BR102021006641A2

BR102021006641A2 - RAPID LATEX AGGLUTINATION TEST FOR ROTAVIRUS DIAGNOSIS

Info

Publication number: BR102021006641A2
Application number: BR102021006641-5A
Authority: BR
Inventors: Sabrina Tainah Da Cruz Silva Bezerra; Maria Izabel Florindo Guedes; Maria Fátima Da Silva Teixeira; Helen Paula Silva Da Costa
Original assignee: Fundação Universidade Estadual Do Ceará - Funece
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-10-11

Abstract

Os testes de aglutinação em látex são empregados em laboratórios de análises clínicas e têm a vantagem de serem executados com facilidade e rapidez na rotina da medicina humana podendo ser utilizados como método de triagem bem como serem aplicados em estudos epidemiológicos. Através da aglutinação de um reagente de látex sensibilizado com um anticorpo anti-rotavírus obtido a partir de antígeno vacinal, a presente invenção disponibiliza um processo e uma ferramenta mais simples e rápida para elaboração de teste diagnóstico para rotavirose.Latex agglutination tests are used in clinical analysis laboratories and have the advantage of being easily and quickly performed in the routine of human medicine and can be used as a screening method as well as being applied in epidemiological studies. Through the agglutination of a latex reagent sensitized with an anti-rotavirus antibody obtained from vaccine antigen, the present invention provides a process and a simpler and faster tool for the elaboration of a diagnostic test for rotavirus disease.

Description

RAPID LATEX AGGLUTINATION TEST FOR ROTAVIRUS DIAGNOSIS

Field of Invention

[1] A presente invenção se situa no campo de processos para fins de diagnose e descreve um reagente de látex sensibilizado com um anticorpo anti-rotavírus.[1] The present invention is in the field of processes for diagnostic purposes and describes a latex reagent sensitized with an anti-rotavirus antibody.

Background of the Invention

[2] Os testes de aglutinação em látex são amplamente empregados em laboratórios de análises clínicas e têm a vantagem de serem executados com facilidade e rapidez na rotina da medicina humana podendo ser utilizados como método de triagem bem como serem aplicados em estudos epidemiológicos. Suas aplicações incluem a detecção de várias doenças infecciosas, além de serem usados na detecção e identificação de muitas outras substâncias como hormônios, drogas, proteínas séricas.[2] Latex agglutination tests are widely used in clinical analysis laboratories and have the advantage of being easily and quickly performed in the routine of human medicine and can be used as a screening method as well as being applied in epidemiological studies. Their applications include the detection of various infectious diseases, in addition to being used in the detection and identification of many other substances such as hormones, drugs, serum proteins.

[3] As aglutinações em látex envolvem a agregação do látex, mediada pela reação específica entre antígeno e anticorpo, onde um dos dois é imobilizado na superfície das partículas de poliestireno. Há testes de aglutinação em látex disponíveis comercialmente para diagnóstico de rotavirose em humanos, estes são baseados na detecção do rotavírus por anticorpos IgG, tanto policlonais quanto monoclonais, ligados à partículas de látex. Entretanto, a utilização de imunoensaios produzidos para humanos em animais é desaconselhada devido a possibilidade de obtenção de resultados inconclusivos devido as características das fezes inerentes as espécies envolvidas.[3] Latex agglutinations involve latex aggregation, mediated by a specific reaction between antigen and antibody, where one of the two is immobilized on the surface of polystyrene particles. There are commercially available latex agglutination tests for the diagnosis of rotavirus disease in humans, these are based on the detection of rotavirus by IgG antibodies, both polyclonal and monoclonal, linked to latex particles. However, the use of immunoassays produced for humans in animals is not recommended due to the possibility of obtaining inconclusive results due to the characteristics of the feces inherent to the species involved.

[4] A patente JP2000121642 apresenta uma solução semelhante, mas difere desta pelo processo de obtenção apresentado para o antígeno viral, muito menos prático e rápido, posto que necessita de mais tempo para desenvolvimento e cultivo dos vírus.[4] Patent JP2000121642 presents a similar solution, but it differs from this one due to the process for obtaining the viral antigen, which is much less practical and fast, since it requires more time for the development and cultivation of the viruses.

[5] A presente invenção visa disponibilizar uma ferramenta mais simples e rápida para o diagnóstico de rotavirose.[5] The present invention aims to provide a simpler and faster tool for diagnosing rotavirus disease.

Detailed Description of the Invention

[6] Está sendo detalhada nesta área uma modalidade da invenção, dentre inúmeras outras possíveis.[6] A modality of the invention is being detailed in this area, among many other possible ones.

[7] Foi utilizada a quantidade de 1 mL de inóculo diluído ao dobro usando vacina e adjuvante incompleto de Freund. Essas emulsões foram agitadas até apresentarem um aspecto homogêneo, quando uma gota desta era colocada sobre água destilada e havia uma dispersão completa, o que caracteriza a homogeneidade da suspensão, foi considerada adequada para aplicação nos animais.[7] The amount of 1 ml of inoculum diluted twice using vaccine and incomplete Freund's adjuvant was used. These emulsions were stirred until they presented a homogeneous appearance, when a drop was placed on distilled water and there was complete dispersion, which characterizes the homogeneity of the suspension, which was considered suitable for application in the animals.

[8] Os animais foram contidos fisicamente e abordados de forma individual. Foi então realizada a injeção intradérmica no dorso, em uma área previamente tricotomizada e desinfetada. Fez-se 4 aplicações de aproximadamente 0,2 mL da mistura da vacina com o adjuvante por ponto de aplicação, totalizando de 0,8 mL por animal. Foram realizadas um total de duas aplicações, intervaladas de 21 dias.[8] The animals were physically restrained and approached individually. An intradermal injection was then performed on the back, in an area previously shaved and disinfected. There were 4 applications of approximately 0.2 mL of the vaccine mixture with the adjuvant per point of application, totaling 0.8 mL per animal. A total of two applications were performed, 21 days apart.

[9] As amostras de soro coletadas das coelhas foram analisadas em laboratório de patologia clínica para avaliação dos níveis de globulinas de cada animal após a primeira e após a segunda inoculação.[9] The serum samples collected from the rabbits were analyzed in a clinical pathology laboratory to assess the levels of globulins in each animal after the first and after the second inoculation.

[10] Foi realizado IDGA após a primeira e após a segunda inoculação das coelhas. Neste teste foi utilizada a vacina como antígeno na quantidade de 10 μL e o soro a ser testado das coelhas foi usado na quantidade de 30 μL por animal.[10] IDGA was performed after the first and after the second inoculation of the rabbits. In this test, the vaccine was used as antigen in the amount of 10 μL and the serum to be tested from the rabbits was used in the amount of 30 μL per animal.

[11] Foi realizada a precipitação das imunoglobulinas em sulfato de amônio então o precipitado foi colocado para a diálise. Para a precipitação foram misturados 2 volumes de soro em 2 volumes de solução salina. Essa solução foi resfriada no gelo e após foi adicionado 4 mL de solução saturada de sulfato de amônio gota a gota, passando pelo vórtex bem suavemente, evitando a formação de espuma. Quando a solução se mostrou com um aspecto leitoso, era um indicativo que havia precipitado. Foi então realizada a centrifugação das amostras a 3.000 rpm durante 20 minutos, após isso retirou-se o sobrenadante e foi adicionado 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio ao precipitado. Foi centrifugado a 3.000 rpm por 15 minutos, resfriado em gelo por 5 minutos e centrifugado por mais 15 minutos, este procedimento é uma lavagem, foram realizadas 3 lavagens para só então colocar o precipitado para a diálise. Esta foi realizada em solução salina tamponada pH 7,4. O Becker onde ocorreu a diálise foi mantido sob refrigeração e a troca da solução salina tamponada ocorreu a cada 24 horas, durante 3 dias. A amostra dialisada foi aliquotada em microtubos e armazenada a -20 °C para posterior purificação.[11] Precipitation of immunoglobulins in ammonium sulfate was performed, then the precipitate was placed for dialysis. For precipitation, 2 volumes of serum were mixed with 2 volumes of saline solution. This solution was cooled on ice and then 4 mL of saturated ammonium sulfate solution was added drop by drop, passing through the vortex very gently, avoiding the formation of foam. When the solution had a milky appearance, it was an indication that it had precipitated. Samples were then centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes, after which the supernatant was removed and 2 mL of saturated ammonium sulfate solution was added to the precipitate. It was centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes, cooled on ice for 5 minutes and centrifuged for another 15 minutes. This procedure is a wash, 3 washes were performed before placing the precipitate for dialysis. This was performed in buffered saline solution pH 7.4. The Becker where the dialysis took place was kept under refrigeration and the buffered saline solution was changed every 24 hours for 3 days. The dialyzed sample was aliquoted into microtubes and stored at -20 °C for further purification.

[12] As amostras de soro dialisadas foram submetidas a cromatografia de afinidade em coluna Hitrap® Protein G HP (1 mL, GE) a fim de isolar as imunoglobulinas G. Para isso, a coluna foi previamente equilibrada com 5 volumes da coluna (5CV) do mesmo tampão de solubilização da amostra (tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4) e, em seguida, a amostra foi aplicada à coluna. Após à injeção da amostra de soro, a coluna foi lavada com 10CV com o tampão de equilíbrio para remover toda a fração não ligante à proteína G, que por sua vez foi descartada. A fração ligante, ou seja, as IgGs foram eluídas através da alteração do pH do sistema, após injeção do tampão glicina 0,1 M, pH 2,6 (7CV). A fração ligante foi coletada em frações de 1 mL em microtubos já contendo 200 μL de tampão Tris-HCl 1,0 M, pH 9,0. Essa solução foi usada para neutralizar o pH da solução de eluição, assim preservando as características das proteínas isoladas. Todas as corridas cromatográficas foram desenvolvidas a um fluxo de 1 mL/min e acompanhadas à absorbância de 280 nm.[12] The dialyzed serum samples were subjected to affinity chromatography on a Hitrap® Protein G HP column (1 mL, GE) in order to isolate the G immunoglobulins. For this, the column was previously equilibrated with 5 column volumes (5CV ) of the same sample solubilization buffer (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4) and then the sample was applied to the column. After injection of the serum sample, the column was washed with 10CV with the equilibration buffer to remove all non-G protein binding fraction, which in turn was discarded. The binding fraction, that is, the IgGs, were eluted by changing the pH of the system, after injection of 0.1 M glycine buffer, pH 2.6 (7CV). The binding fraction was collected in 1 mL fractions in microtubes already containing 200 μL of 1.0 M Tris-HCl buffer, pH 9.0. This solution was used to neutralize the pH of the elution solution, thus preserving the characteristics of the isolated proteins. All chromatographic runs were performed at a flow rate of 1 mL/min and monitored at an absorbance of 280 nm.

[13] A verificação da concentração das imunoglobulinas presentes nas amostras após a passagem pela cromatografia por afinidade foi realizada através do método Bradford. Para isso, em uma placa para Elisa de 96 poços de fundo chato foi adicionado 5μL da amostra purificada, e 250 μL do reagente Bradforf para cada amostra, em seguida foi realizada a leitura a 595 nm.[13] The verification of the concentration of immunoglobulins present in the samples after passage through affinity chromatography was performed using the Bradford method. For this, 5μL of the purified sample was added to a flat-bottomed 96-well Elisa plate, and 250 μL of Bradforf reagent for each sample, then the reading was performed at 595 nm.

[14] A determinação da especificidade da imunoglobulina ao rotavírus por dot-blot (DB). Este foi realizado com uma membrana de nitrocelulose (MN) que foi dividida em partes de 2 x 2 cm, e disposta em recipiente de plástico de polipropileno de 10 mL. Aplicou-se em cada membrana 10 μL das soluções de IgG obtidas anteriormente, esperou-se secar e então foi realizado o bloqueio da MN em solução de leite desnatado a 4% em tampão salina fosfato (PBS) overnight. No dia seguinte o leite foi retirado e foi então colocado 10 μL de vacina em cada MN, incubando-se dessa forma por 30 minutos. Em seguida aplicou-se 10 μL das soluções de IgG em suas respectivas MN e incubou-se por mais 30 minutos. Após este processo foram realizadas 3 lavagens com PBS mais tween 20 a 0,5% (PBS-T) intervaladas de 5 minutos, só então foi adicionado nas MN o conjugado Anti-IgG de coelho com peroxidase, que foi incubado por 30 minutos. Após esta incubação foram realizadas mais 3 lavagens com PBST intervaladas de 5 minutos. Por fim as MN foram incubadas em uma solução de 0,01g DAB (3,3'-Diaminobenzidine) em 30 mL de PBS, 100 μL de peróxido de hidrogênio ao abrigo da luz, por 30 minutos. Na leitura foram considerados positivas todas aquelas soluções de IgG que desenvolveram uma reação formando um halo nos seus respectivos locais de aplicação.[14] Determination of immunoglobulin specificity to rotavirus by dot-blot (DB). This was performed with a nitrocellulose (MN) membrane that was divided into 2 x 2 cm pieces and placed in a 10 mL polypropylene plastic container. 10 μL of the previously obtained IgG solutions were applied to each membrane, it was allowed to dry and then the MN was blocked in a 4% skimmed milk solution in phosphate saline buffer (PBS) overnight. The next day, the milk was removed and 10 μL of vaccine was then placed in each MN, incubating in this way for 30 minutes. Then, 10 μL of the IgG solutions were applied to their respective MN and incubated for another 30 minutes. After this process, 3 washes were performed with PBS plus 0.5% tween 20 (PBS-T) at intervals of 5 minutes, only then was the rabbit Anti-IgG conjugate with peroxidase added to the MN, which was incubated for 30 minutes. After this incubation, 3 more washes with PBST were carried out at intervals of 5 minutes. Finally, the MN were incubated in a solution of 0.01g DAB (3,3'-Diaminobenzidine) in 30 mL of PBS, 100 μL of hydrogen peroxide, protected from light, for 30 minutes. In the reading, all those IgG solutions that developed a reaction forming a halo in their respective application sites were considered positive.

[15] A ligação da IgG ao látex foi realizada da seguinte forma: A solução purificada de IgG anti-RV policlonal obtida das coelhas foi ligada covalentemente ao carboxil-látex 4% (% p/v), 3μM (Sigma, USA) utilizando o cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) (Sigma, EUA). Primeiramente, foi diluído 4,1 g do carboxil-látex em 1,0 mL de PBS pH 7,4, obtendo uma concentração das partículas de poliestireno de 1%. Posteriormente, essa solução foi diluída em 10,0 mL de PBS pH 7,4, homogeneizada e centrifugada a 10.000 g por 15 minutos a 4°C, descartando o sobrenadante lentamente. Repetiu-se essa etapa e depois as esferas foram ressuspensas em 5,0 mL de PBS pH 7,4. Adicionou-se 0,644 mL da solução de EDC, gotejando em agitação lentamente e incubando por 20 minutos sob agitação constante. Posteriormente, as esferas foram lavadas com PBS pH 7,4 e centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos a 4°C. Por fim, foi adicionada a solução de IgG obtida de cada coelha separadamente em microtubos (10 mL da A, 1,5 ml da B, 3,5 mL da C e 3,75mL da D) sendo 1 mL de solução de IgG para 1,0 mL do carboxi-látex, e a suspensão foi incubada por 3 horas sob agitação constante a temperatura ambiente. Para finalizar, essa reação foi lavada com PBS pH 7,4, centrifugando 2 vezes a 10.000 g por 15 minutos a 4°C. Para bloqueio, foram adicionados um total de 10 mL de etanolamina 1M pH 8,0 (Sigma, EUA), como as soluções de IgGs das coelhas foram distribuídas em tubos microtubos então o volume de 10 mL de etanolamina foi dividido pelo número total de tubos que foi 17, então adicionou-se 600 μL de etanolamina por microtubo, e, após a incubação overnight, foram realizadas três lavagens com PBS pH 7,4 com centrifugações a 10.000 g por 15 minutos a 4°C. Obtendo-se dessa forma o látex conjugado com IgG policlonal anti-RV.[15] The binding of IgG to the latex was performed as follows: The purified solution of polyclonal anti-RV IgG obtained from rabbits was covalently bound to carboxyl-latex 4% (% w/v), 3μM (Sigma, USA) using 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) (Sigma, USA). First, 4.1 g of carboxyl-latex was diluted in 1.0 mL of PBS pH 7.4, obtaining a concentration of 1% of the polystyrene particles. Subsequently, this solution was diluted in 10.0 mL of PBS pH 7.4, homogenized and centrifuged at 10,000 g for 15 minutes at 4°C, discarding the supernatant slowly. This step was repeated and then the beads were resuspended in 5.0 mL of PBS pH 7.4. 0.644 mL of the EDC solution was added, dripping while slowly stirring and incubating for 20 minutes under constant stirring. Subsequently, the spheres were washed with PBS pH 7.4 and centrifuged at 10,000 g for 5 minutes at 4°C. Finally, the IgG solution obtained from each rabbit separately in microtubes (10 mL of A, 1.5 mL of B, 3.5 mL of C and 3.75 mL of D) was added, with 1 mL of IgG solution for 1.0 mL of carboxy-latex, and the suspension was incubated for 3 hours under constant agitation at room temperature. Finally, this reaction was washed with PBS pH 7.4, centrifuging twice at 10,000 g for 15 minutes at 4°C. For blocking, a total of 10 mL of 1M ethanolamine pH 8.0 (Sigma, USA) was added, as the rabbit IgG solutions were distributed in microtube tubes so the volume of 10 mL of ethanolamine was divided by the total number of tubes which was 17, then 600 μL of ethanolamine was added per microtube, and, after overnight incubation, three washes were performed with PBS pH 7.4 with centrifugations at 10,000 g for 15 minutes at 4°C. Thus obtaining the latex conjugated with anti-RV polyclonal IgG.

[16] Este teste se baseou em uma reação imunológica de aglutinação entre a suspensão fecal contendo o rotavirus e a IgG anti-RV ligada de forma covalente à superfície de partículas de látex. A suspensão fecal consistiu na adição de 3,0 mL de solução tampão de Tris/Cálcio (100mM Tris; 1,5mM CaCl2; pH7,2) a 0,3 g de amostra de fezes. A amostra foi então centrifugada a 2.500 rpm por 20 minutos a 4°C, transferindo 2 mL do sobrenadante para um novo tubo. Para o teste foram feitas 3 avaliações da suspensão de IgG anti-RV conjugada ao látex: uma amostra de fezes sabidamente positiva em RT-PCR para rotavirus, o controle negativo com PBS pH 7,4, e o controle positivo com a vacina, que foi utilizada na imunização das coelhas. O método utilizado para a detecção da aglutinação em lâmina foi por observação visual sob iluminação contra a luz. Após adicionar 20 μL do látex com 20 μL da suspensão fecal, a reação foi homogeneizada por 5 minutos e observada quanto à presença ou ausência de aglutinação e comparada com o controle negativo (Látex reativo + PBS pH 7,4) e controle positivo (Látex reativo + vacina).[16] This test relied on an immunological agglutination reaction between a faecal suspension containing rotavirus and anti-RV IgG covalently bound to the surface of latex particles. The fecal suspension consisted of the addition of 3.0 mL of Tris/Calcium buffer solution (100mM Tris; 1.5mM CaCl2; pH7.2) to 0.3 g of stool sample. The sample was then centrifuged at 2,500 rpm for 20 minutes at 4°C, transferring 2 mL of the supernatant to a new tube. For the test, 3 evaluations of the latex-conjugated anti-RV IgG suspension were performed: a stool sample known to be positive in RT-PCR for rotavirus, the negative control with PBS pH 7.4, and the positive control with the vaccine, which was used in the immunization of rabbits. The method used for the detection of agglutination in slides was by visual observation under backlight illumination. After adding 20 μL of latex with 20 μL of fecal suspension, the reaction was homogenized for 5 minutes and observed for the presence or absence of agglutination and compared with the negative control (Reactive Latex + PBS pH 7.4) and positive control (Latex reactive + vaccine).

Claims

A rapid latex agglutination test for diagnosing rotavirus, characterized by being composed of a latex reagent and an anti-rotavirus antibody obtained from vaccine antigen;

Rapid latex agglutination test for diagnosing rotavirus, according to claim 1, characterized in that the vaccine antigen may belong to the group (human, animal).