BR102020025938A2

BR102020025938A2 - GENETICALLY MODIFIED MICRO-ORGANISMS, EUKARYOTIC CELL TRANSFORMATION PROCESS, PRODUCTION PROCESS OF BIOLOGICAL PRODUCTS AND USE OF GENETICALLY MODIFIED MICRO-ORGANISMS

Info

Publication number: BR102020025938A2
Application number: BR102020025938-5A
Authority: BR
Inventors: Leandro Vieira Dos Santos; Gisele Cristina De Lima
Original assignee: Cnpem - Centro Nacional De Pesquisa Em Energia E Materiais
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2022-06-28

Abstract

A presente invenção descreve microrganismos modificados geneticamente com a deleção dos genes BSD2 e/ou SSQ1, ou modificações que levem a perda ou diminuição da função dos respectivos genes, em que os microrganismos são capazes de consumir rapidamente xilose e produzir etanol eficientemente em um processo fermentativo. Em uma concretização, o microrganismo geneticamente modificado é do gênero Saccharomyces. A presente invenção se situa nos campos da Biotecnologia e Engenharia Bioquímica.The present invention describes genetically modified microorganisms with the deletion of the BSD2 and/or SSQ1 genes, or modifications that lead to the loss or decrease of the function of the respective genes, in which the microorganisms are able to rapidly consume xylose and produce ethanol efficiently in a fermentation process. . In one embodiment, the genetically modified microorganism is of the genus Saccharomyces. The present invention is in the fields of Biotechnology and Biochemical Engineering.

Description

GENETICALLY MODIFIED MICRO-ORGANISMS, EUKARYOTIC CELL TRANSFORMATION PROCESS, PRODUCTION PROCESS OF BIOLOGICAL PRODUCTS AND USE OF GENETICALLY MODIFIED MICRO-ORGANISMS

Field of Invention

[0001] A presente invenção descreve microrganismos modificados geneticamente com a deleção dos genes BSD2 e/ou SSQ1, tornando os microrganismos capazes de consumir rapidamente xilose e produzir etanol eficientemente em um processo fermentativo. Tais microrganismos são especialmente úteis na conversão de açúcares em produtos biológicos.[0001] The present invention describes microorganisms genetically modified with the deletion of the BSD2 and/or SSQ1 genes, making the microorganisms able to rapidly consume xylose and efficiently produce ethanol in a fermentation process. Such microorganisms are especially useful in converting sugars into biological products.

Background of the Invention

[0002] Produtos biorrenováveis, tais como biocombustíveis e bioquímicos de segunda geração (2G), utilizam como matéria-prima a biomassa lignocelulósica para a sua produção, como o bagaço e palha da cana de açúcar, sendo esta forma uma alternativa de desenvolvimento mais sustentável quando comparada aos compostos de origem fóssil. Constituída basicamente por celulose (35-50%), hemicelulose (20-35%) e lignina (10-25%), a biomassa precisa passar por uma fase de pré-tratamento e hidrólise enzimática para que os açúcares presentes nas cadeias celulósicas e hemicelulósicas da parede vegetal sejam disponibilizados para o processo de fermentação. Após a desconstrução da celulose, moléculas de glicose são liberadas e convertidas em etanol pela levedura tradicionalmente utilizada para a produção em larga escala de etanol, a Saccharomyces cerevisiae. Porém, a hidrólise da hemicelulose produz pentoses (C5), como a xilose, o segundo açúcar mais abundante na biomassa lignocelulósica, que não são naturalmente fermentadas pela levedura S. cerevisiae. Por possuir uma significativa parcela na constituição da biomassa, a conversão eficiente de xilose é um dos grandes desafios para a viabilidade econômica da produção de biorrenováveis 2G.[0002] Biorenewable products, such as second generation (2G) biofuels and biochemicals, use lignocellulosic biomass as raw material for their production, such as sugarcane bagasse and straw, which is an alternative for more sustainable development. when compared to compounds of fossil origin. Basically constituted by cellulose (35-50%), hemicellulose (20-35%) and lignin (10-25%), the biomass needs to go through a pre-treatment and enzymatic hydrolysis phase so that the sugars present in the cellulosic chains and hemicellulosic cells from the plant wall are made available for the fermentation process. After the deconstruction of cellulose, glucose molecules are released and converted into ethanol by the yeast traditionally used for the large-scale production of ethanol, Saccharomyces cerevisiae. However, the hydrolysis of hemicellulose produces pentoses (C5), such as xylose, the second most abundant sugar in lignocellulosic biomass, which are not naturally fermented by the yeast S. cerevisiae. As it has a significant share in the constitution of biomass, the efficient conversion of xylose is one of the great challenges for the economic viability of the production of 2G biorenewables.

[0003] Visando a construção de linhagens recombinantes de S. cerevisiae capazes de metabolizar eficientemente essa pentose, a engenharia metabólica de leveduras adota usualmente duas estratégias: introdução de genes codificadores das enzimas Xilose Redutase (XR) e Xilitol Desidrogenase (XDH), responsáveis pela via de oxi-redução, ou a inserção do gene xylA que codifica uma Xilose Isomerase (XI). Enquanto a isomeração da xilose para a xilulose através da xyIA requer somente uma etapa, a via das oxidoredutases XR/XDH requer dois passos: redução da xilose a xilitol pela XR e oxidação do xilitol a xilulose pela XDH. A xilulose gerada como produto de ambas as vias é naturalmente convertida a xilulose-5-fosfato pela xiluloquinase (XK), sendo capaz de entrar na via das Pentoses Fosfato (PPP) e seguir pela glicólise, produzindo etanol.[0003] Aiming at the construction of recombinant strains of S. cerevisiae capable of efficiently metabolizing this pentose, the metabolic engineering of yeasts usually adopts two strategies: introduction of genes encoding the enzymes Xylose Reductase (XR) and Xylitol Dehydrogenase (XDH), responsible for the oxidation-reduction pathway, or the insertion of the xylA gene that encodes a Xylose Isomerase (XI). While the isomeration of xylose to xylulose via xyIA requires only one step, the XR/XDH oxidoreductase pathway requires two steps: reduction of xylose to xylitol by XR and oxidation of xylitol to xylulose by XDH. The xylulose generated as a product of both pathways is naturally converted to xylulose-5-phosphate by xylulokinase (XK), being able to enter the Pentoses Phosphate (PPP) pathway and proceed through glycolysis, producing ethanol.

[0004] Além de uma etapa a mais, a utilização das enzimas XR/XDH possui um desbalanço de cofatores e resulta no acúmulo de xilitol, principalmente sobre condições anaeróbicas onde não há a completa reoxidação de NAD+, implicando na redução do crescimento, da capacidade fermentativa e, consequentemente, do volume total de etanol produzido. Além do xilitol, outro subproduto formado é o glicerol, devido a reoxidação do excesso de NADH via XDH.[0004] In addition to one more step, the use of XR/XDH enzymes has an imbalance of cofactors and results in the accumulation of xylitol, mainly under anaerobic conditions where there is no complete reoxidation of NAD+, implying in the reduction of growth, of the capacity fermentation and, consequently, of the total volume of ethanol produced. In addition to xylitol, another by-product formed is glycerol, due to the reoxidation of excess NADH via XDH.

[0005] A via que utiliza a enzima xilose isomerase não requer cofatores e resulta em uma menor produção de xilitol pela levedura. Consequentemente, a produção de etanol é maior, sendo uma via mais atrativa para a conversão de xilose em xilulose. Contudo, a baixa atividade enzimática da XI na levedura é um dos obstáculos enfrentados durante a fermentação de xilose. Diversos estudos descritos na literatura demonstraram que o aumento da atividade da XI pode ser feito pela otimização de códons, superexpressão ou aumento do número de cópias da xylA, garantindo uma atividade enzimática suficiente para que possibilite o processo de isomerização eficiente de xilose, resultando no maior consumo de xilose pela levedura. Além das modificações genéticas necessárias para a inserção do gene que codifica a enzima XI, o xylA, a construção de uma cepa com eficiente capacidade fermentativa necessita da superexpressão de genes endógenos responsáveis pela codificação da enzima Xiluloquinase (XKS1) e das enzimas da vias das pentoses-fosfato Transaldolase (TAL1), Transcetolase (TKL1), Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1), sob a ação de promotores fortes e constitutivos de S. cerevisiae. A deleção do gene GRE3, que codifica uma aldose redutase, também se demonstrou necessário para diminuir a formação de xilitol.[0005] The pathway that uses the enzyme xylose isomerase does not require cofactors and results in a lower production of xylitol by the yeast. Consequently, ethanol production is higher, being a more attractive route for the conversion of xylose to xylulose. However, the low enzyme activity of XI in yeast is one of the obstacles faced during xylose fermentation. Several studies described in the literature have shown that the increase in XI activity can be done by codon optimization, overexpression or increase in the number of copies of xylA, ensuring a sufficient enzymatic activity to enable the process of efficient isomerization of xylose, resulting in the highest consumption of xylose by the yeast. In addition to the genetic modifications necessary for the insertion of the gene that encodes the XI enzyme, xylA, the construction of a strain with efficient fermentative capacity requires the overexpression of endogenous genes responsible for encoding the enzyme Xylulokinase (XKS1) and the enzymes of the pentose pathway. -phosphate Transaldolase (TAL1), Transketolase (TKL1), Ribose 5-Phosphate Isomerase (RKI1) and Ribose 5-Phosphate Epimerase (RPE1), under the action of strong and constitutive S. cerevisiae promoters. Deletion of the GRE3 gene, which encodes an aldose reductase, was also shown to be necessary to decrease xylitol formation.

[0006] Após a inserção das modificações descritas, a linhagem é capaz de metabolizar a xilose. Entretanto, a cepa desenvolvida apresenta uma velocidade de consumo da xilose muito lenta inicialmente. Procedimentos de engenharia evolutiva sob condições anaeróbicas foram adotadas juntamente com a engenharia metabólica para a criação de leveduras que apresentem uma fermentação mais rápida de xilose e possíveis novos marcadores gênicos que possam ser utilizados para a construção racional de leveduras geneticamente modificadas. No entanto, processos de evolução adaptativa requerem muitas vezes longos períodos para serem concluídos.[0006] After the insertion of the described modifications, the strain is able to metabolize xylose. However, the developed strain presents a very slow consumption rate of xylose initially. Evolutionary engineering procedures under anaerobic conditions were adopted together with metabolic engineering to create yeasts that present a faster xylose fermentation and possible new gene markers that can be used for the rational construction of genetically modified yeasts. However, adaptive evolution processes often require long periods of time to complete.

[0007] A identificação de novos alvos gênicos que aumentam a produtividade e que possam ser utilizados para a construção racional de microrganismos com alta capacidade fermentativa de açúcares C5, como a xilose, é um campo de grande interesse científico e tecnológico na área dos produtos biológicos renováveis.[0007] The identification of new gene targets that increase productivity and that can be used for the rational construction of microorganisms with high fermentative capacity of C5 sugars, such as xylose, is a field of great scientific and technological interest in the area of biological products. renewable.

Summary of the Invention

[0008] Dessa forma, a presente invenção resolve os problemas do estado da técnica a partir de microrganismos modificados geneticamente com a deleção dos genes BSD2 e/ou SSQ1, em que os microrganismos são capazes de consumir rapidamente xilose e produzir etanol eficientemente em um processo fermentativo.[0008] Thus, the present invention solves the problems of the state of the art from genetically modified microorganisms with the deletion of the BSD2 and/or SSQ1 genes, in which the microorganisms are able to rapidly consume xylose and produce ethanol efficiently in a process fermentation.

[0009] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta um microrganismo geneticamente modificado compreendendo o gene BSD2, SSQ1 ou ambos, inativado e/ou deletado ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional.[0009] In a first object, the present invention presents a genetically modified microorganism comprising the BSD2 gene, SSQ1 or both, inactivated and/or deleted or containing mutation that decreases expression levels or functional activity.

[0010] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta um processo de transformação de célula eucariótica compreendendo a inativação, deleção ou mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional de pelo menos um gene BSD2, SSQ1 ou ambos.[0010] In a second object, the present invention presents a process of eukaryotic cell transformation comprising the inactivation, deletion or mutation that decreases expression levels or functional activity of at least one BSD2 gene, SSQ1 or both.

[0011] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta o uso de um microorganismo geneticamente modificado compreendendo o gene BSD2, SSQ1 ou ambos, inativado e/ou deletado ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional para a produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.[0011] In a third object, the present invention presents the use of a genetically modified microorganism comprising the BSD2 gene, SSQ1 or both, inactivated and/or deleted or containing mutation that decreases expression levels or functional activity for the production of biofuels and /or biochemicals.

[0012] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta um processo de produção de produtos biológicos compreendendo uma etapa de cultivo de um microrganismo geneticamente modificado compreendendo o gene BSD2, SSQ1 ou ambos, inativado, deletado ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional.[0012] In a fourth object, the present invention presents a process for the production of biological products comprising a step of cultivating a genetically modified microorganism comprising the BSD2 gene, SSQ1 or both, inactivated, deleted or containing a mutation that decreases expression levels or functional activity.

[0013] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.[0013] These and other objects of the invention will be immediately appreciated by those skilled in the art and will be described in detail below.

Brief Description of Figures

[0014] São apresentadas as seguintes figuras:[0014] The following figures are presented:

[0015] Figura 1. Função celular das proteínas codificadas pelos genes BSD2 e SSQ1. A - Os transportadores Smf1 e Smf2 (representados por Smfp) são marcados para a degradação vacuolar pela enzima Rsp5, uma ubiquitina ligase, que depende da interação com as proteínas adaptadoras Bsd2p e Trep (Trep1 e Tre2p) para o reconhecimento e adição de ubiquitinas (Ub) para o processo de ubiquitinação dos transportadores Smfp. B - Após a síntese de novo dos Centros de Ferro-Enxofre (Fe/S) na proteína base Isu1p, a chaperona Ssq1p é responsável, juntamente com outras proteínas acessórias, pela interação com a Isu1p que resultará na transferência dos Centros Fe/S para a proteína Grx5p, a qual ajudará na entrega dos Centros Fe/S para as apoproteínas mitocondriais.[0015] Figure 1. Cellular function of proteins encoded by the BSD2 and SSQ1 genes. A - The transporters Smf1 and Smf2 (represented by Smfp) are targeted for vacuolar degradation by the enzyme Rsp5, a ubiquitin ligase, which depends on the interaction with the adapter proteins Bsd2p and Trep (Trep1 and Tre2p) for the recognition and addition of ubiquitins ( Ub) for the ubiquitination process of Smfp transporters. B - After the de novo synthesis of Iron-Sulphur (Fe/S) Centers in the base protein Isu1p, the Ssq1p chaperone is responsible, together with other accessory proteins, for the interaction with Isu1p that will result in the transfer of the Fe/S Centers to the Grx5p protein, which will assist in the delivery of Fe/S Centers to mitochondrial apoproteins.

[0016] Figura 2 - Confirmação da deleção dos genes BSD2 e SSQ1. A - Amplificação das regiões externas ao cassete inserido. O fragmento gerado pelas linhagens mutantes B1 e B2 possui 2122 pb, enquanto a linhagem parental C5TY apresenta um amplicon com 1318 pb. B - A reação 1 demonstra a amplificação das regiões externas ao cassete inserido. O fragmento gerado pela linhagem mutante possui 2285 pb, enquanto a linhagem parental C5TY apresenta um amplicon com 2468 pb. A reação 2 demonstra a amplificação de uma região interna ao cassete inserido, onde a presença do fragmento só ocorre na linhagem mutante. M - Marcador 1kb; B1 - Mutante bsd2∆ 1; B2 -Mutante bsd2∆ 2; S - Mutante ssq1∆; C - C5TY reação 1; Br - Branco da reação.[0016] Figure 2 - Confirmation of the deletion of the BSD2 and SSQ1 genes. A - Amplification of regions external to the inserted cassette. The fragment generated by the mutant strains B1 and B2 has 2122 bp, while the parental strain C5TY has an amplicon with 1318 bp. B - Reaction 1 demonstrates the amplification of regions external to the inserted cassette. The fragment generated by the mutant strain has 2285 bp, while the parental strain C5TY has an amplicon with 2468 bp. Reaction 2 demonstrates the amplification of a region internal to the inserted cassette, where the presence of the fragment only occurs in the mutant strain. M - 1kb marker; B1 - Mutant bsd2∆ 1; B2 -Mutant bsd2∆ 2; S - Mutant ssq1∆; C - C5TY reaction 1; Br - Reaction white.

[0017] Figura 3 - Performance fermentativa da linhagem com deleção no gene SSQ1. A performance fermentativa da linhagem ssq1∆ foi avaliada em relação ao controle (C5TY) segundo o consumo de xilose (linha contínua) e produção de etanol (linha pontilhada) em meio YP com 50g/L de xilose como única fonte de carbono. A fermentação foi realizada em triplicata e o desvio padrão em relação à média está representado por barras de erro no gráfico.[0017] Figure 3 - Fermentation performance of the strain with deletion in the SSQ1 gene. The fermentative performance of the ssq1∆ strain was evaluated in relation to the control (C5TY) according to xylose consumption (continuous line) and ethanol production (dotted line) in YP medium with 50g/L of xylose as the only carbon source. Fermentation was performed in triplicate and the standard deviation from the mean is represented by error bars on the graph.

[0018] Figura 4 - Performance fermentativa da linhagem com deleção no gene BSD2. A performance fermentativa da linhagem bsd2∆ foi avaliada em relação ao controle (C5TY) segundo o consumo de xilose (linha contínua) e produção de etanol (linha pontilhada) em meio YP com 50g/L de xilose como única fonte de carbono. A fermentação foi realizada em triplicata e o desvio padrão em relação à média está representado por barras de erro no gráfico.[0018] Figure 4 - Fermentative performance of the strain with BSD2 gene deletion. The fermentative performance of the bsd2∆ strain was evaluated in relation to the control (C5TY) according to xylose consumption (continuous line) and ethanol production (dotted line) in YP medium with 50g/L of xylose as the only carbon source. Fermentation was performed in triplicate and the standard deviation from the mean is represented by error bars on the graph.

Detailed Description of the Invention

[0019] Os processos de fermentação de materiais celulósicos atuais ainda são muito demorados ou pouco eficientes, principalmente, devido à dificuldade dos microrganismos em metabolizar a xilose, um dos principais açúcares presentes em materiais celulósicos.[0019] The fermentation processes of current cellulosic materials are still very time consuming or inefficient, mainly due to the difficulty of microorganisms in metabolizing xylose, one of the main sugars present in cellulosic materials.

[0020] Desta forma, a presente invenção apresenta microrganismos com mutações que melhoram a velocidade do consumo de xilose. As mutações realizadas na presente invenção compreendem inativação e/ou deleção ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional dos genes BSD2 e SSQ1, aumentando significativamente a fermentação de xilose.[0020] In this way, the present invention presents microorganisms with mutations that improve the rate of xylose consumption. The mutations carried out in the present invention comprise inactivation and/or deletion or containing mutation that decreases expression levels or functional activity of the BSD2 and SSQ1 genes, significantly increasing xylose fermentation.

[0021] O gene BSD2 é responsável pela codificação de uma proteína necessária para a regulação pós-transcricional dos transportadores de metais pesados Smf1p e Smf2p, atuando na marcação dessas proteínas para degradação. As proteínas Smf1p e Smf2p são membros da família de transportadores Nramp e estão localizadas na superfície celular e nas vesículas intracelulares, estando relacionadas ao transporte de manganês, cádmio, cobre e cobalto. Ambos os transportadores possuem a sua regulação especialmente dirigida pelos níveis de manganês intracelular. Em condições fisiológicas, onde há níveis estáveis de manganês, o processo de proteólise desses transportadores é dependente da ubiquitinação pela Ubiquitina Ligase (E3) Rsp5p. Contudo, os transportadores Smf1p e Smf2p não possuem os domínios de reconhecimento da Rsp5p e necessitam de proteínas adaptadoras para que ocorra o processo de ubiquitinação. Entre as proteínas adaptadoras requeridas, está o produto do gene BSD2. A proteína Bsd2p possui os domínios de ligação necessários para o reconhecimento da Rsp5p, com a qual forma, inicialmente, um complexo essencial para a conexão da Ubiquitina Ligase aos transportadores Smf1p e Smf2p. Além da proteína Bsd2p, a ubiquitinação Rsp5p-dependente desses transportadores requer a ação das proteínas adaptadoras Trep (Tre1p e Tre2p) (Figura 1A). Quando há a deleção do gene BSD2, a célula apresenta um aumento do nível intracelular de cádmio, cobre, cobalto e manganês ocasionado pela estabilidade dos transportadores Smf1p e Smf2p nas membranas da superfície celular e das vesículas intracelulares, respectivamente.[0021] The BSD2 gene is responsible for encoding a protein necessary for the post-transcriptional regulation of the heavy metal transporters Smf1p and Smf2p, acting in the tagging of these proteins for degradation. The Smf1p and Smf2p proteins are members of the Nramp transporters family and are located on the cell surface and in intracellular vesicles, being related to the transport of manganese, cadmium, copper and cobalt. Both transporters have their regulation especially driven by intracellular manganese levels. Under physiological conditions, where there are stable levels of manganese, the process of proteolysis of these transporters is dependent on ubiquitination by Ubiquitin Ligase (E3) Rsp5p. However, Smf1p and Smf2p transporters do not have the Rsp5p recognition domains and need adapter proteins for the ubiquitination process to occur. Among the adapter proteins required is the product of the BSD2 gene. The Bsd2p protein has the binding domains necessary for the recognition of Rsp5p, with which it initially forms an essential complex for the connection of Ubiquitin Ligase to the Smf1p and Smf2p transporters. In addition to the Bsd2p protein, Rsp5p-dependent ubiquitination of these transporters requires the action of the adapter proteins Trep (Tre1p and Tre2p) (Figure 1A). When the BSD2 gene is deleted, the cell presents an increase in the intracellular level of cadmium, copper, cobalt and manganese caused by the stability of the Smf1p and Smf2p transporters in the cell surface membranes and intracellular vesicles, respectively.

[0022] O gene SSQ1, cuja deleção aqui também relatada, codifica uma proteína chaperona mitocondrial da família Hsp70 envolvida na biogênese dos Centros de Ferro-Enxofre (Fe/S) mitocondriais e na homeostase de metais. Em conjunto com outras proteínas chaperonas que compreendem o sistema de síntese de novo dos Centros Fe/S, Ssq1p interage com a proteína utilizada como base para a construção do Centros Fe/S, Isu1p, e atua na transferência dos recém-sintetizados Centros Fe/S da proteína Isu1p para a proteína Grx5p, a qual será uma das proteínas responsáveis pela entrega dos centros [2Fe-2S] para as proteínas mitocondriais (Figura 1B). A deleção do gene SSQ1 leva ao acúmulo de ferro mitocondrial e possivelmente de Centros de Fe/S na proteína Isu1p, além de estar relacionada ao aumento da captação de ferro celular pelas linhagens mutantes.[0022] The SSQ1 gene, whose deletion also reported here, encodes a mitochondrial chaperone protein of the Hsp70 family involved in the biogenesis of mitochondrial Iron-Sulphur (Fe/S) Centers and in metal homeostasis. In conjunction with other chaperone proteins that comprise the de novo synthesis system of the Fe/S Centers, Ssq1p interacts with the protein used as a basis for the construction of the Fe/S Centers, Isu1p, and acts on the transfer of the newly synthesized Fe/S Centers S from the Isu1p protein to the Grx5p protein, which will be one of the proteins responsible for delivering the [2Fe-2S] centers to the mitochondrial proteins (Figure 1B). The deletion of the SSQ1 gene leads to the accumulation of mitochondrial iron and possibly of Fe/S Centers in the Isu1p protein, in addition to being related to the increase in cellular iron uptake by the mutant strains.

[0023] Foi observado que mutações na homeostase de metais envolvendo a perda da função da proteína Isu1p e proteínas da via HOG (Ssk2p e Hog1p), relacionadas ao acúmulo de ferro intracelular, levou a um significativo aumento na fermentação de xilose. Dos Santos et al. (2016) relacionou o aumento de ferro intracelular com a atividade da XI, demonstrando que a suplementação de ferro foi capaz de elevar a atividade enzimática. De modo semelhante, Verhoeven et al. (2017) descreveu que a deleção do PMR1, um transportador de cálcio e manganês localizado na membrana do complexo de golgi, elevou a concentração intracelular de manganês e aumentou a atividade da XI.[0023] It was observed that mutations in metal homeostasis involving the loss of function of the Isu1p protein and proteins of the HOG pathway (Ssk2p and Hog1p), related to intracellular iron accumulation, led to a significant increase in xylose fermentation. Dos Santos et al. (2016) related the increase in intracellular iron with XI activity, demonstrating that iron supplementation was able to increase enzyme activity. Similarly, Verhoeven et al. (2017) described that the deletion of PMR1, a calcium and manganese transporter located in the membrane of the golgi complex, raised the intracellular concentration of manganese and increased the activity of XI.

[0024] Dessa forma, a presente invenção apresenta microrganismos geneticamente modificados com a inativação e/ou deleção dos genes BSD2 e SSQ1, aumentando a metabolização de xilose e, consequentemente, a produção de produtos biológicos como o etanol.[0024] Thus, the present invention presents genetically modified microorganisms with the inactivation and/or deletion of the BSD2 and SSQ1 genes, increasing the metabolism of xylose and, consequently, the production of biological products such as ethanol.

[0025] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta um microrganismo geneticamente modificado compreendendo o gene BSD2, SSQ1 ou ambos, inativado e/ou deletado ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional.[0025] In a first object, the present invention presents a genetically modified microorganism comprising the BSD2 gene, SSQ1 or both, inactivated and/or deleted or containing mutation that decreases expression levels or functional activity.

[0026] Em uma concretização, o microrganismo geneticamente modificado compreende adicionalmente pelo menos uma das seguintes modificações genéticas:

a) Expressão do gene otimizado que codifica a proteína Xilose Isomerase (xylA);
b) Deleção do gene GRE3, que codifica uma Aldose Redutase;
c) Adição de pelo menos uma cópia adicional, ou aumento dos níveis de expressão do gene XKS1, que codifica uma Xiluloquinase;
d) Adição de pelo menos uma cópia adicional, ou aumento dos níveis de expressão dos genes codificadores das enzimas da via das pentose-fosfato Transcetolase (TKL1), Transaldolase (TAL1), Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1); e em que todos os genes adicionados/otimizados são funcionais em células eucarióticas e compreendem pelo menos uma sequência promotora de expressão.

[0026] In one embodiment, the genetically modified microorganism additionally comprises at least one of the following genetic modifications:

a) Expression of the optimized gene encoding the protein Xylose Isomerase (xylA);
b) Deletion of the GRE3 gene, which encodes an Aldose Reductase;
c) Addition of at least one additional copy, or increase in expression levels, of the XKS1 gene, which encodes a Xylulokinase;
d) Addition of at least one additional copy, or increase in the expression levels of the genes encoding the enzymes of the pentose-phosphate pathway Transketolase (TKL1), Transaldolase (TAL1), Ribose 5-Phosphate Isomerase (RKI1) and Ribose 5-Phosphate Epimerase (RPE1); and wherein all added/optimized genes are functional in eukaryotic cells and comprise at least one expression-promoting sequence.

[0027] Em uma concretização, o microrganismo geneticamente modificado é uma levedura. Em uma concretização, o microrganismo é Spathaspora passalidarum, Spathaspora arborariae, Spathaspora sp., Scheffersomyces stipitis, Pichia sp., Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces sp., Meyrozyma guilliermondii, Meyrozyma sp., Candida sp., C. tropicalis, C, tenuis, C. shehatae, C. intermedia, Schizosaccharomyces pombe, Debaryomyces sp., Yarrowia sp., Saccharomyces cerevisiae. Em uma concretização, o microrganismo é Saccharomyces cerevisiae.[0027] In one embodiment, the genetically modified microorganism is a yeast. In one embodiment, the microorganism is Spathaspora passalidarum, Spathaspora arborariae, Spathaspora sp., Scheffersomyces stipitis, Pichia sp., Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces sp., Meyrozyma guilliermondii, Meyrozyma sp., Candida sp., C. tropicalis, C tenuis, C. shehatae, C. intermedia, Schizosaccharomyces pombe, Debaryomyces sp., Yarrowia sp., Saccharomyces cerevisiae. In one embodiment, the microorganism is Saccharomyces cerevisiae.

[0028] No presente pedido de patente entende-se que a mutação que diminui a expressão do gene BSD2, SSQ1 ou ambos, pode ser uma deleção, substituição, translocação ou inversão. Ainda, esta mutação diminui a expressão do gene em até 100%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 90%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 85%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 80%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 75%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 70%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 65%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 60%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 55%. Em uma concretização, a mutação diminui a expressão do gene em até 50%.[0028] In the present patent application it is understood that the mutation that decreases the expression of the BSD2 gene, SSQ1 or both, can be a deletion, substitution, translocation or inversion. Furthermore, this mutation decreases gene expression by up to 100%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 90%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 85%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 80%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 75%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 70%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 65%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 60%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 55%. In one embodiment, the mutation decreases gene expression by up to 50%.

[0029] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta um processo de transformação de célula eucariótica compreendendo a inativação, deleção ou mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional de pelo menos um gene BSD2, SSQ1 ou ambos.[0029] In a second object, the present invention presents a process of eukaryotic cell transformation comprising the inactivation, deletion or mutation that decreases expression levels or functional activity of at least one BSD2 gene, SSQ1 or both.

[0030] Em uma concretização, o processo de transformação é realizado pelo método de transformação com acetato de lítio.[0030] In one embodiment, the transformation process is carried out by the lithium acetate transformation method.

[0031] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta o uso de um microorganismo geneticamente modificado compreendendo o gene BSD2, SSQ1 ou ambos, inativado e/ou deletado ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional para a produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.[0031] In a third object, the present invention presents the use of a genetically modified microorganism comprising the BSD2 gene, SSQ1 or both, inactivated and/or deleted or containing mutation that decreases expression levels or functional activity for the production of biofuels and /or biochemicals.

[0032] Em uma concretização, a produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos ser realizada por fermentação de material lignocelulósico da biomassa vegetal ou a partir de conversão de açúcares, tais como a xilose.[0032] In one embodiment, the production of biofuels and/or biochemicals is carried out by fermentation of lignocellulosic material from plant biomass or from the conversion of sugars, such as xylose.

[0033] Em uma concretização, os biocombustíveis e/ou bioquímicos são ácido lático, ácido succínico, ácido 3-hidroxipropanoico, ácido mucônico, ácido málico, etileno glicol, ácido adípico, ácido hialurônico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato). Em uma concretização o biocombustível e/ou bioquímico é etanol.[0033] In one embodiment, the biofuels and/or biochemicals are lactic acid, succinic acid, 3-hydroxypropanoic acid, muconic acid, malic acid, ethylene glycol, adipic acid, hyaluronic acid, 1,3-propanediol, 1,2- propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol and/or PHB - poly(hydroxybutyrate). In one embodiment the biofuel and/or biochemical is ethanol.

[0034] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta um processo de produção de produtos biológicos compreendendo uma etapa de cultivo de um microrganismo geneticamente modificado compreendendo o gene BSD2, SSQ1 ou ambos, inativado, deletado ou contendo mutação que diminui níveis de expressão ou atividade funcional.[0034] In a fourth object, the present invention presents a process for the production of biological products comprising a step of culturing a genetically modified microorganism comprising the BSD2 gene, SSQ1 or both, inactivated, deleted or containing a mutation that decreases expression levels or functional activity.

[0035] Em uma concretização, o processo de produção é realizado por fermentações em condições anaeróbicas e/ou semi-anaeróbicas. Em uma concretização, o os produtos biológicos são produzidos a partir da conversão de açúcares.[0035] In one embodiment, the production process is carried out by fermentations under anaerobic and/or semi-anaerobic conditions. In one embodiment, the biological products are produced from the conversion of sugars.

[0036] Em uma concretização, o produto biológico é ácido lático, ácido succínico, ácido 3-hidroxipropanoico, ácido mucônico, ácido málico, etileno glicol, ácido adípico, ácido hialurônico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB -poli(hidróxido butirato). Em uma concretização, o produto biológico é etanol.[0036] In one embodiment, the biological product is lactic acid, succinic acid, 3-hydroxypropanoic acid, muconic acid, malic acid, ethylene glycol, adipic acid, hyaluronic acid, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol , isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol and/or PHB -poly(hydroxybutyrate). In one embodiment, the biological product is ethanol.

[0037] Em uma concretização, a produtividade volumétrica do processo de produção de etanol é de pelo menos 0,2 gramas de etanol produzido por litro a cada hora. Em uma concretização, a produtividade volumétrica é de pelo menos 0,4 gramas de etanol produzido por litro a cada hora.[0037] In one embodiment, the volumetric productivity of the ethanol production process is at least 0.2 grams of ethanol produced per liter every hour. In one embodiment, the volumetric productivity is at least 0.4 grams of ethanol produced per liter every hour.

[0038] O processo de produção de produtos biológicos compreendendo uma etapa de cultivo de um microrganismo geneticamente modificado como definido na presente invenção, permite um aumento de produtividade volumétrica surpreendente, chegando a uma produtividade até dez vezes maior quando comparada ao mesmo microrganismo sem a modificação. Ainda, o processo de conversão de açúcares em produtos biológicos, como definido na presente invenção, ocorre em tempos mais curtos, aumentando a capacidade de produção.[0038] The process of producing biological products comprising a stage of cultivation of a genetically modified microorganism as defined in the present invention, allows an increase in volumetric productivity surprising, reaching a productivity up to ten times greater when compared to the same microorganism without the modification . Furthermore, the process of converting sugars into biological products, as defined in the present invention, takes place in shorter times, increasing production capacity.

[0039] Microrganismo geneticamente modificado compreende as modificações descritas, em que as modificações estão sob a ação de promotores homólogos da célula eucariótica-alvo; promotores endógenos na célula eucariótica-alvo, de forma que sua introdução no genoma da célula-alvo proporciona alta transcrição na célula-alvo em situações em que fontes de carbono como glicose e xilose estiverem disponíveis no meio de cultivo. Em uma concretização, estas modificações se encontram integradas no genoma do hospedeiro ou na forma de plasmídeos.[0039] Genetically modified microorganism comprises the described modifications, in which the modifications are under the action of homologous promoters of the target eukaryotic cell; endogenous promoters in the target eukaryotic cell, so that their introduction into the target cell genome provides high transcription in the target cell in situations where carbon sources such as glucose and xylose are available in the culture medium. In one embodiment, these modifications are either integrated into the host genome or in the form of plasmids.

Examples

[0040] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.[0040] The examples shown here are intended only to exemplify one of the numerous ways to carry out the invention, however without limiting its scope.

CONSTRUCTION OF THE C5TY LINEAGE

[0041] A linhagem fermentadora de xilose aqui descrita utilizou como plataforma para sua construção um esporo haploide MATa da cepa industrial PE-2. Através de técnicas de engenharia genética, foi inserido de maneira estável em seu genoma múltiplas cópias do gene otimizado que codifica a proteína Xilose Isomerase (xylA) provinda do Orpinomyces sp., deleção do gene GRE3, que codifica uma Aldose Redutase, adição de duas cópias do gene XKS1, que codifica uma Xiluloquinase, e adição de uma cópia adicional dos genes codificadores das enzimas da via das pentose-fosfato Transcetolase (TKL1), Transaldolase (TAL1), Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1), todos incluídos no genoma da levedura sob a ação de promotores fortes e constitutivos de S. cerevisiae.[0041] The xylose fermenting strain described here used as a platform for its construction a MATa haploid spore of the industrial strain PE-2. Using genetic engineering techniques, multiple copies of the optimized gene encoding the Xylose Isomerase (xylA) protein from Orpinomyces sp., deletion of the GRE3 gene, which encodes an Aldose Reductase, addition of two copies of the XKS1 gene, which encodes a Xylulokinase, and addition of an additional copy of the genes encoding the pentose-phosphate pathway enzymes Transketolase (TKL1), Transaldolase (TAL1), Ribose 5-Phosphate Isomerase (RKI1) and Ribose 5-Phosphate Epimerase (RPE1), all included in the yeast genome under the action of strong and constitutive S. cerevisiae promoters.

[0042] Apesar da inserção das modificações genéticas citadas, as quais são necessárias para metabolismo de xilose, a linhagem gerada, denominada C5TY (C5 Trial Yeast), apresenta baixa velocidade no consumo dessa pentose, levando cerca de 72 horas para consumir 50 g/L de xilose em meio rico YP (10 g/L Extrato de Levedura, 20 g/L Peptona). Por não apresentar outras alterações no genoma em relação a selvagem PE-2, essa cepa foi utilizada como base para a realização das mutações aqui descritas, dado que suas modificações genéticas a tornam a linhagem base ideal para a identificação de metabolismos secundários capazes de potencializar a velocidade de fermentação de xilose.[0042] Despite the insertion of the aforementioned genetic modifications, which are necessary for xylose metabolism, the generated strain, called C5TY (C5 Trial Yeast), has a low speed in the consumption of this pentose, taking about 72 hours to consume 50 g/ L of xylose in YP rich medium (10 g/L Yeast Extract, 20 g/L Peptone). As it does not present other alterations in the genome in relation to the wild type PE-2, this strain was used as a basis for carrying out the mutations described here, given that its genetic modifications make it the ideal base line for the identification of secondary metabolisms capable of potentiating the xylose fermentation rate.

[0043] Adicionalmente às modificações genéticas presente na linhagem C5TY utilizada como base, as linhagens aqui apresentadas descrevem o efeito das deleções isoladas dos genes BSD2 e SSQ1 no genoma da levedura S. cerevisiae como modificações gênicas capazes de favorecer o consumo de xilose pela célula. O mesmo efeito seria obtido por mutações de perda de função ou modificações que diminuam os níveis de expressão nos respectivos genes.[0043] In addition to the genetic modifications present in the C5TY strain used as a base, the strains presented here describe the effect of isolated deletions of the BSD2 and SSQ1 genes in the genome of the yeast S. cerevisiae as genetic modifications capable of favoring the consumption of xylose by the cell. The same effect would be obtained by loss-of-function mutations or modifications that decrease expression levels in the respective genes.

CONSTRUCTION OF MUTANT LINEAGES

[0044] A construção dos cassetes utilizados para a deleção individual dos genes SSQ1 e BSD2 na linhagem controle C5TY foi realizada pela amplificação da marca de seleção hphMX6, a qual confere resistência ao antibiótico higromicina B. Sequências homólogas as regiões adjacentes a ORF do gene-alvo foram inseridas flanqueando a região promotora e terminadora do gene hphMX6. Deste modo, os cassetes originados possuem o gene hphMX6 flanqueado por regiões de homologia ao gene-alvo.[0044] The construction of the cassettes used for the individual deletion of the SSQ1 and BSD2 genes in the C5TY control strain was carried out by amplification of the selection marker hphMX6, which confers resistance to the antibiotic hygromycin B. Sequences homologous to the regions adjacent to the ORF of the gene- target were inserted flanking the promoter and terminator region of the hphMX6 gene. Thus, the cassettes generated have the hphMX6 gene flanked by regions of homology to the target gene.

[0045] Após amplificação, as linhagens mutantes foram originadas pela inserção dos respectivos cassetes de deleção na linhagem C5TY pelo método de transformação de leveduras com acetato de lítio. As transformantes de cada gene foram selecionadas em meio YPD 2% suplementado com 200 mg/L de Higromicina B. Após a extração do DNA total das colônias transformantes, a confirmação das mutações foi realizada por PCR, comprovando que a deleção dos genes SSQ1 e BSD2 foi inserida com sucesso nas células analisadas, como demonstrado nas Figura 2, originando as linhagens ssq1Δ e bsd2Δ, respectivamente.

[0045] After amplification, the mutant strains were generated by the insertion of the respective deletion cassettes in the C5TY strain by the method of transforming yeasts with lithium acetate. The transformants of each gene were selected in 2% YPD medium supplemented with 200 mg/L of Hygromycin B. After the extraction of total DNA from the transforming colonies, the confirmation of the mutations was performed by PCR, proving that the deletion of the SSQ1 and BSD2 genes was successfully inserted into the analyzed cells, as shown in Figure 2, giving rise to the ssq1Δ and bsd2Δ lines, respectively.

EFFECT OF INDIVIDUAL DELETION OF BSD2 AND SSQ1 GENES ON YEAST GENOME

[0046] Após a confirmação das linhagens mutantes ssq1∆ e bsd2Δ, as cepas transformantes foram submetidas a um ensaio fermentativo para a comparação do consumo de xilose e produção de etanol em relação a linhagem parental C5TY. O ensaio fermentativo foi realizado em meio YP (10 g/L extrato de levedura, 20 g/L de peptona) contendo 50 g/L de xilose como única fonte de carbono, em condições semi-anaeróbicas. A fermentação iniciou com a cultura de células com densidade óptica (DO) de aproximadamente 1.0, feita em garrafas seladas de 100 mL, com um volume de trabalho de 70 mL. As células foram mantidas na temperatura de incubação de 30 °C, a 200 rpm, durante um período de 72 horas. Foram retiradas alíquotas para a leitura da DO e posterior análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) para aferir os níveis de xilose e etanol das amostras.[0046] After confirmation of the ssq1∆ and bsd2Δ mutant strains, the transforming strains were submitted to a fermentative assay to compare xylose consumption and ethanol production in relation to the parental strain C5TY. The fermentation assay was carried out in YP medium (10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone) containing 50 g/L xylose as the only carbon source, under semi-anaerobic conditions. Fermentation started with cell culture with an optical density (OD) of approximately 1.0, done in sealed 100 mL bottles, with a working volume of 70 mL. Cells were maintained at the incubation temperature of 30°C at 200 rpm for a period of 72 hours. Aliquots were taken for DO reading and subsequent analysis by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) to measure the xylose and ethanol levels of the samples.

[0047] O efeito da deleção do gene SSQ1 em relação ao consumo de xilose e produção de etanol está demonstrado na Figura 3. A linhagem ssq1∆ foi capaz de consumir todo o açúcar em apenas 48 horas de fermentação, enquanto a linhagem parental C5TY necessitou de aproximadamente 72 horas para o consumo total do açúcar. Com uma produtividade volumétrica de 0,454 g.L-1/h em 42h, cerca de 10 vezes maior que a apresentada pelo controle no mesmo período (0,043 g.L-1/h)[0047] The effect of the SSQ1 gene deletion in relation to xylose consumption and ethanol production is shown in Figure 3. The ssq1∆ strain was able to consume all the sugar in just 48 hours of fermentation, while the C5TY parental strain required of approximately 72 hours for the total consumption of sugar. With a volumetric productivity of 0.454 g.L-1/h in 42h, about 10 times greater than that presented by the control in the same period (0.043 g.L-1/h)

[0048] A Figura 4 demonstra o efeito da deleção do gene BSD2 na fermentação de xilose em relação a linhagem parental C5TY. A linhagem portadora da mutação, bsd2Δ, apresentou uma velocidade de consumo de xilose maior quando comparada ao controle, possuindo uma produtividade volumétrica em 48 horas de 0,218 g.L-1/h, o que corresponde a um aumento de velocidade cerca de 2,4 vezes maior que a apresentada pela linhagem parental C5TY (0,091 g.L-1/h).[0048] Figure 4 demonstrates the effect of the BSD2 gene deletion on xylose fermentation in relation to the C5TY parental strain. The strain carrying the mutation, bsd2Δ, presented a higher rate of xylose consumption when compared to the control, having a volumetric productivity in 48 hours of 0.218 g.L-1/h, which corresponds to a speed increase of about 2.4 times higher than that presented by the parental strain C5TY (0.091 g.L-1/h).

[0049] Assim, as mutações aqui apresentadas foram capazes de aumentar a velocidade do consumo de xilose e produção de etanol em linhagens modificadas da levedura S. cerevisiae, favorecendo o desempenho do microrganismo na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico para a produção em escala industrial de biorrenováveis 2G.[0049] Thus, the mutations presented here were able to increase the speed of xylose consumption and ethanol production in modified strains of the yeast S. cerevisiae, favoring the performance of the microorganism in the conversion of pentoses present in the lignocellulosic material for scale production 2G biorenewables industry.

[0050] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes e alternativas, abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.[0050] Those skilled in the art will value the knowledge presented herein and may reproduce the invention in the modalities presented and in other variants and alternatives, covered by the scope of the claims below.

Claims

Genetically modified microorganism characterized by having inactivation, deletion or mutation that decreases the expression of the BSD2 gene, SSQ1 or both.

Genetically modified microorganism according to claim 1, characterized in that it comprises at least one of the following genetic modifications:

a) Optimization of the gene encoding the protein Xylose Isomerase (xylA);
b) Deletion of the GRE3 gene, which encodes an Aldose Reductase;
c) Addition of at least one copy of the XKS1 gene, which encodes a Xylulokinase;
d) Addition of at least one copy of the genes encoding the enzymes of the pentose-phosphate pathway Transketolase (TKL1), Transaldolase (TAL1), Ribose 5-Phosphate Isomerase (RKI1) and Ribose 5-Phosphate Epimerase (RPE1); and

wherein all added/optimized genes are functional in eukaryotic cells and comprise at least one expression-promoting sequence.

Genetically modified microorganism according to claim 1 or 2, characterized in that it is Spathaspora passalidarum, Spathaspora arborariae, Spathaspora sp., Scheffersomyces stipitis, Pichia sp., Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces sp., Meyrozyma guilliermondii, Meyrozyma sp., Candida sp., C. tropicalis, C. tenuis, C. shehatae, C. intermedia, Schizosaccharomyces pombe, Debaryomyces sp., Yarrowia sp., Saccharomyces cerevisiae.

Genetically modified microorganism according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it is Saccharomyces cerevisiae.

Process of transforming a eukaryotic cell for the production of a microorganism, as defined in any one of claims 1 to 4, characterized in that it comprises the inactivation, deletion or mutation that decreases expression levels or functional activity of at least one selected eukaryotic cell gene of the group consisting of BSD2, SSQ1 or both.

Use of a genetically modified microorganism, as defined in any one of claims 1 to 4, characterized in that it is for the production of biofuels and/or biochemicals.

Use according to claim 6, characterized in that the production of biofuels and/or biochemicals is carried out by fermentation of lignocellulosic material from plant biomass or from xylose.

Use according to claim 6 or 7, characterized in that it is for the production of ethanol.

Use according to claim 6 or 7, characterized in that it is for the production of lactic acid, succinic acid, 3-hydroxypropanoic acid, muconic acid, malic acid, ethylene glycol, adipic acid, hyaluronic acid, 1,3-propanediol, 1 ,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol and/or PHB - poly(butyrate hydroxide).

Process for producing biological products characterized in that it comprises at least one step of culturing a microorganism as defined in any one of claims 1 to 4.

Production process according to claim 9, characterized in that fermentation is carried out under anaerobic and/or semi-anaerobic conditions.

Production process, according to claim 10 or 11, characterized in that the volumetric productivity is at least 0.2 grams of ethanol produced per liter every hour.