevar a sensibilidade especificidade dos ensaios. Além disso, a maioria dos kits de diagnóstico de HDV é importada e/ou não permitem a determinação subclasses de imunoglobulinas, tais como IgM e IgG. Nessa perspectiva, o objeto da presente invenção é de grande interesse para a saúde pública, bem como para indústrias de diagnóstico in vitro, farmacêuticas ou biotecnológicas, para o desenvolvimento de kits de diagnósticos de baixo custo e escalonamento industrial.[015] The present invention is based on the production of a chimeric protein, containing isolated or combined antigenic epitopes, capable of recognizing antibodies from different HDV viral genotypes. The production of a polypeptide with this strategy makes it possible to increase the sensitivity and specificity of the assays. Furthermore, most HDV diagnostic kits are imported and/or do not allow the determination of immunoglobulin subclasses, such as IgM and IgG. From this perspective, the object of the present invention is of great interest to public health, as well as to in vitro diagnostic, pharmaceutical or biotechnology industries, for the development of low-cost diagnostic kits and industrial scale-up.
[016] A presente tecnologia refere-se a uma proteína quimérica baseada na proteína S-HDV, reativa com soros de humanos infectados com Hepatite Delta vírus, além de um método e Kit para diagnóstico da Hepatite Delta, que emprega como antígeno uma quimera, sob forma sintética ou recombinante, contendo epítopos antigênicos combinados/associados.[016] The present technology refers to a chimeric protein based on the S-HDV protein, reactive with human sera infected with Hepatitis Delta virus, in addition to a method and kit for diagnosing Hepatitis Delta, which uses a chimera as an antigen, in synthetic or recombinant form, containing combined/associated antigenic epitopes.
[017] O documento de patente, BR1020130329606A2, intitulado “Método quantificador de HDV - vírus da hepatite delta”, depositado em 20 de dezembro de 2013, difere da presente invenção por ser um método de biologia molecular para quantificador HDV caracterizado por utilizar transcriptase reversa seguida de PCR e detecção por fluorescência.[017] The patent document, BR1020130329606A2, entitled “HDV quantifier method - hepatitis delta virus”, filed on December 20, 2013, differs from the present invention in that it is a molecular biology method for HDV quantifier characterized by using reverse transcriptase followed by PCR and fluorescence detection.
[018] A presente invenção também se difere do documento de patente, US20100143894A1, intitulado “Quantitative Detection of HDV by RealTime Rt-PCR, cuja data de prioridade é 06 de agosto de 2004, por consistir em um método quantitativo baseado em PCR em tempo real para detecção de HDV, e de forma mais específica acompanhar a carga viral de HDV em pacientes infectados de forma crônica.[018] The present invention also differs from the patent document, US20100143894A1, entitled “Quantitative Detection of HDV by RealTime Rt-PCR, whose priority date is August 6, 2004, as it consists of a quantitative method based on real-time PCR for detecting HDV, and more specifically monitoring the HDV viral load in chronically infected patients.
[019] O método de diagnóstico, descrito no documento US20200033343A1, intitulado “Exosome-mediated diagnosis of hepatitis virus infections and diseases”, com data de prioridade em 06 de outubro de 2008, se refere a um método de diagnóstico para vírus da hepatite, incluindo HDV, mediado por exossomos presente nas amostras de pacientes de indivíduos, diferindo da presente invenção que avalia a presença de anticorpos reativos à proteína quimérica desenvolvida.[019] The diagnostic method, described in document US20200033343A1, entitled “Exosome-mediated diagnosis of hepatitis virus infections and diseases”, with priority date of October 6, 2008, refers to a diagnostic method for hepatitis viruses, including HDV, mediated by exosomes present in patient samples from individuals, differing from the present invention which evaluates the presence of antibodies reactive to the developed chimeric protein.
[020] Já no documento de patente BR1120200233145A2, intitulado “Método e meios para a rápida detecção de infecções por HDV”, depositado em 16 de maio em 2019, descreve um polipeptídio, um método e kit de diagnóstico in vitro para HDV, de forma mais específica a um teste imunocromatográfico (POC). O polipeptídio descrito nesta invenção, BR1120200233145A2, é baseado na proteína L-HDV, que difere da tecnologia apresentada neste documento, que é baseada na proteína S-HDV, que possui uma quantidade menor de aminoácidos constituintes.[020] In patent document BR1120200233145A2, entitled “Method and means for the rapid detection of HDV infections”, filed on May 16, 2019, describes a polypeptide, a method and in vitro diagnostic kit for HDV, so more specific to an immunochromatographic test (POC). The polypeptide described in this invention, BR1120200233145A2, is based on the L-HDV protein, which differs from the technology presented in this document, which is based on the S-HDV protein, which has a smaller amount of constituent amino acids.
[021] Alguns epítopos da presente invenção estão presentes na sequência descrita no documento de patente BR1120200233145A2, contudo, a combinação dos epítopos que resultou na construção da quimera da presente invenção é inédita, e, portanto, as tecnologias se diferem entre si por utilizarem sequências de aminoácidos distintas.[021] Some epitopes of the present invention are present in the sequence described in patent document BR1120200233145A2, however, the combination of epitopes that resulted in the construction of the chimera of the present invention is unprecedented, and, therefore, the technologies differ from each other by using sequences of different amino acids.
[022] A presente invenção consiste em uma nova quimera recombinante, composta por epítopos selecionados de forma racional, por meio de ferramentas de bioinformática, que evidenciaram antigenicidade e não apresentarem similaridade com outros vírus de hepatite.[022] The present invention consists of a new recombinant chimera, composed of rationally selected epitopes, using bioinformatics tools, which demonstrated antigenicity and do not show similarity with other hepatitis viruses.
[023] A combinação destes epítopos em uma única cadeia polipeptídica, como proposta na tecnologia descrita neste documento, permite padronizar a quantidade de antígenos empregada nos ensaios e elevar a sensibilidade e especificidade dos ensaios em diagnóstico.[023] The combination of these epitopes in a single polypeptide chain, as proposed in the technology described in this document, allows standardizing the quantity of antigens used in the assays and increasing the sensitivity and specificity of diagnostic assays.
[024] Além disso, visando elevar a capacidade de reconhecimento dos epítopos presentes na quimera e impedimento estérico, alguns fragmentos foram repetidos e ligados entre si por conectores (linkers) compostos de aminoácidos de glicina. Esta estratégia permite que a quimera se torne flexível e aumenta a exposição dos epítopos, aumentando a probabilidade de a proteína quimérica ser reconhecida por anticorpos.[024] Furthermore, in order to increase the recognition capacity of the epitopes present in the chimera and steric hindrance, some fragments were repeated and linked together by connectors composed of glycine amino acids. This strategy allows the chimera to become flexible and increases epitope exposure, increasing the likelihood that the chimeric protein will be recognized by antibodies.
[025] Este desenho racional permitiu o desenvolvimento de uma proteína quimérica, denominada de rHDVM. Não foi encontrada nenhuma tecnologia para diagnóstico da Hepatite Delta que compreenda o uso desta quimera conforme é descrita na presente invenção. Por meio dos ensaios de ELISA verificou-se que a proteína recombinante é capaz de detectar anticorpos presentes no sangue de indivíduos infectados e discriminar entre amostras positivas e negativas. Sendo assim, esta tecnologia tem o potencial de ser empregada no diagnóstico de HDV.[025] This rational design allowed the development of a chimeric protein, called rHDVM. No technology for diagnosing Hepatitis Delta has been found that comprises the use of this chimera as described in the present invention. Through ELISA assays, it was found that the recombinant protein is capable of detecting antibodies present in the blood of infected individuals and discriminating between positive and negative samples. Therefore, this technology has the potential to be used in the diagnosis of HDV.
[026] Figura 1: A) Esquema ilustrativo da sequência de aminoácidos da quimérica recombinante (SEQ. ID No: 1), sendo: em azul o epítopo 1 (SEQ. ID No:5), em vermelho epítopo 2 (SEQ. ID No: 7), em verde epítopo 3(SEQ ID No: 9), os linkers (conectores flexíveis) estão em negrito e a cauda de histidina na porção C-terminal está sublinhada. B) Esquema ilustrativo da sequência de aminoácidos da quimérica recombinante (SEQ. ID No 3), sendo: em azul o epítopo 1 (SEQ. ID No:5), em vermelho epítopo 2 (SEQ. ID No: 7), em verde epítopo 3(SEQ ID No: 9) e os linkers (conectores flexíveis) estão em negrito.[026] Figure 1: A) Illustrative scheme of the amino acid sequence of the recombinant chimeric (SEQ. ID No: 1), with: in blue epitope 1 (SEQ. ID No: 5), in red epitope 2 (SEQ. ID No: 7), in green epitope 3 (SEQ ID No: 9), the linkers (flexible connectors) are in bold and the histidine tail in the C-terminal portion is underlined. B) Illustrative scheme of the amino acid sequence of the recombinant chimeric (SEQ. ID No. 3), with: in blue epitope 1 (SEQ. ID No.:5), in red epitope 2 (SEQ. ID No.: 7), in green epitope 3(SEQ ID No: 9) and linkers (flexible connectors) are in bold.
[027] Figura 2: Eletroforese da cinética de expressão da quimera recombinante (representada pela SEQ. ID No: 1) utilizando IPTG 1mM como indutor. Gel SDS-PAGE 12% corado com Comassie blue R-250. A banda de interesse pode ser observada em torno de 25 kDA. Legenda: M: Marcador de peso molecular (Thermo Scientific), 1: Tempo 0 hora de indução; 2: indução por 30 minutos; 3: indução por 1:30h e 4: indução por 2:30h.[027] Figure 2: Electrophoresis of the expression kinetics of the recombinant chimera (represented by SEQ. ID No: 1) using 1mM IPTG as an inducer. 12% SDS-PAGE gel stained with Comassie blue R-250. The band of interest can be observed around 25 kDA. Legend: M: Molecular weight marker (Thermo Scientific), 1: Induction time 0 hours; 2: induction for 30 minutes; 3: induction for 1:30h and 4: induction for 2:30h.
[028] Figura 3: Eletroforese da purificação de proteínas utilizando tampão de lavagem com 5mM de imidazol. As proteínas foram eluídas com 100mM de imidazol. M: Padrão de peso molecular (Unstained Protein Molecular, Wight Maker, Thermo Scientific®). FT: flow-through. L 1,3 e 5: lavagens. E 1-6: eluição da quimera recombinante (SEQ. ID No 1).[028] Figure 3: Electrophoresis of protein purification using wash buffer with 5mM imidazole. Proteins were eluted with 100 mM imidazole. M: Molecular weight standard (Unstained Protein Molecular, Wight Maker, Thermo Scientific®). FT: flow-through. L 1,3 and 5: washes. E 1-6: elution of the recombinant chimera (SEQ. ID No. 1).
[029] Figura 4: A) Curva ROC. A sensibilidade e especifidade determinadas para o ensaio foram 92,31% (IC 95%: 64,0-99) e 100 (IC 95%: 63,1-100), respectivamente. B) Gráfico Boxplots das leituras das absorbâncias dos soros dos grupos positivos e negativos, apresentando diferença estatística entre si (****Teste de Mann-Whitney U: p <0,0001). A mediana das leituras das absorbâncias no grupo positivo foi 0,630, percentil 25%=0,230, percentil 75%=1,197. Em contraste, a mediana das leituras de absorbâncias no grupo negativo foi 0,090, percentil 25%=0,033, percentil 75%=0,122. C) Reatividade das amostras no ensaio de ELISA, sendo um grupo positivo (n= 13) e negativo (n=6) para HDV e grupo de amostras positivas para apenas para HBV (n=2). O cutoff ou ponto de corte do ensaio foi determinado pela curva ROC como 0,144 a 450 nm.[029] Figure 4: A) ROC curve. The sensitivity and specificity determined for the assay were 92.31% (95% CI: 64.0-99) and 100 (95% CI: 63.1-100), respectively. B) Boxplots of absorbance readings of sera from the positive and negative groups, showing statistical differences between them (****Mann-Whitney U test: p <0.0001). The median absorbance readings in the positive group were 0.630, 25% percentile=0.230, 75% percentile=1.197. In contrast, the median absorbance readings in the negative group were 0.090, 25% percentile=0.033, 75% percentile=0.122. C) Reactivity of samples in the ELISA assay, with a positive (n= 13) and negative (n=6) group for HDV and a group of positive samples for HBV only (n=2). The cutoff or cutoff point of the assay was determined by the ROC curve as 0.144 at 450 nm.
[030] A presente tecnologia refere-se à área de Biotecnologia. Trata-se da construção de proteínas quiméricas, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas ao vírus da Hepatite Delta, além de um método e kit para diagnóstico in vitro de Hepatite Delta, que utiliza como antígeno uma proteína quimérica. As proteínas quiméricas foram construídas a partir de epítopos antigênicos triados por bioinformática e podem ser empregadas como antígenos para diagnóstico da infecção por HDV. Além disso, as quimeras possuem potencial para uso na produção de anticorpos e vacinas. A proteínas quiméricas, aqui denominadas de rHDVM, foram constituídas por epítopos antigênicos e com afinidade por receptores de antígenos de células B, por meio de ferramentas de bioinformática a partir de uma sequência consenso de S-HDAg presente nos diferentes sorotipos virais de Hepatite Delta.[030] The present technology refers to the area of Biotechnology. It involves the construction of chimeric proteins, their obtaining process and their applications related to the Hepatitis Delta virus, as well as a method and kit for in vitro diagnosis of Hepatitis Delta, which uses a chimeric protein as an antigen. The chimeric proteins were constructed from antigenic epitopes screened by bioinformatics and can be used as antigens for diagnosing HDV infection. Furthermore, chimeras have potential for use in the production of antibodies and vaccines. The chimeric proteins, here called rHDVM, were constituted by antigenic epitopes with affinity for B cell antigen receptors, using bioinformatics tools from a consensus sequence of S-HDAg present in the different viral serotypes of Hepatitis Delta.
[031] Dentre os epítopos triados, aqueles considerados promissores para compor kits de diagnóstico, vacinas e/ou produção de anticorpos, foram selecionados e combinados (tabela 1) para compor as proteínas de interesse, que compreendem a sequência de aminoácidos SEQ. ID No 1 ou SEQ. ID No3. Tabela 1 - Sequência de epítopos selecionados para compor a proteína quimérica rHDVM e valores de antigenicidade preditos pelo VaxiJen. [031] Among the screened epitopes, those considered promising for composing diagnostic kits, vaccines and/or antibody production, were selected and combined (table 1) to compose the proteins of interest, which comprise the SEQ amino acid sequence. ID No. 1 or SEQ. ID No3. Table 1 - Sequence of epitopes selected to compose the chimeric rHDVM protein and antigenicity values predicted by VaxiJen.
[032] O termo “proteína quimérica” se refere a uma proteína que apresenta um ou mais epítopos combinados. Entende-se por “epítopos” como sequências específicas ou uma pequena configuração de uma molécula de antígeno que são capazes de serem reconhecidas pelos componentes da resposta imunitária.[032] The term “chimeric protein” refers to a protein that presents one or more combined epitopes. “Epitopes” are understood as specific sequences or a small configuration of an antigen molecule that are capable of being recognized by the components of the immune response.
[033] Os fragmentos (epítopos 1, 2 e 3) contendo os epítopos mais antigênicos (contendo um, dois ou mais epítopos, isolados ou sobrepostos, triados por bioinformática) foram combinados e empregados para a construção das proteínas quiméricas, conforme apresentados na tabela 1. Tais fragmentos foram unidos por um peptídeo conector (linkers) de 2 a 10 resíduos de aminoácidos, tais como GSGSG e GGGG, já conhecidos no estado da técnica. A inserção destes conectores permite que anticorpos reconheçam o alvo antigênico e as diferentes porções (epítopos) que o compõem. Foram usados linkers constituídos de resíduos de aminoácidos de glicina e serina, permitindo que as proteínas adquiram uma conformação linear (DIPTI, C. A.; JAIN, S. K.; NAVIN, K. A novel recombinant multiepitope protein as a hepatitis C diagnostic intermediate of high sensitivity and specificity. Protein Expression and Purification, v. 47, n. 1, p. 319-328, 2006).[033] The fragments (epitopes 1, 2 and 3) containing the most antigenic epitopes (containing one, two or more epitopes, isolated or overlapping, screened by bioinformatics) were combined and used for the construction of chimeric proteins, as shown in the table 1. Such fragments were joined by a connecting peptide (linkers) of 2 to 10 amino acid residues, such as GSGSG and GGGG, already known in the art. The insertion of these connectors allows antibodies to recognize the antigenic target and the different portions (epitopes) that make it up. Linkers consisting of glycine and serine amino acid residues were used, allowing the proteins to acquire a linear conformation (DIPTI, C. A.; JAIN, S. K.; NAVIN, K. A novel recombinant multiepitope protein as a hepatitis C diagnostic intermediate of high sensitivity and specificity . Protein Expression and Purification, v. 47, n. 1, p. 319-328, 2006).
[034] Para construção das proteínas quiméricas da presente invenção, exemplificadas pela SEQ. ID No 1 ou 3 e dos ácidos nucleicos SEQ. ID No 2 ou 4, respectivamente, os epítopos 1, 2 e 3 (SEQ. ID No: 5, 7 e/ou 9, respectivamente) foram unidos/combinados empregando-se um linker flexível composto por 4 resíduos de aminoácidos de glicina (GGGG), sendo que o epítopo 2 foi repetido 3 vezes na construção e alternado entre os epítopos 1 e 3. Na figura 1A é possível observar a sequência de aminoácidos da proteína de SEQ. ID. No 1, em que os epítopos e uma cauda de histidina (sublinhada) são unidos por linkers (em negrito). Em 1B é possível observar a sequência de aminoácidos da proteína de SEQ. ID. No 3, em que os epítopos são unidos por linkers (em negrito).[034] For construction of the chimeric proteins of the present invention, exemplified by SEQ. ID No. 1 or 3 and SEQ nucleic acids. ID No. 2 or 4, respectively, epitopes 1, 2 and 3 (SEQ. ID No: 5, 7 and/or 9, respectively) were joined/combined using a flexible linker composed of 4 glycine amino acid residues ( GGGG), with epitope 2 being repeated 3 times in the construction and alternating between epitopes 1 and 3. In figure 1A it is possible to observe the amino acid sequence of the SEQ protein. ID. No. 1, in which the epitopes and a histidine tail (underlined) are joined by linkers (in bold). In 1B it is possible to observe the amino acid sequence of the SEQ protein. ID. In 3, in which the epitopes are joined by linkers (in bold).
[035] A presente invenção também se refere a sequências nucleotídicas (SEQ. 2 ou 4) que codificam as proteínas quiméricas (SEQ. ID 1 ou 3), para clonagem em vetores de expressão heteróloga em microrganismos, tais como bactérias e/leveduras, para expressão das proteínas quiméricas de forma recombinante. As sequências nucleotídicas (SEQ. 2 ou 4) compreendem dois ou mais epítopos selecionados entre as sequências de nucleotídeos SEQ. ID No 6,8 e/ou 10, que foram unidas por conectores flexíveis, formando as sequências de ácidos nucleicos correspondentes às quimeras rHDV (SEQ. ID 1 ou 3).[035] The present invention also relates to nucleotide sequences (SEQ. 2 or 4) that encode chimeric proteins (SEQ. ID 1 or 3), for cloning into heterologous expression vectors in microorganisms, such as bacteria and/yeast, for expression of chimeric proteins in recombinant form. The nucleotide sequences (SEQ. 2 or 4) comprise two or more epitopes selected from the nucleotide sequences SEQ. ID No. 6,8 and/or 10, which were joined by flexible connectors, forming the nucleic acid sequences corresponding to the rHDV chimeras (SEQ. ID 1 or 3).
[036] A presente tecnologia refere-se também ao processo de obtenção das proteínas quiméricas recombinantes. A síntese dessas proteínas envolve o uso das sequências nucleotídicas (SEQ ID No 2 ou 4) que irão codificar as proteínas de interesse por meio da expressão heteróloga em microrganismos. Estas sequências nucleotídicas foram engenheiradas biotecnologicamente, contendo os sítios de restrição da enzima Ndel na região 5' e o sítio de restrição da enzima Xhol na região 3 para clonagem em fase no vetor de expressão, sendo utilizado na presente invenção o pET21a.[036] The present technology also refers to the process of obtaining recombinant chimeric proteins. The synthesis of these proteins involves the use of nucleotide sequences (SEQ ID No. 2 or 4) that will encode the proteins of interest through heterologous expression in microorganisms. These nucleotide sequences were biotechnologically engineered, containing the restriction sites for the NdeI enzyme in the 5' region and the restriction site for the XhoI enzyme in region 3 for in-phase cloning in the expression vector, pET21a being used in the present invention.
[037] De forma geral, o processo de obtenção da proteína quimérica compreende as seguintes etapas: a. Subclonagem da sequência nucleotídica definida pela SEQ ID No 1 ou 3 em vetor de expressão; b. Indução da expressão da proteína de SEQ ID No 2 ou 4 no vetor de expressão; c. Purificação da proteína quimérica.[037] In general, the process of obtaining the chimeric protein comprises the following steps: a. Subcloning of the nucleotide sequence defined by SEQ ID No. 1 or 3 into an expression vector; B. Induction of expression of the protein of SEQ ID No. 2 or 4 in the expression vector; w. Purification of the chimeric protein.
[038] Na etapa “a”, o ácido nucléico compreende multiepítopos triados por bioinformática, derivados da proteína S-HDVAg unidos por peptídeos conectores capazes de resultar na proteína quimérica da presente invenção (SEQ. ID. No 1 ou 3). Os sítios de restrição para enzimas, que na presente invenção são Ndel na região 5' e Xhol na região 3’, e a presença partes estruturais (tags), como uma cauda de histidina que facilita a etapa de purificação, dependem do tipo de microrganismo selecionado para expressão, do vetor utilizado e da técnica de purificação disponível. A incorporação de uma cauda de histidina do vetor de expressão heteróloga utilizado, como a do vetor pET21a, pode permitir a purificação da proteína por meio de técnicas de cromatografia utilizando níquel. Além disso, na presente tecnologia as sequências de cada um dos epítopos selecionados foram otimizadas para expressão em bactérias, sendo preferencialmente Escherichia coli, linhagem BL 21.[038] In step “a”, the nucleic acid comprises multiepitopes screened by bioinformatics, derived from the S-HDVAg protein joined by connector peptides capable of resulting in the chimeric protein of the present invention (SEQ. ID. No. 1 or 3). The restriction sites for enzymes, which in the present invention are NdeI in the 5' region and XhoI in the 3' region, and the presence of structural parts (tags), such as a histidine tail that facilitates the purification step, depend on the type of microorganism. selected for expression, the vector used and the purification technique available. The incorporation of a histidine tail from the heterologous expression vector used, such as that from the pET21a vector, can allow the purification of the protein using chromatography techniques using nickel. Furthermore, in the present technology, the sequences of each of the selected epitopes were optimized for expression in bacteria, preferably Escherichia coli, strain BL 21.
[039] Na etapa “b”, a indução da expressão da proteína interesse ocorre por meios já conhecidos no estado da técnica, em um período na faixa de 1 a 20 horas, empregando-se um indutor, sendo preferencialmente IPTG ou lactose. Após o período de indução, a fração celular passa por um tratamento prévio à etapa purificação (etapa c). Este tratamento compreende uma centrifugação da amostra entre 5000 e 10000 xg e a adição de tampão de lise, com ou sem sonicação. O tampão de lise compreende uma mistura homogênea de ureia de concentração na faixa de 6 a 10 M, NaH2PO4 de 30 a 70 mM, NaCl de 100 a 500 mM e imidazol de 5 a 15mM em pH básico, por exemplo, na faixa de 8 a 10.[039] In step “b”, the induction of expression of the protein of interest occurs by means already known in the art, over a period in the range of 1 to 20 hours, using an inducer, preferably IPTG or lactose. After the induction period, the cellular fraction undergoes treatment prior to the purification step (step c). This treatment comprises centrifuging the sample between 5000 and 10000 xg and adding lysis buffer, with or without sonication. The lysis buffer comprises a homogeneous mixture of urea of concentration in the range of 6 to 10 M, NaH2PO4 of 30 to 70 mM, NaCl of 100 to 500 mM and imidazole of 5 to 15 mM at basic pH, for example in the range of 8 to 10.
[040] A purificação da proteína quimérica de interesse (etapa “c”) compreende condições desnaturantes e uso de técnicas de cromatografia, sendo preferencialmente em coluna de afinidade, como as compostas por níquel.[040] Purification of the chimeric protein of interest (step “c”) comprises denaturing conditions and the use of chromatography techniques, preferably on an affinity column, such as those composed of nickel.
[041] A presente tecnologia também se refere a um método e kit de diagnóstico de HDV, que emprega como alvo antigênico uma proteína quimérica definida pela SEQ. ID No 1 ou 3), a qual pode ser expressa em E. coli, ou pode ser produzida em outros sistemas de expressão heteróloga, ou de forma sintética.[041] The present technology also refers to an HDV diagnostic method and kit, which employs as an antigenic target a chimeric protein defined by SEQ. ID No. 1 or 3), which can be expressed in E. coli, or can be produced in other heterologous expression systems, or synthetically.
[042] O método para diagnóstico da HDV é caracterizado por compreender as seguintes etapas: a. Exposição de uma amostra à proteína quimérica definida pela sequência de aminoácidos SEQ ID No 1 ou SEQ. ID No 3, estando tal proteína ligada a um suporte sólido ou carreador; b. Adição de um anticorpo secundário ou uma proteína que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c. Detecção dos anticorpos específicos para a Hepatite Delta na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou os marcadores citados na etapa (b).[042] The method for diagnosing HDV is characterized by comprising the following steps: a. Exposure of a sample to the chimeric protein defined by the amino acid sequence SEQ ID No. 1 or SEQ. ID No. 3, said protein being attached to a solid support or carrier; B. Addition of a secondary antibody or protein that is conjugated to an enzyme or a marker and that binds to the antibodies in the sample from step (a); w. Detection of antibodies specific to Hepatitis Delta in the sample mentioned in step (a), using reagents capable of detecting the enzyme or markers mentioned in step (b).
[043] Na etapa “a”, a amostra poder ser sangue, soro, plasma e/ou outro fluido biológico.[043] In step “a”, the sample may be blood, serum, plasma and/or other biological fluid.
[044] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses; a proteína pode ser a Proteína A e/ou Proteína G; a enzima pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, uréase, xantina oxidase, glicose oxidase e outras; e o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e compostos quimioluminescentes.[044] In step “b”, the secondary antibody can be selected from the group comprising IgG, IgM, IgA, IgE and/or respective subclasses; the protein can be Protein A and/or Protein G; the enzyme may be selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and others; and the label may be selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent compounds.
[045] Na etapa “c”, a detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados aos anticorpos anti-HDV pode ser feita utilizando reagentes selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas dos marcadores descritos.[045] In step “c”, the detection of the secondary antibody or protein specifically linked to the anti-HDV antibodies can be carried out using reagents selected from the group comprising chromogenic substrates that are recognized by any of the described marker enzymes.
[046] O kit proposto para o diagnóstico da Hepatite Delta compreende: a. Suporte sólido ou carreador contendo a quimera recombinante definida pela sequência de aminoácidos SEQ ID No 1 ou SEQ. ID No 3; b. Anticorpo secundário monoclonal ou policlonal ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c. Reagente para detectar a enzima ou o marcador.[046] The proposed kit for the diagnosis of Hepatitis Delta comprises: a. Solid support or carrier containing the recombinant chimera defined by the amino acid sequence SEQ ID No. 1 or SEQ. ID #3; B. Monoclonal or polyclonal secondary antibody or a protein, conjugated to an enzyme or a marker; w. Reagent to detect the enzyme or marker.
[047] O suporte sólido mencionado no item “a” pode ser escolhido do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno.[047] The solid support mentioned in item “a” can be chosen from the group of materials comprising nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and/or polystyrene.
[048] O anticorpo secundário mencionado no item “b” pode compreender IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses e a proteína pode ser a proteína A e/ou proteína G.[048] The secondary antibody mentioned in item “b” may comprise IgG, IgM, IgA, IgE and/or their respective subclasses and the protein may be protein A and/or protein G.
[049] Para os itens “b” e “c”, a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou proteína pode ser selecionada do grupo incluindo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Em relação ao marcador, pode ser selecionado do grupo incluindo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e/ou quimioluminescentes.[049] For items “b” and “c”, the enzyme that is conjugated to the secondary antibody or protein can be selected from the group including peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase. Regarding the marker, it can be selected from the group including enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and/or chemiluminescents.
[050] Finalmente, no ítem “c”, o reagente para detectar a enzima ou o marcador mencionado pode ser selecionado do grupo incluindo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas ou algum dos marcadores mencionados acima.[050] Finally, in item “c”, the reagent for detecting the mentioned enzyme or marker can be selected from the group including chromogenic substrates that are recognized by any of the enzymes or any of the markers mentioned above.
[051] A proteína quimérica definida pela SEQ ID No1 ou SEQ ID No3 pode ser utilizada para o diagnóstico e/ou produção de kits para diagnóstico da Hepatite Delta.[051] The chimeric protein defined by SEQ ID No1 or SEQ ID No3 can be used for the diagnosis and/or production of kits for diagnosing Hepatitis Delta.
[052] A presente invenção pode ser mais bem compreendida por meio dos exemplos que se seguem, não se limitando a estes.[052] The present invention can be better understood through the following examples, without being limited to these.
[053] Busca das sequências proteicas e alinhamento: As sequências proteicas de S-HDVAg de diferentes sorotipos virais de Hepatite Delta foram obtidas no banco de dados do GeneDB (http://www.genedb.org). As sequencias foram alinhadas, utilizando a ferramenta Muscle (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) para a obtenção de uma sequência consenso.[053] Search for protein sequences and alignment: The protein sequences of S-HDVAg from different viral serotypes of Hepatitis Delta were obtained from the GeneDB database (http://www.genedb.org). The sequences were aligned using the Muscle tool (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) to obtain a consensus sequence.
[054] Seleção dos peptídeos: A sequência consenso foi analisada utilizando ferramentas de bioinformática como parte do desenho racional da proteina quimérica. Este racional de análises tem como objetivo identificar, a partir de sequências inteiras de proteínas, epítopos que tenham maior probabilidade de serem reconhecidos por receptores de células B e estar em contato com o sistema imunológico do hospedeiro, e posteriormente realizar a seleção de epítopos com maior probabilidade de serem antigênicos.[054] Selection of peptides: The consensus sequence was analyzed using bioinformatics tools as part of the rational design of the chimeric protein. This analytical rationale aims to identify, from entire protein sequences, epitopes that are more likely to be recognized by B cell receptors and be in contact with the host's immune system, and subsequently carry out the selection of epitopes with greater probability of being antigenic.
[055] A sequência consenso foi analisada utilizando-se o programa ABCpred (http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/) (WANG, X.; SUN, Q.; YE, Z.; HUA, Y.; SHAO, N.; DU, Y.; ZHANG, Q.; WAN, C. Computational approach for predicting the conserved B-cell epitopes of hemagglutinin H7 subtype influenza virus. Experimental and Therapeutic Medicine, v. 12, n. 4, p. 2439-2446, out. 2016) para a predição de antígenos com afinidade pelo receptor de antígeno de célula B (BCR, do inglês: B cell antigen receptor). Para a triagem em questão, foi ajustado o parâmetro de busca para epítopos contendo 16 aminoácidos, e todos os epítopos acima do threshold de 0.85 foram considerados para as análises seguintes.[055] The consensus sequence was analyzed using the ABCpred program (http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/) (WANG, X.; SUN, Q.; YE, Z.; HUA, Y.; SHAO, N.; DU, Y.; ZHANG, Q.; WAN, C. Computational approach for predicting the conserved B-cell epitopes of hemagglutinin H7 subtype influenza virus. Experimental and Therapeutic Medicine, v. 12, n. 4, pp. 2439-2446, Oct. 2016) for the prediction of antigens with affinity for the B cell antigen receptor (BCR). For the screening in question, the search parameter was adjusted to epitopes containing 16 amino acids, and all epitopes above the threshold of 0.85 were considered for the following analyses.
[056] Após a seleção dos epítopos, o programa VaxiJen (http://ddg- pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) (DOYTCHINOVA, I. A.; FLOWER, D. R. Bioinformatic Approach for Identifying Parasite and Fungal Candidate Subunit Vaccines. The Open Vaccine Journal, v. 1, n. 1, p. 22-26, 2008) foi utilizado para fazer a predição de antigenicidade dos epítopos selecionados. O resultado mostra a probabilidade de ser antigênico ou não antigênico, de acordo com um valor de corte predefinido. Somente os epítopos preditos como antigênicos foi considerado para análise de similaridade.[056] After selecting the epitopes, the VaxiJen program (http://ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) (DOYTCHINOVA, I. A.; FLOWER, D. R. Bioinformatic Approach for Identifying Parasite and Fungal Candidate Subunit Vaccines. The Open Vaccine Journal, v. 1, n. 1, p. 22-26, 2008) was used to predict the antigenicity of the selected epitopes. The result shows the probability of being antigenic or non-antigenic, according to a predefined cutoff value. Only epitopes predicted as antigenic were considered for similarity analysis.
[057] Com a finalidade de evitar possíveis reações cruzadas e possíveis falsos-negativos em kits de diagnóstico, foi verificado por meio do programa NCBI Blast+ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/) (CAMACHO, C. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics, v. 10, n. 1, p. 421, 2009) se os epítopos selecionados apresentavam similaridade com proteínas de outras espécies filogeneticamente relacionados ou não.[057] In order to avoid possible cross-reactions and possible false-negatives in diagnostic kits, it was checked using the NCBI Blast+ program (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/) ( CAMACHO, C. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics, v. 10, n. 1, p. 421, 2009) whether the selected epitopes showed similarity with proteins from other phylogenetically related species or not.
[058] A proteína quimérica recombinante produzida na presente invenção é codificada por uma sequência de DNA sintetiza por empresas especializadas em síntese química de genes. No desenho racional do gene, foram considerados pelos inventores os seguintes critérios: I. O uso de códon preferenciais (Codon usage) dos organismos empregados para expressão heteróloga; II. Adição de sítios de restrição apropriados nas extremidades dos genes para facilitar a clonagem; III. O gene sintetizado, clonado no vetor de expressão heteróloga, codifica uma quimera compatível com o microrganismo utilizado.[058] The recombinant chimeric protein produced in the present invention is encoded by a DNA sequence synthesized by companies specialized in chemical gene synthesis. In the rational design of the gene, the following criteria were considered by the inventors: I. The use of preferred codons (Codon usage) of the organisms used for heterologous expression; II. Addition of appropriate restriction sites at the ends of genes to facilitate cloning; III. The synthesized gene, cloned into the heterologous expression vector, encodes a chimera compatible with the microorganism used.
[059] Os epítopos 1, 2 e 3 (tabela 1) foram selecionados e combinados para desenhar o gene codificador da proteína quimérica. Na figura 1.A é possível observar a sequência de aminoácidos desta proteína (SEQ. ID. No 1), em que, os epítopos e uma cauda de histidina (sublinhada) são unidos por linkers (em negrito). Em 1.B é possível observar a sequência de aminoácidos desta proteína (SEQ. ID. No 3), em que, os epítopos são unidos por linkers (em negrito).[059] Epitopes 1, 2 and 3 (table 1) were selected and combined to design the gene encoding the chimeric protein. In figure 1.A it is possible to observe the amino acid sequence of this protein (SEQ. ID. No. 1), in which the epitopes and a histidine tail (underlined) are joined by linkers (in bold). In 1.B it is possible to observe the amino acid sequence of this protein (SEQ. ID. No. 3), in which the epitopes are joined by linkers (in bold).
[060] Na presente invenção, o gene sintético foi clonado no vetor pET21a, um vetor comercial largamente utilizado, contendo uma cauda de histidina na extremidade C-terminal utilizada para auxiliar na purificação da proteína. O vetor contendo o gene foi inserido em células de E. coli BL21 (DE3) pLysE, para indução da expressão da proteína quimérica de interesse.[060] In the present invention, the synthetic gene was cloned into the pET21a vector, a widely used commercial vector, containing a histidine tail at the C-terminal end used to assist in the purification of the protein. The vector containing the gene was inserted into E. coli BL21 (DE3) pLysE cells, to induce expression of the chimeric protein of interest.
[061] A expressão pode ser feita em pequena escala ou em escalas maiores em frascos sob agitação ou em reatores adequados de acordo com a necessidade. A expressão heteróloga da proteína quimérica foi realizada utilizando-se cepas de E. coli BL21 plysE em pequena escala. Para isto, foi realizado uma colônia contendo a construção plasmidial pET21a::rHDV foi retirada da placa de Petri e inoculadas em um pré- inoculo, contendo 5 mL de meio de cultura Luria-Bertani (LB) pH 7,2 e incubada a 37°C, sob agitação (180-200 rpm), durante 16 h. Após, 1,25 mL deste cultivo foi adicionado à 25mL de meio LB (pH7,5) e a cultura foi incubada a 37°C, sob agitação (180-200 rpm) até atingir a densidade óptica (OD) no comprimento de onda de 600nm de 0,6 (Espectro de bancada UV/Vis Libra S50, Biochrom), quando então foi adicionado IPTG [1mmol/L] como agente indutor [GALDINO, A. S. et al. A Novel Structurally Stable Multiepitope Protein for Detection of HCV. Hepatitis Research and Treatment, v. 2016, p. 1-9, 2016.) Uma alíquota de 2 mL foi coletada após a adição do indutor, sendo considerada como tempo zero (tempo “zero” de indução T0 = 0h), centrifugou-se à 4°C e 35.000xg (Centrífuga Megafuge 16R, Thermo Scientific) durante 10 minutos e descartou-se o sobrenadante; o pellet foi ressuspendido em 100μL de tampão de amostra para proteína [50 mmol/L Tris-HCl (pH 6,8); 2% (p/v) SDS; 0,1% (p/v) Azul de bromofenol; 10% (v/v) Glicerol e 10% (p/v) β- mercaptoetanol]. Os frascos Erlenmeyers foram, então, incubados a 37°C sob agitação (180-200 rpm), durante 2 horas e 30 minutos. E amostras de 1mL foram coletadas ao término da indução (T150 = 2h 30 min) e centrifugadas na mesma condição descrita anteriormente para verificar a expressão da proteína de interesse.[061] Expression can be carried out on a small scale or on larger scales in shaking flasks or in suitable reactors according to need. Heterologous expression of the chimeric protein was performed using E. coli BL21 plysE strains on a small scale. For this, a colony containing the plasmid construction pET21a::rHDV was created, removed from the Petri dish and inoculated in a pre-inoculum, containing 5 mL of Luria-Bertani (LB) culture medium pH 7.2 and incubated at 37 °C, under stirring (180-200 rpm), for 16 h. Afterwards, 1.25 mL of this culture was added to 25 mL of LB medium (pH7.5) and the culture was incubated at 37°C, under agitation (180-200 rpm) until reaching the optical density (OD) at the wavelength 600nm of 0.6 (UV/Vis bench spectrum Libra S50, Biochrom), when IPTG [1mmol/L] was added as an inducing agent [GALDINO, A. S. et al. A Novel Structurally Stable Multiepitope Protein for Detection of HCV. Hepatitis Research and Treatment, vol. 2016, p. 1-9, 2016.) A 2 mL aliquot was collected after adding the inducer, considered as time zero (“zero” induction time T0 = 0h), centrifuged at 4°C and 35,000xg (Megafuge Centrifuge 16R, Thermo Scientific) for 10 minutes and the supernatant was discarded; the pellet was resuspended in 100μL of protein sample buffer [50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8); 2% (w/v) SDS; 0.1% (w/v) Bromophenol blue; 10% (v/v) Glycerol and 10% (w/v) β-mercaptoethanol]. The Erlenmeyer flasks were then incubated at 37°C under shaking (180-200 rpm) for 2 hours and 30 minutes. And 1mL samples were collected at the end of induction (T150 = 2h 30 min) and centrifuged under the same condition described previously to verify the expression of the protein of interest.
[062] A análise da capacidade de indução da cepa para produzir a proteína recombinante de interesse, foi analisada por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes, contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) na concentração de 12% para o separador e 5% no concentrador conforme metodologia de Harlow & Lane (1988) (HARLOW, E.; LANE, D. ANTIBODIES. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988.) Utilizou-se a voltagem de 60V no gel concentrador e 80V no separador e padrão de peso molecular Pierce™ Unstained Protein MW Marker (26610, Thermo Fisher Scientific), contendo as bandas de 14, 44, 18,4, 25, 35, 45, 66,2 e 116kDa. O gel foi corado com Coomassie brilliante blue R-250 [0,25% (p/v) azul de Comassie R-250, 40% (v/v) metanol, 10% (v/v) ácido acético] “overnight” sob leve agitação. Posteriormente, o gel foi submetido imerso em solução descorante [40% (v/v) metanol e 10% (v/v) de ácido acético] até a visualização de bandas.[062] The analysis of the induction capacity of the strain to produce the recombinant protein of interest was analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis, under denaturing conditions, containing sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) at a concentration of 12% for the separator and 5% in the concentrator according to the methodology of Harlow & Lane (1988) (HARLOW, E.; LANE, D. ANTIBODIES. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988.) A voltage of 60V was used in the concentrator gel and 80V in the Pierce™ Unstained Protein MW Marker separator and molecular weight standard (26610, Thermo Fisher Scientific), containing the bands of 14, 44, 18.4, 25, 35, 45, 66.2 and 116kDa. The gel was stained with Coomassie brilliant blue R-250 [0.25% (w/v) Comassie blue R-250, 40% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid] overnight. under slight agitation. Subsequently, the gel was immersed in a decolorizing solution [40% (v/v) methanol and 10% (v/v) acetic acid] until bands were visible.
[063] Dados do gel de eletroforese demonstrando da indução da proteína quimérica podem ser observados na Figura 2, em que é possível observar a presença de uma banda característica de expressão de rHDVM na altura do padrão de massa molecular de aproximadamente 25 kDa. A quantificação da proteína quimérica, foi obtida pelo método de Bradford para quantificação de proteínas totais (Bradford MMA. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing principle of protein dye binding. Anal Biochem 72: 248-254, 1976).[063] Data from the electrophoresis gel demonstrating the induction of the chimeric protein can be seen in Figure 2, in which it is possible to observe the presence of a characteristic band of rHDVM expression at the height of the molecular mass standard of approximately 25 kDa. Quantification of the chimeric protein was obtained using the Bradford method for quantification of total proteins (Bradford MMA. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing principle of protein dye binding. Anal Biochem 72: 248-254, 1976) .
[064] As células foram coletadas após a indução e centrifugadas, sendo o pellet ressuspendido em tampão de lise desnaturante [NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 10mM, Ureia 8M, pH 8,0], com ou sem sonicação.[064] The cells were collected after induction and centrifuged, and the pellet was resuspended in denaturing lysis buffer [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10mM Imidazole, 8M Urea, pH 8.0], with or without sonication.
[065] O produto obtido da análise foi centrifugado, e o sobrenadante contendo as proteínas foi empregado para as etapas subsequentes de purificação. Uma vez que a proteína recombinante possui uma cauda de histidina, o sobrenadante foi então adicionado à uma coluna de cromatografia de afinidade, contendo níquel, e incubado por 1-2horas, 4°C sob agitação orbital para que as proteínas se ligassem à resina.[065] The product obtained from the analysis was centrifuged, and the supernatant containing the proteins was used for subsequent purification steps. Since the recombinant protein has a histidine tail, the supernatant was then added to a nickel-containing affinity chromatography column and incubated for 1-2 hours at 4°C under orbital shaking to allow the proteins to bind to the resin.
[066] A lavagem e remoção de proteínas que não se ligaram à coluna ou fracamente ligadas foi feita com o tampão de lavagem (5 vezes) contendo [NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 5mM, Ureia 8M, pH 8,0], seguido da eluição (4 vezes) com tampão contendo [NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 200mM, Ureia 8M, pH 8,0].[066] Washing and removal of proteins that did not bind to the column or were weakly bound was done with the washing buffer (5 times) containing [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5mM Imidazole, 8M Urea, pH 8.0] , followed by elution (4 times) with buffer containing [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 200 mM Imidazole, 8 M Urea, pH 8.0].
[067] A análise da purificação foi executada por meio de gel SDS-PAGE por meio de amostras obtida durante o processo. Os resultados podem ser observados na Figura 3, em que se verifica que a proteína pode ser purificada com elevado grau de pureza empregando-se esta metodologia.[067] Purification analysis was performed using SDS-PAGE gel using samples obtained during the process. The results can be seen in Figure 3, which shows that the protein can be purified to a high degree of purity using this methodology.
[068] Para avaliar a atividade imunológica da proteína quimérica rHDVM, foi proposto um ensaio baseado na interação antígeno-anticorpo, empregando-se a técnica de ELISA, uma técnica amplamente adotada e difundida no estado da técnica.[068] To evaluate the immunological activity of the chimeric rHDVM protein, an assay based on antigen-antibody interaction was proposed, using the ELISA technique, a technique widely adopted and widespread in the state of the art.
[069] Ensaio de ELISA in-house: Neste ensaio, os poços de uma microplaca (Greiner®) foram sensibilizados com 70 nanogramas/poço de proteína utilizando o tampão Tris-HCl [20mM, pH 8,5], seguida da incubação a 4°C por 16 horas. Posteriormente, a placa foi lavada (3 lavagens x 300μL/poço), utilizando a lavadora de microplaca (Biotek® - Elx 50) e bloqueada utilizando 300 μL da solução de bloqueio [PBS - Tween 20 0,05% leite desnatado 5%, pH 7,2] por uma hora a 37°C. As amostras positivas (n=13) e negativas (n=8, sendo 6 negativas para hepatites e 2 negativas para HDV, porém, positivas para HBV) foram diluídas em solução de bloqueio na diluição de 1:100, e 100 μL/poço de cada amostra foi adicionado à placa. Logo após, a placa foi incubada por trinta minutos a 37°C e lavou-se a placa com a solução de lavagem comercial por três vezes utilizando a lavadora de microplaca. Posteriormente, 100 μL do anticorpo secundário, (Anti-IgG Humano conjugado com HRP, Sigma®, Alemanha), diluído 1:50.000 em PBS-T 0,05%, foi aplicado em cada poço. Logo após, a placa foi incubada por trinta minutos a 37°C e posteriormente lavada conforme já descrito. O teste foi revelado com a aplicação de 100μl/poço de 3,3',5,5‘- Tetrametilbenzidina (TMB) e em seguida, a placa foi incubada por 10 minutos a 37°C. A reação de revelação foi interrompida adicionando-se a solução de parada comercial, e logo em seguida, foi realizada a leitura das absorbâncias, a 450nm, utilizando uma leitora de microplaca (Biotek®).[069] In-house ELISA assay: In this assay, the wells of a microplate (Greiner®) were sensitized with 70 nanograms/well of protein using Tris-HCl buffer [20mM, pH 8.5], followed by incubation at 4°C for 16 hours. Subsequently, the plate was washed (3 washes x 300μL/well), using the microplate washer (Biotek® - Elx 50) and blocked using 300 μL of blocking solution [PBS - Tween 20 0.05% skimmed milk, 5%, pH 7.2] for one hour at 37°C. Positive (n=13) and negative (n=8, 6 negative for hepatitis and 2 negative for HDV, but positive for HBV) samples were diluted in blocking solution at a dilution of 1:100, and 100 μL/well of each sample was added to the plate. Afterwards, the plate was incubated for thirty minutes at 37°C and the plate was washed with the commercial washing solution three times using the microplate washer. Subsequently, 100 μL of the secondary antibody (Anti-Human IgG conjugated to HRP, Sigma®, Germany), diluted 1:50,000 in 0.05% PBS-T, was applied to each well. Soon after, the plate was incubated for thirty minutes at 37°C and subsequently washed as already described. The test was developed by applying 100μl/well of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) and then the plate was incubated for 10 minutes at 37°C. The development reaction was stopped by adding the commercial stop solution, and immediately afterwards, the absorbances were read at 450nm using a microplate reader (Biotek®).
[070] Os resultados da avaliação da atividade imunológica podem ser observados na figura 4. A eficácia diagnóstica da proteína quimérica recombinante foi avaliada e resultados mostraram que a quimera foi reconhecida por anticorpos presentes no soro de portadores de HDV e permitiu discriminar entre soros positivos e negativos (Figura 4B), apresentando diferença estatística entre os grupos avaliados (****Teste de Mann-Whitney U: p <0,0001). Além disso, a proteína foi avaliada quanto a reação cruzada em pacientes monoinfectados por Hepatite B, apresentando ausência de reação cruzada (Figura 4C). Por meio de uma curva ROC (Figura 4A), foi determinado o ponto de corte (Cut-off) como 0,144 a 450 nm e os parâmetros sorológicos de sensibilidade e especifidade para o ensaio, sendo 92,31% (IC 95%: 64,0-99) e 100 (IC 95%: 63,1-100), respectivamente. Estes resultados confirmam a aplicação desta proteína como método e kit para diagnóstico de HDV, de forma mais específica, a detecção de anticorpos IgG anti-HDV.[070] The results of the immunological activity assessment can be seen in figure 4. The diagnostic efficacy of the recombinant chimeric protein was evaluated and results showed that the chimera was recognized by antibodies present in the serum of HDV carriers and allowed discrimination between positive sera and negative (Figure 4B), showing a statistical difference between the groups evaluated (****Mann-Whitney U test: p <0.0001). Furthermore, the protein was evaluated for cross-reaction in patients monoinfected with Hepatitis B, showing no cross-reaction (Figure 4C). Using a ROC curve (Figure 4A), the cut-off point was determined as 0.144 at 450 nm and the serological parameters of sensitivity and specificity for the assay were 92.31% (95% CI: 64 ,0-99) and 100 (95% CI: 63.1-100), respectively. These results confirm the application of this protein as a method and kit for HDV diagnosis, more specifically, the detection of anti-HDV IgG antibodies.
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