BR102020026374A2

BR102020026374A2 - Diluidor a base de suco de fruto do mandacaru e processo de criopreservação do sêmen

Info

Publication number: BR102020026374A2
Application number: BR102020026374-9A
Authority: BR
Inventors: Ellen Cordeiro Bento Da Silva; Deize Bacry Rodrigues Dos Santos; Giovanna Isabella De Souza Couto; Kamila Giffoni Sales Michiles; Aline Helena Albuquerque Da Silva; Maria Madalena Pessoa Guerra
Original assignee: Universidade Federal Rural De Pernambuco
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-07-05

Abstract

DILUIDOR A BASE DE SUCO DE FRUTO DO MANDACARU E PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN. A presente invenção trata de um diluidor a base de suco de fruto de mandacaru, acrescido ou não de caseína do leite, com aplicação na área de biotecnologia da reprodução, no que se destaca a diluição e criopreservação de espermatozoides. Por meio desse podem ser preservadas a qualidade dos gametas e a segurança sanitária, além de eliminar a necessidade de remover o plasma seminal de espécies como a caprina e propiciar a exploração racional e sustentável do potencial biotecnológico do bioma Caatinga. O diluidor é constituído por fruto de mandacaru, água, ácido cítrico, Tris-hidroximetilaminometano e frutose, com adição ou não de caseína do leite. Tal fato o diferencia dos diluidores comumente utilizados, que têm em sua constituição produtos de origem animal como gema de ovo e leite, embora expresse a mesma capacidade crioprotetora, ressaltando sua importância como diluidor livre de produtos de origem animal em relação aos existentes.

Description

DILUIDOR A BASE DE SUCO DE FRUTO DO MANDACARU E PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN

Campo da invenção

[001] O presente pedido de patente de invenção trata de um diluidor a base de suco de fruto de mandacaru (Cereus jamacaru), enriquecido ou não com caseína do leite, com aplicações em biotecnologias da reprodução, como a diluição e criopreservação de espermatozoides, visando manter a qualidade dos gametas, a segurança sanitária e eliminar a necessidade de remoção do plasma seminal e do uso de antimicrobianos, além de propiciar a exploração racional e sustentável do potencial biotecnológico do bioma Caatinga. A inovação se situa no campo da biotecnologia e possibilita aprimorar o processo de criopreservação seminal.

Fundamentos da invenção

[002] Alguns diluidores seminais livres de produto de origem animal vêm sendo desenvolvidos, a exemplo do diluidor de água de coco em pó que, apesar das modificações realizadas (BR 102014016754-4 A2, depositado no INPI em 2014), ainda não é tão eficaz na preservação de parâmetros espermáticos como a motilidade progressiva, a qual está diretamente relacionada com a fertilidade (Matos et al., 2008).

[003] Além disso, em algumas circunstâncias, o diluidor de água de coco não permite eliminar o uso da gema de ovo (BR 102015019457-9 A2, depositado no INPI em 2015), permanecendo os riscos sanitários e os possíveis efeitos deletérios aos espermatozoides (Gil et al., 2000; Aurich et al., 2007; Rehman et al., 2013; Swelum et al., 2019).

[004] A criopreservação de gametas é uma biotecnologia da reprodução de grande importância (Fickel et al., 2007), o que se deve a fatores como a possibilidade de conservação e transporte dos recursos genéticos (Salamon e Maxwell, 2000), a exploração de animais geneticamente superiores, o favorecimento aos programas de melhoramento animal (Anzar et al., 2019) e à aplicação de outras biotécnicas reprodutivas e de simplificar o manejo das criações (Castro et al., 2016).

[005] Apesar de seus benefícios, à criopreservação de espermatozoides sofre profundas limitações decorrentes da constituição do diluidor seminal (Daramola et al., 2016), que consiste em um meio químico indispensável à preservação, extensão e proteção dos gametas durante o armazenamento e o transporte (Rehman et al., 2013).

[006] Ainda na atualidade, os principais e mais eficientes diluidores seminais utilizados para as diferentes espécies animais trazem em sua composição produtos de origem animal como gema de ovo in natura e leite desnatado (Purdy, 2006; Manjunath, 2012; García et al., 2017).

[007] É sabido que existem inúmeras limitações ao uso de diluidores a base de produtos de origem animal, como a variabilidade nos constituintes biológicos do diluidor, presença de agentes prejudiciais aos espermatozoides (Aurich et al., 2007), potente risco sanitário (Gil et al., 2000; Rehman et al., 2013; Swelum et al., 2019) e necessidade de remover o plasma seminal para a espécie caprina (Harrison e White, 1972), além de dificultar a avaliação microscópica do sêmen (Tosic e Walton, 1942).

[008] Como consequência da contaminação microbiana são gerados efeitos deletérios aos espermatozoides (Rehman et al., 2013; Mazurova, et al., 2015; Gączarzewicz et al., 2016; Mohamed, 2017), prejuízo aos resultados de fertilidade após inseminação artificial e risco à saúde da fêmea inseminada (Morrell e Wallgren, 2014; Mazurova et al., 2015; Ahmed et al., 2017).

[009] Com a finalidade de evitar a propagação de doenças e a degradação dos espermatozoides por ação microbiana (Santos e Silva, 2020), antibióticos são adicionados aos meios de diluição do sêmen (Mazurova, et al., 2015; Ahmed et al., 2017). Contudo, o próprio antibiótico pode ser nocivo aos gametas (Rehman et al., 2013; Madeira et al., 2014) e seu emprego contínuo na indústria do sêmen tem como consequência a resistência microbiana a vários fármacos (Toniolli et al., 2001; Fernandes et al., 2013; Mahmood et al., 2013; Madeira et al., 2014; Schulze et al., 2015; Gączarzewicz et al., 2016)

[0010] No caso da espécie caprina o uso de diluidores a base de gema de ovo e leite torna ainda mais complexo e limitante o processo de criopreservação espermática, pois faz necessária a remoção do plasma seminal, por centrifugação, previamente à diluição com esses meios (Harrison e White, 1972).

[0011] O plasma seminal caprino apresenta a enzima fosfolipase A que, ao hidrolisar lecitina e triglicerídeos, presentes em diluidores como os a base de gema de ovo e leite desnatado, dá origem a produtos tóxicos aos gametas (Leboeuf et al., 2000; Oliveira et al., 2013).

[0012] Apesar de necessário para o processo de criopreservação de espermatozoides caprinos (Purdy, 2006), a centrifugação pode lesionar os gametas, aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio e assim os danos oxidativos (Leboeuf et al., 2000).

[0013] O diluidor é fator determinante à preservação dos gametas (Daramola et al., 2016), devendo oferecer ambiente favorável à sobrevivência e longevidade celular por meio de seu papel tamponante, nutritivo e protetor contar crioinjúrias (Hafez e Hafez, 2004).

[0014] É sabido que um bom diluidor deve ter em sua composição carboidratos como fonte de energia, crioprotetores não penetrantes para proteger as células ao longo da refrigeração, crioprotetores penetrantes para proteger os gametas durante a congelação, tampões para evitar variações bruscas de pH e osmolaridade, antibióticos para prevenir os prejuízos causados pelos microrganismos (Hafez e Hafez, 2004) e também antioxidantes (Silva et al., 2019) para evitar os danos oxidativos (Castro et al., 2016; Peris-Frau et al., 2020)

[0015] O mandacaru (Cereus jamacaru) é uma cactácea nativa da Caatinga (Silva et al., 2013), bioma predominante no Nordeste do Brasil, amplamente devastado pela ação humana (Santana Neto et al., 2015; Sarmento et al., 2015) e pouco explorado, apesar de seu potencial biotecnológico (Rocha Filho et al., 2019).

[0016] As cactáceas são plantas suculentas e espinhosas ricas em água (Oliveira et al., 2016), carboidratos, minerais e antioxidantes, além de proteínas e estrato etéreo em menor quantidade, que apresentam promissora ação terapêutica, como o comprovado efeito antimicrobiano (Silva et al., 2005; Cavalcanti e Resende, 2007; Pereira et al., 2013; Davet et al., 2009; Brito-Filho et al., 2017)

[0017] Diante do exposto, cactáceas como o mandacaru possuem elevado potencial biotecnológico para a constituição de diluidor seminal livre de produtos de origem animal e com atividade antimicrobiana, capaz de dispensar o uso de antibióticos e da centrifugação do sêmen caprino durante os processos de diluição e criopreservação.

[0018] A caseína do leite é descrita como o principal elemento responsável pela proteção de célula diluída em meios a base de leite e submetidas à criopreservação (Manjunath, 2012).

[0019] A caseína isolada do leite é comercializada sem qualquer risco sanitário (Bergeron e Manjunath, 2006), de modo que sua presença pode possibilitar incremento do potencial protetor do diluidor a base de fruto de mandacaru de forma segura.

[0020] A continuidade nos estudos para o desenvolvimento de um diluidor seminal livre de produtos de origem animal se deve ao fato daqueles, até então desenvolvidos, ainda não possibilitarem a preservação dos gametas de forma tão eficiente quanto os diluidores convencionais, da manutenção do uso de antimicrobianos e da necessidade de remover o plasma seminal para a espécie caprina.

[0021] Com o intuito de solucionar os problemas descritos, que envolvem tanto os riscos relacionados ao uso de diluidores a base de gema de ovo e leite quanto as limitações na preservação da qualidade espermática com diluidores livres de produtos animais anteriormente elaborados, desenvolveu-se a presente invenção.

[0022] A invenção consiste em um diluidor seminal a base de fruto de mandacaru e solução tampão Tris, o qual possui potencial crioprotetor para células espermáticas, com ou sem adição de caseína extraída do leite. Como efeito técnico novo foi obtido um diluidor seminal capaz de preservar e criopreservar os espermatozoides com a mesma eficiência dos meios a base de produtos de origem animal e sem seus riscos e limitações.

[0023] Com base nas pesquisas literárias realizadas, não foram encontrados documentos relatando os ensinamentos apresentados com a presente invenção. Desse modo, a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva perante o estudo da técnica, representando o primeiro pedido de depósito de patente relacionando o uso do mandacaru à biotecnologia da reprodução.

Breve descrição dos desenhos

[0024] A invenção pode ser melhor compreendida através da seguinte descrição, em consonância com as figuras em anexo, onde:

[0025] A FIGURA 1 representa uma visão dos resultados de motilidade total de espermatozoides ovinos diluídos e posteriormente incubados durante duas horas em temperatura ambiente ou refrigerados a 5°C e avaliados nos tempos zero, 24 e 48 horas após atingida a temperatura de refrigeração, sendo G1 o diluidor a base de suco de fruto de mandacaru, G2 o diluidor a base de suco de fruto de mandacaru acrescido de caseína extraída do leite, G3, diluidor de gema de ovo.

[0026] A FIGURA 2 corresponde à motilidade progressiva de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 1.

[0027] A FIGURA 3 representa a linearidade de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 1.

[0028] A FIGURA 4 evidencia a retilinearidade de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 1.

[0029] A FIGURA 5 representa a integridade de membrana de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 1.

[0030] Por sua vez, a FIGURA 6 representa uma visão dos resultados de motilidade total de espermatozoides caprinos diluídos e posteriormente incubados durante 3 horas em temperatura ambiente ou refrigerados a 5°C e avaliados nos tempos zero, 24 e 48 horas após atingida a temperatura de refrigeração, sendo G1 o diluidor a base de suco de fruto de mandacaru, G2 o diluidor a base de suco de fruto de mandacaru acrescido de caseína extraída do leite, G3 o diluidor de gema de ovo adicionado após a remoção do plasma seminal e G4 o diluidor de gema de ovo sem remoção do plasma seminal.

[0031] A FIGURA 7 corresponde à motilidade progressiva de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 6.

[0032] A FIGURA 8 representa a linearidade de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 6.

[0033] A FIGURA 9 evidencia a retilinearidade de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 6.

[0034] A FIGURA 10 representa a integridade de membrana de espermatozoides ovino submetidos às mesmas condições descritas na FIGURA 6.

[0035] Com relação a FIGURA 1, pode-se observar que os diluidores a base de fruto de mandacaru, sem (G1) ou com (G2) adição de caseína, foram tão eficientes extensores e meios criorpotetores de espermatozoides ovinos quanto o meio a base de gema de ovo (G3), com destaque para o acrescido de caseína, embora sem diferença estatística.

[0036] O mesmo se repete na FIGURA 2, referente à motilidade progressiva de espermatozoides ovinos.

[0037] Na FIGURA 3 é demonstrada a eficiência dos diluidores a base de fruto de mandacaru, sem (G1) ou com (G2) adição de caseína, em preservar a linearidade de espermatozoides ovinos neles diluídos e incubados ou criopreservados, em relação ao meio a base de gema de ovo (G3).

[0038] Tal fato é também percebido para a retilinearidade de espermatozoides ovinos, representada na FIGURA 4.

[0039] Na FIGURA 3 é mostrado que os diluidores a base de fruto de mandacaru, sem (G1) ou com (G2) adição de caseína, foram tão eficientes extensores e meios criorpotetores de espermatozoides ovinos quanto o meio a base de gema de ovo (G3) na preservação da integridade da membrana plasmática, particularmente quando enriquecido com caseína.

[0040] Da mesma forma que para o sêmen ovino, por meio da FIGURA 6, percebe-se que os diluidores a base de fruto de mandacaru, sem (G1) ou com (G2) adição de caseína, foram tão eficientes extensores e crioprotetores de espermatozoides caprino quanto o meio a base de gema de ovo (G3 e G4).

[0041] O mesmo é evidenciado na FIGURA 7 para a motilidade progressiva de espermatozoides caprinos, embora de forma mais discreta.

[0042] Na FIGURA 8 é demonstrada a eficiência dos diluidores a base de fruto de mandacaru, sem (G1) ou com (G2) adição de caseína, em preservar a linearidade de espermatozoides caprinos, neles diluídos e incubados ou criopreservados, em relação ao meio a base de gema de ovo (G3 e G4).

[0043] A observação de repete em relação a preservação da retilinearidade dos gametas caprinos, conforme apresentado na FIGURA 9.

[0044] Na FIGURA 10 é mostrado que os diluidores a base de fruto de mandacaru, sem (G1) ou com (G2) adição de caseína, foram tão eficientes extensores e meios crioprotetores de espermatozoides caprinos quanto o meio a base de gema de ovo (G3 e G4), em relação à preservação da integridade da membrana plasmática, embora de forma mais discreta do que para os espermatozoides ovinos.

[0045] Para a espécie caprina se destaca o fato de que os diluidores de base vegetal permitiram a preservação dos espermatozoides sem a necessidade de promover a remoção do plasma seminal por centrifugação, o que é requerido para o emprego de outros diluidores e que pode ser deletério à célula.

[0046] O potencial crioprotetor do diluidor a base de suco de mandacaru pode ser atribuído a sua composição, onde são encontrados, dentre outros, carboidratos como fonte de energia e com atividade crioprotetora para as células, antioxidantes, aminoácidos, minerais e ácidos graxos também favoráveis à integridade estrutural e funcional dos gametas, além de ação antimicrobiana.

[0047] Em adição, o fruto do mandacaru é atóxico o que implica em seu efeito mantenedor dos espermatozoides e favorece o uso deste material em outras biotécnicas, como a inseminação artificial e fertilização in vitro, uma vez que não representa risco para a fêmea inseminada, para o oócito ou embrião

Descrição da invenção

[0048] A presente invenção permite o uso do suco do fruto do mandacaru como diluidor para a conservação de espermatozoides. Sua novidade se baseia no fato de ser um produto novo, livre de elementos de origem animal e, portanto, dos riscos relacionados, que permite a diluição e preservação dos gametas, dada suas vantagens, sem a necessidade da remoção do plasma seminal para a espécie caprina e da adição de antimicrobianos.

[0049] Assim, a fim de solucionar a problemática com os diluidores seminais existentes, seja em termos sanitários ou de capacidade protetora e crioprotetora, foram estabelecidas formulações com frutos de mandacaru, tomando como base a sua bromatologia, com ou sem acréscimo caseína do leite, em virtude do descrito efeito crioprotetor desta última.

[0050] Para alcançar a formulação ideal do diluidor a base de fruto de suco de mandacaru, com ou sem adição de caseína do leite, foram elaborados meios com três diferentes concentrações do material vegetal (50%, 20% e 10%) em solução aquosa de tampão Tris, perfazendo proporções de 1:1, 1:4 e 1:9 (p:v).

[0051] As soluções foram tratadas enzimaticamente com pectinase, para a redução da viscosidade, e filtradas, para a remoção de partículas, em membrana de 22 μm.

[0052] Uma fração de cada meio foi acrescida de 0,05% de caseína do leite e outra não.

[0053] Os diluidores, acrescidos ou não de caseína, tiveram o pH e osmolaridade determinados e corrigidos, conforme a necessidade, para se manterem próximos a 6,8 e 300 mOsm, respectivamente, necessários para a preservação dos espermatozoides.

[0054] Portanto, a invenção consiste em formulação de diluidor seminal a base de suco de fruto de mandacaru, empregado na diluição e criopreservação de espermatozoides, em comparação ao diluidor padrão, comumente empregado, Tris-gema de ovo.

[0055] Formulações de base vegetal:

• 50 g, 20 g ou 10 g de fruto de mandacaru;
• 37,2 mL, 67,2 mL ou 77,2 mL de solução Tris-tampão (3,605 g de Tris-hidroximetilaminometano, 2,024 g de ácido cítrico, 1,488 g de frutose, 100 mL de água);
• 12,8 mL de água destilada estéril;
• 0,05 g de caseína (quando presente).

[0056] Formulação do diluidor padrão a base de gema de ovo, utilizado como controle no estudo de eficácia do diluidor de base vegetal, para a preservação do sêmen:

• 67,2 mL de solução Tris-tampão;
• 20 mL de gema de ovo;
• 12,8 mL de água destilada estéril;
• 100 UI de penicilina e 50 mg de estreptomicina.

[0057] Para a congelação do sêmen, tanto em diluidor padrão quanto em diluidor de base vegetal, faz-se necessária a adição de crioprotetor penetrante. A escolha dele ou de associações, bem como da concentração, depende da espécie animal a que se destine.

Exemplos de concretizações da invenção

[0058] Os diluidores elaborados com frutos de mandacaru e acrescidos ou não de caseína do leite foram empregados como extensores e meios crioprotetores espermáticos, em comparação ao diluidor padrão Tris-gema de ovo.

[0059] Para esta finalidade foram realizadas colheitas de sêmen de três reprodutores ovinos e três caprinos, alocados na Estação Experimental de Pequenos Animais de Carpina (EEPAC - UFRPE), localizada no município de Carpina, Pernambuco, Brasil.

[0060] As colheitas de sêmen foram realizadas através de vagina artificial, empregando-se uma fêmea como manequim.

[0061] Os ejaculados avaliados subjetivamente quanto à motilidade, vigor e turbilhonamento e aprovados foram destinados à formação de pools seminais, os quais foram fracionados e diluídos, conforme os diferentes diluidores a serem comparados (50% de fruto de mandacaru, 50% de fruto de mandacaru acrescido de caseína, 20% de fruto de mandacaru, 20% de fruto de mandacaru acrescido de caseína, 10% de fruto de mandacaru, 10% de fruto de mandacaru acrescido de caseína, Tris-gema de ovo).

[0062] A concentração final de espermatozoides, após diluição, foi 100x106 espermatozoides por mL.

[0063] Para a espécie caprina, as amostras seminais foram diluídas em Tris-gema com e sem a remoção prévia do plasma seminal, enquanto a diluição em meios de base vegetal se procedeu sem a remoção do plasma seminal.

[0064] Uma fração das amostras seminais, diluídas nos diferentes meios, foram incubadas à temperatura ambiente (± 28°C) por duas horas para a espécie ovina ou três horas para a espécie caprina, enquanto que outra porção foi refrigerada.

[0065] Ao final das duas ou três horas de incubação (± 28°C) e nos momentos zero, 24 e 48 horas de refrigeração a 5°C, alíquotas foram avaliadas quanto a cinética espermática e integridade de membrana plasmática. As avaliações dos parâmetros espermáticos foram realizadas no laboratório de Andrologia (ANDROLAB), localizado na UFRPE, cidade de Recife, Pernambuco, Brasil.

[0066] A cinética espermática foi determinada através de análise objetiva em sistema de análise computadorizada, o CASA. Por sua vez, a integridade de membrana plasmática foi avaliada por meio de dupla coloração com os fluorocromos iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína, em microscópio de epifluorescência.

[0067] A partir das avaliações foi possível confirmar o potencial protetor e crioprotetor dos diluidores a base de fruto de mandacaru, os quais se mostraram tão eficientes quanto o diluidor padrão Tris-gema de ovo, na preservação e criopreservação dos espermatozoides, com destaque para a formulação com 10% do fruto de mandacaru.

[0068] Para a espécie caprina, os resultados obtidos demonstraram que o diluidor a base de suco de mandacaru é uma alternativa viável para eliminar a necessidade de remover o plasma seminal. Tal fato pode estar relacionado a baixa concentração de proteínas e padrão lipídico na constituição do vegetal e, portanto, de substrato para a ação da fosfolipase A, do que resultariam agentes tóxicos às células.

[0069] Portanto, em uma realidade preferencial, a concentração ideal de fruto de mandacaru é a de 10% (10 g de fruto de mandacaru, 77,2 g de solução Tris-tampão, 12,8 ml de água. pH 6,8 e osmolaridade aproximada de 300 mOsm), podendo ser adicionado ou não de 0,05% (0,05 g) de caseína, a depender da espécie.

[0070] A formulação do diluidor com 10% de cacto se mostrou como preferencial em virtude de os resultados obtidos evidenciarem que a preservação espermática com o seu uso é equiparada à observada com a do diluidor padrão Tris-gema de ovo, com maior constância (maior repetitividade), além de ser um meio de mais fácil elaboração e que propicia a realização das análises espermáticas, o que decorre de sua menor turbidez e reduzida presença de debris, em relação aos demais meios empregados.

[0071] Os resultados comparativos entre os grupos experimentais testados e constituintes deste pedido de patente podem ser observados na TABELA 1, para a espécie ovina, e na TABELA 2, para a espécie caprina.

[0072] TABELA 1 Médias e erros padrões dos valores porcentuais de motilidade total e progressiva, linearidade, retilinearidade e integridade da membrana de espermatozoides ovinos diluídos em meios à base de suco de frutos de mandacaru (acrescido ou não de caseína) ou Tris-gema de ovo, em diferentes temperaturas e tempos de incubação

G1: diluidores a base de fruto de mandacaru a 50%; G2: diluidores a base de fruto de mandacaru 50% acrescido de 0,05g de caseína; G3: diluidores a base de fruto de mandacaru a 20%; G4: diluidores a base de fruto de mandacaru 20% acrescido de 0,05g de caseína; G5: diluidores a base de fruto de mandacaru 10%; G6: diluidores a base de fruto de mandacaru 10% acrescido de 0,05g de caseína; G7: diluidores Tris-gema.

[0073] TABELA 2 Médias e erros padrões dos valores porcentuais de motilidade total e progressiva, linearidade, retilinearidade e integridade da membrana de espermatozoides caprinos diluídos em meios à base de suco de frutos de mandacaru (acrescido ou não de caseína) ou Tris-gema de ovo, em diferentes temperaturas e tempos de incubação

G1: diluidores a base de fruto de mandacaru a 50%; G2: diluidores a base de fruto de mandacaru 50% acrescido de 0,05g de caseína; G3: diluidores a base de fruto de mandacaru a 20%; G4: diluidores a base de fruto de mandacaru 20% acrescido de 0,05g de caseína; G5: diluidores a base de fruto de mandacaru 10%; G6: diluidores a base de fruto de mandacaru 10% acrescido de
0,05g de caseína; G7: diluidores Tris-gema com prévia remoção do plasma seminal; G8: diluidor Tris-gema sem prévia remoção do plasma seminal.

[0074] Por meio do exposto, o diluidor formulado com 10% do fruto de mandacaru, com ou sem adição de caseína, é o que melhor se presta a diluição e criopreservação de espermatozoides, apresentando resultados tão favoráveis quanto o meio padrão a base de gema de ovo.

[0075] Além disso, os achados para os parâmetros espermáticos preservados e criopreservados nas formulações a base de suco fruto de mandacaru são superiores aos encontrados para outros meios diluidores seminais desenvolvidos, como é o caso dos de água de coco (BR 102014016754-4 A2; BR102015019457-9A2) e soja (WO02054864A1). Em adição, alguns dos meios desenvolvidos mantêm ainda a necessidade de adição da gema de ovo à sua constituição para a melhor manutenção e proteção das células (BR102015019457-9A2).

[0076] Pelo exposto, com os diluidores até então elaborados permanecem as limitações ligadas a capacidade de preservação dos gametas, risco sanitário, necessidade do emprego de antimicrobianos e de remoção do plasma seminal de espécies como a caprina.

[0077] Dessa forma, a presente invenção soluciona problemáticas envolvendo os meios diluidores destinados, à extensão e criopreservação espermática, além de apresentar potencial para ser usado com outras biotecnologias da reprodução e tipos celulares.

Claims

PROCESSO DE CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN E DILUIDOR A BASE DE SUCO DE FRUTO DO MANDACARU (Cereus jamacaru), caracterizado por ser enriquecido ou não com caseína do leite, com aplicação em biotecnologias da reprodução, como a diluição e criopreservação de espermatozoides.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter de 10 a 50% de fruto de mandacaru em sua composição.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter entre 37,2 mL e 77,2 mL de solução Tris-tampão (3,605 g de Tris-hidroximetilaminometano, 2,024 g de ácido cítrico, 1,488 g de frutose, 100 mL de água) e 12,8 mL de água destilada estéril em sua composição, perfazendo proporções de 1:1, 1:4 e 1:9 (p:v).
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter ou não 0,05 g de caseína em sua composição.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter tratamento enzimático por pectinase.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por filtração em membrana de 22 μm.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por correção do pH e osmolaridade, conforme a necessidade, para próximos a 6,8 e 300 mOsm, respectivamente, preferencialmente com hidróxido de sódio e cloreto de sódio.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por não conter produtos de origem animal que implique em riscos sanitários.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por não conter antibiótico.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter crioprotetores penetrantes, preferencialmente 5% a 7% de glicerol, quando destinado à congelação celular.
PRODUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por excluir a necessidade de remoção do plasma seminal caprino por centrifugação, previamente ao seu uso.