BR102020024433A2

BR102020024433A2 - APTASENSOR, METHOD AND QUALITATIVE COLORIMETRIC VISUAL DETECTION KIT OF THE PRESENCE OF PSEUDOMONAS SYRINGAE FOR SURFACES AND VEGETABLE SAMPLES BASED ON GOLD AND APTAMETER NANOPARTICLES

Info

Publication number: BR102020024433A2
Application number: BR102020024433-7A
Authority: BR
Inventors: Gabriel De Freitas Nunes; Verônica Wisineski Voltolini Neta; Alexsandra Valério Vilaça; Débora De Oliveira; Dachamir Hotza
Original assignee: Tns Nanotecnologia Ltda
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-06-14

Abstract

aptasensor, método e kit qualitativo de detecção colorimétrica visual da presença de pseudomonas syringae para superfícies e amostras vegetais baseado em nanopartículas de ouro e aptâmero. a presente invenção refere-se a novo método e kit qualitativo de detecção colorimétrica da presença de contaminação por pseudomonas syringae em amostras de superfícies vegetais baseado em nanopartículas de ouro e aptâmeros e aptasensor que o compõe. em particular, a invenção fornece um método simplificado sem a necessidade do uso de probes de oligonucleotídeos bifuncionais, utilizando apenas um oligonucleotídeo altamente sensível e específico para a detecção da presença de pseudomonas syringae em amostras com interferentes, como as amostras de superfície oriundas da cadeia agrícola (amostras de tecido de folhas, sementes, superfícies). a invenção também prevê um kit de detecção e um método baseado no mesmo para a detecção de pseudomonas syringae. a detecção da presença de contaminação é realizada a partir de amostras de superfície através de mudança de cor.aptasensor, method and qualitative kit for visual colorimetric detection of the presence of Pseudomonas syringae for surfaces and plant samples based on gold and aptamer nanoparticles. The present invention relates to a new method and qualitative kit for colorimetric detection of the presence of contamination by Pseudomonas syringae in samples of plant surfaces based on gold nanoparticles and aptamers and the aptasensor that composes it. in particular, the invention provides a simplified method without the use of bifunctional oligonucleotide probes, using only a highly sensitive and specific oligonucleotide for the detection of the presence of Pseudomonas syringae in samples with interferents, such as surface samples from the agricultural chain. (tissue samples of leaves, seeds, surfaces). the invention also provides a detection kit and a method based thereon for the detection of Pseudomonas syringae. detection of the presence of contamination is performed from surface samples through color change.

Description

APTASENSOR, METHOD AND QUALITATIVE COLORIMETRIC VISUAL DETECTION KIT OF THE PRESENCE OF PSEUDOMONAS SYRINGAE FOR SURFACES AND VEGETABLE SAMPLES BASED ON GOLD AND APTAMETER NANOPARTICLES

[001] CAMPO DA INVENÇÃO - A presente invenção refere-se a novo método e kit qualitativo de detecção colorimétrica da presença de contaminação por Pseudomonas syringae em amostras de superfícies vegetais baseado em nanopartículas de ouro e aptâmeros e Aptasensor que o compõe. Em particular, a invenção fornece um método simplificado sem a necessidade do uso de probes de oligonucleotídeos bifuncionais, utilizando apenas um oligonucleotídeo altamente sensível e específico para a detecção da presença de Pseudomonas syringae em amostras com interferentes, como as amostras de superfície oriundas da cadeia agrícola (amostras de tecido de folhas, sementes, superfícies). A invenção também prevê um kit de detecção e um método baseado no mesmo para a detecção de Pseudomonas syringae. A detecção da presença de contaminação é realizada a partir de amostras de superfície através de mudança de cor.[001] FIELD OF THE INVENTION - The present invention refers to a new method and qualitative kit for colorimetric detection of the presence of contamination by Pseudomonas syringae in samples of plant surfaces based on gold nanoparticles and aptamers and Aptasensor that compose it. In particular, the invention provides a simplified method without the use of bifunctional oligonucleotide probes, using only a highly sensitive and specific oligonucleotide for the detection of the presence of Pseudomonas syringae in samples with interferents, such as surface samples from the agricultural chain. (tissue samples of leaves, seeds, surfaces). The invention also provides a detection kit and a method based thereon for the detection of Pseudomonas syringae. Detection of the presence of contamination is performed from surface samples through color change.

[002] ESTADO DA TÉCNICA - Os fitopatógenos são uma das causas da baixa produtividade agrícola em todo o mundo. Suas taxas de propagação, incidência e gravidade tornaram-se uma ameaça significativa para a sustentabilidade do abastecimento alimentar mundial.[002] STATE OF THE ART - Phytopathogens are one of the causes of low agricultural productivity worldwide. Its rates of spread, incidence and severity have become a significant threat to the sustainability of the world's food supply.

[003] As plantas apresentam sintomas diferentes nas folhas, caules e frutos devido a infecções por fitopatógenos. Esses sintomas são particularmente úteis para observação visual como um primeiro passo para o diagnóstico de doenças em plantas, mas falha em detectar a presença de patógenos nos estágios iniciais de infecção quando as infecções em plantas são assintomáticas.[003] Plants show different symptoms on leaves, stems and fruits due to phytopathogen infections. These symptoms are particularly useful for visual observation as a first step in diagnosing plant diseases, but fail to detect the presence of pathogens in the early stages of infection when plant infections are asymptomatic.

[004] A detecção precoce de fitopatógenos desempenha um papel importante no monitoramento da saúde das plantas pois permite gerenciar infecções em sistemas de estufa e no campo durante diferentes estágios de desenvolvimento de doenças em plantas e também minimizar o risco de propagação de infecções em plantas, bem como prevenir a introdução de novas doenças em plantas.[004] Early detection of phytopathogens plays an important role in plant health monitoring as it allows managing infections in greenhouse and field systems during different stages of plant disease development and also minimizing the risk of spreading infections in plants, as well as preventing the introduction of new diseases in plants.

[005] As doenças de plantas causadas por Pseudomonas syringae estão listadas entre as dez bactérias patogênicas mais importantes do mundo, causando reduções severas no rendimento e na qualidade de regiões produtoras de alimento no mundo todo. Este patógeno pode se espalhar por longas distâncias e pode durar até 3 anos em sementes secas.[005] Plant diseases caused by Pseudomonas syringae are listed among the ten most important pathogenic bacteria in the world, causing severe reductions in yield and quality in food producing regions worldwide. This pathogen can spread over long distances and can last up to 3 years in dry seeds.

[006] Nos últimos anos, os ensaios à base de ácido nucleico têm sido amplamente utilizados para a detecção precoce e precisa de patógenos transmitidos no meio ambiente em plantações (McConnell Erin M., Nguyen Julie, Li Yingfu. Aptamer-Based Biosensors for Environmental Monitoring. Frontiers in Chemistry. V. 8, 2020, p. 434, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fchem.2020.00434, Mohga Khater, Alfredo de la Escosura-Muñiz, Arben Merkoçi. Biosensors for plant pathogen detection. Biosensors and Bioelectronics. Volume 93, 2017, P. 72-86, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566316309782).[006] In recent years, nucleic acid-based assays have been widely used for the early and accurate detection of environmentally transmitted pathogens in crops (McConnell Erin M., Nguyen Julie, Li Yingfu. Aptamer-Based Biosensors for Environmental Monitoring. Frontiers in Chemistry. V. 8, 2020, p. 434, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fchem.2020.00434, Mohga Khater, Alfredo de la Escosura-Muñiz, Arben Merkoçi. Biosensors for plant pathogen detection. Biosensors and Bioelectronics. Volume 93, 2017, P. 72-86, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566316309782 ).

[007] O aptâmero é um ligante de ácido nucleico de fita simples (DNA ou RNA) que geralmente possui alta afinidade a uma ampla gama de alvos. Os aptâmeros são geralmente selecionados a partir de bibliotecas contendo sequências criadas aleatoriamente através de uma evolução sistemática in vitro de ligantes por enriquecimento exponencial (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX). Como elementos de bio-reconhecimento, os aptâmeros podem reconhecer vários ligantes-alvo com alta especificidade, incluindo íons, drogas, micotoxinas, patógenos ou células inteiras (Dong et al., 2015; Dupont et al., 2015; Meng et al., 2015; Tan et al., 2016). Aptâmeros exibem boa afinidade para alvos específicos, dentro de um coeficiente de dissociação (valor Kd) de pM a mM.[007] Aptamer is a single-stranded nucleic acid ligand (DNA or RNA) that generally has high affinity to a wide range of targets. Aptamers are generally selected from libraries containing sequences created randomly through an in vitro systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). As biorecognition elements, aptamers can recognize various target ligands with high specificity, including ions, drugs, mycotoxins, pathogens or whole cells (Dong et al., 2015; Dupont et al., 2015; Meng et al., 2015; Tan et al., 2016). Aptamers exhibit good affinity for specific targets, within a dissociation coefficient (Kd value) of pM to mM.

[008] A tecnologia de detecção por aptâmeros mostra maior estabilidade à temperatura, pH e força iônica, além de possuir síntese e modificação mais fáceis, maior prazo de validade e menor custo, quando comparados com métodos convencionais a base de, por exemplo, anticorpos. Com base nessa superioridade, os aptâmeros têm atraído muita atenção na construção de ensaios e sensores denominados apta-ensaios ou aptasensores (Chung et al., 2018; Ling et al., 2016).[008] Aptamer detection technology shows greater stability at temperature, pH and ionic strength, in addition to having easier synthesis and modification, longer shelf life and lower cost, when compared to conventional methods based on, for example, antibodies . Based on this superiority, aptamers have attracted much attention in the construction of assays and sensors called apta-assays or aptasensors (Chung et al., 2018; Ling et al., 2016).

[009] Os aptâmeros são moléculas pequenas, quimicamente estáveis e econômicos para produzir em comparação com anticorpos. Com base nessas características, os aptâmeros de ácidos nucleicos são amplamente utilizados no campo dos biossensores. Portanto, vários biossensores baseados em aptâmeros foram desenvolvidos para detectar patógenos transmitidos por alimentos, incluindo E. coli (Zou et al., 2018), S. aureus (Qiao et al., 2018), Salmonella spp. (Shin et al., 2018), Vibrio parahaemolyticus (Wu et al., 2018), Campylobacter spp. (Bruno e Sivils, 2017), Listeria spp. (Liu et al., 2018c) e Shigella flexneri (Duan et al., 2013a).[009] Aptamers are small molecules, chemically stable and economical to produce compared to antibodies. Based on these characteristics, nucleic acid aptamers are widely used in the field of biosensors. Therefore, several aptamer-based biosensors have been developed to detect foodborne pathogens, including E. coli (Zou et al., 2018), S. aureus (Qiao et al., 2018), Salmonella spp. (Shin et al., 2018), Vibrio parahaemolyticus (Wu et al., 2018), Campylobacter spp. (Bruno and Sivils, 2017), Listeria spp. (Liu et al., 2018c) and Shigella flexneri (Duan et al., 2013a).

[010] Aptasensores são uma classe particular de biossensores em que o elemento de reconhecimento biológico é um aptâmero de DNA ou RNA. Em um aptasensor, o aptâmero reconhece o alvo molecular contra o qual foi previamente selecionado. Os aptasensores demonstram inúmeras vantagens no reconhecimento de biossensores em relação aos sensores imunológicos tradicionais, tais como os compostos por peptídeos e proteínas em geral, anticorpos e outros. Comparados aos biossensores acima mencionados, os aptasensores possuem vantagens sem precedentes com alta produtividade, afinidade, seletividade e estabilidade, além de seu uso ser simples e rápido, não requerendo etapas tediosas como lavagem e enriquecimento, por exemplo.[010] Aptasensors are a particular class of biosensors in which the biological recognition element is an aptamer of DNA or RNA. In an aptasensor, the aptamer recognizes the molecular target against which it was previously selected. Aptasensors demonstrate numerous advantages in the recognition of biosensors in relation to traditional immunological sensors, such as those composed of peptides and proteins in general, antibodies and others. Compared to the aforementioned biosensors, aptasensors have unprecedented advantages with high productivity, affinity, selectivity and stability, in addition to being simple and fast to use, not requiring tedious steps such as washing and enrichment, for example.

[011] Nanopartículas de ouro (AuNPs) têm sido amplamente exploradas no campo da química analítica, biologia, diagnóstico e tratamento de câncer devido às suas propriedades ópticas, químicas, eletroquímicas e catalíticas específicas. Elas podem combinar-se com uma variedade de macromoléculas biológicas, no geral sem afetar a atividade biológica. Os ensaios de biossensores colorimétricos baseados em nanopartículas de ouro (AuNP) têm atraído considerável atenção no reconhecimento e diagnóstico molecular (Zhao, Brook & Li, 2008). Vários aptasensores usando nanopartículas de ouro (AuNPs) que atuam como elemento transdutor de sinal do biossensor foram desenvolvidos. Apenas algumas pesquisas foram realizadas para lidar com a detecção de bactérias de células inteiras (“whole-cell”) por ensaios colorimétricos de AuNPs (Chang et al., 2013; Yuan et al., 2014).[011] Gold nanoparticles (AuNPs) have been widely explored in the field of analytical chemistry, biology, diagnosis and cancer treatment due to their specific optical, chemical, electrochemical and catalytic properties. They can combine with a variety of biological macromolecules, overall without affecting biological activity. Colorimetric biosensor assays based on gold nanoparticles (AuNP) have attracted considerable attention in molecular recognition and diagnosis (Zhao, Brook & Li, 2008). Several aptasensors using gold nanoparticles (AuNPs) that act as a signal transducer element of the biosensor have been developed. Only a few researches have been carried out to deal with the detection of whole cell (“whole-cell”) bacteria by colorimetric assays of AuNPs (Chang et al., 2013; Yuan et al., 2014).

[012] Em geral, aptasensores usando nanopartículas de ouro (AuNPs) dispensam a utilização de procedimentos complicados de preparação ou instrumentos delicados e fornecem uma leitura visível a olho nu; o ouro coloidal passa de um tom avermelhado para azulado quando as AuNP se agregam, em determinado caso. Os aptâmeros podem ser facilmente adsorvidos na superfície das AuNPs, protegendo as AuNPs da agregação, induzida por exemplo, por íons. Por outro lado, o aptâmero se dissocia da superfície da AuNP e liga-se ao alvo na presença do patógeno de interesse, levando à mudança de cor de vermelho para azul.[012] In general, aptasensors using gold nanoparticles (AuNPs) dispense with the use of complicated preparation procedures or delicate instruments and provide a visible reading to the naked eye; colloidal gold changes from a reddish to a bluish hue when AuNP aggregates, in a given case. Aptamers can be easily adsorbed on the surface of AuNPs, protecting AuNPs from aggregation, induced for example by ions. On the other hand, the aptamer dissociates from the AuNP surface and binds to the target in the presence of the pathogen of interest, leading to a color change from red to blue.

[013] Com os riscos para a produtividade agrícola que os fitopatógenos representam, vários métodos foram desenvolvidos para sua detecção.[013] With the risks to agricultural productivity that phytopathogens pose, several methods have been developed for their detection.

[014] Muitas estratégias têm sido amplamente utilizadas para diagnosticar problemas de doenças de plantas, incluindo métodos baseados em DNA e imunoensaios, para a detecção de proteína patogênica e ácido nucleico extraído de materiais vegetais infectados, como técnicas diretas baseadas em laboratório, além de inspeção visual dos sintomas da planta no campo.[014] Many strategies have been widely used to diagnose plant disease problems, including DNA-based methods and immunoassays, for the detection of pathogenic protein and nucleic acid extracted from infected plant materials, such as direct laboratory-based techniques in addition to inspection. visual of plant symptoms in the field.

[015] Por outro lado, existem outras estratégias indiretas baseadas na análise de compostos orgânicos voláteis (COV) que as plantas liberam como mecanismo de defesa contra o ataque de patógenos. Vários estudos abordam o diagnóstico de doenças de plantas e a detecção de patógenos usando métodos baseados em ácido nucleico, consistindo principalmente de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida por detecção de hibridização de DNA, para determinar o conteúdo genético do patógeno. Alternativamente, imunoensaios, também conhecidos como ensaios sorológicos, incluindo ensaio imunoenzimático (ELISA), dispositivos de fluxo lateral (LF), ELISA de impressão em tecido ou imunoensaio dot blot direto (DTBIA) têm sido usados para detectar os antígenos do patógeno.[015] On the other hand, there are other indirect strategies based on the analysis of volatile organic compounds (VOCs) that plants release as a defense mechanism against the attack of pathogens. Several studies address the diagnosis of plant diseases and the detection of pathogens using nucleic acid-based methods, consisting mainly of polymerase chain reaction (PCR) followed by DNA hybridization detection, to determine the genetic content of the pathogen. Alternatively, immunoassays, also known as serological assays, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), lateral flow devices (LF), tissue print ELISA, or direct dot blot immunoassay (DTBIA) have been used to detect pathogen antigens.

[016] Os métodos de detecção molecular têm algumas limitações na detecção de patógenos em baixas concentrações em materiais como sementes e vetores de insetos ou em estágios iniciais de infecção. Além disso, resultados falsos negativos podem ser produzidos a partir de contaminação cruzada com reagentes de PCR que bloqueiam completamente a amplificação do DNA alvo, enquanto resultados falsos positivos podem ser gerados por amplificação cruzada de fragmentos gerados por PCR de DNA não alvo. Outra limitação está relacionada à impossibilidade de aplicar PCR para detecção de fitopatógenos em campo.[016] Molecular detection methods have some limitations in detecting pathogens at low concentrations in materials such as seeds and insect vectors or in early stages of infection. In addition, false negative results can be produced from cross-contamination with PCR reagents that completely block amplification of target DNA, while false positive results can be generated by cross-amplifying PCR-generated fragments of non-target DNA. Another limitation is related to the impossibility of applying PCR for the detection of phytopathogens in the field.

[017] Para um melhor controle das infecções por Pseudomonas em plantas em seu estágio inicial assintomático, requer-se um método de detecção rápida, estável e sensível, que tenha um bom custo-benefício e não necessite de equipamentos e técnicos especializados, para ser utilizado no dia-a-dia no campo.[017] For a better control of Pseudomonas infections in plants in their initial asymptomatic stage, a rapid, stable and sensitive detection method is required, which is cost-effective and does not require specialized equipment and technicians, to be used on a daily basis in the field.

[018] Aptasensores colorimétricos apresentam boa estabilidade e sensibilidade, rápida detecção, podendo ser utilizados de forma simples diretamente no campo. Algumas invenções já mostram a utilização de aptasensores para a detecção de Pseudomonas. Entre estas podemos citar a patente CN108753789A que descreve um método de detecção de Pseudomonas aeruginosa para análise de água e bebidas através de leitura de biossensor composto por aptâmero, sem uso de AuNPs, e em comprimento de onda fluorescente e inclui ainda um kit de detecção. Já a patente CN110669767A descreve um método de detecção de Pseudomonas syringae por Raman, utilizando para isso um aptâmero. A patente CN111351812A descreve um método de detecção de P. aeruginosa através da técnica de ressonância magnética nuclear com uma força de campo magnético abaixo de 0,5 T, usando nanobeads. A patente CN110161240B descreve técnica de espectrômetro de fluorescência para detectar P. aeruginosa, através de aptâmero principal e probe. Destes, todos necessitam de equipamentos e técnicos especializados, sendo inviáveis para serem utilizados no dia-a-dia do campo.[018] Colorimetric aptasensors have good stability and sensitivity, fast detection, and can be used simply directly in the field. Some inventions already show the use of aptasensors for the detection of Pseudomonas. Among these we can mention the patent CN108753789A which describes a method of detecting Pseudomonas aeruginosa for analysis of water and beverages by reading a biosensor composed of aptamer, without the use of AuNPs, and at fluorescent wavelength and also includes a detection kit. Patent CN110669767A describes a method for detecting Pseudomonas syringae by Raman, using an aptamer. Patent CN111351812A describes a method of detecting P. aeruginosa through the nuclear magnetic resonance technique with a magnetic field strength below 0.5 T, using nanobeads. Patent CN110161240B describes fluorescence spectrometer technique to detect P. aeruginosa, through main aptamer and probe. Of these, all of them require specialized equipment and technicians, which are unfeasible for day-to-day use in the field.

[019] Alguns artigos científicos mostram a utilização de aptasensores para a detecção de Pseudomonas, entre os quais podemos citar o artigo "Simultaneous detection of different bacteria by microchip electrophoresis combined with universal primer-duplex polymerase chain reaction" publicado no Journal of Chromatography em março de 2020 pelos pesquisadores Feifei Luo, Zhi Li, Ge Dai e Qingjiang Wang, que relata método para detectar S. Typhimurium e P. aeruginosa usando uma sonda baseada em aptâmero combinada com um novo primer duplex PCR universal e MCE-LIF onde a separação e detecção de sequências de DNA é realizada usando um instrumento de fluorescência induzida por eletroforese / LED de microchip. Já o artigo "Aptamer-functionalized localized surface plasmon resonance sensor for the multiplexed detection of different bacterial species" publicado na revista Talanta de 15 January 2015 pelos pesquisadores Seung Min Yoo, Do-Kyun Kim e Sang Yup Lee descreve um sensor baseado em LSPR imobilizado por aptâmero, para a detecção de espécies bacterianas incluindo P. aeruginosa. Estes também apresentam como desvantagem a necessidade de equipamentos e técnicos especializados, sendo inviáveis para serem utilizados no dia-a-dia do campo.[019] Some scientific articles show the use of aptasensors for the detection of Pseudomonas, among which we can mention the article "Simultaneous detection of different bacteria by microchip electrophoresis combined with universal primer-duplex polymerase chain reaction" published in the Journal of Chromatography in March 2020 by researchers Feifei Luo, Zhi Li, Ge Dai, and Qingjiang Wang, who report a method to detect S. Typhimurium and P. aeruginosa using an aptamer-based probe combined with a novel universal PCR duplex primer and MCE-LIF where separation and DNA sequence detection is performed using an electrophoresis-induced fluorescence instrument / LED microchip. The article "Aptamer-functionalized localized surface plasmon resonance sensor for the multiplexed detection of different bacterial species" published in Talanta magazine on January 15, 2015 by researchers Seung Min Yoo, Do-Kyun Kim and Sang Yup Lee describes a sensor based on immobilized LSPR by aptamer, for the detection of bacterial species including P. aeruginosa. These also present as a disadvantage the need for specialized equipment and technicians, being unfeasible to be used in the day-to-day of the field.

[020] A patente US2020003773-A1 prevê um método de detecção visual de bactérias em amostras ambientais em campo que inclui o contato de um substrato, composto por camada metálica, ácido borônico e ácido nucleico, com um analito, com subsequente exposição do substrato à luz e a captura de uma imagem do substrato para então haver a confirmação visual da presença ou ausência de bactérias. Apesar desta invenção apresentar um método de detecção visual de bactérias que pode ser utilizado em campo por pessoal não especializado e sem a necessidade de equipamentos sofisticados, esta não apresenta uma solução específica e seletiva para a detecção de Pseudomonas em amostras ambientais, além da detecção não ser percebida por simples mudança de cor, mas por ampliação de imagem.[020] Patent US2020003773-A1 provides for a method of visual detection of bacteria in environmental samples in the field that includes contacting a substrate, composed of a metallic layer, boronic acid and nucleic acid, with an analyte, with subsequent exposure of the substrate to light and capturing an image of the substrate for visual confirmation of the presence or absence of bacteria. Although this invention presents a method of visual detection of bacteria that can be used in the field by non-specialized personnel and without the need for sophisticated equipment, it does not present a specific and selective solution for the detection of Pseudomonas in environmental samples, in addition to non-specific detection. be perceived by a simple color change, but by enlarging the image.

[021] A patente US9851308-B2 descreve um método de detecção de um alvo através de análise que inclui a colorimétrica visual, com utilização de AuNPs e aptâmero, em que a agregação de nanopartículas não ocorre na presença do alvo, mas indica a ausência do alvo. Apesar desta invenção apresentar um método de detecção visual de bactérias que pode ser utilizado em campo por pessoal não especializado e sem a necessidade de equipamentos sofisticados, esta não apresenta uma solução específica e seletiva para a detecção de Pseudomonas em amostras ambientais, além do método de detecção não indicar a presença do alvo, mas sua ausência.[021] Patent US9851308-B2 describes a method of detecting a target through analysis that includes visual colorimetry, using AuNPs and aptamer, in which the aggregation of nanoparticles does not occur in the presence of the target, but indicates the absence of the target. target. Although this invention presents a method of visual detection of bacteria that can be used in the field by unskilled personnel and without the need for sophisticated equipment, it does not present a specific and selective solution for the detection of Pseudomonas in environmental samples, in addition to the method of detection does not indicate the presence of the target, but its absence.

[022] Como podemos perceber pelas anterioridades apresentadas, os testes atuais para detecção de contaminação por Pseudomonas existentes vão desde os demorados métodos de cultura, passando por testes com alta sensibilidade e precisão, mas que necessitam de equipamentos caros e pessoal técnico especializado, como é o caso dos que utilizam PCR, até os testes que já utilizam aptasensores porém que não consideram a especificidade das amostras ambientais de campo, além de não considerarem metodologia específica para análise de superfícies e ambientais através de simples mudança de cor, que fazem parte do controle de qualidade de rotina da agroindústria.[022] As we can see from the foregoing, the current tests for detecting contamination by existing Pseudomonas range from time-consuming culture methods, through tests with high sensitivity and precision, but which require expensive equipment and specialized technical personnel, such as the case of those that use PCR, to tests that already use aptasensors but that do not consider the specificity of the environmental samples in the field, in addition to not considering specific methodology for surface and environmental analysis through simple color change, which are part of the control of routine quality in the agroindustry.

[023] O que se pode perceber é que é necessário o desenvolvimento de um método de detecção de contaminação por Pseudomonas syringae, espécie que mais afeta as plantações, em amostras de campo que tenha como características: (1) ser simples de ser realizado, não necessitando de pessoal técnico altamente capacitado, podendo ser realizado por pessoal da própria agroindústria em sua rotina de monitoramento da saúde das plantações e seus insumos, como sementes; (2) ter uma resposta analítica rápida, em tempo suficientemente curto para que um determinado insumo, como as sementes, só seja liberado para o plantio após o resultado analítico confirmar a ausência de contaminação e também para que haja tempo hábil de se isolar uma determinada área contaminada das demais áreas, impedindo assim a proliferação da bactéria; (3) possuir reagentes estáveis com vida de prateleira que permita que sejam realizadas várias análises com o mesmo lote e que suporte condições desafiadoras de ensaio derivadas de seu uso em campo; (4) possuir metodologia que contemple amostras de superfície e ambientais, como folhas, caule, sementes, bancadas, entre outros, para que, caso se confirme uma contaminação, seja possível a identificação da origem desta, e não somente o seu resultado, que é o que acontece quando apenas o produto final (após a colheita) é analisado; (5) ter resposta colorimétrica perceptível visualmente, sem a necessidade da utilização de equipamentos sofisticados; e (6) ser capaz de detectar a contaminação mesmo em amostras que possuam interferentes, como resíduos de matérias-primas, de produtos de limpeza, entre outros.[023] What can be seen is that it is necessary to develop a method for detecting contamination by Pseudomonas syringae, the species that most affects plantations, in field samples that has the following characteristics: (1) it is simple to be carried out, not requiring highly qualified technical personnel, and can be carried out by personnel from the agroindustry itself in their routine of monitoring the health of plantations and their inputs, such as seeds; (2) have a quick analytical response, in a short enough time so that a certain input, such as seeds, is only released for planting after the analytical result confirms the absence of contamination and also so that there is time to isolate a certain contaminated area of the other areas, thus preventing the proliferation of the bacteria; (3) have stable reagents with shelf life that allow multiple analyzes to be performed on the same batch and that support challenging assay conditions derived from their use in the field; (4) have a methodology that includes surface and environmental samples, such as leaves, stems, seeds, benches, among others, so that, if contamination is confirmed, it is possible to identify its origin, and not only its result, which this is what happens when only the final product (after harvest) is analyzed; (5) have a visually perceptible colorimetric response, without the need to use sophisticated equipment; and (6) be able to detect contamination even in samples that have interferences, such as residues of raw materials, cleaning products, among others.

[024] Por fim, após diversos testes e melhorias, os inventores chegaram à configuração aqui apresentada, ou seja, um método inovador, que consiste em simplificada abordagem experimental, facilitada mão-de-obra dos operadores e redução dos riscos envolvidos, além da não-dependência de equipamentos específicos e dispendiosos. O resultado obtido pela metodologia de análise é a confirmação da presença de contaminação de forma colorimétrica e visual, sendo verificável a olho nu em um tempo máximo de 12 horas. A metodologia executada para a detecção de Pseudomonas syringae a partir do kit composto com o aptasensor de oligonucleotídeo aqui apresentada traz acelerado poder de decisão para a cadeia de controle de qualidade da agroindústria, sendo altamente inovador na sua aplicabilidade dentro dos mercados previamente discorridos.[024] Finally, after several tests and improvements, the inventors arrived at the configuration presented here, that is, an innovative method, which consists of a simplified experimental approach, facilitated manpower for operators and reduction of the risks involved, in addition to the non-dependence on specific and expensive equipment. The result obtained by the analysis methodology is the confirmation of the presence of contamination in a colorimetric and visual way, being verifiable with the naked eye in a maximum time of 12 hours. The methodology performed for the detection of Pseudomonas syringae from the kit composed with the aptasensor of oligonucleotide presented here brings accelerated power of decision to the chain of quality control of the agroindustry, being highly innovative in its applicability within the previously discussed markets.

[025] RESUMO DA INVENÇÃO - Método qualitativo de detecção colorimétrica da presença de Pseudomonas syringae baseado em nanopartículas de ouro e aptâmero caracterizado por ser específico para análise de amostras de superfície oriundas da cadeia agrícola (amostras de tecido de folhas, sementes, superfícies), sendo composto de aptasensor contendo nanopartícula de ouro e aptâmero principal (SEQ ID NO: 1) e kit para execução do método composto por esse aptasensor, kit esse composto por recipiente contendo volume suficiente para a execução das análises preferencialmente elaborado a partir de placas poliméricas compostas por 96 ou 24 poços, ou alternativamente estante contendo microtubos (tipo eppendorf).[025] SUMMARY OF THE INVENTION - Qualitative method of colorimetric detection of the presence of Pseudomonas syringae based on gold nanoparticles and aptamer characterized by being specific for the analysis of surface samples from the agricultural chain (tissue samples from leaves, seeds, surfaces), being composed of an aptasensor containing gold nanoparticle and main aptamer (SEQ ID NO: 1) and a kit for carrying out the method composed of this aptasensor, a kit comprising a container containing sufficient volume to perform the analysis, preferably made from composite polymer plates for 96 or 24 wells, or alternatively a rack containing microtubes (eppendorf type).

[026] Lista de desenhos e sua explicação:[026] List of drawings and their explanation:

[027] Figura 1 - Esquema experimental da sonda oligonucleotídica.[027] Figure 1 - Experimental scheme of the oligonucleotide probe.

[028] Figura 2 - Problemática causada por interferentes.[028] Figure 2 - Problem caused by interference.

[029] Figura 3 - Solução proposta para o problema causado por interferentes através da otimização da metodologia de síntese tornando a sonda oligonucleotídica menos sensível aos interferentes.[029] Figure 3 - Proposed solution to the problem caused by interferents by optimizing the synthesis methodology, making the oligonucleotide probe less sensitive to interferents.

[030] Figura 4 - Tamanho das nanopartículas de ouro obtidas através de análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM).[030] Figure 4 - Size of gold nanoparticles obtained through transmission electron microscopy (TEM) analysis.

[031] Figura 5 - Teste de especificidade e seletividade da resposta analítica do método para Pseudomonas syringae e Escherichia coli.[031] Figure 5 - Test of specificity and selectivity of the analytical response of the method for Pseudomonas syringae and Escherichia coli.

[032] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO - Detalhadamente, a invenção consiste de um Aptasensor para detecção da presença de Pseudomonas syringae em amostras de superfícies e amostras vegetais através de método visual colorimétrico composto por nanopartícula de ouro e aptâmero sequência SEQ ID NO: 1. O aptasensor da presente invenção é portanto composto de nanopartículas de ouro e oligonucleotídeo, caracterizado por sua estabilização ser promovida pela interação das moléculas à superfície da nanopartícula, por afinidade eletrostática que é fortalecida quando são utilizados AuNPs com tamanho de partícula padronizadas a aproximadamente 20nm.[032] DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION - In detail, the invention consists of an Aptasensor for detecting the presence of Pseudomonas syringae in surface samples and plant samples through a visual colorimetric method composed of a gold nanoparticle and aptamer sequence SEQ ID NO: 1. aptasensor of the present invention is therefore composed of gold nanoparticles and oligonucleotide, characterized by its stabilization being promoted by the interaction of molecules on the surface of the nanoparticle, by electrostatic affinity that is strengthened when AuNPs with particle size standardized at approximately 20nm are used.

[033] A fim de resolver o problema do estado da técnica, isto é, disponibilizar no mercado um método de detecção de presença de contaminação por Pseudomonas syringae, espécie que mais afeta as plantações, em amostras de campo, com as características de ser simples e com resposta visual, não necessitar de equipamentos sofisticados ou pessoal técnico especializado, ser portátil e ter resposta analítica rápida, ser estável, aplicável a amostras da agroindústria, os inventores testaram diversas modificações na síntese de nanopartículas de ouro, a fim de aumentar a estabilidade do kit, o que reduz a probabilidade de ocorrência de falso positivo. A reação de redução de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) utilizando citrato de sódio foi conduzida em diferentes proporções (2:1, 3,5:1 e 5:1 de citrato de sódio para HAuCl4), diferentes condições de pH (3, 5, 6 e 12), temperatura (temperatura ambiente e a 100 °C) e duração da reação (10 minutos a 24 horas). Outros testes conduzidos pelos inventores, no esforço inventivo para reduzir o tempo de revelação do kit, como testes variando a concentração de aptâmero presente na solução de nanopartículas de ouro e a concentração de aptasensor no produto final, aplicando tais modificações em testes de detecção com o patógeno para confirmação da metodologia utilizada.[033] In order to solve the problem of the state of the art, that is, to make available on the market a method of detecting the presence of contamination by Pseudomonas syringae, the species that most affects plantations, in field samples, with the characteristics of being simple and with visual response, not requiring sophisticated equipment or specialized technical personnel, being portable and having a quick analytical response, being stable, applicable to agro-industry samples, the inventors tested several modifications in the synthesis of gold nanoparticles in order to increase the stability of the kit, which reduces the likelihood of false positives. The reduction reaction of tetrachloroauric acid (HAuCl4) using sodium citrate was carried out in different proportions (2:1, 3.5:1 and 5:1 of sodium citrate to HAuCl4), different pH conditions (3, 5, 6 and 12), temperature (room temperature and at 100 °C) and reaction duration (10 minutes to 24 hours). Other tests conducted by the inventors, in an inventive effort to reduce the development time of the kit, such as tests varying the concentration of aptamer present in the solution of gold nanoparticles and the concentration of aptasensor in the final product, applying such modifications in detection tests with the pathogen to confirm the methodology used.

[034] Na Figura 1 temos um exemplo da reação que ocorre no método de detecção da presença de P. syringae, resultando em uma resposta colorimétrica visual positiva verdadeira, porém sem considerar a ação de interferentes, que estão comumente presentes em amostras reais da cadeia produtiva da agroindústria. Já na Figura 2 podemos verificar a problemática causada quando estes interferentes estão presentes nas amostras, que mesmo na ausência de P. syringae, apresenta uma resposta colorimétrica visual positiva falsa, devido aos interferentes. Já na Figura 3, o que temos é o proposto pela presente invenção, ou seja, a funcionalização (conjugação por afinidade eletrostática) do aptâmero com as nanopartículas de ouro a qual possui uma estabilidade adicional devido a formação de uma rede ou estrutura tridimensional formada pela conjugação entre as nanopartículas de ouro e os aptâmeros, o que faz com que, mesmo na presença de interferentes, o aptâmero ligue-se à P. syringae e não ao interferente, resultando em uma resposta colorimétrica visual positiva verdadeira, mesmo na presença de interferentes.[034] In Figure 1 we have an example of the reaction that occurs in the method of detecting the presence of P. syringae, resulting in a true positive visual colorimetric response, but without considering the action of interferents, which are commonly present in real samples of the chain agribusiness production. In Figure 2, we can see the problem caused when these interferents are present in the samples, which even in the absence of P. syringae, presents a false positive visual colorimetric response, due to the interferents. In Figure 3, what we have is what is proposed by the present invention, that is, the functionalization (conjugation by electrostatic affinity) of the aptamer with the gold nanoparticles, which has an additional stability due to the formation of a network or three-dimensional structure formed by the conjugation between the gold nanoparticles and the aptamers, which means that, even in the presence of interferents, the aptamer binds to P. syringae and not to the interferent, resulting in a true positive visual colorimetric response, even in the presence of interferents .

[035] A escolha do aptâmero se deu com base na busca pela literatura. Como não foi encontrado um aptâmero específico para P. syringae, optou-se pela avaliação da sequência do aptâmero utilizado para P. aeruginosa no artigo “Selective capture and sensitive fluorometric determination of Pseudomonas aeruginosa by using aptamer modified magnetic nanoparticles” publicado na revista Microchimica Acta em julho de 2018, pelos pesquisadores Z. Zhong, X. Gao, R. Gao e L. Jia, que relata uma metodologia de detecção por fluorescência de P. aeruginosa através de nanopartículas magnéticas funcionalizadas com aptâmero. Como a única espécie de Pseudomonas que causa prejuízos à cadeia da agroindústria é a syringae, os inventores concentraram seus esforços inventivos nesta espécie. A validação da sequência se deu através da realização de inúmeros ensaios que avaliaram a eficiência do aptâmero sequência SEQ ID NO: 1 conjugado as nanopartículas de ouro em manter a habilidade de detectar P. syringae.[035] The choice of aptamer was based on the literature search. As no specific aptamer was found for P. syringae, we chose to evaluate the sequence of the aptamer used for P. aeruginosa in the article “Selective capture and sensitive fluorometric determination of Pseudomonas aeruginosa by using aptamer modified magnetic nanoparticles” published in the journal Microchimica Acta in July 2018, by researchers Z. Zhong, X. Gao, R. Gao and L. Jia, who report a methodology for fluorescence detection of P. aeruginosa through aptamer-functionalized magnetic nanoparticles. As the only Pseudomonas species that causes damage to the agroindustry chain is syringae, the inventors concentrated their inventive efforts on this species. The validation of the sequence was carried out through numerous assays that evaluated the efficiency of the aptamer sequence SEQ ID NO: 1 conjugated to gold nanoparticles in maintaining the ability to detect P. syringae.

[036] O processo de funcionalização é caracterizado pela etapa de conjugação por afinidade eletrostática entre as nanopartículas de ouro sintetizadas e o aptâmero sequência SEQ ID NO:1 por 12 a 24 horas, preferencialmente 18 h a 37 0C sem agitação.[036] The functionalization process is characterized by the step of electrostatic affinity conjugation between the synthesized gold nanoparticles and the aptamer sequence SEQ ID NO:1 for 12 to 24 hours, preferably 18 h at 37 0C without agitation.

[037] As nanopartículas de ouro sintetizadas apresentaram uma diâmetro de partícula médio entre 12 a 25 nm, como observado na Figura 4, que apresenta uma imagem obtida por análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) em que o tamanho das partículas varia de 12 a 25 nm, possibilitando atingir maiores tempos de estabilidade de vida de prateleira dos kits elaborados com aptasensor do presente invento.[037] The synthesized gold nanoparticles had an average particle diameter between 12 and 25 nm, as seen in Figure 4, which presents an image obtained by transmission electron microscopy (TEM) analysis in which the particle size varies from 12 at 25 nm, making it possible to achieve longer shelf life stability times for kits made with the aptasensor of the present invention.

[038] Devido a ausência de tecnologia competitiva semelhante para a análise de amostras vegetais e ambientais, e alta seletividade reportada para Pseudomonas syringae, os inventores trouxeram à luz tecnologia com unicidade e aplicabilidade prática para o mercado industrial e agrícola. O propósito do uso do kit é acelerar a cadeia produtiva com a detecção antecipada e precoce da doença de plantas causada pela Pseudomonas syringae, substituindo o tratamento com agrotóxicos que hoje é utilizado como paliativo, através da utilização desse kit, pois com ele o produtor poderá se preparar e pensar em um método/estratégia preventiva, reduzindo custos de produção e dando agilidade para a cadeia produtiva da agroindústria, sem a necessidade da utilização indiscriminada de agrotóxicos.[038] Due to the absence of similar competitive technology for the analysis of plant and environmental samples, and the high selectivity reported for Pseudomonas syringae, the inventors brought to light technology with uniqueness and practical applicability for the industrial and agricultural market. The purpose of using the kit is to accelerate the production chain with the early and early detection of plant disease caused by Pseudomonas syringae, replacing the treatment with pesticides that is currently used as a palliative, through the use of this kit, because with it the producer can prepare and think of a preventive method/strategy, reducing production costs and giving agility to the agroindustry production chain, without the need for the indiscriminate use of pesticides.

[039] Foram realizados ensaios em etapa laboratorial e posteriormente com amostras reais do campo, em planejamento experimental e estatístico adequado. A metodologia final obtida então foi otimizada para a execução com amostras de tecido vegetal que representam a realidade da cadeia produtiva da indústria agrícola. Essa amostra é caracterizada por conter microrganismos contaminantes do ambiente, além de demais células dos tecidos vegetais, como parênquima, esclerênquima, além de compostos interferentes oriundos de estruturas como a cutícula e semelhantes.[039] Tests were carried out in the laboratory stage and later with real samples from the field, in adequate experimental and statistical planning. The final methodology obtained was then optimized for the execution with samples of plant tissue that represent the reality of the production chain of the agricultural industry. This sample is characterized by containing microorganisms contaminating the environment, in addition to other cells of plant tissues, such as parenchyma, sclerenchyma, in addition to interfering compounds from structures such as the cuticle and the like.

[040] Compreende a presente invenção um método de análise para detecção da presença de Pseudomonas syringae em amostras de superfícies e amostras vegetais através de método visual colorimétrico que compreende os seguintes passos: (a) Amostrar superfícies ou amostras vegetais; (b) Enriquecer a amostra com meio de cultivo apropriado e incubação; (c) Adicionar quantidade do caldo enriquecido a uma quantidade suficiente de solução de aptasensor composta por: (i) sonda de nanopartícula de ouro; (ii) aptâmero sequência SEQ ID NO: 1; (d) Aguardar até a completa interação da amostra com o aptasensor; (e) Aguardar por tempo determinado a temperatura controlada; (f) Verificar mudança de cor através de método visual.[040] The present invention comprises an analysis method for detecting the presence of Pseudomonas syringae in surface samples and plant samples through a visual colorimetric method that comprises the following steps: (a) Sampling surfaces or plant samples; (b) Enrich the sample with appropriate culture medium and incubation; (c) Adding an amount of the enriched broth to a sufficient amount of aptasensor solution comprising: (i) gold nanoparticle probe; (ii) aptamer sequence SEQ ID NO: 1; (d) Wait until the complete interaction of the sample with the aptasensor; (e) Wait for a determined time at controlled temperature; (f) Check color change by visual method.

[041] As amostras a serem analisadas podem ser amostradas, não se limitando a, a partir do fracionamento de lotes de sementes ou qualquer material passível de contaminação que possa ser fracionado, pode ser amostrado a através da coleta ambiental com a utilização de swab em superfícies, como plantas e bancadas, ou ainda as amostras podem ser coletadas a partir da água do enxágue de superfícies.[041] The samples to be analyzed can be sampled, not limited to, from the fractionation of seed lots or any material susceptible to contamination that can be fractionated, it can be sampled through environmental collection with the use of swab in surfaces, such as plants and countertops, or samples can be collected from surface rinse water.

[042] A amostra coletada deve ser enriquecida em meio de cultura apropriado, preferencialmente água peptonada tamponada ou em caldo infusão cérebro coração (BHI), após tempo (18 horas) e temperatura (37 0C) de incubação ótimos para o crescimento de Pseudomonas, uma alíquota desse caldo, em uma razão de 1:6 a 3:6 (caldo enriquecido para solução de aptasensor), preferencialmente 1:6, é inoculada na solução de aptasensor. Nesse método desenvolvido, não se faz necessário a adição de solução salina ou obrigatoriedade da utilização de temperatura para mudança de cor da solução de aptasensor. A solução resultante é reservada e mantida em temperatura ambiente (25 - 30 °C) até completa interação entre amostra e aptasensor. O avaliador deve comparar a mudança de coloração da solução nunca ultrapassando o tempo de 12 horas para realizar a avaliação.[042] The collected sample must be enriched in appropriate culture medium, preferably buffered peptone water or in brain heart infusion (BHI) broth, after optimal incubation time (18 hours) and temperature (37 0C) for the growth of Pseudomonas, an aliquot of this broth, in a ratio of 1:6 to 3:6 (enriched broth for aptasensor solution), preferably 1:6, is inoculated into the aptasensor solution. In this developed method, it is not necessary to add saline solution or to use temperature to change the color of the aptasensor solution. The resulting solution is reserved and kept at room temperature (25 - 30 °C) until complete interaction between sample and aptasensor. The evaluator must compare the color change of the solution never exceeding the time of 12 hours to perform the evaluation.

[043] Esta invenção também apresenta um kit para detecção colorimétrica de Pseudomonas syringae para superfícies e amostras vegetais baseado em nanopartículas de ouro e aptâmero que contém (a) recipiente contendo volume suficiente para a execução das análises contendo solução de aptasensor composta de nanopartícula de ouro associada a aptâmero sequência SEQ ID NO: 1, (b) meio de cultivo e (c) manual de instrução.[043] This invention also presents a kit for the colorimetric detection of Pseudomonas syringae for surfaces and plant samples based on gold nanoparticles and aptamer that contains (a) a container containing sufficient volume to perform the analyzes containing an aptasensor solution composed of a gold nanoparticle associated with aptamer sequence SEQ ID NO: 1, (b) culture medium and (c) instruction manual.

[044] O recipiente contendo volume suficiente para a execução das análises pode ser placas poliméricas de 24 ou 96 poços e microtubos (tipo eppendorf), ou outra quantidade que seja mais conveniente para a rotina do laboratório, sendo que as placas poliméricas de 96 poços são mais indicadas quando existe alta demanda amostral no laboratório e as de 24 poços ou microtubos tipo eppendorf quando a demanda amostral é reduzida. Já nas análises onde o fator determinante é a sua portabilidade, o kit pode ser composto por microtubos tipo eppendorf. Tanto as placas poliméricas com poços quando os microtubos já vem preenchidos com a solução de aptasensor, composta por AuNPs e aptâmero SEQ ID NO: 1, sendo esta solução pronta para uso, oferecendo conveniência e diminuindo a chance de erro humano, na quantidade necessária para a análise, sendo necessário somente pipetar a amostra previamente incubada em meio de cultura, na proporção de 1:6 a 3:6 (meio de cultura com amostra para solução de aptasensor), preferencialmente 1:6.[044] The container containing enough volume to perform the analyzes can be polymeric plates of 24 or 96 wells and microtubes (eppendorf type), or another quantity that is more convenient for the routine of the laboratory, being that the polymeric plates of 96 wells are more indicated when there is high sampling demand in the laboratory and those with 24 wells or eppendorf-type microtubes when the sampling demand is reduced. In analyzes where portability is the determining factor, the kit can be composed of eppendorf-type microtubes. Both the polymer plates with wells and the microtubes are already filled with the aptasensor solution, composed of AuNPs and aptamer SEQ ID NO: 1, which is a ready-to-use solution, offering convenience and reducing the chance of human error, in the amount necessary for the analysis, being necessary only pipetting the sample previously incubated in culture medium, in the proportion of 1:6 to 3:6 (culture medium with sample for aptasensor solution), preferably 1:6.

[045] O manual de instruções contido no kit contém um protocolo único especialmente desenvolvido para acompanhar os kits e guiar seu uso, para todas as variações de kit (com placas poliméricas ou microtubos). O manual/protocolo contido no kit pode ser incluído tanto em meio impresso como digital no referido kit.[045] The instruction manual contained in the kit contains a unique protocol specially developed to accompany the kits and guide their use, for all kit variations (with polymeric plates or microtubes). The manual/protocol contained in the kit can be included in both printed and digital media in said kit.

[046] O meio de cultivo/enriquecimento deve ser preparado pelo usuário. No entanto a utilização do kit não requer que o usuário altere a sua rotina laboratorial com o preparo de um meio de cultivo/enriquecimento extra do que já faz parte de sua rotina. Para isso, os inventores trabalharam com meios de cultivo que já são padrão na rotina laboratorial, como água peptonada tamponada ou caldo infusão cérebro coração (BHI).[046] The culture/enrichment medium must be prepared by the user. However, the use of the kit does not require the user to change their laboratory routine with the preparation of an extra culture/enrichment medium that is already part of their routine. For this, the inventors worked with culture media that are already standard in the laboratory routine, such as buffered peptone water or brain-heart infusion (BHI) broth.

[047] O kit composto pelas soluções supramencionadas possui efetividade durante todo seu tempo de estocagem, caracterizado pelas suas modificações em comparação com o apresentado nas demais metodologias previamente discorridas.[047] The kit composed of the aforementioned solutions is effective throughout its storage time, characterized by its modifications compared to that presented in the other previously discussed methodologies.

[048] Detalhadamente, a invenção acima consiste de um método de análise rápida e visual composta de aptasensor baseado em nanopartículas de ouro e aptâmero para controle de qualidade de amostras colhidas de superfícies, com resultado colorimétrico e observado a olho nu. A obtenção do presente invento derivou de extensivo estudo de metodologias descritas como válidas para amostras da agroindústria apresentados no decorrer desta revisão.[048] In detail, the above invention consists of a rapid and visual analysis method composed of an aptasensor based on gold nanoparticles and aptamer for quality control of samples collected from surfaces, with colorimetric results and observed with the naked eye. Obtaining the present invention resulted from an extensive study of methodologies described as valid for samples from the agroindustry presented in the course of this review.

[049] A seguir estão listados exemplos da concretização de dito método inovador, sendo estes exemplos ilustrativos e não esgotam todas as combinações e possibilidades para design de solução construída a partir dos inventos descritos nessa patente.[049] Below are listed examples of the implementation of said innovative method, these examples being illustrative and do not exhaust all combinations and possibilities for designing a solution built from the inventions described in that patent.

[050] EXEMPLO 1 - Ensaios com placas poliméricas de 96 poços e alta demanda amostral[050] EXAMPLE 1 - Assays with 96-well polymeric plates and high sample demand

[051] Neste exemplo de concretização da invenção, um operador da agroindústria realiza amostragem de superfície de folhas através da coleta por swab. Esse material é embalado e transportado até a unidade laboratorial, onde será embebido em meio de cultura água peptonada tamponada. Essa mistura é incubada durante 18 h a 37 °C. Após esse tempo, o analista responsável retira uma alíquota do caldo enriquecido de 20 a 40 μL com uma micropipetadora e inocula sobre um poço contendo 120 μL contendo solução de aptasensor, já previamente identificado para registro posterior. O kit é incubado a temperatura ambiente por 12 h, e então o analista verifica se houve alteração visual de coloração de vermelho para azul no poço logo antes e depois da incubação. Caso haja alteração de cor, identifica-se a contaminação no ponto de coleta amostrado pelo swab. Caso não haja alteração de cor, confirma-se a ausência de contaminação no ponto de coleta amostrado pelo swab. Esse processo pode ser repetido concomitantemente na mesma placa para até 96 amostras.[051] In this example of embodiment of the invention, an agroindustry operator performs leaf surface sampling through swab collection. This material is packaged and transported to the laboratory unit, where it will be soaked in buffered peptone water culture medium. This mixture is incubated for 18 h at 37 °C. After this time, the responsible analyst removes an aliquot of the enriched broth from 20 to 40 μL with a micropipettor and inoculates it onto a well containing 120 μL containing aptasensor solution, previously identified for later recording. The kit is incubated at room temperature for 12 h, then the analyst checks for a visual change in color from red to blue in the well just before and after incubation. If there is a color change, contamination is identified at the collection point sampled by the swab. If there is no color change, the absence of contamination at the collection point sampled by the swab is confirmed. This process can be repeated concurrently on the same plate for up to 96 samples.

[052] EXEMPLO 2 - Ensaios com placas poliméricas de 24 poços e demanda amostral reduzida.[052] EXAMPLE 2 - Assays with 24-well polymeric plates and reduced sample demand.

[053] Neste exemplo de concretização da invenção, um operador da agroindústria realiza amostragem por lote de certa quantia de sementes seguida da incubação das mesmas. Esse material é embalado e transportado até a unidade laboratorial, onde será embebido em meio de cultura água peptonada tamponada. Essa mistura é incubada durante 18 h a 37 °C. Após esse tempo, o analista responsável retira uma alíquota do caldo enriquecido de 20 a 40 μL com uma micropipetadora e inocula sobre um poço contendo 120 μL contendo solução de aptasensor, já previamente identificado para registro posterior. O kit é incubado a temperatura ambiente por 12 h, e então o analista verifica se houve alteração visual de coloração de vermelho para azul no poço logo antes e depois da incubação. Caso haja alteração de cor, identifica-se a contaminação do lote de onde a amostra foi coletada. Caso não haja alteração de cor, confirma-se a ausência de contaminação no ponto de coleta amostrado. Esse processo pode ser repetido concomitantemente na mesma placa para até 24 amostras.[053] In this example of embodiment of the invention, an agroindustry operator performs sampling by batch of a certain amount of seeds followed by their incubation. This material is packaged and transported to the laboratory unit, where it will be soaked in buffered peptone water culture medium. This mixture is incubated for 18 h at 37 °C. After this time, the responsible analyst removes an aliquot of the enriched broth from 20 to 40 μL with a micropipettor and inoculates it onto a well containing 120 μL containing aptasensor solution, previously identified for later recording. The kit is incubated at room temperature for 12 h, then the analyst checks for a visual change in color from red to blue in the well just before and after incubation. If there is a color change, the contamination of the batch from which the sample was collected is identified. If there is no color change, the absence of contamination at the sampled collection point is confirmed. This process can be repeated concurrently on the same plate for up to 24 samples.

[054] EXEMPLO 3 - Ensaios com microtubos (tipo eppendorf) carregados com o aptasensor, para análises que demandem portabilidade.[054] EXAMPLE 3 - Assays with microtubes (eppendorf type) loaded with the aptasensor, for analyzes that demand portability.

[055] Neste exemplo de concretização da invenção, um operador da agroindústria realiza amostragem de superfícies através da coleta de água de enxágue/lavagem da superfície ou coleta por swab. Esse material é embalado e transportado até a unidade laboratorial, onde será embebido em meio de cultura caldo infusão cérebro coração (BHI). Essa mistura é incubada durante 18 h a 37 °C. Após esse tempo, o analista responsável retira uma alíquota do caldo enriquecido de 200 a 400 μL com uma micropipetadora e inocula em um microtubo tipo eppendorf contendo 1,2 mL de solução de aptasensor, já previamente identificado para registro posterior. O kit é incubado a temperatura ambiente por 12 h e então o analista verifica se houve alteração visual de coloração de vermelho para azul no tubo logo antes e depois da incubação. Caso haja alteração de cor, identifica-se a contaminação no ponto de coleta amostrado. Caso não haja alteração de cor, confirma-se a ausência de contaminação no ponto de coleta amostrado. Esse processo pode ser repetido concomitantemente em diversos microtubos presentes na mesma estante.[055] In this example of embodiment of the invention, an agroindustry operator performs surface sampling by collecting surface rinse/wash water or swab collection. This material is packaged and transported to the laboratory unit, where it will be soaked in brain-heart infusion (BHI) broth culture medium. This mixture is incubated for 18 h at 37 °C. After this time, the responsible analyst removes an aliquot of the enriched broth from 200 to 400 μL with a micropipettor and inoculates it into an eppendorf-type microtube containing 1.2 mL of aptasensor solution, previously identified for later recording. The kit is incubated at room temperature for 12 h and then the analyst checks for a visual change in color from red to blue in the tube just before and after incubation. If there is a color change, contamination is identified at the sampled collection point. If there is no color change, the absence of contamination at the sampled collection point is confirmed. This process can be repeated concurrently in several microtubes present on the same rack.

[056] RESULTADOS DE ESTUDOS - para demonstrar a estabilidade, segurança e vantagens da formulação, realizaram-se os estudos de eficácia com o alvo e com o controle:[056] STUDY RESULTS - to demonstrate the stability, safety and advantages of the formulation, efficacy studies were carried out with the target and with the control:

[057] Tabela 1. comparação entre estabilidade de vida de prateleira dos kits elaborados com aptasensor do presente invento em comparação com o protocolo controle de qualidade em ensaio laboratorial:

[057] Table 1. Comparison between shelf life stability of kits made with aptasensor of the present invention compared to the quality control protocol in laboratory testing:

[058] Tabela 2. Tempo para identificação colorimétrica das concentrações de inóculo:

[058] Table 2. Time for colorimetric identification of inoculum concentrations:

[059] Teste de especificidade e seletividade da resposta analítica do método para Pseudomonas syringae e Escherichia coli[059] Test of specificity and selectivity of the analytical response of the method for Pseudomonas syringae and Escherichia coli

[060] Foi realizado um teste, cujo resultado pode ser visualizado na Figura 5, demonstrando a aparência do kit em até 12 h de contato com diferentes concentrações de Pseudomonas syringae e a bactéria controle Escherichia coli, para avaliar a especificidade e seletividade do aptasensor desta invenção frente à outros possíveis fitopatógenos comumente encontrados em amostras vegetais, comparando a resposta analítica do método utilizando Pseudomonas syringae em diferentes concentrações e Escherichia coli nas mesmas concentrações. Como podemos perceber na figura 5, apenas amostras contendo P. syringae tornaram-se azul, demonstrando assim a especificidade e seletividade do método frente ao fitopatógeno através da avaliação de cor em comparação com a bactéria controle.[060] A test was performed, the result of which can be seen in Figure 5, demonstrating the appearance of the kit in up to 12 h of contact with different concentrations of Pseudomonas syringae and the control bacterium Escherichia coli, to evaluate the specificity and selectivity of the aptasensor of this invention against other possible phytopathogens commonly found in plant samples, comparing the analytical response of the method using Pseudomonas syringae at different concentrations and Escherichia coli at the same concentrations. As we can see in Figure 5, only samples containing P. syringae turned blue, thus demonstrating the specificity and selectivity of the method against the phytopathogen through the evaluation of color in comparison with the control bacterium.

Claims

Aptasensor for the detection of Pseudomonas Syringae CHARACTERIZED BY detecting its presence, being specific for surfaces and plant samples through a visual colorimetric method, presenting a three-dimensional structure in the form of a network, composed of:

a) gold nanoparticle
b) aptamer sequence SEQ ID NO: 1.

Aptasensor for detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 1 CHARACTERIZED IN THAT said gold nanoparticle has a particle size of 12 to 25 nm, preferably 20 nm.

Pseudomonas Syringae detection method CHARACTERIZED BY detecting its presence, being specific for surfaces and plant samples through a visual colorimetric method and understanding the following steps:
a) Sampling surfaces or plant samples;
b) Enrich the sample with appropriate culture medium and incubation;
c) Add a quantity of the enriched broth to a sufficient quantity of aptasensor solution composed of:

i. gold nanoparticle;
ii. aptamer sequence SEQ ID NO: 1;

d) Wait until the complete interaction of the sample with the aptasensor;
e) Wait for a determined time at controlled temperature;
f) Check color change by visual method.

Method of detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 3 CHARACTERIZED BY said suitable culture medium of item (b) is preferably peptone buffered water and said incubation is at 37°C +/- 2°C for 18 h to 24 h.

Method of detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 3 CHARACTERIZED BY said ratio of item (c) between the amount of enriched broth and said amount of aptasensor being from 1:6 to 3:6 (broth for aptasensor solution), preferably 1:6.

Method of detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 3 CHARACTERIZED BY said aptasensor of item (c) having a three-dimensional structure in the form of a network.

Pseudomonas Syringae detection method according to Claim 3 CHARACTERIZED BY said gold nanoparticle of item (c) having a particle size of 12 to 25 nm, preferably 20 nm.

Method of detecting Pseudomonas Syringae according to Claim 3 CHARACTERIZED IN THAT said controlled temperature of item (e) is preferably room temperature.

Kit for the colorimetric detection of Pseudomonas Syringae CHARACTERIZED BY detecting its presence, being specific for surfaces and plant samples based on gold and aptamer nanoparticles and understanding:

a) container containing sufficient volume to perform the analyzes containing aptasensor solution composed of gold nanoparticle associated with aptamer sequence SEQ ID NO: 1;
b) culture medium;
c) instruction manual.

Kit for the colorimetric detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 9 CHARACTERIZED BY said container containing sufficient volume to carry out the analyzes preferably being polymeric plates composed of 96 or 24 wells or alternatively eppendorf-type microtubes.

Kit for colorimetric detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 9 CHARACTERIZED BY said volume sufficient for the execution of the analyzes to be composed of 1 to 3 parts in volume of inoculated sample for 6 parts of aptasensor, preferably 1 part of inoculated sample for 6 of aptasensor.

Kit for the colorimetric detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 9 CHARACTERIZED BY said aptasensor of item (a) having a three-dimensional structure in the form of a network.

Kit for colorimetric detection of Pseudomonas Syringae according to Claim 9 CHARACTERIZED BY said gold nanoparticle of item (a) having a particle size of 12 to 25 nm, preferably 20 nm.