BR102020010265A2

BR102020010265A2 - SYNTHETIC FORMULATIONS WITH CAIROMONAL ACTIVITY, FROM VOLATILE COMPOUNDS OF PINE FRUITS (ANNONA SQUAMOSA), ATTRACTIVE TO MALE CERCONOTA ANONELLA (LEPIDOPTERA: DEPRESSARIDAE)

Info

Publication number: BR102020010265A2
Application number: BR102020010265-6A
Authority: BR
Inventors: Ruth Rufino Do Nascimento; Rita De Cássia Corrreia Da Silva; Cristiane Canuto Dos Santos Tavares; Maxdouglas Dos Santos; Fabiane Caxico De Abreu Galdino; Adriana De Lima Mendonça; Paulo Milet-Pinheiro; Daniela Maria Do Amaral Ferraz Navarro
Original assignee: Universidade Federal De Alagoas
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2021-12-07

Abstract

A broca-do-fruto das anonáceas, Cerconota anonella (Lepidoptera: Oecophoridae), pode ser encontrada em diversos países da América Latina. No Brasil, encontra-se bastante disseminada, ocorrendo em todas as regiões brasileiras, exceto na região sul, e atacando principalmente frutos de pinha e graviola. Os estudos com relação à comunicação química desta espécie são escassos, não havendo nenhum registro de produtos específicos no combate deste inseto praga. Assim, técnicas que visam capturá-lo, por meio de atrativos específicos baseados em compostos voláteis que desencadeiam mudanças comportamentais no receptor do organismo (semioquímicos), são objetos importantes das investigações científicas. Deste modo, o presente estudo objetivou identificar formulações atrativas para machos virgens de C. anonella, a partir de compostos voláteis liberados por frutos de pinha no estágio maduro de maturação. Os resultados obtidos demonstram que três compostos: mirceno, β-ocimeno e linalol eliciaram atividade antenal em machos desta espécie. Nos bioensaios comportamentais, quatro misturas, na dose de 1ng, destes componentes desencadearam atratividade em machos virgens de maneira análoga ao extrato de pinha no estágio maduro de maturação. Os resultados desta pesquisa demonstraram que as misturas testadas são promissoras para emprego como iscas olfativas na captura de machos em pomares de pinha infestados com esta espécie no território brasileiro.

The Annonaceae fruit borer, Cerconota anonella (Lepidoptera: Oecophoridae), can be found in several Latin American countries. In Brazil, it is quite widespread, occurring in all Brazilian regions, except in the southern region, and attacking mainly pine and soursop fruits. Studies regarding the chemical communication of this species are scarce, with no record of specific products for combating this insect pest. Thus, techniques that aim to capture it, through specific attractants based on volatile compounds that trigger behavioral changes in the organism's receptor (semiochemicals), are important objects of scientific investigations. Thus, the present study aimed to identify attractive formulations for virgin males of C. anonella, from volatile compounds released by pinecone fruits in the mature stage of maturation. The results obtained demonstrate that three compounds: myrcene, β-ocimene and linalool elicited antennal activity in males of this species. In the behavioral bioassays, four mixtures, at a dose of 1ng, of these components triggered attractiveness in virgin males in a similar way to the pine cone extract in the mature stage of maturation. The results of this research showed that the tested mixtures are promising for use as olfactory baits in the capture of males in pine cone orchards infested with this species in Brazilian territory.

Description

SYNTHETIC FORMULATIONS WITH CAIROMONAL ACTIVITY, FROM VOLATILE COMPOUNDS OF PINE FRUITS (ANNONA SQUAMOSA), ATTRACTIVE TO MALE CERCONOTA ANONELLA (LEPIDOPTERA: DEPRESSARIDAE)

[001] A presente invenção refere-se às preparações com atividade cairomonal a partir dos constituintes voláteis liberados por frutos de pinha (Annona squamosa, eficientes no controle da broca-do-fruto das anonáceas, Cerconota anonella. Em uma primeira concretização, a composição com atividade cairomonal corresponde as seguintes misturas: mistura 1 (mirceno, β-ocimeno e linalol) mistura 2 (mirceno e β-ocimeno), mistura 3 (mirceno e linalol) e mistura 4 (β-ocimeno e linalol) formuladas no substrato polimérico quitosana na dose de 0,1ng com a proporção entre mistura e substrato de 1:1.[001] The present invention relates to preparations with kairomonal activity from the volatile constituents released by pinecone fruits (Annona squamosa, efficient in controlling the annonaceae fruit borer, Cerconota anonella. In a first embodiment, the composition with kairomonal activity corresponds to the following mixtures: mixture 1 (myrcene, β-ocimene and linalool) mixture 2 (myrcene and β-ocimene), mixture 3 (myrcene and linalool) and mixture 4 (β-ocimene and linalool) formulated on the polymeric substrate chitosan at a dose of 0.1ng with a ratio between mixture and substrate of 1:1.

PROBLEM THAT THE INVENTION IS PROPOSED TO SOLVE

[002] A Cerconota anonella, também conhecida como broca-do-fruto, é considerada uma das pragas mais importantes da cultura de anonáceas, devido aos danos causados ao fruto, comprometendo a polpa, e, consequentemente, reduzindo o seu valor comercial para o consumo in natura ou para o processamento industrial. Os frutos atacados por este inseto apresentam apodrecimento da polpa, o endurecimento e enegrecimento da região atacada, reduzindo seu valor comercial e tornando-os impróprios para a comercialização ou para o processamento industrial. Além de depreciar a qualidade dos frutos e impedir a reprodução deles, devido aos danos causados as flores e botões florais, a praga C. anonella ainda facilita a entrada de vários organismos oportunistas no interior dos frutos. Estimativas indicam que, em cada safra, a perda comercial de polpa de graviola pode atingir percentuais de até 100%, devido ao ataque massivo desta praga. Os compostos voláteis liberados por plantas e frutos hospedeiros afetam o comportamento reprodutivo de machos e fêmeas de lepidópteros, atuando como sinalizadores que orientam os machos virgens para os sítios de acasalamento, mesmo na ausência de feromônio sexual e as fêmeas acasaladas a encontrarem os locais adequados para oviposição. Atualmente não existem produtos oficialmente registrados no Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) para o controle de pragas e doenças em frutos de pinha. Assim, técnicas que visem à captura seletiva destes insetos são extremamente importantes, principalmente se incluírem o uso de compostos não tóxicos, em pequenas quantidades e que possam ser formulados em substrato específico que garanta a liberação lenta e gradual e facilite o manuseio dos compostos bioativos pelo produtor (SOBRINHO et al., 2011; ARX et al., 2011; AGROFIT, 2020).[002] Cerconota anonella, also known as fruit borer, is considered one of the most important pests of annonaceae culture, due to the damage caused to the fruit, compromising the pulp, and, consequently, reducing its commercial value for the consumption in natura or for industrial processing. The fruits attacked by this insect show rotting of the pulp, the hardening and blackening of the attacked region, reducing their commercial value and making them unsuitable for commercialization or industrial processing. In addition to depreciating the quality of the fruits and preventing their reproduction, due to the damage caused to the flowers and floral buds, the pest C. anonella also facilitates the entry of several opportunistic organisms inside the fruits. Estimates indicate that, in each harvest, the commercial loss of soursop pulp can reach percentages of up to 100%, due to the massive attack of this pest. The volatile compounds released by host plants and fruits affect the reproductive behavior of lepidopteran males and females, acting as signals that guide virgin males to mating sites, even in the absence of sex pheromone, and mated females to find suitable sites for mating. oviposition. Currently, there are no products officially registered with the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA) for the control of pests and diseases in pinecone fruits. Thus, techniques aimed at the selective capture of these insects are extremely important, especially if they include the use of non-toxic compounds, in small amounts and that can be formulated in a specific substrate that guarantees a slow and gradual release and facilitates the handling of bioactive compounds by the animal. producer (SOBRINHO et al., 2011; ARX et al., 2011; AGROFIT, 2020).

[003] A presente invenção se propõe a minimizar o problema enfrentado pelos produtores destes frutos, no que se refere ao ataque da praga em questão, pelo uso de formulações contendo misturas de compostos voláteis liberados por frutos de pinha.[003] The present invention proposes to minimize the problem faced by the producers of these fruits, with regard to the attack of the pest in question, by the use of formulations containing mixtures of volatile compounds released by pinecone fruits.

FIELD OF OPERATION

[004] Com a presente invenção, espera-se que esta seja utilizada em plantios comerciais de pinha nas regiões brasileiras em que essa cultura está disseminada, objetivando o controle e consequente diminuição dos prejuízos causados pela broca do fruto, Cerconota anonella.[004] With the present invention, it is expected that it will be used in commercial plantations of pinecone in Brazilian regions where this culture is widespread, aiming at the control and consequent reduction of the damage caused by the fruit borer, Cerconota anonella.

STATUS OF THE TECHNIQUE

[005] Um dos principais desafios da fruticultura está na produção sustentável de frutas, principalmente devido ao uso indiscriminado de agrotóxicos para o controle de insetos praga. Um meio alternativo que vem sendo estudado é o controle comportamental através da utilização de semioquímicos.[005] One of the main challenges of fruit growing is the sustainable production of fruit, mainly due to the indiscriminate use of pesticides to control insect pests. An alternative means that has been studied is behavioral control through the use of semiochemicals.

[006] Devido à importância dos compostos orgânicos voláteis na atração dos insetos, a literatura reporta registros de produtos utilizados como atraentes para diversas espécies de lepidópteros. O composto 5,9-dimetil-pentadecano, por exemplo, é o feromônio sexual, produzido pelas fêmeas do bicho-mineiro do café, Leucoptera coffeella (Guérin-mèneville) (Lepidoptera: Lyonetiidae) (IBARRA, R.T.L.B., 2006) para atrair machos virgens coespecíficos. A mistura constituída pelos aldeídos, (Z)-9- hexadecenal e (Z)-11-hexadecenal funciona como isca eficaz na atração de Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) (KEHAT, M. et al., 1980). O sesquiterpeno, (E)-β-farneseno, oriundo da planta hospedeira, Malus domestica, funciona como cairomônio, atraindo e capturando machos de C. pomonella para armadilhas iscadas em testes de campo (Bäckman et al. (2001) e Bengtsson et al. (2001).[006] Due to the importance of volatile organic compounds in attracting insects, the literature reports records of products used as attractants for several species of lepidopterans. The compound 5,9-dimethyl-pentadecane, for example, is the sex pheromone produced by females of the coffee leaf miner, Leucoptera coffeella (Guérin-mèneville) (Lepidoptera: Lyonetiidae) (IBARRA, RTLB, 2006) to attract males. conspecific virgins. The mixture consisting of the aldehydes, (Z)-9-hexadecenal and (Z)-11-hexadecenal works as an effective bait in attracting Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) (KEHAT, M. et al., 1980). Sesquiterpene, (E)-β-farnesene, from the host plant, Malus domestica, functions as kairomonium, attracting and capturing C. pomonella males for baited traps in field tests (Bäckman et al. (2001) and Bengtsson et al. (2001).

[007] Em pesquisas realizadas em diferentes bases patentárias encontrou-se um único registro de patente referente à mariposa Cerconota anonella, a patente BR102014010066A2, intitulada composição com atividade feromonal e seu uso no controle da broca de frutos anonáceas, a qual refere-se a formulação com atividade de feromônio sexual, eficazes no controle da broca de frutos (Cerconota anonella) de anonáceas (pinha, graviola e atemóia).[007] In research carried out in different patent bases, a single patent record was found for the Cerconota anonella moth, patent BR102014010066A2, entitled composition with pheromonal activity and its use in the control of the annonaceous fruit borer, which refers to formulation with sexual pheromone activity, effective in controlling fruit borer (Cerconota anonella) of annonaceae (pine cone, soursop and atemoya).

[008] Quanto a associação dos compostos voláteis linalol, mirceno e ocimeno aos comportamentos de atração ou de repelência em lepidópteros, foram encontradas quatro patentes. A patente WO2004028256A1 intitulada Attractant for apple fruit moth and other insect pests of apple, refere-se ao uso de compostos voláteis para o controle de insetos pragas em maçãs, em particular as mariposas Argyresthia conjugella Zeller (Lepidoptera: Argyresthiidae) e a Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Tortricidae). Este documento relata os compostos linalol, ρ-anisaldeído, (E)-β-farneseno, farnesol, (Z)-3-hexenil-2-butanoato de metila e o salicilato de metila como atraentes eficazes para estas espécies e para outros insetos que são importantes pragas da maçã. A patente US6190652B1, intitulada Volatiles of Japanese honeysuckle flowers as attractants for adult lepidopteran insects, apresenta o emprego da cis-jasmona e da combinação desta substância com um ou mais compostos voláteis oriundos da flor Lonicera japonica (japanese honeysuckle), particularmente linalol e/ou fenil acetaldeído, para atrair os lepidópteros adultos Heliothis virescens e Helicoverpa zea para armadilhas de campo, sendo estes voláteis empregados no controle e monitoramento destas pragas agrícolas. A invenção CN108552176B descreve um método para melhorar a defesa da planta lavanda a insetos fitófagos, induzindo o aumento da produção dos terpenóides limoneno, β-felandreno e β-ocimeno nas flores, mediante a aplicação do éster metílico do ácido jasmônico à plantas de lavanda, promovendo repelência em insetos fitófagos ou atraindo os inimigos naturais destes insetos. A patente CN109042647A, trata da aplicação do β-mirceno como um componente repelente para fêmeas da mariposa Chilo suppressalis, principal praga do arroz na China, cultura que promove amplos benefícios econômicos, sociais e ecológicos a esta nação. Adicionalmente, uma mistura constituída por β-mirceno, linalol e ocimeno, liberados pelo fruto de carambola, como atraentes para fêmeas de A. oblíqua foi depositada junto ao INPI no ano passado sob o número BR1020190045418. Os compostos mirceno e ocimeno, identificados em nosso estudo, também foram reportados como constituintes das misturas de compostos voláteis liberados por frutos de pitanga (Eugenia uniflora L.) e por três cultivares de manga (Haden, Tommy-Atkins e Keitt), demonstrando que estes compostos integram os aromas de diversas frutas (OLIVEIRA et al., 2006; RANCO, M. R. B. et al., 2004).[008] As for the association of the volatile compounds linalool, myrcene and ocimene to the behavior of attraction or repellency in lepidopterans, four patents were found. WO2004028256A1 entitled Attractant for apple fruit moth and other insect pests of apple, refers to the use of volatile compounds for the control of insect pests in apples, in particular the moths Argyresthia conjugella Zeller (Lepidoptera: Argyresthiidae) and Cydia pomonella L (Lepidoptera: Tortricidae). This document reports the compounds linalool, ρ-anisaldehyde, (E)-β-farnesene, farnesol, methyl (Z)-3-hexenyl-2-butanoate and methyl salicylate as effective attractants for these species and for other insects that are important apple pests. The patent US6190652B1, entitled Volatiles of Japanese honeysuckle flowers as attractants for adult lepidopteran insects, presents the use of cis-jasmone and the combination of this substance with one or more volatile compounds from the Lonicera japonica flower (Japanese honeysuckle), particularly linalool and/or phenyl acetaldehyde, to attract adult lepidopterans Heliothis virescens and Helicoverpa zea to field traps, and these volatiles are used in the control and monitoring of these agricultural pests. The invention CN108552176B describes a method to improve the defense of the lavender plant against phytophagous insects, inducing an increase in the production of the terpenoids limonene, β-phelandrene and β-ocimene in flowers, by applying jasmonic acid methyl ester to lavender plants, promoting repellency in phytophagous insects or attracting the natural enemies of these insects. Patent CN109042647A deals with the application of β-myrcene as a repellent component for females of the Chilo suppressalis moth, the main pest of rice in China, a crop that promotes broad economic, social and ecological benefits to this nation. Additionally, a mixture consisting of β-myrcene, linalool and ocimene, released by star fruit, as attractive to females of A. oblique was deposited with the INPI last year under the number BR1020190045418. The compounds myrcene and ocimene, identified in our study, were also reported as constituents of mixtures of volatile compounds released by cherry (Eugenia uniflora L.) and three mango cultivars (Haden, Tommy-Atkins and Keitt), demonstrating that these compounds integrate the aromas of several fruits (OLIVEIRA et al., 2006; RANCO, MRB et al., 2004).

[009] Antes mesmo da descoberta dos pesticidas, as plantas já eram mundialmente utilizadas no controle de pragas. Atualmente vários produtos à base de plantas são utilizados com a finalidade de minimizar os possíveis danos ocasionados por insetospragas (ADEYEMI et al., 2010; STEVENSON; BELMAIN, 2016).[009] Even before the discovery of pesticides, plants were already used worldwide in pest control. Currently, several herbal products are used in order to minimize the possible damage caused by insect pests (ADEYEMI et al., 2010; STEVENSON; BELMAIN, 2016).

[010] Kutinkova e colaboradores (2005) em seu estudo sobre sinergismo, relataram que o cairomônio (2E, 4Z)-2,4-decadienoato de etila funciona como um potente atraente para machos e fêmeas de Cydia pomonella, quando combinado ao feromônio sexual sintético, em testes conduzidos em pomares de maçã na Bulgária. Esses autores relataram que, nenhum macho de C. pomonella foi capturado em armadilha iscada com (2E, 4Z)-2,4-decadienoato de etila; poucos machos foram capturados em armadilhas contendo o feromônio de fêmeas coespecíficas, ao passo que, um maior número de machos foi capturado em armadilhas iscadas com uma mistura constituída pelo feromônio e cairomônios na proporção de 1:1, demonstrando a potencialização da interação entre os semioquímicos na atração de machos. Entretanto, outros estudos conduzidos na Califórnia e em outros estados dos Estados Unidos atribuem ao cairomônio (2E, 4Z)-2,4-decadienoato de etila, a atração efetiva de machos e fêmeas de C. pomonella (Light et al. 2001; Knight e Light 2004).[010] Kutinkova et al. (2005) in their study on synergism, reported that kairomonium (2E, 4Z)-2,4-ethyl decadienoate works as a potent attractant for males and females of Cydia pomonella, when combined with the sex pheromone. synthetic, in tests conducted in apple orchards in Bulgaria. These authors reported that no male of C. pomonella was captured in a trap baited with ethyl (2E, 4Z)-2,4-decadienoate; few males were captured in traps containing the pheromone of conspecific females, while a greater number of males were captured in traps baited with a mixture consisting of pheromone and kairomones in the proportion of 1:1, demonstrating the potentiation of the interaction between the semiochemicals in attracting males. However, other studies conducted in California and other US states attribute the effective attraction of males and females of C. pomonella to kairomonium (2E, 4Z)-2,4-decadienoate (Light et al. 2001; Knight and Light 2004).

[011] Considerando a ação de compostos voláteis de frutos hospedeiros no comportamento de diversas espécies de lepidópteros e a inexistência de patentes baseadas nos compostos voláteis liberados por frutos de A. squamosa e A. muricata e seu potencial como atraente para adultos de C. anonella. Os autores, desta invenção, propõem através de estudos eletrofisiológicos, químicos e comportamentais o desenvolvimento de um bioproduto, baseado nos compostos voláteis liberados por frutos de A. squamosa, administrado na forma de formulações específicas e agricolamente aceitáveis, que sirva para captura de machos de C. anonella.[011] Considering the action of volatile compounds from host fruits on the behavior of several species of lepidopterans and the lack of patents based on volatile compounds released by fruits of A. squamosa and A. muricata and their potential as an attractive to adults of C. anonella . The authors of this invention propose, through electrophysiological, chemical and behavioral studies, the development of a bioproduct, based on volatile compounds released by A. squamosa fruits, administered in the form of specific and agriculturally acceptable formulations, which can be used to capture males of C. anonella.

TECHNIQUE DESCRIPTION

[012] Os inventores da presente composição identificaram formulações em biopolímero dos compostos sintéticos oriundos dos constituintes voláteis de frutos de pinha. As formulações com atividade cairomonal compreendem as misturas 1, 2, 3 e 4 constituídas pelos compostos: mirceno, β-ocimeno e linalol em diferentes combinações, na dose de 0,1ng, as quais foram testadas com machos virgens de C. anonella.[012] The inventors of the present composition identified biopolymer formulations of synthetic compounds from the volatile constituents of pinecone fruits. The formulations with kairomonal activity comprise mixtures 1, 2, 3 and 4 constituted by the compounds: myrcene, β-ocimene and linalool in different combinations, at a dose of 0.1ng, which were tested with virgin males of C. anonella.

[013] As composições da invenção podem incluir um ou mais aditivos para melhorar a estabilidade da composição, enchimentos, espessantes, solventes, aglutinantes. Exemplos de tais aditivos incluem, mas não estão limitados a óleos vegetais, tais como, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de milho, óleo de girassol, óleo de canola e suas combinações. Exemplos de enchimentos incluem uma ou mais argilas minerais (por exemplo, atapulgita). Exemplos de solventes incluem álcool etílico, álcool metílico, hidrocarbonetos clorados, solventes de petróleo e suas combinações. Exemplos de aglutinantes incluem goma shellac, resinas acrílicas, epóxidos, alquídicas, poliuretanas, óleo de linhaça e suas combinações. Estimulantes de apetite também podem estar presentes nas composições da invenção, estimulantes esses que incluem, mas não estão limitados a óleo de semente de algodão, ésteres de ácido graxo de fitol, ésteres de ácido graxo de geranil geraniol, extratos de plantas, álcoois de plantas e suas combinações.[013] The compositions of the invention may include one or more additives to improve the stability of the composition, fillers, thickeners, solvents, binders. Examples of such additives include, but are not limited to, vegetable oils such as olive oil, soybean oil, corn oil, sunflower oil, canola oil and combinations thereof. Examples of fillers include one or more mineral clays (eg attapulgite). Examples of solvents include ethyl alcohol, methyl alcohol, chlorinated hydrocarbons, petroleum solvents and combinations thereof. Examples of binders include shellac gum, acrylic resins, epoxides, alkyds, polyurethanes, linseed oil and combinations thereof. Appetite stimulants may also be present in the compositions of the invention, which stimulants include, but are not limited to, cottonseed oil, phytol fatty acid esters, geranyl geraniol fatty acid esters, plant extracts, plant alcohols and their combinations.

[014] As composições da invenção podem conter um ou mais agentes poliméricos tais como celuloses, proteínas, caseína, polímeros baseados em fluorcarbono, resinas hidrogenadas, ligninas, melamina, poliuretanas, polímeros vinílicos, tais como acetato de polivinila (PVAC), policarbonatos, polivinilideno dinitrila, poliamidas, álcool polivinílico (PVA), poliamida-aldeído, aldeído polivinílico, poliésteres, cloreto de polivinila (PVC), polietilenos, poliestirenos, polivinilideno, silicones, e combinações dos mesmos. Exemplos de celuloses incluem, mas não estão limitados a, metilcelulose, etil celulose, acetato de celulose, acetato-butirato de celulose, acetatopropionato de celulose, propionato de celulose, e combinações dos mesmos.[014] The compositions of the invention may contain one or more polymeric agents such as celluloses, proteins, casein, fluorocarbon-based polymers, hydrogenated resins, lignins, melamine, polyurethanes, vinyl polymers such as polyvinyl acetate (PVAC), polycarbonates, polyvinylidene dinitrile, polyamides, polyvinyl alcohol (PVA), polyamide-aldehyde, polyvinyl aldehyde, polyesters, polyvinyl chloride (PVC), polyethylenes, polystyrenes, polyvinylidene, silicones, and combinations thereof. Examples of celluloses include, but are not limited to, methyl cellulose, ethyl cellulose, cellulose acetate, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate propionate, cellulose propionate, and combinations thereof.

[015] As composições da invenção também podem incluir um ou mais inseticidas químicos tais como ciflutrin, permetrin, cipermetrin, bifintrin, fenvalerato, flucitrinato, azinfosmetil, metil paration, malation e outros. As composições da invenção também podem incluir inseticidas biológicos, tais como toxinas e piretrinas naturais, proteínas de Bacillus thuringiensis e de Beauveria bassiana.[015] The compositions of the invention may also include one or more chemical insecticides such as cyfluthrin, permethrin, cypermethrin, bifinthrin, fenvalerate, flucitrinate, azinphosmethyl, methyl parathion, malathion and others. Compositions of the invention may also include biological insecticides, such as natural toxins and pyrethrins, proteins from Bacillus thuringiensis and Beauveria bassiana.

[016] As composições da invenção compreendem os ingredientes ativos e inertes em uma quantidade cairomonal eficaz, ou seja, em uma quantidade suficiente para atrais machos de C. anonella em pomares de pinha. A dita quantidade eficaz corresponde a uma proporção que varia na faixa de 1 até 10 (p/p) de substâncias ativas (componentes da formulação).[016] The compositions of the invention comprise the active and inert ingredients in an effective kairomonal amount, that is, in an amount sufficient to attract males of C. anonella in pinecone orchards. Said effective amount corresponds to a proportion ranging from 1 to 10 (w/w) of active substances (components of the formulation).

[017] As composições da invenção podem incluir um ou mais aditivos para melhorar a estabilidade da composição, enchimentos, espessantes, solventes, aglutinantes. Exemplos de tais aditivos incluem, mas não estão limitados a óleos vegetais, tais como, óleo de oliva, óleo de soja, óleo de milho, óleo de girassol, óleo de canola e suas combinações. Exemplos de enchimentos incluem uma ou mais argilas minerais (por exemplo, atapulgita). Exemplos de solventes incluem álcool etílico, álcool metílico, hidrocarbonetos clorados, solventes de petróleo e suas combinações. Exemplos de aglutinantes incluem goma shellac, resinas acrílicas, epóxidos, alquídicas, poliuretanas, óleo de linhaça e suas combinações. Estimulantes de apetite também podem estar presentes nas composições da invenção, estimulantes esses que incluem, mas não estão limitados a óleo de semente de algodão, ésteres de ácido graxo de fitol, ésteres de ácido graxo de geranil geraniol, extratos de plantas, álcoois de plantas e suas combinações.[017] The compositions of the invention may include one or more additives to improve the stability of the composition, fillers, thickeners, solvents, binders. Examples of such additives include, but are not limited to, vegetable oils such as olive oil, soybean oil, corn oil, sunflower oil, canola oil and combinations thereof. Examples of fillers include one or more mineral clays (eg attapulgite). Examples of solvents include ethyl alcohol, methyl alcohol, chlorinated hydrocarbons, petroleum solvents and combinations thereof. Examples of binders include shellac gum, acrylic resins, epoxides, alkyds, polyurethanes, linseed oil and combinations thereof. Appetite stimulants may also be present in the compositions of the invention, which stimulants include, but are not limited to, cottonseed oil, phytol fatty acid esters, geranyl geraniol fatty acid esters, plant extracts, plant alcohols and their combinations.

[018] As composições da invenção podem conter um ou mais agentes poliméricos tais como celuloses, proteínas, caseína, polímeros baseados em fluorcarbono, resinas hidrogenadas, ligninas, melamina, poliuretanas, polímeros vinílicos, tais como acetato de polivinila (PVAC), policarbonatos, polivinilideno dinitrila, poliamidas, álcool polivinílico (PVA), poliamida-aldeído, aldeído polivinílico, poliésteres, cloreto de polivinila (PVC), polietilenos, poliestirenos, polivinilideno, silicones, e combinações dos mesmos. Exemplos de celuloses incluem, mas não estão limitados a, metilcelulose, etil celulose, acetato de celulose, acetato-butirato de celulose, acetatopropionato de celulose, propionato de celulose, e combinações dos mesmos.[018] The compositions of the invention may contain one or more polymeric agents such as celluloses, proteins, casein, fluorocarbon-based polymers, hydrogenated resins, lignins, melamine, polyurethanes, vinyl polymers such as polyvinyl acetate (PVAC), polycarbonates, polyvinylidene dinitrile, polyamides, polyvinyl alcohol (PVA), polyamide-aldehyde, polyvinyl aldehyde, polyesters, polyvinyl chloride (PVC), polyethylenes, polystyrenes, polyvinylidene, silicones, and combinations thereof. Examples of celluloses include, but are not limited to, methyl cellulose, ethyl cellulose, cellulose acetate, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate propionate, cellulose propionate, and combinations thereof.

[019] As composições da invenção também podem incluir um ou mais inseticidas químicos tais como ciflutrin, permetrin, cipermetrin, bifintrin, fenvalerato, flucitrinato, azinfosmetil, metil paration, malation e outros. As composições da invenção também podem incluir inseticidas biológicos, tais como toxinas e piretrinas naturais, proteínas de Bacillus thuringiensis e de Beauveria bassiana.[019] The compositions of the invention may also include one or more chemical insecticides such as cyfluthrin, permethrin, cypermethrin, bifinthrin, fenvalerate, flucitrinate, azinphosmethyl, methyl parathion, malathion and others. Compositions of the invention may also include biological insecticides, such as natural toxins and pyrethrins, proteins from Bacillus thuringiensis and Beauveria bassiana.

[020] As composições da invenção compreendem os ingredientes ativos e inertes em uma quantidade cairomonal eficaz, ou seja, em uma quantidade suficiente para atrais machos de C. anonella em pomares de pinha. A dita quantidade eficaz corresponde a uma proporção que varia na faixa de 1 até 10 (p/p) de substâncias ativas (componentes da formulação).[020] The compositions of the invention comprise the active and inert ingredients in an effective kairomonal amount, that is, in an amount sufficient to attract males of C. anonella in pinecone orchards. Said effective amount corresponds to a proportion ranging from 1 to 10 (w/w) of active substances (components of the formulation).

[021] Os exemplos a seguir são referentes a experimentos para identificação dos compostos bioativos e caracterização da atividade biológica atrativa dos componentes liberados por frutos de pinha no estágio maduro de maturação.[021] The following examples refer to experiments for the identification of bioactive compounds and characterization of the attractive biological activity of the components released by pinecone fruits in the mature stage of maturation.

Example 1: Collection and storage of infested fruits to obtain adult insects

[022] Frutos infestados com lagartas da broca-dos-frutos, C. anonella foram coletados no município de Coruripe-AL (10°09’54’’S; 36°21’07’’W) e levados para o laboratório de Ecologia Química, da Universidade Federal de Alagoas (UFAL). Os frutos maduros e verdes, com sinais de ataque, foram armazenados em gaiolas de madeira (30 cm de largura x 30 cm de comprimento x 30 cm de altura) com as laterais cobertas por tela de material plástico, facilitando a ventilação.[022] Fruits infested with caterpillars of the fruit borer, C. anonella were collected in the municipality of Coruripe-AL (10°09'54''S; 36°21'07''W) and taken to the laboratory of Chemical Ecology, from the Federal University of Alagoas (UFAL). The ripe and unripe fruits, with signs of attack, were stored in wooden cages (30 cm wide x 30 cm long x 30 cm high) with the sides covered by a plastic screen, facilitating ventilation.

Example 2. Insect Maintenance

[023] Após a coleta, os frutos infestados foram utilizados para a remoção das lagartas de C. anonella. Com o auxílio de luvas e pinças, as lagartas foram individualmente retiradas e mantidas em placas de Petri de acrílico contendo dieta artificial de realimentação, sendo mantidas em laboratório para criação até obtenção da fase de pupa. A dieta era composta dos seguintes ingredientes: gérmem de trigo, cloridrato de colina, sais de Wesson, ácido ascórbico, farelo de soja, açúcar, nipagin, ácido sórbico, ágar-ágar, solução vitamínica, formol, ambrasinto, vita gold e água destilada. No estágio de pupa, fêmeas e machos foram sexados com o auxílio do microscópio, baseado na presença de poro genital, presente em machos e, ausente em fêmeas. Em seguida, foram colocadas em placas forradas com algodão umedecido com água destilada e uma solução de sulfato de cobre a 1%, cobertas com papel filtro e mantidas em câmara de vidro (9 cm de largura x 16 cm de comprimento x 9,5 cm de altura) devidamente etiquetadas, onde se encontrava um recipiente de vidro contendo solução de mel em água a 10%. Após a emergência dos insetos adultos, fêmeas e machos virgens foram colocados em câmaras de vidro (9 cm de largura x 16 cm de comprimento x 9,5 cm de altura) devidamente identificadas, contendo alimento (solução de mel em água a 10%). Os machos virgens foram utilizados em bioensaios posteriores. Este procedimento ocorreu em sala climatizada (24,1ºC ± 1,2 e 65% UR ± 1,9), com fotoperíodo invertido (12h:12h).[023] After collection, the infested fruits were used to remove C. anonella caterpillars. With the aid of gloves and tweezers, the caterpillars were individually removed and kept in acrylic Petri dishes containing artificial refeeding diet, being kept in the laboratory for breeding until reaching the pupal stage. The diet consisted of the following ingredients: wheat germ, choline hydrochloride, Wesson salts, ascorbic acid, soy bran, sugar, nipagin, sorbic acid, agar-agar, vitamin solution, formaldehyde, ambrasinth, vita gold and distilled water. . In the pupal stage, females and males were sexed with the aid of a microscope, based on the presence of a genital pore, present in males and absent in females. Then, they were placed on plates lined with cotton moistened with distilled water and a 1% copper sulfate solution, covered with filter paper and kept in a glass chamber (9 cm wide x 16 cm long x 9.5 cm in height) properly labeled, where there was a glass container containing a 10% solution of honey in water. After the emergence of adult insects, virgin females and males were placed in properly identified glass chambers (9 cm wide x 16 cm long x 9.5 cm high) containing food (10% solution of honey in water). . Virgin males were used in further bioassays. This procedure took place in an acclimatized room (24.1ºC ± 1.2 and 65% RH ± 1.9), with inverted photoperiod (12h:12h).

Example 3. Obtaining extracts from pine cones

[024] Para obtenção de extratos, a partir de frutos sadios de pinha no estágio maduro de maturação, foi utilizada a técnica de aeração, também conhecida como “headspace” dinâmico. Os frutos sadios, obtidos comercialmente, foram colocados em câmaras de aeração (22 cm de altura x 30 cm de diâmetro). A parte superior da câmara continha um tubo de vidro com carvão ativo que servia como filtro, para purificar o ar que entrava no sistema. Também na parte superior, existia outro tubo contendo um polímero adsorvente, neste caso, 150 mg de Tenax® com diâmetro poroso de 60-80 mesh, que tinha a função de adsorver as substâncias voláteis liberados pelos frutos. Uma bomba de ar foi conectada na parte superior do sistema e a corrente de ar (filtrada com carvão ativo) era admitida no interior da câmara, se misturava com os compostos voláteis liberados pelos frutos de pinha e seguia em direção ao tubo contendo o adsorvente (Tenax® TA), onde os compostos voláteis eram adsorvidos. O tempo de duração do processo de aeração foi de 24 horas.[024] To obtain extracts from healthy pinecone fruits in the mature stage of maturation, the aeration technique, also known as dynamic headspace, was used. The healthy fruits, obtained commercially, were placed in aeration chambers (22 cm high x 30 cm in diameter). The upper part of the chamber contained a glass tube with activated carbon that served as a filter to purify the air that entered the system. Also in the upper part, there was another tube containing an adsorbent polymer, in this case, 150 mg of Tenax® with a porous diameter of 60-80 mesh, which had the function of adsorbing the volatile substances released by the fruits. An air pump was connected to the upper part of the system and the air stream (filtered with active carbon) was admitted inside the chamber, mixed with the volatile compounds released by the pinecone fruits and followed towards the tube containing the adsorbent ( Tenax® TA), where volatile compounds were adsorbed. The duration of the aeration process was 24 hours.

[025] Os compostos voláteis liberados pelos frutos foram dessorvidos da superfície do Tenax®, através da passagem de 2 mL de hexano (C6H12) bidestilado (grau HPLC) pelo tubo contendo o adsorvente. Cada extrato foi dividido igualmente e armazenado em duas ampolas de 1 mL cada. Em seguida, as ampolas foram seladas, etiquetadas e mantidas em freezer para uso posterior nas análises químicas.[025] The volatile compounds released by the fruits were desorbed from the surface of Tenax®, by passing 2 mL of double-distilled hexane (C6H12) (HPLC grade) through the tube containing the adsorbent. Each extract was divided equally and stored in two ampoules of 1 mL each. Then, the ampoules were sealed, labeled and kept in a freezer for later use in chemical analyses.

Example 4. Identification of electrophysiologically active compounds for C. anonella virgins

[026] Para identificar os compostos presentes nas amostras de aeração de pinha que funcionam como atraentes para machos de C. anonella, as análises eletrofisiológicas foram conduzidas empregando-se um cromatógrafo gasoso (Trace GC Ultra; Thermo Scientific, Milão, Itália), equipado com uma coluna DB-5 (30m x 0,25mm i.d. x 0,25µm film, ValcoBond) e um detector de ionização em chamas (FID) acoplado a uma interface de detecção eletroantenográfica provida pela Syntech (Kirchzarten, Alemanha) (CG-EAG).[026] To identify the compounds present in the pineapple aeration samples that act as attractants for C. anonella males, electrophysiological analyzes were carried out using a gas chromatograph (Trace GC Ultra; Thermo Scientific, Milan, Italy), equipped with a DB-5 column (30m x 0.25mm id x 0.25µm film, ValcoBond) and a flame ionization detector (FID) coupled to an electroantenographic detection interface provided by Syntech (Kirchzarten, Germany) (CG-EAG ).

[027] Uma alíquota das amostras (1,0 µL) foi injetada em cromatógrafo gasoso. Foram utilizados machos virgens com idade variando de 1 a 3 dias. A antena do inseto foi extraída com o auxílio de micro-tesoura, a base e a ponta da antena foram colocadas entre dois eletrodos capilares de vidro, preenchidos com solução de Ringer (8.0 g/L de NaCl, 0,4 g/L de KCl, 0,4 g/L de CaCl2) ligado a fios de prata.[027] An aliquot of the samples (1.0 µL) was injected into a gas chromatograph. Virgin males aged between 1 and 3 days were used. The insect antenna was extracted with the aid of micro-scissors, the base and the tip of the antenna were placed between two glass capillary electrodes, filled with Ringer's solution (8.0 g/L NaCl, 0.4 g/L KCl, 0.4 g/L CaCl2) bonded to silver wires.

[028] A análise ocorreu sob o modo splitless a uma temperatura de 150 °C. O forno do equipamento foi programado para operar a uma temperatura inicial de 40 °C, com velocidade de aquecimento de 6 °C/min até atingir a temperatura final de 200 °C. Durante o processo, o fluxo de gás de arraste, contendo os constituintes químicos separados na coluna, foi dividido em duas partes iguais: uma seguiu para a antena do inseto (detector antenográfico) e a outra para o FID, ocorrendo o registro simultâneo das respostas de ambos os detectores ao material eluído da coluna. Um composto foi considerado EAG-ativo quando induziu despolarização na antena em, pelo menos, três dos seis indivíduos testados.[028] The analysis took place under splitless mode at a temperature of 150 °C. The equipment oven was programmed to operate at an initial temperature of 40 °C, with a heating speed of 6 °C/min until reaching a final temperature of 200 °C. During the process, the carrier gas flow, containing the chemical constituents separated in the column, was divided into two equal parts: one went to the insect antenna (antennagraphic detector) and the other to the FID, with the simultaneous recording of responses. from both detectors to the material eluted from the column. A compound was considered EAG-active when it induced antenna depolarization in at least three of the six subjects tested.

Example 5. Identification of volatile compounds using the technique of Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS)

[029] Os constituintes químicos presentes nos extratos dos frutos de pinha foram identificados mediante análises em cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas (CG-EM) da Agilent Technologies (7890ATM CG, Serie 5975C EM; Palo Alto, CA, USA) equipado com uma coluna capilar DB-5 da Agilent J&W (30 m × 0,25 mm d.i. × 0,25 μm de espessura do filme).[029] The chemical constituents present in the extracts of the pinecone fruits were identified by means of analysis in a gas chromatograph coupled to a mass spectrometer (GC-MS) from Agilent Technologies (7890ATM CG, Series 5975C EM; Palo Alto, CA, USA) equipped with an Agilent J&W DB-5 capillary column (30 m × 0.25 mm di × 0.25 μm film thickness).

[030] Uma alíquota de 1 μL de cada amostra do extrato contendo os constituintes liberados pelos frutos foi introduzida no injetor do cromatógrafo do CG-EM, sob o modo splitless, a uma temperatura de 150°C. A temperatura do forno foi mantida inicialmente a 40°C durante 2 min e, em seguida, aumentada para 230°C a uma velocidade de aquecimento de 4°C/min e mantida a 230°C por 5 min. O fluxo de gás de arraste (hélio) foi mantido a 1 mL/min a uma pressão constante de 7.0 psi. A temperatura da interface do EM e do quadrupolo foram ajustadas para 230°C e 150°C, respectivamente. Os espectros de massas foram obtidos a 70 eV, registrados no intervalo de m/z 30-350 a uma velocidade de escaneamento de 0.5 scan/s.[030] An aliquot of 1 μL of each extract sample containing the constituents released by the fruits was introduced into the chromatograph injector of the GC-MS, under the splitless mode, at a temperature of 150°C. The oven temperature was initially maintained at 40°C for 2 min and then increased to 230°C at a heating rate of 4°C/min and held at 230°C for 5 min. The carrier gas (helium) flow was maintained at 1 mL/min at a constant pressure of 7.0 psi. The EM and quadrupole interface temperatures were set to 230°C and 150°C, respectively. Mass spectra were obtained at 70 eV, recorded in the range of m/z 30-350 at a scan speed of 0.5 scan/s.

[031] Os componentes foram identificados por comparação de seus espectros de massas e índices de retenção, obtidos pela coinjeção da amostra com uma serie de n-alcanos (C7-C40) e calculados através da equação de Van Den Dool e Dec Kratz (1963; MÜHLEN, 2009), com padrões autênticos armazenados nas bibliotecas de referência NIST08, Adams (2007) e Wiley Registry™ (versão 9), integradas ao software Agilent MSD Productivity ChemStation Agilent Technologies (Palo Alto, CA, EUA).[031] The components were identified by comparing their mass spectra and retention indices, obtained by co-injection of the sample with a series of n-alkanes (C7-C40) and calculated through the equation of Van Den Dool and Dec Kratz (1963) ; MÜHLEN, 2009), with authentic standards stored in the NIST08, Adams (2007) and Wiley Registry™ (version 9) reference libraries, integrated into the Agilent MSD Productivity ChemStation Agilent Technologies software (Palo Alto, CA, USA).

Example 6. Obtaining solutions and formulations of synthetic compounds

[032] Os padrões dos compostos sintéticos (mirceno, β-ocimeno e linalol) foram adquiridos comercialmente da Sigma-Aldrich (Brasil) com grau de pureza ≥ 98,5%. Posteriormente, para o preparo das soluções dos compostos foram utilizados os seguintes procedimentos: 5 μL do composto sintético foram transferidos para um balão volumétrico de 5,0 mL completando-se o volume com hexano bidestilado grau (HPLC) e homogeneizando a solução, obtendo-se assim, uma solução com concentração 1,0 μL/mL. As soluções dos compostos foram acondicionadas em vials de vidro, os quais foram mantidos em freezer para posterior uso nos bioensaios comportamentais.[032] The standards of synthetic compounds (myrcene, β-ocimene and linalool) were purchased commercially from Sigma-Aldrich (Brazil) with a purity of ≥ 98.5%. Subsequently, the following procedures were used to prepare the solutions of the compounds: 5 μL of the synthetic compound were transferred to a 5.0 mL volumetric flask, completing the volume with double-distilled grade hexane (HPLC) and homogenizing the solution, obtaining if so, a solution with a concentration of 1.0 μL/mL. The solutions of the compounds were placed in glass vials, which were kept in a freezer for later use in behavioral bioassays.

[033] Volumes de 10 µL de cada solução das misturas na concentração de 1,0 µL/mL foram formulados em eppendorfs contendo 0,01 g de um substrato biopolimérico, através da adsorção por contato, por um período de 24h. As formulações obtidas resultaram na dose 0,1 ng.[033] Volumes of 10 µL of each solution of the mixtures in the concentration of 1.0 µL/mL were formulated in eppendorfs containing 0.01 g of a biopolymeric substrate, through adsorption by contact, for a period of 24h. The formulations obtained resulted in a dose of 0.1 ng.

Example 7. Laboratory tests with the formulations

[034] Para avaliar os comportamentos exibidos por machos de C. anonella diante de formulações dos compostos voláteis sintéticos, os bioensaios foram conduzidos no laboratório de Ecologia Química (UFAL) utilizando um olfatômetro do tipo “Y” de dupla escolha, durante a escotofase, entre 9:00 e 11:30 h, com temperatura média de 26,2°C e umidade relativa média de 40%. Nesses ensaios, foram utilizados machos virgens de C.anonella com 1 a 3 dias de idade. Pelo fato dos bioensaios serem realizados no escuro, os mesmos foram conduzidos com auxílio de uma luz vermelha, para visualização do comportamento do inseto.[034] To evaluate the behaviors exhibited by males of C. anonella in the face of formulations of synthetic volatile compounds, bioassays were conducted at the Chemical Ecology Laboratory (UFAL) using a double-choice "Y" type olfactometer during scotophase, between 9:00 and 11:30 h, with an average temperature of 26.2°C and an average relative humidity of 40%. In these trials, virgin males of C.anonella with 1 to 3 days of age were used. Because the bioassays were performed in the dark, they were conducted with the aid of a red light to visualize the insect's behavior.

[035] O olfatômetro em “Y” (15,7 cm de comprimento x 4,4 cm de altura) consiste de um tubo de vidro bifurcado, ao qual foi acoplada uma arena (54 cm de comprimento x 25,8 cm de largura x 24,7 cm de altura) e uma bomba para introdução de ar no interior do olfatômetro, o qual foi purificado mediante passagem prévia em filtro de carvão ativo.[035] The “Y” olfactometer (15.7 cm long x 4.4 cm high) consists of a bifurcated glass tube, to which an arena (54 cm long x 25.8 cm wide) was attached. x 24.7 cm high) and a pump for introducing air inside the olfactometer, which was purified by passing through an active carbon filter.

[036] O eppendorf contendo a solução microencapsulada foi colocado em um dos braços do sistema Y, no outro braço do sistema foi colocado o eppendorf contendo a formulação com o tratamento controle (extrato de pinha encapsulado em quitosana).[036] The eppendorf containing the microencapsulated solution was placed in one of the arms of the Y system, in the other arm of the system was placed the eppendorf containing the formulation with the control treatment (cone extract encapsulated in chitosan).

[037] Foi utilizado um macho (virgem) por bioensaio. O comportamento observado e quantificado foi o vôo orientado para a fonte de odor com movimento simultâneo de antenação (comportamento de busca ativa). Para cada tratamento (formulações dos compostos sintéticos individuais e respectivas misturas) foram realizadas seis repetições. O tempo de observação para cada bioensaio foi de quinze minutos e as posições dos braços do olfatômetro foram invertidas entre os tratamentos para evitar qualquer efeito tendencioso de habituação.[037] One male (virgin) was used per bioassay. The observed and quantified behavior was the flight oriented towards the odor source with simultaneous antenna movement (active search behavior). For each treatment (formulations of the individual synthetic compounds and their mixtures) six replications were performed. The observation time for each bioassay was fifteen minutes and the positions of the olfactometer arms were inverted between treatments to avoid any biased habituation effect.

Example 8. Statistical analysis

[038] A comparação pareada entre os tratamentos testados foi realizada pela aplicação do teste t-pareado com p<0,05. As análises estatísticas foram executadas com o software BioEstat 5.3 e o Suplemento de ferramentas de Análise VBA do Microsoft Excel Versão 365/2016.[038] The paired comparison between the treatments tested was performed by applying the t-paired test with p<0.05. Statistical analyzes were performed using BioEstat 5.3 software and the Microsoft Excel VBA Analysis Tools Supplement Version 365/2016.

[039] A partir dos exemplos supracitados a investigação apresentou os seguintes resultados:
Exemplo 1. Identificação de compostos eletrofisiologicamente ativos para machos virgens de C. anonella

i.As análises por Cromotagrafia Gasosa acoplada à Eletroantenografia (CG-EAG) do extrato de pinha no estágio maduro de maturação, revelaram que três monoterpenos, mirceno, β-ocimeno e linalol eliciam despolarização em antenas de machos virgens de C. anonella (Figura 1).

[039] From the above-mentioned examples, the investigation presented the following results:
Example 1. Identification of electrophysiologically active compounds for virgin males of C. anonella

i.The analysis by Gas Chromotagraphy coupled to Electroantenography (GC-EAG) of the pineapple extract in the mature stage of maturation, revealed that three monoterpenes, myrcene, β-ocimene and linalool elicit depolarization in the antennae of virgin males of C. anonella (Figure 1).

[040] Compostos voláteis de plantas já foram identificados como mediadores de atração de machos de algumas espécies de mariposas para plantas hospedeiras, tais como: Cydia pomonella, Lobesia boltrana, Hyphantria cunea, entre outras. Em sua grande maioria, os compostos identificados são terpenóides, a saber: β-ocimeno, β-cariofileno, β-farneseno, α-farneseno, (E)-4,8-dimetil-1,3,7-nonatrieno, dentre outros (CORACINI et al., 2003; ARX et al, 2011; TANG et al, 2012).[040] Volatile plant compounds have already been identified as mediators of male attraction of some moth species to host plants, such as: Cydia pomonella, Lobesia boltrana, Hyphantria cunea, among others. Most of the compounds identified are terpenoids, namely: β-ocimene, β-caryophyllene, β-farnesene, α-farnesene, (E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene, among others (CORACINI et al., 2003; ARX et al, 2011; TANG et al, 2012).

[041] Os machos da Lobesia botrana percebem e respondem aos voláteis da planta hospedeira em níveis biologicamente relevantes, indicando que os voláteis da planta hospedeira servem como sinais olfativos que auxiliam os machos desta espécie na busca por lugares onde existe maior probabilidade de encontrar as fêmeas coespecíficas. Dos doze compostos EAD-ativos identificados, quatro eliciaram mudança comportamental em machos de L. botrana, conhecida como a traça da videira. Posteriormente, a resposta comportamental dos machos desta traça a esses quatro compostos, testados individualmente e em misturas (1-hexanol, 1-octen-3-ol, (Z) -3-hexenil acetato e (E)-β-cariofileno) foi comprovada em túnel de vento (ARX et al., 2011).[041] Males of Lobesia botrana perceive and respond to host plant volatiles at biologically relevant levels, indicating that host plant volatiles serve as olfactory signals that assist males of this species in searching for places where they are more likely to find females. conspecific. Of the twelve EAD-active compounds identified, four elicited behavioral change in males of L. botrana, known as the vine moth. Subsequently, the behavioral response of males of this moth to these four compounds, tested individually and in mixtures (1-hexanol, 1-octen-3-ol, (Z)-3-hexenyl acetate and (E)-β-caryophyllene) was proven in a wind tunnel (ARX et al., 2011).

[042] Bäckman et al. (2001) e Bengtsson et al. (2001) relataram a resposta antenal da mariposa Cydia pomonella aos voláteis de frutos de maça. As antenas de fêmeas de C. pomanella responderam fortemente ao 4,8-dimetil-1,3-(E),7-nonatrieno, linalol, β-cariofileno, (E)-β-farneseno, germacreno D, (Z,E)-α-farneseno, (E,E)-α-farneseno, (Z)-3-hexenol e salicilato de metila. Coracini e colaboradores (2004) testaram, em túnel de vento e em campo, os compostos que desencadearam resposta antenal em fêmeas de C. pomonella. Em campo, o composto (E)-β-farneseno eliciou maior atratividade e captura em machos de C. pomonella, em armadilhas iscadas. Entretanto, a adição de outros voláteis da maçã, incluindo (E, E)-α-farneseno, linalol ou (E,E)-farnesol ao (E)-β-farneseno, não aumentou significativamente a captura de machos nas armadilhas. Em túnel de vento, os autores observaram atração de machos para o (E, E)-farnesol e nenhuma resposta para o (E)-β-farneseno. Todavia, a adição de (E, E)-α-farneseno ao (E)-β-farneseno eliciou atração em machos, demonstrando sinergismo entre os dois componentes.[042] Backman et al. (2001) and Bengtsson et al. (2001) reported the antennal response of the moth Cydia pomonella to apple fruit volatiles. C. pomanella female antennae responded strongly to 4,8-dimethyl-1,3-(E),7-nonatriene, linalool, β-caryophyllene, (E)-β-farnesene, germacrene D, (Z,E )-α-farnesene, (E,E)-α-farnesene, (Z)-3-hexenol and methyl salicylate. Coracini et al. (2004) tested, in a wind tunnel and in the field, the compounds that triggered an antennal response in females of C. pomonella. In the field, the compound (E)-β-farnesene elicited greater attractiveness and capture in C. pomonella males in baited traps. However, the addition of other apple volatiles, including (E, E)-α-farnesene, linalool or (E,E)-farnesol to (E)-β-farnesene, did not significantly increase male capture in traps. In the wind tunnel, the authors observed male attraction to (E, E)-farnesol and no response to (E)-β-farnesene. However, the addition of (E, E)-α-farnesene to (E)-β-farnesene elicited attraction in males, demonstrating synergism between the two components.

DESCRIPTION OF THE FIGURES

[043] Figura 1. Identificação dos compostos, presentes no extrato de pinha no estágio maduro de maturação, que eliciaram despolarização em antenas de machos virgens de C. anonella.[043] Figure 1. Identification of compounds, present in the extract of custard apple in the mature stage of maturation, that elicited depolarization in antennae of virgin males of C. anonella.

[044] Nota: FID: Detector de Ionização de chamas; EAG: Eletroantenografia; (1) – Mirceno; (2) – β-Ocimeno; (3) – Linalol.[044] Note: FID: Flame Ionization Detector; EAG: Electroantenography; (1) – Myrcene; (2) – β-Ocymene; (3) – Linalool.

[045] Figura 2. Atratividade de machos virgens de C. anonella para as formulações de misturas (dose de 0,1ng) frente ao extrato de pinha.[045] Figure 2. Attractiveness of virgin males of C. anonella for the formulations of mixtures (0.1ng dose) against the pinecone extract.

[046] Nota: Mistura 1 (Mirceno, β-Ocimeno, Linalol), Mistura 2 (Mirceno, β-Ocimeno), Mistura 3 (Mirceno, Linalol), Mistura 4 (β-Ocimeno, Linalol). ns – indica ausência de diferença estatística significativa pelo Teste T- pareado (p<0.05).[046] Note: Mixture 1 (Myrcene, β-Ocymene, Linalool), Mixture 2 (Myrcene, β-Ocymene), Mixture 3 (Myrcene, Linalool), Mixture 4 (β-Ocymene, Linalool). ns – indicates the absence of statistically significant difference by the paired T-test (p<0.05).

Example 2. Attractiveness of virgin males of C. anonella to mixtures of EAG-active compounds.

[047] As sensilas presentes nas antenas dos insetos, permitem o reconhecimento de combinações específicas de voláteis, sendo assim, as misturas de constituintes voláteis exercem um papel primordial na identificação dos odores por parte dos insetos. Os machos da mariposa oriental (Grapholita molesta), por exemplo, são atraídos para uma mistura ternária composta por acetato de (Z)-3-hexenila, βocimeno e (E)-β-farneseno. Quando esses compostos foram testados individualmente não eliciaram a mesma resposta atrativa observada para a mistura ternária (BEYAERT et al., 2009; IL’ICHEV et al, 2009).[047] The sensilla present in the antennae of insects, allow the recognition of specific combinations of volatiles, thus, mixtures of volatile constituents play a key role in the identification of odors by insects. Males of the eastern moth (Grapholita molesta), for example, are attracted to a ternary mixture composed of (Z)-3-hexenyl acetate, βocymene and (E)-β-farnesene. When these compounds were tested individually, they did not elicit the same attractive response observed for the ternary mixture (BEYAERT et al., 2009; IL'ICHEV et al, 2009).

[048] Baseado nessa evidência, as misturas 1, 2, 3 e 4 foram preparadas para verificar se os componentes individuais que eliciaram atração em machos virgens de C. anonella contribuem para potencializar a resposta de atração dos machos para as misturas. Os resultados obtidos demonstraram que os machos foram atraídos para todas as misturas testadas, nos experimentos de dupla escolha e, em todos os casos, não foi constatada diferença significativa quando comparados com o extrato do fruto de pinha.[048] Based on this evidence, mixtures 1, 2, 3 and 4 were prepared to verify if the individual components that elicited attraction in virgin males of C. anonella contribute to potentiate the male attraction response to the mixtures. The results obtained showed that males were attracted to all mixtures tested, in the double-choice experiments and, in all cases, no significant difference was found when compared with the extract of the custard apple.

PATENT ADVANTAGES

[049] Uma das técnicas aplicadas para proteger frutos de pinha e graviola contra o ataque de insetos-praga é o ensacamento dos frutos com diferentes materiais. Esta é uma técnica cultural e considerada uma das práticas mais antigas e, apesar do surgimento dos inseticidas e da redução da mão de obra familiar, esta técnica tem sido mais empregada pela exigência do mercado por alimentos com níveis reduzidos ou isentos de agrotóxicos. Outra técnica é o controle químico. Este não é tão eficiente quando a larva de C. anonella já se encontra instalada no fruto. Esta técnica vem sendo realizada de forma preventiva, desde o momento em que são observados os primeiros sinais de ataque até a maturação dos frutos. Entretanto, o uso de pesticidas tende a ser reduzido cada vez mais devido ao impacto que os mesmos causam ao meio ambiente (ALVARENGA et al., 2009; BRITO, 2010; OLIVEIRA et al., 2004).[049] One of the techniques applied to protect pine cone and soursop fruits against the attack of insect pests is the bagging of the fruits with different materials. This is a cultural technique and considered one of the oldest practices and, despite the emergence of insecticides and the reduction of family labor, this technique has been more used by the market demand for foods with reduced levels or free of pesticides. Another technique is chemical control. This is not as efficient when the larva of C. anonella is already installed in the fruit. This technique has been carried out in a preventive way, from the moment the first signs of attack are observed until the maturation of the fruits. However, the use of pesticides tends to be reduced more and more due to the impact they have on the environment (ALVARENGA et al., 2009; BRITO, 2010; OLIVEIRA et al., 2004).

[050] Em face da inviabilidade dos métodos empregados atualmente no controle da broca-do-fruto, surge, então, a necessidade da utilização de outro meio de controle com o objetivo de manter as pragas abaixo do nível de dano econômico e que funcione de forma harmoniosa com o meio ambiente e com o homem. O controle por comportamento ou controle comportamental é um método diferenciado, baseado na comunicação química entre insetos e plantas hospedeiras. O princípio é inteiramente ecológico, pois são substâncias produzidas e utilizadas pelo próprio inseto e dessa forma agem especificamente sem interferir em organismos não alvos. A identificação dos compostos atrativos para machos de C. anonella surge como uma nova possibilidade para uso no controle por comportamento da praga em estudo, podendo servir, como mais um método para ser agregado ao Manejo Integrado de Pragas (MIP), principalmente para diminuir o número de acasalamentos, pela interferência ou impedimento da transmissão de sinais entre os parceiros sexuais em uma técnica conhecida como mating disruption (THOMAZINI, 2009).[050] In view of the unfeasibility of the methods currently used to control the fruit borer, there is a need to use another means of control with the objective of keeping the pests below the level of economic damage and that works in a harmoniously with the environment and with man. Behavioral control or behavioral control is a differentiated method, based on chemical communication between insects and host plants. The principle is entirely ecological, as they are substances produced and used by the insect itself and thus act specifically without interfering with non-target organisms. The identification of attractive compounds for males of C. anonella emerges as a new possibility for use in the behavioral control of the pest under study, which may serve as another method to be added to the Integrated Pest Management (IPM), mainly to reduce the number of matings, by interfering with or preventing the transmission of signals between sexual partners in a technique known as mating disruption (THOMAZINI, 2009).

REFERENCES

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Claims

Attractive formulations with kairomonal activity for virgin males of C. anonella characterized by comprising components identified in the pine cone extract at the mature stage of maturation, in the case of the following mixtures of these components: mixture 1 (myrcene, β-ocimene and linalool) mixture 2 (myrcene and β-ocimene), mixture 3 (myrcene and linalool) and mixture 4 (β-ocimene and linalool).