BR102021007058B1 - COVID-19 DIAGNOSIS USING SYNTHETIC PEPTIDE ANTIGEN FROM NUCLEOCAPSID PROTEIN - Google Patents
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Abstract
DIAGNÓSTICO DA COVID-19 UTILIZANDO ANTÍGENO PEPTÍDICOSINTÉTICO PROVENIENTE DA PROTEÍNA DO NUCLEOCAPSÍDEO. A presente invenção trata deum novo peptídeo sintético P.SC2.N.366que tem forte interação com anticorpos específicos anti-SARS-CoV-2. O peptídeo foi engenheirado a partir da sequência de aminoácidos da proteína N de SARS-CoV-2 e foi sintetizado por via química. O peptídeo pode ser utilizado como antígeno em ensaios imunológicos para diagnóstico da COVID-19. Um ensaioimuno-enzimático indireto (ELISA indireto) foi padronizado utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 como antígeno. A validação do método usando o novo antígeno apresentou 91.67% de sensibilidade e 98,00% de especificidade para anticorpos anti-IgM e 100,00% de sensibilidade e 92,00% de especificidade de para anticorpos anti-IgG. A invenção trata também de um novo kit de diagnóstico para a COVID-19 que reúne todas as soluções necessárias para a realização do ensaio, bem como a microplaca revestida com o antígeno P.SC2.N.366.Deste modo, o conjunto da invenção apresenta ferramentas que podem ser utilizados no controle da pandemia da doença causada por SARS-COV-2pela testagem rápidas e em larga escalaCOVID-19 DIAGNOSIS USING SYNTHETIC PEPTIDE ANTIGEN FROM NUCLEOCAPSID PROTEIN. The present invention deals with a new synthetic peptide P.SC2.N.366 that has strong interaction with specific anti-SARS-CoV-2 antibodies. The peptide was engineered from the amino acid sequence of the SARS-CoV-2 N protein and was synthesized chemically. The peptide can be used as an antigen in immunoassays for the diagnosis of COVID-19. An indirect enzyme immunoassay (indirect ELISA) was standardized using the peptide P.SC2.N.366 as an antigen. The validation of the method using the new antigen showed 91.67% sensitivity and 98.00% specificity for anti-IgM antibodies and 100.00% sensitivity and 92.00% specificity for anti-IgG antibodies. The invention also deals with a new diagnostic kit for COVID-19 that brings together all the solutions necessary to carry out the assay, as well as the microplate coated with the P.SC2.N.366 antigen. presents tools that can be used to control the disease pandemic caused by SARS-COV-2 by rapid and large-scale testing
Description
[001]. A presente invenção trata de um novo antígeno peptídico sintético imunorreativo contra anticorpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 presentes em amostras biológicas. Trata também de um teste ELISA indireto para diagnóstico da COVID-19 utilizando como antígeno o peptídeo P.SC2.N.366. O teste permite discriminar eficientemente indivíduos que foram infectados pelo vírus SARS-CoV-2 (tanto para casos sintomáticos quanto assintomáticos da doença), dos que não foram infectados.[001]. The present invention deals with a new synthetic peptide antigen immunoreactive against anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG antibodies present in biological samples. It is also an indirect ELISA test for the diagnosis of COVID-19 using the peptide P.SC2.N.366 as antigen. The test makes it possible to efficiently discriminate individuals who have been infected with the SARS-CoV-2 virus (both for symptomatic and asymptomatic cases of the disease) from those who have not been infected.
[002]. Além disso, a presente invenção trata de um kit de diagnóstico para COVID-19. O kit é caracterizado por conter microplaca revestida com o antígeno P.SC2.N.366, solução de lavagem, diluente de amostra, diluente do conjugado, solução de anticorpos secundários, solução substrato de revelação, solução de parada da reação e os controles positivo e negativo.[002]. Furthermore, the present invention deals with a diagnostic kit for COVID-19. The kit is characterized by containing a microplate coated with the P.SC2.N.366 antigen, washing solution, sample diluent, conjugate diluent, secondary antibody solution, development substrate solution, reaction stop solution and the positive controls. and negative.
[003]. O vírus da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é o sétimo vírus da família dos coronavírus (CoV) que pode infectar humanos, causando a doença denominada COVID-19. Os outros membros desta família são HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV- NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV e MERS-CoV. Estes vírus infectam também outras espécies de vertebrados, como morcegos e animais de companhia. Os animais infectados podem servir de reservatórios para o vírus, que passa a infectar seres humanos através do ciclo zoonótico. O comportamento, patogênese e etiologia do SARS-CoV-2, também chamado de novo coronavírus, são diferentes dos coronavírus epidêmicos anteriores. Porém, as características de outros coronavírus conhecidos, principalmente do SARS-CoV, fornecem uma base útil para a pesquisa relacionada ao SARS-CoV-2 (OF THE INTERNATIONAL, Coronaviridae Study Group et al. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature Microbiology, v. 5, n. 4, p. 536, 2020).[003]. Severe acute respiratory syndrome virus 2 (SARS-CoV-2) is the seventh virus in the family of coronaviruses (CoV) that can infect humans, causing the disease called COVID-19. The other members of this family are HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV and MERS-CoV. These viruses also infect other vertebrate species, such as bats and companion animals. Infected animals can serve as reservoirs for the virus, which goes on to infect humans through the zoonotic cycle. The behavior, pathogenesis and etiology of SARS-CoV-2, also called novel coronavirus, are different from previous epidemic coronaviruses. However, the characteristics of other known coronaviruses, mainly SARS-CoV, provide a useful basis for research related to SARS-CoV-2 (OF THE INTERNATIONAL, Coronaviridae Study Group et al. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature Microbiology, v. 5, n. 4, p. 536, 2020).
[004]. O SARS-CoV-2 tem diâmetro entre 80-120 nm, e apresenta RNA de fita positiva como material genético. O RNA viral pode ser diretamente traduzido em proteína, ou pode ser usado como molde para sintetizar novas cópias de RNA utilizando uma enzima polimerase dependente de RNA. Este mecanismo contribui para uma alta taxa de mutação do material genético viral. O comprimento total do genoma é de 26 a 32 kb, sendo o maior entre todos os vírus de RNA documentados até o momento. A região ORF1ab corresponde a dois terços do genoma, e é responsável por codificar a poliproteína ORF1ab, que tem papel na replicação do material genético viral. O outro um terço do genoma é composto por genes que codificam quatro proteínas estruturais e pelo menos seis proteínas acessórias (3a, 6, 7a, 7b, 8 e 10). As proteínas estruturais são: a proteína spike (S), a proteína de envelope (E), a glicoproteína de membrana (M) e a proteína do nucleocapsídeo (N) (KIM, Dongwan et al. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell, 2020).[004]. SARS-CoV-2 has a diameter between 80-120 nm, and has positive-stranded RNA as its genetic material. Viral RNA can be directly translated into protein, or it can be used as a template to synthesize new copies of RNA using an RNA-dependent polymerase enzyme. This mechanism contributes to a high mutation rate of viral genetic material. The total genome length is 26 to 32 kb, the largest among all RNA viruses documented to date. The ORF1ab region corresponds to two thirds of the genome, and is responsible for encoding the ORF1ab polyprotein, which plays a role in the replication of viral genetic material. The other one-third of the genome is composed of genes encoding four structural proteins and at least six accessory proteins (3a, 6, 7a, 7b, 8, and 10). The structural proteins are: the spike protein (S), the envelope protein (E), the membrane glycoprotein (M) and the nucleocapsid protein (N) (KIM, Dongwan et al. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell, 2020).
[005]. A infecção viral causada pelo novo coronavírus tem como alvo principal o sistema respiratório de humanos. As manifestações clínicas mais comuns da doença são febre, fraqueza e tosse seca, e algumas manifestações mais raras são a obstrução nasal, rinorreia e diarreia. A maioria dos casos geram infecções leves (80%), e com um período de recuperação normal de duas semanas. Todavia, os casos graves de infecção progridem para pneumonia, choque séptico, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), acidose metabólica refratária e disfunção de coagulação, sendo potencialmente fatal (GUAN, Wei-jie et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England journal of medicine, v. 382, n. 18, p. 1708-1720, 2020).[005]. The viral infection caused by the new coronavirus mainly targets the respiratory system of humans. The most common clinical manifestations of the disease are fever, weakness and dry cough, and some rarer manifestations are nasal obstruction, rhinorrhea and diarrhea. Most cases generate mild infections (80%), with a normal recovery period of two weeks. However, severe cases of infection progress to pneumonia, septic shock, acute respiratory distress syndrome (ARDS), refractory metabolic acidosis and clotting dysfunction, being potentially fatal (GUAN, Wei-jie et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England journal of medicine, v. 382, n. 18, p. 1708-1720, 2020).
[006]. Os primeiros casos da COVID-19 surgiram no final de 2019 na China, e se espalharam rapidamente pelo mundo. A transmissão da doença entre humanos ocorre por meio do contato próximo com um indivíduo infectado, que produz gotículas respiratórias ao tossir ou espirrar, da mesma maneira que ocorre com o resfriado e a gripe comum. Em 11 de Março de 2020, a Organização Mundial da Saúde (OMS) reconheceu o status de pandemia da COVID-19. Até 20 de Janeiro de 2021, foram confirmados mais de 94,1 milhões de casos no mundo e mais de 8,5 milhões de casos no Brasil. Dentre estes, foram reportados mais de dois milhões de óbitos no mundo e 211 mil no Brasil (WHO, World Health Organization. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. 2020. Disponível em: https://covid19.who.int/. Acesso em 20/01/2021; BRASIL. COVID-19: Painel Coronavírus. Ministério da Saúde, 2020. Disponível em: https://covid.saude.gov.br/, acesso em 20/01/2021).[006]. The first cases of COVID-19 emerged in late 2019 in China and quickly spread around the world. Transmission of the disease between humans occurs through close contact with an infected individual, who produces respiratory droplets when coughing or sneezing, in the same way as with the common cold and flu. On March 11, 2020, the World Health Organization (WHO) recognized the pandemic status of COVID-19. As of January 20, 2021, more than 94.1 million cases have been confirmed worldwide and more than 8.5 million cases in Brazil. Among these, more than two million deaths were reported worldwide and 211 thousand in Brazil (WHO, World Health Organization. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. 2020. Available at: https://covid19.who.int/ . Accessed on 01/20/2021; BRAZIL. COVID-19: Panel Coronavirus. Ministry of Health, 2020. Available at: https://covid.saude.gov.br/, accessed on 01/20/2021).
[007]. A prevenção e o controle da COVID-19 se tornaram tarefa comum para governos e pessoas de todos os países, que tiveram que se adaptar à presença do vírus. Dentre as medidas para controle da doença está a identificação de casos ativos. A identificação de indivíduos infectados, com ou sem sintomas, permite o seu isolamento precoce. Desta maneira, evita-se maior disseminação do vírus, e consequentemente se reduz o número de casos e mortes. Neste sentido, kits e testes de diagnóstico tornaram-se ferramentas indispensáveis para a prevenção e controle da pandemia (PEELING, Rosanna W. et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. The Lancet Infectious Diseases, 2020).[007]. The prevention and control of COVID-19 has become a common task for governments and people in all countries, who have had to adapt to the presence of the virus. Among the measures to control the disease is the identification of active cases. The identification of infected individuals, with or without symptoms, allows their early isolation. In this way, further spread of the virus is avoided, and consequently the number of cases and deaths is reduced. In this sense, diagnostic kits and tests have become indispensable tools for the prevention and control of the pandemic (PEELING, Rosanna W. et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. The Lancet Infectious Diseases, 2020).
[008]. Os kits de diagnóstico em uso atualmente são classificados em dois tipos de acordo com o alvo de detecção, o primeiro detecta ácido nucléico viral (RT-qPCR) e o outro detecta anticorpos anti-SARS- CoV-2. A transcrição reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) é o teste laboratorial para detecção da presença do material genético viral. Este método apresenta alta sensibilidade. Porém, podem apresentar resultados falsos negativos por fatores como: 1) a coleta de amostra realizada de maneira incorreta, 2) a variação das sequências virais de RNA, 3) a variação da quantidade de carga viral ao decorrer da infecção e em diferentes locais anatômicos dos infectados. Além disso, o RT-qPCR requer equipamentos complexos, operadores treinados, garantia de qualidade laboratorial de alto padrão, e leva mais tempo para fornecer o resultado (WANG, Yishan et al. Combination of RT-qPCR testing and clinical features for diagnosis of COVID-19 facilitates management of SARS-CoV-2 outbreak. Journal of medical virology, v. 92, n. 6, p. 538-539, 2020).[008]. The diagnostic kits currently in use are classified into two types according to the detection target, the first detects viral nucleic acid (RT-qPCR) and the other detects anti-SARS-CoV-2 antibodies. Reverse transcription followed by real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) is the laboratory test to detect the presence of viral genetic material. This method has high sensitivity. However, they may present false negative results due to factors such as: 1) incorrect sample collection, 2) variation of viral RNA sequences, 3) variation in the amount of viral load during the course of infection and in different anatomical sites of the infected. In addition, RT-qPCR requires complex equipment, trained operators, high standard laboratory quality assurance, and takes longer to provide the result (WANG, Yishan et al. Combination of RT-qPCR testing and clinical features for diagnosis of COVID -19 facilitators management of SARS-CoV-2 outbreak. Journal of medical virology, v. 92, n. 6, p. 538-539, 2020).
[009]. O segundo método visa à detecção de anticorpos contra o coronavírus por testes sorológicos. Estes ensaios são utilizados para medir as respostas de anticorpos contra os patógenos em fluidos corporais como soro, plasma sanguíneo, saliva, urina, entre outros. Eles são baseados na interação entre antígeno e anticorpo, e podem ser aplicados em diferentes plataformas: ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), ensaios de fluxo lateral (lateral flow) ou ensaios de quimiluminescência, imunoeletroquímica. O sistema imunológico produz ao longo da infecção diferentes imunoglobulinas. Imunoglobulinas IgM são produzidas mais cedo, e aparecem dentro de uma semana após a infecção. Deste modo, a presença destes anticorpos é um indicador de infecção aguda. Por outro lado, imunoglobulinas IgG são produzidas mais tarde, mas se mantém por um período de tempo mais longo, indicando infecção ativa e infecção passada (ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. H.; PILLAI, S. Cellular and Molecular Immunology. ed. 9. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2017).[009]. The second method aims to detect antibodies against the coronavirus by serological tests. These assays are used to measure antibody responses against pathogens in body fluids such as serum, blood plasma, saliva, urine, among others. They are based on the interaction between antigen and antibody, and can be applied in different platforms: enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), lateral flow assays or chemiluminescence, immunoelectrochemical assays. The immune system produces different immunoglobulins during the infection. IgM immunoglobulins are produced earlier, and appear within a week of infection. Thus, the presence of these antibodies is an indicator of acute infection. On the other hand, IgG immunoglobulins are produced later, but are maintained for a longer period of time, indicating active infection and past infection (ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. H.; PILLAI, S. Cellular and Molecular Immunology. ed. 9. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2017).
[010]. Ensaios sorológicos são ferramentas essenciais no manejo de doenças infecciosas. Elas permitem a detecção de anticorpos na presença da doença ou anticorpos protetores após a vacinação. Além disso, é possível fazer avaliação da soroprevalência em uma população. A detecção de anticorpos é possível em amostras biológicas como soros, sangue, saliva, urina, lágrimas entre outras. Tem a vantagem de usar técnicas in vitro que são fáceis de operar e permitem emitir resultados em poucas horas. Para isso são usadas metodologias como o teste ELISA, Imunocromatografia, western blot, mas não se limitando a estas (KRAMMER, Florian; SIMON, Viviana. Serology assays to manage COVID-19. Science, v. 368, n. 6495, p. 1060-1061, 2020).[010]. Serological assays are essential tools in the management of infectious diseases. They allow detection of antibodies in the presence of the disease or protective antibodies after vaccination. In addition, it is possible to assess the seroprevalence in a population. Antibody detection is possible in biological samples such as serum, blood, saliva, urine, tears, among others. It has the advantage of using in vitro techniques that are easy to operate and allow you to produce results in a few hours. For this, methodologies such as ELISA, Immunochromatography, western blot are used, but not limited to these (KRAMMER, Florian; SIMON, Viviana. Serology assays to manage COVID-19. Science, v. 368, n. 6495, p. 1060-1061, 2020).
[011]. Os ensaios ELISA são realizados com antígenos sintéticos ou recombinantes, que são responsáveis pela ligação com os anticorpos. Portanto, a precisão do teste depende diretamente da seleção dos melhores antígenos. As duas principais proteínas virais, utilizadas como antígenos, são: a proteína spike (S) e a proteína do nucleocapsídeo de SARS-CoV-2 (N). A proteína S está presente na superfície do SARS-CoV-2, e tem função de ligação do vírus aos receptores de membrana da célula hospedeira. Desta maneira, desempenha um papel importante na patogênese e pode estimular a resposta imune gerando anticorpos.[011]. ELISA assays are performed with synthetic or recombinant antigens, which are responsible for binding with antibodies. Therefore, the accuracy of the test depends directly on the selection of the best antigens. The two main viral proteins used as antigens are: the spike protein (S) and the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (N). Protein S is present on the surface of SARS-CoV-2, and has the function of binding the virus to the host cell's membrane receptors. In this way, it plays an important role in pathogenesis and can stimulate the immune response by generating antibodies.
[012]. A proteína N funciona principalmente em combinação com o RNA viral e está intimamente relacionada à patogenicidade. Pode estar envolvida na transcrição e replicação do RNA, ter funções relacionadas à mecanismos patogênicos, além de outras funções biológicas. Ademais, as proteínas do nucleocapsídeo do coronavírus são relativamente conservadas, e são muito antigênicas, então induzem a imunidade do hospedeiro para gerar altas taxas de anticorpos. Por esta razão, a proteína N de SARS-CoV-2 é uma ótima opção para ser usada como antígeno para diagnóstico de coronavírus e no desenvolvimento de vacinas (ZENG, Weihong et al. Biochemical characterization of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Biochemical and biophysical research communications, v. 527, n. 3, p. 618-623, 2020).[012]. The N protein mainly works in combination with viral RNA and is closely related to pathogenicity. It may be involved in RNA transcription and replication, have functions related to pathogenic mechanisms, in addition to other biological functions. Furthermore, coronavirus nucleocapsid proteins are relatively conserved, and are very antigenic, so they induce host immunity to generate high rates of antibodies. For this reason, SARS-CoV-2 N protein is a great option to be used as an antigen for coronavirus diagnosis and vaccine development (ZENG, Weihong et al. Biochemical characterization of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Biochemical and biophysical research communications, v. 527, n. 3, p. 618-623, 2020).
[013]. Quando as proteínas virais são produzidas de maneira recombinante, sua expressão na estrutura correta é geralmente a etapa mais difícil. Além disso, as proteínas virais costumam ter vários locais de glicosilação, o que aumenta a dificuldade de expressa-las e purifica-las. Portanto, existe um custo alto associado a sua produção e armazenamento. Além disso, ao utilizar a proteína completa como antígeno, existe a possibilidade de reconhecimento cruzado de outros anticorpos inespecíficos, o que diminui a especificidade do teste de diagnóstico.[013]. When viral proteins are produced recombinantly, their expression in the correct structure is often the most difficult step. In addition, viral proteins often have multiple glycosylation sites, which increases the difficulty of expressing and purifying them. Therefore, there is a high cost associated with its production and storage. In addition, when using the complete protein as an antigen, there is the possibility of cross-recognition of other nonspecific antibodies, which decreases the specificity of the diagnostic test.
[014]. Sendo assim, a sequência da proteína N de SARS-CoV-2 pode ser utilizada como modelo para desenvolvimento de peptídeos sintéticos com função central parcial. Os peptídeos são fragmentos da proteína completa, compostos por regiões antigênicas chave, o que possibilita aumentar a especificidade sem diminuir a sensibilidade do teste. Isto ocorre, pois a especificidade de um anticorpo é dirigida a um único epítopo antigênico, em vez da molécula antigênica inteira. Ademais, os peptídeos não dependem de conformação tridimensional, o que resolve os problemas de expressão e purificação da proteína. Portanto, os peptídeos sintéticos são uma alternativa segura e conveniente para serem utilizados como substratos para imunoensaios e vacinas (GOMARA, M. J.; HARO, I. Synthetic peptides for the immunodiagnosis of human diseases. Current Medicinal Chemistry, v. 14, n. 5, p. 531-546, 2007).[014]. Therefore, the sequence of the N protein of SARS-CoV-2 can be used as a model for the development of synthetic peptides with partial central function. Peptides are fragments of the complete protein, composed of key antigenic regions, which makes it possible to increase the specificity without decreasing the sensitivity of the test. This is because the specificity of an antibody is directed at a single antigenic epitope, rather than the entire antigenic molecule. Furthermore, the peptides do not depend on three-dimensional conformation, which solves the problems of protein expression and purification. Therefore, synthetic peptides are a safe and convenient alternative for use as substrates for immunoassays and vaccines (GOMARA, M. J.; HARO, I. Synthetic peptides for the immunodiagnosis of human diseases. Current Medicinal Chemistry, v. 14, n. pp. 531-546, 2007).
[015]. Outro fator importante é a avaliação da avidez dos anticorpos IgG. O índice avidez tem sido amplamente utilizado em testes imunoenzimáticos para discriminar entre infecções ativas, infecções primárias ou secundárias. A avidez refere-se à força de ligação resultante de todas as interações entre o antígeno e o anticorpo. A mudança na afinidade dos anticorpos IgG durante a resposta imune adaptativa depende da maturação e evolução temporal da resposta imune. A medida desta afinidade permite a distinção entre uma infecção primária recente e uma infecção passada ou crônica, e é uma ferramenta eficaz no diagnóstico temporal de diversas doenças infecciosas. O teste de avidez também pode ser utilizado para análise de reações cruzadas, estudos epidemiológicos e como controle de programas de vacinação (LIU, Tiancheng et al. High- Accuracy Multiplexed SARS-CoV-2 Antibody Assay with Avidity and Saliva Capability on a Nano-Plasmonic Platform. bioRxiv, 2020; BAUER, Georg. The variability of the serological response to SARSacorona virusa 2: Potential resolution of ambiguity through determination of avidity (functional affinity). Journal of Medical Virology, v. 93, n. 1, p. 311-322, 2021).[015]. Another important factor is the assessment of the avidity of IgG antibodies. The avidity index has been widely used in enzyme immunoassays to discriminate between active infections, primary or secondary infections. Avidity refers to the binding strength resulting from all interactions between antigen and antibody. The change in the affinity of IgG antibodies during the adaptive immune response depends on the maturation and temporal evolution of the immune response. The measurement of this affinity allows the distinction between a recent primary infection and a past or chronic infection, and is an effective tool in the temporal diagnosis of several infectious diseases. The avidity test can also be used for cross-reaction analysis, epidemiological studies and as a control of vaccination programs (LIU, Tiancheng et al. High-Accuracy Multiplexed SARS-CoV-2 Antibody Assay with Avidity and Saliva Capability on a Nano- Plasmonic Platform. bioRxiv, 2020; BAUER, Georg. The variability of the serological response to SARSacorona virusa 2: Potential resolution of ambiguity through determination of avidity (functional affinity). Journal of Medical Virology, v. 93, n. 1, p. 311-322, 2021).
[016]. Durante a pandemia de coronavírus vivida em 2020 e 2021, a demanda por insumos, equipamentos e tecnologias da área da saúde cresceram em todo o globo. Esta disputa internacional pela compra de itens essenciais levou ao aumento de preços e até a falta de itens para atender toda a demanda. O Brasil ficou sujeito às variações de preços do mercado internacional e também ficou dependente dos países detentores das mercadorias. Por esta razão, são necessários grandes esforços para prover soluções tecnológicas nacionais, que permitam o combate à pandemia de COVID-19, bem como garantir maior autonomia do país em relação aos itens importados.[016]. During the coronavirus pandemic experienced in 2020 and 2021, demand for healthcare supplies, equipment and technologies grew across the globe. This international dispute over the purchase of essential items has led to price increases and even a lack of items to meet all the demand. Brazil was subject to price variations in the international market and was also dependent on the countries holding the goods. For this reason, great efforts are needed to provide national technological solutions that allow the fight against the COVID-19 pandemic, as well as guaranteeing greater autonomy for the country in relation to imported items.
[017]. A presente invenção trata de um novo antígeno um peptídeo sintético mimético e um método de diagnóstico sorológico (ELISA indireto) para COVID-19. O peptídeo é de sequência artificial, imunorreativo com soros de indivíduos infectados com SARS-CoV-2.[017]. The present invention deals with a new antigen a synthetic peptide mimetic and a method of serological diagnosis (indirect ELISA) for COVID-19. The peptide is of artificial sequence, immunoreactive with sera from individuals infected with SARS-CoV-2.
[018]. Até o presente momento, poucas soluções tecnológicas foram publicadas em documentos patentários, tendo em vista que a COVID- 19 foi identificada em humanos no final de 2019. Algumas soluções tecnológicas tratam de testes RT-qPCR para diagnóstico de COVID-19, como: CN111518960A, CN111074005A, CN111118228A, CN111118228B, CN111197112A, RU2731390C1.[018]. To date, few technological solutions have been published in patent documents, given that COVID-19 was identified in humans at the end of 2019. Some technological solutions deal with RT-qPCR tests for the diagnosis of COVID-19, such as: CN111518960A , CN111074005A, CN111118228A, CN111118228B, CN111197112A, RU2731390C1.
[019]. Outras tratam de testes do tipo imunocromatografia, como: CN111024954A, CN111239400A, CN111060691A, CN111426830A,DE202020102077U1.[019]. Others deal with immunochromatography-type tests, such as: CN111024954A, CN111239400A, CN111060691A, CN111426830A, DE202020102077U1.
[020]. Entretanto, algumas invenções descrevem o uso de proteínas recombinantes como antígeno para testes do tipo ELISA. A proteína S é utilizada nas patentes CN111983226A, US8541003B2 e US2016376321A. Já a proteína N é utilizada nas patentes CN111983226A e CN111647055A.[020]. However, some inventions describe the use of recombinant proteins as an antigen for ELISA-type tests. Protein S is used in patents CN111983226A, US8541003B2 and US2016376321A. Protein N is used in patents CN111983226A and CN111647055A.
[021]. Alguns trabalhos exploram peptídeos para diagnóstico de COVID-19, como CN111856027A e CN111978378A. Contudo, nestes trabalhos foram utilizados combinações de diferentes peptídeos para realizar o diagnóstico.[021]. Some works explore peptides for the diagnosis of COVID-19, such as CN111856027A and CN111978378A. However, in these works, combinations of different peptides were used to make the diagnosis.
[022]. A presente invenção inova por se tratar de um peptídeo sintético, não natural e imunorreativo com anticorpos anti-SARS-CoV-2. O ensaio ELISA indireto utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 como antígeno apresenta 91,67% de sensibilidade e 98% de especificidade para anticorpos IgM e 100% de sensibilidade e 92% de especificidade para IgG. A elevada sensibilidade e especificidade possibilita um diagnóstico confiável e conciso. Além disso, ao testar dois anticorpos, IgM e IgG, é possível compreender melhor o estágio da doença. A presente invenção trata também de um kit de diagnóstico para COVID- 19, que contém uma microplaca revestida com o peptídeo P.SC2.N.366 e todas as soluções necessárias para a realização do teste. Desta forma, este trabalho oferece uma opção original e promissora de teste sorológico para diagnóstico da COVID-19.[022]. The present invention is innovative because it is a synthetic, non-natural peptide that is immunoreactive with anti-SARS-CoV-2 antibodies. The indirect ELISA assay using P.SC2.N.366 peptide as antigen has 91.67% sensitivity and 98% specificity for IgM antibodies and 100% sensitivity and 92% specificity for IgG. The high sensitivity and specificity enables a reliable and concise diagnosis. In addition, by testing two antibodies, IgM and IgG, it is possible to better understand the stage of the disease. The present invention also deals with a diagnostic kit for COVID-19, which contains a microplate coated with the peptide P.SC2.N.366 and all the solutions necessary to perform the test. In this way, this work offers an original and promising option for a serological test for the diagnosis of COVID-19.
[023]. Até o momento, não existe nenhum medicamento eficaz para tratar a COVID-19, e são poucas as vacinas aprovadas e em uso atualmente. Por este motivo, o diagnóstico precoce é um ponto chave para controlar a situação pandêmica. As técnicas de diagnósticos moleculares, principalmente a RT-qPCR, apresentam limitações com relação ao período de detecção do vírus, que só é possível a ser realizado nas primeiras semanas da infecção viral.[023]. To date, there is no effective drug to treat COVID-19, and few vaccines are currently approved and in use. For this reason, early diagnosis is a key point to control the pandemic situation. Molecular diagnostic techniques, especially RT-qPCR, have limitations regarding the period of virus detection, which is only possible to be performed in the first weeks of the viral infection.
[024]. Por outro lado, os testes sorológicos podem ser utilizados para diagnóstico da fase aguda, na forma do isotipo IgM, ou mesmo havendo decorrido semanas da infecção, na forma do isotipo IgG. Ale disso, os testes sorológicos permitem acompanhar a soro prevalência da população após a vacinação e auxiliam nas políticas de vacinação.[024]. On the other hand, serological tests can be used for diagnosis of the acute phase, in the form of the IgM isotype, or even weeks after the infection, in the form of the IgG isotype. In addition, serological tests allow monitoring the population's seroprevalence after vaccination and assist in vaccination policies.
[025]. Para a avaliação sorológica os ensaios sorológicos do tipo ELISA são bem consolidados e difundidos. Eles podem ser realizados em laboratórios de menor infraestrutura, e com equipe não especializada, além de serem passíveis de automação. Desta forma, os ensaios ELISA possibilitam testagem em larga escala incluindo casos assintomáticos para qualquer doença. Para seu uso são necessários antígenos podendo ser o patógeno total, ou seus fragmentos, ou proteínas recombinantes ou ainda frações proteicas denominados epítopos antigênicos.[025]. For serological assessment, ELISA-type serological assays are well established and widespread. They can be carried out in laboratories with less infrastructure, and with a non-specialized team, in addition to being subject to automation. In this way, ELISA assays enable large-scale testing including asymptomatic cases for any disease. For its use, antigens are needed, which can be the total pathogen, or its fragments, or recombinant proteins or protein fractions called antigenic epitopes.
[026]. A utilização de antígeno peptídico de sequência artificial é uma alternativa às proteínas recombinantes, pois peptídeos apresentam potencial antigênico de um ou poucos epítopos. A utilização de alta concentração de um único epítopo oferece vantagem de aumentar a especificidade ao teste, uma vez que garante uma interação com anticorpos específicos contra o SARS-CoV-2. A síntese de peptídeos é comumente realizada em equipamentos automatizados, o que permite uma produção do antígeno em grande quantidade e rápida.[026]. The use of artificial sequence peptide antigen is an alternative to recombinant proteins, because peptides have antigenic potential of one or a few epitopes. The use of a high concentration of a single epitope offers the advantage of increasing the specificity of the test, as it guarantees an interaction with specific antibodies against SARS-CoV-2. Peptide synthesis is commonly performed in automated equipment, which allows for rapid and large-scale antigen production.
[027]. Neste contexto, a presente invenção descreve o uso de um novo antígeno, o peptídeo sintético de sequência artificial P.SC2.N.366 para uso em diagnóstico sorológico. Este pode ser produzido por síntese química, em larga escala, e pode ser utilizado em uma plataforma de testagem de COVID-19. O método ELISA indireto permite identificar imunoglobulinas IgM, IgG e IgTotal pode ser utilizado para diagnóstico em diferentes fases da infecção pelo vírus, para casos clinicamente sintomáticos e assintomáticos. Além disso, o kit de diagnóstico aqui descrito reúne os insumos necessários para realização do teste de COVID-19, constituindo uma opção prática para laboratórios não especializados e para testagens em larga escala. Sendo assim, o conjunto da presente invenção é uma opção viável para teste sorológico da doença causada pelo coronavírus (SARS-CoV-2) e pode contribuir para o controle da pandemia.[027]. In this context, the present invention describes the use of a new antigen, the artificial sequence synthetic peptide P.SC2.N.366 for use in serological diagnosis. This can be produced by chemical synthesis, on a large scale, and can be used in a COVID-19 testing platform. The indirect ELISA method allows the identification of IgM, IgG and Total Ig immunoglobulins and can be used for diagnosis at different stages of the virus infection, for clinically symptomatic and asymptomatic cases. In addition, the diagnostic kit described here brings together the necessary supplies to perform the COVID-19 test, constituting a practical option for non-specialized laboratories and for large-scale testing. Therefore, the set of the present invention is a viable option for serological testing of the disease caused by the coronavirus (SARS-CoV-2) and can contribute to the control of the pandemic.
[028]. Primeiramente, a presente invenção trata de um novo peptídeo sintético P.SC2.N.366, caracterizado por conter a sequência artificial detalhada no arquivo Txt (SEQ ID N°1). Esta sequência é composta por fragmentos base proveniente da proteína N de SARS- CoV-2 (P0DTC9.1), acrescida de uma sequência artificial de aminoácidos para conferir maior estabilidade físico-química e hidrofilicidade à molécula.[028]. First, the present invention deals with a new synthetic peptide P.SC2.N.366, characterized by containing the artificial sequence detailed in the Txt file (SEQ ID N°1). This sequence is composed of base fragments from the N protein of SARS-CoV-2 (P0DTC9.1), plus an artificial sequence of amino acids to confer greater physicochemical stability and hydrophilicity to the molecule.
[029]. O peptídeo contendo esta sequência artificial pode ser utilizado como antígeno para diagnóstico sorológico em indivíduos infectados pelo vírus SARS-CoV-2. Além disso, o peptídeo pode ser utilizado para detectar os isotipos IgM e IgG (mais detalhes nos exemplos 2, 3 e 4). Desta maneira, pode ser utilizado para diagnóstico tanto na fase aguda, ou tendo decorrido algumas semanas da infecção.[029]. The peptide containing this artificial sequence can be used as an antigen for serological diagnosis in individuals infected with the SARS-CoV-2 virus. Furthermore, the peptide can be used to detect IgM and IgG isotypes (more details in Examples 2, 3 and 4). In this way, it can be used for diagnosis either in the acute phase, or after a few weeks of infection.
[030]. O peptídeo foi sintetizado pela técnica de síntese química em suporte sólido, utilizando um equipamento automatizado MultiPep RS (Intavis Bioanalytical Instruments) e aminoácidos com grupos de proteção Fmoc. Em seguida, o peptídeo foi purificado com três lavagens com éter terc-butil-metil, congelado em ultrafreezer a -80°c e liofilizado. Após esta etapa o peptídeo encontra-se em estado sólido, e pode ser armazenado ou suspendido em água ultrapura para gerar uma solução concentrada. Por fim, a concentração da proteína em solução concentrada foi determinada utilizando o Kit Micro BSA BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific).[030]. The peptide was synthesized by the chemical synthesis technique on solid support, using an automated equipment MultiPep RS (Intavis Bioanalytical Instruments) and amino acids with Fmoc protecting groups. Then, the peptide was purified with three washes with tert-butyl-methyl ether, frozen in an ultrafreezer at -80°C and lyophilized. After this step, the peptide is in a solid state, and can be stored or suspended in ultrapure water to generate a concentrated solution. Finally, the concentration of the protein in concentrated solution was determined using the Micro BSA BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific).
[031]. Uma vez que o peptídeo P.SC2.N.366 está sintetizado, ele pode ser utilizado em ensaios imunológicos para a detecção da resposta imune humoral e detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2. Estes ensaios sorológicos são: ELISA, Western Blotting, immunoblotting, imunofluorescência, radioimuensaio, microarranjo, teste de fluxo lateral, Multiantigen Print Immunoassay(MAPIA), porém não são limitados a esses.[031]. Once the P.SC2.N.366 peptide is synthesized, it can be used in immunoassays for the detection of humoral immune response and detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies. These serological assays are: ELISA, Western Blotting, immunoblotting, immunofluorescence, radioimmunoassay, microarray, lateral flow test, Multiantigen Print Immunoassay (MAPIA), but they are not limited to these.
[032]. A presente invenção também descreve um ensaio ELISA indireto para diagnóstico sorológico da COVID-19, utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 como antígeno. Este método compreende as etapas:[032]. The present invention also describes an indirect ELISA assay for the serological diagnosis of COVID-19, using the peptide P.SC2.N.366 as an antigen. This method comprises the steps:
[033]. diluição do peptídeo na solução de revestimento (coating), e em seguida imobilização em suporte sólido como microplaca de alta afinidade para teste ELISA (Greiner Bio-one). A incubação é realizada overnight (12 horas) a 4°C, possibilitando o revestimento dos poços da microplaca com o antígeno. Após incibação é feita lavagem de quatro a seis vezes dos poços com solução de lavagem e na sequência é feito o bloqueio com solução de bloqueio (PBS-0,05% Tween 20 + 2% de BSA% incubação por uma hora a 37 °C).[033]. dilution of the peptide in the coating solution (coating), and then immobilization on solid support as a high affinity microplate for ELISA test (Greiner Bio-one). The incubation is performed overnight (12 hours) at 4°C, allowing the coating of the microplate wells with the antigen. After incubation, the wells are washed four to six times with washing solution and then blocked with blocking solution (PBS-0.05
[034]. diluição das amostras de fluido biológico, em tampão de incubação na concentração predeterminada, e adicionar aos poços da microplaca. Os anticorpos anti-SARS-CoV-2 presentes nas amostras se ligarão aos antígenos imobilizados por interação antígeno-anticorpo. Caso o indivíduo testado não apresente anticorpos anti-SARS-CoV-2, não haverá ligação, e os antígenos imobilizados ficarão livres.[034]. dilution of the biological fluid samples in incubation buffer at the predetermined concentration and adding to the microplate wells. Anti-SARS-CoV-2 antibodies present in the samples will bind to the immobilized antigens by antigen-antibody interaction. If the tested individual does not have anti-SARS-CoV-2 antibodies, there will be no binding, and the immobilized antigens will be free.
[035]. adição de anticorpos secundários anti-human IgM ou antihuman IgG (Thermofisher Scientific). Estes anticorpos interagem com os isotipos IgM e IgG humanos respectivamente e são conjugadas com um uma enzima, como por exemplo a enzyme horseradish peroxidase (HRP), mas não se limitando a esta. Para ensaios de IgG, é necessária uma etapa subsequente para adição de neutravidina-HRP (Thermofisher Scientific). Para ensaios de avidez é necessária a etapa de adição de solução concentrada de Ureia.[035]. addition of anti-human IgM or anti-human IgG secondary antibodies (Thermofisher Scientific). These antibodies interact with human IgM and IgG isotypes respectively and are conjugated to an enzyme, such as the horseradish peroxidase (HRP) enzyme, but not limited to it. For IgG assays, a subsequent step is required for the addition of Neutravidin-HRP (Thermofisher Scientific). For avidity tests, the step of addition of concentrated Urea solution is necessary.
[036]. adição da solução de revelação como, por exemplo, TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina), mas não se restringindo a esta. Após o período de incubação, as amostras contendo anticorpos anti-SARS- CoV-2 irão reagir fortemente com a solução de TMB, enquanto que as amostras que não possuem anticorpos anti-SARS-CoV-2 apresentarão reação fraca, ou não irão reagir. Adição da solução de parada, como ácido clorídrico (Anidrol Produtos para Laboratórios), mas não se restringindo a esta. Ao final, deve ser feita a leitura da absorbância a 450 nm, e é feita a comparação do resultado com o valor do corte entre amostras biológicas positivas e negativas (Cutoff) determinado para o teste. O método aqui descrito é melhor detalhado no exemplo 2.[036]. addition of the developing solution such as, for example, TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine), but not limited thereto. After the incubation period, samples containing anti-SARS-CoV-2 antibodies will react strongly with the TMB solution, while samples that do not have anti-SARS-CoV-2 antibodies will react weakly or not at all. Addition of stop solution, such as hydrochloric acid (Anidrol Laboratory Products), but not limited to this. Finally, the absorbance at 450 nm must be read, and the result compared with the cutoff value between positive and negative biological samples (Cutoff) determined for the test. The method described here is further detailed in example 2.
[037]. Por último, a presente invenção também apresenta um kit para diagnóstico da COVID-19 usando o teste ELISA indireto e o peptídeo P.SC2.N.366 como antígeno. O Kit é caracterizado por conter microplaca revestida com o antígeno em concentração estabelecida, solução de lavagem, diluente de amostra, diluente do conjugado, solução de anticorpos secundários, solução de revelação, solução de parada e controle positivo e negativo. Desta forma, facilita a testagem em larga escala e em laboratórios com menor estrutura.[037]. Lastly, the present invention also presents a kit for the diagnosis of COVID-19 using the indirect ELISA test and the peptide P.SC2.N.366 as an antigen. The Kit is characterized by containing a microplate coated with the antigen in established concentration, washing solution, sample diluent, conjugate diluent, secondary antibody solution, development solution, stop solution and positive and negative control. In this way, it facilitates testing on a large scale and in laboratories with a smaller structure.
[038]. Constata-se que esta invenção não se limita aos protocolos, metodologias e reagentes específicos descritos, enquanto tal, que podem variar. Ademais, a terminologia aqui utilizada tem apenas o propósito de descrever os procedimentos e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção será limitado pelas reivindicações anexas.[038]. It is understood that this invention is not limited to the specific protocols, methodologies and reagents described, as such, which may vary. Furthermore, the terminology used herein is for the purpose of describing the procedures only and is not intended to limit the scope of the present invention. It will be limited by the appended claims.
[039]. Por fim, a presente invenção poderá ser compreendida por meio da descrição dos resultados obtidos descritos nos exemplos 1, 2, 3, 4 e 5 que compõem este relatório descritivo.[039]. Finally, the present invention can be understood through the description of the results obtained described in examples 1, 2, 3, 4 and 5 that make up this descriptive report.
[040]. A sequência de aminoácidos do peptídeo P.SC2.N.366 (SEQ ID No. 1) foi definida a partir de uma predição de epítopos de célula B realizada por bioinformática. Para isso, foi realizada uma varredura na sequência base da proteína N de SARS-CoV-2 (P0DTC9.1), buscando por epítopos mais antigênicos. Uma vez identificado os fragmentos antigênicos, aminoácidos não naturais foram adicionados à sequência, compondo assim a SEQ ID No. 1 (Tabela1). O resultado foi a construção de um peptídeo bastante antigênico, contendo epítopos da proteína N. As ferramentas utilizadas foram BepiPred-2.0, BcePred, IEDB e o software DNASTAR. Estas ferramentas fornecem um valor predito para a sequência de aminoácidos, quanto mais próximo de um for este valor predito, maior será a antigenicidade da sequência (SWEREDOSKI, Michael J.; BALDI, Pierre. PEPITO: improved discontinuous B-cell epitope prediction using multiple distance thresholds and half sphere exposure. Bioinformatics, v. 24, n. 12, p. 1459-1460, 2008; GALGONEK, Jakub et al. Amino acid interaction (INTAA) web server. Nucleic acids research, v. 45, n. W1, p. W388-W392, 2017; SAHA, Sudipto; RAGHAVA, Gajendra Pal Singh. BcePred: prediction of continuous B-cell epitopes in antigenic sequences using physico-chemical properties. In: International Conference on Artificial Immune Systems. Springer, Berlin, Heidelberg, 2004. p. 197-204; FREIRE, Paulo. A importância do ato de ler em três artigos que se completam: Volume 22. Cortez editora, 2017). Tabela 1. Predição da antigenicidade do novo peptídeo P.SC2.N.366 por quatro diferentes ferramentas de bioinformática. Quanto mais próximo de um o valor predito, mais antigênica terá a sequência de aminoácidos.
[041]. Em seguida, foi avaliada a similaridade da sequência do peptídeo com sequências dos organismos SARS-CoV-2 (taxid:2697049), MERS (1335626), H1N1 (taxid:114727) e humanos (taxid:9606). Esta análise foi feita usando a ferramenta BLASTp e as sequências foram comparadas em termos de cobertura e identidade (ALTSCHUL, Stephen F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 17, p. 33893402, 1997).[041]. Then, the peptide sequence similarity with sequences from SARS-CoV-2 (taxid:2697049), MERS (1335626), H1N1 (taxid:114727) and humans (taxid:9606) organisms was evaluated. This analysis was performed using the BLASTp tool and the sequences were compared in terms of coverage and identity (ALTSCHUL, Stephen F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, no. 17, p. 33893402, 1997).
[042]. A cobertura e identidade da SEQ ID No. 1 com o vírus SARS- CoV-2 foram de 100 e 89%. Deste modo, o peptídeo P.SC2.N.366 apresenta alta similaridade com o organismo alvo, contribuindo para uma elevada especificidade do teste. Mas a sequência de aminoácidos do peptídeo não corresponde a uma sequência natural, pois a maior identidade encontrada foi de 89% com a proteína N de SARS-CoV-2.[042]. Coverage and identity of SEQ ID No. 1 with the SARS-CoV-2 virus were 100 and 89%. Thus, the P.SC2.N.366 peptide shows high similarity with the target organism, contributing to a high specificity of the test. But the amino acid sequence of the peptide does not correspond to a natural sequence, as the highest identity found was 89% with the N protein of SARS-CoV-2.
[043]. A SEQ ID No. 1 também apresentou baixa similaridade para organismos MERS, H1N1 e humanos, diminuindo o risco de reação cruzada e contribuindo para uma maior especificidade do teste de diagnóstico. Ainda, a SEQ ID No. 1 foi comparada com sequências já patenteadas, e todas as sequências encontradas apresentam cobertura e/ou identidade menores do que 95% (database Patented Protein Sequence).[043]. SEQ ID No. 1 also showed low similarity for MERS, H1N1 and human organisms, decreasing the risk of cross-reaction and contributing to a greater specificity of the diagnostic test. Furthermore, SEQ ID No. 1 was compared with sequences already patented, and all sequences found showed coverage and/or identity less than 95% (Patented Protein Sequence database).
[044]. Em seguida, foi determinado o índice GRAVY do peptídeo utilizando a ferramenta ProtParam-Expasy. O índice GRAVY é utilizado para representar o valor de hidrofobicidade de um peptídeo. Ele é calculado a partir da soma dos valores de hidrofobicidade de todos os aminoácidos individuais e dividido pelo comprimento da sequência. Assim, o peptídeo P.SC2.N.366 apresentou um índice GRAVY de -2,593, indicando tendência a ser hidrofílico. Esta característica é desejada, uma vez que peptídeos solúveis em água são mais simples de manejar, principalmente em maiores escalas (GASTEIGER, Elisabeth et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. The proteomics protocols handbook, p. 571-607, 2005).[044]. Then, the GRAVY index of the peptide was determined using the ProtParam-Expasy tool. The GRAVY index is used to represent the hydrophobicity value of a peptide. It is calculated from the sum of the hydrophobicity values of all individual amino acids and divided by the length of the sequence. Thus, the peptide P.SC2.N.366 had a GRAVY index of -2.593, indicating a tendency to be hydrophilic. This feature is desired, since water-soluble peptides are simpler to handle, especially on larger scales (GASTEIGER, Elisabeth et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. The proteomics protocols handbook, p. 571-607, 2005).
[045]. Definida a sequência SEQ ID No. 1, o peptídeo P.SC2.N.366 foi sintetizado quimicamente. A síntese foi realizada em equipamento automatizado MultiPep RS (Intavis Bioanalytical Instruments), pela técnica de síntese ancorada em matriz sólida. Após a síntese, o peptídeo foi purificado com lavagens sucessivas com solvente éter terc- butil-metil. Em seguida foi congelado em freezer a -80°C e passou por um processo de liofilização em equipamento liofilizador Modulyod Freeze Dryer (ThermoFischer) até a solidificação. Por fim, o peptídeo foi ressuspendido em água ultrapura, a concentração da solução final foi determinada utilizando o kit Micro BCA Protein Assay (MERRIFIELD, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society, v. 85, n. 14, p. 2149-2154, 1963).[045]. Defined sequence SEQ ID No. 1, the peptide P.SC2.N.366 was chemically synthesized. The synthesis was performed in an automated equipment MultiPep RS (Intavis Bioanalytical Instruments), by the technique of synthesis anchored in solid matrix. After synthesis, the peptide was purified with successive washings with tert-butyl-methyl ether solvent. Then it was frozen in a freezer at -80°C and underwent a lyophilization process in a lyophilization equipment Modulyod Freeze Dryer (ThermoFischer) until solidification. Finally, the peptide was resuspended in ultrapure water, the concentration of the final solution was determined using the Micro BCA Protein Assay kit (MERRIFIELD, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society, v. 85, no. 14, pp. 2149-2154, 1963).
[046]. Uma vez preparada a solução concentrada do peptídeo P.SC2.N.366, ele foi testado como antígeno pela técnica de ELISA indireta para detecção de anticorpos específicos para SARS-CoV-2. Para isso, foram necessárias amostras biológicas provenientes de indivíduos infectados pelo vírus, e que tiveram resultado positivo para COVID-19 pelo teste RT-qPCR. A coleta e uso dos soros foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) n° 4.421.856. Se as amostras de indivíduos infectados reagirem fortemente no ensaio ELISA e as amostras de indivíduos não infectados não reagirem ou reagirem de maneira fraca, então o antígeno reage especificamente com anticorpos anti- SARS-CoV-2 e o ensaio consegue fazer a diferenciação entre os grupos infectados e não infectados.[046]. Once the concentrated solution of the P.SC2.N.366 peptide was prepared, it was tested as an antigen by the indirect ELISA technique for detection of specific antibodies to SARS-CoV-2. For this, biological samples were needed from individuals infected with the virus, and who had a positive result for COVID-19 by the RT-qPCR test. The collection and use of sera was approved by the Research Ethics Committee (CEP) No. 4,421,856. If samples from infected individuals react strongly in the ELISA assay and samples from uninfected individuals do not react or react weakly, then the antigen reacts specifically with anti-SARS-CoV-2 antibodies and the assay is able to differentiate between groups. infected and uninfected.
[047]. Contudo, ao realizar um teste ELISA, é necessário estabelecer as condições ótimas para a reação. Este processo de padronização de diluições ou concentrações das condições ótimas de trabalho foi feita primeiramente por testes in silico e depois realizadas em condições experimentais. Os parâmetros avaliados foram a massa de peptídeo por poço, concentração da solução de bloqueio, fator de diluição das amostras biológicas, fator de diluição da solução dos anticorpos secundários conjugados anti-human-IgM-HRP ou anti-human- IgG-Biotina ou anti-human-Ig-HRP, fator de diluição de proteína conjugada neutravidina com peroxidase (para o isotipo IgG), e por último o tempo para parada da reação (Tabela 2). Tabela 2. Parâmetros avaliadas na padronização do ensaio ELISA indireto.
[048]. O ensaio ELISA indireto se inicia com a diluição do peptídeo em tampão carbonato (0,05M, pH 9.6), mas não se restringindo a este. A concentração de peptídeo na solução diluída varia de 0,1 a 1,2 ng/μL. Em seguida, a solução é pipetada nos poços da microplaca de alta aderência (suporte sólido) de modo que a massa de peptídeo por poço varie de 10 a 120 ng. A microplaca permanece incubada a 4°C overnight, permitindo que o peptídeo se ligue e permaneça aderido à sua superfície. Os suportes sólidos incluem microplacas de alta afinidade, que podem ser de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno ou poliestireno, mas não se restringindo a estas.[048]. The indirect ELISA begins with the dilution of the peptide in carbonate buffer (0.05M, pH 9.6), but not limited to this. The peptide concentration in the diluted solution ranges from 0.1 to 1.2 ng/μL. Then, the solution is pipetted into the wells of the high adhesion microplate (solid support) so that the mass of peptide per well varies from 10 to 120 ng. The microplate remains incubated at 4°C overnight, allowing the peptide to bind and remain adhered to its surface. Solid supports include high-affinity microplates, which may be, but not limited to, nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene or polystyrene.
[049]. Posteriormente, são realizadas quatro lavagens dos poços com solução de lavagem 1x (PBS 100 mM, Tween 20 a 0,05%, pH 7.4). Adiciona-se solução de bloqueio de soro albumina bovina (BSA) variando de 1 a 5% em tampão PBS, pH 7.4, mas não se restringindo a estas concentrações. E são realizadas outras quatro a seis lavagens.[049]. Subsequently, the wells are washed four times with 1x wash solution (100 mM PBS, 0.05
[050]. Em seguida, amostras de fluido biológico (sangue, soro, plasma, saliva, urina ou lágrima) são adicionadas ao suporte sólido. Neste exemplo a amostra é soro. Estas amostras biológicas devem ser diluídas e as taxas de diluição variaram de 1:50 a 1:400. O diluente das amostras é o tampão de incubação composto de caseína em concentração entre 1,6 e 4,4% (m/v) em solução tampão fosfato-salina (PBS) pH 7.4, mas não se restringindo a este. As moléculas presentes nas amostras que não interagem especificamente com o antígeno imobilizado são removidas por seis lavagens.[050]. Then, samples of biological fluid (blood, serum, plasma, saliva, urine or tears) are added to the solid support. In this example the sample is serum. These biological samples must be diluted and dilution ratios ranged from 1:50 to 1:400. The sample diluent is the incubation buffer composed of casein at a concentration between 1.6 and 4.4% (m/v) in phosphate-saline buffer solution (PBS) pH 7.4, but not limited to this. Molecules present in the samples that do not specifically interact with the immobilized antigen are removed by six washes.
[051]. Em seguida, são adicionados soluções de anticorpos secundários, que tem por característica serem conjugados com isótopos radioativos, enzimas ou fluoróforos, mas não se restringindo a estes. Os anticorpos secundários variam de acordo com o anticorpo alvo do teste, e devem ser diluídos em tampão de incubação nas diluições 1:5000 a 1:25000. O poço é então lavado seis vezes com solução de lavagem.[051]. Then, solutions of secondary antibodies are added, which are characterized by being conjugated with radioactive isotopes, enzymes or fluorophores, but not restricted to these. Secondary antibodies vary according to the target antibody of the test, and must be diluted in incubation buffer at dilutions from 1:5000 to 1:25000. The well is then washed six times with wash solution.
[052]. Caso o anticorpo conjugado esteja ligado com biotina, é necessário adicionar uma molécula conjugada como uma enzima. Neste caso podem ser utilizadas Neutravidina, Estreptavidina e Avidina, os quais são diluídos na solução de incubação em um faixa de 1:5000 a 1:25000 e adicionados aos poços. Novamente o suporte sólido é lavado seis vezes.[052]. If the conjugated antibody is bound with biotin, it is necessary to add a conjugated molecule as an enzyme. In this case Neutravidin, Streptavidin and Avidin can be used, which are diluted in the incubation solution in a range of 1:5000 to 1:25000 and added to the wells. Again the solid support is washed six times.
[053]. Posteriormente é adicionada solução de revelação ao suporte sólido, como TMB e OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride), mas não se restringindo a estas. O tempo de incubação varia de 5 a 60 minutos, após este tempo a reação é interrompida pela adição de solução de parada (HCL 5M), mas não se restringindo a esta. O sinal emitido após a adição dos substratos enzimáticos pode ser colorimétrico, quimioluminescente ou fluorescente, e a quantificação deste sinal indica a presença ou não de anticorpos anti-SARS-CoV-2.[053]. Subsequently, developing solution is added to the solid support, such as TMB and OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride), but not limited to these. The incubation time varies from 5 to 60 minutes, after this time the reaction is stopped by the addition of stop solution (5M HCL), but not limited to this. The signal emitted after the addition of enzyme substrates can be colorimetric, chemiluminescent or fluorescent, and the quantification of this signal indicates the presence or absence of anti-SARS-CoV-2 antibodies.
[054]. O peptídeo P.SC2.N.366 foi testado para detecção de IgM e IgG isoladamente e também de Ig Total (IgM, IgA e IgG concomitantemente). O sinal obtido para os ensaios mostraram que um pool de soros composto por amostras de indivíduos infectados pelo SARS-CoV-2 reagiu fortemente no ensaio ELISA, enquanto que o pool composto por amostras de indivíduos não infectados reagiu não reagiu ou fracamente. Esta diferença foi observada para todos isotipos testados (Figura 1), e mais detalhes são descritos no exemplo 3.[054]. Peptide P.SC2.N.366 was tested for detection of IgM and IgG alone and also for Total Ig (IgM, IgA and IgG concomitantly). The signal obtained for the assays showed that a pool of sera composed of samples from individuals infected by SARS-CoV-2 reacted strongly in the ELISA assay, while the pool composed of samples from uninfected individuals reacted either unreacted or weakly. This difference was observed for all tested isotypes (Figure 1), and more details are described in example 3.
[055]. Estes resultados indicam a imunorreatividade do peptídeo frente aos anticorpos IgM, IgG e Ig Total anti-SARS-CoV-2 presentes no soro de pacientes infectados, e confirma a possibilidade dele ser utilizado em imunoensaios.[055]. These results indicate the immunoreactivity of the peptide against IgM, IgG and Total Ig anti-SARS-CoV-2 antibodies present in the sera of infected patients, and confirm the possibility of its use in immunoassays.
[056]. Para a validação do antígeno para detecção de anticorpos IgM foi utilizado um painel de 62 soros (12 soros positivos e 50 negativos). Já para a detecção de anticorpos IgG foi utilizado um painel com 99 soros (49 positivos e 50 negativos). A diferença na quantidade de amostras biológicas entre os dois isotipos de imunoglobulinas foi dado pela disponibilidade de amostras positivas para IgG ser maior em relação às amostras com infecção recente (IgM positivas). Estes painéis de soros foram avaliados pelo ensaio ELISA indireto utilizando o peptídeo P.SC2.N.366, utilizando o protocolo descrito no exemplo 2. Dentre os soros positivos existem casos de COVID-19 sintomáticos e assintomáticos.[056]. For the validation of the antigen for the detection of IgM antibodies, a panel of 62 sera (12 positive and 50 negative sera) was used. For the detection of IgG antibodies, a panel with 99 sera (49 positive and 50 negative) was used. The difference in the amount of biological samples between the two immunoglobulin isotypes was given by the availability of samples positive for IgG being greater in relation to samples with recent infection (IgM positive). These sera panels were evaluated by the indirect ELISA assay using the P.SC2.N.366 peptide, using the protocol described in example 2. Among the positive sera, there are both symptomatic and asymptomatic cases of COVID-19.
[057]. A partir dos resultados obtidos para os testes de detecção de IgM e IgG, foram determinados os índices AUC (area under the ROC curve), a sensibilidade, a especificidade, o índice J de Youden e o valor do corte da reação entre positivos e negativos (cutoff) (ver Tabela 3).[057]. From the results obtained for the IgM and IgG detection tests, the AUC indexes (area under the ROC curve), sensitivity, specificity, Youden's J index and the cut-off value of the reaction between positive and negative were determined. (cutoff) (see Table 3).
[058]. O ensaio para IgM apresentou sensibilidade de 91,67% e especificidade de 98,00%, e permitiu a diferenciação clara entre os grupos de amostras positivas e negativas (Figuras 2 e 3). O mesmo foi observado no ensaio para IgG (Figuras 4 e 5), que também apresentou sensibilidade de 100,00% e especificidade de 92,00%. Assim, demonstra- se a potencialidade do antígeno P.SC2.N.366 de detectar a presença de anticorpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 através de um ensaio sorológico, tanto para casos sintomáticos quanto assintomáticos da doença. Tabela 3. Parâmetros do uso do peptídeo P.SC2.N.366 para diagnóstico de COVID-19.
[059]. Para a determinação do índice avidez, um segundo grupo de 38 soros positivos foram testados pelo ensaio ELISA de avidez. Este ensaio é similar ao ensaio descrito no exemplo 2 para detecção de anticorpos IgG acrescido de uma etapa posterior à adição da amostra biológica diluída. Esta etapa adicional consiste na adição de solução de ureia 6M, e incubação de 10 minutos. Os anticorpos de baixa avidez serão desligados e removidos por seis lavagens com solução de lavagem (descrito no exemplo 2), enquanto que os anticorpos de alta avidez permanecerão ligados.[059]. For the determination of the avidity index, a second group of 38 positive sera were tested by the avidity ELISA assay. This assay is similar to the assay described in example 2 for detecting IgG antibodies plus a step after the addition of the diluted biological sample. This additional step consists of the addition of 6M urea solution, and incubation for 10 minutes. Low avidity antibodies will be turned off and removed by six washes with wash solution (described in example 2), while high avidity antibodies will remain bound.
[060]. O índice de avidez é obtido ao dividir-se o valor da absorbância do ensaio com a adição da ureia, pelo valor da absorbância sem a adição de ureia para cada amostra biológica individual. Em seguida, é calculada a média para o número total de amostras (equação 1).Equação 1:
[061]. Valores de índice de avidez acima de 60% são considerados alta avidez, entre 50 e 60% média avidez e abaixo de 50% baixa avidez. O peptídeo P.SC2.N.366 apresentou índice avidez de 64%, portanto é considerado de alta avidez. Ou seja, a força de ligação entre o peptídeo e os anticorpos anti-SARS-CoV-2 é alta. Desta forma, o peptídeo tem potencial para ser utilizado em análises de reações cruzadas, estudos epidemiológicos e até para controle de programas de vacinação.[061]. Values of avidity index above 60% are considered high avidity, between 50 and 60% medium avidity and below 50% low avidity. The peptide P.SC2.N.366 had an avidity index of 64%, therefore it is considered high avidity. That is, the binding strength between the peptide and anti-SARS-CoV-2 antibodies is high. In this way, the peptide has the potential to be used in cross-reaction analyses, epidemiological studies and even to control vaccination programs.
[062]. O Kit de diagnóstico (Figura 6) é caracterizado por conter todas as soluções necessárias para realizar do teste de COVID-19, como descrito no exemplo 2. Além de conter uma microplaca de 96 poços, previamente sensibilizada com o novo antígeno P.SC2.N.366, e bloqueada com solução de bloqueio.[062]. The Diagnostic Kit (Figure 6) is characterized by containing all the solutions necessary to perform the COVID-19 test, as described in example 2. In addition to containing a 96-well microplate, previously sensitized with the new P.SC2 antigen. N.366, and blocked with blocking solution.
[063]. As soluções incluídas no kit são: 1. Solução de lavagem (PBS 100 mM, Tween-20 a 0,05%, pH 7.4) acondicionada em frasco plástico de 50 mL; 2. Tampão de incubação diluente (PBS 100 mM, caseína entre 1,6 e 4,4% (m/v), pH 7.4), acondicionada em frasco plástico de 50 mL; 3. Solução de anticorpo secundário Anti-IgM (diluído 1:5000 a 1:25000) , acondicionada em frasco plástico de 2 mL; 4. Solução de anticorpo secundário Anti-IgG (diluído 1:5000 a 1:25000), acondicionada em frasco plástico de 2 mL; 5. Solução de conjugado neutravidina-peroxidase (diluído 1:5000 a 1:25000), acondicionada em frasco plástico de 2 mL; 6. Solução substrato de revelação: solução de substrato cromogênico TMB, acondicionada em frasco plástico escuro de 50 mL; 7. Solução de parada da reação: solução aquosa composta de HCL 5 M, acondicionada em frasco plástico escuro de 50 mL. 8. Controles de soros positivo e negativo, acondicionados em microtubos plásticos de 2 mL;[063]. The solutions included in the kit are: 1. Washing solution (100 mM PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) packed in a 50 mL plastic bottle; 2. Diluent incubation buffer (100 mM PBS, casein between 1.6 and 4.4% (m/v), pH 7.4), packed in a 50 mL plastic bottle; 3. Anti-IgM secondary antibody solution (diluted 1:5000 to 1:25000), packaged in a 2 ml plastic bottle; 4. Anti-IgG secondary antibody solution (diluted 1:5000 to 1:25000), packed in a 2 mL plastic bottle; 5. Neutravidin-peroxidase conjugate solution (diluted from 1:5000 to 1:25000), packed in a 2 mL plastic bottle; 6. Development substrate solution: TMB chromogenic substrate solution, packed in a 50 mL dark plastic bottle; 7. Reaction stop solution: aqueous solution composed of 5 M HCL, packed in a 50 mL dark plastic bottle. 8. Positive and negative serum controls, packed in 2 mL plastic microtubes;
[064]. Uma caixa é utilizada paga guardar os reagentes, podendo ser de material plástico, papel ou uma combinação. Os frascos de soluções e a microplaca sensibilizada são acondicionados de forma a ficarem fixos no interior da embalagem. O Kit deve ser mantido a uma temperatura de 2 a 8 °C até o momento do uso.[064]. A box is used to store the reagents, which can be plastic, paper or a combination. The vials of solutions and the sensitized microplate are packed so that they are fixed inside the package. The Kit must be kept at a temperature of 2 to 8 °C until use.
[65]. O Kit necessário é útil pela praticidade na realização do ensaio, permitindo fazer uma testagem rápida, em ambiente de baixa infraestrutura e por uma equipe com baixo treinamento. Desta maneira, contribui para a testagem em massa, essencial no controle de epidemias.[65]. The necessary Kit is useful for the practicality in carrying out the test, allowing for a quick test, in an environment with low infrastructure and by a team with little training. In this way, it contributes to mass testing, essential in the control of epidemics.
[065]. Figura 1 - Valores de absorbância obtidos na padronização do ensaio ELISA indireto utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 como antígeno. São mostrados os valores obtidos para um pool de soros positivos e negativos, bem como a diferença de absorbância e a proporção entre eles. Os valores correspondem aos testes de IgM, IgG e Ig Total.[065]. Figure 1 - Absorbance values obtained in the standardization of the indirect ELISA assay using the peptide P.SC2.N.366 as antigen. The values obtained for a pool of positive and negative sera are shown, as well as the difference in absorbance and the proportion between them. The values correspond to the IgM, IgG and Total Ig tests.
[066]. Figura 2 - Receiver operator characteristic curve (CURVA ROC) do teste ELISA utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 para imunodetecção de anticorpos IgM anti-SARS-CoV-2. O AUC de 0,925 é indicador de excelentes resultados na diferenciação entre soros positivos e negativos.[066]. Figure 2 - Receiver operator characteristic curve (ROC CURVE) of the ELISA test using P.SC2.N.366 peptide for immunodetection of anti-SARS-CoV-2 IgM antibodies. The AUC of 0.925 is an indicator of excellent results in differentiating between positive and negative sera.
[067]. Figura 3 - Distribuição da reatividade de indivíduos positivos e negativos do teste ELISA indireto utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 para imunodetecção de anticorpos IgM anti-SARS-CoV-2. Foram utilizados 12 soros positivos e 50 soros negativos.[067]. Figure 3 - Distribution of reactivity of positive and negative individuals in the indirect ELISA test using the P.SC2.N.366 peptide for immunodetection of anti-SARS-CoV-2 IgM antibodies. Twelve positive and 50 negative sera were used.
[068]. Figura 4 - Receiver operator characteristic curve (CURVA ROC) do teste ELISA utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 para imunodetecção de anticorpos IgG anti-SARS-CoV-2. O AUC de 0,983 indica que o peptídeo usado como antígeno é também capaz de detectar anticorpos IgG.[068]. Figure 4 - Receiver operator characteristic curve (ROC CURVE) of the ELISA test using the P.SC2.N.366 peptide for immunodetection of IgG anti-SARS-CoV-2 antibodies. The AUC of 0.983 indicates that the peptide used as an antigen is also capable of detecting IgG antibodies.
[069]. Figura 5 - Distribuição da reatividade de indivíduos positivos e negativos do teste ELISA indireto utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 para imunodetecção de anticorpos IgG anti-SARS-CoV-2. Foram utilizados 49 soros positivos e 50 soros negativos.[069]. Figure 5 - Distribution of reactivity of positive and negative individuals in the indirect ELISA test using the P.SC2.N.366 peptide for immunodetection of IgG anti-SARS-CoV-2 antibodies. 49 positive sera and 50 negative sera were used.
[070]. Figura 6 - Componentes do kit ELISA para diagnóstico de COVID-19 utilizando o peptídeo P.SC2.N.366 como antígeno. Os itens mostrados são: caixa para armazenar os reagentes, microplaca de 96 poços revestida com o antígeno P.SC2.N.366, solução de lavagem, tampão de incubação, soluções de anticorpos secundários (anti-IgM, anti-IgG e marcador-HRP), solução substrato de revelação, solução de parada da reação. O kit contém também controles positivo e negativo é dado na figura.[070]. Figure 6 - Components of the ELISA kit for the diagnosis of COVID-19 using the peptide P.SC2.N.366 as an antigen. Items shown are: box to store reagents, 96-well microplate coated with P.SC2.N.366 antigen, wash solution, incubation buffer, secondary antibody solutions (anti-IgM, anti-IgG and marker- HRP), developing substrate solution, reaction stop solution. The kit also contains positive and negative controls is given in the figure.
[071]. Anticorpos ou imunoglobulinas (Ig), são proteínas presentes no sangue que atuam como mediadores da imunidade humoral específica. As moléculas de anticorpos interagem de modo específico com um antígeno, e mediam diversos mecanismos efetores que servem para eliminar tais antígenos.[071]. Antibodies, or immunoglobulins (Ig), are proteins present in the blood that act as mediators of specific humoral immunity. Antibody molecules specifically interact with an antigen and mediate several effector mechanisms that serve to eliminate such antigens.
[072]. Um antígeno é uma molécula capaz de estimular uma resposta imune. Cada antígeno tem características de superfície distintas, ou epítopos, resultando em respostas específicas. Epítopo é uma pequena porção desta molécula onde efetivamente ocorre a interação com os anticorpos.[072]. An antigen is a molecule capable of stimulating an immune response. Each antigen has distinct surface features, or epitopes, resulting in specific responses. An epitope is a small portion of this molecule where interaction with antibodies actually takes place.
[073]. Durante a infecção do hospedeiro por um patógeno, anticorpos específicos são produzidos. A presença destes anticorpos específicos pode se utilizada para diagnosticar indiretamente a infecção através de ensaios sorológicos (ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. H.; PILLAI, S. Cellular and Molecular Immunology. ed. 9. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2017).[073]. During infection of the host by a pathogen, specific antibodies are produced. The presence of these specific antibodies can be used to indirectly diagnose the infection through serological assays (ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. H.; PILLAI, S. Cellular and Molecular Immunology. ed. 9. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2017).
[74] . Sensibilidade se refere à capacidade do teste de fornecer resultado positivo quando o indivíduo realmente for portador do vírus.[74] . Sensitivity refers to the ability of the test to provide a positive result when the individual actually has the virus.
[75] . Especificidade se refere à capacidade do teste fornecer resultado negativo quando o indivíduo realmente for negativo.[75] . Specificity refers to the ability of the test to give a negative result when the individual is actually negative.
[76] . O índice J de Yonden é uma maneira de sumarizar o desempenho de um teste de diagnóstico, sendo calculado pela soma de sensibilidade e especificidade menos uma unidade.[76] . The Yonden J index is a way of summarizing the performance of a diagnostic test, being calculated by adding sensitivity and specificity minus one unit.
[77] . O cutoff é o valor a partir do qual o resultado é considerado positivo.[77] . The cutoff is the value from which the result is considered positive.
[78] . O índice AUC demostra a capacidade do peptídeo de diferenciar indivíduos infectados de não infectados.[78] . The AUC index demonstrates the peptide's ability to differentiate infected from uninfected individuals.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03B | Publication of an application: publication anticipated [chapter 3.2 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 14/04/2021, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |
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| B22L | Other matters related to patents and certificates of addition of invention: notification of licence offer (art 64 par 1 of lpi) |
Free format text: CONDICOES CONTRATUAIS: 1) ROYALTIES: 5% (CINCO POR CENTO) DO PRECO DE VENDA, LIVRE DE IMPOSTOS; 2) PRAZO: ATE O TERMINO DE VIGENCIA DA PATENTE, EM 14/04/2041; 3) CONDICOES DE PAGAMENTO: ANUAL EM FUNCAO DAS VENDAS APURADAS NO PERIODO; 4) DISPONIBILIDADE DE ?KNOW-HOW?: SIM; 5) ASSISTENCIA TECNICA: NAO. |
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| B22L | Other matters related to patents and certificates of addition of invention: notification of licence offer (art 64 par 1 of lpi) |
Free format text: CONDICOES CONTRATUAIS: 1) ROYALTIES: 5% (CINCO POR CENTO) DO PRECO DE VENDA, LIVRE DE IMPOSTOS; 2) PRAZO: ATE O TERMINO DE VIGENCIA DA PATENTE, EM 14/04/2041; 3) CONDICOES DE PAGAMENTO: ANUAL EM FUNCAO DAS VENDAS APURADAS NO PERIODO; 4) DISPONIBILIDADE DE ?KNOW-HOW?: SIM; 5) ASSISTENCIA TECNICA: NAO. - OBS: CONSULTA A CARTA PATENTE PODERA SER FEITA ATRAVES DO ENDERECO ELETRONICO WWW.INPI.GOV.BR = NO ACESSO RAPIDO = BUSCA WEB = PATENTE. PARA ACESSAR, CADASTRE-SE NO PORTAL DO INPI E USE LOGIN E SENHA. |
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| B22L | Other matters related to patents and certificates of addition of invention: notification of licence offer (art 64 par 1 of lpi) |
Free format text: CONDICOES CONTRATUAIS: 1) ROYALTIES: 5% (CINCO POR CENTO) DO PRECO DE VENDA, LIVRE DE IMPOSTOS; 2) PRAZO: ATE O TERMINO DE VIGENCIA DA PATENTE, EM 14/04/2041; 3) CONDICOES DE PAGAMENTO: ANUAL EM FUNCAO DAS VENDAS APURADAS NO PERIODO; 4) DISPONIBILIDADE DE KNOW-HOW: SIM; 5) ASSISTENCIA TECNICA: NAO. --- OBS: CONSULTA A CARTA PATENTE PODERA SER FEITA ATRAVES DO ENDERECO ELETRONICO WWW.INPI.GOV.BR - NO ACESSO RAPIDO = BUSCA DE PROCESSOS = FACA LOGIN COM SENHA OU TECLE CONTINUAR = PATENTE = DIGITE O NUMERO DO PROCESSO = PESQUISAR. PARA ACESSAR, CADASTRE-SE NO PORTAL DO INPI. |
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| B22L | Other matters related to patents and certificates of addition of invention: notification of licence offer (art 64 par 1 of lpi) |
Free format text: CONDICOES CONTRATUAIS: 1) ROYALTIES: 5% (CINCO POR CENTO) DO PRECO DE VENDA, LIVRE DE IMPOSTOS; 2) PRAZO: ATE O TERMINO DE VIGENCIA DA PATENTE, EM 14/04/2041; 3) CONDICOES DE PAGAMENTO: ANUAL EM FUNCAO DAS VENDAS APURADAS NO PERIODO; 4) DISPONIBILIDADE DE KNOW-HOW: SIM; 5) ASSISTENCIA TECNICA: NAO. --- OBS: CONSULTA A CARTA PATENTE PODERA SER FEITA ATRAVES DO ENDERECO ELETRONICO WWW.INPI.GOV.BR - NO ACESSO RAPIDO = BUSCA DE PROCESSOS = FACA LOGIN COM SENHA OU TECLE CONTINUAR = PATENTE = DIGITE O NUMERO DO PROCESSO = PESQUISAR. PARA ACESSAR, CADASTRE-SE NO PORTAL DO INPI. |