BR102020026395A2 - METHOD, PANEL AND KIT FOR DIAGNOSIS AND MONITORING THE TREATMENT OF PATIENTS WITH BREAST CANCER - Google Patents
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Abstract
MÉTODO, PAINEL E KIT PARA O DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO DO TRATAMENTO DE PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA. A presente invenção refere-se à um método para diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama compreendendo a detecção de subpopulações de células tumorais circulantes (CTCs), baseado na presença ou ausência de proteínas analisadas por meio de citometria de fluxo em amostras biológicas, por exemplo sangue periférico, para serem utilizadas como biomarcadores para o câncer de mama (CM). Especificamente, a invenção compreende um método para detecção de subpopulações de CTCs baseado (i) na ausência de CD45 e (ii) na presença de vimentina, CD44 e EpCAM. A análise desses marcadores foi realizada sem uma etapa de enriquecimento prévio das CTCs, otimizando o processo. Além disso, a presente invenção refere-se à um painel de marcadores e um kit para teste diagnóstico rápido de câncer de mama e monitoramento rápido do tratamento de pacientes com câncer de mama. Sendo assim, o método, painel e kit para detecção baseado no resultado da análise de CTCs por citometria de fluxo, tem o potencial de serem utilizados como ferramenta complementar ao diagnóstico clínico, podendo também ser utilizado para monitoramento do tratamento.METHOD, PANEL AND KIT FOR THE DIAGNOSIS AND MONITORING OF THE TREATMENT OF PATIENTS WITH BREAST CANCER. The present invention relates to a method for diagnosing and monitoring the treatment of patients with breast cancer comprising the detection of subpopulations of circulating tumor cells (CTCs), based on the presence or absence of proteins analyzed by flow cytometry in samples. biologics, for example peripheral blood, to be used as biomarkers for breast cancer (BC). Specifically, the invention comprises a method for detecting subpopulations of CTCs based on (i) the absence of CD45 and (ii) the presence of vimentin, CD44 and EpCAM. The analysis of these markers was performed without a prior enrichment step of the CTCs, optimizing the process. Furthermore, the present invention relates to a panel of markers and a kit for rapid breast cancer diagnostic testing and rapid monitoring of the treatment of breast cancer patients. Therefore, the method, panel and kit for detection based on the result of the analysis of CTCs by flow cytometry, have the potential to be used as a complementary tool to the clinical diagnosis, and can also be used for monitoring the treatment.
Description
[0001] O presente pedido de patente refere-se à um método de diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama, mais particularmente em que o método compreende a detecção de subpopulações de células tumorais circulantes (CTCs), baseado na presença ou ausência de proteínas analisadas por meio de citometria de fluxo no sangue periférico para serem utilizadas como biomarcadores para o câncer de mama (CM). Além disso, o presente pedido de refere-se à um painel de marcadores e um kit para teste diagnóstico rápido de câncer de mama e monitoramento rápido do tratamento de pacientes com câncer de mama. Especificamente, o presente pedido de patente descreve um método para detecção de subpopulações de CTCs baseado (i) na ausência de CD45 e (ii) na presença de vimentina, CD44 e EpCAM. A análise desses marcadores foi realizada sem enriquecimento prévio das CTCs, otimizando o processo. Sendo assim, o método, painel de marcadores e kit para detecção baseado no resultado da análise de CTCs por citometria de fluxo, tem o potencial de ser utilizado como ferramenta complementar ao diagnóstico clínico, podendo também ser utilizado para monitoramento do tratamento. Ressalta-se ainda que a metodologia aqui proposta compreende uma técnica rápida e não invasiva.[0001] The present patent application relates to a method of diagnosing and monitoring the treatment of patients with breast cancer, more particularly where the method comprises the detection of subpopulations of circulating tumor cells (CTCs), based on the presence or absence of proteins analyzed by flow cytometry in peripheral blood to be used as biomarkers for breast cancer (BC). In addition, the present application relates to a marker panel and kit for rapid breast cancer diagnostic testing and rapid monitoring of the treatment of breast cancer patients. Specifically, the present patent application describes a method for detecting subpopulations of CTCs based on (i) the absence of CD45 and (ii) the presence of vimentin, CD44 and EpCAM. The analysis of these markers was performed without prior enrichment of the CTCs, optimizing the process. Therefore, the method, panel of markers and kit for detection based on the result of the analysis of CTCs by flow cytometry, has the potential to be used as a complementary tool to clinical diagnosis, and can also be used for monitoring of treatment. It is also noteworthy that the methodology proposed here comprises a fast and non-invasive technique.
[0002] O câncer de mama é o tipo de câncer mais incidente entre as mulheres. Na última estimativa mundial, publicada em 2018, houve 18 milhões de novos casos de câncer e destes 11,6% foram de mama (BRAY et al.,2018) . No Brasil, a estimativa para cada ano do triênio 2020-2022 é de 625 mil novos casos de câncer, sendo que o câncer de mama representará 29,7% dos cânceres em mulheres (INCA, 2019).[0002] Breast cancer is the most common type of cancer among women. In the latest global estimate, published in 2018, there were 18 million new cases of cancer, of which 11.6% were breast cancer (BRAY et al., 2018). In Brazil, the estimate for each year of the triennium 2020-2022 is 625 thousand new cases of cancer, with breast cancer representing 29.7% of cancers in women (INCA, 2019).
[0003] A carcinogênese caracteriza-se como um processo de múltiplas etapas orientadas por alterações tanto em nível de genótipo quanto de fenótipo e o crescimento descontrolado das células que sofreram tais alterações é definido como câncer (BARTOSCH et al., 2017; WEIGELT et al., 2014) . A progressão metastática é uma sequência de eventos não determinados, que envolve a migração das células por meio da membrana basal e tecido circundante, deslocamento pela corrente sanguínea para locais distantes, readaptação ao novo ambiente tecidual e por fim a formação de metástases clinicamente detectáveis (VANHARANTA & MASSAGUE, 2013). Para que as primeiras etapas ocorram, evidências sugerem que as células tumorais sofrem a transição de um fenótipo epitelial para mesenquimal, o que desencadeará a liberação e disseminação destas células na corrente sanguínea (WERNER et al., 2017) .[0003] Carcinogenesis is characterized as a multi-step process driven by alterations both at the genotype and phenotype levels, and the uncontrolled growth of cells that have undergone such alterations is defined as cancer (BARTOSCH et al., 2017; WEIGELT et al. ., 2014). Metastatic progression is a sequence of undetermined events that involves the migration of cells through the basement membrane and surrounding tissue, movement through the bloodstream to distant sites, readaptation to the new tissue environment, and eventually the formation of clinically detectable metastases. & MASSAGUE, 2013). For the first steps to occur, evidence suggests that tumor cells undergo the transition from an epithelial to mesenchymal phenotype, which will trigger the release and dissemination of these cells in the bloodstream (WERNER et al., 2017).
[0004] As mortes em decorrência do câncer são consequência, em sua maioria, das metástases em órgãos e tecidos distantes (HANAHAN & WEINBERG, 2000). O padrão ouro para avaliar a recidiva do câncer tem sido os mesmos testes utilizados para o diagnóstico do tumor, quando possível a coleta do material. As técnicas de histopatologia, mamografia, ultrassonografia e imageamento por ressonância magnética são as análises mais utilizadas na rotina clínica, porém são demoradas e exigem protocolos rígidos (TRIA et al., 2013).[0004] Deaths from cancer are mostly a consequence of metastases in distant organs and tissues (HANAHAN & WEINBERG, 2000). The gold standard for evaluating cancer recurrence has been the same tests used for tumor diagnosis, when material is collected. Histopathology, mammography, ultrasound and magnetic resonance imaging techniques are the most used analyzes in clinical routine, but they are time consuming and require strict protocols (TRIA et al., 2013).
[0005] A biópsia do tecido é utilizada para o diagnóstico e fornece informações histológicas e permite estabelecer o perfil imuno-histoquímico dos receptores hormonais e do status do receptor HER-2. Porém, possui limitações e pode fornecer informações de apenas um momento e apenas do tecido tumoral coletado (TAY & TAN, 2019) . Mas, os tumores são heterogêneos e ainda podem sofrer alterações de acordo com o tipo de tratamento realizado (GERLINGER et al., 2012). A possibilidade de utilizar CTCs para complementar ou substituir biópsias de tecidos tumorais para o diagnóstico e terapêutica torna tal metodologia relevante e aplicável como "biópsias líquidas em tempo real" (PANTEL & ALIX-PANABIERES, 2010; BARDELLI & PANTEL, 2017). A biópsia líquida pode suprir tanto a carência de dados em relação a diferentes tempos e ainda detectar a inerente heterogeneidade do tecido tumoral.[0005] Tissue biopsy is used for diagnosis and provides histological information and allows establishing the immunohistochemical profile of hormone receptors and HER-2 receptor status. However, it has limitations and can provide information from just a moment and only from the tumor tissue collected (TAY & TAN, 2019). But the tumors are heterogeneous and can still change according to the type of treatment performed (GERLINGER et al., 2012). The possibility of using CTCs to complement or replace tumor tissue biopsies for diagnosis and therapy makes such a methodology relevant and applicable as "real-time liquid biopsies" (PANTEL & ALIX-PANABIERES, 2010; BARDELLI & PANTEL, 2017). Liquid biopsy can fill both the lack of data in relation to different times and still detect the inherent heterogeneity of the tumor tissue.
[0006] O único método para realizar a biópsia líquida aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) é o CellSearch. Este método se baseia na expressão de moléculas de adesão celular epitelial (EpCAM), para seleção das CTCs, seguido por caracterização das células selecionadas em: i) negativo para CD45 e ii) positivo para citoqueratinas. Porém, estudos demonstraram que esta técnica não captura CTCs com baixa expressão de EpCAM adequadamente. Assim, CTCs que sofrem o processo de transição epitélio-mesenquimal (EMT), perdem seus antígenos epiteliais e não são detectadas pelo CellSearch. Além disso, essas CTCs negativas para EpCAM parecem ser um subtipo altamente agressivo e invasivo (PUNNOOSE et al., 2010; GEORGES et al., 2012).[0006] The only method to perform liquid biopsy approved by the Food and Drug Administration (FDA) is CellSearch. This method is based on the expression of epithelial cell adhesion molecules (EpCAM) for selection of CTCs, followed by characterization of selected cells as: i) negative for CD45 and ii) positive for cytokeratins. However, studies have shown that this technique does not capture CTCs with low EpCAM expression adequately. Thus, CTCs that undergo the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process lose their epithelial antigens and are not detected by CellSearch. Furthermore, these EpCAM-negative CTCs appear to be a highly aggressive and invasive subtype (PUNNOOSE et al., 2010; GEORGES et al., 2012).
[0007] Diante desse quadro, fica evidente a necessidade de novos métodos para a detecção de CTCs, que possibilitem não somente a identificação de CTCs com diferentes fenótipos, mas também que seja exequível e que não requeira muitos processos até a obtenção do resultado final. A presente invenção busca atender essas exigências.[0007] In view of this situation, it is evident the need for new methods for the detection of CTCs, which allow not only the identification of CTCs with different phenotypes, but also that it is feasible and that does not require many processes to obtain the final result. The present invention seeks to meet these requirements.
[0008] Apesar das limitações do CellSearch, vários estudos que utilizaram essa técnica, comprovaram a relevância da análise de CTCs para estabelecimento do prognóstico. Pacientes com câncer de mama e com valores de ≥ 5 CTCs por 7.5 mL de sangue total em comparação com aqueles com valores de < 5 CTCs apresentaram significativamente menor sobrevida livre de progressão e sobrevida global (CRISTOFANILLI et al.,2004; BUDD et al., 2006; PIERGA et al.,2012; ROSSI et al., 2018).[0008] Despite the limitations of CellSearch, several studies that used this technique, proved the relevance of the analysis of CTCs to establish the prognosis. Patients with breast cancer and with values of ≥ 5 CTCs per 7.5 mL of whole blood compared with those with values of < 5 CTCs had significantly lower progression-free survival and overall survival (CRISTOFANILLI et al., 2004; BUDD et al. , 2006; PIERGA et al., 2012; ROSSI et al., 2018).
[0009] Para o diagnóstico do câncer de mama, a utilização de CTCs ainda precisa ser melhor investigada pois evidencia-se a existência de resultados muito pouco significativos. Porém, sondas ativadas por nucleases derivadas de CTCs foram capazes de discriminar pacientes com câncer de mama metastático de controles saudáveis (KRUSPE et al., 2017).[0009] For the diagnosis of breast cancer, the use of CTCs still needs to be better investigated because it shows the existence of very little significant results. However, nuclease-activated probes derived from CTCs were able to discriminate patients with metastatic breast cancer from healthy controls (KRUSPE et al., 2017).
[00010] Os documentos de patente US9671407B2, EP283121, CN105518464B, WO2016004311A, CN104781007B, JP2018079327A, TW201920928A e US20200055048A1 utilizam um dispositivo (chip microfluído ou microfiltros) para capturar e/ou detectar CTCs. Apesar de também utilizarem anticorpos, porém imobilizados no microchip ou filtro, verifica-se a necessidade da utilização de técnicas após a captura para caracterização das células alvo, tais como imunohistoquímica, citometria de fluxo, hibridização in situ, análise de mutações no DNA e imunofluorescência.[00010] Patent documents US9671407B2, EP283121, CN105518464B, WO2016004311A, CN104781007B, JP2018079327A, TW201920928A and US20200055048A1 use a detection device (microfluid chip or microfilters./or C) Despite also using antibodies, however immobilized on the microchip or filter, there is a need to use techniques after capture to characterize the target cells, such as immunohistochemistry, flow cytometry, in situ hybridization, analysis of DNA mutations and immunofluorescence .
[00011] O documento de patente US20190107542A1 fornece métodos para detectar e isolar CTCs por anticorpos ligados a esferas magnéticas e posterior caracterização da expressão gênica destas células. Os documentos de patentes EP2948776B, CA2798250A1 e US20140154799A1 selecionam CTCs com base em um conjunto de anticorpos, tais como EpCAM, CD45, CD44, CD14, CD24, CD34, Citoqueratinas como 8, 18 e 19, EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), ALDH1 (aldeídesidrogenase 1), vimentina, dentro outros, e em seguida as coloca em cultura para enriquecimento, com o objetivo principal de selecionar fármacos para a terapia dos pacientes, além de poder caracterizar as CTCs em cultura por imagem.[00011] Patent document US20190107542A1 provides methods for detecting and isolating CTCs by antibodies bound to magnetic beads and further characterizing the gene expression of these cells. Patent documents EP2948776B, CA2798250A1 and US20140154799A1 select CTCs based on a set of antibodies such as EpCAM, CD45, CD44, CD14, CD24, CD34, Cytokeratins such as 8, 18 and 19, EGFR (epidermal growth factor receptor) , ALDH1 (aldehydehydrogenase 1), vimentin, among others, and then place them in culture for enrichment, with the main objective of selecting drugs for patient therapy, in addition to being able to characterize CTCs in culture by imaging.
[00012] O documento de patente AU2016228165A1 fornece métodos para obter CTCs e a possibilidade de analisar uma única célula. Essa identificação se dá por imunohistoquímica com a aspiração das células por pipetagem e posterior análise morfológica, genômica, epigenética ou proteômica. Utiliza marcadores epiteliais e mesenquimais. Da mesma forma, o documento de patente JP2006509185A fornece um método para detectar e descriminar mudanças nos níveis de expressão de marcadores moleculares, utiliza, entre outros marcadores, o CD44.[00012] Patent document AU2016228165A1 provides methods for obtaining CTCs and the possibility of analyzing a single cell. This identification is performed by immunohistochemistry with aspiration of cells by pipetting and subsequent morphological, genomic, epigenetic or proteomic analysis. Uses epithelial and mesenchymal markers. Likewise, patent document JP2006509185A provides a method to detect and discriminate changes in the expression levels of molecular markers, using, among other markers, CD44.
[00013] O documento de patente WO2017180499A2 utiliza um método para capturar CTCs de fluidos biológicos que compreende o contato do material biológico com a lectina presa na superfície magnética. A separação ocorre em um aparato magnético. A análise das CTCs ocorre a posteriori por técnicas como imunhistoquímica, genômica e metabolômica, por exemplo. De uma maneira semelhante, o documento de patente CN107428837A utiliza um método para enriquecimento e detecção de CTCs baseado em anticorpo anti-TROP2, porém tal análise é valida apenas para tumores positivos para esse marcador. Análises posteriores incluem imunofluorescência, FISH e RT-PCR.[00013] Patent document WO2017180499A2 uses a method to capture CTCs from biological fluids which comprises contacting the biological material with the lectin trapped on the magnetic surface. The separation takes place in a magnetic apparatus. The analysis of CTCs occurs a posteriori by techniques such as immunohistochemistry, genomics and metabolomics, for example. In a similar way, patent document CN107428837A uses a method for enrichment and detection of CTCs based on anti-TROP2 antibody, however such analysis is valid only for tumors positive for this marker. Further analyzes include immunofluorescence, FISH and RT-PCR.
[00014] O documento de patente US20170038389A1 utiliza um método de detecção de CTCs visando sua diferenciação de células endoteliais circulantes e confirma que a vimentina é expressa nestas últimas células, mas quando analisada em conjunto com outros marcadores (CD45 e CD144) é possível separar as populações. O documento de patente CN108588018A utiliza uma membrana de eritrócitos para capturar CTCs, sendo uma captura mais efetiva que os métodos disponíveis.[00014] The patent document US20170038389A1 uses a method of detection of CTCs aiming their differentiation from circulating endothelial cells and confirms that vimentin is expressed in these latter cells, but when analyzed together with other markers (CD45 and CD144) it is possible to separate the populations. Patent document CN108588018A uses an erythrocyte membrane to capture CTCs, which is more effective than the available methods.
[00015] O documento de patente EP3160654A2 identifica ácidos nucleicos de CTCs utilizando a combinação de PCR e FACS (seleção ativada por PCR), os primers podem ser de EpCAM, CD44 e vimentina, entre outros. Em outra abordagem, o documento de patente CN106868101A utiliza marcadores semelhantes para detecção de CTCs por sonda e hibridização in situ, mas não houveram análises deste método para o monitoramento do tratamento ou diagnóstico.[00015] Patent document EP3160654A2 identifies nucleic acids from CTCs using the combination of PCR and FACS (PCR activated selection), primers can be EpCAM, CD44 and vimentin, among others. In another approach, patent document CN106868101A uses similar markers for detection of CTCs by probe and in situ hybridization, but there have been no analyzes of this method for monitoring treatment or diagnosis.
[00016] Os documentos de patente JP2017207516A, US20130129681A1 e EP2529223B1 utilizam marcadores epiteliais e mesenquimais e detecção por citometria de fluxo, mas utilizam métodos de enriquecimento como passos iniciais, esferas magnéticas, RosetteSep e CellSearch, respectivamente.[00016] Patent documents JP2017207516A, US20130129681A1 and EP2529223B1 use epithelial and mesenchymal markers and flow cytometry detection, but use enrichment methods such as initial steps, magnetic beads, RosetteSep and CellSearch, respectively.
[00017] Nenhum dos ensinamentos do estado da técnica demonstram ou sugerem um método que utilize da combinação dos marcadores: vimentina, CD44, CD45 e EpCAM, nem da detecção destes 4 marcadores utilizando a técnica de citometria de fluxo, e nem muito menos, que tal método permitisse a análise de diferentes populações de CTCs sem a necessidade de uma etapa de inicial de enriquecimento. O método proposto pelo presente pedido de patente se mostrou eficaz na detecção direta de diferentes populações de CTCs em amostras biológicas, por exemplo, amostras de sangue periférico. Proporcionando então o desenvolvimento de um método, painel de marcadores e kit para o diagnóstico do câncer de mama e monitoramento do tratamento, sendo que a técnica utilizada e descrita no presente pedido de patente fornece uma ferramenta simples e poderosa para analisar amostras biológicas com pouca preparação, permitindo que a amostra seja analisada diretamente, sem a necessidade de etapas adicionais de enriquecimento das CTCs. Além disso, o método , painel e kit aqui descritos facilitam ainda mais a utilização na rotina clínica, produzindo um ponto de inflexão (cut off) e informando o diagnóstico positivo ou negativo para o câncer de mama e a possibilidade de acompanhamento do perfil destas células durante o tratamento.[00017] None of the teachings of the state of the art demonstrate or suggest a method that uses the combination of the markers: vimentin, CD44, CD45 and EpCAM, nor the detection of these 4 markers using the flow cytometry technique, nor much less, that such a method would allow the analysis of different populations of CTCs without the need for an initial enrichment step. The method proposed by the present patent application proved to be effective in the direct detection of different populations of CTCs in biological samples, for example, peripheral blood samples. Thus providing the development of a method, panel of markers and kit for the diagnosis of breast cancer and monitoring of treatment, and the technique used and described in the present patent application provides a simple and powerful tool to analyze biological samples with little preparation. , allowing the sample to be analyzed directly, without the need for additional CTC enrichment steps. In addition, the method, panel and kit described here facilitate even more its use in clinical routine, producing an inflection point (cut off) and informing the positive or negative diagnosis for breast cancer and the possibility of monitoring the profile of these cells. during treatment.
[00018] Dessa forma, apesar dos documentos do estado da técnica revelarem à busca pela captura e detecção de CTCs no diagnóstico de câncer, há ainda a necessidade de um método de diagnóstico sensível, específico e simples que possa ser implementado na rotina clínica, para o câncer de mama.[00018] Thus, despite the state-of-the-art documents revealing the search for the capture and detection of CTCs in the diagnosis of cancer, there is still a need for a sensitive, specific and simple diagnostic method that can be implemented in the clinical routine, to the breast cancer.
[00019] O presente pedido de patente teve como objetivo de resolver um problema no estado da técnica desenvolvendo um método, painel de marcadores e kit para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama, sensível, específico e simples que possa ser implementado na rotina clínica de forma otimizada.[00019] The present patent application aimed to solve a problem in the state of the art by developing a method, panel of markers and kit for the diagnosis and monitoring of the treatment of patients with breast cancer, sensitive, specific and simple that can be implemented in the clinical routine in an optimized way.
[00020] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais:[00020] The present invention will be better understood based on the description below, taken together with the attached figures, in which:
[00021] A FIGURA 1 a) mostra a porcentagem de CTCs mesenquimal. Teste de Mann-Whitney com *p<0.05;[00021] FIGURE 1 a) shows the percentage of mesenchymal CTCs. Mann-Whitney test with *p<0.05;
[00022] A FIGURA 1 b) mostra a porcentagem de CTCs intermediário. Teste de Mann-Whitney com *p<0.05;[00022] FIGURE 1 b) shows the percentage of intermediate CTCs. Mann-Whitney test with *p<0.05;
[00023] A FIGURA 1 c) mostra a porcentagem de CTCs epitelial. Teste de Mann-Whitney com *p<0.05.[00023] FIGURE 1 c) shows the percentage of epithelial CTCs. Mann-Whitney test with *p<0.05.
[00024] Os inventores do presente pedido de patente, por meio de experimentos utilizando amostras biológicas de sangue periférico e tecidos de pacientes com doença benigna da mama ou com câncer de mama submetidos ou não à quimioterapia, foram capazes de identificar que a expressão de somente quatro marcadores específicos seria útil no desenvolvimento de um método, painel de marcadores e kit de diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama simplificado. Mas particularmente, a análise dos referidos marcadores dentro do método desenvolvido é capaz de indicar, através de um cut off definido especificamente para separação dos grupos, se o paciente apresenta: doença benigna da mama (DBM), câncer de mama sem tratamento por quimioterapia (CM sem QT) ou câncer de mama com tratamento por quimioterapia (CM com QT).[00024] The inventors of the present patent application, through experiments using biological samples of peripheral blood and tissues from patients with benign breast disease or breast cancer submitted or not to chemotherapy, were able to identify that the expression of only four specific markers would be useful in developing a simplified method, marker panel and kit for the diagnosis and monitoring of breast cancer treatment. More particularly, the analysis of these markers within the developed method is able to indicate, through a cut off specifically defined for separating the groups, whether the patient has: benign breast disease (BMD), breast cancer without chemotherapy treatment ( CM without CT) or breast cancer with chemotherapy treatment (CM with CT).
[00025] O painel de marcadores propostos pela presente invenção engloba a detecção de: CD45, um marcador para seleção negativa, definido como um marcador pan-leucocitário; Vimentina, marcador típico do fenótipo mesenquimal e com estudos demonstrando que maiores níveis dessa proteína estão associados ao maior poder de invasão de células tumorais in vitro e consequentemente, o seu silenciamento reduz a formação de metástases (ZELENKO et al., 2017); CD44, marcador estabelecido para células tronco, sendo uma molécula de adesão, relacionada às interações célula a célula e célula-matriz (KLINGREIL et al., 2010). Por meio das interações anteriormente citadas, o CD44 promove a invasão e migração das CTCs (SENBANJO et al., 2017); EpCAM, uma glicoproteína transmembrana, que possui função de adesão e está relacionada com a sinalização, proliferação, diferenciação e migração celular (OSTA et al.,2004).[00025] The panel of markers proposed by the present invention encompasses the detection of: CD45, a marker for negative selection, defined as a pan-leukocyte marker; Vimentin, a typical marker of the mesenchymal phenotype and with studies demonstrating that higher levels of this protein are associated with greater invasiveness of tumor cells in vitro and, consequently, its silencing reduces the formation of metastases (ZELENKO et al., 2017); CD44, an established marker for stem cells, being an adhesion molecule, related to cell-to-cell and cell-matrix interactions (KLINGREIL et al., 2010). Through the aforementioned interactions, CD44 promotes the invasion and migration of CTCs (SENBANJO et al., 2017); EpCAM, a transmembrane glycoprotein, which has an adhesion function and is related to cell signaling, proliferation, differentiation and migration (OSTA et al., 2004).
[00026] Frente a estes fatos, o presente pedido de patente propõe a utilização de um painel de marcadores, que compreende anticorpos marcados anti-CD45 (para seleção negativa), anti-CD44, anti-vimentina e anti-EpCAM. Esse painel de marcadores é capaz de, identificar subpopulações de CTCs do câncer de mama (CM), selecionadas a partir de amostras biológicas, como por exemplo sangue periférico, de pacientes com CM ou DBM por meio de um método de diagnóstico simplificado e isento de etapa de enriquecimento, usando a citometria de fluxo.[00026] In view of these facts, the present patent application proposes the use of a panel of markers, which comprises labeled anti-CD45 (for negative selection), anti-CD44, anti-vimentin and anti-EpCAM antibodies. This panel of markers is able to identify subpopulations of breast cancer (BC) CTCs, selected from biological samples, such as peripheral blood, from patients with CM or DBM through a simplified diagnostic method free of enrichment step, using flow cytometry.
[00027] A utilização de um método de detecção baseado na expressão de vimentina, CD44 e EpCAM em CTCs que são CD45 negativos, de amostras biológicas de pacientes com doença benigna da mama ou com câncer de mama submetidos ou não à quimioterapia, demonstrou possibilitar não somente o diagnóstico de CM ou DBM, mas também a possibilidade de monitoramento do tratamento com a identificação dos grupos: câncer de mama sem tratamento por quimioterapia (CM sem QT) e câncer de mama com tratamento por quimioterapia (CM com QT) .[00027] The use of a detection method based on the expression of vimentin, CD44 and EpCAM in CTCs that are CD45 negative, of biological samples from patients with benign breast disease or with breast cancer submitted or not to chemotherapy, has been shown to make it possible not to only the diagnosis of CM or DBM, but also the possibility of monitoring the treatment with the identification of the groups: breast cancer without chemotherapy treatment (CM without chemotherapy) and breast cancer with chemotherapy treatment (CM with chemotherapy).
[00028] Mais particularmente, a análise da expressão dos marcadores selecionados possibilita a identificação e separação das populações de CTCs com perfil mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44+ e vimentina+), intermediário (CD45-, EpCAM+, CD44+ e vimentina+) e epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44-e vimentina-). Tal identificação dos perfis de CTCs a partir da análise da expressão dos referidos marcadores, com a determinação de cut offs específicos em relação a porcentagem de populações de CTCs em cada perfil, mostrou um alto potencial no diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama.[00028] More particularly, the analysis of the expression of selected markers allows the identification and separation of populations of CTCs with mesenchymal (CD45-, EpCAM-, CD44+ and vimentin+), intermediate (CD45-, EpCAM+, CD44+ and vimentin+) and epithelial profiles (CD45-, EpCAM+, CD44-and vimentin-). Such identification of CTCs profiles from the analysis of the expression of these markers, with the determination of specific cut offs in relation to the percentage of CTCs populations in each profile, showed a high potential in the diagnosis and monitoring of breast cancer treatment.
[00029] Assim, a presente invenção propõe a utilização de um método simplificado para detecção de populações de CTCs, isento da necessidade de uma etapa de enriquecimento prévio das CTCs, baseado: (i) na seleção de CTCs ausentes de CD45 (CD45-) e (ii) na identificação do perfil das CTCs através da presença ou ausência de vimentina, CD44 e EpCAM, a identificação destas populações compõem um painel simplificado para diagnóstico e monitoramento do tratamento.[00029] Thus, the present invention proposes the use of a simplified method for the detection of CTC populations, exempt from the need for a previous CTC enrichment step, based on: (i) the selection of CTCs absent from CD45 (CD45-) and (ii) in identifying the profile of CTCs through the presence or absence of vimentin, CD44 and EpCAM, the identification of these populations composes a simplified panel for diagnosis and treatment monitoring.
[00030] Para o diagnóstico, a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) apresentou uma sensibilidade de 73% e especificidade de 83% para CM vs DBM e odds ratio de 13.33 (p=0.0443). A análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% para CM vs DBM e odds ratio de 84.33 (p=0.0096). A análise do perfil mesenquimal para DBM vs CM sem tratamento, apresentou uma sensibilidade de 83% e especificidade de 100% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257). A análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257).[00030] For diagnosis, the analysis of the mesenchymal profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT) showed a sensitivity of 73% and specificity of 83% for CM vs DBM and odds ratio of 13.33 (p= 0.0443). The analysis of the intermediate profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT) showed a sensitivity of 100% and specificity of 83% for CM vs DBM and an odds ratio of 84.33 (p=0.0096). The analysis of the mesenchymal profile for DBM vs CM without treatment showed a sensitivity of 83% and specificity of 100% and an odds ratio of 47.6667 (p=0.0257). The analysis of the epithelial profile for DBM vs CM without QT showed a sensitivity of 100% and specificity of 83% and an odds ratio of 47.6667 (p=0.0257).
[00031] Para o monitoramento do tratamento, a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 91% para câncer de mama sem QT vs doença benigna da mama e CM com QT, e odds ratio de 91 (p=0.0082). A análise do perfil intermediário para CM sem QT vs CM com QT apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172). A análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172).[00031] For treatment monitoring, epithelial profile analysis for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT) showed a sensitivity of 100% and specificity of 91% for breast cancer without QT vs. breast and CM with chemotherapy, and odds ratio of 91 (p=0.0082). The analysis of the intermediate profile for CM without QT vs CM with QT showed a sensitivity of 100% and specificity of 100% and an odds ratio of 143 (p=0.00172). The analysis of the epithelial profile for CM without QT vs CM with QT showed a sensitivity of 100% and specificity of 100% and an odds ratio of 143 (p=0.00172).
[00032] Assim, o presente pedido de patente propõe mais particularmente a utilização de um método de diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama, baseado na detecção, identificação e análise de populações de CTCs, preferencialmente por citometria de fluxo, em que compreende as etapas de:
- - obtenção da amostra biológica, preferencialmente sangue, mais preferencialmente sangue periférico;
- - preparação da amostra para receber os anticorpos marcadores, em que a preparação é isenta da necessidade de uma etapa de enriquecimento prévio;
- - por em contado a amostra preparada com os anticorpos marcados com fluorocromos anti-CD45, anti-CD44, anti-Epcam e anti-vimentina,
- - seleção de CTCs ausentes de CD45 (CD45-) ; e
- - identificação e análise do perfil das CTCs através da presença ou ausência de vimentina, CD44 e EpCAM.
- - obtaining the biological sample, preferably blood, more preferably peripheral blood;
- - sample preparation to receive the marker antibodies, in which the preparation is exempt from the need for a previous enrichment step;
- - count the sample prepared with the fluorochrome-labeled anti-CD45, anti-CD44, anti-Epcam and anti-vimentin antibodies,
- - selection of CTCs absent from CD45 (CD45-); and
- - identification and analysis of the profile of CTCs through the presence or absence of vimentin, CD44 and EpCAM.
[00033] A etapa de identificação dos perfis das CTCs compreende a identificação dos perfis:
- (i) mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44 + e vimentina+);
- (ii) intermediária (CD45-, EpCAM+, CD44 + e vimentina+); e
- (iii) epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44- e vimentina-), por citometria de fluxo.
- (i) mesenchymal (CD45-, EpCAM-, CD44+ and vimentin+);
- (ii) intermediate (CD45-, EpCAM+, CD44+ and vimentin+); and
- (iii) epithelial (CD45-, EpCAM+, CD44- and vimentin-), by flow cytometry.
[00034] A identificação e análise do perfil das CTCs compõem então um painel de marcadores simples para diagnóstico e monitoramento do tratamento, em a etapa de análise dos perfis das CTCs compreende o uso cut offs definidos em relação a porcentagem de populações de CTCs específicas em cada um dos perfis identificados, para o diagnóstico de doença benigna da mama (DBM) ou câncer de mama (CM), ou monitoramento de câncer de mama com quimioterapia (CM com QT) e câncer de mama sem quimioterapia (CM sem QT).[00034] The identification and analysis of the profile of CTCs then compose a panel of simple markers for diagnosis and monitoring of treatment, in the stage of analysis of the profiles of CTCs comprises the use of defined cut offs in relation to the percentage of specific CTC populations in each of the profiles identified, for the diagnosis of benign breast disease (BMD) or breast cancer (CM), or monitoring of breast cancer with chemotherapy (CM with QT) and breast cancer without chemotherapy (CM without QT).
[00035] O presente pedido de patente descreve ainda um painel de marcadores para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de pacientes com câncer de mama em que compreende anticorpo marcado com fluorocromos anti-CD45, anticorpo marcado com fluorocromos anti-CD44, anticorpo marcado com fluorocromos anti-vimentina e anticorpo marcado com fluorocromos anti-EpCAM para detecção de populações de CTCs, em que o painel permite a identificação dos perfis das CTCs:
- (i) mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44 + e vimentina+);
- (ii) intermediária (CD45-, EpCAM+, CD44 + e vimentina+); e
- (iii) epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44- e vimentina-).
- (i) mesenchymal (CD45-, EpCAM-, CD44+ and vimentin+);
- (ii) intermediate (CD45-, EpCAM+, CD44+ and vimentin+); and
- (iii) epithelial (CD45-, EpCAM+, CD44- and vimentin-).
[00036] O Painel ainda compreende um painel de diagnóstico e um painel de monitoramento com base na análise dos perfis das CTCs, em que o painel de diagnóstico compreende:
- - a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off acima de 4,5% de células tumorais circulantes mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama;
- - a análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,04% de células tumorais circulantes intermediárias indicando diagnóstico de câncer de mama
- - a análise do perfil mesenquimal para DBM vs CM sem QT, com um cut off acima de 5,5% de células tumorais circulantes mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama; e
- - a análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT, com um cut off abaixo de 0,28% de células tumorais circulantes epiteliais indicando diagnóstico de câncer de mama;
- - a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,27% de células tumorais circulantes epiteliais indicando tumor sem tratamento;
- - a análise do perfil intermediário para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off acima de 0, 0004% de células tumorais circulantes intermediárias indicando tumor sem tratamento; e
- - a análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off abaixo de 0,6% de células tumorais circulantes epiteliais indicando tumor sem tratamento.
- - analysis of the mesenchymal profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off above 4.5% of circulating mesenchymal tumor cells indicating a diagnosis of breast cancer;
- - analysis of the intermediate profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off below 0.04% of intermediate circulating tumor cells indicating diagnosis of breast cancer
- - analysis of the mesenchymal profile for DBM vs CM without QT, with a cut off above 5.5% of circulating mesenchymal tumor cells indicating a diagnosis of breast cancer; and
- - analysis of the epithelial profile for DBM vs CM without QT, with a cut off below 0.28% of circulating epithelial tumor cells indicating diagnosis of breast cancer;
- - analysis of the epithelial profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off below 0.27% of circulating epithelial tumor cells indicating untreated tumor;
- - analysis of the intermediate profile for CM without QT vs CM with QT, with a cut off above 0.0004% of intermediate circulating tumor cells indicating untreated tumor; and
- - epithelial profile analysis for CM without QT vs CM with QT, with a cut off below 0.6% of circulating epithelial tumor cells indicating untreated tumor.
[00037] O presente pedido de patente descreve ainda um kit para o diagnóstico e monitoramento do tratamento de câncer de mama em que compreende, combinados ou separados em um ou mais recipientes: anticorpo marcado com um fluorocromo anti-CD45, anticorpo marcado com um fluorocromo anti-CD44, anticorpo marcado com fluorocromo anti-vimentina e anticorpo marcado com fluorocromo anti-EpCAM; em que ainda compreende instruções de uso.[00037] The present patent application further describes a kit for the diagnosis and monitoring of the treatment of breast cancer in which it comprises, combined or separated in one or more containers: antibody labeled with an anti-CD45 fluorochrome, antibody labeled with a fluorochrome anti-CD44, fluorochrome-labeled anti-vimentin antibody, and fluorochrome-labeled anti-EpCAM antibody; in which it still understands instructions for use.
[00038] O referido kit ainda pode compreender em outra modalidade o referido painel de marcadores descrito no presente pedido de patente, bem como pode compreender instruções para uso no referido método descrito no presente pedido de patente.[00038] Said kit may comprise in yet another embodiment said panel of markers described in the present patent application, as well as may comprise instructions for use in said method described in the present patent application.
[00039] A presente invenção será ainda melhor compreendida por meio da descrição dos resultados obtidos. Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados no final desse relatório descritivo.[00039] The present invention will be even better understood through the description of the results obtained. The experimental procedures involved are detailed at the end of this descriptive report.
[00040] Esse exemplo refere-se às características dos sujeitos do estudo, sendo estes agrupados em pacientes com câncer de mama que foram ou não submetidos a quimioterapia (grupo CM com QT ou CM sem QT), pacientes com doença benigna da mama (grupo DBM).[00040] This example refers to the characteristics of the study subjects, which are grouped into patients with breast cancer who were or were not submitted to chemotherapy (CM group with QT or CM without QT), patients with benign breast disease (group DBM).
[00041] A Tabela 1 apresenta as características clínicas, hormonais, diagnósticas e terapêuticas de pacientes com câncer de mama.
[00042] A Tabela 1 apresenta as características clínicas, hormonais, diagnósticas e terapêuticas de pacientes com câncer de mama.[00042] Table 1 presents the clinical, hormonal, diagnostic and therapeutic characteristics of patients with breast cancer.
[00043] Esse exemplo refere-se a análise por RT-qPCR dos níveis transcricionais dos grupos câncer de mama e doença benigna da mama.[00043] This example refers to RT-qPCR analysis of transcriptional levels of the breast cancer and benign breast disease groups.
[00044] A Tabela 2 apresenta a comparação dos níveis transcricionais entre câncer de mama (CM) e doença benigna da mama (DBM).
[00045] A Tabela 3 apresenta a comparação dos níveis transcricionais entre câncer de mama com quimioterapia (CM com QT), câncer de mama sem quimioterapia (CM sem QT) e doença benigna da mama (DBM).
[00046] Para análise da expressão dos marcadores em nível proteico, com os resultados obtidos na RT-qPCR e dados da literatura, os marcadores EpCAM, CD44 e vimetina foram selecionados.[00046] To analyze the expression of markers at the protein level, with the results obtained in RT-qPCR and literature data, the markers EpCAM, CD44 and vimetine were selected.
[00047] As diferentes populações de CTCs (mesenquimal, intermediário e epitelial) apresentam diferentes porcentagens para cada grupo. A figura 1 apresenta as porcentagens de CTCs com perfil mesenquimal, intermediário e epitelial do sangue de pacientes com doença benigna da mama (DBM), câncer de mama com quimioterapia (CM com QT) e câncer de mama sem quimioterapia (CM sem QT).[00047] The different populations of CTCs (mesenchymal, intermediate and epithelial) have different percentages for each group. Figure 1 shows the percentages of CTCs with mesenchymal, intermediate and epithelial blood profiles of patients with benign breast disease (BMD), breast cancer with chemotherapy (CM with QT) and breast cancer without chemotherapy (CM without QT).
[00048] Para o diagnóstico, a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off acima de 4,5% de CTCs mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 73% e especificidade de 83% para câncer de mama vs doença benigna da mama (DBM) e odds ratio de 13.33 (p=0.0443). A análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,04% de CTCs intermediárias indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% para câncer de mama vs doença benigna da mama (DBM) e odds ratio de 84.33 (p=0.0096). A análise do perfil mesenquimal para doença DBM vs CM sem QT, com um cut off acima de 5,5% de CTCs mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 83% e especificidade de 100% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257). A análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT, com um cut off abaixo de 0,28% de CTCs epiteliais indicando diagnóstico de câncer de mama, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 83% e odds ratio de 47.6667 (p=0.0257). Para o monitoramento do tratamento, a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,27% de CTCs epiteliais sem tratamento prévio, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 91% para CM sem QT vs DBM e CM com QT, e odds ratio de 91 (p=0.0082). A análise do perfil intermediário para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off acima de 0,0004% de CTCs intermediárias em tumores sem tratamento prévio, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172). A análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off abaixo de 0,6% de CTCs epiteliais indicando tumor sem tratamento prévio, apresentou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 100% e odds ratio de 143 (p=0.00172).[00048] For diagnosis, analysis of the mesenchymal profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off above 4.5% of mesenchymal CTCs indicating a diagnosis of breast cancer, showed a sensitivity of 73% and specificity of 83% for breast cancer vs benign breast disease (BMD) and odds ratio of 13.33 (p=0.0443). The analysis of the intermediate profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off below 0.04% of intermediate CTCs indicating a diagnosis of breast cancer, showed a sensitivity of 100% and specificity of 83% for breast cancer vs benign breast disease (BMD) and odds ratio of 84.33 (p=0.0096). Mesenchymal profile analysis for DBM vs CM disease without QT, with a cut off above 5.5% of mesenchymal CTCs indicating a diagnosis of breast cancer, showed a sensitivity of 83% and specificity of 100% and an odds ratio of 47.6667 ( p=0.0257). Epithelial profile analysis for DBM vs CM without QT, with a cut off below 0.28% of epithelial CTCs indicating a diagnosis of breast cancer, showed a sensitivity of 100% and specificity of 83% and an odds ratio of 47.6667 (p =0.0257). For treatment monitoring, analysis of the epithelial profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off below 0.27% of untreated epithelial CTCs, showed a sensitivity of 100%. and specificity of 91% for CM without QT vs DBM and CM with QT, and odds ratio of 91 (p=0.0082). The analysis of the intermediate profile for CM without QT vs CM with QT, with a cut off above 0.0004% of intermediate CTCs in previously untreated tumors, showed a sensitivity of 100% and specificity of 100% and an odds ratio of 143 ( p=0.00172). The epithelial profile analysis for CM without QT vs CM with QT, with a cut off below 0.6% of epithelial CTCs indicating untreated tumor, showed a sensitivity of 100% and specificity of 100% and an odds ratio of 143 ( p=0.00172).
[00049] A seguir, é descrita a metodologia para o desenvolvimento do método de detecção a partir da análise de populações de CTCs por citometria de fluxo em amostras de sangue de pacientes com CM sem QT, CM com QT e DBM.[00049] The methodology for developing the detection method based on the analysis of CTC populations by flow cytometry in blood samples from patients with CM without QT, CM with QT and DBM is described below.
[00050] A presente invenção foi conduzida no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (número do protocolo: 174.009/2013) e baseado na Declaração de Helsinque. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi obtido de todas as participantes. Os critérios de exclusão foram idade inferior a 18 anos, sítio do tumor primário diferente da mama e incapacidade física ou mental para responder o questionário.[00050] The present invention was conducted at the Hospital de Clínicas, Universidade Federal de Uberlândia and approved by the Ethics Committee for Research with Human Beings (protocol number: 174.009/2013) and based on the Declaration of Helsinki. Free and Informed Consent Term was obtained from all participants. Exclusion criteria were age younger than 18 years, primary tumor site other than the breast, and physical or mental incapacity to respond to the questionnaire.
[00051] Os dados foram coletados em duas etapas de diferentes pacientes. Na primeira etapa, o perfil transcricional foi avaliado de 2013 a 2016, com 62 pacientes com câncer de mama (49 não submetidas a quimioterapia e 13 submetidas a quimioterapia) e 25 pacientes com doença benigna da mama. Na segunda etapa de 2019 a 2020, o perfil proteico foi analisado com 6 pacientes com câncer de mama e não submetidas a quimioterapia, 5 pacientes com câncer de mama e submetidas a quimioterapia e 6 pacientes com câncer de mama.[00051] Data were collected in two steps from different patients. In the first stage, the transcriptional profile was evaluated from 2013 to 2016, with 62 patients with breast cancer (49 not undergoing chemotherapy and 13 undergoing chemotherapy) and 25 patients with benign breast disease. In the second stage from 2019 to 2020, the protein profile was analyzed with 6 patients with breast cancer and not undergoing chemotherapy, 5 patients with breast cancer and undergoing chemotherapy and 6 patients with breast cancer.
[00052] Sangue periférico foi coletado em tubos Vacutainer™ contendo 7.2 mg de K2EDTA. O tecido obtido foi armazenado a -80°C submergido em RNAlater (Invitrogen™) para extração de RNA.[00052] Peripheral blood was collected in Vacutainer™ tubes containing 7.2 mg of K2EDTA. The tissue obtained was stored at -80°C submerged in RNAlater (Invitrogen™) for RNA extraction.
[00053] O RNA foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e seguindo as recomendações do fabricante. O produto da extração foi analisado por eletroforese em gel de agarose (1,5% de agarose). Para a transcrição reversa foi utilizado 1μg de RNA total, 10 U de inibidor de RNase (Invitrogen), 40 U de MMLV-RT (Amersham Biosciences), 1X de Tampão da MMLV-RT (Amersham Biosciences), 200 μM de dNTPs (dGTP, dATP, dTTP e dCTP) e 126 pmoles. A solução foi incubada em termociclador PTC-100 (MJ Research) a 37°C por 1 hora e aquecida a 95°C por 5 minutos. Reações controle (sem RNA) foram realizadas para a verificação de possíveis contaminantes exógenos. O cDNA foi estocado a -20°C para posterior amplificação.[00053] RNA was extracted using the Trizol reagent (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and following the manufacturer's recommendations. The extraction product was analyzed by agarose gel electrophoresis (1.5% agarose). For reverse transcription, 1μg of total RNA, 10 U of RNase inhibitor (Invitrogen), 40 U of MMLV-RT (Amersham Biosciences), 1X of MMLV-RT Buffer (Amersham Biosciences), 200 μM of dNTPs (dGTP , dATP, dTTP and dCTP) and 126 pmoles. The solution was incubated in a PTC-100 thermocycler (MJ Research) at 37°C for 1 hour and heated to 95°C for 5 minutes. Control reactions (without RNA) were performed to check for possible exogenous contaminants. The cDNA was stored at -20°C for further amplification.
[00054] As quantificações transcricionais relativas dos genes alvos (citoqueratinas, ALDH1, CD44, E-caderina, Ep-CAM, MMP-2, MMP-9, N-caderina e vimentina) em relação ao gene endógeno (B2M) foram estimadas por meio de PCR em tempo real a partir do cDNA obtido. As amostras foram amplificadas em duplicata e a detecção ocorreu a partir da emissão de fluorescência do corante dye SYBRGreen de acordo com o uso do kit Master Mix SYBR®Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems).[00054] The relative transcriptional quantifications of the target genes (cytokeratins, ALDH1, CD44, E-cadherin, Ep-CAM, MMP-2, MMP-9, N-cadherin and vimentin) in relation to the endogenous gene (B2M) were estimated by real-time PCR from the cDNA obtained. The samples were amplified in duplicate and the detection occurred from the fluorescence emission of the dye SYBRGreen according to the use of the Master Mix SYBR®Green PCR Core Reagents kit (Applied Biosystems).
[00055] A análise das proteínas envolvidas na EMT em CTCs foi realizada por citometria de fluxo usando BD ACCURITM C6 (Becton, Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA). Para este experimento dois tubos (4mL) contendo sangue periférico estabilizado com EDTA foi utilizado. O primeiro tubo foi descartado para evitar contaminação com células epiteliais. A amostra foi primeiramente submetida a centrifugação e então a monocamada de leucócitos coletada. A monocamada foi incubada com soro AB para bloquear as porções FC, evitando ligações inespecíficas e então marcadas com os anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos anti-CD45 (304008, PE) (Biolegend, San Diego, CA, USA), anti-CD44 (338816, PE/Cy7) (Biolegend, San Diego, CA, USA) e anti-EpCAM (324208, APC) (Biolegend, San Diego, CA, USA). Em seguida, os eritrócitos foram lisados com solução de lise BD FACS (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA) e lavagem da amostra duas vezes com solução de lavagem (Tampão fosfato salino 1x, Albumina do soro bolvino 1% e Azida sódica 0,1%). As células foram ressuspendidas em 150μL de solução de lavagem. Para marcação intracelular, as células foram incubadas com solução de permeabilização BD FACS (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA). Em seguida, as amostras foram incubadas com soro AB, lavadas duas vezes com solução de lavagem e então incubadas com o anticorpo monoclonal marcado com fluorocromo anti-vimentina (562338, Alexa fluor 488) (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA) e lavadas duas vezes com a solução de lavagem e ressuspendidas em 150 μL de solução de lavagem. BDTM CompBeads (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA) foram utilizadas para compensação da fluorescência, assim como a marcação com iodeto de propídio realizada para avaliação da viabilidade celular. Células não marcadas e anticorpos isotipos controles foram utilizados para controle. Para cada tubo, 300.000 eventos foram coletados.[00055] Analysis of proteins involved in EMT in CTCs was performed by flow cytometry using BD ACCURITM C6 (Becton, Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA). For this experiment two tubes (4mL) containing peripheral blood stabilized with EDTA were used. The first tube was discarded to avoid contamination with epithelial cells. The sample was first subjected to centrifugation and then the leukocyte monolayer collected. The monolayer was incubated with AB serum to block the FC portions, preventing nonspecific binding, and then labeled with the fluorochrome-labeled monoclonal antibodies anti-CD45 (304008, PE) (Biolegend, San Diego, CA, USA), anti-CD44 (338816 , PE/Cy7) (Biolegend, San Diego, CA, USA) and anti-EpCAM (324208, APC) (Biolegend, San Diego, CA, USA). Then, the erythrocytes were lysed with BD FACS lysis solution (Becton, Dickinson, and Company (BD), Franklin Lakes, FL, USA) and the sample was washed twice with washing solution (1x Phosphate Buffer Saline,
[00056] A estratégia de gate seguiu uma ordem específica para analisar os dados: (i) eliminação dos debris celulares, (ii) eliminação dos doublets, (iii) eliminação dos leucócitos totais (CD45+), e (iv) seleção positiva para CTCs mesenquimais (CD45-EpCAM-CD44+Vimentina+), intermediárias (CD45-EpCAM+CD44+Vimentin+) e epiteliais (CD45-EpCAM+CD44“Vimentin“).[00056] The gate strategy followed a specific order to analyze the data: (i) elimination of cellular debris, (ii) elimination of doublets, (iii) elimination of total leukocytes (CD45+), and (iv) positive selection for CTCs mesenchymal (CD45-EpCAM-CD44+Vimentin+), intermediate (CD45-EpCAM+CD44+Vimentin+) and epithelial (CD45-EpCAM+CD44“Vimentin”).
[00057] Inicialmente, o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov foi realizado. Dependendo do comportamento das variáveis, testes paramétricos foram realizados para variáveis com distribuição normal ou teste não paramétricos para variáveis sem distribuição normal. Para comparar a expressão (mRNA e proteína) dos genes alvo entre os grupos estabelecidos o teste Mann-Whitney ou teste t para amostras independentes foi utilizado. O intervalo de confiança de 95% foi considerado e valores de p<0.05 foi considerado significante. Analises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) e SPSS versão 21.0 (SPSS, IBM, Chicago, IL, USA).[00057] Initially, the Kolmogorov-Smirnov normality test was performed. Depending on the behavior of the variables, parametric tests were performed for variables with normal distribution or non-parametric tests for variables without normal distribution. To compare the expression (mRNA and protein) of the target genes between the established groups the Mann-Whitney test or t test for independent samples was used. The 95% confidence interval was considered and p values <0.05 were considered significant. Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) and SPSS version 21.0 (SPSS, IBM, Chicago, IL, USA).
[00058] Para análise da sensibilidade, especificidade e odds ratio foi definido um cut off para separação dos grupos em relação a porcentagem de população de CTCs específicas, e calculado por meio do site https://www.medcalc.org.[00058] For the analysis of sensitivity, specificity and odds ratio, a cut off was defined for separating the groups in relation to the population percentage of specific CTCs, and calculated through the website https://www.medcalc.org.
Claims (9)
- - obtenção da amostra biológica,
- - preparação da amostra para receber os anticorpos marcadores, em que a preparação é isenta da necessidade de uma etapa de enriquecimento prévio;
- - por em contato a amostra preparada com os anticorpos marcados com fluorocromos anti-CD45, anti-CD44, anti-Epcam e anti-vimentina,
- - seleção de CTCs ausentes de CD45 (CD4 5-); e
- - identificação e análise dos perfis das CTCs através da presença ou ausência de vimentina, CD44 e EpCAM.
- - obtaining the biological sample,
- - sample preparation to receive the marker antibodies, in which the preparation is exempt from the need for a previous enrichment step;
- - contact the prepared sample with the fluorochrome-labeled anti-CD45, anti-CD44, anti-Epcam and anti-vimentin antibodies,
- - selection of CTCs absent from CD45 (CD4 5-); and
- - identification and analysis of CTCs profiles through the presence or absence of vimentin, CD44 and EpCAM.
- (i) mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44+ e vimentina-);
- (ii) intermediário (CD45-, EpCAM+, CD44+ e vimentina+); e
- (iii) epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44- e vimentina-), por citometria de fluxo.
- (i) mesenchymal (CD45-, EpCAM-, CD44+ and vimentin-);
- (ii) intermediate (CD45-, EpCAM+, CD44+ and vimentin+); and
- (iii) epithelial (CD45-, EpCAM+, CD44- and vimentin-), by flow cytometry.
- (i) mesenquimal (CD45-, EpCAM-, CD44+ e vimentina+);
- (ii) intermediário (CD45-, EpCAM+, CD44+ e vimentina+); e
- (iii) epitelial (CD45-, EpCAM+, CD44- e vimentina-).
- (i) mesenchymal (CD45-, EpCAM-, CD44+ and vimentin+);
- (ii) intermediate (CD45-, EpCAM+, CD44+ and vimentin+); and
- (iii) epithelial (CD45-, EpCAM+, CD44- and vimentin-).
a análise do perfil mesenquimal para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off acima de 4,5% de células tumorais circulantes mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama;
a análise do perfil intermediário para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT), com um cut off abaixo de 0,04% de células tumorais circulantes intermediárias indicando diagnóstico de câncer de mama;
a análise do perfil mesenquimal para DBM vs CM sem QT, com um cut off acima de 5,5% de células tumorais circulantes mesenquimais indicando diagnóstico de câncer de mama; e
a análise do perfil epitelial para DBM vs CM sem QT, com um cut off abaixo de 0,28% de células tumorais circulantes epiteliais indicando diagnóstico de câncer de mama;
e o painel de monitoramento compreende: a análise do perfil epitelial para os três grupos (DBM, CM com QT e CM sem QT) , com um cut off abaixo de 0,27% de células tumorais circulantes epiteliais indicando tumor sem tratamento;
a análise do perfil intermediário para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off acima de 0,0004% de células tumorais circulantes intermediárias indicando tumor sem tratamento; e
a análise do perfil epitelial para CM sem QT vs CM com QT, com um cut off abaixo de 0,6% de células tumorais circulantes epiteliais indicando tumor sem tratamento.Panel, according to claim 5, characterized in that the panel further comprises a diagnostic panel and a monitoring panel based on the analysis of CTC profiles, in which the diagnostic panel comprises:
analysis of the mesenchymal profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off above 4.5% of circulating mesenchymal tumor cells indicating a diagnosis of breast cancer;
the analysis of the intermediate profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off below 0.04% of intermediate circulating tumor cells indicating a diagnosis of breast cancer;
analysis of the mesenchymal profile for DBM vs CM without QT, with a cut off above 5.5% of circulating mesenchymal tumor cells indicating a diagnosis of breast cancer; and
epithelial profile analysis for DBM vs CM without QT, with a cut off below 0.28% of circulating epithelial tumor cells indicating diagnosis of breast cancer;
and the monitoring panel comprises: analysis of the epithelial profile for the three groups (DBM, CM with QT and CM without QT), with a cut off below 0.27% of circulating epithelial tumor cells indicating untreated tumor;
the analysis of the intermediate profile for CM without QT vs CM with QT, with a cut off above 0.0004% of intermediate circulating tumor cells indicating untreated tumor; and
epithelial profile analysis for CM without QT vs CM with QT, with a cut off below 0.6% of circulating epithelial tumor cells indicating untreated tumor.
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