BR102020013264A2

BR102020013264A2 - CONTINUOUS BIOTECHNOLOGICAL XYLITOL PURIFICATION PROCESS

Info

Publication number: BR102020013264A2
Application number: BR102020013264-4A
Authority: BR
Inventors: Marcus Bruno Soares Forte; Bernardo Soares Cardoso; Yara Pereira Cerceau Alves
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2022-01-11
Also published as: WO2022000060A1

Abstract

processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico. a presente invenção se insere no campo da biotecnologia industrial, mais precisamente na seção de processos de produção e purificação e descreve um processo contínuo de purificação de xilitol produzido por fermentação. o processo possibilita a realização de um processo contínuo e automatizado, mais adaptado à utilização industrial e em grandes escalas, uma vez que pode ser ligado em série com outras etapas, aumentando a produtividade e reduzindo perdas.continuous biotechnological xylitol purification process. the present invention falls within the field of industrial biotechnology, more precisely in the section of production and purification processes, and describes a continuous process of purification of xylitol produced by fermentation. the process makes it possible to carry out a continuous and automated process, more adapted to industrial use and on large scales, since it can be connected in series with other stages, increasing productivity and reducing losses.

Description

CONTINUOUS BIOTECHNOLOGICAL XYLITOL PURIFICATION PROCESS

FIELD OF THE INVENTION

[001] A presente invenção trata-se de um processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico produzido por fermentação.[001] The present invention is a continuous process of purification of biotechnological xylitol produced by fermentation.

[002] A presente invenção se insere no campo da biotecnologia industrial, mais precisamente na seção de processos de produção e purificação de xilitol biotecnológico. O xilitol sendo um edulcorante possui aplicações em alimentos, como gomas de mascar, doces, chocolates, sorvetes, gelatinas e bebidas variadas, além de fármacos e produtos de higiene bucal e cuidados pessoais.[002] The present invention is part of the field of industrial biotechnology, more precisely in the section of production processes and purification of biotechnological xylitol. Xylitol, being a sweetener, has applications in foods, such as chewing gum, candies, chocolates, ice cream, gelatins and various beverages, as well as pharmaceuticals and oral care and personal care products.

FUNDAMENTALS OF THE INVENTION

[003] A produção mundial de biomassa lignocelulósica atinge 181,5 bilhões de toneladas por ano. Essa biomassa pode ser convertida em produtos valiosos, como o xilitol, um poliol natural que é utilizado como substituto da sacarose para pacientes diabéticos e tem propriedades anticariogênicas.[003] The world production of lignocellulosic biomass reaches 181.5 billion tons per year. This biomass can be converted into valuable products such as xylitol, a natural polyol that is used as a sucrose substitute for diabetic patients and has anti-cariogenic properties.

[004] O xilitol por ser um poliol de cinco carbonos (pentitol) possui alto poder adoçante, apesar de apresentar teor calórico 40% menor quando comparado à sacarose. Seu uso está relacionado aos efeitos benéficos à saúde, como por exemplo em ajudar no combate à formação de cáries, redução da ocorrência de otite média aguda em crianças, participação no combate à obesidade e diabetes, redução de gengivite e controle de halitose.[004] Xylitol, being a five-carbon polyol (pentitol), has a high sweetening power, despite having a 40% lower caloric content when compared to sucrose. Its use is related to the beneficial effects on health, such as helping to combat the formation of caries, reducing the occurrence of acute otitis media in children, participating in the fight against obesity and diabetes, reducing gingivitis and controlling halitosis.

[005] Atualmente, o xilitol é produzido principalmente por reações químicas. Nesse processo a xilose pura é reduzida cataliticamente sob altas pressões e temperaturas com utilização de custosos catalisadores, normalmente a base de níquel. Devido às condições de operação, à necessidade de etapas de purificação da xilose e ao custo elevado dos catalisadores, o processo é bastante oneroso. Desta forma, o xilitol acaba se tornando aditivo caro.[005] Currently, xylitol is mainly produced by chemical reactions. In this process, pure xylose is catalytically reduced under high pressures and temperatures using expensive catalysts, usually nickel-based. Due to the operating conditions, the need for xylose purification steps and the high cost of the catalysts, the process is quite expensive. In this way, xylitol ends up becoming an expensive additive.

[006] Uma alternativa é produzir xilitol através de uma rota bioquímica usando biomassa lignocelulósica como resíduos agroindustriais do bagaço da cana-deaçúcar. A produção do xilitol biotecnológico está orientado à obtenção dos hidrolisados hemicelulósicos a partir da matéria prima lignocelulósica inicial, sua fermentação e bioconversão metabólica. Essa forma alternativa de produção se encaixa no desenvolvimento sustentável, pois pode utilizar resíduos agroindustriais e pode ter um preço mais barato quando comparada à forma atual de produção, se sua tecnologia estiver totalmente desenvolvida. Embora exista uma extensa pesquisa na obtenção dos hidrolisados hemicelulósicos e sua fermentação, o processo de purificação para atingir a pureza necessária para comercialização ainda não está bem desenvolvido. A solução proposta apresenta alternativa para purificação do xilitol biotecnológico obtido a partir de hidrolisado hemicelulósico oriundo de biomassa lignocelulósica.[006] An alternative is to produce xylitol through a biochemical route using lignocellulosic biomass as agro-industrial residues from sugarcane bagasse. The production of biotechnological xylitol is oriented towards obtaining hemicellulosic hydrolysates from the initial lignocellulosic raw material, its fermentation and metabolic bioconversion. This alternative form of production fits into sustainable development, as it can use agro-industrial residues and can have a cheaper price when compared to the current form of production, if its technology is fully developed. Although there is extensive research on obtaining hemicellulosic hydrolysates and their fermentation, the purification process to achieve the purity required for commercialization is still not well developed. The proposed solution presents an alternative for the purification of biotechnological xylitol obtained from hemicellulosic hydrolyzate from lignocellulosic biomass.

[007] O documento BRPI0903273 intitulado “PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE XILITOL A PARTIR DO BAGAÇO DE CANADE-AÇÚCAR ORGÂNICO” refere-se a um método de produção de xilitol através do uso de um hidrolisado contendo xilose, proveniente do bagaço de cana de açúcar orgânico. A metodologia envolve o processo de hidrólise ácida (0,2-5,0%), purificação do hidrolisado, fermentação para produção de xilitol, purificação do xilitol e cristalização. O documento revela que a purificação do xilitol produzido por via biotecnológica ocorre utilizando resinas de trocas aniônicas e catiônicas em colunas, sendo três resinas aniônicas e uma catiônica, e ainda, revela que as resinas podem ser substituídas por carvão ativado. Todavia, o documento não revela sobre o processo de uso do carvão ativado em colunas de leito fixo, conforme a presente invenção.[007] The document BRPI0903273 entitled “BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF XYLITOL FROM ORGANIC SUGAR CANE BAGASSE” refers to a method of producing xylitol through the use of a xylose-containing hydrolyzate from organic sugarcane bagasse. The methodology involves the process of acid hydrolysis (0.2-5.0%), purification of the hydrolyzate, fermentation to produce xylitol, purification of xylitol and crystallization. The document reveals that the purification of biotechnologically produced xylitol occurs using anion and cationic exchange resins in columns, with three anionic resins and one cationic, and also reveals that the resins can be replaced by activated carbon. However, the document does not disclose the process of using activated carbon in fixed bed columns, according to the present invention.

[008] No que se refere ao artigo intitulado “PURIFICATION OF XYLITOL OBTAINED BY FERMENTATION OF CORNCOB HYDROLYSATES”, são analisados hidrolisados obtidos por auto- hidrólise- pós- hidrólise de espigas de milho. A biomassa utilizada foi purificada utilizando carvão ativado em batelada, variando a concentração de 5 a 125 kg caldo/kg carvão. Contudo, apesar de também utilizar carvão ativado para purificação do caldo contendo xilitol, a presente invenção utiliza o processo contínuo, em coluna de leito fixo, com características diferentes de um processo em batelada.[008] With regard to the article entitled “PURIFICATION OF XYLITOL OBTAINED BY FERMENTATION OF CORNCOB HYDROLYSATES”, hydrolysates obtained by auto-hydrolysis-post-hydrolysis of corn cobs are analyzed. The biomass used was purified using batch activated charcoal, varying the concentration from 5 to 125 kg broth/kg charcoal. However, despite also using activated carbon for the purification of the broth containing xylitol, the present invention uses the continuous process, in a fixed bed column, with different characteristics from a batch process.

[009] Com relação a patente US2006281913 intitulada “PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CRYSTALLINE XYLOSE FROM SUGAR CANE BAGASSE, CRYSTALLINE XYLOSE OBTAINED BY SAID PROCESS, PROCESS FOR THE PRODUCTION OF XYLITOL FROM THE SAID XYLOSE AND CRYSTALLINE XYLITOL OBTAINED THEREBY” é revelada neste documento a produção de xilitol por via química a partir da redução de xilose com alto grau de pureza (>99%). A solução obtida do processo de hidrogenação é alimentada em coluna de adsorção preenchida com carvão ativado. Entretanto, a presente invenção revela a aplicação do processo de purificação utilizando colunas de leito fixo preenchidas com carvão ativado ao caldo contendo xilitol obtido através de fermentação de material hidrolisado.[009] With respect to patent US2006281913 entitled "PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CRYSTALLINE XYLOSE FROM SUGAR CANE BAGASSE, CRYSTALLINE XYLOSE OBTAINED BY SAID PROCESS, PROCESS FOR THE PRODUCTION OF XYLITOL FROM THE SAID XYLOSE AND CRYSTALLINE XYLITOL OBTAINED THEREBY" is disclosed in this document to chemical production of xylitol from xylose reduction with a high degree of purity (>99%). The solution obtained from the hydrogenation process is fed into an adsorption column filled with activated carbon. However, the present invention discloses the application of the purification process using fixed bed columns filled with activated carbon to broth containing xylitol obtained through fermentation of hydrolyzed material.

[0010] No que se refere ao artigo intitulado “PURIFICATION AND CRYSTALLIZATION OF XYLITOL FROM FERMENTATION BROTH OF CORNCOB HYDROLYSATES” é analisado o processo de purificação de xilitol biotecnológico multifásico, incluindo adsorção em carvão ativado, utilização de três resinas de troca iônica, concentração a vácuo e cristalização. A etapa de adsorção em carvão ativado, que é a que mais se aproxima da presente invenção, é realizada em batelada, na qual se adicionou de 1 a 5 g em 100 mL de caldo contendo xilitol. Diferentemente, a presente invenção utiliza-se de um processo contínuo, em coluna de leito fixo, com características processuais que se distanciam do estado da técnica deste documento, já que um processo em batelada possui parâmetros distintos de um processo contínuo.[0010] With regard to the article entitled "PURIFICATION AND CRYSTALLIZATION OF XYLITOL FROM FERMENTATION BROTH OF CORNCOB HYDROLYSATES" the multiphase biotechnological xylitol purification process is analyzed, including adsorption on activated carbon, use of three ion exchange resins, concentration at vacuum and crystallization. The adsorption step on activated carbon, which is the closest to the present invention, is carried out in batches, in which 1 to 5 g are added to 100 mL of broth containing xylitol. Differently, the present invention uses a continuous process, in a fixed bed column, with procedural characteristics that differ from the state of the art of this document, since a batch process has different parameters from a continuous process.

[0011] O documento intitulado “AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TIPOS DE CARVÃO ATIVO NA DESTOXIFICAÇÃO DE HIDROLISADO DE PALHA DE ARROZ PARA PRODUÇÃO DE XILITOL” utiliza carvão ativado para destoxificar o hidrolisado e aplica a outra etapa da produção, com outros objetivos (retirada de compostos tóxicos). Portanto, o referido documento revela uma solução para um problema diferente, uma vez que a presente invenção tem o objetivo de purificar o caldo contendo xilitol.[0011] The document entitled "EVALUATION OF DIFFERENT TYPES OF ACTIVE CHARCOAL IN THE DETOXIFICATION OF RICE STRAW HYDROLYSATE FOR XYLITOL PRODUCTION" uses activated charcoal to detoxify the hydrolyzate and applies it to another stage of production, with other objectives (removal of toxic compounds ). Therefore, said document reveals a solution to a different problem, since the present invention aims to purify broth containing xylitol.

[0012] No que concerne o documento intitulado “STRATEGIES FOR XYLITOL PURIFICATION AND CRYSTALLIZATION: A REVIEW”, tal documento é uma revisão que aponta outros estados da técnica que utilizaram carvão ativado na purificação do xilitol obtido por via biotecnológica. Os processos propostos são realizados em batelada, variando entre eles a proporção de caldo e adsorvente utilizado, temperatura, agitação, tempo e pH. Entretanto a presente invenção é diferente pois utiliza de processo contínuo, em coluna de leito fixo, com características diferentes de um processo em batelada.[0012] Regarding the document entitled “STRATEGIES FOR XYLITOL PURIFICATION AND CRYSTALLIZATION: A REVIEW”, this document is a review that points out other states of the art that used activated carbon in the purification of xylitol obtained via biotechnology. The proposed processes are carried out in batches, varying among them the proportion of broth and adsorbent used, temperature, agitation, time and pH. However, the present invention is different because it uses a continuous process, in a fixed bed column, with different characteristics from a batch process.

[0013] Em referência ao documento intitulado “EVALUATION OF THE ACTIVATED CHARCOALS AND ADSORPTION CONDITIONS USED IN THE TREATMENT OF SUGARCANE BAGASSE HYDROLYSATE FOR XYLITOL PRODUCTION” este documento utiliza carvão ativado para destoxificar o hidrolisado hemicelulósico em processo contínuo, ao passo que a presente invenção tem o objetivo de purificar o caldo contendo xilitol e desta forma não se relaciona com o estado da técnica.[0013] In reference to the document entitled "EVALUATION OF THE ACTIVATED CHARCOALS AND ADSORPTION CONDITIONS USED IN THE TREATMENT OF SUGARCANE BAGASSE HYDROLYSATE FOR XYLITOL PRODUCTION" this document uses activated carbon to detoxify the hemicellulose hydrolyzate in a continuous process, while the present invention has the purpose of purifying the broth containing xylitol and thus does not relate to the state of the art.

[0014] Assim sendo, é possível ressaltar que não foram encontradas patentes, artigos ou anterioridades que descrevam processo de purificação do xilitol biotecnológico, proveniente dos resíduos agroindustriais como o bagaço da cana-de-açúcar, através da utilização de uma coluna de adsorção com leito fixo composto por carvão ativado, que possibilita a realização de um processo contínuo e automatizado, mais adaptado à utilização industrial e em grandes escalas, uma vez que pode ser ligado em série com outras etapas, aumentando a produtividade e reduzindo perdas.[0014] Therefore, it is possible to emphasize that no patents, articles or prior art were found that describe the purification process of biotechnological xylitol, from agro-industrial residues such as sugarcane bagasse, through the use of an adsorption column with fixed bed composed of activated carbon, which makes it possible to carry out a continuous and automated process, more adapted to industrial use and on large scales, since it can be connected in series with other stages, increasing productivity and reducing losses.

BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0015] A presente invenção trata-se de um processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico produzido por fermentação.[0015] The present invention is a continuous process of purification of biotechnological xylitol produced by fermentation.

[0016] O processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico compreende as seguintes etapas:
a) Hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar em temperatura ambiente (25ºC) até atingir umidade de 5 a 15% (m/m), preferencialmente 10% (m/m);
b) Pré-tratamento do bagaço seco com ácido sulfúrico diluído, com proporção bagaço/líquido de 5 a 20%, preferencialmente 10% em massa na proporção de 10 a 300 mg H2SO4/g de bagaço, preferencialmente 100 mg H2SO4/g de bagaço, e temperatura de 80 a 200ºC, preferencialmente 121°C por um período de 5 a 60 min, preferencialmente 20 min;
c) Filtragem do hidrolisado obtido em papel de filtro à temperatura ambiente;
d) Armazenamento da fonte líquida a 4°C;
e) Concentração do hidrolisado obtido em (d) preferencialmente por evaporador a vácuo, à temperatura de 40 a 90ºC, preferencialmente 70°C, aumentando a concentração de xilose de 2 a 10 vezes, preferencialmente 3 vezes (de 15 g/L a 45 g/L, correspondendo a um fator de concentração igual a 3);
f) Destoxificação do hidrolisado com a técnica de liming em duas fases: f.1) elevação do pH do hidrolisado para 7,0 com hidróxido de sódio 12 M, seguido de centrifugação a 3000 rpm por 15 min e filtração a vácuo em papel filtro; f.2) redução do pH a 5,5 pela adição de ácido fosfórico (grau analítico), seguido de centrifugação a 3000 rpm por 15 min e filtração a vácuo em papel filtro;
g) Obtenção de caldo fermentado;
h) Purificação do caldo pode ser realizada de duas formas:
1)Filtração a vácuo:

- adição de carvão ativado ao hidrolisado na proporção de 2,5% (m/v), sendo mantido à agitação de 200 rpm, 30ºC por 1 h; Centrifugação a 3000 rpm por 15 min e filtração a vácuo em papel filtro; ou

2)Filtração contínua:
- empacotamento completo da coluna com carvão ativado compreendendo diâmetro de 0,03 a 1,00mm ou razão entre diâmetro de partícula e diâmetro de leito entre 0,3 e 10%, teor de cinzas que varia de 1 a 40%;
- alimentação do caldo na coluna encamisada:

- por pulso: a vazão varia (vs) de 0,8 a 1,5 cm/min, preferencialmente de 0,64 a 1,2 mL/min, a temperatura (T) varia de 40 a 70ºC e o volume de injeção (Vi) varia de 0,14 a 3,0 mL ou de 12 a 25% do volume da coluna vazia;
- por degrau: a vazão é de 1,2 a 1,5 cm/min e a temperatura é 70ºC; e

i) obtenção de frações ricas em xilitol, com recuperação de 70 a 83% do xilitol injetado e pureza de 93,4 a 100,0% em relação a proteínas (contaminante majoritário identificado no caldo de fermentação).[0016] The continuous process of biotechnological xylitol purification comprises the following steps:
a) Hydrolysis of sugarcane bagasse at room temperature (25ºC) until reaching a humidity of 5 to 15% (m/m), preferably 10% (m/m);
b) Pre-treatment of dried bagasse with dilute sulfuric acid, with a bagasse/liquid ratio of 5 to 20%, preferably 10% by mass in the proportion of 10 to 300 mg H2SO4/g of bagasse, preferably 100 mg H2SO4/g of bagasse , and temperature from 80 to 200°C, preferably 121°C for a period of 5 to 60 min, preferably 20 min;
c) Filtration of the hydrolyzate obtained on filter paper at room temperature;
d) Storage of the liquid source at 4°C;
e) Concentration of the hydrolyzate obtained in (d) preferably by vacuum evaporator, at a temperature of 40 to 90°C, preferably 70°C, increasing the xylose concentration from 2 to 10 times, preferably 3 times (from 15 g/L to 45 g/L, corresponding to a concentration factor equal to 3);
f) Detoxification of the hydrolyzate using the liming technique in two stages: f.1) raising the pH of the hydrolyzate to 7.0 with 12 M sodium hydroxide, followed by centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration on filter paper ; f.2) pH reduction to 5.5 by adding phosphoric acid (analytical grade), followed by centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration on filter paper;
g) Obtaining fermented broth;
h) Purification of the broth can be carried out in two ways:
1) Vacuum filtration:

- addition of activated carbon to the hydrolyzate in a proportion of 2.5% (m/v), maintained at 200 rpm, 30ºC for 1 h; Centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration on filter paper; or

2)Continuous filtration:
- complete packing of the column with activated carbon comprising a diameter from 0.03 to 1.00 mm or a ratio between particle diameter and bed diameter between 0.3 and 10%, ash content ranging from 1 to 40%;
- feeding the broth into the jacketed column:

- per pulse: the flow rate varies (vs) from 0.8 to 1.5 cm/min, preferably from 0.64 to 1.2 mL/min, the temperature (T) varies from 40 to 70ºC and the injection volume (Vi) ranges from 0.14 to 3.0 mL or from 12 to 25% of the empty column volume;
- by step: the flow is from 1.2 to 1.5 cm/min and the temperature is 70ºC; and

i) obtaining fractions rich in xylitol, with recovery of 70 to 83% of the injected xylitol and purity of 93.4 to 100.0% in relation to proteins (major contaminant identified in the fermentation broth).

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0017] A Figura 1 ilustra graficamente o processo contínuo de purificação em colunas de leito fixo de carvão ativado utilizando o modo de operação pulso cromatográfico (alimentação de um volume específico), no qual são apresentadas a concentrações de xilitol, xilose, arabinose, glicerol e etanol na saída do processo de purificação de 3 corridas.[0017] Figure 1 graphically illustrates the continuous process of purification in fixed bed columns of activated carbon using the pulse chromatographic mode of operation (feeding a specific volume), in which concentrations of xylitol, xylose, arabinose, glycerol are presented and ethanol at the exit of the 3-run purification process.

[0018] A Figura 2 ilustra graficamente o processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico em colunas de leito fixo de carvão ativado utilizando o modo de operação denominado degrau (alimentação contínua), no qual são apresentadas as concentrações relativas de xilitol e contaminantes. Sendo a concentração relativa (C/C0) referindo-se à razão entre a concentração na fração coletada após a purificação e a concentração na amostra inicial. A absorbância relativa refere-se à razão entre a absorbância na fração coletada após a purificação e a absorbância na amostra inicial.[0018] Figure 2 graphically illustrates the continuous process of purification of biotechnological xylitol in columns of fixed bed of activated carbon using the operation mode called step (continuous feeding), in which the relative concentrations of xylitol and contaminants are presented. Being the relative concentration (C/C0) referring to the ratio between the concentration in the fraction collected after purification and the concentration in the initial sample. Relative absorbance refers to the ratio between the absorbance in the fraction collected after purification and the absorbance in the initial sample.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0019] A presente invenção trata-se de um processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico produzido por fermentação.[0019] The present invention is a continuous process of purification of biotechnological xylitol produced by fermentation.

[0020] O processo contínuo de purificação de xilitol biotecnológico compreende as seguintes etapas:
j) Hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar em temperatura ambiente (25ºC) até atingir umidade de 5 a 15% (m/m), preferencialmente 10% (m/m);
k) Pré-tratamento do bagaço seco com ácido sulfúrico diluído, com proporção bagaço/líquido de 5 a 20%, preferencialmente 10% em massa na proporção de 10 a 300 mg H2SO4/g de bagaço, preferencialmente 100 mg H2SO4/g de bagaço, e temperatura de 80 a 200ºC, preferencialmente 121°C por um período de 5 a 60 min, preferencialmente 20 min;
l) Filtragem do hidrolisado obtido em papel de filtro à temperatura ambiente;
m) Armazenamento da fonte líquida a 4°C;
n) Concentração do hidrolisado obtido em (d) preferencialmente por evaporador a vácuo, à temperatura de 40 a 90ºC, preferencialmente 70°C, aumentando a concentração de xilose de 2 a 10 vezes, preferencialmente 3 vezes (de 15 g/L a 45 g/L, correspondendo a um fator de concentração igual a 3);
o) Destoxificação do hidrolisado com a técnica de liming em duas fases:
f.1) elevação do pH do hidrolisado para 7,0 com hidróxido de sódio 12 M, seguido de centrifugação a 3000 rpm por 15 min e filtração a vácuo em papel filtro;
f.2) redução do pH a 5,5 pela adição de ácido fosfórico (grau analítico), seguido de centrifugação a 3000 rpm por 15 min e filtração a vácuo em papel filtro;
p) Obtenção de caldo fermentado;
q) Purificação do caldo pode ser realizada de duas formas:
1)Filtração a vácuo:

r) obtenção de frações ricas em xilitol, com recuperação de 70 a 83% do xilitol injetado e pureza de 93,4 a 100,0% em relação a proteínas (contaminante majoritário identificado no caldo de fermentação).[0020] The continuous process of biotechnological xylitol purification comprises the following steps:
j) Hydrolysis of sugarcane bagasse at room temperature (25ºC) until reaching a humidity of 5 to 15% (m/m), preferably 10% (m/m);
k) Pre-treatment of dried bagasse with dilute sulfuric acid, with a bagasse/liquid ratio of 5 to 20%, preferably 10% by mass in the proportion of 10 to 300 mg H2SO4/g of bagasse, preferably 100 mg H2SO4/g of bagasse , and temperature from 80 to 200°C, preferably 121°C for a period of 5 to 60 min, preferably 20 min;
l) Filtration of the hydrolyzate obtained on filter paper at room temperature;
m) Storage of the liquid source at 4°C;
n) Concentration of the hydrolyzate obtained in (d) preferably by vacuum evaporator, at a temperature of 40 to 90°C, preferably 70°C, increasing the xylose concentration from 2 to 10 times, preferably 3 times (from 15 g/L to 45 g/L, corresponding to a concentration factor equal to 3);
o) Detoxification of the hydrolyzate with the liming technique in two stages:
f.1) raising the pH of the hydrolyzate to 7.0 with 12 M sodium hydroxide, followed by centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration through filter paper;
f.2) pH reduction to 5.5 by adding phosphoric acid (analytical grade), followed by centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration on filter paper;
p) Obtaining fermented broth;
q) Purification of the broth can be carried out in two ways:
1) Vacuum filtration:

r) obtaining fractions rich in xylitol, with recovery of 70 to 83% of the injected xylitol and purity of 93.4 to 100.0% in relation to proteins (major contaminant identified in the fermentation broth).

Packaging of the adsorbent material:

[0021] O preenchimento da coluna é realizado com carvão ativado proveniente de casca de coco. Coloca-se o carvão ativado compreendendo o diâmetro de 0,03 a 1,00 mm ou razão entre diâmetro de partícula e diâmetro de leito entre 0,3 e 10%, teor de cinzas que varia de 1 a 40%, vagarosamente através de um funil. Aplica-se vibração intensa e intermitente na coluna para que o adsorvente se acomode adequadamente e não forme caminhos preferenciais. Um leito fixo de carvão ativado de 1 cm de diâmetro e 15 cm de altura é formado no interior da coluna, preenchendo-a completamente.[0021] The column is filled with activated carbon from coconut husk. Activated carbon comprising a diameter of 0.03 to 1.00 mm or a ratio between particle diameter and bed diameter between 0.3 and 10%, ash content ranging from 1 to 40%, is placed slowly through a funnel. Intense and intermittent vibration is applied to the column so that the adsorbent settles properly and does not form preferential paths. A fixed bed of activated carbon 1 cm in diameter and 15 cm in height is formed inside the column, filling it completely.

[0022] Carvões ativados de outras origens podem ser selecionados a partir de qualquer material residual vegetal, tais como caules folhas e biomassas e desde que o material vegetal seja desidratado, seguido de carbonização e ativação.
Purificação do Xilitol
1) O caldo contendo xilitol proveniente da fermentação de material lignocelulósico hidrolisado e destoxificado é alimentado em uma coluna.
2) A alimentação do caldo na coluna pode ser realizada de duas formas: por pulso ou por degrau:

- Na alimentação por pulso, um volume conhecido da mistura (Vi) é injetado enquanto há passagem contínua ascendente de fase móvel (água destilada) com vazão (vs) e temperatura (T) controladas;
- Na alimentação por degrau, o caldo é alimentado continuamente na coluna com vazão (vs) e temperatura (T) controladas até que ocorra saturação da coluna.

[0022] Activated carbons from other sources can be selected from any residual plant material, such as stems, leaves and biomass and provided that the plant material is dehydrated, followed by carbonization and activation.
Xylitol Purification
1) The broth containing xylitol from the fermentation of hydrolyzed and detoxified lignocellulosic material is fed into a column.
2) The broth can be fed into the column in two ways: pulse or step:

- In pulse feeding, a known volume of the mixture (Vi) is injected while there is a continuous upward passage of mobile phase (distilled water) with controlled flow (vs) and temperature (T);
- In step feeding, the broth is fed continuously into the column with controlled flow (vs) and temperature (T) until the column saturates.

[0023] O caldo contendo xilitol é alimentado em uma coluna com vazão (expressa em termos de velocidade superficial) controlada por bomba peristáltica e temperatura controlada na camisa da coluna por banho termostático. Usando a alimentação por pulso, a vazão varia (vs) de 0,8 a 1,5 cm/min (ou de 0,64 a 1,2 mL/min), a temperatura (T) varia de 40 a 70ºC e o volume de injeção (Vi) varia de 0,14 a 3,0 mL (ou de 12 a 25% do volume da coluna vazia). Usando a alimentação por degrau, a vazão é 1,5 cm/min (ou 1,2 mL/min) e a temperatura é 70ºC. O caldo fermentado atravessa o leito de carvão ativado e na saída do sistema é coletado por coletor de frações e as frações coletadas possuem de 0,5 a 10 ml, preferivelmente 5 mL, ou de 1 a 100% do volume líquido da coluna.[0023] The broth containing xylitol is fed into a column with a flow rate (expressed in terms of surface velocity) controlled by a peristaltic pump and temperature controlled in the column jacket by a thermostatic bath. Using pulse feed, the flow rate varies (vs) from 0.8 to 1.5 cm/min (or from 0.64 to 1.2 mL/min), the temperature (T) ranges from 40 to 70°C and the injection volume (Vi) ranges from 0.14 to 3.0 mL (or from 12 to 25% of the empty column volume). Using step feeding, the flow rate is 1.5 cm/min (or 1.2 mL/min) and the temperature is 70°C. The fermented broth passes through the activated carbon bed and at the exit of the system is collected by a fraction collector and the fractions collected have from 0.5 to 10 ml, preferably 5 ml, or from 1 to 100% of the liquid volume of the column.

Example:

[0024] Para que o xilitol biotecnológico seja purificado, ele precisa ser produzido pela fermentação da cepa do micro-organismo usando o hidrolisado hemicelulósico como meio de substrato. O hidrolisado é obtido a partir da hidrólise de bagaço de cana-deaçúcar.[0024] In order for biotech xylitol to be purified, it needs to be produced by fermenting the strain of the microorganism using the hemicellulosic hydrolyzate as the substrate medium. The hydrolyzate is obtained from the hydrolysis of sugarcane bagasse.

[0025] A obtenção do caldo complexo contendo xilitol obtido por via fermentativa ocorre para que o xilitol biotecnológico seja purificado. Assim, ele precisa ser produzido pela fermentação da cepa do micro-organismo usando o hidrolisado hemicelulósico como meio de substrato.[0025] Obtaining the complex broth containing xylitol obtained by fermentation occurs so that the biotechnological xylitol is purified. Thus, it needs to be produced by fermenting the strain of the microorganism using the hemicellulose hydrolyzate as the substrate medium.

[0026] O hidrolisado é obtido a partir da hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. O bagaço é seco ao ar livre até atingir cerca de 10% (m/m) de umidade. Em seguida, o bagaço seco é submetido a um pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído, na proporção de 100 mg H2SO4/g de bagaço, e temperatura de 121°C por 20 min. O hidrolisado obtido é filtrado e a fonte líquida resultante do processo é armazenada a 4°C. O hidrolisado obtido é concentrado em evaporador a vácuo de capacidade em volume de 32 L, a 70°C, elevando a concentração de xilose de 15 g/L a 45 g/L, correspondendo a um fator de concentração igual a 3. O hidrolisado obtido após o pré-tratamento e concentrado passa pelo processo de destoxificação.[0026] The hydrolyzate is obtained from the hydrolysis of sugarcane bagasse. The bagasse is dried in the open air until it reaches about 10% (m/m) humidity. Then, the dried bagasse is subjected to a pre-treatment with dilute sulfuric acid, in the proportion of 100 mg H2SO4/g of bagasse, at a temperature of 121°C for 20 min. The hydrolyzate obtained is filtered and the liquid source resulting from the process is stored at 4°C. The hydrolyzate obtained is concentrated in a vacuum evaporator with a volume capacity of 32 L, at 70°C, raising the xylose concentration from 15 g/L to 45 g/L, corresponding to a concentration factor equal to 3. The hydrolyzate obtained after pre-treatment and concentrate goes through the detoxification process.

[0027] A destoxificação do hidrolisado é iniciada com a técnica de liming, que consiste em duas fases; em um primeiro momento o pH do hidrolisado é elevado de 0,8 para 7,0 com hidróxido de sódio 12 M, sendo então centrifugado a 3000 rpm/15 min e filtrado a vácuo em papel filtro comum; em um segundo momento o pH é reduzido a 5,5 pela adição de ácido fosfórico (grau analítico), sendo novamente centrifugado e filtrado. Com a alteração do pH há a remoção de compostos insolúveis, que varia conforme pH do meio. Após o liming, é adicionado carvão ativo ao hidrolisado na proporção de 2,5% (m/v), sendo mantido a 200 rpm, 30ºC por 1 h. Ao final deste tempo, o hidrolisado é centrifugado e filtrado, nas mesmas condições das etapas anteriores de destoxificação.[0027] The detoxification of the hydrolyzate is initiated with the liming technique, which consists of two phases; at first, the pH of the hydrolyzate is raised from 0.8 to 7.0 with 12 M sodium hydroxide, then centrifuged at 3000 rpm/15 min and vacuum filtered through common filter paper; in a second moment the pH is reduced to 5.5 by the addition of phosphoric acid (analytical grade), being centrifuged again and filtered. With the change in pH, there is the removal of insoluble compounds, which varies according to the pH of the medium. After liming, active carbon is added to the hydrolyzate at a rate of 2.5% (m/v), maintained at 200 rpm, 30ºC for 1 h. At the end of this time, the hydrolyzate is centrifuged and filtered under the same conditions as in the previous detoxification steps.

[0028] A obtenção do xilitol pela fermentação da levedura a partir do hidrolisado é composto basicamente pelas etapas ativação da cepa, inóculo e fermentação. Após a fermentação, o caldo complexo contendo o xilitol é purificado.[0028] The obtaining of xylitol by yeast fermentation from the hydrolyzate is basically composed of the stages of strain activation, inoculum and fermentation. After fermentation, the complex broth containing the xylitol is purified.

[0029] A levedura utilizada para obtenção biotecnológica de xilitol refere-se a uma cepa de Candida tropicalis encontrada naturalmente no bagaço da cana-de-açúcar. A cepa foi isolada do bagaço da cana-de-açúcar no município de Guararu (SE), cedida pelo LGE/IB/UNICAMP e armazenada em meio de cultura contendo glicerol 30% (v/v) sob temperatura -80°C. A ativação da cepa é feita em um meio de cultura específico (YEPD) em placa de petri, contendo extrato de levedura (10 g/L), peptona (20 g/L) e dextrose (glicose 10 g/L).[0029] The yeast used to biotechnologically obtain xylitol refers to a strain of Candida tropicalis found naturally in sugarcane bagasse. The strain was isolated from sugarcane bagasse in the municipality of Guararu (SE), provided by LGE/IB/UNICAMP and stored in a culture medium containing 30% glycerol (v/v) at -80°C. Strain activation is performed in a specific culture medium (YEPD) in a petri dish, containing yeast extract (10 g/L), peptone (20 g/L) and dextrose (10 g/L glucose).

[0030] O inóculo consiste em um volume (cerca de 10% do volume da fermentação) de meio de cultura semelhante em composição ao meio da fermentação para que haja adaptação da levedura ao meio e para que o crescimento da levedura seja acelerado para a etapa seguinte de fermentação. O meio do inóculo não é preparado com o hidrolisado, mas sim em meio sintético (para que haja aceleração do crescimento da levedura), que é composto por xilose como fonte de carbono (30 g/L), além de peptona (20 g/L) e extrato de levedura (10 g/L) como fontes de nitrogênio e outros nutrientes necessários para o crescimento e multiplicação da levedura. Para a composição do meio, são utilizadas soluções estoque, de 200 g/L para xilose, 200 g/L para peptona e 100 g/L para o extrato de levedura, que foram esterilizadas em autoclave pelo binômio de 121°C por 15 min. Os inóculos são feitos em frascos Erlenemeyer (125 mL), em incubadora de movimento rotatório, sob agitação de 200 rpm, temperatura de 30°C por um tempo de 48 h. Após este período, as leveduras são recuperadas por centrifugação a 3000 rpm por 5 min, lavadas com água destilada estéril, novamente centrifugadas nas mesmas condições e finalmente ressuspensas em pequeno volume de água estéril. Para a fermentação, calcula-se o volume necessário para que a processo fermentativo seja iniciado com densidade óptica equivalente a 1,0, já que é esperado que nessa densidade óptica o micro-organismo esteja em sua fase de crescimento exponencial.[0030] The inoculum consists of a volume (about 10% of the fermentation volume) of culture medium similar in composition to the fermentation medium so that the yeast adapts to the medium and that the yeast growth is accelerated for the next step. next fermentation. The inoculum medium is not prepared with the hydrolyzate, but in a synthetic medium (to accelerate yeast growth), which is composed of xylose as a carbon source (30 g/L), in addition to peptone (20 g/L). L) and yeast extract (10 g/L) as sources of nitrogen and other nutrients necessary for yeast growth and multiplication. For the composition of the medium, stock solutions of 200 g/L for xylose, 200 g/L for peptone and 100 g/L for yeast extract are used, which were sterilized in an autoclave at 121°C for 15 min. . The inoculums are made in Erlenemeyer flasks (125 mL), in a rotating incubator, under agitation of 200 rpm, temperature of 30°C for a time of 48 h. After this period, the yeasts are recovered by centrifugation at 3000 rpm for 5 min, washed with sterile distilled water, centrifuged again under the same conditions and finally resuspended in a small volume of sterile water. For fermentation, the volume necessary for the fermentation process to start with an optical density equivalent to 1.0 is calculated, since it is expected that at this optical density the microorganism is in its exponential growth phase.

[0031] As fermentações dos hidrolisados são realizadas em frascos Erlenmeyer de 1L. O hidrolisado, utilizado como fonte de carbono, é composto por 41 g/L de xilose. Há suplementação do meio com extrato de levedura (10 g/L), fosfato monopotássico (KH2PO4, 5 g/L) e sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O, 0,4 g/L). Os frascos são mantidos em incubadora de movimento sob agitação de 200 rpm, temperatura de 30°C por um tempo de 120 h.[0031] The fermentations of the hydrolysates are carried out in 1L Erlenmeyer flasks. The hydrolyzate, used as a carbon source, is composed of 41 g/L of xylose. The medium is supplemented with yeast extract (10 g/L), potassium monophosphate (KH2PO4, 5 g/L) and magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O, 0.4 g/L). The flasks are kept in a moving incubator under agitation of 200 rpm, temperature of 30°C for a time of 120 h.

[0032] A composição do caldo fermentado utilizado para purificação pela presente invenção pode variar dependendo do material lignocelulósico e do microorganismo utilizado, porém, pode conter além de xilitol, açúcares residuais (xilose, arabinose, celobiose e oligômeros), etanol, arabitol, furfural, ácido acético, fenóis, glicerol, ácidos uronicos, proteínas e cinzas e outros componentes. Na presente composição do caldo foram utilizados xilitol de 1,0 a 100,0 g/L, preferencialmente 15,0 g/L, xilose de 0,0 a 20,0 g/L, preferencialmente 1,4 g/L, glicose de 0,0 a 20,0 g/L, preferencialmente 0,0 g/L, arabinose de 0,0 a 20,0 g/L, preferencialmente 3,4 g/L, glicerol de 0,0 a 20 g/L, preferencialmente 1,7 g/L, ácido acético de 0,0 a 20 g/L, preferencialmente 0,0 g/L, etanol de 0,0 a 20 g/L, preferencialmente 5,0 g/L, proteínas totais de 0,0 a 30,0 g/L, preferencialmente 19,2 g/L, absorbância a 420 nm de 0,1 a 30,0, preferencialmente 15,7 e absorbância a 560 nm de 0,1 a 10,0, preferencialmente 3,5.[0032] The composition of the fermented broth used for purification by the present invention may vary depending on the lignocellulosic material and the microorganism used, however, it may contain, in addition to xylitol, residual sugars (xylose, arabinose, cellobiose and oligomers), ethanol, arabitol, furfural , acetic acid, phenols, glycerol, uronic acids, proteins and ash and other components. In the present composition of the broth, xylitol from 1.0 to 100.0 g/L, preferably 15.0 g/L, xylose from 0.0 to 20.0 g/L, preferably 1.4 g/L, glucose from 0.0 to 20.0 g/L, preferably 0.0 g/L, arabinose from 0.0 to 20.0 g/L, preferably 3.4 g/L, glycerol from 0.0 to 20 g/L L, preferably 1.7 g/L, acetic acid from 0.0 to 20 g/L, preferably 0.0 g/L, ethanol from 0.0 to 20 g/L, preferably 5.0 g/L, proteins totals from 0.0 to 30.0 g/L, preferably 19.2 g/L, absorbance at 420 nm from 0.1 to 30.0, preferably 15.7 and absorbance at 560 nm from 0.1 to 10, 0, preferably 3.5.

[0033] O caldo contendo xilitol é alimentado na coluna encamisada à uma vazão constante de 0,1 a 5,0 cm. Temperatura do sistema é controlada por camisa da coluna mantendo de 20 a 80ºC e mantida constante. O produto na saída do sistema é coletado por coletor de frações e as frações coletadas possuem de 0,5 a 10 ml, preferivelmente 5 ml ou de 1 a 100% do volume líquido da coluna.[0033] The broth containing xylitol is fed into the jacketed column at a constant flow rate of 0.1 to 5.0 cm. System temperature is controlled by the column jacket keeping from 20 to 80ºC and kept constant. The product at the outlet of the system is collected by a fraction collector and the fractions collected have from 0.5 to 10 ml, preferably 5 ml or from 1 to 100% of the liquid volume of the column.

Fraction analysis

[0034] Em uma primeira corrida, as frações coletadas são analisadas quanto à cor, teor de proteínas, teor de sólidos totais e concentrações de outros contaminantes a fim de identificar em quais frações se tem o xilitol mais puro.[0034] In a first run, the fractions collected are analyzed for color, protein content, total solids content and concentrations of other contaminants in order to identify which fractions have the purest xylitol.

[0035] As concentrações dos açúcares residuais, xilose e glicose, de xilitol, etanol, glicerol e ácido acético são determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), com coluna Aminex HPX-87H utilizando 5,0 N de ácido sulfúrico como fase móvel, vazão de 0,6 mL/min, temperatura da coluna de 45ºC e volume de injeção de 20 µL. É construída uma curva de calibração para cada composto correlacionando diferentes concentrações conhecidas do referido composto (a partir de soluções padrões) com as áreas dos picos obtidos no equipamento com a injeção das soluções nas respectivas concentrações. As amostras obtidas no experimento são então injetadas no equipamento usando as mesmas condições e as respectivas concentrações são determinadas usando as curvas de calibração construídas previamente. O teor de sólidos totais é determinado utilizando estufa a 100ºC até peso constante, e então é calculado a diferença de peso entre a amostra inicial e final. A cor foi determinada através de leitura de absorbância em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 420 nm e 560 nm, como estabelecido pela International Commission for the Unification of the Methods of Sugar Analysis (ICUMSA). A leitura a 420 nm é utilizada para comparar açúcares brancos e produtos de coloração leve e a leitura a 560 nm é utilizada para comparar produtos mais escuros. Os valores de pH foram determinados por potenciometria em pHmêtro. O teor de proteínas totais foi determinado segundo método de Lowry, que se baseia na redução do reagente Folin-Ciocateau ao reagir com proteínas, na presença de catalisador cobre (II), produzindo um composto com absorção máxima a 750 nm. O reagente Folin-Ciocateau é uma mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico. Para o branco foi utilizada água destilada. A curva de calibração foi construída a partir de albumina bovina padrão e tanto as amostras quanto os pontos da curva padrão foram analisados em triplicata.[0035] The concentrations of residual sugars, xylose and glucose, xylitol, ethanol, glycerol and acetic acid are determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), with Aminex HPX-87H column using 5.0 N sulfuric acid as phase mobile, flow rate of 0.6 mL/min, column temperature of 45ºC and injection volume of 20 µL. A calibration curve is constructed for each compound by correlating different known concentrations of said compound (from standard solutions) with the peak areas obtained in the equipment with the injection of the solutions at the respective concentrations. The samples obtained in the experiment are then injected into the equipment using the same conditions and the respective concentrations are determined using the previously constructed calibration curves. The total solids content is determined using an oven at 100°C until constant weight, and then the weight difference between the initial and final sample is calculated. Color was determined by reading the absorbance in a spectrophotometer at wavelengths of 420 nm and 560 nm, as established by the International Commission for the Unification of the Methods of Sugar Analysis (ICUMSA). Reading at 420 nm is used to compare white sugars and light colored products and reading at 560 nm is used to compare darker products. The pH values were determined by potentiometry in a pH meter. The total protein content was determined according to the Lowry method, which is based on the reduction of the Folin-Ciocateau reagent when reacting with proteins, in the presence of a copper (II) catalyst, producing a compound with maximum absorption at 750 nm. Folin-Ciocateau reagent is a mixture containing molybdate, tungstate and phosphoric acid. For the blank, distilled water was used. The calibration curve was constructed from standard bovine albumin and both samples and points on the standard curve were analyzed in triplicate.

[0036] Pureza total de um composto em uma solução é a razão entre a massa do referido composto e a massa total da solução. Pureza parcial de um composto em relação a contaminantes específicos em uma solução é a razão entre a massa do referido composto e a somatória das massas dos contaminantes específicos na solução.[0036] Total purity of a compound in a solution is the ratio between the mass of said compound and the total mass of the solution. Partial purity of a compound with respect to specific contaminants in a solution is the ratio between the mass of said compound and the sum of the masses of specific contaminants in the solution.

[0037] O processo de purificação pode ser avaliado através de um coeficiente denominado Fator de Purificação. Fator de Purificação (FP) é a razão entre a pureza das amostras purificadas e a pureza inicial e anterior à purificação. FP > 1 significa que a amostra obtida após a purificação tem pureza maior que inicialmente; FP = 1 significa que a amostra obtida após a purificação tem pureza igual que inicialmente; FP < 1 significa que a amostra obtida após a purificação tem pureza menor que inicialmente. Pode-se considerar que a fração apresenta pureza suficiente de xilitol quando o FP de xilitol com relação aos contaminantes for maior que 2 para a fração. Esse valor pode ser alterado a fim de selecionar somente frações com xilitol mais isolado, ou acomodar frações contendo mais contaminantes. Depois dessa identificação, o processo pode ser repetido, porém interrompido no momento em que as frações deixam de ser adequadas de acordo com o critério apresentado.[0037] The purification process can be evaluated through a coefficient called Purification Factor. Purification Factor (FP) is the ratio between the purity of the purified samples and the initial and pre-purification purity. FP > 1 means that the sample obtained after purification has a higher purity than initially; FP = 1 means that the sample obtained after purification has the same purity as initially; FP < 1 means that the sample obtained after purification is of lower purity than initially. It can be considered that the fraction has sufficient xylitol purity when the FP of xylitol in relation to contaminants is greater than 2 for the fraction. This value can be changed in order to select only fractions with more isolated xylitol, or to accommodate fractions containing more contaminants. After this identification, the process can be repeated, but interrupted when the fractions are no longer adequate according to the criterion presented.

[0038] Outra resposta medida para avaliação do processo de purificação é o Coeficiente de Retenção (CR) dos compostos isoladamente que representa a porcentagem de massa do referido composto retida na coluna durante o processo de purificação.[0038] Another measured response to evaluate the purification process is the Retention Coefficient (CR) of the compounds alone, which represents the mass percentage of said compound retained in the column during the purification process.

[0039] O processo de purificação também é avaliado quanto ao rendimento de recuperação de xilitol (ηxilitol) que representa a porcentagem de massa de xilitol injetada que é recuperada no pool (união) de amostras após o processo de purificação.[0039] The purification process is also evaluated for the xylitol recovery yield (ηxylitol) which represents the mass percentage of injected xylitol that is recovered in the pool (union) of samples after the purification process.

Details of the results obtained

[0040] Ao entrar em contato com o carvão ativado, diferentes componentes do caldo complexo apresentam comportamento de adsorção distintos, gerando uma retenção maior ou menor de cada um no leito fixo, produzindo uma separação entre eles nas frações coletadas.[0040] When in contact with activated carbon, different components of the complex broth present different adsorption behavior, generating a greater or lesser retention of each one in the fixed bed, producing a separation between them in the collected fractions.

[0041] O primeiro lote de experimentos denominado DCCR foi realizado com a utilização do método de alimentação por pulso, foram realizados um número de 17 ensaios à 5 temperaturas (T) diferentes (20, 28, 40, 52 e 60ºC), 5 volumes de injeção (Vi) diferentes (0,80, 1,05, 1,40, 1,75 e 2,00 mL) e 5 velocidades superficiais (vs) diferentes (0,40, 0,56, 0,80, 1,04 e 1,20 cm/min). Os resultados obtidos com esses ensaios são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Condições utilizadas, temperatura (T), volume de injeção (Vi) e vazão de alimentação em termos de velocidade superficial (vs) e respostas obtidas para o lote de experimentos denominado DCCR usando alimentação por pulso. Estão apresentados nesta tabela os seguintes parâmetros: Fator de Purificação (FP), o Coeficiente de Retenção (CR) para os diferentes compostos, ambos já definidos anteriormente, o rendimento de recuperação de xilitol (ηxilitol) e a massa de xilitol obtida no pool de amostras obtida após o processo de purificação. O pool de amostras se refere à união das amostras que isoladamente apresentaram FP > 2.

[0041] The first batch of experiments called DCCR was carried out using the pulse feeding method, a number of 17 tests were performed at 5 different temperatures (T) (20, 28, 40, 52 and 60ºC), 5 volumes of injection (Vi) different (0.80, 1.05, 1.40, 1.75 and 2.00 mL) and 5 different superficial velocities (vs) (0.40, 0.56, 0.80, 1 .04 and 1.20 cm/min). The results obtained with these tests are shown in Table 1.
Table 1. Conditions used, temperature (T), injection volume (Vi) and feed rate in terms of surface velocity (vs) and responses obtained for the batch of experiments called DCCR using pulse feed. The following parameters are presented in this table: Purification Factor (FP), the Retention Coefficient (CR) for the different compounds, both previously defined, the xylitol recovery yield (ηxylitol) and the xylitol mass obtained in the pool of samples obtained after the purification process. The pool of samples refers to the union of samples that individually presented PF > 2.

[0042] Houve completa separação de proteínas e compostos coloridos em todos os testes, indicando boa separação para pequenas quantidades de amostra; alto aproveitamento do xilitol, obtendo no melhor ensaio uma porcentagem de retenção no adsorvente de apenas 3,4%; fator de purificação do xilitol relacionado a xilose, arabinose, glicerol e etanol de até 4,6; e uma boa retenção de sólidos totais, chegando a 36,1%.[0042] There was complete separation of proteins and colored compounds in all tests, indicating good separation for small amounts of sample; high utilization of xylitol, obtaining in the best test a percentage of retention in the adsorbent of only 3.4%; xylitol purification factor related to xylose, arabinose, glycerol and ethanol up to 4.6; and a good retention of total solids, reaching 36.1%.

[0043] O segundo lote de experimentos foi realizado utilizando o método de alimentação por pulso, foram realizados 3 ensaios (em triplicata), denominados “Pto. Central”, “Conf1” e “Conf2”, variando-se as condições de temperatura, T (40, 60 e 70ºC), volume de injeção, Vi (1,4, 2,0 e 3,0 mL) e vazão de alimentação em termos de velocidade superficial, vs (0,8, 1,2 e 1,5 cm/min), respectivamente. Os resultados obtidos para os diferentes ensaios estão resumidos e ilustrados na Tabela 2 e Figura 1. Nas tabelas 3-5 estão apresentadas as concentrações obtidas em uma replicata em cada uma das condições testadas.
Tabela 2. Alimentação por pulso. Condições utilizadas, temperatura (T), volume de injeção (Vi) e vazão de alimentação em termos de velocidade superficial (vs) e respostas obtidas para os ensaios (Pto. Central, Conf1 e Conf2). Estão apresentados nesta tabela o Fator de Purificação (FP), o coeficiente de retenção (CR) para os diferentes compostos, o rendimento de recuperação de xilitol (ηxilitol) e a massa de xilitol obtida no pool de amostras após o processo de purificação. O pool de amostras se refere à união das amostras que isoladamente apresentaram FP > 2.

Tabela 3. Alimentação por pulso, ensaio Pto. Central. Concentrações em g/L de xilose, arabinose, xilitol, glicerol, etanol e proteínas nas frações obtidas em um dos ensaios nas condições do ensaio Pto. Central.

Tabela 4. Alimentação por pulso, ensaio Conf1. Concentrações em g/L de xilose, arabinose, xilitol, glicerol, etanol e proteínas nas frações obtidas em um dos ensaios nas condições de Conf1.

Tabela 5. Alimentação por pulso, ensaio Conf2. Concentrações em g/L de xilose, arabinose, xilitol, glicerol, etanol e proteínas nas frações obtidas em um dos ensaios nas condições de Conf2.

[0043] The second batch of experiments was performed using the pulse feeding method, 3 tests were performed (in triplicate), called “Pto. Central”, “Conf1” and “Conf2”, varying the temperature conditions, T (40, 60 and 70ºC), injection volume, Vi (1.4, 2.0 and 3.0 mL) and flow rate of feed in terms of surface velocity, vs (0.8, 1.2 and 1.5 cm/min), respectively. The results obtained for the different assays are summarized and illustrated in Table 2 and Figure 1. Tables 3-5 present the concentrations obtained in a replicate in each of the conditions tested.
Table 2. Pulse feeding. Conditions used, temperature (T), injection volume (Vi) and feed flow in terms of surface velocity (vs) and responses obtained for the tests (Central Pto, Conf1 and Conf2). The Purification Factor (FP), the retention coefficient (CR) for the different compounds, the xylitol recovery yield (ηxylitol) and the xylitol mass obtained in the sample pool after the purification process are presented in this table. The pool of samples refers to the union of samples that individually presented PF > 2.

Table 3. Pulse Power, Pto test. Central. Concentrations in g/L of xylose, arabinose, xylitol, glycerol, ethanol and proteins in the fractions obtained in one of the assays under the conditions of the Pto assay. Central.

Table 4. Pulse Power, Conf1 Assay. Concentrations in g/L of xylose, arabinose, xylitol, glycerol, ethanol and proteins in the fractions obtained in one of the assays under Conf1 conditions.

Table 5. Pulse power, Conf2 assay. Concentrations in g/L of xylose, arabinose, xylitol, glycerol, ethanol and proteins in the fractions obtained in one of the assays under Conf2 conditions.

[0044] Houve completa separação de proteínas e compostos coloridos em todos os testes, indicando boa separação para pequenas quantidades de amostra; alto aproveitamento do xilitol, obtendo no melhor ensaio (Conf2) uma porcentagem de retenção no adsorvente muito baixa, CRxilitol de 5%; FP do xilitol relacionado a todos os compostos detectados pelo método analítico de detecção (HPLC), isto é xilose, arabinose, glicerol e etanol, FPárea de 3,6; FP do xilitol relacionado aos sólidos totais de FPárea de 5,4; quase toda a massa de xilitol após a purificação se concentra no pool de amostras com FP > 2, ηxilitol, pool de 80,5 %.[0044] There was complete separation of proteins and colored compounds in all tests, indicating good separation for small amounts of sample; high utilization of xylitol, obtaining in the best test (Conf2) a very low retention percentage in the adsorbent, 5% CRxylitol; FP of xylitol related to all compounds detected by the analytical detection method (HPLC), ie xylose, arabinose, glycerol and ethanol, FP area of 3.6; FP of xylitol related to total solids of FP Area of 5.4; almost all the mass of xylitol after purification is concentrated in the pool of samples with FP > 2, ηxylitol, pool of 80.5%.

[0045] O terceiro lote de experimentos foi realizado utilizando o método de alimentação por degrau, ou alimentação contínua, foi realizado ensaio em triplicata com temperatura T = 70ºC e vazão de alimentação em termos de velocidade superficial vs = 1,5 cm/min. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 6 e Figura 2. Na Tabela 7 estão apresentadas concentrações obtidas em cada fração em uma replicata nessas condições. O processo de purificação com essa alimentação pode ser interrompido aos 17 minutos. O produto do processo pode ser considerado, nessas condições, como o efluente obtido entre 8,5 e 17 minutos de processo, condizendo com as frações 3 e 4 obtidas.
Tabela 6. Alimentação por degrau. mxilitol: massa de xilitol; mproteína: massa de proteínas; msólidos: massa de sólidos totais; madsorvente: massa de carvão ativado utilizado; CRxilitol: coeficiente de retenção de xilitol; CRproteína: coeficiente de retenção de proteínas; CRsólidos: coeficiente de retenção de sólidos; CR420: redução da absorbância lida a 420 nm; CR560: redução da absorbância lida a 560 nm; CRetanol: coeficiente de retenção de etanol; FPproteína: fator de purificação de proteínas; FPsólidos: fator de purificação de sólidos; FPetanol: fator de purificação de etanol; Prod: produtividade volumétrica.

[0045] The third batch of experiments was carried out using the step-feed method, or continuous feed, a test was performed in triplicate with temperature T = 70ºC and feed flow in terms of surface velocity vs = 1.5 cm/min. The results obtained are shown in Table 6 and Figure 2. In Table 7 are presented concentrations obtained in each fraction in a replicate under these conditions. The purification process with this feed can be stopped at 17 minutes. The process product can be considered, under these conditions, as the effluent obtained between 8.5 and 17 minutes of process, in agreement with fractions 3 and 4 obtained.
Table 6. Feeding by step. mxylitol: xylitol mass; mprotein: protein mass; solids: mass of total solids; madsorbent: mass of activated carbon used; CRxylitol: xylitol retention coefficient; CRprotein: protein retention coefficient; CRsolids: solids retention coefficient; CR420: reduction in absorbance read at 420 nm; CR560: reduction in absorbance read at 560 nm; C Ethanol: ethanol retention coefficient; FPprotein: protein purification factor; FPsolids: solids purification factor; FPethanol: ethanol purification factor; Prod: volumetric productivity.

[0046] Houve separação quase completa de proteínas (CRproteína = 96%) e completa de compostos coloridos (CR420, 560 = 100%, aproximadamente); bom aproveitamento do xilitol (CRxilitol = 31%); altos valores purificação do xilitol com relação a proteínas (FPproteína = 18) e etanol (FPetanol = 20); alto valor de produtividade volumétrica (Prod = 36,8 g/L.h).[0046] There was almost complete separation of proteins (CRprotein = 96%) and complete separation of colored compounds (CR420, 560 = 100%, approximately); good use of xylitol (CRxylitol = 31%); high purification values of xylitol with respect to proteins (FPprotein = 18) and ethanol (FPethanol = 20); high volumetric productivity value (Prod = 36.8 g/L.h).

Claims

Continuous biotechnological xylitol purification process characterized by comprising the following steps:
a) Hydrolysis of sugarcane bagasse at room temperature (25ºC) until reaching a humidity of 5 to 15% (m/m), preferably 10% (m/m);
b) Pre-treatment of dried bagasse with dilute sulfuric acid, with a bagasse/liquid ratio of 5 to 20%, preferably 10% by mass in the proportion of 10 to 300 mg H2SO4/g of bagasse, preferably 100 mg H2SO4/g of bagasse , and temperature from 80 to 200°C, preferably 121°C for a period of 5 to 60 min, preferably 20 min;
c) Filtration of the hydrolyzate obtained on filter paper at room temperature;
d) Storage of the liquid source at 4°C;
e) Concentration of the hydrolyzate obtained in (d) preferably by vacuum evaporator, at a temperature of 40 to 90°C, preferably 70°C, increasing the xylose concentration from 2 to 10 times, preferably 3 times (from 15 g/L to 45 g/L, corresponding to a concentration factor equal to 3);
f) Detoxification of the hydrolyzate with the two-stage liming technique:

f.1) raising the pH of the hydrolyzate to 7.0 with 12 M sodium hydroxide, followed by centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration through filter paper;
f.2) pH reduction to 5.5 by the addition of phosphoric acid (analytical grade), followed by centrifugation at 3000 rpm for 15 min and vacuum filtration on filter paper;

g) Obtaining fermented broth;
h) Purification of the broth can be carried out in two ways:
1) Vacuum filtration:

i) obtaining fractions rich in xylitol, with recovery of 70 to 83% of the injected xylitol and purity of 93.4 to 100.0% in relation to proteins and with complete removal (100%) of colored compounds with absorbance in both 420 and 560 nm.

Process according to claim 1 characterized in that it comprises xylitol from 1.0 to 100.0 g/L, preferably 15.0 g/L, xylose from 0.1 to 20.0 g/L, preferably 1.4 g /L, glucose from 0.1 to 20.0 g/L, preferably 0.1 g/L, arabinose from 0.1 to 20.0 g/L, preferably 3.4 g/L, glycerol from 0.1 to 20 g/L, preferably 1.7 g/L, acetic acid from 0.1 to 20 g/L, preferably 0.1 g/L, ethanol from 0.1 to 20 g/L, preferably 5.0 g /L, total proteins from 0.1 to 30.0 g/L, preferably 19.2 g/L, absorbance at 420 nm from 0.1 to 30.0, preferably 15.7 and absorbance at 560 nm from 0. 1 to 10.0, preferably 3.5.