BR102020016004A2

BR102020016004A2 - Enzymatic method to prepare a monounsaturated alkene

Info

Publication number: BR102020016004A2
Application number: BR102020016004-4A
Authority: BR
Inventors: Gabriela Felix Persinoti; Leticia Leandro Rade; Amanda Silva De Sousa; Leticia Maria Zanphorlin
Original assignee: Cnpem - Centro Nacional De Pesquisa Em Energia E Materiais
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2022-04-12

Abstract

"MÉTODO ENZIMÁTICO PARA PREPARAR UM ALCENO MONOINSATURADO". A presente invenção trata de um método enzimático para preparar um alceno monoinsaturado através de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID No: 1, com um ácido graxo. Os polipeptídeos da presente invenção apresentam atividade enzimática de peroxigenase de ácidos graxos superior e ocorre em faixas amplas de pH e temperatura, sendo vantajosos para produção de alcenos monoinsaturados úteis como bioprodutos.

"ENZYMATIC METHOD FOR PREPARING A MONOUNSATURATED Alkene". The present invention deals with an enzymatic method for preparing a monounsaturated alkene via a peptide comprising an amino acid sequence SEQ ID No: 1, with a fatty acid. The polypeptides of the present invention exhibit superior fatty acid peroxygenase enzymatic activity and occur over wide pH and temperature ranges, being advantageous for the production of monounsaturated alkenes useful as byproducts.

Description

ENZYMATIC METHOD TO PREPARE A MONOUNSATURATED Alkene

SEQUENCE LISTING REFERENCE

[001] Este pedido contém uma listagem de sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.[001] This request contains a listing of sequences in computer readable form. The computer readable form is incorporated herein by reference.

FIELD OF THE INVENTION

[002] A presente invenção se insere nas grandes áreas química e ambiental. Especificamente a invenção refere-se a métodos enzimáticos aperfeiçoados para a produção de alquenos úteis na produção de biocombustíveis e/ou produtos bioquímicos.[002] The present invention is part of the broad chemical and environmental areas. Specifically the invention relates to improved enzymatic methods for producing alkenes useful in the production of biofuels and/or biochemicals.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[003] A indústria da aviação mundial representa 2% das emissões globais de dióxido de carbono (CO2), sendo que esses níveis podem triplicar até 2050 caso não sejam tomadas medidas para redução da emissão de gases poluentes principalmente devido a queima de combustíveis fósseis (Associação Internacional do Transporte Aéreo - IATA, 2011 - disponível em bit.ly/3c4ZMAQ) . Dessa forma, há um interesse em participar de um esforço global para mitigar as emissões de gases de efeito estufa por meio, por exemplo, do emprego de bio-combustíveis.[003] The world aviation industry represents 2% of global emissions of carbon dioxide (CO2), and these levels could triple by 2050 if measures are not taken to reduce the emission of polluting gases mainly due to the burning of fossil fuels ( International Air Transport Association - IATA, 2011 - available at bit.ly/3c4ZMAQ) . Thus, there is an interest in participating in a global effort to mitigate greenhouse gas emissions through, for example, the use of biofuels.

[004] Os biocombustíveis produzidos de forma sustentável reduzem as emissões de CO2 em todo o seu ciclo de vida, em relação aos combustíveis fósseis. O dióxido de carbono absorvido pelas plantas durante o crescimento da biomassa é equivalente à quantidade produzida quando o combustível é queimado em um motor de combustão, quando será devolvido para a atmosfera. Esse processo permite que o biocombustível receba a condição de carbono neutro durante o seu ciclo de vida (Llamas, A. et al. Energy & Fuels. 26: 5968-76, 2012).[004] Sustainably produced biofuels reduce CO2 emissions throughout their life cycle compared to fossil fuels. The carbon dioxide absorbed by plants during biomass growth is equivalent to the amount produced when the fuel is burned in a combustion engine, when it will be returned to the atmosphere. This process allows the biofuel to be carbon neutral during its life cycle (Llamas, A. et al. Energy & Fuels. 26: 5968-76, 2012).

[005] Atualmente o foco da indústria está no desenvolvimento de biocombustíveis do tipo drop-in. Totalmente compatíveis com as tecnologias atuais e provenientes de fontes renováveis, esses combustíveis podem ser misturados em proporções adequadas com o querosene de aviação de origem fóssil, sem necessidade de alterações nos motores, aeronaves e infraes-trutura de distribuições já existentes. Uma de suas vantagens é seu uso sem comprometer a segurança do sistema de aviação (Mikulec, J et al. Journal of Cleaner Production. 18: 91726, 2010).[005] Currently the focus of the industry is on the development of drop-in type biofuels. Fully compatible with current technologies and from renewable sources, these fuels can be blended in adequate proportions with fossil-based aviation kerosene, without the need for changes to existing engines, aircraft and distribution infrastructure. One of its advantages is its use without compromising the safety of the aviation system (Mikulec, J et al. Journal of Cleaner Production. 18: 91726, 2010).

[006] Os alcenos são hidrocarbonetos alifáticos, com ao menos uma insaturação (ligação dupla) entre os carbonos, que apresentam alta hidrofobicidade e possuem alto poder energético. Tais características tornam os alcenos úteis em diversas áreas da indústria, como aditivos, lubrificantes, detergentes, plastificantes, pesticidas e também compatíveis com a infraestrutura já existente para os combustíveis de origem fóssil e, consequentemente, excelentes precursores para a produção de combustíveis drop-in.[006] Alkenes are aliphatic hydrocarbons, with at least one unsaturation (double bond) between the carbons, which have high hydrophobicity and high energy power. Such characteristics make alkenes useful in several areas of industry, such as additives, lubricants, detergents, plasticizers, pesticides and also compatible with the existing infrastructure for fossil fuels and, consequently, excellent precursors for the production of drop-in fuels. .

[007] O maior desafio para a produção de biocombustíveis drop-in a partir de óleo vegetal ou de materiais lignocelu-lósicos consiste na presença de intermediários oxigenados. Devido à presença do oxigênio, processos termoquímicos em alta temperatura, pressão e metais pesados, além de grande input de hidrogenação são necessários, uma vez que a presença desse elemento no combustível causa corrosão nas peças e motores dos veículos, bem como modifica a densidade e ponto de congelamento do líquido.[007] The biggest challenge for the production of drop-in biofuels from vegetable oil or lignocellulosic materials is the presence of oxygenated intermediates. Due to the presence of oxygen, thermochemical processes at high temperature, pressure and heavy metals, in addition to a large hydrogenation input, are necessary, since the presence of this element in the fuel causes corrosion in vehicle parts and engines, as well as changes the density and freezing point of the liquid.

[008] Nesse sentido, rotas biotecnológicas por meio do uso de enzimas têm sido empregadas como uma alternativa amigavelmente mais sustentável e específica para produção de combustíveis drop-in.[008] In this sense, biotechnological routes through the use of enzymes have been employed as a more sustainable and specific alternative for the production of drop-in fuels.

[009] Por exemplo, o documento de patente US 2013/330,795 (A1) descreve um método em duas etapas para preparação de alcenos monoinsaturados a partir de ácidos graxos monoinsa-turados empregando um polipolipeptídio Fdc1 e um polipetídeo Pad1 apresentando ação de descarboxilase.[009] For example, US patent document 2013/330,795 (A1) describes a two-step method for preparing monounsaturated alkenes from monounsaturated fatty acids employing a Fdc1 polypeptide and a Pad1 polypeptide having decarboxylase action.

[010] Representantes da classe de peroxigenases tornaram-se um importante alvo de estudo neste campo após a descoberta e caracterização da enzima P450 descarboxilase OleTJE de Je-otgalicoccus sp., pertencente à família CYP152, primeira enzima reportada por realizar predominantemente a descarboxi-lação oxidativa de ácidos graxos de tamanho médio e longo, na presença de H2O2, para produção de 1-alcenos como produto final (Rude, MA et al. Appl Environ Microbiol. 2011;77(5):1718-27). Nesse artigo, é demonstrado que o processo enzimático ocorre apenas em pH 7,2, mostrando ser uma desvantagem quando se trata do uso para tratar substratos ácidos.[010] Representatives of the class of peroxygenases have become an important target of study in this field after the discovery and characterization of the enzyme P450 decarboxylase OleTJE from Je-otgalicoccus sp., belonging to the CYP152 family, the first enzyme reported to predominantly perform decarboxylation oxidation of medium and long sized fatty acids, in the presence of H2O2, to produce 1-alkenes as a final product (Rude, MA et al. Appl Environ Microbiol. 2011;77(5):1718-27). In this article, it is demonstrated that the enzymatic process occurs only at pH 7.2, proving to be a disadvantage when it comes to use to treat acidic substrates.

[011] Da mesma forma, o documento de patente US 8.183.028 (A1) descreve um polipeptídio com atividade de descarboxilase de ácido graxo proveniente de bactéria do gênero Je-otgalicoccus sp., útil na preparação de olefinas terminais. Contudo, uma vez que a enzima descrita performa em pH neutro (7,2 e 7,5), o processo demanda uma etapa de pré-tratamento do substrato para que haja formação de sais de ácidos graxos, representando uma desvantagem do método descrito.[011] Likewise, patent document US 8,183,028 (A1) describes a polypeptide with fatty acid decarboxylase activity from bacteria of the genus Je-otgalicoccus sp., useful in the preparation of terminal olefins. However, since the described enzyme performs at neutral pH (7.2 and 7.5), the process requires a pre-treatment step of the substrate for the formation of fatty acid salts, representing a disadvantage of the described method.

[012] Assim, existe a necessidade de identificação de novas fontes de obtenção de peroxigenases, bem como do desenvolvimento de métodos enzimáticos vantajosos para obtenção de olefinas úteis como biocombustíveis e outros bioprodutos a partir dessas enzimas.[012] Thus, there is a need to identify new sources for obtaining peroxygenases, as well as the development of advantageous enzymatic methods to obtain useful olefins as biofuels and other bioproducts from these enzymes.

SUMMARY OF THE INVENTION

[013] Em uma primeira modalidade, a presente invenção des- creve um método para preparar um alceno monoinsaturado a partir de um ácido graxo empregando-se um polipolipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID No: 1 e apresentando atividade enzimática de peroxigenase.[013] In a first embodiment, the present invention describes a method for preparing a monounsaturated alkene from a fatty acid using a polypeptide comprising an amino acid sequence SEQ ID No: 1 and having peroxygenase enzymatic activity.

[014] Os polipeptídios da presente invenção, também referidos como "polipeptídios RN" ou "enzima RN", são oriundos de micro-organismos, preferencialmente de bactérias do gênero Rothia sp. e, em uma modalidade preferencial, os polipeptí-dios da invenção são expressos por uma célula hospedeira recombinante.[014] The polypeptides of the present invention, also referred to as "RN polypeptides" or "RN enzyme", come from microorganisms, preferably from bacteria of the genus Rothia sp. and, in a preferred embodiment, the polypeptides of the invention are expressed by a recombinant host cell.

[015] Para o melhor de nosso conhecimento, as enzimas da classe citocromo P450 (CY450) descarboxilase da família 152 descritas no estado da técnica, e.g. OleTJE, apresentam uma série de restrições, tais como faixa de temperatura de trabalho muito estreita, geralmente limitada à temperatura ambiente, e faixa de pH ótimo muito apertada, geralmente próxima do pH neutro ou 7,0, limitando a sua atividade enzimática. Tais restrições tem dificultado o uso dessas enzimas na conversão de ácidos graxos em alcenos monoinsaturados terminais úteis na síntese de biocombustíveis, o que implica na necessidade do uso de mais de uma enzima e/ou um processo multi-etapas, incluindo o tratamento do substrato para ajuste pH, a fim de aumentar o rendimento do produto obtido.[015] To the best of our knowledge, the enzymes of the cytochrome P450 (CY450) decarboxylase class of the family 152 described in the prior art, e.g. OleTJE, have a number of restrictions, such as a very narrow working temperature range, usually limited to room temperature, and a very tight optimal pH range, usually close to neutral pH or 7.0, limiting their enzymatic activity. Such restrictions have hampered the use of these enzymes in the conversion of fatty acids into terminal monounsaturated alkenes useful in the synthesis of biofuels, which implies the need to use more than one enzyme and/or a multi-step process, including the treatment of the substrate to adjust pH in order to increase the yield of the product obtained.

[016] Os polipeptídios RN compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 incluídos no escopo da invenção também pertencem à família de enzimas citocromo P450 descarboxilase mencionada acima. Contudo, tais polipeptídios apresentam atividade enzimática em faixas de temperatura e pH surpreendentemente amplas, contrariando qualquer expectativa de um técnico no assunto teria à luz dos ensinamentos da técnica para outros polipeptídios da mesma classe de enzimas.[016] The RN polypeptides comprising the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 included in the scope of the invention also belong to the family of cytochrome P450 decarboxylase enzymes mentioned above. However, such polypeptides exhibit enzymatic activity over surprisingly wide temperature and pH ranges, contrary to any expectations one skilled in the art would have in light of the teachings of the art for other polypeptides of the same enzyme class.

[017] Por exemplo, em uma das modalidades da presente invenção, os polipeptídios compreendendo a sequência de aminoá-cidos SEQ ID No: 1 apresentam atividade enzimática de des-carboxilase em uma faixa de temperatura variando entre aproximadamente 20 °C e aproximadamente 50 °C e em uma faixa de pH variando entre aproximadamente 5,0 e aproximadamente 9,0, o que permite o emprego desses polipeptídios em métodos para obtenção de alcenos monoinsaturados a partir de ácidos graxos que exigem apenas uma etapa de conversão, não exigindo um pré-tratamento do substrato como, por exemplo, conversão do ácido graxo em sais de ácidos graxos, e com rendimento superior .[017] For example, in one of the embodiments of the present invention, polypeptides comprising the amino acid sequence SEQ ID No: 1 exhibit de-carboxylase enzymatic activity in a temperature range ranging from approximately 20 °C to approximately 50 ° C and in a pH range ranging from approximately 5.0 to approximately 9.0, which allows the use of these polypeptides in methods for obtaining monounsaturated alkenes from fatty acids that require only one conversion step, not requiring a pre - substrate treatment such as, for example, conversion of fatty acid into fatty acid salts, and with superior yield.

[018] Uma outra limitação das enzimas da classe citocromo P450 (CY450) descarboxilase da família 152 descritas no estado da técnica (OleTjE) se dá em relação à sua capacidade de conversão de ácidos graxos nas olefinas terminais correspondentes, especialmente limitada para ácidos graxos de cadeia longa.[018] Another limitation of the cytochrome P450 (CY450) decarboxylase family 152 enzymes described in the state of the art (OleTjE) is related to their ability to convert fatty acids into the corresponding terminal olefins, especially limited for fatty acids of long chain.

[019] Assim, em uma concretização da invenção, os inventores da presente invenção identificaram que os peptídeos RN apresentam uma eficiência de conversão de ácidos graxos, medida por meio do potencial de inibição, surpreendentemente maior que a apresentada pelas enzimas CYP450-152 descritas no estado da técnica. Assim, a enzima RN descrita apresenta potencial de inibição cerca de pelo menos 30 % maior que o exibida pela OleTjE descrita no estado da técnica. Ainda mais surpreendente, os peptídeos da presente invenção apresentaram uma eficiência de conversão de ácidos graxos de cadeia longa (C20) cerca de 33 vezes maior que a exibida pela referida enzima OleT.[019] Thus, in an embodiment of the invention, the inventors of the present invention identified that the RN peptides have a fatty acid conversion efficiency, measured by the inhibition potential, surprisingly higher than that presented by the CYP450-152 enzymes described in state of the art. Thus, the RN enzyme described has an inhibition potential about at least 30% greater than that exhibited by the OleTjE described in the state of the art. Even more surprising, the peptides of the present invention showed a conversion efficiency of long chain fatty acids (C20) about 33 times greater than that exhibited by said OleT enzyme.

[020] Tais vantagens demonstradas pelos polipeptídios da presente invenção permitem o emprego em métodos para conversão de ácidos graxos em alcenos monoinsaturados de forma muito mais vantajosa e eficiente do que os métodos descritos até o momento, apresentando-se vantajoso para aplicação na geração de 1-alcenos úteis para aplicação industrial como bioproduto, tal como, mas não limitado a, aditivos, lubrificantes, detergentes, plastificantes, pesticidas e para formação de biocombustíveis.[020] Such advantages demonstrated by the polypeptides of the present invention allow the use in methods for converting fatty acids into monounsaturated alkenes in a much more advantageous and efficient way than the methods described so far, being advantageous for application in the generation of 1 -alkenes useful for industrial application as a bioproduct, such as, but not limited to, additives, lubricants, detergents, plasticizers, pesticides and for forming biofuels.

[021] Assim, a presente invenção também descreve o uso de um alceno monoinsaturado obtido a partir do método da presente invenção na preparação de um bioproduto.[021] Thus, the present invention also describes the use of a monounsaturated alkene obtained from the method of the present invention in the preparation of a bioproduct.

[022] Por fim, em uma segunda modalidade, a presente invenção descreve o uso de um polipeptídio incluído dentro do escopo da invenção, assim como descrito acima, na preparação de um alceno monoinsaturado, que será empregado na preparação de um bioproduto.[022] Finally, in a second embodiment, the present invention describes the use of a polypeptide included within the scope of the invention, as described above, in the preparation of a monounsaturated alkene, which will be used in the preparation of a bioproduct.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[023] A Figura 1 apresenta a análise dos produtos obtidos nas reações da enzima RN nos seguintes ácidos graxos: (A) ácido láurico (C12), (B) ácido mirístico (C14) e (C) ácido palmítico (C16). Os experimentos foram realizados em temperatura ambiente, utilizando 2 mL de complexo enzima-substrato e adição gradativa de peróxido de hidrogênio (2 mL a 500 μΜ) no período de 1h. Controle negativo: reação realizada na ausência de enzima; controle positivo: reação realizada com RN; 2-HHDA: padrão interno ácido 2-hidroxihexadecanoico.[023] Figure 1 presents the analysis of the products obtained in the reactions of the RN enzyme in the following fatty acids: (A) lauric acid (C12), (B) myristic acid (C14) and (C) palmitic acid (C16). The experiments were carried out at room temperature, using 2 mL of enzyme-substrate complex and gradual addition of hydrogen peroxide (2 mL at 500 μΜ) over a period of 1 h. Negative control: reaction carried out in the absence of enzyme; positive control: reaction performed with NB; 2-HHDA: 2-hydroxyhexadecanoic acid internal standard.

[024] A Figura 2 demonstra os testes de titulação com substratos: (A) ácido mirístico (C14), (B) ácido palmítico (C16) e (C) ácido araquídico (C20). Os experimentos foram realizados em espectrofotômetro Cary 60 UV-visible a temperatura ambiente, utilizando 5 μΜ de RN em tampão contento 100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl e 5% glicerol. As titulações foram realizadas por adição gradual de alíquotas de ácidos graxos à cubeta.[024] Figure 2 demonstrates the titration tests with substrates: (A) myristic acid (C14), (B) palmitic acid (C16) and (C) arachidic acid (C20). The experiments were carried out in a Cary 60 UV-visible spectrophotometer at room temperature, using 5 μΜ of RN in a buffer containing 100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl and 5% glycerol. Titrations were performed by gradually adding aliquots of fatty acids to the cuvette.

[025] A Figura 3 ilustra os ensaios de Dicroísmo Circular (CD) a diversos pHs e temperaturas: (a) espectro de far-UV em função do pH e (b) espectro de CD como função da temperatura, ambos realizados em espectrofotômetro de dicroísmo circular equipado com sistema de controle de temperatura.[025] Figure 3 illustrates the Circular Dichroism (CD) tests at different pHs and temperatures: (a) far-UV spectrum as a function of pH and (b) CD spectrum as a function of temperature, both performed in a spectrophotometer of circular dichroism equipped with temperature control system.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[026] A menos que definido de outro modo, os termos científicos e técnicos usados nesta descrição terão os significados comumente entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica.[026] Unless defined otherwise, scientific and technical terms used in this description will have the meanings commonly understood by those of ordinary skill in the art.

[027] Métodos e técnicas convencionais mencionadas aqui são explicadas mais detalhadamente, por exemplo, em Sambrook et al. (Molecular Cloning, a laboratory manual [segunda edição] , Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) .[027] Conventional methods and techniques mentioned here are explained in more detail, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning, a laboratory manual [second edition], Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

[028] As descarboxilases/peroxigenases CYP450 da família 152 apresentam uma propriedade única que é remover o oxigênio de ácidos graxos de tamanho C12-C22, originando como produto 1-alcenos e solucionando, desta forma, o maior gargalo da produção de biocombustíveis drop-in e outros bioprodutos. Estas enzimas utilizam H2O2 como fonte única de oxigênio e doadora de elétrons durante as reações oxidativas, ao invés de NAD(P)H (Xu, H et al. Biotechnol Biofuels. 2017;10(1):1-15).[028] The CYP450 decarboxylases/peroxygenases of the 152 family have a unique property that is to remove oxygen from fatty acids of size C12-C22, giving rise to 1-alkenes as a product and thus solving the biggest bottleneck in the production of drop-in biofuels. in and other bioproducts. These enzymes use H2O2 as the sole source of oxygen and electron donor during oxidative reactions, instead of NAD(P)H (Xu, H et al. Biotechnol Biofuels. 2017;10(1):1-15).

[029] Os polipeptídios da presente invenção apresentam uma atividade de enzima citocromo P450 descarboxilase da família 152. Entende-se dentro do contexto da presente invenção, que as expressões "enzima RN" e "polipeptídio RN" são sinônimas entre si e usadas intercambiavelmente para denominar os po-lipeptídios da invenção.[029] The polypeptides of the present invention exhibit a family 152 cytochrome P450 decarboxylase enzyme activity. It is understood within the context of the present invention that the expressions "RN enzyme" and "RN polypeptide" are synonymous with each other and used interchangeably to name the polypeptides of the invention.

[030] De acordo com a invenção, o polipeptídio RN compreende uma sequência de aminoáciodos SEQ ID No: 1, ou uma sequência de aminoacídica variante, que é pelo menos 60 % idêntica, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 % idêntica à SEQ ID No: 1.[030] In accordance with the invention, the RN polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID No: 1, or a variant amino acid sequence, which is at least 60% identical, more preferably at least 70%, more preferably at least 80 % identical to SEQ ID No: 1.

[031] Em uma modalidade da invenção, os polipeptídios RN são expressos por uma célula hospedeira recombinante, tal como um micro-organismo recombinante e pode, por exemplo, ser um micro-organismo geneticamente modificado. Portanto, um micro-organismo pode ser geneticamente modificado, isto é, artificialmente alterado de seu estado natural, para expressar pelo menos um dos polipeptídios da presente invenção. Preferivelmente, a enzima RN é exógena à célula hospedeira, isto é, não presentes na célula antes da modificação, tendo sido introduzidas usando-se métodos microbiológicos, tais como são descritos aqui.[031] In one embodiment of the invention, the RN polypeptides are expressed by a recombinant host cell, such as a recombinant microorganism and may, for example, be a genetically modified microorganism. Therefore, a microorganism can be genetically modified, that is, artificially altered from its natural state, to express at least one of the polypeptides of the present invention. Preferably, the RN enzyme is exogenous to the host cell, i.e. not present in the cell prior to modification, having been introduced using microbiological methods such as are described herein.

[032] A célula hospedeira pode ser geneticamente modificada por qualquer maneira conhecidamente adequada para esta finalidade pela pessoa versada na técnica. Isto inclui a introdução do gene de interesse, tais como um ou mais genes codificando o polipeptídeo RN em um plasmídeo ou cosmídeo ou outro vetor de expressão que se reproduza dentro da célula hospedeira.[032] The host cell may be genetically modified in any manner known to be suitable for this purpose by the person skilled in the art. This includes introducing the gene of interest, such as one or more genes encoding the RN polypeptide into a plasmid or cosmid or other expression vector that reproduces within the host cell.

[033] Por exemplo, o gene de interesse é o gene que codifica a enzima citocromo P450 de Rothia nasimurium, cuja sequência de nucleotídeos está representada pela SEQ ID No. 2.[033] For example, the gene of interest is the gene encoding the cytochrome P450 enzyme from Rothia nasimurium, whose nucleotide sequence is represented by SEQ ID No. two.

[034] Em uma modalidade preferencial, o gene de interesse compreendendo uma sequência de nucleotídeos SEQ ID No. 2 é introduzido na célula hospedeira por meio de transformação genética como parte de um vetor de expressão compreendendo uma sequência de polinucleotídeos SEQ ID No. 3 ou seu complemento, co-transformado em um plasmídeo compreendendo uma sequência de polinucleotídeos SEQ ID No. 4. Vetores adequados para construção de um vetor de expressão são bem conhecidos na técnica e podem ser dispostos para compreender o polinu-cleotídeo operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle de expressão, a fim de serem úteis para expressar as enzimas requeridas em uma célula hospedeira.[034] In a preferred embodiment, the gene of interest comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 2 is introduced into the host cell via genetic transformation as part of an expression vector comprising a polynucleotide sequence SEQ ID No. 3 or its complement, co-transformed into a plasmid comprising a polynucleotide sequence SEQ ID No. 4. Vectors suitable for constructing an expression vector are well known in the art and can be arranged to comprise the polynucleotide operably linked to one or more expression control sequences in order to be useful for expressing the required enzymes in a host cell.

[035] Alguns sistemas de expressão de proteínas recombinan-tes podem ser utilizados para a obtenção da enzima de interesse purificada, entre esses sistemas destaca-se o uso de células hospedeiras como Pichia pastoris, Saccharomyces ce-revisiae e Escherichia coli. O uso da bactéria E. coli, para a expressão heteróloga de proteínas, apresenta inúmeras vantagens quando comparada aos sistemas eucarióticos de expressão, devido as facilidades de manipulação genética e de cultivo, representando assim, uma consolidada técnica para a produção rápida e eficiente de proteínas recombinantes.[035] Some recombinant protein expression systems can be used to obtain the enzyme of interest purified, among these systems the use of host cells such as Pichia pastoris, Saccharomyces ce-revisiae and Escherichia coli stands out. The use of E. coli bacteria for the heterologous expression of proteins has numerous advantages when compared to eukaryotic expression systems, due to the ease of genetic manipulation and cultivation, thus representing a consolidated technique for the rapid and efficient production of proteins. recombinants.

[036] A célula hospedeira preferencial para expressão da enzima da presente invenção consiste na E. coli estirpe BL21(DE3), devido ao emprego de técnicas simples de cultivo e do sistema de indução, além da obtenção da enzima funcionalmente ativa e alto rendimento de expressão.[036] The preferred host cell for expression of the enzyme of the present invention consists of the E. coli strain BL21(DE3), due to the use of simple cultivation techniques and the induction system, in addition to obtaining the functionally active enzyme and high yield of expression.

[037] Opcionalmente, os polipeptídeos da presente invenção expressos nas células hospedeiras, conforme descrito acima, [037] Opcionalmente, os polipeptídeos da presente invenção expressos nas células hospedeiras, conforme descrito acima, podem ser purificados em um extrato livre de célula. Essa etapa de purificação é comumente obtida por métodos padrão, para uso no método de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Exemplos não limitantes de técnicas de purificação adequadas para obtenção dos polipetídeos RN puros são cro-matografia de afinidade e cromatografia de troca iônica.[037] Optionally, polypeptides of the present invention expressed in host cells, as described above, [037] Optionally, polypeptides of the present invention expressed in host cells, as described above, can be purified in a cell-free extract. This purification step is commonly accomplished by standard methods, for use in the method according to the first aspect of the invention. Non-limiting examples of suitable purification techniques for obtaining pure RN polypeptides are affinity chromatography and ion exchange chromatography.

[038] Quando um ácido graxo é contactado por um polipeptídeo RN que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No. I, assim como definido acima, é possível gerar um alceno mo-noinsaturado. De modo vantajoso, é possível obter um alceno terminal a partir de um ácido graxo de cadeia linear e saturada.[038] When a fatty acid is contacted by an RN polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID No. I, as defined above, it is possible to generate a mono-unsaturated alkene. Advantageously, it is possible to obtain a terminal alkene from a saturated, straight chain fatty acid.

[039] Dentro do contexto da presente invenção, entende-se por um "ácido graxo” qualquer ácido orgânico monocarboxílico ligado a uma cadeia alquílica. Exemplos de ácidos graxos adequados, isto é, que podem ser empregados como substrato no método descrito aqui, possuem cadeia alquílica possuindo entre 12 e 22 átomos de carbono, em que a referida cadeia alquílica ocorre em formação linear e é saturada. Por "ácido graxo de cadeia alquílica saturada" ou, simplesmente "ácido graxo saturado", entende-se pelo ácido graxo que apresenta apenas ligações simples carbono-carbono na cadeia alquílica.[039] Within the context of the present invention, a "fatty acid" is understood to mean any organic monocarboxylic acid linked to an alkyl chain. Examples of suitable fatty acids, that is, which can be used as a substrate in the method described here, have alkyl chain having between 12 and 22 carbon atoms, in which said alkyl chain occurs in linear formation and is saturated.By "saturated alkyl chain fatty acid" or simply "saturated fatty acid", is meant the fatty acid has only carbon-carbon single bonds in the alkyl chain.

[040] Assim, exemplos particulares de ácidos graxos que podem ser empregados como substrato no método da presente invenção incluem ácidos graxos compreendendo cadeia alquílica saturada e linear possuindo 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 átomos de carbono.[040] Thus, particular examples of fatty acids that can be employed as a substrate in the method of the present invention include fatty acids comprising saturated and linear alkyl chain having 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22 carbon atoms.

[041] Mais do que um tipo de ácido graxo pode ser contactado com os polipeptídeos RN em uma única etapa, resultando na produção de uma mistura de alcenos, dependente dos ácidos carboxílicos inicialmente presentes, antes de o método ser realizado. Em uma modalidade preferida, uma mistura de al-cenos, compreendendo pelo menos um ou mais alquenos monoin-saturados terminais, é preparada contactando-se uma mistura de ácidos graxos adequados.[041] More than one type of fatty acid can be contacted with RN polypeptides in a single step, resulting in the production of a mixture of alkenes, dependent on the carboxylic acids initially present, before the method is carried out. In a preferred embodiment, a mixture of alkenes, comprising at least one or more terminal monounsaturated alkenes, is prepared by contacting a mixture of suitable fatty acids.

[042] Ácidos graxos oriundos de diferentes fontes podem ser empregados no método descrito pela invenção. Exemplos não limitantes de obtenção de ácidos graxos incluem fermentação utilizando açúcar como fonte de carbono e hidrólise a partir de substrato mais complexo, como óleos e gorduras de origem animal e vegetal.[042] Fatty acids from different sources can be used in the method described by the invention. Non-limiting examples of obtaining fatty acids include fermentation using sugar as a carbon source and hydrolysis from a more complex substrate, such as animal and vegetable oils and fats.

[043] De acordo com o contexto da presente invenção, entende-se por um "alceno" qualquer composto de hidrocarboneto ali-fático insaturado, compreendendo pelo menos uma dupla ligação carbono-carbono. Por um "composto de hidrocarboneto" entende-se por um composto consistindo de hidrogênio e carbono. Exemplos de alcenos adequados, isto é, que podem ser preparados empregando-se o método da presente invenção têm entre 12 e 22 átomos de carbono em formação linear e são monoin-saturados. Entende-se por um "alceno monoinsaturado", dentro do contexto da presente invenção, qualquer alceno compreendendo somente uma ligação carbono-carbono insaturada, ou seja, uma dupla ligação carbono-carbono.[043] In the context of the present invention, an "alkene" is understood to mean any unsaturated aliphatic hydrocarbon compound, comprising at least one carbon-carbon double bond. By a "hydrocarbon compound" is meant a compound consisting of hydrogen and carbon. Examples of suitable alkenes, i.e., which can be prepared using the method of the present invention, have between 12 and 22 carbon atoms in linear formation and are monounsaturated. A "monounsaturated alkene", within the context of the present invention, is understood to mean any alkene comprising only one unsaturated carbon-carbon bond, i.e. a carbon-carbon double bond.

[044] Exemplos particulares de alcenos monoinsaturados que podem ser preparados usando-se o método da invenção incluem alcenos monoinsaturados de cadeia linear possuindo 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 átomos de carbono, de acordo com o número de carbonos do ácido graxo ou da mistura de ácidos graxos empregados como substrato.[044] Particular examples of monounsaturated alkenes that can be prepared using the method of the invention include straight chain monounsaturated alkenes having 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22 carbon atoms. , according to the number of carbons of the fatty acid or of the mixture of fatty acids used as substrate.

[045] Em uma modalidade preferida, o um ou mais alcenos preparados usando-se o método da presente invenção são alcenos terminais. Dentro do contexto desta invenção, entende-se por "alceno terminal”, ou sinônimos não limitados a "alqueno terminal", "1-alceno", um "alfa-alceno", um "α-alqueno" ou uma "α-olefina", qualquer alceno compreendendo uma dupla ligação carbono-carbono entre um átomo de carbono terminal e seu átomo de carbono adjacente. Assim, dentro dessa modalidade preferida, o alceno obtido por meio do método desta invenção são alcenos monoinsaturados terminais.[045] In a preferred embodiment, the one or more alkenes prepared using the method of the present invention are terminal alkenes. Within the context of this invention, "terminal alkene", or synonyms not limited to "terminal alkene", "1-alkene", an "alpha-alkene", an "α-alkene" or an "α-olefin" ", any alkene comprising a carbon-carbon double bond between a terminal carbon atom and its adjacent carbon atom. Thus, within that preferred embodiment, the alkene obtained by the method of this invention are terminal monounsaturated alkenes.

[046] De modo vantajoso, a conversão de ácido(s) graxo(s) em alceno(s) terminal(is), de acordo com o método descrito nesta invenção, pode ocorrer em faixas de pH e de temperatura amplas, uma vez que a atividade enzimática dos peptídeos da invenção não sofre, ou sofre pouca, influência das condições reacionais do meio.[046] Advantageously, the conversion of fatty acid(s) to terminal alkene(s), according to the method described in this invention, can occur in wide pH and temperature ranges, since that the enzymatic activity of the peptides of the invention does not suffer, or suffers little, from the reaction conditions of the medium.

[047] Por exemplo, em uma das modalidades da presente invenção, os polipeptídios compreendendo a sequência de aminoá-cidos SEQ ID No: 1 apresentam atividade enzimática de des-carboxilase em uma faixa de temperatura variando entre aproximadamente 20 °C e aproximadamente 50 °C e em uma faixa de pH variando entre aproximadamente 5,0 e aproximadamente 9,0, o que permite o emprego desses polipeptídios em métodos para obtenção de alcenos monoinsaturados a partir de ácidos graxos que exigem apenas uma etapa de conversão, não exigindo um pré-tratamento do substrato como, por exemplo, conversão do ácido graxo em sais de ácidos graxos, e com rendimento superior.[047] For example, in one embodiment of the present invention, polypeptides comprising the amino acid sequence SEQ ID No: 1 exhibit decarboxylase enzymatic activity in a temperature range ranging from approximately 20°C to approximately 50° C and in a pH range ranging from approximately 5.0 to approximately 9.0, which allows the use of these polypeptides in methods for obtaining monounsaturated alkenes from fatty acids that require only one conversion step, not requiring a pre - substrate treatment such as, for example, conversion of fatty acid into fatty acid salts, and with superior yield.

[048] O método pode subsequentemente compreender extrair o alqueno e/ou mistura de alquenos do meio reacional, sepa-rando-o(s) de outros componentes não hidrocarbonetos. Para etapa de extração do método da presente invenção qualquer técnica de extração conhecida de um técnico no assunto pode ser empregada. Um exemplo não limitante de processo de extração é a separação de duas fases (sistema bifásico), onde o(s) alqueno(s) são extraídos do meio reacional empregando-se uma fase orgânica, i.e., um solvente orgânico, seguida da concentração da fase orgânica para evaporação do dito solvente. Qualquer solvente orgânico adequado conhecido de um técnico no assunto pode ser empregado. Vantajosamente, são empregados solvente organoclorados, tais como diclorometano e clorofórmio. Em uma modalidade preferencial, a extração de alcenos é realizada adicionando-se clorofórmio à mistura re-acional na proporção de 1/1 (v/v) e a fase orgânica é concentrada usando fluxo de nitrogênio (N2).[048] The method may subsequently comprise extracting the alkene and/or mixture of alkenes from the reaction medium, separating it from other non-hydrocarbon components. For the extraction step of the method of the present invention any extraction technique known to a person skilled in the art can be employed. A non-limiting example of an extraction process is the separation of two phases (two-phase system), where the alkene(s) are extracted from the reaction medium using an organic phase, i.e., an organic solvent, followed by concentration of the organic phase for evaporation of said solvent. Any suitable organic solvent known to one skilled in the art may be employed. Advantageously, organochlorine solvents such as dichloromethane and chloroform are employed. In a preferred embodiment, the extraction of alkenes is carried out by adding chloroform to the reaction mixture at a ratio of 1/1 (v/v) and the organic phase is concentrated using nitrogen (N2) flow.

[049] Os exemplos a seguir ilustram as formas de execução preferenciais da presente invenção. Eles não limitam, portanto, o escopo de proteção da invenção, o qual é exclusivamente definido pelas reivindicações que acompanham esta descrição.[049] The following examples illustrate the preferred embodiments of the present invention. They do not, therefore, limit the scope of protection of the invention, which is exclusively defined by the claims accompanying this specification.

EXAMPLES:

[050] Os exemplos abaixo detalham que a sequência da enzima P450 descarboxilase de Rothia nasimurium (RN) foi selecionada por rede de similaridade utilizando o software "EFI-EST - EFI - Enzyme Similarity Networks Tool".[050] The examples below detail that the sequence of the enzyme P450 decarboxylase from Rothia nasimurium (RN) was selected by similarity network using the software "EFI-EST - EFI - Enzyme Similarity Networks Tool".

[051] A enzima RN foi eficientemente expressa em cepa E.coli BL21 (TF2) e purificada por cromatografia de afinidade e troca iônica.[051] The RN enzyme was efficiently expressed in E.coli strain BL21 (TF2) and purified by affinity chromatography and ion exchange.

[052] Por fim, após a obtenção da enzima purificada, foi então investigado por meio de uma abordagem multidiscipli-nar, a capacidade das enzimas de remover o oxigênio dos ácidos graxos de cadeia média e longa, empregados na produção de alcenos.[052] Finally, after obtaining the purified enzyme, the ability of enzymes to remove oxygen from medium and long chain fatty acids used in the production of alkenes was then investigated through a multidisciplinary approach.

Example 1: Expression of the polypeptide of the present invention in a host cell

[053] O gene que codifica a enzima citocromo P450 de Rothia nasimurium (SEQ ID No. 2) foi clonado em plasmídeo pET28a(+) (SEQ ID No. 3) e inserido na célula hospedeira E. coli por meio de transformação genética. Desta forma, o plasmídeo contendo a RN_Dsc é co-transformado em BL21(DE3) contendo o plasmídeo pG-TF2 (Takara Bio) (SEQ ID No. 4), que confere a expressão das chaperonas GroEL, GroES e Tig.[053] The gene encoding the cytochrome P450 enzyme from Rothia nasimurium (SEQ ID No. 2) was cloned into plasmid pET28a(+) (SEQ ID No. 3) and inserted into the E. coli host cell by means of genetic transformation. In this way, the plasmid containing the DscRN is co-transformed into BL21(DE3) containing the plasmid pG-TF2 (Takara Bio) (SEQ ID No. 4), which confers the expression of the GroEL, GroES and Tig chaperones.

[054] Uma única colônia foi inoculada em meio líquido TB seletivo (24 g de extrato de levedura, 12 g de triptona e 1 grama de bactopeptona por litro) com 50 μg/mL de antibiótico canamicina e cloranfenicol, a 37 °C por 16 h.[054] A single colony was inoculated in selective TB liquid medium (24 g of yeast extract, 12 g of tryptone and 1 gram of bactopeptone per litre) with 50 μg/mL of the antibiotic kanamycin and chloramphenicol, at 37 °C for 16 H.

[055] Posteriormente, 10 mL das células cultivadas foram inoculadas em 500 mL de meio líquido TB, suplementado com 50 μg/mL dos antibióticos canamicina e cloranfenicol, solução com traços de metais e 125 mg/L de tiamina HCl. Ao atingir densidade óptica de 0,6, a temperatura foi reduzida para 20 °C e mantida por 30 minutos.[055] Subsequently, 10 mL of the cultured cells were inoculated into 500 mL of TB liquid medium, supplemented with 50 μg/mL of the antibiotics kanamycin and chloramphenicol, a solution with traces of metals and 125 mg/L of thiamine HCl. Upon reaching an optical density of 0.6, the temperature was reduced to 20 °C and maintained for 30 minutes.

[056] Após este período, a expressão da enzima foi induzida pela adição de 200 μΜ isopropil-b-D-galactosídeo (IPTG), 100 μΜ ácido δ-aminolevulínico (ALA), 10 μg/mL tetraciclina hi-drocloreto e 5 μΜ FeCL3, a 20 °C, overnight.[056] After this period, the enzyme expression was induced by the addition of 200 μΜ isopropyl-b-D-galactoside (IPTG), 100 μΜ δ-aminolevulinic acid (ALA), 10 μg/mL tetracycline hydrochloride and 5 μΜ FeCL3, at 20°C overnight.

Example 2: Purification of the polypeptide of the present invention

[057] Ao final da expressão descrita no Exemplo 1, as células foram centrifugadas a 6000 g por 10 min.[057] At the end of the expression described in Example 1, the cells were centrifuged at 6000 g for 10 min.

[058] O pellet obtido foi ressuspendido em 4 mL de tampão de lise por grama de pellet (100 mM fosfato de potássio (KPi), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol e 5% glicerol, pH 7,5).[058] The obtained pellet was resuspended in 4 mL of lysis buffer per gram of pellet (100 mM potassium phosphate (KPi), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole and 5% glycerol, pH 7.5).

[059] A lise celular foi realizada com ciclos de sonicação (Sonicador Vibra-CellTM VC505) com 40% de amplitude por 2 minutos, intercalados com 5 minutos de intervalo em gelo e agitação. O lisado foi então centrifugado a 24.000 xg por 30 minutos.[059] Cell lysis was performed with sonication cycles (Sonicator Vibra-CellTM VC505) with 40% amplitude for 2 minutes, interspersed with 5 minutes of interval on ice and shaking. The lysate was then centrifuged at 24,000 xg for 30 minutes.

[060] O sobrenadante foi carregado em uma resina Ni-NTA, previamente equilibrada com o tampão de lise, e a enzima foi eluída com tampão composto de 100 mM fosfato de potássio (KPi), 300 mM NaCl, 300 mM imidazol e 5% glicerol, pH 7,5 (etapa realizada a 4 °C).[060] The supernatant was loaded onto a Ni-NTA resin, previously equilibrated with the lysis buffer, and the enzyme was eluted with a buffer composed of 100 mM potassium phosphate (KPi), 300 mM NaCl, 300 mM imidazole and 5% glycerol, pH 7.5 (step performed at 4°C).

[061] Posteriormente, dialisou-se a amostra por 16 h a 4 °C em 4 litros de tampão contendo fosfato de potássio 100 mM (KPi), NaCl 50 mM e glicerol a 5%, pH 7,5.[061] Subsequently, the sample was dialyzed for 16 h at 4 °C in 4 liters of buffer containing 100 mM potassium phosphate (KPi), 50 mM NaCl and 5% glycerol, pH 7.5.

[062] Após a diálise, realizou-se a última etapa de purificação por troca iônica, utilizando uma coluna Q-sepharose e gradiente linear de NaCl (50 mM a 1 M) e, por fim, concentrou-se a da enzima por ultrafiltração (Amicon® Ultra-4 Cen-trifugalFilter, Millipore).[062] After dialysis, the last purification step was performed by ion exchange, using a Q-sepharose column and linear gradient of NaCl (50 mM to 1 M) and, finally, the enzyme was concentrated by ultrafiltration (Amicon® Ultra-4 Cent-trifugalFilter, Millipore).

Example 3: Production of alkenes through the decarboxylation of fatty acids using the enzyme of the present invention

[063] Após a obtenção da enzima concentrada, assim como des-cito no Exemplo 2, os ácidos graxos láurico (C12), mirístico (C14) e palmítico (16) foram convertidos em alcenos terminais, como descrito a seguir.[063] After obtaining the concentrated enzyme, as described in Example 2, the fatty acids lauric (C12), myristic (C14) and palmitic (16) were converted into terminal alkenes, as described below.

[064] Para as reações de descarboxilação de ácidos graxos, preparou-se 2 mL do complexo enzima-substrato, contendo 5 μM RN_Dsc em tampão (100 mM Kpi pH 7,5, 100 mM NaCl, 5% glicerol) e 500 μΜ de ácido graxo (preparado em solução de etanol e Triton X-100 (70:30 v/v). O complexo foi mantido em gelo por 40 minutos. Após este período, 2 mL de peróxido de hidrogênio (5 mM em tampão) foi adicionado ao complexo de maneira gradativa (alíquotas de 300 μL) ao longo de 1 h, em temperatura ambiente. As reações foram então extintas com a adição de 100 μL de HCl 36 M. Para cada reação, um controle negativo (adicionando tampão ao complexo) foi realizado para fins comparativos. Para quantificação dos produtos, dois padrões internos foram adicionados à amostra (1-hexadeceno e 2-HHDA, 500 nmol). Os produtos reacionais foram extraídos do meio, adicionando-se clorofórmio (1/1 v/v).[064] For the fatty acid decarboxylation reactions, 2 mL of the enzyme-substrate complex was prepared, containing 5 μM RN_Dsc in buffer (100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% glycerol) and 500 μΜ of fatty acid (prepared in ethanol and Triton X-100 solution (70:30 v/v). The complex was kept on ice for 40 minutes. After this period, 2 mL of hydrogen peroxide (5 mM in buffer) was added to the complex gradually (300 μL aliquots) over 1 h at room temperature. The reactions were then quenched with the addition of 100 μL of 36 M HCl. For each reaction, a negative control (adding buffer to the complex) was performed for comparative purposes. To quantify the products, two internal standards were added to the sample (1-hexadecene and 2-HHDA, 500 nmol). The reaction products were extracted from the medium, adding chloroform (1/1 v/v ).

[065] As amostras foram homogeneizadas em agitador vórtex por 1 minuto e centrifugada por 12 minutos a 2,3 rpm e 4 °C. As fases orgânicas foram separadas e concentradas através de um fluxo de nitrogênio (N2). Em seguida, os produtos foram derivatizados pela adição de BSTFA (N,O-Bis(trimetilsi-lil)trifluoroacetamida) (1/1 v/v) e incubação a 60 °C por 20 min. Por fim, as amostras foram analisadas por cromatografia gasosa.[065] The samples were homogenized in a vortex mixer for 1 minute and centrifuged for 12 minutes at 2.3 rpm and 4 °C. The organic phases were separated and concentrated through a stream of nitrogen (N2). Then, the products were derivatized by the addition of BSTFA (N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) (1/1 v/v) and incubation at 60 °C for 20 min. Finally, the samples were analyzed by gas chromatography.

Example 4: Evaluation of the enzymatic capacity of the polypeptides of the present invention

[066] Após a obtenção da enzima purificada dos exemplos 1 a 3, foi então investigado por meio de uma abordagem multidis-ciplinar, a capacidade das enzimas de remover o oxigênio dos ácidos graxos de cadeia média e longa, empregados na produção de alcenos[066] After obtaining the purified enzyme from examples 1 to 3, the ability of enzymes to remove oxygen from medium and long chain fatty acids used in the production of alkenes was then investigated through a multidisciplinary approach.

[067] Para a determinação de ácidos graxos livres (FFA) e alcenos, 1 μL de amostra derivatizada foi injetada no cro-matógrafo a gás (Agilent Technologies 7890A), utilizando uma coluna DB-5, nas seguintes condições cromatográficas: 170 °C por 3 min, aumentando para 220 °C a uma taxa de 10 °C/min, e para 320 °C a 5 °C/min, permanecendo nessa temperatura por 3 min. Vazão do gás de arraste de 1,5 mL/min, temperatura do injetor de 250 °C e detector de 250 °C, injeção no modo splitless.[067] For the determination of free fatty acids (FFA) and alkenes, 1 μL of derivatized sample was injected into the gas chromatograph (Agilent Technologies 7890A), using a DB-5 column, under the following chromatographic conditions: 170 °C for 3 min, increasing to 220 °C at a rate of 10 °C/min, and to 320 °C at 5 °C/min, remaining at that temperature for 3 min. Carrier gas flow rate of 1.5 mL/min, inlet temperature of 250 °C and detector of 250 °C, injection in splitless mode.

[068] Os experimentos foram realizados em temperatura ambiente, utilizando 2 mL de complexo enzima-substrato (contendo 5 μΜ RN, 100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% glicerol e 500 μΜ de ácido graxo) e adição gradativa de peróxido de hidrogênio (2 mL a 500 μΜ) no período de 1h. Controle negativo: reação realizada na ausência de enzima; controle positivo: reação realizada com RN; 2-HHDA: padrão interno ácido 2-hidroxihexadecanoico.[068] The experiments were carried out at room temperature, using 2 mL of enzyme-substrate complex (containing 5 μΜ RN, 100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl, 5% glycerol and 500 μΜ of fatty acid) and gradual addition of peroxide of hydrogen (2 mL at 500 μΜ) within 1 h. Negative control: reaction carried out in the absence of enzyme; positive control: reaction performed with NB; 2-HHDA: 2-hydroxyhexadecanoic acid internal standard.

[069] A Figura 1 apresenta a análise dos produtos obtidos nas reações da enzima RN nos seguintes ácidos graxos: (A) ácido láurico (C12), (B) ácido mirístico (C14) e (C) ácido palmítico (C16).[069] Figure 1 presents the analysis of the products obtained in the reactions of the RN enzyme in the following fatty acids: (A) lauric acid (C12), (B) myristic acid (C14) and (C) palmitic acid (C16).

[070] Como pode ser observado na Figura 1, após a análise dos produtos reacionais por cromatografia a gás (GC), foi possível observar a produção de 1-undeceno, 1-trideceno, e 1-pentadeceno a partir do ácido láurico (C12), ácido mirístico (C14) e ácido palmítico (16), respectivamente.[070] As can be seen in Figure 1, after analyzing the reaction products by gas chromatography (GC), it was possible to observe the production of 1-undecene, 1-tridecene, and 1-pentadecene from lauric acid (C12 ), myristic acid (C14) and palmitic acid (16), respectively.

[071] Além disso, também foi analisada por caracterização espectroscópica no ultravioleta visível (UV/Vis) a capacidade de inibição da enzima na presença de ácidos graxos, a partir de testes de titulação com ácidos graxos e determinação do coeficiente de inibição (Kd) (Figura 2).[071] In addition, the ability to inhibit the enzyme in the presence of fatty acids was also analyzed by spectroscopic characterization in the ultraviolet visible (UV/Vis), from titration tests with fatty acids and determination of the inhibition coefficient (Kd) (Figure 2).

[072] Os experimentos foram realizados em espectrofotômetro Cary 60 UV-visible a temperatura ambiente, utilizando 5 μΜ de RN em tampão contento 100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl e 5% glicerol. As titulações foram realizadas por adição gradual de alíquotas de ácidos graxos à cubeta.[072] The experiments were carried out in a Cary 60 UV-visible spectrophotometer at room temperature, using 5 μΜ of RN in a buffer containing 100 mM Kpi pH 7.5, 100 mM NaCl and 5% glycerol. Titrations were performed by gradually adding aliquots of fatty acids to the cuvette.

[073] A Figura 2 demonstra os testes de titulação com substratos: (A) ácido mirístico (C14), (B) ácido palmítico (C16) e (C) ácido araquídico (C20).[073] Figure 2 demonstrates the titration tests with substrates: (A) myristic acid (C14), (B) palmitic acid (C16) and (C) arachidic acid (C20).

[074] A Tabela 1 mostra a determinação de coeficiente de inibição (Kd) da enzima RN na presença de ácidos graxos de cadeia média e longa por caracterização espectroscópica em UV/Vis comparado com os valores de Kd reportado na literatura da enzima P450 descarboxilase OleTJE de Jeotgalicoccus sp.

[074] Table 1 shows the determination of inhibition coefficient (Kd) of the RN enzyme in the presence of medium and long chain fatty acids by UV/Vis spectroscopic characterization compared with the Kd values reported in the literature of the enzyme P450 decarboxylase OleTJE of Jeotgalicoccus sp.

[075] Conforme observado na Tabela 1, a enzima RN apresentou menor inibição na presença de ácidos graxos de cadeia média, diferentemente da OleTJE, que apresenta menor inibição em ácidos graxos de cadeia longa.[075] As seen in Table 1, the RN enzyme showed less inhibition in the presence of medium-chain fatty acids, unlike OleTJE, which shows less inhibition in long-chain fatty acids.

[076] Ainda assim, qualquer que seja o substrato empregado - i.e. quer seja o ácido graxo de cadeia média ou longa - o polipeptídeo da presente invenção apresenta uma atividade surpreendentemente superior à observada para a enzima do estado da técnica. Nesse sentido, a partir da Tabela 1, vê-se que a atividade da enzima da presente invenção é cerca de 35 % superior para ácido graxo C12 (cadeia média), 2 vezes superior para o ácido graxo C16 e, ainda mais surpreendente, 33,5 vezes superior para conversão de ácidos graxos de cadeia longa (C20) em relação à atividade enzimática da OleTJE.[076] Yet whatever the substrate employed - i.e. whether medium or long chain fatty acid - the polypeptide of the present invention has surprisingly higher activity than that observed for the prior art enzyme. In this sense, from Table 1, it can be seen that the activity of the enzyme of the present invention is about 35% higher for C12 fatty acid (medium chain), 2 times higher for C16 fatty acid and, even more surprisingly, 33 .5 times higher for conversion of long-chain fatty acids (C20) in relation to the enzymatic activity of OleTJE.

Example 5: Evaluation of the stability of the polypeptide of the pre-seven invention in different reaction media.

[077] Nesse experimento avaliou-se a estabilidade da enzima obtida nos exemplos anteriores frente à variação de temperatura e pH do meio reacional.[077] In this experiment, the stability of the enzyme obtained in the previous examples was evaluated against the variation of temperature and pH of the reaction medium.

[078] Para isso, foram realizados ensaios de Dicroísmo Celular (CD) conduzidos em espectrofotômetro de dicroísmo circular equipado com sistema de controle de temperatura.[078] For this, Cell Dichroism (CD) tests were carried out in a circular dichroism spectrophotometer equipped with a temperature control system.

[079] A Figura 3 ilustra os resultados dos Ensaios de Dicroísmo Circular (CD) frente à variação de temperatura para determinar o desenovelamento proteico causado por calor (Figura 3A) e a diversos pHs (Figura 3B).[079] Figure 3 illustrates the results of Circular Dichroism (CD) Assays against temperature variation to determine protein unfolding caused by heat (Figure 3A) and at different pHs (Figure 3B).

[080] A enzima Rn mostrou-se estável e ativa em diferentes condições de pH entre 5,0 e 10 e temperaturas.[080] The enzyme Rn was shown to be stable and active under different conditions of pH between 5.0 and 10 and temperatures.

Claims

A method for preparing a monounsaturated alkene characterized in that it comprises contacting a peptide comprising an amino acid sequence SEQ ID No: 1 with a fatty acid, wherein said peptide has peroxygenase enzymatic activity.

Method according to claim 1, characterized in that the peptide is a cytochrome P450 decarboxylase enzyme.

Method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the peptide comes from the genus Rothia sp.

Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the peptide is expressed by a recombinant host cell selected from Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli.

Method according to claim 4, characterized in that the recombinant host cell is Escherichia coli BL21 (TF2).

Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the fatty acid is selected from lauric acid (C12), myristic acid (C14), palmitic acid (C16), heptadecanoic acid (C17), stearic acid (C18), eicosanoic acid (C20), docosanoic acid (C22), or a mixture thereof.

Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the monounsaturated alkene is a terminal alkene.

Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it occurs in a pH range ranging from approximately 5.0 to approximately 9.0, and a temperature range ranging from approximately 20°C to approximately 50°C.

Use of a monounsaturated alkene obtained from the method described in any one of claims 1 to 8, characterized in that it is in the preparation of a bioproduct, selected from an additive, lubricant, detergent, plasticizer, pesticide and biofuel.

Use of a peptide having cytochrome P450 decarboxylase activity, characterized in that it is in the preparation of a monounsaturated alkene, wherein said peptide comprises the amino acid sequence SEQ ID No: 1.