BR102022002539A2

BR102022002539A2 - Marcador molecular de nicotina associado ao snp 1 para identificação do teor elevado ou baixo de nicotina no tabaco, kit de identificação e métodos relacionados

Info

Publication number: BR102022002539A2
Application number: BR102022002539-8A
Authority: BR
Inventors: He Xie; Ge BAI; Yong Li; Aiguo Yang; Tao Pang; Dahai Yang; Bingguang Xiao; Yongping Li; Min Ren; Mingliang Fei
Original assignee: Yunan Academy of Tobacco Agricultural Science
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2023-05-23

Abstract

A presente invenção "MARCADOR MOLECULAR DE NICOTINA ASSOCIADO AO SNP 1 PARA IDENTIFICAÇÃO DO TEOR ELEVADO OU BAIXO DE NICOTINA NO TABACO, KIT DE IDENTIFICAÇÃO E MÉTODOS RELACIONADOS" pertence ao campo da tecnologia da biologia molecular. O marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017. A presente invenção pode identificar e filtrar com precisão os recursos de germoplasma de tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina, onde o tabaco rastreado pode ser utilizado diretamente para o melhoramento de novas variedades de tabaco sem métodos transgênicos. Paralelamente, a sequência genética em que se localiza o local de SNP também pode ativar significativamentt os promotores de genes-chave da enzima na via de síntese de nicotina.

Description

MARCADOR MOLECULAR DE NICOTINA ASSOCIADO AO SNP 1 PARA IDENTIFICAÇÃO DO TEOR ELEVADO OU BAIXO DE NICOTINA NO TABACO, KIT DE IDENTIFICAÇÃO E MÉTODOS RELACIONADOS

Campo Técnico

[001] A presente invenção diz respeito ao domínio da tecnologia da biologia molecular, em especial a um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para a identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco e do seu kit, bem como à sua aplicação.

Técnica Anterior

[002] É um trabalho muito significativo para estudar regulação metabólica da nicotina no tabaco. As variedades de tabaco com diferentes teores de nicotina podem ser fornecidas através de regulamentação genética, que pode fornecer matérias-primas para a produção comercial de tabaco de produtos personalizados de tabaco à base de nicotina. A nicotina possui um forte efeito estimulante fisiológico no corpo humano, sendo base material para o uso comercial do tabaco. Muitas das principais empresas de tabaco do mundo, como Philip Morris, Imperial Tobacco, Japan Tobacco, British American Tobacco e outras empresas investiram fortemente em pesquisas sobre vias metabólicas e mecanismos reguladores da nicotina do tabaco.

[003] Como o metabolito secundário mais importante da Nicotiana tabacum, e um dos alcalóides mais conhecidos, a nicotina é a parte economicamente mais valiosa do tabaco cujo conteúdo pode determinar diretamente a qualidade das folhas do tabaco. Na maioria das variedades de tabaco, os alcalóides representam 2%-4% do peso seco, enquanto a nicotina representa 90%-95% do teor total de alcalóides.

[004] Quando o crescimento do tabaco é invadido ou forçado por insetos e bactérias patogênicas, a nicotina pode ser produzida na planta do tabaco induzindo resistir à invasão. Portanto, a nicotina é um metabólito protetor do próprio tabaco, que fornece proteção para seu crescimento e desenvolvimento normais. Um teor muito elevado ou muito baixo de nicotina na produção industrial conduzirá a um teor químico descoordenado de folhas de tabaco, à redução da usabilidade e à desfavorável produção de cigarros. Portanto, estudar a síntese e a regulação metabólica da nicotina no tabaco é de grande importância para o desenvolvimento da indústria tabaqueira e da produção agrícola de nosso país.

[005] A via biossintética da nicotina foi parcialmente resolvida. A putrescina no tabaco pode ser utilizada para sintetizar o anel pirrolidino de nicotina. A arginina descarboxilase (ADC) catalisa a descarboxilação da arginina para formar a putrescina, ou a ornitina descarboxilase (ODC) catalisa a descarboxilação da ornitina para formar a putrescina. A putrescina obtém a metil fornecida pela S-adenosil-L-metionina (SAM) sob a ação da putrescina-N-metiltransferase (PMT) para formar N-metilputrescina, que é uma reação dependente da atividade da S-adenosilmetionina sintase (SAMs). A N-metilputresina forma éter 4-metilamino-butil sob catálise da N-metilputrescine oxidase (MPO), e forma a N-metil-A1-pirrolina catiônica através da auto-ligadura, logo condensa-se com derivados de ácido nicotínico fornecendo anel piridina para formar nicotina.

[006] O anel piridina da nicotina é parcialmente fornecido pelo ácido nicotínico, e seu precursor é o ácido quinolínico sintetizado a partir do ácido aspártico. O ácido quinolínico forma nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) sob a catálise da quinolinato-fosforibosil transferase (QPRT), logo gera ácido nicotínico através da via do ciclo de nucleotídeos piridina.

[007] Estudos recentes sobre a reação de condensação do anel pirrolidino de nicotina e do anel piridina mostraram que o gene A622 tipo isoflavona redutase, membro da família PIP da redutase dependente do NADPH, e seus genes homólogos estão envolvidos nesse processo.

[008] O hormônio vegetal é uma das formas básicas de regular a biossíntese de metabólitos secundários. A análise do mecanismo regulador do sinal hormonal sobre a biossíntese de metabólitos secundários é um dos pontos-chave da investigação científica das plantas. Jasmonatos (JAs) têm sido amplamente envolvidos na regulação metabólica de metabólitos secundários vegetais. A JA possui um efeito indutor significativo na biossíntese da nicotina.

[009] Na presença de ácido jasmônico, a JA-Ile derivada do ácido jasmônico liga-se ao receptor de ácido jasmônico COI1 mediado por ubiquitina degradar a proteína JAZ do regulador negativo, liberando assim ativadores transcricionais a jusante e ativando a resposta do ácido jasmônico da planta. Os reguladores COI1 e JAZ da via do ácido jasmônico da proteína do tabaco provaram ser reguladores da síntese de nicotina. Estudos recentes também identificaram alguns fatores de transcrição que regulam a síntese de nicotina, como membros da família do fator de transcrição da ERF JAP1, ERF32 e ORC1 e seus genes homólogos, membros da família do fator de transcrição da bHLH bHLH1/2 e MYC2. Tais fatores de transcrição da FER e os fatores de transcrição da bHLH também podem afetar o metabolismo da nicotina por meio de regulação mútua.

[0010] Atualmente, não existem marcadores moleculares utilizando o local do SNP para identificar o alto ou baixo teor de nicotina do tabaco neste campo.

Resumo da Invenção

[0011] Com base na lacuna de pesquisa acima mencionada no campo, o objetivo da presente invenção é fornecer um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco e do seu kit, bem como para uso.

[0012] Para atingir o objetivo acima referido, a solução técnica da presente invenção é a seguinte:

[0013] Um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, caracterizado nesse sentido, é um local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do Segmento Genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0014] Um par de iniciadores especificos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificação do teor de nicotina do tabaco são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2.

[0015] Um kit de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, caracterizado nesse sentido, um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1, o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0016] O kit de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco inclui também: um par de iniciadores especificos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1;

[0017] Preferencialmente, os iniciadores especificos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2.

[0018] Preferencialmente, o kit inclui também: reagentes para PCR, reagentes para sequenciação e/ou reagentes para ensaio de determinação do genótipo KASP;

[0019] Preferencialmente, os reagentes para PCR incluem: dNTPs, Enzima Taq, Solução PCR, ddH2O;

[0020] Preferencialmente, os reagentes para sequenciação incluem: Tris-HCl, agarose, EB;

[0021] Preferencialmente, os reagentes para o ensaio de determinação do genótipo KASP incluem: MASTER mix KASP.

[0022] Método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, caracterizado nesse sentido, um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1, é usado para selecionar tabacos candidatos; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0023] O método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco por incluir: um par de iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são utilizados para amplificação por PCR no DNA de tabacos candidatos; os iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2;

[0024] Preferencialmente, o método de identificação do teor elevado ou nível elevado de nicotina no tabaco inclui também: Os produtos PCR são submetidos a ensaios de sequenciação ou genotipagem de KASP;

[0025] Preferencialmente, os resultados do ensaio de sequenciação ou do ensaio de genotipagem de KASP mostram que os tabacos candidatos cujo genótipo do local SNP é GG, sendo um tabaco com baixo teor de nicotina;

[0026] os resultados do ensaio de sequenciação ou genotipagem do KASP mostram que os tabacos candidatos cujo genótipo do local SNP é AA, sendo um tabaco com elevado teor de nicotina;
Preferencialmente, o sistema de reação PCR inclui:

[0027] Modelo 0,02pL/ pL, iniciador de avanço 0,02pL/ pL, iniciador reverso 0,02pL/ pL, 5*solução 0,2pL/ pL, mistura dNTP 0,02pL/ pL, polimerase de DNA 0,02pL/pL, com o resto de água;

[0028] O programa de reação de amplificação PCR inclui: 98°C 5 min.; tomar 98°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s como 1 ciclo, um total de 35 ciclos; 72°C 5 min.;

[0029] Preferencialmente, o DNA do tabaco candidato é extraído de folhas, sementes, raízes, caules, flores ou frutas.

[0030] Um método para a reprodução de variedades de tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina, caracterizado nesse sentido, os tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina provenientes de tabacos candidatos são rastreados utilizando o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, e/ou o kit de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, e/ou o método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco.

[0031] Tabaco com elevado teor de nicotina é selecionado como progenitor feminino ou progenitor masculino, o tabaco necessário para ser melhorado é tomado como progenitor masculino ou progenitor feminino, a geração F1 é obtida através da travessia do progenitor feminino e do progenitor masculino.

[0032] Preferencialmente, as plantas da geração F2 são obtidas por plantas consanguíneas da geração F1, e as plantas da geração F2 são retrocruzadas com tabacos selecionados com índice elevado ou baixo da nicotina ou tabacos que requerem melhoramento;

[0033] Tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina são rastreados a partir da população retrocruzada através do método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, e/ou o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, e/ou o kit para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco.

[0034] Um método para ativar os promotores de genes que envolvem a via de síntese de nicotina do tabaco, caracterizado nesse sentido, os genes que hiperexpressam o local de SNP; o local de SNP é um local de SNP de um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é o local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0035] Preferencialmente, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 7 e ID SEQ. N° 8 são utilizados para amplificar o DNA de tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina, de modo a obter uma sequência genética que contenha o local SNP;

[0036] Preferencialmente, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 3 e ID SEQ. N° 4 ou ID SEQ. N° 5 e ID SEQ. N° 6 são utilizados para amplificar o DNA de tabacos para obter a sequência promotora de genes que envolvem a via de sintese de nicotina do tabaco;

[0037] Preferencialmente, a sequência genética que contém o local de SNP está ligada ao vetor de hiperexpressão e a sequência de genes que envolvem a via de sintese de nicotina do tabaco está ligada ao vetor de expressão;

[0038] Preferencialmente, o vetor de hiperexpressão que liga a sequência genética que contém o local do SNP e o vetor de expressão que liga a sequência do gene que envolve a via de sintese de nicotina do tabaco são transformados em agrobacterium e depois transferidos para o tabaco;

[0039] Preferencialmente, os promotores de genes que envolvem a via de sintese de nicotina são selecionados a partir de promotores dos seguintes genes: NtPMT2 e/ou NtQPT2;

[0040] Preferencialmente, o vetor de hiperexpressão é o vetor de hiperexpressão pB2GW7; o vetor de expressão é pGreen0800.

[0041] Um método de reforço da interação com o gene que promove a síntese de nicotina, caracterizado nesse sentido, os genes que promovem a síntese de nicotina e os fragmentos de genes que contêm o sítio SNP são co-expressos; o local de SNP é um local de SNP de um marcador molecular à nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é o local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0042] Preferencialmente, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 9 e ID SEQ. N° 10 são utilizados para amplificar a sequência do gene que promove a síntese de nicotina;

[0043] Preferencialmente, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 11 e ID SEQ. N° 12 são utilizados para amplificar o fragmento genético que contém o local SNP;

[0044] Preferencialmente, o gene que promove a síntese de nicotina e o fragmento genético que contém o local SNP, estão ligados respetivamente ao vetor de expressão para realizar a co-expressão;

[0045] Preferencialmente, o vetor de expressão ligado à sequência do gene que promove a síntese de nicotina e o vetor de expressão ligado ao fragmento genético que contém o local SNP são tabaco transformado em co-transformação;

[0046] Preferencialmente, o gene que promove a síntese de nicotina é NtMED25, com o vetor de expressão sendo pCAMBIA1300-cLUC ou pCAMBIA 1300-nLUC.

[0047] A presente invenção fornece um local SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) nicotina associada ao SNP 1 associado a marcas de teor de nicotina no tabaco, caracterizado nesse sentido: o local de SNP é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0048] O local de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco.

[0049] O método de análise GWAS do sítio SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco, caracterizado nesse sentido, inclui as seguintes etapas: 1) O software Senteion é utilizado para detetar SNPs da população de tabaco, sendo que um total de 47140188 locais SNP são obtidos por tal deteção. 2) Os SNPs são filtrados através do software vcftools com condições de Miss0,5, Het0,2 e maf0,05, e, por fim, um total de 6.957.682 locais de SNP de alta qualidade são obtidos para análise posterior. 3) A análise SVs é realizada em múltiplas populações de tabaco natural, utilizando-se o processo de análise de padrões de BreakDancer e CNVnator; 4) Baseado na análise da estrutura populacional e da relação genética, a análise da associação do genoma completo é realizada com base nos dados fenotípicos do teor de nicotina no tabaco, utilizando-se o método misto do modelo linear.

[0050] Utilização do local SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado ao teor de nicotina no tabaco na predição e triagem precoce do teor de nicotina no tabaco.

[0051] Utilização do local SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco em melhoramento assistido por marcadores moleculares do tabaco.

[0052] O local de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco é utilizado no cultivo de tabaco com alto ou baixo teor de nicotina.

[0053] Local de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco, o local de SNP é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0054] Utilização do local SNP (Polimorfismo de Nucleotídeo Único) associado ao teor de nicotina no tabaco na predição e triagem precoce do teor de nicotina no tabaco.

[0055] Utilização do local SNP (Polimorfismo de Nucleotídeo Único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco em melhoramento assistido por marcadores moleculares do tabaco.

[0056] O local de SNP (Polimorfismo de Nucleotídeo Único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco é utilizado no cultivo de tabaco com alto ou baixo teor de nicotina.

[0057] A presente invenção apresenta vantagens como à seguir: a presente invenção identifica o local de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado a marcas de teor de nicotina no tabaco, esclarece uma nova função de NtMYC2a e fornece métodos para a sua utilização, que estabelece uma base para o cultivo de tabaco com diferentes teores de nicotina. A análise GWAS baseada em SNPs é utilizada para identificar o local e genes do SNP (polimorfismo de nucleotídeos único) que controlam as marcas de teor de nicotina no tabaco e estabelecem uma base para o melhoramento genético assistido por marcadores moleculares e o melhoramento piramidal para alterar o teor de nicotina no tabaco.

[0058] A presente invenção fornece um local de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado ao teor de nicotina no tabaco e um método de análise GWAS, bem como sua utilização. O local do SNP é um local do SNP com uma mudança básica de A/G, localizado na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0059] Este local é um SNP A/G na base N° 95304 no segmento genômico N° 0002539 da versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards 2017. A presente invenção utiliza a análise GWAS baseada no SNP para identificar que o local chave que controla o teor de nicotina no tabaco é o local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0060] A identificação de tal SNP ajuda a compreender a função biológica do NtMYC2a, também estabelece paralelamente uma base para o melhoramento genético assistido por marcadores moleculares e o melhoramento piramidinário para alterar o teor de nicotina no tabaco.

[0061] A presente invenção utiliza o método de Estudo de Associação do Genoma (GWAS) para identificar o local do SNP que possui um efeito importante no teor de nicotina do tabaco de 339 materiais do tabaco. Portanto, as variedades de tabaco com elevado teor de nicotina ou baixo teor de nicotina podem ser criadas com base na assistência do referido sitio SNP pelo método convencional de cruzamento e logo retrocruzamento. Pode ser utilizado para fornecer recursos genéticos para a reprodução de tabaco com diferentes teores de nicotina, mas também para fornecer informações marcadoras para a reprodução assistida por marcadores moleculares de tabaco, acelerando o progresso na reprodução de tabaco com diferentes teores de nicotina. Sob a assistência do referido local de SNP, a presente invenção está disponivel para entrar diretamente no vinculo de melhoramento do tabaco sem métodos transgênicos.

Descrição dos Desenhos

[0062] A Figura 1 é um mapa de calor LD de SNP no cromossomo Chr8 do exemplo experimental 1 da presente invenção.

[0063] A Figura 2 é um histograma de valor de fluorescência da expressão do fragmento promotor do gene enzimático relacionado à sintese de nicotina quando o gene que contém o local de SNP do marcador molecular da invenção é hiperexpresso no exemplo experimental 3 da invenção; o quadro esquerdo mostra o valor de fluorescência da expressão do fragmento promotor do gene NtQPT2 relacionado à síntese de nicotina, em que o sinal QPT2 em abscissa se refere ao valor de fluorescência detectado no tabaco transferido por agrobacterium transformado com vetor NtQPT2 Pgreen0800 e vetor vazio pB2GW7, o sinal NtMYC2a_G + QTP2 refere-se ao valor de fluorescência detectado no tabaco transferido por agrobacterium transformado em vetor NtMYC2a_A e vetor NtQTP2 Pgreen0800, o sinal NtMYC2a_G + QTP2 refere-se ao valor de fluorescência detectado no tabaco transferido por agrobacterium transformado em vetor NtMYC2a_G + NQTP2 Pgreen0800; o quadro à direita mostra o valor de fluorescência da expressão do fragmento promotor do gene NtPMT2 da enzima relacionada à síntese de nicotina, em que o sinal PMT2 em abscissa se refere ao valor de fluorescência detectado no tabaco transferido por agrobacterium transformado com vetor NtPMT2 Pgreen0800 e vetor vazio pB2GW7, o sinal NtMYC2a_A + PMT2 refere-se ao valor de fluorescência detectado em agrobacterium transferido com vetor NtMYC2a_A e vetor NT PMT2 Pgreen0800, o sinal NtMYC2a_G + PMT2 refere-se ao valor de fluorescência detectado em tabaco transferido por agrobacterium transformado com vetor NtMYC2a_G e vetor PMT2 Pgreen0800.

[0064] A Figura 3 é uma fotografia fluorescente de fragmento genético co-expressante contendo o local de SNP do marcador molecular desta invenção com o gene NtMED25 em folhas de tabaco do exemplo experimental 4 da invenção. O lado esquerdo da folha é o resultado da fluorescência do genótipo AA co-expressante do local de SNP do marcador molecular da presente invenção, o lado direito da folha é o resultado da fluorescência do genótipo GG co-expressante do local de SNP do marcador molecular da presente invenção.

Materialização

[0065] A presente invenção será ainda ilustrada com os seguintes exemplos específicos, porém, o âmbito de proteção não limita-se a tais exemplos.

Fonte de material biológico

[0066] 339 os materiais do tabaco utilizados no exemplo experimental 1 e os 17 materiais do tabaco utilizados no exemplo experimental 2 da presente invenção são todos os recursos do germoplasma do tabaco de propriedade do requerente. O requerente promete distribuir ao público no prazo de 20 anos a contar da data de depósito da presente invenção para verificar o efeito da presente invenção.

[0067] O tabaco Honghua Daijinyuan utilizado nos exemplos experimentais 3 e 4 e o tabaco Yunyan 87 utilizado nos exemplos experimentais 3 e 4 são variedades de tabaco bem conhecidas, disponíveis comercialmente. As plantas de tabaco de Ben utilizados no exemplo experimental 3 são recursos experimentais comuns do tabaco em todo o mundo, que podem ser comprados comercialmente.

[0068] A Agrobacterium utilizada no Experimento 3 encontra-se comercialmente disponível.

O 1o grupo de exemplos: O marcador molecular da invenção

[0069] Este grupo de exemplos fornece um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 (nicas1) para identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco. Todas as materializações deste grupo possuem as seguintes caraterísticas comuns: o referido marcador molecular nicas1 para identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco dessa invenção é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do Segmento Genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017. O nucleotídeo do local de SNP é G ou A. Verifica-se que o nucleotídeo do referido local de SNP do tabaco com elevado teor de nicotina é A, e o nucleotídeo do referido local de SNP do tabaco com baixo teor de nicotina é G. Além disso, o marcador molecular nicas1 pode ser utilizado para filtrar com precisão variedades de tabaco com teor elevado ou baixo de nicotina e confirmar o seu genótipo e fenótipo. A versão do genoma do tabaco da invenção é o Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0070] Em materialização específica, as sequências de iniciadores para amplificar o marcador molecular nicas1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2:
MYC2A-F1 GTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCT (ID SEQ. N° 1),
MYC2A-R1 TGATAAAGTCAGGCGAAAACGA (ID SEQ. N° 2).

[0071] O genótipo SNP referido pode ser distinguido através da utilização de iniciadores acima através da detecção de produtos de amplificação pelo método de rotulagem KASP. Indivíduos com competências na técnica também podem utilizar outros métodos de detecção, tais como o método de rotulagem caps, etc. Ele pode conceber outros iniciadores disponíveis adequados para diferentes métodos de detecção, de acordo com o referido local de SNP.

O 2o grupo de exemplos: Kit para identificar o teor de nicotina do tabaco desta invenção

[0072] Este grupo de exemplos fornece um kit para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco. Todas as materializações neste grupo possuem as seguintes caraterísticas comuns: O kit inclui: Esse marcador molecular nicas1; o marcador molecular nicas1 é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0073] Preferencialmente, o kit inclui também: um par de iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1; preferencialmente, os iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2;

[0074] Preferencialmente, o kit inclui também: reagentes para PCR, reagentes para sequenciação e/ou reagentes para ensaio de determinação do genótipo KASP;

[0075] Preferencialmente, os reagentes para PCR incluem: dNTPs, Enzima Taq, Solução PCR, ddH2O;

[0076] Preferencialmente, os reagentes para sequenciação incluem: Tris-HCl, agarose, EB;

[0077] Preferencialmente, os reagentes para o ensaio de determinação do genótipo KASP incluem: MASTER mix KASP.

O 3o grupo de exemplos: Método para a identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco desta invenção

[0078] Este grupo de exemplos fornece um método para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco. Todas as materializações deste grupo possuem as seguintes caraterísticas comuns: Os tabacos candidatos são rastreados por esse marcador molecular nicas1; o marcador molecular nicas1 é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0079] Em materialização específica, o método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco por incluir: um par de iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são utilizados para amplificação por PCR no DNA do material de tabacos a serem testados; os iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2;

[0080] Preferencialmente, o método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco inclui também: Os produtos de amplificação PCR são submetidos a ensaios de sequenciação ou genotipagem de KASP;

[0081] Preferencialmente, os resultados do ensaio de sequenciação ou do ensaio de genotipagem de KASP mostram que os tabacos candidatos cujo genótipo do local SNP é GG, sendo um tabaco com baixo teor de nicotina;

[0082] os resultados do ensaio de sequenciação ou genotipagem do KASP mostram que os tabacos candidatos cujo genótipo do local SNP é AA, sendo um material de tabaco com elevado teor de nicotina;

[0083] Preferencialmente, o sistema de reação e o procedimento de reação para a amplificação PCR são apresentados na Tabela 1 abaixo:

[0084] Preferencialmente, o DNA do tabaco candidato é extraído de folhas, sementes, raízes, caules, flores ou frutas.

[0085] KASP é uma tecnologia amplamente conhecida na técnica. O indivíduo qualificado na técnica pode fazer a seleção e o ajuste rotineiros de acordo com as condições específicas da prática experimental com referência aos meios técnicos convencionais da técnica. Por exemplo, a "KASP Master mix" pode ser adquirida e as suas condições de reação podem seguir o registo do respectivo manual do produto. De acordo com o tamanho do fragmento dos produtos de amplificação PCR obtidos pela invenção, parâmetros adequados e condições de reação são selecionados e ajustados.

[0086] A KASP e a sequenciação de DNA são tecnologias amplamente conhecidas na técnica e também tecnologias comerciais amadurecidas no mercado atual. O indivíduo qualificado na técnica pode realizar amplificação PCR de acordo com as sequências de iniciadores reveladas na invenção, enviar o produto de amplificação para a empresa que é profissional em KASP e sequenciação de DNA para detectar o produto de amplificação PCR, a fim de obter o tamanho do fragmento ou sequência específica do produto de amplificação PCR. Se o fenótipo do tabaco candidato for de alto teor de nicotina ou de baixo teor de nicotina, é determinado de acordo com os produtos PCR amplificados com base no modelo de DNA do tabaco candidato que mostram se o genótipo do local de SNP é AA ou GG.

[0087] O indivíduo qualificado na técnica também pode usar outros métodos convencionais na técnica para detectar produtos de amplificação de PCR. Por exemplo, a amplificação PCR competitiva, a eletroforese, a sequenciação de DNA e outros métodos podem ser utilizados para obter a sequência de produtos de amplificação PCR, logo descobrir se o fenótipo do tabaco candidato é tabaco do tipo com baixo teor de nicotina ou tabaco do tipo com elevado teor de nicotina.

[0088] Em outras materializações, o instrumento de genotipagem do autor Kluster Caller pode ser utilizado para detectar a sequência de produtos PCR.

[0089] O instrumento de genotipagem do autor Kluster Caller é um instrumento comum neste campo que pode ser adquirido comercialmente e o seu funcionamento pode ser realizado de acordo com o manual do produto do instrumento.

O 4o grupo de exemplos: Método para selecionar variedades de tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina da invenção

[0090] Este grupo de exemplos fornece um método para selecionar variedades de tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina. Todas as materializações neste grupo possuem as seguintes caraterísticas comuns: o método para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina no tabaco fornecido por qualquer um dos 3o grupo de exemplos é utilizado para filtrar o tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina de tabacos candidatos.

[0091] O indivíduo qualificado na técnica pode filtrar tabacos em qualquer fase de crescimento de plantas de tabaco pelo método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, a fim de obter tabacos com índice elevado ou baixo da nicotina.

[0092] Em outras materializações, a geração F1 é obtida cruzando o tabaco selecionado com elevado ou baixo teor de nicotina como mãe feminina ou mãe masculina e tabaco necessário para ser melhorado como mãe masculina ou mãe feminina.

[0093] Preferencialmente,

[0094] as plantas da geração F2 são obtidas por plantas consanguíneas da geração F1, e as plantas da geração F2 são retrocruzadas com tabacos selecionados com índice elevado ou baixo da nicotina ou tabacos que requerem melhoramento;

[0095] preferencialmente, os tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina são rastreados a partir da população retrocruzada através do método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, de acordo com qualquer exemplo do 3o grupo, e/ou o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, de acordo com qualquer exemplo do 1o grupo, e/ou o kit para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, de acordo com qualquer exemplo do 2o grupo.

O 5o grupo de exemplos: um método para ativar os promotores genéticos de genes que envolvem a via de sintese de nicotina do tabaco dessa invenção

[0096] Este grupo de exemplos fornece um método para ativar os promotores de genes que envolvem a via de sintese de nicotina no tabaco. Todas as materializações deste grupo apresentam as seguintes carateristicas comuns: os genes que hiperexpressam o local de SNP; o local de SNP é um local de SNP de um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[0097] Em algumas materializações, a base do local de o SNP no o gene que contém o local de SNP é A ou G;

[0098] Em materializações especificas, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 7 e ID SEQ. N° 8 são utilizados para amplificar o DNA de tabacos com elevado teor de nicotina ou baixo teor de nicotina, de modo a obter uma sequência genética que contenha o local SNP;

[0099] Em materializações preferiveis, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 3 e ID SEQ. N° 4 ou ID SEQ. N° 5 e ID SEQ. N° 6 são utilizados para amplificar o DNA de tabacos para obter a sequência de genes que envolvem a via de sintese de nicotina do tabaco;

[00100] Em outras materializações, a sequência genética que contém o local de SNP está ligada ao vetor de hiperexpressão e a sequência de genes que envolvem a via de sintese de nicotina do tabaco está ligada a um vetor de expressão;

[00101] Em outras materializações, o vetor de hiperexpressão ligado à sequência de gene que contém o local SNP e o vetor de expressão ligado à sequência de gene que envolve a via de sintese de nicotina do tabaco são transformados em agrobacterium e logo transferidos para o tabaco;

[00102] Em materializações específicas, os promotores de genes que envolvem a via de sintese de nicotina são selecionados a partir de promotores dos seguintes genes: NtPMT2 e/ou NtQPT2;

[00103] Em materializações avançadas, o vetor de hiperexpressão é um vetor de hiperexpressão pB2GW7; o vetor de expressão é pGreen0800.

O 6° grupo de exemplos: um método para melhorar a interação genética desta invenção

[00104] Este grupo de exemplos fornece um método para melhorar a interação entre genes que promovem a sintese de nicotina. Todas as materializações deste grupo possuem as seguintes carateristicas comuns: os genes que promovem a sintese de nicotina são co-expressos com fragmentos de genes que contêm o local de SNP; o local do SNP é o local de um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar teores elevados ou baixos de nicotina no tabaco. O marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.

[00105] Em algumas materializações, a base do local de o SNP no o gene que contém o local de SNP é A ou G;

[00106] Preferencialmente, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 9 e ID SEQ. N° 10 são utilizados para amplificar a sequência genética promotora da sintese de nicotina;

[00107] Preferencialmente, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 11 e ID SEQ. N° 12 são utilizados para amplificar o fragmento genético que contém o local SNP;

[00108] Preferencialmente, a sequência genética amplificada que promove a síntese de nicotina e o fragmento genético que contém o local SNP, estão ligados respetivamente ao vetor de expressão para realizar a co-expressão;

[00109] Preferencialmente, um vetor de expressão ligado à sequência genética que promove a síntese de nicotina e um vetor de expressão ligado ao fragmento genético que contém o local SNP são co-transformados em tabaco;

[00110] Preferencialmente, o gene que promove a síntese de nicotina ou o gene sintetizador de promoção é NtMED25, com o vetor de expressão sendo pCAMBIA1300-cLUC ou pCAMBIA 1300-nLUC.

[00111] Comparado com o genótipo AA do local de SNP, o genótipo GG do local de SNP pode melhorar significativamente o efeito de interação com o gene NtMED25.

Exemplo experimental 1: Obtendo o marcador molecular da presente invenção

[00112] Local de SNP (Polimorfismo de Nucleotídeo Único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco, o local de SNP é um SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017. O local do SNP está localizado na base N° 259 na região codificadora do gene NtMYC2a.

[00113] O método de análise GWAS do sítio SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) associado as marcas de teor de nicotina no tabaco, incluindo as seguintes etapas:

1. O software Senteion é utilizado para detectar SNPs populacionais, obtendo-se um total de 47140188 locais de SNP;
2. Os SNPs são filtrados através de software vcftools com condições de Miss0,5, Het0,2 e maf0,05, obtendo-se por fim 6.957.682 sítios SNP de alta qualidade para posterior análise;
3. Os procedimentos de análise padrão de BreakDancer e CNVnator são utilizados para realizar a análise SVs em múltiplas populações de tabaco natural;
4. Com base na análise da estrutura populacional e da relação genética, o método do modelo linear misto é utilizado para realizar um estudo de associação genômica ampla sobre os dados fenotípicos das características do teor de nicotina no tabaco. Ao realizar um estudo de associação de âmbito genômico, os limiares de significância de associação entre todas as características testados e os locais de SNP são avaliados utilizando a seguinte fórmula: P=0,05/n, onde n é o número de SNPs detectados.

[00114] A presente invenção utiliza o SNP para classificar as caraterísticas fenotípicas de 339 sementes de tabaco GWAS, descobrindo que existem 53 tabacos com genótipo "GG" e 286 tabacos com genótipo "AA" entre 339 sementes de tabaco GWAS.

[00115] A presente invenção realizou uma análise detalhada sobre o intervalo GWAS em torno de 900kb no genoma do tabaco, constatando que esta área contém um total de 12 genes (*, **, **) e 2 blocos LD óbvios (Tabela 2, Figura 1), descobrindo um forte sinal SNP associado com caraterísticas de teor de nicotina (-logP 11,41, Nitrab4.5_0002539:95304 A/G.), que está localizado como SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017, que também se encontra em um exão do gene da proteína do fator de transcrição MYC2a (CASP) (Ga08G0117). É uma variação de SNP A-G, sendo que a variação correspondente do aminoácido é o ácido glutâmico-Lisina, indicando que essa variação de SNP de NtMYC2a pode ser uma variação fundamental que determina o teor de nicotina.

Exemplo experimental 2: Marcador molecular SNP, a presente invenção identifica tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina Determinação do teor de nicotina nas folhas de tabaco

[00116] O teor de nicotina em tabacos foi detectado de acordo com a norma YC/T 160-2002. Os materiais de tabaco selecionados foram plantas de tabaco não transgênicas e plantas de tabaco transgênico com fenótipos de desenvolvimento semelhantes, todos em fase de crescimento vigoroso, o tabaco tipo selvagem K326 foi utilizado como controle. As folhas superiores, médias e inferiores de 5 plantas de tabaco não transgênico e plantas de tabaco transgênico foram consideradas como um grupo. Para o outro grupo, foram cobertas 5 plantas de tabaco não transgênico e plantas de tabaco transgênico, e as folhas superiores, médias e inferiores das plantas de tabaco não transgênico e das plantas de tabaco transgênico.

[00117] As amostras de tabaco foram extraídas com solução aquosa de ácido acético a 5%. Os alcalóides totais (calculados como nicotina) no extrato reagiram com ácido sulfônico de p-amino benzeno e cloreto de cianogênio, que foi produzido pela reação em linha do cianeto de potássio e da cloramina T. Os produtos de reação foram medidos a 4 60 nm com um colorímetro.

[00118] Principais instrumentos e equipamento: Analisador de fluxo contínuo (American API) (GERMAN SEAL AA3) (French ALLIANCE).

Preparação do reagente:

[00119] Solução tampão A: 2,35g cloreto de sódio (NaCl) e 7,60g de borato de sódio (Na2a4O3.10H2O) foram pesados dissolvidos com água, transferidos para um balão volumétrico de 1L, logo adicionou-se 1ml Brij 35 diluído a 1L com água destilada, filtrado com papel de filtro qualitativo antes da utilização.

[00120] Solução tampão B: Foram pesados 26 g de hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4), 10,4 g de ácido cítrico [COH (COOH) (CH2COOH) 2 .H2O] , 7 g de ácido sulfônico de p-amino benzeno (NH2C6H4SO3H) e dissolvidos com água, transferido para um balão volumétrico de 1L, logo adicionou-se 1ml Brij 35 diluído a 1L com água destilada, filtrado com papel de filtro qualitativo antes da utilização.

[00121] Solução de cloramina T (sal de sódio N-cloro-4-metilfeniltioamida) [CH3C6H4SO2N (Na) Cl-3H2O] : 8,65g de cloramina T foi dissolvido em água, transferida para um balão volumétrico de 500ml, volume fixo pela adição de água e filtrada com papel de filtro qualitativo antes da utilização.

[00122] 0,22 mol/L de solução NaOH:NaOH 8,8g, Na2HPO4 26,0g, C6H8O7.H2O (ácido cítrico monohidratado) foram dissolvidos com água até 1000ml.

[00123] Solução de ácido sulfônico de P-aminobenzeno: C6H7NO3S (ácido sulfônico p-amino benzeno) 7g, Na2HPO4 26,0 g e C6H8O7.H2O (ácido cítrico monohidratado) 10,4 g foram dissolvidos com água até 1000 ml.

[00124] Cloramina T: A cloramina T 1,2g foi dissolvida com água pura até 100ml e armazenada em frasco de reagente castanho.

[00125] Cianeto de potássio: KCN 0,4g foi dissolvido com água pura a 100ml.

[00126] Solução NACO3 : 10G de NaCO3 foi dissolvido com água destilada a 1000ml.

[00127] Etapas da análise: 0,3 g de tabaco foi colocado em frasco triangular de 150 ml ou frasco de plástico (com uma precisão de 0,0001 g), foram adicionados 50 ml de solução de ácido acético a 5% em um frasco triangular ou frasco de plástico com tampa de rolha; o frasco triangular ou o frasco plástico foram agitados e extraídos em uma mesa de agitação ordinária por 30min, com o controle de rotação a 170 R/min. O extrato foi filtrado com papel de filtro e detectado pelo instrumento. (É necessária diluição se a concentração da solução da amostra exceder o intervalo de concentração da solução-padrão de trabalho).

Cálculo e expressão dos resultados:

[00128] O teor de alcalóides totais em base seca é obtido a partir da seguinte fórmula:

Onde:
C -- valor de observação dos alcalóides totais na solução da amostra, unidade: mg/ml;
V -- volume do extrato, unidade: ml;
M -- massa da amostra, unidade: Mg;
W -- teor de umidade da amostra, unidade: %.

[00129] O valor médio de dois valores detectados é considerado como resultado da determinação, sendo o resultado exato de 0,01%.

[00130] Nesta divulgação, os tabacos com teor de nicotina > 20 mg/g são tabacos com elevado teor de nicotina cujo genótipo é AA;

[00131] Tabacos com teor de nicotina d 20 mg/g são tabacos com baixo teor de nicotina cujo genótipo é GG.

[00132] Outros 17 tabacos candidatos foram verificados com o uso do marcador molecular da invenção, e os resultados de identificação estão apresentados na Tabela 2 abaixo:
Tabela 2

[00133] Através da detecção do marcador molecular nicas1 e do método de identificação da invenção, entre 17 tabacos candidatos, todos os 17 tabacos são consistentes com o genótipo e o fenótipo, onde 9 tabacos são do genótipo AA e 8 tabacos são do genótipo GG. O marcador SNP e o método da invenção identificam tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina com precisão de até 100%.

Exemplo experimental 3: A hiperexpressão do gene do sítio SNP ativa o promotor do gene enzimático relacionado à síntese de nicotina

[00134] fragmento do promotor do gene NtPMT2 do tabaco foi clonado com o iniciador PMT2_Pgreen_0800_F gtcgacggtatcgataagcttAGTATTCAAGGTATCTAAC (ID SEQ. N° 3) e PMT2_Pgreen_0800_R o iniciador cgctctagaactagtggatccTTTCAAAATTAAACTAAAC (ID SEQ. N° 4), logo o fragmento foi clonado no vetor fluorescente pGreen0800. A sequência do promotor do gene NtQPT2 foi clonada com o iniciador QPT2_Pgreen_0800_F gtcgacggtatcgataagcttGAAACTATAAATAGCTAAG (ID SEQ. N° 5) e o iniciador QPT2_Pgreen_0800_R cgctctagaactagtggatccGGTTTATTTTCTTGGGGCT (ID SEQ. N° 6), logo clonado no vetor pGreen0800 novamente.

[00135] cDNA de Honghua Daijinyuan e Yunyan 87 foram amplificados com respectivamente NtMYC2a_F iniciador
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT GCATGACGGATTATAGAATACC AAC (ID SEQ. N° 7) e
NtMYC2a_R iniciador
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATCGCGATTCAGCAATTCT GGATG (ID SEQ. N° 8), e sequências gênicas de NtMYC2a de diferentes genótipos foram obtidas, onde o genótipo do local SNP de Honghua Daijinyuan era A e o genótipo do local SNP de Yunyan 87 era G. Dois fragmentos foram clonados no vetor PDONR-Zeo pela reação do portal BP. O fragmento de sequência foi finalmente introduzido no vetor de hiperexpressão pb2gw7 pela reação LR. Logo, foi adotado para esses vetores, que foram transformados em agrobacterium, o método de transformação quimica. Os mono-clones de agrobacterium foram colhidos e cultivados em 2 ml de meio liquido de resistência durante a noite, e 2 ml de caldo foram colocados em meio de resistência de 50 ml para cultivo no dia seguinte, os sedimentos de agrobacterium foram coletados até atingir o valor OD de 0,6.

[00136] A injeção de agrobacterium é preparada de acordo com a seguinte combinação na Tabela 3:

[00137] Folhas de 14 dias de idade das plantas de tabaco de Ben foram injetadas pelo método de transformação instantânea, o tabaco de Ben injetado foi mantido afastado da luz por 24 horas, e restaurado à cultura sob luz por 48 horas. O material retirado acima do tabaco de Ben foi posto em um tubo EP de 1,5 ml, com 2 esferas de aço com um diâmetro de 0,5 cm adicionadas, abaladas e esmagadas a 60 Hz durante 30 segundos a temperaturas ultrabaixas; 100 μL dee lisado PLB foi adicionado aos pós esmagados, vibrado por vibração de vórtice durante 10 segundos para dissolução rápida, de modo a extrair a proteína total; centrifugado a 4°C por 13000 rpm 10 segundos e 8pL de sobrenadante absorvido e adicionado a outro tubo de EP, e adicionado 40pl LARIIis, misturado suavemente, sendo detectado pela primeira vez por espetrofotômetro de fluorescência; após a detecção, foi adicionado 40 pL de Stop&GloReagent, misturado gentilmente e realizado novamente a detecção de fluorescência; foi encontrado registrando e comparando o valor de detecção que NtMYC2a_A mais siginificantemente do que NtMYC2a_G para ativar os promotores de NtPMT2 e NtQPT2 do tabaco (Figura 2). Comprovou-se, por meio de relatório, que os genes NtPMT2 e NtQPT2 são duas enzimas-chave na via de síntese de nicotina, e a ativação sobre os promotores desses dois genes-chave da enzima está significativamente positivamente correlacionada com a síntese e o conteúdo de nicotina. Em outras palavras, indivíduos qualificados na técnica podem esperar que o teor de nicotina aumente com a ativação de promotores desses dois genes-chave de enzimas. Portanto, tal exemplo experimental também demonstra que a hiperexpressão do gene que contém o local do SNP da invenção pode ativar duas enzimas-chave positivamente relacionadas à síntese de nicotina, e quando o local do SNP é A, o grau de ativação é significativamente maior do que quando o local de SNP é G (Figura 2).

Exemplo experimental 4: O marcador molecular da invenção melhora o efeito de interação com NtMED25

[00138] NtMED25 pode promover a síntese de nicotina. Este exemplo experimental verifica a influência de diferentes genótipos do local de SNP da invenção na força de ligação do NtMED25, e prova que o genótipo AA do local de SNP da invenção pode se ligar e interagir com o gene NtMED25 mais fortemente que o genótipo GG, influenciando significativamente o conteúdo de nicotina. A sequência de comprimento completo de NtMED25 foi clonada com os iniciadores NtMED25 F: AAGGTACCatgtgtaaaaatgcgttgggagctg (ID SEQ. N° 9) e NtMED25 R: R:AAGTCGACgggcatgtttggcagtcctcgtgaa (ID SEQ. N° 10), logo clonado em vetor 1300 nLUC. Dois fragmentos de NtMYC2 A/G foram clonados, respetivamente, com NtMYC2 F: TTGGTACCatgacggactatagaataccaacgatgacta (ID SEQ. N° 11) e NtMYC2 R: AAGTCGACtcgcgattcagcaattctggatgtcaatgat (ID SEQ. N° 12), logo ligado respectivamente ao vetor pCAMBIA13 0 0-cLUC para obter o vetor de expressão NtMYC2 A/G 1300-cLUC e o vetor de expressão NtMED25 1300-nLUC. O vetor de expressão NtMYC2 A/G 1300-cLUC e o vetor de expressão NtMED25 1300-nLUC são co-transformados em folhas de tabaco de Ben, e a intensidade de fluorescência foi observada 3 dias depois. O resultado é mostrado conforme a Figura 3. É demonstrado pelo resultado que, fragmento de SNP do genótipo AA interage com NtMED25 de forma mais forte com fluorescência mais brilhante. Por outro lado, o fragmento SNP do genótipo GG interage com o NtMED25 mais fraco com a fluorescência mais escura. O quadro à esquerda da figura 3 mostra a interação do genótipo AA, e o quadro à direita da figura 3 mostra a interação do genótipo GG.

Exemplo experimental 5: Uso de local de SNP em reprodução

[00139] Com o propósito de identificar posteriormente o uso do local de SNP na reprodução, neste exemplo, a variedade de tabaco com grande índice de nicotina de Honghua dajinyuan (teor de nicotina de 21,4mg/g e genótipo AA) foi hibridizada com a variedade de tabaco com baixo índice de nicotina de Yunyan 87 (teor de nicotina de 9,4mg/g e genótipo GG), sendo que as sementes de F1 colhidas foram plantadas. Foram detectados genótipo e teor de nicotina na população F2 e F1. O genótipo foi detectado pelo método de marcação KASP e os iniciadores de detecção foram MYC2a-F1 GTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCT (ID SEQ. 1), MYC2a-R1 TGATAAAGTCAGGCGAAAACGA (ID SEQ. 2).

[00140] Houveram 54 cepas com genótipo GG na população F2, e todos apresentaram teores de nicotina superiores a 20 mg/g. Os resultados experimentais mostram que a acurácia da detecção do genótipo e fenótipo da população F2 com o local do SNP da invenção ainda atinge 100%.

Claims

Marcador Molecular de Nicotina Associado ao SNP 1 para identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, caracterizado pelo fato de que é um local de SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do Segmento Genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.
Marcador Molecular de Nicotina Associado ao SNP 1 para identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um par de iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificação do teor de nicotina do tabaco são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2.
Kit de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, caracterizado pelo fato de que um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1, o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.
Kit de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por incluir também: um par de iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1; e/ou, os iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2;
e/ou o kit inclui também: reagentes para PCR, reagentes para sequenciação e/ou reagentes para ensaio de determinação do genótipo KASP;
e/ou os reagentes para PCR incluem: dNTPs, Enzima Taq, Solução PCR, ddH2O;
e/ou, os reagentes para sequenciação incluem: Tris-HCl, agarose, EB;
e/ou, os reagentes para o ensaio de determinação do genótipo KASP incluem: MASTER mix KASP.
Método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, caracterizado pelo fato de que um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1, é usado para selecionar tabacos candidatos; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é um local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017.
Método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por incluir: um par de iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são utilizados para amplificação por PCR no DNA de tabacos candidatos; os iniciadores específicos para o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 são apresentados como ID SEQ. N° 1 e ID SEQ. N° 2;
e/ou o método de identificação do teor elevado ou nível elevado de nicotina no tabaco inclui também: os produtos PCR são submetidos a ensaios de sequenciação ou genotipagem de KASP;
e/ou, os resultados do ensaio de sequenciação ou do ensaio de genotipagem de KASP mostram que os tabacos candidatos cujo genótipo do local SNP é GG, sendo um tabaco com baixo teor de nicotina;
os resultados do ensaio de sequenciação ou genotipagem do KASP mostram que os tabacos candidatos cujo genótipo do local SNP é AA, sendo um tabaco com elevado teor de nicotina;
e/ou, o sistema de reação PCR inclui:
modelo 0,02μL/ μL, iniciador de avanço 0,02μL/ μL, iniciador reverso 0,02μL/ μL, 5xsolução 0,2μL/ μL, mistura dNTP 0,02μL/ μL, polimerase de DNA 0,02μL/μL, com o resto de água;
o programa de reação de amplificação PCR inclui: 98°C 5 min.; tomar 98°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s como 1 ciclo, um total de 35 ciclos; 72°C 5 min.;
e/ou o DNA do tabaco candidato é extraídode folhas, sementes, raizes, caules, flores ou frutas.
Método para a reprodução de variedades de tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina, caracterizado pelo fato de que os tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina provenientes de tabacos candidatos são rastreados utilizando o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, e/ou o kit de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, conforme definido na reivindicação 3 ou 4, e/ou o método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, conforme definido na reivindicação 5 ou 6.
Método para a reprodução de variedades de tabaco com elevado ou baixo teor de nicotina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tabaco com elevado teor de nicotina é selecionado como progenitor feminino ou progenitor masculino, o tabaco necessário para ser melhorado é tomado como progenitor masculino ou progenitor feminino, a geração F1 é obtida através da travessia do progenitor feminino e do progenitor masculino;
e/ou, as plantas da geração F2 são obtidas por plantas consanguineas da geração F1, e as plantas da geração F2 são retrocruzadas com tabacos selecionados com indice elevado ou baixo da nicotina ou tabacos que requerem melhoramento;
e/ou os tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina são rastreados a partir da população retrocruzada através do método de identificação do teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, conforme definido na reivindicação 5 ou 6, e/ou o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, e/ou o kit para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco, conforme definido na reivindicação 3 ou 4.
Método para ativar os promotores de genes que envolvem a via de síntese de nicotina do tabaco, caracterizado pelos genes que hiperexpressam o local de SNP; o local de SNP é um local de SNP de um marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é o local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017;
e/ou, a base do local SNP no gene que contém o local SNP é A ou G;
e/ou, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 7 e ID SEQ. N° 8 são utilizados para amplificar o DNA de tabacos com elevado ou baixo teor de nicotina, de modo a obter uma sequência genética que contenha o local SNP;
e/ou, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 3 e ID SEQ. N° 4 ou ID SEQ. N° 5 e ID SEQ. N° 6 são utilizados para amplificar o DNA de tabacos para obter a sequência promotora de genes que envolvem a via de síntese de nicotina do tabaco;
e/ou, a sequência genética que contém o local de SNP está ligada ao vetor de hiperexpressão e a sequência de genes que envolvem a via de síntese de nicotina do tabaco está ligada ao vetor de expressão;
e/ou, o vetor de hiperexpressão que liga a sequência genética que contém o local do SNP e o vetor de expressão que liga a sequência do gene que envolve a via de síntese de nicotina do tabaco são transformados em agrobacterium e depois transferidos para o tabaco;
e/ou, os promotores de genes que envolvem a via de sintese de nicotina são selecionados a partir de promotores dos seguintes genes: NtPMT2 e/ou NtQPT2;
e/ou, o vetor de hiperexpressão é o vetor de hiperexpressão pB2GW7; o vetor de expressão é pGreen0800.
Método de reforço da interação com o gene que promove a síntese de nicotina, caracterizado pelo fato de que os genes que promovem a sintese de nicotina e os fragmentos de genes que contêm o local SNP são co-expressos; o local SNP é um local SNP de um marcador molecular à nicotina associado ao SNP 1 para identificar o teor elevado ou baixo de nicotina do tabaco; o marcador molecular de nicotina associado ao SNP 1 é o local SNP Nitab4.5_0002539:95304 A/G na base N° 95304 do segmento genômico N° 0002539 na versão do genoma do tabaco de Nitab v4.5 Genome Scaffolds Edwards2017;
e/ou, a base do local SNP no o gene que contém o local SNP é A ou G;
e/ou, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 9 e ID SEQ. N° 10 são utilizados para amplificar a sequência do gene que promove a sintese de nicotina;
e/ou, os iniciadores apresentados como ID SEQ. N° 11 e ID SEQ. N° 12 são utilizados para amplificar o fragmento genético que contém o local SNP;
e/ou, ligando respetivamente a sequência do gene que promove a sintese de nicotina e o fragmento genético que contém o local SNP, estão ligados respetivamente ao vetor de expressão para realizar a co-expressão;
e/ou, o vetor de expressão ligado à sequência do gene que promove a sintese de nicotina e o vetor de expressão ligado ao fragmento genético que contém o local SNP são tabaco transformado em co-transformação;
e/ou, o gene que promove a sintese de nicotina é NtMED25, com o vetor de expressão sendo pCAMBIA1300-cLUC ou pCAMBIA 1300-nLUC.