BR102021018419A2

BR102021018419A2 - RNA DETECTION OR QUANTIFICATION SYSTEM BY ELECTROCHEMIOLUMINESCENCE, USE OF THE SYSTEM AND METHOD FOR RNA DETECTION

Info

Publication number: BR102021018419A2
Application number: BR102021018419-1A
Authority: BR
Inventors: Ronaldo Censi Faria; Tássia Regina De Oliveira; Matias Eliseo Melendez; Taise Helena Oliveira Leite; Ester Cerdeira Sabino; Henrique Pott Junior; Fabio Eudes Leal; Erika Regina Manuli
Original assignee: Fundação Universidade Federal De São Carlos; Cloning Solutions Pesquisa E Desenvolvimento Ltda; Universidade Municipal De São Caetano Do Sul - Uscs
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2023-03-28

Abstract

Descreve-se um sistema de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente de RNA contendo ao menos uma solução com pelo menos uma sonda de captura conjugada a partícula ou nanopartícula magnética e pelo menos uma sonda de detecção conjugada a um marcador eletroquimioluminescente, que, quando ligadas às primeira e segunda regiões do RNA, respectivamente, formam um bioconjugado. O sistema inclui ainda pelo menos um dispositivo de detecção eletroquimioluminescente contendo pelo menos um eletrodo de trabalho adaptado para receber tensão e pelo menos um ímã, sendo o dispositivo adaptado para receber um ou mais bioconjugados sobre uma ou mais regiões da superfície do eletrodo de trabalho com cada ímã posicionado abaixo de cada região da superfície deste eletrodo. É descrito ainda o uso do sistema para a detecção ou quantificação de RNA e um método de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente de RNA. O método compreende a incubação da amostra com pelo menos uma solução contendo ao menos uma sonda de captura e ao menos uma sonda de detecção, a adição de uma solução contendo um composto redutor de sacrifício, a transferência da pelo menos uma amostra para pelo menos uma região da superfície de um eletrodo de trabalho de um dispositivo eletroquimioluminescente com pelo menos um ímã posicionado abaixo de cada região da superfície do eletrodo de trabalho, a aplicação de uma tensão neste eletrodo por meio de uma fonte de tensão e a detecção de luz gerada por eletroquimioluminescência pelos marcadores, quando presentes no bioconjugado.

We describe an electrochemiluminescent RNA detection or quantification system containing at least one solution with at least one capture probe conjugated to a magnetic particle or nanoparticle and at least one detection probe conjugated to an electrochemiluminescent marker, which, when linked to the first and second regions of the RNA, respectively, form a bioconjugate. The system further includes at least one electrochemiluminescent detection device containing at least one working electrode adapted to receive voltage and at least one magnet, the device being adapted to receive one or more bioconjugates on one or more regions of the surface of the working electrode with each magnet positioned below each region of the surface of this electrode. It is also described the use of the system for the detection or quantification of RNA and a method of electrochemiluminescent detection or quantification of RNA. The method comprises incubating the sample with at least one solution containing at least one capture probe and at least one detection probe, adding a solution containing a sacrificial reducing compound, transferring the at least one sample to at least one surface region of a working electrode of an electrochemiluminescent device with at least one magnet positioned below each surface region of the working electrode, applying a voltage to this electrode by means of a voltage source, and detecting light generated by electrochemiluminescence by the markers, when present in the bioconjugate.

Description

RNA DETECTION OR QUANTIFICATION SYSTEM BY ELECTROCHEMIOLUMINESCENCE, USE OF THE SYSTEM AND METHOD FOR RNA DETECTION

FIELD OF THE INVENTION

[0001] A presente invenção está inserida no campo da biotecnologia. Particularmente, é aqui descrito um sistema de detecção eletroquimioluminescente de RNA, sua aplicação na detecção ou quantificação de RNA e um método de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente de RNA.[0001] The present invention is inserted in the field of biotechnology. Particularly, an electrochemiluminescent RNA detection system, its application in RNA detection or quantification, and an electrochemiluminescent RNA detection or quantification method are described herein.

FUNDAMENTALS OF THE INVENTION

[0002] O ácido ribonucleico (RNA) é uma molécula que participa ativamente de processos de expressão gênica seja por carrear a informação genética contida no DNA para a sua tradução em proteínas (como RNA mensageiro) ou por regular etapas desse processo, como observado para RNAs não codificantes. Por sua relevância na expressão gênica, diferentes níveis de RNAs são frequentemente associados a diferentes condições biológicas como ocorre, por exemplo, em processos patogênicos. Dessa maneira, a detecção e quantificação de RNA pode ser utilizada em abordagens diagnósticas para doenças onde RNAs-alvo funcionam como biomarcadores de patogênese, como observado para doenças cardiovasculares e câncer1,2. Em outros casos, como em doenças infecciosas, a detecção de moléculas de RNA relativas ao agente etiológico é suficiente para o diagnóstico de uma dada infecção e sua quantificação pode se relacionar com a quantidade do microrganismo no indivíduo infectado.[0002] Ribonucleic acid (RNA) is a molecule that actively participates in gene expression processes either by carrying the genetic information contained in DNA for its translation into proteins (as messenger RNA) or by regulating stages of this process, as observed for non-coding RNAs. Due to their relevance in gene expression, different levels of RNAs are often associated with different biological conditions, as occurs, for example, in pathogenic processes. Thus, RNA detection and quantification can be used in diagnostic approaches for diseases where target RNAs function as pathogenesis biomarkers, as observed for cardiovascular diseases and cancer1,2. In other cases, such as in infectious diseases, the detection of RNA molecules related to the etiological agent is sufficient for the diagnosis of a given infection and its quantification can be related to the amount of the microorganism in the infected individual.

[0003] Técnicas distintas estão disponíveis atualmente para a detecção de RNAs, onde exemplos recentes podem ser encontrados em estratégias de diagnóstico de infecções por SARS-CoV-2, um vírus de genoma de RNA. As patentes PI0413825-2 e US10815539 possuem como base o método de reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR) para diagnóstico. Este método consiste em uma etapa de retrotranscrição do RNA genômico do virus em DNA complementar (cDNA) e sua posterior amplificação para detecção e/ou quantificação via sondas oligonucleotídicas fluorescentes em aparelho termociclador equipado com sistema de detecção de fluorescência. Abordagens de PCR podem ainda ser aplicadas em sistema multiplex, possibilitando a detecção de mais de um RNA-alvo simultaneamente, como descrito no invento CN111733293(A), também paraSARS-CoV-2. Por suas taxas de sensibilidade e especificidade, técnicas que possuemporbasea PCR têm sido consideradas padrão-ouro para a detecção e quantificação de RNAs. Entretanto, dado o custo elevado dos seus insumos/infraestrutura necessários, seu tempo extenso de execução e a necessidade de um corpo técnico especializado, esta técnica fica restrita a laboratórios de pesquisa ou de diagnóstico.[0003] Different techniques are currently available for the detection of RNAs, where recent examples can be found in diagnostic strategies for infections by SARS-CoV-2, an RNA genome virus. Patents PI0413825-2 and US10815539 are based on the polymerase chain reaction (RT-qPCR) method for diagnosis. This method consists of a step of retrotranscription of the genomic RNA of the virus into complementary DNA (cDNA) and its subsequent amplification for detection and/or quantification via fluorescent oligonucleotide probes in a thermal cycler equipped with a fluorescence detection system. PCR approaches can also be applied in a multiplex system, allowing the detection of more than one target RNA simultaneously, as described in invention CN111733293(A), also for SARS-CoV-2. Due to their sensitivity and specificity rates, techniques based on PCR have been considered the gold standard for the detection and quantification of RNAs. However, given the high cost of its necessary inputs/infrastructure, its extensive execution time and the need for a specialized technical staff, this technique is restricted to research or diagnostic laboratories.

[0004] Estratégias para minimizar os custos e o tempo até a obtenção do resultado além de viabilizar a detecção e quantificação de RNA em regiões onde não há estrutura laboratorial nem mão de obra altamente especializada têm sido buscadas. Pelo fato das múltiplas etapas até a amplificação e detecção do método RT-qPCR serem longas e custosas, técnicas de detecção de RNA por hibridização a sondas oligonucleotídicas foram desenvolvidas, como apresentado no pedido de patente CNl11593146(A) para a detecção de RNAs virais. O invento descrito em CNl11593146(A) apresenta um método para detecção de vírus de genoma de RNA e possui como base a hibridização in situ do RNA viral a sondas oligonucleotídicas conjugadas a anticorpos marcados com digoxina ou biotina. Sua detecção ocorre por emissão de fluorescência induzida através de incubação com substrato de peroxidase visualizada em microscopia. Apesar de sua performance de sensibilidade ter sido comparada à técnica padrão-ouro e possuir custo inferior, o método ainda apresenta diversas etapas que implicam em tempo e que, por fim, necessitam de microscópio de epifluorescência, um equipamento pouco prático e de alto investimento.[0004] Strategies to minimize costs and time to obtain the result, in addition to enabling the detection and quantification of RNA in regions where there is no laboratory structure or highly specialized labor, have been sought. Because the multiple steps for amplification and detection of the RT-qPCR method are long and costly, RNA detection techniques by hybridization to oligonucleotide probes were developed, as presented in the patent application CNl11593146(A) for the detection of viral RNAs. The invention described in CN11593146(A) presents a method for detection of RNA genome viruses and is based on the in situ hybridization of viral RNA to oligonucleotide probes conjugated to antibodies labeled with digoxin or biotin. Its detection occurs by fluorescence emission induced by incubation with peroxidase substrate visualized in microscopy. Although its sensitivity performance has been compared to the gold standard technique and has a lower cost, the method still has several steps that involve time and that, finally, require an epifluorescence microscope, an impractical piece of equipment with a high investment.

[0005] Na busca por ganho em sensibilidade e diminuição de custos, o pedido de patente BR102018 069600-9 A2 apresenta uma invenção que utiliza um sistema microfluídico em dispositivo descartável para a detecção de biomarcadores por eletroquimioluminescência. Seu sistema de detecção se baseia em anticorpos conjugados ao marcador eletroqurmiolummescente [Ru(bpy)2] PVP2+, para o qual são necessárias múltiplas etapas de síntese, e possui aplicação ao diagnóstico de um fungo de soja. Entretanto, o invento ainda se mantém dependente da produção de anticorpos para sua fabricação, o que limita esforços de barateamento do sistema, além de ser um dispositivo de microfluídica que, portanto, demandam um tempo maior de análise quando comparados a sistemas estáticos de um modo geral.[0005] In the search for gain in sensitivity and cost reduction, the patent application BR102018 069600-9 A2 presents an invention that uses a microfluidic system in a disposable device for the detection of biomarkers by electrochemiluminescence. Its detection system is based on antibodies conjugated to the electrochemoluminescent marker [Ru(bpy)2] PVP2+, for which multiple synthesis steps are necessary, and has application in the diagnosis of a soybean fungus. However, the invention still remains dependent on the production of antibodies for its manufacture, which limits efforts to make the system cheaper, in addition to being a microfluidics device that, therefore, requires a longer analysis time when compared to static systems in a way general.

[0006] Sendo assim, permanece necessário o desenvolvimento de um sistema e um método para detecção e/ou quantificação de RNAs em amostras biológicas de forma que apresente níveis satisfatórios de sensibilidade, especificidade, rapidez e um menor custo.[0006] Therefore, it remains necessary to develop a system and a method for detection and/or quantification of RNAs in biological samples in a way that presents satisfactory levels of sensitivity, specificity, speed and a lower cost.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0007] A presente invenção propõe solucionar o referido problema através de um sistema de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente de RNA que contém: pelo menos uma solução compreendendo pelo menos uma sonda de captura covalentemente conjugada a partícula ou nanopartícula magnética (para ligação a uma primeira região do RNA) e pelo menos uma sonda de detecção covalentemente conjugada a um marcador eletroquimioluminescente (para ligação a uma segunda região do RNA), em que uma sonda de captura e uma sondade detecção, quando ligadas às primeira e segunda regiões do RNA, formam um bioconjugado; e pelo menos um dispositivo de detecção eletroquimioluminescente que compreende pelo menos um eletrodo de trabalho adaptado para receber uma tensão de uma fonte de tensão e pelo menos um imã, em que o dispositivo de detecção é adaptado para receber um ou mais bioconjugados sobre uma ou mais regiões da superfície do eletrodo de trabalho e em que cada imã é posicionado abaixo de cada região da superfície do eletrodo de trabalho para atrair os um ou mais bioconjugados às respectivas regiões da superfície do eletrodo de trabalho.[0007] The present invention proposes to solve said problem through an electrochemiluminescent RNA detection or quantification system that contains: at least one solution comprising at least one capture probe covalently conjugated to the magnetic particle or nanoparticle (for binding to a first region of RNA) and at least one detection probe covalently conjugated to an electrochemiluminescent label (for binding to a second RNA region), wherein a capture probe and a detection probe, when attached to the first and second RNA regions, form a bioconjugate; and at least one electrochemiluminescent detection device comprising at least one working electrode adapted to receive a voltage from a voltage source and at least one magnet, wherein the detection device is adapted to receive one or more bioconjugates on one or more regions of the surface of the working electrode and where each magnet is positioned below each region of the surface of the working electrode to attract the one or more bioconjugates to the respective regions of the surface of the working electrode.

[0008] É ainda descrito o uso do referido sistema para a detecção ou quantificação de RNAs.[0008] It is also described the use of said system for the detection or quantification of RNAs.

[0009] Adicionalmente, é descrito um método de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente deRNA que compreende a incubação de pelo menos uma amostra com pelo menos uma solução contendo pelo menos uma sonda de captura covalentemente conjugada a partícula ou nanopartícula magnética e pelo menos uma sonda de detecção covalentemente conjugada a um marcador eletroquimioluminescente, em que a sonda de captura se liga a uma primeira região do RNA e a sonda de detecção se liga a uma segunda região do RNA, formando um bioconjugado quando houver na amostra RNA compreendendo as primeira e segunda regiões complementares às sondas de captura e detecção; adição de uma solução compreendendo um composto redutor de sacrifício à amostraincubada compelo menos uma sonda de captura e uma sonda de detecção; transferência de pelo menos uma amostra para pelo menos uma região da superfície de um eletrodo de trabalho de um dispositivo de detecção eletroquimioluminescente, em que os bioconjugados, se presentes na pelo menos uma amostra, são atraídos à superfície do eletrodo de trabalho por meio de pelo menos um ímã posicionado abaixo de cada região da superfície do eletrodo de trabalho; aplicação de uma tensão no pelo menos um eletrodo de trabalho por meio de uma fonte de tensão; detecção de luz gerada por eletroquimioluminescência pelo marcador conjugado a sonda de detecção, quando presente no bioconjugado, em cada região da superfície do eletrodo de trabalho.[0009] Additionally, a method of electrochemiluminescent detection or quantification of RNA is described, which comprises incubating at least one sample with at least one solution containing at least one capture probe covalently conjugated to the magnetic particle or nanoparticle and at least one detection probe covalently conjugated to an electrochemiluminescent marker, in which the capture probe binds to a first RNA region and the detection probe binds to a second RNA region, forming a bioconjugate when RNA comprising the first and second complementary regions is present in the sample capture and detection probes; adding a solution comprising a sacrificial reducing compound to the sample incubated with at least one capture probe and one detection probe; transferring at least one sample to at least one region of the surface of a working electrode of an electrochemiluminescent detection device, wherein bioconjugates, if present in the at least one sample, are attracted to the surface of the working electrode by means of at least at least one magnet positioned below each region of the surface of the working electrode; applying a voltage to the at least one working electrode via a voltage source; detection of light generated by electrochemiluminescence by the marker conjugated to the detection probe, when present in the bioconjugate, in each region of the surface of the working electrode.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0010] Para obter uma total e completa visualização dos objetos desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referência, conforme a seguir.[0010] In order to obtain a total and complete view of the objects of this invention, the figures to which reference is made are presented, as follows.

[0011] A Figura 1 mostra uma concretização particular do dispositivo de detecção eletroquimioluminescente da presente invenção. Em A), é mostrado o eletrodo com 20 regiões sensoras (eletrodos de trabalho) para as reações de ECL; em B) é mostrado um suporte impresso contendo os 20 imãs para retenção dos bioconjugados, por meio das partículas ou nanopartículas magnéticas, sobre os eletrodos de trabalho; em C) é mostrado o dispositivo final.[0011] Figure 1 shows a particular embodiment of the electrochemiluminescent detection device of the present invention. In A), the electrode with 20 sensing regions (working electrodes) for ECL reactions is shown; in B) a printed support is shown containing the 20 magnets for retaining the bioconjugates, by means of the magnetic particles or nanoparticles, on the working electrodes; in C) the final device is shown.

[0012] A Figura 2 ilustra etapas para concretização particular de um dispositivo descartável em PVC. Em Al) é ilustrada a transferência do vinil contendo o layout dos eletrodos; em A2) é ilustrada a serigrafia com tinta de carbono; em A3) é ilustrada a etapa de cura da tinta de carbono; em A4) é ilustrada a aplicação da tinta de Ag/Cl no eletrodo; em A5) é ilustrada a retirada do vinil delimitador; em A6) são ilustrados os eletrodos serigrafados com o layout desejado. Em B1) o esquema ilustrativo representaa etapa de aplicação do vinil adesivo delimitador de cada eletrodo de trabalho do dispositivo; em B2) é ilustrada a aplicação de cartão adesivo delimitador de cada poço do dispositivo; em B3) é ilustrado o encaixe do dispositivo contendo os imãs; em B4) é representado 0 dispositivo pronto para aplicação.[0012] Figure 2 illustrates steps for particular embodiment of a disposable PVC device. In Al) the vinyl transfer containing the layout of the electrodes is illustrated; in A2) serigraphy with carbon ink is illustrated; in A3) the carbon ink curing step is illustrated; in A4) the application of the Ag/Cl ink on the electrode is illustrated; in A5) the removal of the delimiter vinyl is illustrated; in A6) the serigraphed electrodes with the desired layout are illustrated. In B1) the illustrative scheme represents the step of application of the delimiting adhesive vinyl of each working electrode of the device; in B2) the application of an adhesive card delimiting each well of the device is illustrated; in B3) the fitting of the device containing the magnets is illustrated; in B4) the device ready for application is represented.

[0013] A Figura 3 ilustra uma curva analítica obtida para o DNA alvo contendo a sequência similar a região lA do RNA do vírus SARS-CoV-2, obtida através o teste de ECL proposto.[0013] Figure 3 illustrates an analytical curve obtained for the target DNA containing the sequence similar to the lA region of the RNA of the SARS-CoV-2 virus, obtained through the proposed ECL test.

[0014] A Figura 4 ilustra um gráfico de barras correspondente à intensidade de ECL obtida para amostras de saliva para coortes de indivíduos saudáveis e diagnosticados com SARS-CoV-2. É também mostrado, no canto esquerdo superior, uma imagem das regiões de superfície de um eletrodo de trabalho do dispositivo obtidas com o fotodocumentador.[0014] Figure 4 illustrates a bar graph corresponding to the ECL intensity obtained for saliva samples for cohorts of healthy individuals and those diagnosed with SARS-CoV-2. It is also shown, in the upper left corner, an image of the surface regions of a working electrode of the device obtained with the photodocumenter.

[0015] A Figura 5 ilustra um gráfico de barras correspondente à intensidade de ECL obtida para 33 amostras de saliva, sendo 11 negativas (indivíduos saudáveis) e 22 positivas (infectados com SARS-CoV-2).[0015] Figure 5 illustrates a bar graph corresponding to the ECL intensity obtained for 33 saliva samples, 11 of which are negative (healthy individuals) and 22 are positive (infected with SARS-CoV-2).

[0016] A Figura 6 ilustra uma curva ROC para detecção do RNA do SARS-CoV-2 em amostras de saliva.[0016] Figure 6 illustrates a ROC curve for detection of SARS-CoV-2 RNA in saliva samples.

[0017] A Figura 7 ilustra um diagrama de pontos para os resultados obtidos na detecção de RNA do SARS-CoV-2 em amostra de saliva de sujeitos negativos e positivos para COVID-19.[0017] Figure 7 illustrates a dot plot for the results obtained in the detection of SARS-CoV-2 RNA in saliva samples from negative and positive subjects for COVID-19.

DETAILED DESCRIPTION INVENTION

[0018] Na descrição a seguir, concretizações específicas serão ilustradas, as quais não devem ser interpretadas como limitantes do escopo de proteção da presente invenção.[0018] In the following description, specific embodiments will be illustrated, which should not be interpreted as limiting the scope of protection of the present invention.

[0019] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um sistema de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente de RNA que compreende: pelo menos uma solução compreendendo pelo menos uma sonda de captura covalentemente conjugada a partícula ou nanopartícula magnéticas (para ligação a uma primeira região do RNA) e pelo menos uma sonda de detecção covalentemente conjugada a um marcador eletroquimioluminescente (para ligação a uma segunda região do RNA), em que uma sonda de captura e uma sonda de detecção, quando ligadas às primeira e segunda regiões do RNA, formam um bioconjugado; e pelo menos um dispositivo de detecção eletroquimioluminescente que compreende pelo menos um eletrodo de trabalho adaptado para receber uma tensão de uma fonte de tensão e pelo menos um imã, em que o dispositivo de detecção é adaptado para receber um ou mais bioconjugados sobre uma ou mais regiões da superfície do eletrodo de trabalho e em que cada ímã é posicionado abaixo de cada região da superfície do eletrodo de trabalho para atrair os um ou mais bioconjugados às respectivas regiões da superfície do eletrodo de trabalho.[0019] In a first aspect, the present invention relates to an electrochemiluminescent RNA detection or quantification system comprising: at least one solution comprising at least one capture probe covalently conjugated to a magnetic particle or nanoparticle (for binding to a first RNA region) and at least one detection probe covalently conjugated to an electrochemiluminescent label (for binding to a second RNA region), wherein a capture probe and a detection probe, when linked to the first and second RNA regions, form a bioconjugate; and at least one electrochemiluminescent detection device comprising at least one working electrode adapted to receive a voltage from a voltage source and at least one magnet, wherein the detection device is adapted to receive one or more bioconjugates on one or more regions of the working electrode surface and wherein each magnet is positioned beneath each region of the working electrode surface to attract the one or more bioconjugates to the respective regions of the working electrode surface.

[0020] A partir desse sistema, é possível realizar a detecção ou quantificação deRNAs de maneira livre de anticorpos, enzimas, dNTPs, o que viabiliza um menor custo de produção do sistema. Da mesma forma, o sistema é livre de etapas de amplificação ou termociclagens, o que possibilita sua execução em tempo menor, na ausência de equipamentos como termocicladores e em temperatura ambiente.[0020] From this system, it is possible to perform the detection or quantification of RNAs free of antibodies, enzymes, dNTPs, which enables a lower production cost of the system. Likewise, the system is free of amplification steps or thermocycling, which allows its execution in a shorter time, in the absence of equipment such as thermal cyclers and at room temperature.

[0021] Em uma concretização, as primeira e segunda regiões do RNA reconhecidas pela sonda de capturae pela sonda de detecção, respectivamente, são regiões distintas e não sobrepostas do RNA.[0021] In one embodiment, the first and second regions of the RNA recognized by the capture probe and the detection probe, respectively, are distinct and non-overlapping regions of the RNA.

[0022] Em uma concretização, as primeira e segunda regiões do RNA são espaçadas uma da outra por até 500 nucleotídeos.[0022] In one embodiment, the first and second regions of the RNA are spaced apart by up to 500 nucleotides.

[0023] As sondas referidas na presente invenção são sequências de nucleotídeos que se ligam, por hibridização, a sequências especificas de bases nitrogenadas do RNA a ser detectado. Desta forma, as sondas de captura possibilitam a separação dosbioconjugados formados por separação magnética ao passo que as sondas de detecção possibilitam a detecção ou quantificação dos bioconjugados poreletroquimioluminescência.[0023] The probes referred to in the present invention are nucleotide sequences that bind, by hybridization, to specific sequences of nitrogenous bases of the RNA to be detected. In this way, the capture probes allow the separation of the bioconjugates formed by magnetic separation, while the detection probes allow the detection or quantification of the bioconjugates by electrochemiluminescence.

[0024] Estas sondas podem ser construídas por um técnico no assunto levando-se em consideração o conhecimento amplamente disponível na técnica sobre o pareamento de bases nitrogenadas e a sequência de bases específica do RNA a ser detectado. A tecnologia usada para a síntese dos oligonucleotídeos é qualquer uma daquelas disponíveis no estado da técnica.[0024] These probes can be constructed by a person skilled in the art, taking into account the knowledge widely available in the art on the pairing of nitrogenous bases and the specific base sequence of the RNA to be detected. The technology used for the synthesis of oligonucleotides is any of those available in the state of the art.

[0025] Na conjugação dos oligonucleotídeos às partículas magnéticas ou de sílica para a síntese das sondas de captura ou detecção, respectivamente, pode ser realizada uma etapa de incubação das sondas com uma solução de bloqueio a fim de bloquear os sítios de ligações livres e evitar ligações não específicas. Esta solução de bloqueio pode ser produzida por um técnico no assunto com qualquer bloqueador disponível no estado da técnica. Exemplos não limitativos de possíveis bloqueadores incluem a etanolamina, a glicina, o tampão Tris-HCl + Tween 20 (tampão TT), e a albumina de soro bovino (BSA).[0025] In the conjugation of oligonucleotides to magnetic or silica particles for the synthesis of capture or detection probes, respectively, a step of incubating the probes with a blocking solution can be performed in order to block the free binding sites and avoid non-specific links. This blocking solution can be produced by a person skilled in the art with any blocker available in the state of the art. Non-limiting examples of possible blockers include ethanolamine, glycine, Tris-HCl + Tween 20 buffer (TT buffer), and bovine serum albumin (BSA).

[0026] Em uma concretização, as sondas de captura e detecção compreendem, cada uma, de 10 a 30 nucleotídeos respectivamente complementares à primeira e à segunda região do RNA.[0026] In one embodiment, the capture and detection probes each comprise from 10 to 30 nucleotides respectively complementary to the first and second region of the RNA.

[0027] O RNA a ser detectado pode ter origem em qualquer organismo vivo. De maneira não limitativa, o RNA pode ser um RNA de procarionte, um RNA de arqueia ou um RNA de eucarionte. Exemplos não limitativos da presente invenção são RNAs bacterianos, virais ou de mamífero. Em uma concretização, o RNA é um RNA virai. Em uma concretização particular, o RNA é um RNA de vírus causador de doença infecciosa em humanos. Em uma concretização mais particular, o RNA é um RNA de um vírus da família Coronaviridae.[0027] The RNA to be detected can originate from any living organism. In a non-limiting manner, the RNA can be a prokaryotic RNA, an archaeal RNA or a eukaryotic RNA. Non-limiting examples of the present invention are bacterial, viral or mammalian RNAs. In one embodiment, the RNA is a viral RNA. In a particular embodiment, the RNA is an RNA of virus causing infectious disease in humans. In a more particular embodiment, the RNA is an RNA from a virus of the Coronaviridae family.

[0028] O marcador eletroquimioluminescente conjugado às sondas de detecção pode ser qualquer composto capaz de emitir luz após reação de oxidação e aplicação de tensão. Exemplos não limitativos incluem [Ru(bpy)3] 2+, [Ru(bpy)2(dcbpy)] 2+, [Ru(bpy)2(bpySH)p+, [Ru(bpy)2(PVP)10] 2A [Os(bpy)2(PVP)10] 2+, [Os(bpy)3] 2+, [Ir(bpy)3] 3+ e [Ir(bpy)2(acac)] .[0028] The electrochemiluminescent marker conjugated to the detection probes can be any compound capable of emitting light after oxidation reaction and voltage application. Non-limiting examples include [Ru(bpy)3] 2+, [Ru(bpy)2(dcbpy)] 2+, [Ru(bpy)2(bpySH)p+, [Ru(bpy)2(PVP)10] 2A [Os(bpy)2(PVP)10] 2+, [Os(bpy)3] 2+, [Ir(bpy)3] 3+ and [Ir(bpy)2(acac)] .

[0029] Em uma concretização particular, o marcador eletroquimioluminescente é o [Ru(bpy)3] 2+.[0029] In a particular embodiment, the electrochemiluminescent label is [Ru(bpy)3] 2+.

[0030] Para a hibridização das sondas de captura e de detecção ao RNA presente na amostra, é necessária uma incubação destes elementos. Para esta finalidade, o sistema da presente invenção pode ainda compreender uma solução de incubação em água ultrapuraou com propriedades tamponantes. Exemplos não limitativos de solução tamponante de incubação são tampão Tris, tampão Tris-EDTA, Tampão NE (Tris, EDTA, DTT, MgCl2), tampão PBS (NaCl, KCl, Na2HPO4, and KH2PO4.).[0030] For the hybridization of the capture and detection probes to the RNA present in the sample, an incubation of these elements is necessary. For this purpose, the system of the present invention may further comprise an incubation solution in ultrapure water or with buffering properties. Non-limiting examples of incubation buffer solution are Tris buffer, Tris-EDTA buffer, NE buffer (Tris, EDTA, DTT, MgCl2), PBS buffer (NaCl, KCl, Na2HPO4, and KH2PO4.).

[0031] Após a etapa de incubação da amostra com as referidas sondas, pode ser necessária uma etapa de lavagem dos bioconjugados formados, por meio de uma solução de lavagem com propriedades detergentes, para minimizar possibilidades de detecções espúrias. Para essa finalidade, o sistema da presente invenção pode ainda compreender uma solução de lavagem. Exemplos não limitativos de solução de lavagem são tampão NE contendo Tween-20, tampão Tris contendo Tween-20, tampão Tris-EDTA contendo Tween-20,tampão PBS (NaCl,KCl, Na2HPO4, e KH2PO4).[0031] After the incubation step of the sample with said probes, it may be necessary to wash the formed bioconjugates using a washing solution with detergent properties, to minimize possibilities of spurious detections. For that purpose, the system of the present invention may further comprise a washing solution. Non-limiting examples of wash solution are NE buffer containing Tween-20, Tris buffer containing Tween-20, Tris-EDTA buffer containing Tween-20, PBS buffer (NaCl, KCl, Na2HPO4, and KH2PO4).

[0032] O sistema proposto na presente invenção é capaz de realizar a detecção ou quantificação de RNA por meio de reação de eletroquimioluminescência (ECL). A ECL se baseia na geração de luz pela oxidação do marcador eletroquimioluminescente devido a aplicação de uma tensão. No contexto da presente invenção, 0 marcador eletroquimioluminescente é covalentemente conjugado à sonda de detecção.[0032] The system proposed in the present invention is able to perform the detection or quantification of RNA by means of electrochemiluminescence (ECL) reaction. ECL is based on the generation of light by oxidation of the electrochemiluminescent marker due to the application of a voltage. In the context of the present invention, the electrochemiluminescent marker is covalently conjugated to the detection probe.

[0033] O processo de oxidação do marcador eletroquimioluminescente ocorre na presença de um composto redutor de sacrifício. Um composto de sacrifício adequado no contexto da presente invenção é qualquer composto capaz de causar a oxidação do marcador eletroquimioluminescente, para produção do estado excitado, que resulta na emissão de luz. Exemplos não limitativos incluem solventes orgânicos apróticos como a tripropilamina, peróxido de benzoíla, persulfato e tetrafenilborato.[0033] The oxidation process of the electrochemiluminescent marker takes place in the presence of a sacrificial reducing compound. A suitable sacrificial compound in the context of the present invention is any compound capable of causing oxidation of the electrochemiluminescent marker to produce the excited state, which results in the emission of light. Non-limiting examples include aprotic organic solvents such as tripropylamine, benzoyl peroxide, persulfate and tetraphenylborate.

[0034] A título de exemplo, considerando um sistema com o marcador eletroquimioluminescente [Ru(bpy)3] 2+, uma vez em presença de um redutor de sacrifício e sob a aplicação de uma tensão, 0 marcador sofre oxidação com consequente emissão de luz. Essa luz, resultante da oxidação do [Ru(bpy)3] 2+ e consequente redução do redutor de sacrifício para produzir 0 estado excitado, é referida como eletroquimioluminescência (ECL).[0034] As an example, considering a system with the electrochemiluminescent marker [Ru(bpy)3] 2+, once in the presence of a sacrificial reducer and under the application of a voltage, the marker undergoes oxidation with consequent emission of light. This light, resulting from the oxidation of [Ru(bpy)3] 2+ and consequent reduction of the sacrificial reductant to produce the excited state, is referred to as electrochemiluminescence (ECL).

[0035] A reação de ECL mais eficiente conhecida atualmente é a baseada no composto [Ru(bpy)3] 2+ tendo tripropilamina (TPA) como co-reagente e redutor de sacrifício. As etapas para a geração de ECL no referido exemplo são mostradas nas reações a seguir:
[Ru(bpy)3] 2+ → [Ru(bpy)3] 3+ + e- (1)
[Ru(bpy)3] 3+ + TPA → [Ru(bpy)3] 2+ + TPA+· (2a)
TPA-→ TPA+·+e- (2b)
TPA+·→ TPA·+H+ (3)
[Ru(bpy)3] 3++ TPA·→ [Ru(bpy)3] 2+* (4)
[Ru(bpy)3] 2+* → [Ru(bpy)3] 2+ + hv (610nm) (5)[0035] The most efficient ECL reaction currently known is based on the compound [Ru(bpy)3] 2+ having tripropylamine (TPA) as co-reagent and sacrificial reductant. The steps for generating ECL in the above example are shown in the following reactions:
[Ru(bpy)3] 2+ → [Ru(bpy)3] 3+ + e- (1)
[Ru(bpy)3] 3+ + TPA → [Ru(bpy)3] 2+ + TPA+· (2a)
TPA-→ TPA+·+e- (2b)
TPA+·→ TPA·+H+ (3)
[Ru(bpy)3] 3++ TPA·→ [Ru(bpy)3] 2+* (4)
[Ru(bpy)3] 2+* → [Ru(bpy)3] 2+ + hv (610nm) (5)

[0036] Nesse sentido, em uma concretização, o sistema da presente invenção pode compreender ainda uma solução compreendendo um composto redutor de sacrifício compatível com o marcador eletroquimioluminescente utilizado. Umtécnico no assunto saberá, combase nos conhecimentos disponíveis na técnica, escolher um par de marcador eletroquimioluminescente e composto redutor de sacrifício adequado para detecção de ECL e, consequentemente, de RNA por meio da aplicação do sistema da presente invenção.[0036] Accordingly, in one embodiment, the system of the present invention may further comprise a solution comprising a sacrificial reducing compound compatible with the electrochemiluminescent marker used. A technician in the subject will know, based on the knowledge available in the art, to choose a pair of electrochemiluminescent marker and sacrificial reducing compound suitable for detection of ECL and, consequently, of RNA through the application of the system of the present invention.

[0037] A detecção ou quantificação da referida reação de ECL é realizada em cada região da superfície do eletrodo de trabalho do dispositivo de detecção ou quantificação da presente invenção. A amostra, após incubação com a solução compreendendo as sondas de captura e detecção e ressuspensa com o composto redutor de sacrifício, deve ser transferida para pelo menos uma região de superfície do eletrodo de trabalho do sistema aqui definido.[0037] The detection or quantification of said ECL reaction is performed in each region of the surface of the working electrode of the detection or quantification device of the present invention. The sample, after incubation with the solution comprising the capture and detection probes and resuspended with the sacrificial reducing compound, must be transferred to at least one surface region of the working electrode of the system defined here.

[0038] A Figura 1 mostra uma concretização exemplificativa do dispositivo de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente compreendido no sistema aqui definido. O dispositivo de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente 1 compreende pelo menos um eletrodo de trabalho 2, o qual é adaptado para receber uma tensão de uma fonte de tensão. Cada eletrodo de trabalho 2 compreende uma ou mais regiões de superfície 4, cada uma delas sendo adaptada para receber um bioconjugado. Abaixo de cada região da superfície 4 do eletrodo de trabalho 2 é posicionado um ímã 3. O dispositivo de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente 1 da presente invenção é um sistema estático, na qual uma alíquota da amostra é posicionada diretamente em uma região da superfície 4 do eletrodo de trabalho 2.[0038] Figure 1 shows an exemplary embodiment of the electrochemiluminescent detection or quantification device comprised in the system defined herein. The electrochemiluminescent detection or quantification device 1 comprises at least one working electrode 2, which is adapted to receive a voltage from a voltage source. Each working electrode 2 comprises one or more surface regions 4, each of which is adapted to receive a bioconjugate. Below each region of the surface 4 of the working electrode 2, a magnet 3 is positioned. The electrochemiluminescent detection or quantification device 1 of the present invention is a static system, in which an aliquot of the sample is positioned directly on a region of the surface 4 of the working electrode 2.

[0039] Em cada região de superfície 4, será posicionada uma alíquota da amostra que foi incubada com sondas de captura e detecção complementares a uma primeira e segunda regiões do RNA a ser detectado. Caso haja na amostra moléculas de RNA compreendendo as referidas primeira e segunda regiões, haverá hibridização das sondas de captura e detecção à molécula de RNA, formando, assim, o bioconjugado. Em vista da partícula ou nanopartícula magnética conjugada à sonda de captura, o bioconjugado será magneticamente atraído ao eletrodo de trabalho 2 devido à presença do ímã 3 abaixo de cada região de superfície 4.[0039] In each surface region 4, an aliquot of the sample that was incubated with capture and detection probes complementary to a first and second region of the RNA to be detected will be positioned. If there are RNA molecules in the sample comprising the aforementioned first and second regions, there will be hybridization of the capture and detection probes to the RNA molecule, thus forming the bioconjugate. In view of the magnetic particle or nanoparticle conjugated to the capture probe, the bioconjugate will be magnetically attracted to the working electrode 2 due to the presence of the magnet 3 below each surface region 4.

[0040] Em vista do marcador eletroquimioluminescente conjugado à sonda de detecção, que será oxidado na presença do composto redutor de sacrifício, é possível detectar geração de luz nas regiões de superfície 4 onde houve formação do bioconjugado, ou seja, onde há presença do RNA.[0040] In view of the electrochemiluminescent marker conjugated to the detection probe, which will be oxidized in the presence of the sacrificial reducing compound, it is possible to detect light generation in the surface regions 4 where the bioconjugate was formed, that is, where the RNA is present .

[0041] Em cada região de superfície 4, portanto, é detectada uma reação de ECL. Seem cada região de superfície 4 for colocada uma alíquota de uma amostra de indivíduos diferentes, todas incubadas com a mesma solução de sondas de captura e detecção, é possível realizar uma pluralidade de detecções simultâneas no dispositivo de detecção 1 da presente invenção e definir em quais das amostras há presença do RNA.[0041] On each 4 surface region, therefore, an ECL reaction is detected. If in each surface region 4 an aliquot of a sample from different individuals is placed, all incubated with the same solution of capture and detection probes, it is possible to carry out a plurality of simultaneous detections in the detection device 1 of the present invention and define in which of the samples there is presence of the RNA.

[0042] Seem cada região de superfície 4 for colocada uma alíquota de uma amostra de um mesmo indivíduo, porém incubadas com diferentes soluções de sondas de captura e detecção (ou seja, sondas de captura e detecção complementares a primeira e segunda região de RNAs diferentes), é possível realizar uma pluralidade de detecções simultâneas no dispositivo de detecção 1 da presente invenção e definir qual RNA está presente na amostra.[0042] If in each surface region 4 an aliquot of a sample from the same individual is placed, but incubated with different solutions of capture and detection probes (that is, capture and detection probes complementary to the first and second region of different RNAs ), it is possible to perform a plurality of simultaneous detections on the detection device 1 of the present invention and define which RNA is present in the sample.

[0043] A intensidade da luz detectada é proporcional a quantidade de bioconjugados formados pelahibridização entre a sonda de captura, o RNA de interesse e a sonda de detecção. Sendo assim, é também válido afirmar que a intensidade da luz detectada é proporcional à quantidade de RNA presente na(s) amostra(s). Consequentemente, a diferença de intensidade de luz nas imagens obtidas pela reação de ECL permite a quantificação de RNA em cada amostra aplicada em cada região de superfície 4.[0043] The intensity of the detected light is proportional to the amount of bioconjugates formed by the hybridization between the capture probe, the RNA of interest and the detection probe. Therefore, it is also valid to state that the intensity of the detected light is proportional to the amount of RNA present in the sample(s). Consequently, the difference in light intensity in the images obtained by the ECL reaction allows quantification of RNA in each sample applied to each surface region 4.

[0044] Para que ocorra as referidas reações de ECL em cada superfície 4, é necessária a aplicação de uma tensão. Essa tensão deve ser aplicada no pelo menos um eletrodo de trabalho 2 do dispositivo de detecção eletroquimioluminescente 1 compreendido no sistema da presente invenção. Esse pelo menos um eletrodo de trabalho 2 é adaptado para receber a referida tensão, que pode ser produzida por qualquer dispositivo capaz de gerar uma tensão - aqui referidos como “fonte de tensão”. Exemplos não limitativos de fontes de tensão incluem potenciostatos, fontes reguláveis, baterias ou capacitores.[0044] For the aforementioned ECL reactions to occur on each surface 4, it is necessary to apply a voltage. This voltage must be applied to at least one working electrode 2 of the electrochemiluminescent detection device 1 comprised in the system of the present invention. This at least one working electrode 2 is adapted to receive said voltage, which can be produced by any device capable of generating a voltage - herein referred to as "voltage source". Non-limiting examples of voltage sources include potentiostats, dimmable sources, batteries or capacitors.

[0045] Nesse sentido, o sistema da presente invenção pode compreender ainda uma fonte de tensão para aplicação de uma tensão no pelo menos um eletrodo de trabalho. Como anteriormente descrito, a reação de ECL culmina na emissão de luz. É a detecção da luz gerada por eletroquimioluminescência em cada região da superfície 4 do eletrodo de trabalho 2 que indicará a presença de bioconjugados, ou seja, hibridizados entre as sondas de captura, o RNA e as sondas de detecção, na amostra.[0045] In this sense, the system of the present invention may also comprise a voltage source for applying a voltage to at least one working electrode. As previously described, the ECL reaction culminates in the emission of light. It is the detection of the light generated by electrochemiluminescence in each region of the surface 4 of the working electrode 2 that will indicate the presence of bioconjugates, that is, hybridized between the capture probes, the RNA and the detection probes, in the sample.

[0046] Para esta detecção, a aplicação da tensão ao dispositivo de detecção 1 contendo alíquotas de amostras em uma ou mais regiões da superfície 4 do eletrodo de trabalho 2 é realizada por meio de um captador de imagem. No contexto da presente invenção, um captador de imagem é qualquer dispositivo capazde detectar luz no comprimento de onda emitido pela oxidação do marcador eletroquimioluminescente utilizado no sistema. Exemplos não limitativos de captadores de imagem são fotodocumentadores, fotodiodos, câmeras em geral ou dispositivos de captura de imagem como um Semicondutor de Óxido Metálico Complementar (CMOS, do inglês Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) ou Dispositivo de Carga Acoplada (CCD, do inglês Charge-Coupled Device). Em uma concretização, a ECL é gerada em cada região da superfície 4 pela aplicação de uma tensão por meio de uma fonte de tensão e é concomitantemente detectada pelo captador de imagem.[0046] For this detection, the application of voltage to the detection device 1 containing sample aliquots in one or more regions of the surface 4 of the working electrode 2 is performed using an image pickup. In the context of the present invention, an image pickup is any device capable of detecting light in the wavelength emitted by the oxidation of the electrochemiluminescent marker used in the system. Non-limiting examples of image pickups are photodocumenters, photodiodes, cameras in general, or image capture devices such as a Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) or Charge-Coupled Device (CCD). Charge-Coupled Device). In one embodiment, the ECL is generated in each surface region 4 by applying a voltage via a voltage source and is concomitantly detected by the imager.

[0047] Em um segundo aspecto, o presente pedido refere-se ao uso do sistema de detecção descrito acima a detecção ou quantificação de RNA.[0047] In a second aspect, the present application relates to the use of the detection system described above for the detection or quantification of RNA.

[0048] Conforme anteriormente descrito, o RNA a ser detectado pelo uso do sistema da presente invenção pode ter origem em qualquer organismo vivo. De maneira não limitativa, o RNA pode ser um RNA de procarionte, um RNA de arqueia ou um RNA de eucarionte. Exemplos não limitativos da presente invenção são o uso do sistema para detecção ou quantificação de RNAs bacterianos, virais ou de mamífero. Em uma concretização, o RNA é um RNA virai. Em uma concretização particular, o RNA é um RNA de virus causador de doença infecciosa em humanos. Em uma concretização mais particular, o RNA é um RNA de um vírus da família Coronaviridae.[0048] As previously described, the RNA to be detected using the system of the present invention can originate from any living organism. In a non-limiting manner, the RNA can be a prokaryotic RNA, an archaeal RNA or a eukaryotic RNA. Non-limiting examples of the present invention are the use of the system for detection or quantification of bacterial, viral or mammalian RNAs. In one embodiment, the RNA is a viral RNA. In a particular embodiment, the RNA is an RNA of virus causing infectious disease in humans. In a more particular embodiment, the RNA is an RNA from a virus of the Coronaviridae family.

[0049] Em um terceiro aspecto, o presente pedido refere-se a um método de detecção ou quantificação de RNA. Este método compreende:
a incubação de pelo menos uma amostra com pelo menos uma solução compreendendo pelo menos uma sonda de captura covalentemente conjugada a partícula ou nanopartícula magnética e pelo menos uma sonda de detecção covalentemente conjugada a um marcador eletroquimioluminescente, em que a sonda de captura se liga a uma primeira região do RNA e a sonda de detecção se liga a uma segunda região do RNA, formando um bioconjugado, quando houver na amostra RNA compreendendo as primeira e segunda regiões complementares às sondas de capturae detecção;
adição de uma solução compreendendo um composto redutor de sacrifício à amostra incubada com as pelo menos uma sonda de captura e uma sonda de detecção; transferência de pelo menos uma amostra para pelo menos uma região da superfície de um eletrodo de trabalho de um dispositivo de detecção eletroquimioluminescente, em que os bioconjugados, se presentes na pelo menos uma amostra, são atraídos à superfície do eletrodo de trabalho por meio de pelo menos um imã posicionado abaixo de cada região da superfície do eletrodo de trabalho;
a aplicação de uma tensão no pelo menos um eletrodo de trabalho pormeio de uma fonte de tensão;
detecção de luz gerada por eletroquimioluminescência pelo marcador conjugado a sonda de detecção, quando presente no bioconjugado, em cada região da superfície do eletrodo de trabalho.[0049] In a third aspect, the present application relates to a method of detection or quantification of RNA. This method comprises:
incubating at least one sample with at least one solution comprising at least one capture probe covalently conjugated to the magnetic particle or nanoparticle and at least one detection probe covalently conjugated to an electrochemiluminescent label, wherein the capture probe binds to a first region of RNA and the detection probe binds to a second region of RNA, forming a bioconjugate, when there is RNA in the sample comprising the first and second regions complementary to the capture and detection probes;
adding a solution comprising a sacrificial reducing compound to the sample incubated with the at least one capture probe and one detection probe; transferring at least one sample to at least one region of the surface of a working electrode of an electrochemiluminescent detection device, wherein bioconjugates, if present in the at least one sample, are attracted to the surface of the working electrode by means of at least at least one magnet positioned below each region of the surface of the working electrode;
applying a voltage to the at least one working electrode via a voltage source;
detection of light generated by electrochemiluminescence by the marker conjugated to the detection probe, when present in the bioconjugate, in each region of the surface of the working electrode.

[0050] Com este método, é possível realizar a detecção ou a quantificação de RNAs de maneira livre de amplificações ou anticorpos e em temperatura ambiente, o que viabiliza um menor custo e menor tempo de execução.[0050] With this method, it is possible to perform the detection or quantification of RNAs free of amplifications or antibodies and at room temperature, which enables a lower cost and shorter execution time.

[0051] Durante a etapa de incubação da pelo menos uma amostra com pelo menos uma solução compreendendo as sondas de captura e de detecção, as sequências especificas de bases nitrogenadas do RNA a ser detectado hibridizam com as sondas de captura e detecção, que possuem sequências respectivamente complementares a uma primeirae uma segunda região do RNA. Destaforma, as sondas de captura possibilitam a separação dos bioconjugados formados por precipitação magnética ao passo que as sondas de detecção possibilitam a detecção ou quantificação dos bioconjugados por eletroquimioluminescência.[0051] During the incubation step of the at least one sample with at least one solution comprising the capture and detection probes, the specific sequences of nitrogenous bases of the RNA to be detected hybridize with the capture and detection probes, which have sequences respectively complementary to a first and a second region of the RNA. Thus, the capture probes make it possible to separate the bioconjugates formed by magnetic precipitation, while the detection probes make it possible to detect or quantify the bioconjugates by electrochemiluminescence.

[0052] Em uma concretização, as primeira e segunda regiões do RNA reconhecidas pela sonda de captura e pela sonda de detecção, respectivamente, são regiões distintas e não sobrepostas do RNA.[0052] In one embodiment, the first and second regions of the RNA recognized by the capture probe and the detection probe, respectively, are distinct and non-overlapping regions of the RNA.

[0053] Em uma concretização, as primeira e segunda regiões do RNA são espaçadas uma da outra por até 500 nucleotídeos.[0053] In one embodiment, the first and second regions of the RNA are spaced apart by up to 500 nucleotides.

[0054] As sondas referidas na presente invenção são sequências de nucleotídeos que se ligam, por hibridização, a sequências especificas de bases nitrogenadas do RNA a ser detectado. Desta forma, as sondas de captura possibilitam a separação dos bioconjugados formados por precipitação magnética ao passo que as sondas de detecção possibilitam a detecção ou quantificação dos bioconjugados por eletroquimioluminescência.[0054] The probes referred to in the present invention are sequences of nucleotides that bind, by hybridization, to specific sequences of nitrogenous bases of the RNA to be detected. In this way, the capture probes allow the separation of the bioconjugates formed by magnetic precipitation, while the detection probes allow the detection or quantification of the bioconjugates by electrochemiluminescence.

[0055] Estas sondas podem ser construídas por um técnico no assunto levando-se em consideração o conhecimento amplamente disponível na técnica sobre o pareamento de bases nitrogenadas e a sequência de bases específica do RNA a ser detectado. A tecnologia usada para a síntese dos oligonucleotídeos é qualquer uma daquelas disponíveis no estado da técnica, conforme já descrito anteriormente.[0055] These probes can be constructed by a person skilled in the art, taking into account the knowledge widely available in the art on the pairing of nitrogenous bases and the specific base sequence of the RNA to be detected. The technology used for the synthesis of the oligonucleotides is any one of those available in the state of the art, as previously described.

[0056] Em uma concretização, as sondas de captura e detecção compreendem, cada uma, de 10 a 30 nucleotídeos respectivamente complementares à primeira e à segundaregião do RNA.[0056] In one embodiment, the capture and detection probes each comprise from 10 to 30 nucleotides respectively complementary to the first and second regions of the RNA.

[0057] O RNA a ser detectado podeter origem em qualquer organismo vivo. De maneira não limitativa, o RNA pode ser um RNA de procarionte, um RNA de arqueia ou um RNA de eucarionte. Exemplos não limitativos da presente invenção são RNAs bacterianos, virais ou de mamífero. Em uma concretização, 0 RNA é um RNA virai. Em uma concretização particular, o RNA é um RNA de vírus causador de doença infecciosa em humanos. Em uma concretização mais particular, o RNA é um RNA de um vírus da família Coronaviridae.[0057] The RNA to be detected may originate from any living organism. In a non-limiting manner, the RNA can be a prokaryotic RNA, an archaeal RNA or a eukaryotic RNA. Non-limiting examples of the present invention are bacterial, viral or mammalian RNAs. In one embodiment, the RNA is a viral RNA. In a particular embodiment, the RNA is an RNA of virus causing infectious disease in humans. In a more particular embodiment, the RNA is an RNA from a virus of the Coronaviridae family.

[0058] O marcador eletroquimioluminescente conjugado às sondas de detecção pode ser qualquer composto capaz de emitir luz após reação de oxidação e emissão de tensão, conforme já descrito anteriormente. Em uma concretização particular, o marcador eletroquimioluminescente é o [Ru(bpy)3] 2+.[0058] The electrochemiluminescent marker conjugated to the detection probes can be any compound capable of emitting light after an oxidation reaction and voltage emission, as previously described. In a particular embodiment, the electrochemiluminescent label is [Ru(bpy)3] 2+ .

[0059] Opcionalmente, o método inclui etapas adicionais de lavagem dos bioconjugados formados por meio de uma solução de lavagem com propriedades detergentes para minimizar possibilidades de detecções espúrias. Exemplos não limitativos de solução de lavagem são tampão Tris contendo Tween-20, tampão Tris-EDTA contendo Tween-20, Tampão NE contendo Tween-20, tampão PBS (NaCl, KCl, Na2HPO4, e KH2PO4).[0059] Optionally, the method includes additional steps of washing the formed bioconjugates using a washing solution with detergent properties to minimize possibilities of spurious detections. Non-limiting examples of wash solution are Tris buffer containing Tween-20, Tris-EDTA buffer containing Tween-20, NE Buffer containing Tween-20, PBS buffer (NaCl, KCl, Na2HPO4, and KH2PO4).

[0060] A etapa de adição de um composto de sacrifício capaz de causar a oxidação do marcador eletroquimioluminescente conjugado covalentemente às sondas de detecção resulta, quando aplicada uma tensão, na emissão de luz que possibilita a detecção do RNA de interesse na amostra. Em uma eoncretização, o composto adicionado nestaetapa é a tripropilamina.[0060] The step of adding a sacrificial compound capable of causing oxidation of the covalently conjugated electrochemiluminescent marker to the detection probes results, when a voltage is applied, in the emission of light that enables the detection of the RNA of interest in the sample. In one embodiment, the compound added in this step is tripropylamine.

[0061] Após transferência da pelo menos uma amostra para um dispositivo de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente, a atração dos bioconjugados presentes na pelo menos uma amostra para pelo menos uma região da superfície de um eletrodo de trabalho do dispositivo de detecção ou quantificação eletroquimioluminescente ocorrerá por magnetismo exercido pelos ímãs posicionados abaixo de cada região da superfície, nas quais a pelo menos uma amostra nos bioconjugados contendo as partículas magnéticas covalentemente conjugadas são aplicadas.[0061] After transferring at least one sample to an electrochemiluminescent detection or quantification device, the attraction of the bioconjugates present in at least one sample to at least one region of the surface of a working electrode of the electrochemiluminescent detection or quantification device will occur by magnetism exerted by magnets positioned below each surface region to which the at least one sample in the bioconjugates containing the covalently conjugated magnetic particles is applied.

[0062] Com a aplicação de uma tensão sobre o pelo menos um eletrodo de trabalho por meio de uma fonte de tensão, ocorre a referida oxidação do marcador eletroquimioluminescente seguida de emissão de luz. A fonte de tensão, sua voltagem e tempo de aplicação podem variar de acordo com a natureza da amostra e são facilmente definidas pelo técnico no assunto. Em uma concretização particular, essa tensão é de 1 a 2V e o tempo de aplicação varia de 100 a 200 segundos.[0062] With the application of a voltage on at least one working electrode by means of a voltage source, the said oxidation of the electrochemiluminescent marker occurs followed by light emission. The voltage source, its voltage and application time may vary according to the nature of the sample and are easily defined by the person skilled in the art. In a particular embodiment, this voltage is 1 to 2V and the application time varies from 100 to 200 seconds.

[0063] A luz emitida pela reação de ECL durante 0 método da presente invenção pode ser captada por qualquer dispositivo capaz de detectar luz no comprimento de onda emitido pela oxidação do marcador eletroquimioluminescente. Em uma concretização, a detecção da emissão de luz referida ocorre por meio de um captador de imagem, sendo concomitante a etapa de aplicação da tensão.[0063] The light emitted by the ECL reaction during the method of the present invention can be captured by any device capable of detecting light in the wavelength emitted by the oxidation of the electrochemiluminescent marker. In one embodiment, the detection of the referred light emission occurs by means of an image pickup, concomitantly with the voltage application step.

[0064] A intensidade da emissão de luz pelo sistema durante o método aqui proposto é proporcional à quantidade de bioconjugados formados pela hibridização entre a sonda de captura, o RNA de interesse e a sonda de detecção, sendo também correto afirmar que a intensidade de emissão de luz é proporcional à quantidade de RNA na(s) amostra(s). Consequentemente, o presente método viabiliza, alémda detecção, a quantificação do RNA de interesse na(s) amostra(s) em teste em vista da diferença de intensidade de luz nas imagens obtidas pela reação de ECL.[0064] The intensity of light emission by the system during the method proposed here is proportional to the amount of bioconjugates formed by the hybridization between the capture probe, the RNA of interest and the detection probe, and it is also correct to state that the emission intensity of light is proportional to the amount of RNA in the sample(s). Consequently, the present method enables, in addition to detection, the quantification of the RNA of interest in the sample(s) under test in view of the difference in light intensity in the images obtained by the ECL reaction.

[0065] Esta quantificação pode ser realizada por meio do estabelecimento de uma curva padrão de diluição de uma solução contendo o RNA de interesse com concentração conhecida. A partir dos resultados de detecção obtidos para a curva padrão, pode-se calcular a concentração do RNA de interesse na(s) amostra(s) testada(s).[0065] This quantification can be performed by establishing a standard dilution curve of a solution containing the RNA of interest with known concentration. From the detection results obtained for the standard curve, the concentration of the RNA of interest in the tested sample(s) can be calculated.

[0066] O método possibilita uma pluralidade de detecções ou quantificações de RNA simultaneamente. Conforme anteriormente descrito, se em cada região de superfície de um eletrodo de trabalho do dispositivo for colocada uma alíquota de uma amostra de indivíduos diferentes, todas incubadas com a mesma solução de sondas de captura e detecção, é possível realizar uma pluralidade de detecções simultâneas e definir em quais das amostras hápresençadoRNA. Assim, em uma concretização, o eletrodo de trabalho recebe amostras de indivíduos diferentes. Duas ou mais regiões de superfície do eletrodo de trabalho podem receber a mesma amostra, caso pelo menos uma duplicata seja realizada.[0066] The method allows a plurality of RNA detections or quantifications simultaneously. As previously described, if an aliquot of a sample from different individuals is placed in each surface region of a working electrode of the device, all incubated with the same solution of capture and detection probes, it is possible to carry out a plurality of simultaneous detections and define in which of the samples there is presence of RNA. Thus, in one embodiment, the working electrode receives samples from different individuals. Two or more working electrode surface regions can receive the same sample if at least one duplicate is performed.

[0067] Se em cada região de superfície for colocada uma alíquota de uma amostra de um mesmo indivíduo, porém incubadas com diferentes soluções de sondas de captura e detecção (ou seja, sondas de captura e detecção complementares a primeira e segunda região de RNAs diferentes), é possível realizar uma pluralidade de detecções simultâneas e definir qual RNA está presente na amostra. Assim, em uma concretização, o eletrodo de trabalho recebe amostras de um mesmo indivíduo incubadas com soluções de sondas de captura e detecção diferentes. Duas ou mais regiões da superfície do eletrodo de trabalho podem receber amostras incubadas com a mesma solução de sondas, caso pelo menos uma duplicata seja realizada.[0067] If an aliquot of a sample from the same individual is placed in each surface region, but incubated with different solutions of capture and detection probes (that is, capture and detection probes complementary to the first and second region of different RNAs ), it is possible to perform a plurality of simultaneous detections and define which RNA is present in the sample. Thus, in one embodiment, the working electrode receives samples from the same individual incubated with different capture and detection probe solutions. Two or more regions of the surface of the working electrode can receive samples incubated with the same probe solution, if at least one duplicate is performed.

[0068] No contexto da presente invenção, a amostra pode ser qualquer amostra sólida ou fluida de um indivíduo. Exemplos não limitativos de amostras sólidas são fezes, escarro, biopsia, tecido, raspado bucal, raspado nasofaríngeo. Exemplos não limitativos de amostras fluidas são saliva, urina, sangue, swab oral ou nasal, soro, plasma, lágrima, ascite. Em uma concretização, a amostra é um fluido de um indivíduo.[0068] In the context of the present invention, the sample may be any solid or fluid sample from an individual. Non-limiting examples of solid samples are stool, sputum, biopsy, tissue, buccal scraping, nasopharyngeal scraping. Non-limiting examples of fluid samples are saliva, urine, blood, oral or nasal swab, serum, plasma, tear, ascites. In one embodiment, the sample is a fluid from an individual.

EXAMPLES Construction of disposable electrochemiluminescent device

[0069] Os dispositivos desenvolvidos são descartáveis e foram construídos com material de baixo custo e encontrados, em sua maioria, no mercado local. O dispositivo construído é com posto por um eletrodo de trabalho de carbono (WE) contendo um arranjo com 20 regiões sensoras e um eletrodo de referência (RE) e um contra eletrodo (CE). O dispositivo foi construído por método serigráfico sendo o desenho dos padrões contendo os formatos dos dispositivos e dos eletrodos realizado com o software Silhouette Studio®. Usou-se a impressora de corte Silhouette Cameo, Silhouette America, Inc., para recortar ο filme de vinil adesivo no formato dos dispositivos de interesse. Após a impressão, as porções indesejadas foram retiradas usando uma pinça, deixando o molde dos eletrodos, como uma máscara negativa. Em seguida, o vinil com o molde foi transferido para uma folha de PVC (0,5mm de altura). A tintade carbono (C2051014P10, Gwent Electronic Materials Ltd) foi então aplicada utilizando-se um pequeno rodo. Após a cura da tinta por 60 minutos a 60°C, a tinta de Ag|AgC1 (C2051014P10, Gwent Electronic Materials Ltd) foi depositada como o eletrodo de pseudo-referência, seguido de cura por 30 minutos a 60°C. Na sequência, a máscara de vinil foi removida e um processo de laminação foi utilizado para definir a área geométrica e isolar os eletrodos. Nesta etapa, foi utilizada novamente vinil adesivo devidamente cortado na impressora de corte e colocado sobre a folha de PVC contendo os eletrodos. Aplicou-se calor e pressão por meio de uma prensa aquecidaa 120°C por 120 segundos e resfriamento por 30 minutos, obtendo-se os eletrodos prontos para o uso. Após esta etapa, um adesivo de vinil foi aplicado, que foi previamente cortado com a impressora de recorte de forma a gerar as regiões da superfície do eletrodo referentes as regiões sensores. Este adesivo foi colado sobre o eletrodo de trabalho. A Figura 2 apresenta um esquema da construção do arranjo de eletrodos.[0069] The devices developed are disposable and were built with low-cost material and found, for the most part, in the local market. The constructed device is composed of a carbon working electrode (WE) containing an arrangement with 20 sensor regions and a reference electrode (RE) and a counter electrode (CE). The device was built using the serigraphic method, with the design of the patterns containing the shapes of the devices and electrodes carried out using the Silhouette Studio® software. A Silhouette Cameo Cutting Printer, Silhouette America, Inc., was used to cut the adhesive vinyl film into the shape of the devices of interest. After printing, unwanted portions were removed using tweezers, leaving the electrode mold, like a negative mask. Then, the vinyl with the mold was transferred to a PVC sheet (0.5 mm high). Carbon paint (C2051014P10, Gwent Electronic Materials Ltd) was then applied using a small squeegee. After curing the ink for 60 minutes at 60°C, Ag|AgC1 ink (C2051014P10, Gwent Electronic Materials Ltd) was deposited as the pseudo-reference electrode, followed by curing for 30 minutes at 60°C. Next, the vinyl mask was removed and a lamination process was used to define the geometric area and isolate the electrodes. In this step, adhesive vinyl duly cut in the cutting printer was used again and placed on the PVC sheet containing the electrodes. Heat and pressure were applied through a press heated to 120°C for 120 seconds and cooling for 30 minutes, obtaining the electrodes ready for use. After this step, a vinyl sticker was applied, which was previously cut with the cutting printer in order to generate the electrode surface regions referring to the sensor regions. This sticker was pasted over the working electrode. Figure 2 presents a schematic of the construction of the electrode array.

Preparation of magnetic particles conjugated with capture DNA oligonucleotides (capture probes)

[0070] Neste exemplo, foram utilizadas partículas magnéticas comerciais. No entanto, outros tipos de partículas ou nanopartículas magnéticas podem ser empregues, sejam comerciais, sintetizadas ou variações destas, com incorporações de outros elementos ou compostos.[0070] In this example, commercial magnetic particles were used. However, other types of magnetic particles or nanoparticles can be used, whether commercial, synthesized or variations thereof, with incorporation of other elements or compounds.

[0071] As partículas magnéticas (1μm de diâmetro) foram modificadas seguindo o protocolo proposto pelo fabricante (Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid, Invitrogen), entretanto, diferentes protocolos podem ser empregues. Inicialmente, as partículas magnéticas foram mantidas no banho ultrossom por 10 minutos e agitadas em vórtex por 5 minutos para dispersão. Em seguida, 50 μL das partículas magnéticas foram dispersas em 1mL de tampão MES (ácido 4-morfolinoetanosulfonico monohidratado) 100 mM pH 4,8, foram lavadas três vezes com o mesmo tampão com auxílio da estante magnética para separação das partículas e descarte da solução tampão. Após etapa de lavagem, foi adicionado 1mL de solução contendo o oligonucleotídeos de DNA de captura a 2 μmol/L, preparada em solução mista de EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) 60 mmol/L eNHS (A-hidroxisuccinimida) 22 mmol/L em tampão Tris-EDTA (Composição: 10 mmol L-1 Tis-HCl (do inglês Tris Hydrochloride)', 1 mmol L-1 EDTA (do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid); pH entre 7,6 - 8,0). Esta solução foi mantida em incubação com agitação lenta em temperatura ambiente por 24 horas para imobilização dos oligonucleotídeos sobre as partículas magnéticas.[0071] The magnetic particles (1μm in diameter) were modified following the protocol proposed by the manufacturer (Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid, Invitrogen), however, different protocols can be used. Initially, the magnetic particles were kept in the ultrasound bath for 10 minutes and vortexed for 5 minutes to disperse. Then, 50 μL of the magnetic particles were dispersed in 1 mL of MES buffer (4-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate) 100 mM pH 4.8, washed three times with the same buffer with the aid of the magnetic shelf to separate the particles and discard the solution plug. After the washing step, 1mL of solution containing the capture DNA oligonucleotide at 2 μmol/L, prepared in a mixed solution of EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 60 mmol/L and NHS (A -hydroxysuccinimide) 22 mmol/L in Tris-EDTA buffer (Composition: 10 mmol L-1 Tis-HCl (Tris Hydrochloride)', 1 mmol L-1 EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid); pH between 7.6 - 8.0). This solution was incubated with slow agitation at room temperature for 24 hours to immobilize the oligonucleotides on the magnetic particles.

[0072] Após tempo de incubação, as sondas de captura (partículas magnéticas + oligonucleotídeos de DNA de captura) foram separadas magneticamente e removido o sobrenadante. Em seguida, as sondas foram lavadas três vezes com 1 mL TE-Tw20 (tampão Tris-EDTA com 0,05% de Tween 20). A seguir, foi realizada mais uma etapa de incubação com etanolamina (1,0 M; pH 8) por 2 horas, a fim de bloquear os sítios de ligações livres e evitar ligações não específicas. Novamente após tempo de incubação, as sondas foram lavadas três vezes com 1 mL TE-Tw20. Por fim, foram dispersas em 1 mL de TE-Tw20 e armazenadas sob refrigeração até o uso. Preparação da nanopartícula de silica com complexo [Ru(bpy)3] Cl2 e sua conjugacão a oligonucleotídeos de DNA de detecção (sondas de detecção)[0072] After incubation time, the capture probes (magnetic particles + capture DNA oligonucleotides) were magnetically separated and the supernatant removed. Then, the probes were washed three times with 1 ml TE-Tw20 (Tris-EDTA buffer with 0.05% Tween 20). Next, another incubation step with ethanolamine (1.0 M; pH 8) was performed for 2 hours, in order to block free binding sites and avoid non-specific binding. Again after incubation time, the probes were washed three times with 1 ml TE-Tw20. Finally, they were dispersed in 1 mL of TE-Tw20 and stored under refrigeration until use. Preparation of silica nanoparticle with [Ru(bpy)3]Cl2 complex and its conjugation to detection DNA oligonucleotides (detection probes)

[0073] Em um balão foram adicionados 1800 μL de TrintonX100, 1800 μL de n-hexanol, 7500 μL de ciclo hexano e 340 μL de solução de [Ru(bpy)3] Cl2 a 0,04 M. Essa mistura foi deixada em agitação por 30 minutos. Em seguida foram adicionados 100 μL de TOES (do inglês tetraethyl orthosilicate) e 60 μL de NH4OH e deixados em agitação vigorosa por 24 horas a temperatura ambiente no escuro. Após tempo de síntese, adicionou-se 20 mL de acetona para precipitação. O sólido laranja (composto Ru-Si) foi separado por centrifugação e lavado com água e etanol, seco na estufa por 1 hora.[0073] In a flask were added 1800 μL of TrintonX100, 1800 μL of n-hexanol, 7500 μL of cyclohexane and 340 μL of 0.04 M [Ru(bpy)3]Cl2 solution. This mixture was left in stirring for 30 minutes. Then, 100 μL of TOES (tetraethyl orthosilicate) and 60 μL of NH4OH were added and left in vigorous agitation for 24 hours at room temperature in the dark. After synthesis time, 20 mL of acetone was added for precipitation. The orange solid (Ru-Si compound) was separated by centrifugation and washed with water and ethanol, dried in an oven for 1 hour.

[0074] Para a imobilização dos oligonucleotídeos de DNA de detecção no composto Ru-Si, foi realizado o seguinte procedimento: Pesou-se 2 mg do composto Ru-Si e adicionou-se 1mL de água ultrapura. Essa suspensão foi mantida no ultrassom por 2 horas, para completa dispersão e homogeneização das nanopartículas de sílica imobilizadas com [Ru(bpy)3] 2+. Em seguida, a dispersão foicentrifugadae eliminado o sobrenadante. Adicionou-se 1mL de policloreto de dialildimetilamônio (0,033 mg/mL) e deixou-se 30 minutos em incubação lenta. Após tempo, a suspensão foi centrifugada e lavada três vezes com água ultrapura. Após lavagem, adicionou-se 1mL de ácido poliacrílico (0,033 mg/mL) e deixou-se em incubação lenta por 30 minutos. Em seguida a suspensão foi centrifugada e lavada três vezes com água ultrapura. Então, foi preparada uma solução mista de EDC / NHS (0,4 mol/L / 0,1 mol/L) em tampão Tris-EDTA e adicionado 40 μL (100 mM) de oligonucleotídeos de DNA de detecção. Esta solução foi mantida em incubação com agitação lenta em temperatura ambiente por 24 horas para imobilização dos oligonucleotídeos de DNA de detecção sobre a partículas de Ru-Si. Após 0 tempo de incubação, as sondas de detecção (Ru-Si + oligonucleotídeos de DNA de detecção) foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido. Em seguida, foram lavadas três vezes com 1mL TE-Tw20(TE com 0,05% de Tween 20). A seguir, foi realizada mais uma etapa de incubação com etanolamina (1,0 M, pH 8) por 2 horas, a fim de bloquear os sítios de ligações livres e evitar ligações não específicas. Novamente, após o tempo de incubação, as sondas de detecção foram lavadas três vezes com 1 mL TE-Tw20. Porfim, este foi disperso em 1 mL de TE-Tw20 e armazenado sob refrigeração até o uso.[0074] For the immobilization of the detection DNA oligonucleotides in the Ru-Si compound, the following procedure was performed: Weighed 2 mg of the Ru-Si compound and added 1mL of ultrapure water. This suspension was kept under ultrasound for 2 hours, for complete dispersion and homogenization of silica nanoparticles immobilized with [Ru(bpy)3] 2+. Then, the dispersion was centrifuged and the supernatant was discarded. 1mL of diallyldimethylammonium polychloride (0.033 mg/mL) was added and left for 30 minutes in slow incubation. After time, the suspension was centrifuged and washed three times with ultrapure water. After washing, 1mL of polyacrylic acid (0.033 mg/mL) was added and left in slow incubation for 30 minutes. The suspension was then centrifuged and washed three times with ultrapure water. Then, a mixed solution of EDC / NHS (0.4 mol/L / 0.1 mol/L) in Tris-EDTA buffer was prepared and 40 μL (100 mM) of detection DNA oligonucleotides were added. This solution was incubated with slow stirring at room temperature for 24 hours to immobilize the detection DNA oligonucleotides on the Ru-Si particles. After the incubation time, the detection probes (Ru-Si + detection DNA oligonucleotides) were centrifuged and the supernatant was removed. Then, they were washed three times with 1mL TE-Tw20 (TE with 0.05% Tween 20). Next, another incubation step with ethanolamine (1.0 M, pH 8) was performed for 2 hours, in order to block free binding sites and avoid non-specific binding. Again, after the incubation time, the detection probes were washed three times with 1 ml TE-Tw20. Finally, this was dispersed in 1 mL of TE-Tw20 and stored under refrigeration until use.

Capture and detection of SAR-CoV-2 RNA sequence from saliva samples

[0075] Para este exemplo, sondas de captura e detecção foram sintetizadas de acordo com as etapas descritas anteriormente. As sequências de oligonucleotídeos para serem utilizadas na síntese das referidas sondas deste exemplo são apresentadas na Tabela 1.

[0075] For this example, capture and detection probes were synthesized according to the steps described above. The oligonucleotide sequences to be used in the synthesis of said probes in this example are shown in Table 1.

[0076] A princípio, as amostras de saliva passaram por tratamento térmico, no qual consistiu em aquecer as amostras em um banho seco por 15 min a 80 °C ou por 30 min a 56 °C. Esta etapa foi realizada com objetivo de permitir a manipulação das amostras de forma segura, sendo o procedimento do ensaio, realizado em um laboratório de Biossegurança Nível 2. Foi utilizado um volume de 20 μL de saliva para o ensaio. Em seguida, em um microtubo foi adicionado 180 μL de tampão NE 1x (Tris-HCl 50 mmol/L; NaCl 100 mmol/L; MgCl2 10 mmol/L; pH 7,9), 20 μL de saliva, 5 μL de sondas de captura e 5 μL de sondas de detecção. Esta mistura foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente sob agitação lenta para promover a hibridização da sequência alvo com as sondas de captura e detecção formando bioconjugados. Ademais, também poderão ser utilizadas outras proporções, diferentes sequências de DNA e diferentes tempos de incubação.[0076] Initially, the saliva samples underwent heat treatment, which consisted of heating the samples in a dry bath for 15 min at 80 °C or for 30 min at 56 °C. This step was carried out with the objective of allowing the manipulation of the samples in a safe way, and the test procedure was carried out in a Biosafety Level 2 laboratory. A volume of 20 μL of saliva was used for the test. Then, in a microtube, 180 μL of 1x NE buffer (Tris-HCl 50 mmol/L; NaCl 100 mmol/L; MgCl2 10 mmol/L; pH 7.9), 20 μL of saliva, 5 μL of probes of capture and 5 μL of detection probes. This mixture was incubated for 30 minutes at room temperature under slow agitation to promote hybridization of the target sequence with the capture and detection probes, forming bioconjugates. Furthermore, other proportions, different DNA sequences and different incubation times may also be used.

[0077] Após tempo de incubação, fez-se a separação magnética da mistura com 0 auxílio de uma estante magnética, por 5 minutos. Retirou-se o sobrenadante com uma pipeta volumétrica e adicionou-se tampão de lavagem (NE 1x + TW-20 a 0,05%) deixando em agitação lenta por 2 minutos. Estes procedimentos, separação e lavagem, foram realizados três vezes.[0077] After the incubation time, the mixture was magnetically separated with the aid of a magnetic rack for 5 minutes. The supernatant was removed with a volumetric pipette and a wash buffer (1x NE + 0.05% TW-20) was added and left in slow agitation for 2 minutes. These procedures, separation and washing, were performed three times.

[0078] Em seguida, adicionou-se ao microtubo 40 μL de solução de tripropilamina a 50 mmol/L. Essa solução foi transferida para superfície dos dispositivos fixados ao suporte com imãs e acoplados a um potenciostato. Para detecção do RNA virai, foi aplicado um potencial de 1,2 V vs Ag/AgCl por 180 segundos com o dispositivo alocado dentro do gabinete do fotodocumentador ImageQuant LAS 500. Desta forma, durante a aplicação do potencial, a ECL gerada permitiu a detecção concomitante das imagens. Sendo a intensidade de ECL proporcional a concentração do RNA virai.[0078] Then, 40 μL of tripropylamine solution at 50 mmol/L was added to the microtube. This solution was transferred to the surface of the devices fixed to the support with magnets and coupled to a potentiostat. For viral RNA detection, a potential of 1.2 V vs Ag/AgCl was applied for 180 seconds with the device placed inside the ImageQuant LAS 500 photodocumenter cabinet. concomitant of the images. Being the ECL intensity proportional to the viral RNA concentration.

[0079] As imagens da luz emitida a partir das regiões contendo as amostras via ECL foram registradas pelo fotodocumentador e analisadas pelo software ImageLab 6.0.1. Paraisso, foi selecionado na imagem do dispositivo a área que a analisar. Neste caso, esferas padronizadas do tamanho de cada eletrodo de trabalho foram delimitadas e a análise feita baseada na ferramenta do cálculo de quantidade, que foi o volume. Essa ferramenta é utilizada para identificar a intensidade de sinal de bandas, pontos ou qualquer outro tipo de dado de uma imagem. O valor do volume integral é o sinal analítico utilizado, e seu valor é atribuído para cada amostra.[0079] The images of the light emitted from the regions containing the samples via ECL were recorded by the photodocumenter and analyzed by the ImageLab 6.0.1 software. For this, the area to be analyzed was selected in the device image. In this case, standardized spheres of the size of each working electrode were delimited and the analysis was carried out based on the quantity calculation tool, which was the volume. This tool is used to identify the signal strength of bands, points or any other type of data in an image. The integral volume value is the analytical signal used, and its value is assigned for each sample.

Performance analysis of the method applied to the detection of SARS-CoV-2 RNA

[0080] O método desenvolvido apresentou resposta linear na faixa de concentração ampla entre 5,0 fmol L-1 a 5, 0 nmol L-1, conforme mostrado na Figura 3. A equação, obtida via regressão linear pode ser expressa por: ECL = 3,39 × 106 + 2,21 × 15 log [DNA alvo] (mol/L), com um coeficiente de correlação (r) de 0,992 indicando uma boa correlação linear entre a resposta de intensidade de ECL e concentração de ácido nucléico alvo com sequência similar à do vírus SARS-Cov-2. O limite de detecção (LD) foi considerado como o primeiro ponto da região linear, sendo este 5,0 fmol/L.[0080] The developed method showed a linear response in the wide concentration range between 5.0 fmol L-1 to 5.0 nmol L-1, as shown in Figure 3. The equation, obtained via linear regression, can be expressed by: ECL = 3.39 × 106 + 2.21 × 15 log [target DNA] (mol/L), with a correlation coefficient (r) of 0.992 indicating a good linear correlation between ECL intensity response and nucleic acid concentration target with sequence similar to that of the SARS-Cov-2 virus. The detection limit (LD) was considered as the first point of the linear region, being 5.0 fmol/L.

[0081] As amostras de saliva de indivíduos infectados com o SARS-Cov-2 foram analisadas e comparadas com amostras de saliva de indivíduos saudáveis. A Figura 4 apresenta o gráfico de barras juntamente com as imagens obtidas pelo fotodocumentador, das respostas de intensidade de ECL obtidas em função da concentração de RNA do SAR-CoV-2 em amostras de saliva referente as coortes compostas por indivíduos diagnosticados com COVID-19 via técnica de RT-PCR (positivos) e de indivíduos saudáveis (negativos).[0081] Saliva samples from individuals infected with SARS-Cov-2 were analyzed and compared with saliva samples from healthy individuals. Figure 4 shows the bar graph along with the images obtained by the photodocumenter, of the ECL intensity responses obtained as a function of the SAR-CoV-2 RNA concentration in saliva samples referring to the cohorts composed of individuals diagnosed with COVID-19 via the RT-PCR technique (positive) and healthy individuals (negative).

[0082] Foram avaliadas um total 33 amostras de saliva, sendo 11 negativas e 22 positivas. O gráfico em barras da Figura 5 apresenta a intensidade de sinal obtida para cada uma dessas amostras.[0082] A total of 33 saliva samples were evaluated, 11 negative and 22 positive. The bar graph in Figure 5 shows the signal strength obtained for each of these samples.

[0083] Para avaliar a capacidade do método aptidão do método em diferenciar as duas coortes, analisou-se as respostas por meio da curva ROC (do inglês Receiver Operating Characteristic). A curva ROC é empregada para determinar a precisão discriminativa da invenção para diferenciar indivíduos saudáveis dos infectados com o vírus. Para isso, adotou-se o diagnóstico por RT-PCR parao vírus SARS-CoV-2 como técnica padrão e analisou-se as medidas de desempenho diagnóstico (acurácia, sensibilidade e especificidade) do invento.[0083] To assess the ability of the method's ability to differentiate the two cohorts, the responses were analyzed using the ROC (Receiver Operating Characteristic) curve. The ROC curve is employed to determine the discriminative accuracy of the invention in differentiating healthy individuals from those infected with the virus. For this, the RT-PCR diagnosis for the SARS-CoV-2 virus was adopted as a standard technique and the diagnostic performance measures (accuracy, sensitivity and specificity) of the invention were analyzed.

[0084] A curva ROC para a detecção do RNA do SARS-CoV-2 em saliva utilizando o ensaio de ECL proposto é apresentado na Figura 6. Baseado nos resultados obtidos, a área sobre a curva ROC (AUC) foi de 0,931, que é considerado um excelente valor e indica a excelente capacidade do método em diferenciar as amostras positivas das negativas.[0084] The ROC curve for the detection of SARS-CoV-2 RNA in saliva using the proposed ECL assay is shown in Figure 6. Based on the results obtained, the area under the ROC curve (AUC) was 0.931, which is considered an excellent value and indicates the method's excellent ability to differentiate positive from negative samples.

[0085] Os resultados alcançados com o método são mostrados na Figura 7, pelo diagrama de pontos. O método proposto permitiu diferenciar indivíduos saudáveis de indivíduos infectados com o vírus SARS-CoV-2 com 90,5% de sensibilidade e 100% de especificidade. O valor de corte ideal obtido foi ≥ 2.920.000 intensidades de ECL (Vol.) baseado no índice de Youden. Este resultado sugere que o ensaio proposto apresenta uma excelente capacidade discriminatória entre as coortes, indicando, sua viabilidade paradetecção do RNA do SARS-CoV-2.[0085] The results achieved with the method are shown in Figure 7, by the dot diagram. The proposed method allowed to differentiate healthy individuals from individuals infected with the SARS-CoV-2 virus with 90.5% sensitivity and 100% specificity. The optimal cut-off value obtained was ≥ 2,920,000 ECL intensities (Vol.) based on the Youden index. This result suggests that the proposed assay has an excellent discriminatory ability between cohorts, indicating its viability for detecting SARS-CoV-2 RNA.

[0086] A Tabela 2 apresentaos resultados de desempenho diagnóstico com diferentes valores de corte e respectivas sensibilidades e especificidades alcançado com o invento.

[0086] Table 2 presents the results of diagnostic performance with different cutoff values and respective sensitivities and specificities achieved with the invention.

[0087] Portanto, diante do exemplo exposto, o teste eletroquimiluminescente proposto na presente invenção permite a detecção e quantificação de RNA de forma simples e rápida. A invenção necessita de uma pequena quantidade de reagentes, não são requeridas etapas de amplificação, podendo todo o procedimento ser realizado a temperatura ambiente com obtenção do resultado em menos de 1 hora. Há ainda a possibilidade de análise de vinte ou mais amostras, diretamente por imagem.[0087] Therefore, in view of the above example, the electrochemiluminescent test proposed in the present invention allows the detection and quantification of RNA in a simple and fast way. The invention requires a small amount of reagents, amplification steps are not required, and the entire procedure can be performed at room temperature, obtaining the result in less than 1 hour. There is also the possibility of analyzing twenty or more samples, directly by image.

[0088] Esse resultado sugere que o ensaio proposto apresenta a mesma capacidade de confirmação de detecção que a atual técnica padrão RT-PCR para detecção de RNAs, apresentando como vantagens menor custo e menor tempo de execução.[0088] This result suggests that the proposed assay has the same detection confirmation capability as the current standard RT-PCR technique for RNA detection, with the advantages of lower cost and shorter execution time.

Claims

Electrochemiluminescent RNA detection or quantification system, characterized by the fact that it comprises:
at least one solution comprising:
at least one capture probe, covalently conjugated to the magnetic particle or nanoparticle, for binding to a first RNA region and
at least one detection probe, covalently conjugated to an electrochemiluminescent label, for binding to a second RNA region,
wherein a capture probe and a detection probe, when linked to the first and second RNA regions, form a bioconjugate, and
at least one electrochemiluminescent detection device (1) comprising:
at least one working electrode (2) adapted to receive a voltage from a voltage source; It is
at least one magnet (3);
in which the detection device is adapted to receive one or more bioconjugates on one or more regions of the surface (4) of the working electrode (2), and
wherein each magnet is positioned beneath each region of the working electrode surface to attract the one or more bioconjugates to the respective regions of the working electrode surface.

System, according to claim 1, characterized by the fact that the first and second regions of the RNA are distinct and non-overlapping regions of the RNA.

System, according to claim 1 or 2, characterized by the fact that the first and second regions of the RNA are spaced from each other by up to 500 nucleotides.

System according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the capture and detection probes each comprise 10 to 30 nucleotides respectively complementary to the first and second region of the RNA.

System according to claim 1, characterized in that the electrochemiluminescent marker is selected from the group consisting of [Ru(bpy)3] 2+, [Ru(bpy)2(dcbpy)] 2+, [Ru(bpy) )2(bpySH)] 2+, [Ru(bpy)2(PVP)10] 2+ , [Os(bpy)2(PVP)10] 2+ , [Os(bpy)3] 2+, [Ir( bpy)3] 3+ and [Go(bpy)2(acac)] .

System according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it additionally comprises an incubation solution.

System according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it additionally comprises a washing solution.

System according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it additionally comprises a solution comprising a sacrificial reducing compound.

System according to claim 8, characterized in that the sacrificial reducing compound is tripropylamine.

System according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it additionally comprises a voltage source for applying a voltage to at least one working electrode.

System according to any one of claims 1 to 10, characterized in that it additionally comprises an image capturer for detecting light generated by electrochemiluminescence.

Use of the system, as defined in any one of claims 1 to 11, characterized in that it is for the detection or quantification of RNA.

Use according to claim 12, characterized in that it is for the detection or quantification of viral RNA.

Electrochemiluminescent RNA detection or quantification method, characterized by the fact that it comprises:
incubating at least one sample with at least one solution comprising at least one capture probe covalently conjugated to a magnetic particle or nanoparticle and at least one detection probe covalently conjugated to an electrochemiluminescent label, wherein the capture probe binds to a first region of the RNA and the detection probe binds to a second region of the RNA, forming a bioconjugate, when there is RNA in the sample comprising the first and second regions complementary to the capture and detection probes;
adding a solution comprising a sacrificial reducing compound to the sample incubated with the at least one capture probe and one detection probe;
transferring the at least one sample to at least one region of the surface of a working electrode of an electrochemiluminescent detection or quantification device, wherein bioconjugates, if present in the at least one sample, are attracted to the surface of the working electrode by means of at least one magnet positioned below each region of the surface of the working electrode;
applying a voltage to the at least one working electrode via a voltage source;
detection of light generated by electrochemiluminescence by the marker conjugated to the detection probe, when present in the bioconjugate, in each region of the surface of the working electrode.

Method, according to claim 14, characterized in that the sample is a fluid from an individual.

Method, according to claim 14 or 15, characterized in that the light detection step is carried out by means of an image capture device.

Method according to any one of claims 14 to 16, characterized by the fact that the voltage application and light detection steps occur concurrently.

Method according to any one of claims 14 to 17, characterized by the fact that the light intensity in the image is proportional to the concentration of the bioconjugate in the sample and allows the quantification of the RNA in the sample.

Method according to any one of claims 14 to 18, characterized in that the working electrode receives samples from different individuals.

Method, according to any one of claims 14 to 19, characterized by the fact that the working electrode receives samples from the same individual incubated with different capture and detection probe solutions.

Method according to any one of claims 14 to 20, characterized in that the RNA to be detected is a viral RNA.