BR102021026042A2

BR102021026042A2 - KIT, METHOD FOR DIAGNOSIS OF VISCERAL LEISHMANIASIS AND COINFECTION WITH HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUSES, AND USES

Info

Publication number: BR102021026042A2
Application number: BR102021026042-4A
Authority: BR
Inventors: Eduardo Antonio Ferraz Coelho; Thaís Teodoro De Oliveira Santos; Isabela Amorim Gonçalves Pereira; Grasiele De Sousa Vieira Tavares; Fernanda Fonseca Ramos; Fernanda Ludolf Ribeiro De Melo; João Augusto Oliveira Da Silva; Thiago Alves Rosa Dos Reis
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-07-04

Abstract

A presente tecnologia trata de kit e método contendo uma proteína recombinante para emprego no diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral e da coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). The present technology deals with a kit and method containing a recombinant protein for use in the laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis and co-infection with the human immunodeficiency virus (HIV).

Description

KIT, METHOD FOR DIAGNOSIS OF VISCERAL LEISHMANIASIS AND COINFECTION WITH HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUSES, AND USES

[01] A presente tecnologia trata de kit e método contendo uma proteína recombinante para emprego no diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral e da coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV).[01] This technology deals with a kit and method containing a recombinant protein for use in the laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis and co-infection with the human immunodeficiency virus (HIV).

[02] As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias endêmicas em 98 países e três territórios distribuídos em regiões tropicais e subtropicais no mundo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, cerca de 90% dos casos ocorrem no Afeganistão, Argélia, Arábia Saudita, Irã, Sudão, Síria, Brasil e Peru. Estima-se que 380 milhões de pessoas encontram-se expostas ao risco de contrair a doença e que haja uma incidência aproximada de 0,5 a 1,0 e 1,5 a 2,0 milhões de novos casos por ano de leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT), respectivamente. No Continente Americano, calcula-se que o Brasil seja responsável por aproximadamente 95% dos casos de LV, o que torna a doença um importante problema de Saúde Pública e que requer, dessa forma, uma atenção especial pelas autoridades competentes.[02] Leishmaniasis are infectious and parasitic diseases endemic in 98 countries and three territories distributed in tropical and subtropical regions of the world. According to the World Health Organization, about 90% of cases occur in Afghanistan, Algeria, Saudi Arabia, Iran, Sudan, Syria, Brazil and Peru. It is estimated that 380 million people are exposed to the risk of contracting the disease and that there is an approximate incidence of 0.5 to 1.0 and 1.5 to 2.0 million new cases per year of visceral leishmaniasis ( LV) and tegumentary leishmaniasis (LT), respectively. In the American Continent, it is estimated that Brazil is responsible for approximately 95% of VL cases, which makes the disease an important Public Health problem and therefore requires special attention by the competent authorities.

[03] A gravidade da doença no hospedeiro mamífero, no qual se enquadram o homem e o cão, alcança desde uma lesão cutânea única, no local da picada, até a forma visceral da doença, que pode ser fatal quando na forma aguda e não tratada. O cão é considerado o principal reservatório doméstico do parasita e é tido como uma importante fonte de transmissão entre o vetor flebotomíneo e o hospedeiro mamífero. Devido à ineficácia das medidas de controle utilizadas, da dificuldade para um diagnóstico correto e dos problemas de toxicidade relacionados aos tratamentos convencionais; o desenvolvimento de vacinas que sejam capazes de induzir imunidade protetora contra a doença torna-se desejável.[03] The severity of the disease in the mammalian host, which includes humans and dogs, ranges from a single skin lesion at the bite site to the visceral form of the disease, which can be fatal when in the acute form and not treated. The dog is considered the main domestic reservoir of the parasite and is considered an important source of transmission between the sandfly vector and the mammalian host. Due to the ineffectiveness of the control measures used, the difficulty in making a correct diagnosis and the toxicity problems related to conventional treatments; the development of vaccines capable of inducing protective immunity against the disease becomes desirable.

[04] O diagnóstico das leishmanioses é dificultado pela semelhança dos sintomas clínicos com outras doenças, também comuns em nosso meio. Em paralelo, testes laboratoriais baseiam-se na detecção de antígenos e/ou anticorpos específicos aos parasitas em amostras de soro dos pacientes. Nesses casos, a Análise de Imunoadsorção por Ligação Enzimática (ELISA), a Reação de Imunofluorescência Indireta (IFAT) e o Teste de Aglutinação Direta (DAT) são utilizados, porém, dentre alguns problemas relatados, não apresentam a capacidade de diferenciar pacientes com a doença subclínica, com a doença na forma ativa ou com a mesma já curada.[04] The diagnosis of leishmaniasis is made difficult by the similarity of clinical symptoms with other diseases, also common in our country. In parallel, laboratory tests are based on the detection of antigens and/or antibodies specific to the parasites in serum samples from patients. In these cases, the Enzyme-Linked Immunosorption Analysis (ELISA), the Indirect Immunofluorescence Reaction (IFAT) and the Direct Agglutination Test (DAT) are used, however, among some problems reported, they do not have the ability to differentiate patients with the subclinical disease, with the disease in the active form or with it already cured.

[05] No caso da LV canina (LVC), o diagnóstico apresenta-se dificultado por fatores como a especificidade e/ou sensibilidade variáveis dos antígenos utilizados. Nesse caso, a ocorrência de um elevado número de resultados falso-positivos em animais saudáveis, porém, residentes em áreas endêmicas da doença, bem como em animais portando outras doenças, tais como doença de Chagas, babesiose, toxoplasmose, rickettsiose e ehrlichiose; e a ocorrência de resultados falso-negativos, como em animais infectados, porém, com baixos títulos de anticorpos anti-Leishmania; têm criado grandes dificuldades para a interpretação correta dos testes sorológicos nos animais.[05] In the case of canine VL (CVL), the diagnosis is made difficult by factors such as specificity and/or variable sensitivity of the antigens used. In this case, the occurrence of a high number of false-positive results in healthy animals, however, living in endemic areas of the disease, as well as in animals with other diseases, such as Chagas disease, babesiosis, toxoplasmosis, rickettsiosis and ehrlichiosis; and the occurrence of false-negative results, as in infected animals, however, with low titers of anti-Leishmania antibodies; have created great difficulties for the correct interpretation of serological tests in animals.

[06] Nas últimas décadas, fatores têm influenciado o aumento da incidência de casos de leishmanioses, sendo alguns deles: o aumento do desflorestamento e urbanização crescente nestas áreas, aquecimento global e migração de pessoas que levam seus cães infectados de áreas onde o vetor se encontra presente para outras áreas. A Leishmaniose Tegumentar (LT) inclui-se no quadro das grandes endemias, sendo encontrada em todas as regiões brasileiras apresentando ampla distribuição, desta forma, é considerada uma das afecções dermatológicas que merece mais atenção pelas autoridades de saúde pública, pelo risco de ocorrência de deformidades que podem acometer o homem, causando sua morbidade. No Brasil, a LT é causada principalmente pela espécie Leishmania braziliensis, enquanto a LV é causada pela espécie Leishmania infantum. No ano de 2012, foram registrados 3.392 casos da doença, tendo um período de incubação que pode levar de seis meses a alguns anos e os indivíduos acometidos apresentam sinais de uma infecção sistêmica e persistente, que inclui febre, fadiga, fraqueza, perda de peso, hepatoesplenomegalia e inchaço dos gânglios linfáticos. Os sintomas são progressivos e as complicações decorrentes da evolução da infecção são responsáveis pelos óbitos, sendo que, no geral, a LV é considerada a infecção mais grave do que os demais tipos da doença, pois se não tratada precocemente se torna uma doença fatal.[06] In recent decades, factors have influenced the increase in the incidence of cases of leishmaniasis, some of them being: increased deforestation and increasing urbanization in these areas, global warming and migration of people who take their infected dogs from areas where the vector is finds present for other areas. Tegumentary Leishmaniasis (LT) is included in the framework of the major endemic diseases, being found in all Brazilian regions with a wide distribution. deformities that can affect men, causing their morbidity. In Brazil, LT is mainly caused by the species Leishmania braziliensis, while VL is caused by the species Leishmania infantum. In 2012, 3,392 cases of the disease were registered, with an incubation period that can take from six months to a few years and affected individuals show signs of a systemic and persistent infection, which includes fever, fatigue, weakness, weight loss , hepatosplenomegaly and swollen lymph nodes. The symptoms are progressive and the complications resulting from the evolution of the infection are responsible for the deaths, and, in general, VL is considered a more serious infection than the other types of the disease, because if not treated early, it becomes a fatal disease.

[07] A evolução clínica das leishmanioses é determinada, principalmente, pela espécie infectante do parasita e pela imunidade do hospedeiro. Sendo o cão um importante reservatório doméstico dos parasitos, a infecção canina também merece atenção especial, pois apresenta uma maior soroprevalência quando comparada à doença humana e pelo fato de que muitos animais infectados, e que ainda se apresentam assintomáticos, podem transmitir o parasito aos hospedeiros mamíferos não infectados. Sendo assim, um diagnóstico precoce desses animais é de extrema importância, pois segundo o programa de controle da doença no Brasil, o número de cães infectados na América do Sul se encontra na faixa dos milhões, sendo no Brasil e na Venezuela as maiores taxas registradas.[07] The clinical course of leishmaniasis is mainly determined by the infecting parasite species and host immunity. Since the dog is an important domestic reservoir of the parasites, canine infection also deserves special attention, as it has a higher seroprevalence when compared to the human disease and because many infected animals, which are still asymptomatic, can transmit the parasite to their hosts. uninfected mammals. Therefore, an early diagnosis of these animals is extremely important, since according to the disease control program in Brazil, the number of infected dogs in South America is in the millions, with Brazil and Venezuela having the highest rates recorded. .

[08] O diagnóstico das leishmanioses é realizado com base na avaliação clínica em conjunto com exames laboratoriais. Testes parasitológicos demonstram a presença do parasito pela visualização das formas amastigotas em aspirados, sendo necessário realizar uma punção aspirativa, que é considerada invasiva e cuja sensibilidade depende da presença de parasitas no material coletado. Também pode ser realizada amplificação do DNA do parasito por PCR, porém, há problemas que reduzem a sensibilidade dos testes devido à possibilidade de a porção coletada do material não apresentar quantidade suficiente de parasito, há também necessidade de padronização e treinamento, dado à possibilidade de contaminação com agentes externos e ao seu elevado custo. Outro método que pode ser utilizado é o cultivo em meios de cultura e inoculação das biópsias em animais de laboratório susceptíveis, porém, esta técnica requer mais tempo para execução e obtenção de resultados tornando-se, então, inviável.[08] The diagnosis of leishmaniasis is based on clinical evaluation in conjunction with laboratory tests. Parasitological tests demonstrate the presence of the parasite by viewing the amastigotes in aspirates, requiring an aspiration puncture, which is considered invasive and whose sensitivity depends on the presence of parasites in the collected material. Amplification of the parasite DNA by PCR can also be performed, however, there are problems that reduce the sensitivity of the tests due to the possibility that the collected portion of the material does not present a sufficient amount of parasite, there is also a need for standardization and training, given the possibility of contamination with external agents and its high cost. Another method that can be used is cultivation in culture media and inoculation of biopsies in susceptible laboratory animals, however, this technique requires more time to perform and obtain results, thus becoming unfeasible.

[09] Todos esses métodos apresentam limitações em sua sensibilidade, devido à distribuição do parasito não ser homogênea e a coleta dos materiais ocorrer de forma invasiva; dificultando sua utilização na prática rotineira. O diagnóstico sorológico apresenta-se como importante ferramenta, haja vista que a coleta de sangue é considerada pouco invasiva e a técnica não exige treinamento específico e mão-de-obra especializada.[09] All these methods have limitations in their sensitivity, due to the distribution of the parasite not being homogeneous and the collection of materials occurs in an invasive way; hindering its use in routine practice. The serological diagnosis is presented as an important tool, given that blood collection is considered little invasive and the technique does not require specific training and specialized labor.

[10] A técnica de ELISA apresenta melhores valores de sensibilidade e especificidade. Essa técnica é considerada uma ferramenta importante para o diagnóstico da LT e monitoramento da exposição dos indivíduos em áreas endêmicas da doença. Geralmente, esses testes utilizam antígenos obtidos de frações brutas e/ou moléculas semi-purificadas do parasito, bem como proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintéticos derivados dos mesmos. Essa técnica permite o melhoramento da especificidade, com o objetivo de diferenciar os pacientes com LV daqueles com doença de Chagas, malária, tuberculose, dentre outras doenças que apresentam clínica similar e reatividade cruzada.[10] The ELISA technique has better sensitivity and specificity values. This technique is considered an important tool for diagnosing TL and monitoring the exposure of individuals in disease-endemic areas. Generally, these tests use antigens obtained from crude fractions and/or semi-purified molecules of the parasite, as well as recombinant proteins and/or synthetic peptides derived from them. This technique allows the improvement of specificity, with the aim of differentiating patients with VL from those with Chagas disease, malaria, tuberculosis, among other diseases that present similar clinical features and cross-reactivity.

[11] Outras razões para que a ELISA tenha um enorme potencial como método de diagnóstico é a possibilidade de inovações tecnológicas que melhorem sua efetividade. O uso de frações sub-celulares, de novos substratos para detecção e o emprego de proteínas recombinantes têm permitido melhorias na técnica, com vistas ao aumento de sua sensibilidade e especificidade. Atualmente, a proteína recombinante mais importante no diagnóstico da LV é a rK39, que tem sido empregada para o diagnóstico de pacientes e para estudos epidemiológicos com humanos e cães. No entanto, sua validação para detecção dos casos de infecção por L. infantum tem variado de acordo com a cepa e o cultivo dos parasitos, a produção da proteína recombinante e a variabilidade clínica e sorológica dos pacientes, além da variabilidade genética observada entre cepas diferentes da mesma espécie, principalmente quando se avalia cepas isoladas de localizações distantes. Dessa forma, um teste sorológico ideal para o diagnóstico da LV deveria ser baseado no uso de antígenos que sejam reconhecidos por amostras de soros de todos os pacientes infectados, independente da sintomatologia clínica e dos níveis de anticorpos antileishmaniais existentes e, ao mesmo tempo, não serem reconhecidos por indivíduos não infectados pelo parasita Leishmania.[11] Other reasons why ELISA has enormous potential as a diagnostic method is the possibility of technological innovations that improve its effectiveness. The use of sub-cellular fractions, new substrates for detection and the use of recombinant proteins have allowed for improvements in the technique, with a view to increasing its sensitivity and specificity. Currently, the most important recombinant protein in the diagnosis of VL is rK39, which has been used for the diagnosis of patients and for epidemiological studies with humans and dogs. However, its validation for detecting cases of infection by L. infantum has varied according to the strain and culture of the parasites, the production of the recombinant protein and the clinical and serological variability of the patients, in addition to the genetic variability observed between different strains of the same species, especially when evaluating strains isolated from distant locations. Thus, an ideal serological test for the diagnosis of VL should be based on the use of antigens that are recognized by sera samples from all infected patients, regardless of clinical symptomatology and existing antileishmanial antibody levels and, at the same time, do not recognized by individuals not infected by the Leishmania parasite.

[12] Em adição, quando da coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), a sensibilidade dos kits de diagnóstico para a LV cai drasticamente (de 95% para cerca de 40%), e tais indivíduos acabam não sendo corretamente diagnosticados.[12] In addition, when co-infected with the human immunodeficiency virus (HIV), the sensitivity of diagnostic kits for VL drops dramatically (from 95% to about 40%), and such individuals end up not being correctly diagnosed.

[13] Para o sorodiagnóstico da LV canina, a existência de títulos elevados de anticorpos específicos às proteínas do parasita é uma característica importante da doença, e a geração de uma elevada resposta humoral tem sido relacionada com o desenvolvimento da doença. Porém, a especificidade dos testes empregando extratos é prejudicada, uma vez que há ocorrência de reação cruzada dos anticorpos com proteínas expressas em outros patógenos, tais como em tripanossomatídeos, na esquistossomose, além da ocorrência de um número elevado de resultados falso-positivos em animais que residem em áreas endêmicas da doença, mas não são infectados por Leishmania.[13] For the serodiagnosis of canine VL, the existence of high titers of antibodies specific to parasite proteins is an important characteristic of the disease, and the generation of a high humoral response has been related to the development of the disease. However, the specificity of tests using extracts is impaired, since there is cross-reaction of antibodies with proteins expressed in other pathogens, such as trypanosomatids, in schistosomiasis, in addition to the occurrence of a high number of false-positive results in animals residing in areas endemic to the disease, but not infected by Leishmania.

[14] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia utilizando a proteína da presente tecnologia, a qual foi selecionada para emprego na detecção da LV e coinfecção com o HIV. A proteína recombinante, que foi identificada no estágio promastigota em distintas espécies de Leishmania capazes de causar LT e LV, foi clonada, expressa, purificada e avaliada em experimentos de ELISA contra elevado painel de amostras de soro caninos e humanos. Kits comerciais e preparações antigênicas de parasitas foram usadas como controles, e a proteína mostrou melhor desempenho tanto para a leishmaniose canina quanto humana, com valores de sensibilidade e especificidade de 100% para identificar as duas formas clínicas da doença. A proteína também apresentou maiores valores preditivos positivos e negativos e melhor eficácia diagnóstica, quando comparado aos kits EIE-CVL® e Kalazar Detect™ Rapid Test, usados para detecção da LV no cão e homem, respectivamente, além dos extratos proteicos de L. braziliensis e L. infantum. A proteína também reconheceu de forma bastante satisfatória pacientes com LV e com a coinfecção LV/HIV.[14] In the state of the art, no technology was found using the protein of the present technology, which was selected for use in the detection of VL and co-infection with HIV. The recombinant protein, which was identified at the promastigote stage in different Leishmania species capable of causing LT and VL, was cloned, expressed, purified and evaluated in ELISA experiments against a large panel of canine and human serum samples. Commercial kits and parasite antigenic preparations were used as controls, and the protein showed better performance for both canine and human leishmaniasis, with sensitivity and specificity values of 100% to identify the two clinical forms of the disease. The protein also showed higher positive and negative predictive values and better diagnostic efficacy, when compared to the EIE-CVL® and Kalazar Detect™ Rapid Test kits, used to detect VL in dogs and humans, respectively, in addition to protein extracts from L. braziliensis and L. infantum. The protein also recognized patients with VL and with VL/HIV co-infection quite satisfactorily.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[15] A Figura 1 representa a avaliação diagnóstica para leishmaniose visceral canina. Os ensaios de ELISA foram realizados com amostras de soros de cães com LV assintomática (n=20) ou sintomática (n=25) (grupo CVL), bem como com soros de cães saudáveis que vivem em área endêmica (n=25) ou não endêmica (n=25) da doença (grupo Controle Saudável: HC), e de animais vacinados com Leish-Tec® (n=20) ou experimentalmente infectados com Ehrlichia canis (n=15), Babesia canis (n=10) ou Trypanosoma cruzi (n=15) (grupo CRD). Os valores de densidade ótica contra rLiHyQ e SLA são mostrados. A média de cada grupo é também indicada. Curvas ROC foram construídas para calcular os valores de corte.[15] Figure 1 depicts the diagnostic evaluation for canine visceral leishmaniasis. ELISA assays were performed with sera samples from dogs with asymptomatic (n=20) or symptomatic (n=25) VL (CVL group), as well as with sera from healthy dogs living in an endemic area (n=25) or non-endemic (n=25) of the disease (Healthy Control group: HC), and from animals vaccinated with Leish-Tec® (n=20) or experimentally infected with Ehrlichia canis (n=15), Babesia canis (n=10) or Trypanosoma cruzi (n=15) (CRD group). Optical density values against rLiHyQ and SLA are shown. The average of each group is also indicated. ROC curves were constructed to calculate cut-off values.

[16] A Figura 2 apresenta a reatividade ELISA contra painel sorológico humano. Os ensaios de ELISA foram realizados com amostras de soros de pacientes com LT (n=25 casos de LC e 25 casos de LM) e LV (n=40), bem como de pacientes coinfectados com LV/HIV (n=35) e indivíduos saudáveis (grupo HC) vivendo em região endêmica da doença (n=40). Amostras de pacientes infectados pelo HIV (n=30) ou portadores de Doença de Chagas (n=30), malária (n=10), tuberculose (n=10), paracoccidioidomicose (n=15), hanseníase (n=30) ou aspergilose (n=15) foram também utilizadas e classificadas como grupo CRD. Os valores de densidade ótica em relação à rLiHyQ e ao SLA são mostrados. A média de cada grupo é indicada. Curvas ROC foram construídas para calcular os valores de corte.[16] Figure 2 shows the ELISA reactivity against a human serological panel. ELISA assays were performed with sera samples from patients with LT (n=25 cases of CL and 25 cases of ML) and VL (n=40), as well as from patients co-infected with VL/HIV (n=35) and healthy individuals (HC group) living in an endemic region of the disease (n=40). Samples from patients infected with HIV (n=30) or with Chagas disease (n=30), malaria (n=10), tuberculosis (n=10), paracoccidioidomycosis (n=15), leprosy (n=30) or aspergillosis (n=15) were also used and classified as CRD group. Optical density values in relation to rLiHyQ and SLA are shown. The average of each group is indicated. ROC curves were constructed to calculate cut-off values.

DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNOLOGY

[17] A presente tecnologia trata de kit e método contendo a proteína, para emprego no diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral e da coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV).[17] The present technology deals with a kit and method containing the protein, for use in the laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis and co-infection with the human immunodeficiency virus (HIV).

[18] Mais especificamente, o kit para diagnóstico da leishmaniose visceral e para coinfecção com vírus da imunodeficiência humana compreende:

a. A proteína definida pela SEQ ID N° 1;
b. Um anticorpo secundário ou uma proteína, onde o anticorpo secundário (IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses), ou a proteína (proteína A e/ou proteína G), conjugados a uma enzima ou a um marcador;
c. Um reagente para detectar a enzima ou marcador.

[18] More specifically, the kit for diagnosing visceral leishmaniasis and for co-infection with human immunodeficiency virus comprises:

The. The protein defined by SEQ ID NO: 1;
B. A secondary antibody or a protein, where the secondary antibody (IgG, IgM, IgA, IgE and/or their respective subclasses), or the protein (protein A and/or protein G), conjugated to an enzyme or a marker;
w. A reagent to detect the enzyme or marker.

[19] No item “a”, a proteína deve estar ligada a um suporte sólido, selecionado do grupo de material compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno; ou a um carreador, preferencialmente partículas de ouro.[19] In item “a”, the protein must be attached to a solid support, selected from the material group comprising nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and/or polystyrene; or to a carrier, preferably gold particles.

[20] No item “b”, o marcador deve ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes e a enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.[20] In item “b”, the marker must be selected from the group consisting of enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents and the enzyme must be selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase , glucose oxidase and penicillinase.

[21] O método para diagnóstico da leishmaniose visceral e da coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana compreende as seguintes etapas:

a. Exposição de uma amostra a proteína definida pela SEQ ID Nº1, estando tal antígeno ligado a um suporte sólido ou a um carreador;
b. Adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
c. Detecção dos anticorpos específicos para a leishmaniose visceral e/ou com coinfecção pelo HIV na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citado na etapa (b).

[21] The method for diagnosing visceral leishmaniasis and co-infection with the human immunodeficiency virus comprises the following steps:

The. Exposure of a sample to the protein defined by SEQ ID NO 1, such antigen being bound to a solid support or carrier;
B. Addition of an antibody or a protein, which are conjugated to an enzyme or a marker and which bind to the antibodies in the sample of step (a);
w. Detection of specific antibodies for visceral leishmaniasis and/or HIV co-infection in the sample mentioned in step (a), using reagents capable of detecting the enzyme or marker mentioned in step (b).

[22] Na etapa “a”, a amostra pode ser selecionada do grupo compreendendo sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal, sem a necessidade de grandes quantidades desta, e o suporte sólido compreender materiais consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno, poliestireno.[22] In step "a", the sample can be selected from the group comprising blood, serum, plasma or other body fluid, without the need for large amounts of it, and the solid support comprises materials consisting of nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene , polystyrene.

[23] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode compreender IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses; a proteína ser Proteína A e/ou Proteína G; a enzima ser selecionada do grupo consistindo de peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; o marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.[23] In step "b", the secondary antibody may comprise IgG, IgM, IgA, IgE and respective subclasses; the protein is Protein A and/or Protein G; the enzyme is selected from the group consisting of peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase; the marker is selected from the group consisting of enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents.

[24] Na etapa “c”, o anticorpo de detecção pode ser selecionado do grupo compreendendo detecção de fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou de radioisótopos.[24] In step "c", the detection antibody can be selected from the group comprising fluorescence, immunofluorescence, immunoluminescence, absorbance or radioisotope detection.

[25] A proteína definida pela SEQ ID No 1 pode ser utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral e/ou da coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana.[25] The protein defined by SEQ ID No 1 can be used for the diagnosis of visceral leishmaniasis and/or human immunodeficiency virus co-infection.

[26] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida pelos exemplos que se seguem, não limitantes.[26] The present technology may be better understood by the following non-limiting examples.

EXAMPLE 1 - BIOINFORMATICS AND CHARACTERIZATION OF LIHYQ PROTEIN

[27] A proteína LiHyQ de L. infantum é conservada nas espécies L. donovani (LdCL_290013500), L. major (LmjF.29.0830) e L. braziliensis (LbrM.29.0860), com similaridade de aminoácidos da ordem de 99.79%, 91.32% e 72.14%, respectivamente. Além disso, houve baixa homologia com as sequências de aminoácidos das proteínas de T. cruzi-Esmo (TcCLB.504431.40) e T. cruzi-Não-Esmo (TcCLB.507951.90), com valores de 29.83% e 30.62%, respectivamente. Nenhuma semelhança foi encontrada com qualquer sequência de aminoácidos de proteínas de cães e do homem. Além disso, de acordo com o banco de dados Uniprot (https://www.uniprot.org/), LiHyQ é uma proteína transmembrana do parasita, pois contém uma região em sua sequência de aminoácidos localizada entre os aminoácidos 452-473 que compõem a parte hidrofóbica da proteína na membrana de Leishmania.[27] The LiHyQ protein of L. infantum is conserved in the species L. donovani (LdCL_290013500), L. major (LmjF.29.0830) and L. braziliensis (LbrM.29.0860), with amino acid similarity of the order of 99.79%, 91.32 % and 72.14%, respectively. Furthermore, there was low homology with the amino acid sequences of T. cruzi-Esmo (TcCLB.504431.40) and T. cruzi-No-Esmo (TcCLB.507951.90) proteins, with values of 29.83% and 30.62%, respectively. No similarity was found to any amino acid sequence of human and dog proteins. Furthermore, according to the Uniprot database (https://www.uniprot.org/), LiHyQ is a transmembrane protein of the parasite, as it contains a region in its amino acid sequence located between amino acids 452-473 that make up the hydrophobic part of the protein in the Leishmania membrane.

EXAMPLE 2 - PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEIN

[28] O gene que codifica LiHyQ (LINF_290013500) foi clonado a partir do DNA de L. infantum usando os primers 5´- GGCTGGATCCACCATGGGAGACAGATTCGGTGCA-3´ (Forward) e 5´- TGATGAATTCTCACGGTGCTGTCGATG-3´ (Reverse) e as enzimas BamHI and EcoRI. O fragmento de DNA foi purificado e ligado ao vetor pGEM®-T (Promega, EUA) e o plasmídeo recombinante foi transformado em células de Escherichia coli XL1-Blue (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil). O fragmento obtido da digestão do plasmídeo pGEM-LiHyQ foi ligado ao vetor pET28a-TEV e transformado em E. coli Arctic Express (DE3) (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA). A identidade do inserto foi confirmada por sequenciamento automático (MegaBace 1000; Amersham Biosciences, EUA). As células transformadas foram cultivadas a 37ºC com agitação em meio Luria Bertani (LB) contendo 50 μg/mL de canamicina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) e 20 μg/mL de gentamicina (Neoquímica, Anápolis, Brasil), até atingir um valor de densidade ótica (DO) de 0.600 a 600 nm. A expressão da proteína foi induzida pela adição de 1 mM de isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG; Promega, Montreal, Canadá) por 4 h a 12ºC e as células foram recolhidas por centrifugação (3.000 x g por 10 min a 4ºC). O sedimento foi lisado usando solução salina tamponada com fosfato pH 7.4 (PBS) contendo 0,25 mg/mL de lisozima, 25 U/mL de nuclease de benzonase, 10 mM de imidazol, 1 mM de PMSF e 2 mM de β-mercaptoetanol (todos adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA).[28] The gene encoding LiHyQ (LINF_290013500) was cloned from L. infantum DNA using the primers 5'- GGCTGGATCCACCATGGGAGACAGATTCGGTGCA-3' (Forward) and 5'- TGATGAATTCTCACGGTGCTGTCGATG-3' (Reverse) and the enzymes BamHI and EcoRI. The DNA fragment was purified and ligated into the pGEM®-T vector (Promega, USA) and the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli XL1-Blue cells (Phoneutria, Belo Horizonte, Brazil). The fragment obtained from the digestion of the pGEM-LiHyQ plasmid was ligated to the pET28a-TEV vector and transformed into E. coli Arctic Express (DE3) (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Insert identity was confirmed by automated sequencing (MegaBace 1000; Amersham Biosciences, USA). Transformed cells were cultured at 37ºC with agitation in Luria Bertani (LB) medium containing 50 μg/mL of kanamycin (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) and 20 μg/mL of gentamicin (Neoquímica, Anápolis, Brazil), until reaching an optical density (OD) value of 0,600 to 600 nm. Protein expression was induced by adding 1 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG; Promega, Montreal, Canada) for 4 h at 12°C and cells were harvested by centrifugation (3,000 x g for 10 min at 4°C). The pellet was lysed using phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) containing 0.25 mg/mL lysozyme, 25 U/mL benzonase nuclease, 10 mM imidazole, 1 mM PMSF and 2 mM β-mercaptoethanol (all purchased from Sigma-Aldrich, USA).

[29] Os lisados foram sonicados seis vezes em gelo por 30 segundos cada a 38 MHz com 30 segundos de descanso, seguido por seis ciclos de congelamento e descongelamento. O sobrenadante contendo a proteína rLiHyQ foi carregado em uma coluna nitrilotriacética de níquel (GE Healthcare, EUA), que foi pré-equilibrada com PBS contendo 10 mM de imidazol, 1 mM de PMSF e 2 mM de β-mercaptoetanol e conectado a um sistema AKTA. A proteína recombinante (26.0 kDa) foi eluída usando o mesmo tampão de carga mais 500 mM de imidazol. As frações eluídas foram concentradas com um filtro Amicon® ultra-15 com limite de peso molecular nominal de 10.000 (NMWL, Millipore, Alemanha), e posteriormente purificadas em uma coluna de gel filtração SuperdexTM 200 (GE Healthcare, EUA). Sais e imidazol foram removidos por diálise usando PBS por 18 h e a 4ºC, e a proteína purificada foi passada por uma coluna de polimixina-agarose (Sigma-Aldrich, EUA) para remover o conteúdo de endotoxina residual (Ensaio Quantitativo Limulus Amebócito Cromogênico QCL-1000, BioWhittaker, MD, EUA).[29] Lysates were sonicated six times on ice for 30 seconds each at 38 MHz with 30 seconds rest, followed by six cycles of freezing and thawing. The supernatant containing the rLiHyQ protein was loaded onto a nickel nitrilotriacetic column (GE Healthcare, USA), which was pre-equilibrated with PBS containing 10 mM imidazole, 1 mM PMSF and 2 mM β-mercaptoethanol and connected to a system AKTA. Recombinant protein (26.0 kDa) was eluted using the same loading buffer plus 500 mM imidazole. The eluted fractions were concentrated with an Amicon® ultra-15 filter with nominal molecular weight limit of 10,000 (NMWL, Millipore, Germany), and subsequently purified on a SuperdexTM 200 gel filtration column (GE Healthcare, USA). Salts and imidazole were removed by dialysis using PBS for 18 h at 4°C, and the purified protein was passed over a polymyxin-agarose column (Sigma-Aldrich, USA) to remove residual endotoxin content (QCL-1000 Chromogenic Limulus Amebocyte Assay QCL-1000 , BioWhittaker, MD, USA).

EXAMPLE 3 - DIAGNOSTIC EVALUATION FOR CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS

[30] Os ensaios de ELISA foram usados para avaliar a eficácia diagnóstica do rLiHyQ para a leishmaniose visceral canina. Os dados mostraram que os soros de cães com LV assintomática e sintomática reconheceram a proteína recombinante em ELISA, enquanto nenhuma reatividade cruzada foi observada com soros de cães saudáveis que vivem em áreas endêmicas ou não endêmicas da doença ou de cães vacinados com Leish-Tec® ou infectados com E. canis, B. canis ou T. cruzi (Fig. 1A). Em contraste, a reatividade média dos soros contra SLA não foi significativamente diferente do valor de corte calculado para qualquer um dos grupos (Fig. 1B). Curvas ROC foram calculadas para ambos os antígenos analisando os valores de DO e os valores de Se, Sp, PPV e NPV foram de 100% para rLiHyQ, e de 60.0%, 99.0%, 96.0% e 86.0%, respectivamente, para o SLA (Tabela 1). Também comparamos as amostras de soro de cães assintomática e sintomática com o kit EIECVL® juntamente com a proteína rLiHyQ em ELISA. A reatividade positiva para rLiHyQ foi encontrada em 19 dos 20 soros de cães assintomáticos e em 25 dos 25 soros sintomáticos, enquanto a reatividade positiva no kit EIE-CVL® foi encontrada em 11 das 20 e em 21 das 25 amostras de soros de cães com LV assintomática e sintomática, respectivamente (Tabela 2).

[30] ELISA assays were used to assess the diagnostic efficacy of rLiHyQ for canine visceral leishmaniasis. Data showed that sera from dogs with asymptomatic and symptomatic VL recognized the recombinant protein in ELISA, while no cross-reactivity was observed with sera from healthy dogs living in endemic or non-endemic areas of the disease or from dogs vaccinated with Leish-Tec® or infected with E. canis, B. canis or T. cruzi (Fig. 1A). In contrast, the mean reactivity of sera against SLA was not significantly different from the calculated cut-off value for either group (Fig. 1B). ROC curves were calculated for both antigens by analyzing OD values and Se, Sp, PPV and NPV values were 100% for rLiHyQ, and 60.0%, 99.0%, 96.0% and 86.0%, respectively, for SLA (Table 1). We also compared serum samples from asymptomatic and symptomatic dogs with the EIECVL® kit along with rLiHyQ protein in ELISA. Positive reactivity for rLiHyQ was found in 19 out of 20 sera from asymptomatic dogs and in 25 out of 25 symptomatic sera, while positive reactivity in the EIE-CVL® kit was found in 11 out of 20 and in 21 out of 25 sera samples from dogs with asymptomatic and symptomatic VL, respectively (Table 2).

EXAMPLE 4 - REACTIVITY OF HUMAN SERA SAMPLES AGAINST rLiHyQ

[31] A eficácia diagnóstica da proteína rLiHyQ foi também avaliada para a leishmaniose humana usando um painel sorológico contendo 265 amostras de soros. Os resultados mostraram que os pacientes com LV, LC e LM apresentaram valores individuais de DO acima do valor do ponto de corte com rLiHyQ (Fig. 2A). A proteína foi reconhecida por soros de pacientes coinfectados com LV e HIV, mas não por soros de pacientes infectados apenas com HIV ou por soros de pacientes com Doença de Chagas, Malária, Tuberculose, Paracoccidiomicose, Hanseníase e Aspergilose (Grupo CRD) (Fig. 2B). Por outro lado, os soros de todos os grupos mostraram reatividade semelhante com SLA, que não foi significativamente maior do que o valor de corte. Com os valores individuais de DO, curvas ROC foram construídas para os antígenos e os valores de Se, Sp, PPV e NPV para rLiHyQ foram de 100%, enquanto usando SLA; eles foram de 58%, 76%, 50% e 82%, respectivamente (Tabela 3). A eficácia diagnóstica de rLiHyQ para LV humana foi também comparada com o kit comercial Kalazar Detect™ Rapid Test, e a reatividade positiva para rLiHyQ foi encontrada em 39 das 40 amostras de soros, enquanto para o kit de diagnóstico 28 das 40 amostras foram positivas (Tabela 4).
Tabela 3 - Avaliação diagnóstica na leishmaniose humana. Um painel sorológico humano foi usado em experimentos ELISA com rLiHyQ ou SLA, e os resultados dos valores de densidade ótica foram usados para
determinar: sensibilidade (Se), especificidade (Sp), intervalo de confiança usando nível de 95% (95%CI), valor preditivo positivo (PPV), valor preditivo negativo (NPV), razão de verossimilhança (LR) e índice de Youden (Y).

[31] The diagnostic efficacy of rLiHyQ protein was also evaluated for human leishmaniasis using a serological panel containing 265 sera samples. The results showed that patients with LV, LC and LM had individual OD values above the cutoff value with rLiHyQ (Fig. 2A). The protein was recognized by sera from patients coinfected with VL and HIV, but not by sera from patients infected only with HIV or by sera from patients with Chagas Disease, Malaria, Tuberculosis, Paracoccidiomycosis, Leprosy and Aspergillosis (CRD Group) (Fig. 2B). On the other hand, sera from all groups showed similar reactivity with SLA, which was not significantly greater than the cut-off value. With the individual OD values, ROC curves were constructed for the antigens and the Se, Sp, PPV and NPV values for rLiHyQ were 100%, while using SLA; they were 58%, 76%, 50% and 82%, respectively (Table 3). The diagnostic efficacy of rLiHyQ for human VL was also compared with the commercial Kalazar Detect™ Rapid Test kit, and positive reactivity for rLiHyQ was found in 39 out of 40 sera samples, while for the diagnostic kit 28 out of 40 samples were positive ( Table 4).
Table 3 - Diagnostic evaluation in human leishmaniasis. A human serological panel was used in ELISA experiments with rLiHyQ or SLA, and the results of optical density values were used to
determine: sensitivity (Se), specificity (Sp), confidence interval using 95% level (95%CI), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), likelihood ratio (LR) and Youden index (Y).

Claims

KIT FOR DIAGNOSIS OF VISCERAL LEISHMANIASIS AND COINFECTION WITH HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS, characterized by comprising:

The. The protein defined by SEQ ID NO: 1;
B. A secondary antibody or a protein, where the secondary antibody (IgG, IgM, IgA, IgE and/or their respective subclasses), or the protein (protein A and/or protein G), is conjugated to an enzyme or a marker;
w. A reagent to detect the enzyme or marker.

KIT, according to claim 1, item "a", characterized in that the protein is attached to a solid support, selected from the material group comprising nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and/or polystyrene, or to a carrier, such as particles of gold.

KIT, according to claim 1, item "b", characterized in that the marker is selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents and the enzyme is selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase.

METHOD FOR DIAGNOSIS OF VISCERAL LEISHMANIASIS AND COINFECTION WITH HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS using the Kit defined in claim 1, characterized in that it comprises the following steps:

The. Exposure of a sample to the protein defined by SEQ ID No. 1, such antigen being bound to a solid support or to a carrier;
B. Addition of an antibody or a protein, which are conjugated to an enzyme or a marker and which bind to the antibodies in the sample of step (a);
w. Detection of specific antibodies for visceral leishmaniasis and cases of HIV co-infection in the sample mentioned in step (a), using reagents capable of detecting the enzyme or marker mentioned in step (b).

METHOD, according to claim 4, characterized in that, in step "a", the sample is selected from the group comprising blood, serum, plasma or other body fluid.

METHOD, according to claim 4, characterized in that, in step "a", the solid support comprises materials selected from the group comprising nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene, polystyrene.

METHOD, according to claim 4, characterized in that, in step "b", the secondary antibody is selected from the group comprising IgG, IgM, IgA, IgE and respective subclasses, the protein is Protein A and/or Protein G, the enzyme be selected from the group comprising peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase, the label being selected from the group comprising enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescents.

METHOD, according to claim 4, characterized in that, in step "c", the detection antibody is selected from the group comprising fluorescence, immunofluorescence, immunoluminescence, absorbance or radioisotope detection.

USE of the recombinant protein defined by SEQ ID No1, characterized by being for the diagnosis of visceral leishmaniasis.

USE of the recombinant protein defined by SEQ ID No1, characterized by being for the diagnosis of visceral leishmaniasis and co-infection with the human immunodeficiency virus.