BR102021017843A2 - Síntese e uso de chalconas derivadas do eugenol e diidroeugenol para o tratamento do câncer - Google Patents

Abstract

Foram planejadas e sintetizadas novas chalconas derivadas do eugenol e análogos estruturais deste fenol natural bioativo. Dentre as substâncias sintetizadas e caracterizadas quimicamente, uma chalcona derivada do diidroeugenol (CHDE) apresentou atividade contra as linhagens HepG2 (carcinoma hepatocelular humano) e TOV-21G (adenocarcinoma de ovário humano) com valores de CI50 de 4,25 e 7,22µM, respectivamente. Esta chalcona também foi avaliada quanto à sua citotoxicidade contra a linhagem de células humanas sadias MRC-5 (fibroblastos de pulmão humano), apresentando citototoxicidade (CC50) na concentração de 47,20µM. Estes resultados conferiram índices de seletividade de 11,1 e 6,54 para o composto CHDE, considerando as linhagens HepG2 e TOV-21G, respectivamente. A doxorrubicina, fármaco controle utilizado nos estudos, apresentou valores de CI50 de 11,23 e 4,12µM (e índices de seletividade de 1,40 e 3,83) para as linhagens HepG2 e TOV-21G, respectivamente. Diante destes resultados, observou-se que a nova chalcona sintética se mostrou mais de duas vezes mais potente e três vezes menos tóxica que o fármaco doxorrubicina, para a linhagem HepG2, representando um potencial candidato a fármaco mais eficaz e mais seguro para o tratamento do câncer de fígado. Além disso, a chalcona reduziu a proliferação celular a longo prazo, bem como inibiu a migração celular.

Description

SÍNTESE E USO DE CHALCONAS DERIVADAS DO EUGENOL E DIIDROEUGENOL PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Foram planejadas e sintetizadas novas chalconas derivadas do eugenol e análogos estruturais deste fenol natural bioativo. Dentre as substâncias sintetizadas e caracterizadas quimicamente, uma chalcona derivada do diidroeugenol (CHDE, em que R1: propila e R2: metila, conforme Figura 2) apresentou atividade contra as linhagens HepG2 (carcinoma hepatocelular humano) e TOV-21G (adenocarcinoma de ovário humano) com valores de CI50 de 4,25 e 7,22µM, respectivamente. Esta chalcona também foi avaliada quanto à sua citotoxicidade contra a linhagem de células humanas sadias MRC-5 (fibroblastos de pulmão humano), apresentando citotoxicidade (CC50) na concentração de 47,20µM. Estes resultados conferiram índices de seletividade de 11,1 e 6,54 para o composto CHDE, considerando as linhagens HepG2 e TOV-21G, respectivamente. A doxorrubicina, fármaco controle utilizado nos estudos, apresentou valores de CI50 de 11,23 e 4,12µM (e índices de seletividade de 1,40 e 3,83) para as linhagens HepG2 e TOV-21G, respectivamente. Diante destes resultados, observou-se que a nova chalcona sintética mostrou-se mais de duas vezes mais potente e três vezes menos tóxica que o fármaco doxorrubicina, para a linhagem HepG2. Além disso, a nova chalcona reduziu a migração celular e inibiu a proliferação celular a longo prazo, representando um potencial candidato a fármaco mais eficaz e mais seguro para o tratamento do câncer de fígado.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] O câncer representa um conjunto de mais de cem doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem tecidos adjacentes. Os dados de incidência e mortalidade por câncer aumentam a cada ano no mundo, parte pelo envelhecimento e crescimento populacional, parte pela mudança na distribuição e prevalência dos fatores de risco que estão associados à doença, principalmente os socioeconômicos (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (Brasil), 2021. Disponível em https://www.inca.gov.br/).

[003] Atualmente, as três principais formas de tratamento para o câncer são cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Embora o objetivo principal da quimioterapia consista na destruição das células neoplásicas, os agentes químicos disponíveis atuam de forma não seletiva, atingindo tanto células sadias como células tumorais. Esta baixa seletividade dos fármacos antineoplásicos representa a principal limitação do tratamento, incentivando a busca por substâncias mais seletivas, seguras e menos tóxicas (SCHIRRMACHER, V. et al. From chemotherapy to biological therapy: A review of novel concepts to reduce the side effects of systemic cancer treatment (Review). International Journal of Oncology, n. 54, p. 407-419, 2019).

[004] Existem, na literatura, relatos de atividade citotóxica (principalmente contra linhagens de células cancerígenas) de várias substâncias derivadas de chalconas (SALEHI, B. et al. Pharmacological Properties of Chalcones: A Review of Preclinical Including Molecular Mechanisms and Clinical Evidence. Frontiers in Pharmacology, v. 11, p. 1-21, 2021), entretanto tais substâncias estão associadas a baixos índices de seletividade (IS) quando avaliadas contra células humanas sadias (ZHU, H. et al. Synthesis of Chalcone Derivatives: Inducing Apoptosis of HepG2 Cells via Regulating Reactive Oxygen Species and Mitochondrial Pathway. Frontiers in Pharmacology, v. 10, p. 1341, 2019); (AYATI, A. et al. Synthesis and biological evaluation of 4-amino-5 cinnamoylthiazoles as chalcone-like anticancer agents. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 145, p. 404-412, 2018)

[005] O documento EP0288794A2 (EP0288794A2. Edwards, M. L. et al. Controlling the growth of tumor tissue with chalcone derivatives, 1988) descreve a síntese de chalconas potencialmente antitumorais contendo substituintes alquílicos e halogênios no carbono α-carbonílico e grupos amina e amida no anel benzênico α,β-insaturado destas substâncias. Além disso, o documento EP0370461A2 (EP0370461A2. Abe, M. et al. Chalcone derivatives and process for producing the same, 1990) relata a síntese de chalconas com esta mesma atividade biológica, contendo diferentes substituintes hidroxila e éteres ligados diretamente aos dois anéis benzênicos. Já o documento RU2203883C2 (RU2203883C2. Bombardelli, E. et al. Chalcones Eliciting Antiproliferative Activity, 2003) descreve a atividade antitumoral de outras chalconas contendo um grupo hidroxila e pelo menos um outro grupo químico, de natureza bastante variada, no anel benzênico ligado ao grupo carbonila. Ressalta-se que em nenhum dos documentos citados, são descritas estruturas químicas de chalconas contendo os substituintes hidroxila, metoxila e propila (provenientes do diidroeugenol) ligados a um mesmo anel benzênico, conforme estrutura química da nossa invenção.

[006] Substâncias bioativas que apresentem baixos índices de seletividade (relação de quantas vezes o composto é mais ativo contra as células cancerígenas em relação às células humanas) deixam de ser promissoras, visto que têm grande probabilidade de serem tóxicas e apresentarem efeitos adversos graves quando administradas ao paciente. Uma vez que o principal desafio da quimioterapia contra o câncer consiste na descoberta de novas substâncias com alta seletividade para células tumorais e baixa ou nenhuma ação contra células sadias, substâncias que apresentem altos índices de seletividade são vistas como promissoras candidatas a novos fármacos úteis clinicamente (ALBANESE, S. K. et al. Is Structure-Based Drug Design Ready for Selectivity Optimization? Journal of Chemical Information and Modeling, v. 60, n. 12, p. 6211-6227, 2020).

[007] Nosso grupo de pesquisa planejou a estrutura química de novas chalconas derivadas do eugenol e análogos, a partir da técnica da hibridação molecular, um método de planejamento de novos fármacos em que duas ou mais substâncias bioativas são associadas a uma mesma estrutura química, com o objetivo de se obter uma nova molécula que carrega em si, o potencial biológico das duas ou mais substâncias isoladas, potencializando assim sua ação (IVASIV, V. et al. Molecular Hybridization as a Tool for Designing Multitarget Drug Candidates for Complex Diseases. Current Topics in Medicinal Chemistry, v. 19, p. 1694-1711, 2019).

[008] Dentre as chalconas obtidas sinteticamente, uma chalcona derivada do diidroegenol (CHDE) apresentou potencial atividade contra duas linhagens de células cancerígenas (carcionoma hepatocelular humano e adenocarcinoma de ovário humano) com valores de índices de seletividade maiores que a doxorrubicina, fármaco utilizado clinicamente que foi empregado como controle positivo nos testes realizados. Além disso, a chalcona CHDE foi mais de duas vezes mais potente que a doxorrubicina considerando as células de carcinoma hepatocelular humano. A nova chalcona também inibiu a migração celular e reduziu a proliferação celular a longo prazo. É importante ressaltar que a síntese da chalcona CHDE foi planejada a partir de uma rota sintética objetiva (apenas duas etapas) e que faz uso de condições reacionais e reagentes simples, baratos e de fácil acesso comercial, o que facilitaria sua produção em grande escala.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] A Figura 1 apresenta a estrutura geral das chalconas planejadas (3) a partir da técnica de hibridação molecular entre o eugenol (1) e um núcleo chalcônico (2).

[0010] A Figura 2 apresenta a rota sintética empregada para a síntese das chalconas, onde i: hexamina, ácido acético e aquecimento; ii: acetofenona correspondente, hidróxido de sódio e etanol, à temperatura ambiente; R1: hidrogênio, alila ou propila; R2: metila ou flúor.

[0011] A Figura 3 representa a avaliação da morfologia celular após o tratamento com CHDE. Seta branca: célula alongada. Setas pretas: debris celulares.

[0012] A Figura 4 apresenta os resultados do teste de sobrevivência clonogênica.

[0013] A Figura 5 apresenta as fotografias do teste de migração celular.

[0014] A Figura 6 apresenta a porcentagem de migração celular após o tratamento com CDHE.

[0015] A Figura 7 apresenta o histograma representativo do teste de progressão do ciclo celular para as células controle (IP: iodeto de propídeo).

[0016] A Figura 8 apresenta o histograma representativo do teste de progressão do ciclo celular para as células tratadas com CHDE 0,5 µg/mL (IP: iodeto de propídeo).

[0017] A Figura 9 apresenta o histograma representativo do teste de progressão do ciclo celular para as células tratadas com CHDE 0,75 µg/mL (IP: iodeto de propídeo).

[0018] A Figura 10 apresenta o histograma representativo do teste de progressão do ciclo celular para as células tratadas com CHDE 1,0 µg/mL (IP: iodeto de propídeo).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção descreve o desenvolvimento e síntese de chalconas sintéticas com promissora aplicação para o tratamento de diferentes tipos de câncer. Dentre elas, uma chalcona hibridizada com a molécula do diidroeugenol (CHDE) apresentou potencial duas vezes maior e toxicidade três vezes menor que a doxorrubicina, contra células de carcionoma de fígado (células HepG2). Essa substância também inibiu a migração celular e reduziu a proliferação celular a longo prazo. Estes resultados indicam que esta nova substância sintética (CHDE) pode representar um novo candidato a fármaco mais eficaz e mais seguro para o tratamento do câncer de fígado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0020] Inicialmente, foi empregada a técnica da hibridação molecular para o planejamento das novas substâncias com potencial ação citotóxica contra diferentes linhagens de células cancerígenas. Este método de planejamento de novos fármacos consiste na associação de duas ou mais substâncias ativas em uma mesma estrutura química, com o objetivo de se obter uma nova molécula que carregue em si, o potencial biológico das duas ou mais substâncias isoladas, potencializando assim sua ação.

[0021] Nosso grupo planejou a hibridação (Figura 1) de uma chalcona com a estrutura química do eugenol, diidroeugenol ou orto-vanilina (fenóis análogos estruturalmente), visto que diferentes atividades biológicas já são descritas tanto para derivados de chalconas (SALEHI, B. et al. Pharmacological Properties of Chalcones: A Review of Preclinical Including Molecular Mechanisms and Clinical Evidence. Frontiers in Pharmacology, v. 11, p. 1-21, 2021) quanto para o eugenol, dentre estas atividades, destaca-se a ação anticancerígena destas substâncias (SHARMA, U. K. Pharmacological activities of cinnamaldehyde and eugenol: antioxidant, cytotoxic and anti-leishmanial studies. Cellular and Molecular Biology, v. 63, n. 6, p. 73-78, 2017).

[0022] As chalconas planejadas foram obtidas a partir de duas etapas sintéticas (Figura 2), a primeira consistiu na reação de formilação do eugenol ou diidroeugenol (BRANCAGLION, G. A. et al. In vitro and in vivo trypanocidal activities of 8- methoxy- 3- (4- nitrobenzoyl)- 6- propyl- 2H- cromen- 2- one, a new synthetic coumarin of low cytotoxicity against mammalian cells. Chemical Biology & Drug Design, v.92, p. 1888–1898, 2018), e os derivados formilados obtidos foram submetidos a uma reação com diferentes acetofenonas, a fim de se obter as chalconas híbridas propostas (YADAV, P. et al. Green synthesis and anticancer potential of chalcone linked-1,2,3-triazoles. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 126, p. 944–953, 2017), conforme rota sintética apresentada a seguir. As substâncias obtidas foram, cada uma, purificadas por cromatografia em camada de sílica e caracterizadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C e por espectrometria de massas de alta resolução, o que comprovou inequivocamente a identidade química de todos os produtos obtidos

[0023] Dentre todos os híbridos sintetizados, uma chalcona derivada do diidroeugenol (CHDE) se destacou quando avaliada contra três diferentes linhagens de células tumorais: HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), T24 (carcinoma de bexiga) e TOV-21G (adenocarcinoma de ovário humano); além de uma linhagem de células humanas sadias: MRC-5 (fibroblastos de pulmão humano). A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo dos ensaios biológicos e foi ativa contra estas quatro linhagens de células com valores de CI50 de 11,23µM (HepG2), 5,21µM (T24), 4,12µM (TOV-21G) e 15,77µM (MRC5). Estes resultados conferiram valores de índice de seletividade para a doxorrubicina de 1,40 (considerando a linhagem HepG2), 3,03 (considerando a linhagem TOV-21G) e 3,83 (considerando a linhagem MRC-5). Por outro lado, a chalcona CHDE foi citotóxica na concentração de 47,20µM contra as células humanas MRC-5, ou seja, foi três vezes menos tóxica que o fármaco doxorrubicina.

[0024] Em relação às células de câncer de fígado HepG2, esta substância foi ativa a 4,25µM, mais de duas vezes mais potente que o fármaco controle, além de apresentar índice de seletividade de 11,1, podendo ser considerada bem mais segura e menos tóxica que a doxorrubicina (IS: 1,40). Além disso, o composto CHDE foi ativo contra as células de câncer de ovário com valor de CI50 de 7,22µM, e, embora tenha sido menos potente que a doxorrubicina contra essa linhagem, esta chalcona foi mais seletiva e menos tóxica, apresentando um índice de seletividade de 6,54, enquanto este valor foi de 3,83 para o fármaco controle.

[0025] Em estudos complementares com a linhagem HepG2, a substância CHDE reduziu a proliferação celular a longo prazo e inibiu a migração celular. Em resumo, descobrimos uma substância mais potente contra o carcinoma hepatocelular humano, quando comparada com outras substâncias pertencentes a esta classe química, já descritas na literatura, e com o fármaco doxorrubicina, que é empregado, atualmente, para este tratamento. Além disso, esta substância apresentou menor toxicidade contra as células saudáveis humanas avaliadas, quando comparada com a doxorrubicina, indicando uma maior segurança para seu uso clínico.

EXEMPLOS Síntese das substâncias

[0026] Síntese dos derivados formilados: em um balão de fundo redondo de 125mL adicionou-se hexamina (5 equivalentes) e ácido acético glacial (40mL). A mistura reacional foi colocada sob banho de óleo e mantida sob agitação e aquecimento (125ºC), em refluxo, por 10 minutos. Após esse tempo, o eugenol (1 eq.) ou diidroeugenol (1 eq.) foram adicionados à mistura reacional. Ao se verificar o fim da reação (por CCD; eluente: Hex/AcOEt 1:1; reveladores: vapor de iodo seguido de cloreto férrico 5%), adicionou-se à mistura uma solução aquosa de HCl 1M (10mL) mantendo-se o refluxo e aquecimento por mais 24h. Após esse tempo, a mistura reagente foi vertida em um béquer de 500mL e este foi colocado sob banho de gelo para que a neutralização da solução fosse realizada. Para tal, utilizou-se uma solução supersaturada de bicarbonato de sódio, adicionado sob agitação magnética. Após atingido o pH 7, a solução foi transferida para um funil de separação e extraída com clorofórmio (5 x 25mL). A fase orgânica foi reunida, seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e o solvente evaporado sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de sílica (eluente: Hex/AcOEt 95:5), obtendo-se um óleo amarelo (0,9380g; 80% de rendimento) que foi caracterizado por RMN de 1H, 13C e DEPT. Síntese das chalconas: em um balão de 50mL, preparou-se uma solução contendo a acetofenona (1 eq.) e o aldeído (1 eq.) correspondentes, em etanol (10mL). A esta solução adicionou-se 6mL de uma solução aquosa de NaOH (60%), gota a gota, por 30 minutos (2mL a cada 10 minutos) sob agitação constante. O sistema foi mantido sob agitação magnética por 4 horas à temperatura ambiente. Ao ser observado o fim da reação, por CCD (eluente: Hex/AcOEt 6:4; reveladores: vapor de iodo e CAM), a mistura reagente foi neutralizada utilizando-se HCl 1 M, sob resfriamento. Após atingir pH próximo de 7, a solução foi filtrada e o sólido recolhido e purificado por cromatografia em coluna de sílica, fornecendo as chalconas com rendimentos entre 19-93%. Os produtos obtidos foram purificados por cromatografia em camada e sílica e caracterizados por espectroscopia de RMN de 1H, 13C e DEPT.

Dados de caracterização das chalconas

[0027] Dados de caracterização da chalcona (E)-3-(5-alil-2-hidroxi-3- metoxifenil)-1-(p-tolil)prop-2-en-1-ona (6).

[0028] F.M: C20H20O3; MM: 308,38 g/mol; F.F: 80-82ºC; Aspecto físico: sólido vermelho; Massa obtida: 103,1 mg (56% rendimento).

[0029] RMN de 1H (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 7,98 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H11); 7,92 (d, 2H, 3 J = 8,0 Hz, H-15); 7,70 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-12); 7,49 (d, 2H, 3 J = 7,92 Hz, H-16); 6,98 (s, 1H, H-5); 6,69 (s, 1H, H-7); 5,99-5,89 (m, 1H, H-9); 5,11-5,06 (m, 2H, H-10); 3,89 (s, 3H, H-1); 3,32 (d, 2H, 3 J = 6,6 Hz, H8); 2,41 (s, 3H, H-18). RMN de 13C (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 190,78 (1C, C13); 146,81 (1C, C-2); 144,18 (1C, C-3); 143,30 (1C, C-17); 139,77 (1C, C-11); 137,34 (1C, C-9); 135,94 (1C, C-14); 131,37 (1C, C-6); 129,23 (2C, C-16); 128,74 (2C, C-15); 128,37 (1C, C-12); 123,50 (1C, C-5); 121,27 (1C, C-4); 116,05 (1C, C-10); 112,49 (1C, C-7); 56,23 (1C, C-1); 39,84 (1C, C-8); 21,68 (1C, C-18). HRMS (ESI) calculada para C20H20O3 [M+Na] + 331,1305; encontrada 331,1301

[0030] Dados de caracterização da chalcona (E)-3-(2-hidroxi-3-metoxi-5- propilfenil)-1-(p-tolil)prop-2-en-1-ona (7).

[0031] F.M: C20H22O3; MM: 310,39g/mol; F.F: 80-82ºC; Aspecto físico: Sólido amarelo; Massa obtida: 241,8 mg (93% rendimento).

[0032] RMN de 1H (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 8,0 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H11); 7,94 (d, 2H, 3 J = 8,16 Hz; H-15); 7,73 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-12); 7,29 (d, 2H, 3 J = 7,88 Hz; H-16); 6,97 (d, 1H, 4 J = 1,16 Hz, H-5); 6,71 (d, 1H, 4 J = 1,48 Hz, H-7); 6,16 (s, 1H, OH); 3,91 (s, 3H, H-1); 2,54 (t, 2H, H-8); 2,42 (s, 3H, H-18); 1,68-1,59 (sext, 2H, H-9); 0,95 (t, 3H, H-10). RMN de 13C (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 190,80 (1C, C-13); 146,61 (1C, C-2); 143,82 (1C, C-3); 143,24 (1C, C-18); 139,99 (1C, C-11); 135,91 (1C, C-14); 134,04 (1C, C-6); 129,18 (2C, C-15); 128,69 (1C, C-16); 123,28 (1C, C-12); 121,08 (1C, C-5); 120,80 (1C, C-4); 112,43 (1C, C-7); 56,16 (1C, C-1); 37,68 (1C, C-8); 24,70 (1C, C-9); 21,62 (1C, C-18); 13,73 (1C, C-10). HRMS (ESI) calculada para C20H22O3 [M+Na] + 333,1461; encontrada 331,1459.

[0033] Dados de caracterização da chalcona (E)-3-(2-hidroxi-3-metoxifenil)-1- (p-tolil)prop-2-en-1-ona (8).

[0034] F.M: C17H16O3; MM: 268,31g/mol; F.F: 98-102ºC; Aspecto físico: Sólido vermelho; Massa obtida: 65,9 mg (10% de rendimento).

[0035] RMN de 1H (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 8,04 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz; H8); 7,95 (d, 2H, 3 J = 8,12 Hz; H-12); 7,75 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-9); 7,31 (s, 1H, H-5); 7,29 (s, 1H, H-7); 7,21-7,19 (m, 1H, H-6); 6,90-6,88 (m, 2H, H-13); 6,31 (s, 1H, OH); 3,93 (s, 3H, H-1); 2,44 (s, 3H, H-15). RMN de 13C (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 190,69 (1C, C-10); 146,83 (1C, C-2); 145,76 (1C, C-3); 143,30 (1C, C-14); 139,61 (1C, C-8); 135,88 (1C, C-11); 129,20 (2C, C-12); 128,68 (2C, C-13); 123,57 (1C, C-6); 121,69 (1C, C-9); 121,40 (1C, C-5) 119,66 (1C, C-4); 111,83 (1C, C-7); 56,21 (1C, C-1); 21,63 (1C, C-15). HRMS (ESI) calculada para C17H16O3 [M+Na] + 291,0992; encontrada 291,0980.

[0036] Dados de caracterização da chalcona (E)-3-(5-alil-2-hidroxi-3- metoxifenil)-1-(4-fluorfenil)prop-2-en-1-ona (9).

[0037] F.M: C19H17FO3; MM: 312,34g/mol; F.F: 82-84ºC; Aspecto físico: Sólido amarelo; Massa obtida: 172,9 mg (89% rendimento)

[0038] RMN de 1H (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 8,08-8,04 (m, 2H, H-15); 8,0 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-11); 7,70 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-12); 7,16 (t, 2H, 3 J = 8,6 Hz; H-16); 6,99 (s, 1H, H-5); 6,73 (d, 1H, 4 J = 1,4 Hz, H-7); 6,19 (s, OH); 6,00-5,91 (m, 1H, H-9); 5,13-5,08 (m, 2H, H-10); 3,91 (s, 3H, H-1); 3,34 (d, 2H, 3 J = 6,56 Hz, H-8). RMN de 13C (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 189,61 (1C, C-13); 165,48 (1C, d, 1 J = 252,26 Hz, C-17); 146,81 (1C, C-2); 144,27 (1C, C-3); 140,49 (1C, C-11); 137,28 (1C, C-9); 134,83 (d, 2C, 4 J = 2,62 Hz, C-14); 131,47 (1C, C-6); 131,15 (d, 2C, 3 J = 9,15 Hz, C-15); 123,02 (1C, C-12); 121,42 (1C, C-5); 120,79 (1C, C-4); 116,11 (1C, C-10); 115,61 (d, 2C, 2 J = 21,5 Hz, C-16), 112,68 (1C, C-7); 56,24 (1C, C-1); 39,82 (1C, C-8). HRMS (ESI) calculada para C19H17FO3 [M+Na] + 335,1054; encontrada 335,1045.

[0039] Dados de caracterização da chalcona (E)-1-(4-fluorfenil)-3-(2-hidroxi-3- metoxi-5-propilfenil)prop-2-en-1-ona (10).

[0040] F.M: C19H19FO3; MM: 314,36g/mol; F.F: 72-74ºC; Aspecto físico: Sólido amarelo; Massa obtida: 89,9 mg (55% rendimento).

[0041] RMN de 1H (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 8,08-8,05 (m, 2H, H-15); 8,0 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-11); 7,71 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-12); 7,16 (t, 2H, 3 J = 8,6 Hz; H-16); 6,97 (d, 1H, 4 J = 1,52 Hz, H-5); 6,73 (d, 1H, 4 J = 1,8 Hz, H-7); 6,16 (s, OH); 3,91 (s, 3H, H-1); 2,54 (t, 2H, 3 J = 1,8 Hz; H-8); 1,68-1,61 (m, 2H, H-9); 0,95 (t, 3H, 3 J = 7,36 Hz; H-10). RMN de 13C (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 189,80 (1C, C-13); 165,61 (1C, d, 1 J = 252,22 Hz, C-17); 146,79 (1C, C-2); 144,10 (1C, C-3); 140,88 (1C, C-11); 135,02 (d, 1C, 4 J = 2,73 Hz, C-14); 134,32 (1C, C-6); 131,28 (2C, d, 3 J = 9,14 Hz, C-15); 123,03 (1C, C-12); 121,43 (1C, C-5); 120,75 (1C, C-4); 115,75 (2C, d, 2 J = 21,79 Hz, C-16); 112,80 (1C, C-7); 56,36 (1C, C-1); 37,86 (1C, C-8); 24,88 (1C, C-9); 13,92 (1C, C-10). HRMS (ESI) calculada para C19H19FO3 [M+Na] + 337,1210; encontrada 337,1200.

[0042] Dados de caracterização da chalcona (E)-1-(4-fluorfenil)-3-(2-hidroxi-3- metoxifenil)prop-2-en-1-ona (11).

[0043] F.M: C16H13FO3; MM: 272,28g/mol; F.F: 102-104ºC; Aspecto físico: Sólido vermelho; Massa obtida: 132,3 mg (47% rendimento).

[0044] RMN de 1H (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 8,08-8,04 (m, 2H, H-12); 8,02 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-8); 7,73 (d, 1H, 3 Jtrans = 15,8 Hz, H-9); 7,19-7,14 (m, 3H, H-5, H-7, H-6); 6,91-6,86 (m, 2H, H-13); 6,33 (s, 1H, OH); 3,92 (s, 1H, H-1). RMN de 13C (400 MHz; CDCl3), δ (ppm): 189,42 (1C, C-10); 165,34 (d, 2C, 1 J = 252,29 Hz, C-14); 146,71 (1C, C-2); 145,74 (1C, C-3); 140,22 (1C, C-8); 134,65 (d, 1C, 4 J = 2,8 Hz, C-11); 130,98 (d, 2C, 3 J = 9,1 Hz, C-12); 122,98 (1C, C-6); 121,75 (1C, C-5); 121,02 (1C, C-9); 119,61 (1C, C-4); 115,47 (d, 2C, 2 J = 21,6 Hz, C-13); 111,89 (1C, C-7); 56,10 (1C, C-1). HRMS (ESI) calculada para C16H13FO3 [M+Na] + 295,0741; encontrada 295,0743.

Avaliação da citotoxicidade

[0045] Para avaliação da citotoxicidade e determinação do índice de seletividade, foram utilizadas as seguintes linhagens celulares: HepG2 (carcinoma hepatocelular do fígado de humano), T24 (carcinoma de células de transição da bexiga de humano), TOV-21G (adenocarcinoma maligno primário de ovário de humano) e MRC5 (fibroblastos de pulmão humano). Todas as linhagens celulares foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 5% SFB contendo penicilina/estreptomicina (100UI/mL) e anfotericina B (5μg/mL), em estufa com 5% de CO2, a 37°C.

[0046] Suspensões de células foram distribuídas em microplacas de 96 cavidades. As placas foram incubadas em atmosfera úmida, a 5% de CO2, a 37°C por 24 horas. Oito diluições seriadas das amostras, previamente solubilizadas em DMSO, foram preparadas utilizando meio DMEM 1% SFB, em concentrações que variam de 100 a 0,78125µg/mL. O volume utilizado das amostras foi calculado para que a quantidade de DMSO por poço não excedesse a concentração de 2%. Após a formação da monocamada celular na superfície dos poços de cada placa, o meio de cultura foi removido das cavidades e 100µL das soluções diluídas das amostras e 100µL de meio de cultura DMEM 1% SFB foram adicionados e as placas incubadas sob a mesma condição atmosférica. A solução de MTT [brometo de 3-(4’,5’-dimetiltiazol-2’- ila)-2,5-difeniltetrazol] (Sigma Aldrich® ), preparada em tampão fosfato estéril (PBS) na concentração de 1,0mg/mL, foi adicionada 120 minutos antes da realização das leituras. As leituras foram realizadas em leitor de microplacas 24 horas após a adição das amostras nos ensaios realizados com a linhagem celular MRC-5, após 48 horas nos ensaios com a célula tumoral T24 e após 72 horas nos ensaios utilizando as células tumorais HepG2 e TOV-21G. A quantificação da formazana, obtida após a redução do sal de tetrazólio (MTT) nas células viáveis, foi realizada pela leitura da absorbância no comprimento de onda de 490nm. A multiplicação celular da monocamada tratada foi comparada com controle celular. A toxicidade celular foi expressa em termos de concentração inibitória de 50% do crescimento celular(CI50). A porcentagem citotóxica foi calculada como [(A-B)/A] x100, onde A e B são as densidades óticas a 490nm (DO490) dos poços onde estão presentes células não tratadas (A) e tratadas (B), respectivamente. Células não tratadas foram utilizadas como controle. Os resultados estão apresentados na Tabela 1 a seguir.
Tabela 1 – Citotoxicidade das chalconas sintetizadas, determinada nas linhagens celulares MRC-5, HepG2, T24 e TOV-21G, expressa em termos de concentração citotóxica a 50% (CC50), respectivos desvios padrões (n=3) e índice de seletividade (IS), realizada por meio do ensaio colorimétrico do MTT

[0047] Como apresentado na Figura 3, há uma redução da densidade celular após o tratamento com a chalcona CHDE. Além disso, pode-se observar a presença de células alongadas e debris celulares.

Avaliação da sobrevivência clonogênica

[0048] O teste de sobrevivência clonogênica, que é a forma mais relevante para medir a morte celular em linhagens celulares de tumores (TANNOCK, I. F. et al. Evidence against apoptosis as a major mechanism for reproductive cell death following treatment of cell lines with anti-cancer drugs. British Journal of Cancer, v.84, p.100-105, 2001), foi utilizado para avaliar a atividade antitumoral da chalcona derivada do diidroeugenol. Inicialmente, 1 x 106 células foram plaqueadas em placas de 12 poços. Após 24 horas, as células foram tratadas com diferentes concentrações da chalcona CHDE por 72 horas. Células não tratadas foram utilizadas como controle. Após o tratamento, as células foram lavadas com solução de Hanks, tripsinizadas, e aproximadamente 1000 células foram plaqueadas em placas de 12 poços e cresceram durante 7 dias em estufa de CO2 para formação de colônias. Posteriormente, as células foram fixadas com formol a 10% e corado com 0,5% de violeta de cristal. A absorbância foi medida usando um leitor de microplaca em comprimento de onda de 560 nm. Como apresentado na Figura 4, o tratamento com a chalcona reduziu significativamente a proliferação celular a longo prazo quando comparada às células não tratadas.

Avaliação da migração celular

[0049] A migração celular foi avaliada através do teste de cicatrização de feridas. Inicialmente, 5 x 105 células foram plaqueadas em placas de 12 poços. Após 24 horas, a monocamada de células foi raspada com o auxílio de uma ponteira de 200 µL esterilizada para criar uma ferida. As células foram lavadas, fotografadas e posteriormente tratadas com diferentes concentrações da chalcona CHDE por 72 horas. Células não tratadas foram usadas como controle. Ao fim do tratamento, a migração celular foi fotografada. A quantificação de motilidade celular foi realizada usando o software ImageJ medindo-se a distância entre a frente invasora das células em 3 campos selecionados aleatoriamente. De acordo com as Figuras 5 e 6, a chalcona inibiu significativamente a migração celular em todas as concentrações testadas.

[0050] Embora a migração celular seja crucial para o desenvolvimento e a reparação dos tecidos, ela também medeia doenças como o câncer. O processo de metástase do câncer ocorre quando células se separam dos tumores primários, entram nos vasos sanguíneos e linfáticos e finalmente colonizam em tecidos saudáveis para formar um tumor secundário (TREPAT, X. et al. Cell migration. Comprehensive Physiology, v.2, p.2369-2392, 2012).

Avaliação da progressão do ciclo celular

[0051] Para avaliar a cinética do ciclo celular 5 × 105 células foram plaqueadas em placas de 12 poços. Após 24 horas, as células foram tratadas com diferentes concentrações da chalcona CHDE por 72 horas. Após o tratamento, as células foram lavadas com soluções de Hanks, removidas utilizando tripsina e centrifugadas a 1000 rpm por 10 minutos. O sedimento formado foi fixado com etanol 70% e mantido a -20ºC por pelo menos 12 horas. No momento da leitura a solução fixadora foi removida, as células foram lavadas com solução de Hanks e ressuspensas em 200uL de solução de marcação (0,0914g de cloreto de magnésio; 0,0774g de citrato de sódio; 0,04766g de hepes; 10uL de triton-X, 0,5mL de iodeto de propídeo, 9,490mL de água). As células forma mantidas em gelo e protegidas da luz por pelo menos 30 minutos antes da leitura. A percentagem de células nas fases G0/G1, S e G2/M foi medida utilizando citômetro de fluxo (BD FACSCalibur) e posteriormente analisadas utilizando o software FlowJo. Foram analisados 30.000 eventos. Conforme apresentado nas Figuras 7-10, o tratamento com CHDE não modulou a progressão do ciclo celular, entretanto pode-se observar um aumento significativo de conteúdo sub-G1, indicativo de morte celular (JAFARGHOLIZADEH, N. et al. The cucurbitacins D, E, and I from Ecballium elaterium (L.) upregulate the LC3 gene and induce cell-cycle arrest in human gastric cancer cell line AGS. Iranian Journal of Basic Medical Science, v.21, p.253-259, 2018), o que corrobora os resultados do teste de citotoxicidade.

Claims (3)

1. Chalcona derivada do diidroeugenol, caracterizada pela estrutura química I.

   
2. Chalconas derivadas da substância I, caracterizadas pelo padrão estrutural geral II, onde R1, R2 e R3 sejam: -H, -OH, -OR, -OCOR, -O-heterosídeos, -NH2, NHR, -NHCOR, -NH-heterosídeos, -SH, -SR, -SCOR, -S-heterosídeos, grupos alquila, grupos arila, aromáticos, heteroaromáticos, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -CHO, -COR, -N3, -CN, -COOH, -COOR, -CONH2, -CONHR, -CONRR, -CONHNHR, amidinas, guanidinas, semicarbazonas, tiossemicarbazonas, tetrazóis, triazóis, imidazóis.

   
3. Chalconas, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelas estruturas químicas I e II, caracterizadas por apresentarem atividade antitumoral, preferencialmente hepatocarcinona.

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