BR102020009664A2 - MICROEMULSION CONTAINING CURCUMIN FOR APPLICATION IN INTRAORAL PHOTODYNAMIC THERAPY FOR DENTAL PURPOSES - Google Patents
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Abstract
microemulsão contendo curcumina para aplicação em terapia fotodinâmica intraoral com fins odontológicos. na presente invenção a curcumina e/ou curcuminoides foram veiculados em diferentes concentrações (30-150 µg.ml-1) a partir de um sistema microemulsionado do tipo óleo em água, dispersível em água, para aplicação em terapia fotodinâmica intraoral com fins odontológicos. o produto resultante foi denominado de enxaguatório oral e contém o tensoativo polissobrato 80, o co-tensoativo polietilenoglicol 400 e a fase oleosa com óleo de linhaça. o sorbitol foi usado como edulcorante. a caracterização físico-química do formulado mostrou diâmetro em escala nanométrica das gotículas (13-17 nm) e potencial zeta igual a -8 mv, com solubilização completa da curcumina e/ou curcuminoides e fácil espalhamento na cavidade oral. a eficácia terapêutica do formulado foi determinada em experimento in vitro usando aparelho de fotossensibilização (led) com emissão a 450 nm, demonstrando a atividade antimocrobiana sobre biofilmes de candida albicans (atcc 90029), staphylococcus aureus meticilino resistente (atcc 33591) e escherichia coli (atcc 25922). por tratar-se de uma formulação de microemulsão, contendo compostos considerados seguros para saúde humana em baixas concentrações, a via de administração pode ser tópica na mucosa oral. o preparado foi estável após 60 dias de armazenamento a temperatura de 40 °c, com redução de teor de curcumina e/ou curcuminoides inferior a 5% daquele determinado inicialmente após a manipulação.microemulsion containing curcumin for application in intraoral photodynamic therapy for dental purposes. In the present invention, curcumin and/or curcuminoids were delivered in different concentrations (30-150 µg.ml-1) from an oil-in-water microemulsified system, dispersible in water, for application in intraoral photodynamic therapy for dental purposes. the resulting product was called oral rinse and contains the surfactant polysobrate 80, the co-surfactant polyethylene glycol 400 and the oily phase with linseed oil. sorbitol was used as a sweetener. the physicochemical characterization of the formula showed a nanometer-scale diameter of the droplets (13-17 nm) and zeta potential equal to -8 mv, with complete solubilization of curcumin and/or curcuminoids and easy spreading in the oral cavity. The therapeutic efficacy of the formula was determined in an in vitro experiment using a photosensitization device (LED) with emission at 450 nm, demonstrating antimicrobial activity on biofilms of candida albicans (atcc 90029), methicillin-resistant staphylococcus aureus (atcc 33591) and escherichia coli ( atcc 25922). As it is a microemulsion formulation, containing compounds considered safe for human health in low concentrations, the administration route can be topical on the oral mucosa. the preparation was stable after 60 days of storage at a temperature of 40 °C, with a reduction in curcumin and/or curcuminoids content of less than 5% of that initially determined after manipulation.
Description
[1] . O presente pedido de patente de invenção trata de um sistema microemulsionado para uso oral, contendo curcumina e/ou curcuminoides para aplicação em terapia fotodinâmica intraoral com fins odontológicos. [1] . The present patent application deals with a microemulsified system for oral use, containing curcumin and/or curcuminoids for application in intraoral photodynamic therapy for dental purposes.
[2] . A presente invenção envolve a produção de um sistema microemulsionado contendo curcumina e/ou curcuminoides, seu método de obtenção e a sua atividade antimicrobiana sobre biofilmes de Candida albicans (ATCC 90029), Staphylococcus aureus meticilino resistente (ATCC 33591) e Escherichia coli (ATCC 25922). [two] . The present invention involves the production of a microemulsified system containing curcumin and/or curcuminoids, its method of obtaining and its antimicrobial activity on biofilms of Candida albicans (ATCC 90029), methicillin resistant Staphylococcus aureus (ATCC 33591) and Escherichia coli (ATCC 25922 ).
[3] . A curcumina é um componente dos rizomas de Curcuma longa e está comercialmente disponível como uma mistura de três compostos: curcumina, desmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina. A atividade anti-inflamatória, antimicrobiana, cicatrizante e digestiva da curcumina é conhecida, bem como sua aplicação como agente fotossensibilizante, ativado pela luz azul em terapia fotodinâmica. [3]. Curcumin is a component of the Curcuma longa rhizomes and is commercially available as a mixture of three compounds: curcumin, desmethoxycurcumin and bisdesmethoxycurcumin. The anti-inflammatory, antimicrobial, healing and digestive activity of curcumin is known, as well as its application as a photosensitizing agent, activated by blue light in photodynamic therapy.
[4] . Doenças orais comuns como cáries, gengivites e doenças periodontais estão relacionadas à colonização bacteriana na superfície dental. Algumas bactérias podem formar biofilmes na cavidade oral. Os biofilmes são caracterizados como estruturas em que as células estão ligadas por uma matriz extracelular polimérica com elevado grau de organização, incluindo estruturação física e coordenação metabólica. A formação dos biofilmes favorece a proliferação microbiana e se agrava em más condições de higiene oral, dificultando os tratamentos odontológicos. O uso de enxaguatórios orais contendo agentes antimicrobianos é uma estratégia para reduzir a formação de placas bacterianas. [4]. Common oral diseases such as caries, gingivitis and periodontal diseases are related to bacterial colonization on the tooth surface. Some bacteria can form biofilms in the oral cavity. Biofilms are characterized as structures in which cells are linked by a polymeric extracellular matrix with a high degree of organization, including physical structuring and metabolic coordination. The formation of biofilms favors microbial proliferation and worsens in poor oral hygiene conditions, making dental treatments difficult. The use of mouthwashes containing antimicrobial agents is a strategy to reduce the formation of bacterial plaques.
[5] . A terapia fotodinâmica aplicada na área de saúde é baseada em reações fotoquímicas usando corantes fotossensibilizadores como a curcumina. O corante fotossensibilizante é irradiado com luz ultravioleta ou luz visível em faixas espectrais selecionadas, havendo absorção de fótons com passagem do estado fundamental (So) para o estado excitado singlete (S1). O estado S1 apresenta tendência a retornar ao estado So, e neste processo pode ocorrer a interconversão e cruzamento inter-sistemas, havendo inversão espontânea do spin do elétron excitado. A partir disso, a molécula do corante pode passar do estado S1 para o estado excitado triplete (T1), que apresenta tempo de vida mais longo que o estado S1. Os processos responsáveis pelos efeitos fototerapêuticos são decorrentes da molécula no estado T1 poder transferir sua energia para outras moléculas ou iniciar diretamente a reação a partir do seu estado excitado. [5]. Photodynamic therapy applied in healthcare is based on photochemical reactions using photosensitizing dyes such as curcumin. The photosensitizing dye is irradiated with ultraviolet light or visible light in selected spectral ranges, with photon absorption with passage from the ground state (So) to the singlet excited state (S1). The S1 state tends to return to the So state, and in this process, inter-system interconversion and crossing can occur, with spontaneous inversion of the excited electron spin. From then on, the dye molecule can go from the S1 state to the triplet excited state (T1), which has a longer lifetime than the S1 state. The processes responsible for phototherapeutic effects result from the molecule in the T1 state being able to transfer its energy to other molecules or directly initiating the reaction from its excited state.
[6] . O conceito de morte não tóxica das células microbianas é oriundo da terapia fotodinâmica envolvendo os mecanismos fotoquímicos dos tipos I e II, em que são formadas as espécies reativas de oxigênio (EROs). Estes processos podem ocorrer simultaneamente e as EROs formadas podem induzir reações em cadeia com componentes celulares como os ácidos nucleicos, proteínas e fosfolipídeos, levando à morte celular. No mecanismo tipo I, o corante no estado S1 ou T1 gera EROs a partir de reações de oxirredução com compostos orgânicos, formando ânions peróxido, superóxido e radical hidroxila. No mecanismo tipo II, a molécula no estado T1 transfere energia para o oxigênio molecular no estado fundamental triplete (3O2), que passa para o estado excitado singlete (1O2). [6] . The concept of non-toxic microbial cell death comes from photodynamic therapy involving photochemical mechanisms of types I and II, in which reactive oxygen species (ROS) are formed. These processes can occur simultaneously and the formed ROS can induce chain reactions with cellular components such as nucleic acids, proteins and phospholipids, leading to cell death. In the type I mechanism, the dye in the S1 or T1 state generates ROS from redox reactions with organic compounds, forming peroxide, superoxide and hydroxyl radical anions. In the type II mechanism, the molecule in the T1 state transfers energy to molecular oxygen in the triplet ground state (3O2), which passes to the singlet excited state (1O2).
[7] . A aplicação da curcumina como corante em terapia fotodinâmica intraoral pode ser limitada pela sua estabilidade química e baixa solubilidade em fluidos aquosos, sendo difícil sua incorporação em preparações farmacêuticas na forma solúvel. Para isso, é necessário pesquisar formulações destinadas a aplicação na cavidade oral que permitam incorporar a curcumina na forma solúvel ao mesmo tempo que assegurem a estabilidade química do corante. O preparado a ser delineado deve ser um produto de simples manipulação e de preferência formulado usando componentes de baixo custo e seguros para aplicação na mucosa oral. [7] . The application of curcumin as a dye in intraoral photodynamic therapy may be limited by its chemical stability and low solubility in aqueous fluids, making its incorporation into pharmaceutical preparations in soluble form difficult. For this, it is necessary to research formulations intended for application in the oral cavity that allow the incorporation of curcumin in its soluble form while ensuring the chemical stability of the dye. The preparation to be outlined must be a product that is simple to handle and preferably formulated using inexpensive and safe components for application to the oral mucosa.
[8] . O uso de sistemas estabilizados por tensoativos (por exemplo os sistemas micelares e/ou microemulsões) apresenta resultados promissores para solubilização de compostos bioativos de baixa solubilidade em água. Os sistemas micelares são formados unicamente por água e tensoativo acima da sua concentração micelar crítica. Os tensoativos espontaneamente se autoagregam no meio aquoso formando as micelas que possuem um núcleo hidrofóbico que é um meio para solubilização de compostos de baixa solubilidade em água. As microemulsões são sistemas termodinamicamente estáveis, sendo formadas espontaneamente após a mistura de óleo, água e tensoativo, podendo ainda incluir co-tensoativos. Os sistemas óleo em água estabilizados por tensoativos são amplamente utilizados, obtendo formulações facilmente dispersíveis em fluidos aquosos. Apresentam-se como sistemas coloidais isotrópicos, ou seja, são opticamente transparentes. As gotículas dispersas das microemulsões possuem diâmetro hidrodinâmico com dimensões variáveis de 10 a 100 nm. As microemulsões também são caracterizadas pela sua baixa viscosidade, o que pode contribuir para o desenvolvimento de formulações fluidas, como enxaguatórios orais de fácil aplicação e espalhamento na mucosa oral. Ao contrário das microemulsões, as emulsões convencionais ou macroscópicas são opticamente turvas com aspecto leitoso, com glóbulos de fase dispersa geralmente maiores que 400 nm. Além disso, as emulsões macroscópicas são sistemas termodinamicamente instáveis e dependem da agitação mecânica e aquecimento dos componentes para sua formação e estabilização. [8]. The use of systems stabilized by surfactants (eg micellar and/or microemulsion systems) presents promising results for the solubilization of bioactive compounds with low solubility in water. Micellar systems are formed solely by water and surfactant above its critical micellar concentration. Surfactants spontaneously self-aggregate in the aqueous medium forming micelles that have a hydrophobic core which is a means for solubilizing compounds with low solubility in water. Microemulsions are thermodynamically stable systems, being formed spontaneously after mixing oil, water and surfactant, and may also include co-surfactants. Oil-in-water systems stabilized by surfactants are widely used, obtaining formulations that are easily dispersible in aqueous fluids. They present themselves as isotropic colloidal systems, that is, they are optically transparent. The dispersed droplets of microemulsions have a hydrodynamic diameter with dimensions varying from 10 to 100 nm. Microemulsions are also characterized by their low viscosity, which can contribute to the development of fluid formulations, such as easy-to-apply mouthwashes and spread on the oral mucosa. Unlike microemulsions, conventional or macroscopic emulsions are optically cloudy with a milky appearance, with dispersed phase globules generally larger than 400 nm. Furthermore, macroscopic emulsions are thermodynamically unstable systems and depend on mechanical agitation and heating of the components for their formation and stabilization.
[9] . Vários componentes podem ser usados para obtenção de microemulsões, sendo que a seleção do sistema tensoativo é um fator decisivo ao considerar a via de administração pretendida. No caso de formulações aplicadas na mucosa oral, os tensoativos não iônicos, como os ésteres de sorbitano polietoxilados, tal como o polissorbato 80, são interessantes devido à sua baixa toxicidade. O polissorbato 80 pode formar filmes de tensoativo com alto teor de água adsorvida promovendo a estabilização das gotículas da fase dispersa por um mecanismo estérico, visto que em muitos casos a estabilização promovida por tensoativos iônicos, que possuem geralmente maior toxicidade, envolve a modificação do potencial zeta do sistema e, consequentemente, fenômenos de repulsão eletrostática entre os glóbulos da fase oleosa. [9] . Several components can be used to obtain microemulsions, and the selection of the surfactant system is a decisive factor when considering the intended route of administration. In the case of formulations applied to the oral mucosa, nonionic surfactants, such as polyethoxylated sorbitan esters, such as polysorbate 80, are interesting due to their low toxicity. Polysorbate 80 can form surfactant films with a high adsorbed water content, promoting the stabilization of dispersed phase droplets by a steric mechanism, since in many cases the stabilization promoted by ionic surfactants, which generally have greater toxicity, involves the modification of the potential zeta of the system and, consequently, phenomena of electrostatic repulsion between the oil phase globules.
[10] . As microemulsões com reduzido teor de fase oleosa podem encapsular moléculas de baixa solubilidade em água, que passam a ser encapsuladas na forma solúvel nos glóbulos de fase oleosa dispersa. Devido às características hidrofóbicas da curcumina, é esperado que o ativo se mantenha solúvel no filme tensoativo ou nos glóbulos da fase dispersa, estando solúvel de maneira minoritária na fase dispersante aquosa. Ainda mais, a curcumina apresenta menor estabilidade química em meio aquoso, podendo sofrer degradação por hidrólise ou oxidação, enquanto que a sua encapsulação nos glóbulos de fase oleosa pode garantir uma maior estabilidade química. [10] . Microemulsions with reduced oil phase content can encapsulate molecules with low water solubility, which are then encapsulated in the soluble form in the dispersed oil phase globules. Due to the hydrophobic characteristics of curcumin, it is expected that the active remains soluble in the surface-active film or in the globules of the dispersed phase, being less soluble in the aqueous dispersant phase. Furthermore, curcumin is less chemically stable in an aqueous medium and can be degraded by hydrolysis or oxidation, while its encapsulation in the oil phase globules can ensure greater chemical stability.
[11] . A patente PI 1102594-8 A2 descreve soluções aquosas ou contendo solventes orgânicos para solubilização da curcumina e sua aplicação em terapia fotodinâmica intraoral. A patente BR 11 2015 014654 6 A2 descreve a incorporação da curcumina em sistemas micelares contendo tensoativos como polissorbato 80 ou polissorbato 20. A patente BR 10 2015 022081 2 A2 descreve uma formulação baseada em emulsão água em óleo incorporada em um gel hidrofílico e contendo curcumina a ser aplicada no tratamento de onicomicose usando terapia fotodinâmica. Algumas patentes depositadas no Brasil, tais como: BR 10 2017 011715 4 A2, BR 11 2018 011511 8, BR 10 2016 027560 1 A2, BR 10 2016 024495 1 A2, BR 10 2016 015631 9 A2, PI 0915239-3 A2, PI 0621872-5 A2, descrevem métodos, bem como compostos e composições contendo curcumina. Internacionalmente, a patente depositada AR079564 A1 descreve um exaguatório oral (do tipo solução hidroalcoólica contendo tensoativo e outros co-solventes como glicerina), um gel dental e uma pasta de dentes contendo agentes fotossensibilizantes diversos, incluindo a curcumina, para terapia fotodinâmica intraoral. Algumas patentes depositadas internacionalmente, tais como CN108991513 A, WO2019105792 A1, CN106619588 A, IN3800MU2013 A, CN102899924 A, CN102641237 A, CN102266287 A, CN101869692 A, descrevem métodos, bem como compostos e composições de microemulsões contendo curcumina para aplicações diversas, sem incluir a terapia fotodinâmica intraoral. [11] . Patent PI 1102594-8 A2 describes aqueous solutions or containing organic solvents for curcumin solubilization and its application in intraoral photodynamic therapy. Patent BR 11 2015 014654 6 A2 describes the incorporation of curcumin in micellar systems containing surfactants such as polysorbate 80 or
[12] . O objetivo da presente invenção é obter sistemas microemulsionados estabilizados por tensoativos não-iônicos contendo o agente fotossensibilizante curcumina e/ou curcuminoides na forma solúvel, assegurando a estabilidade química e física por pelo menos 60 dias após a preparação. A invenção prevê uma formulação de enxaguatório oral com atividade antimicrobiana a ser utilizada diretamente como produto final, ou podendo ser diluída usando água, destinado a aplicação em terapia fotodinâmica intraoral com fins odontológicos. [12] . The aim of the present invention is to obtain microemulsified systems stabilized by non-ionic surfactants containing the photosensitizing agent curcumin and/or curcuminoids in soluble form, ensuring chemical and physical stability for at least 60 days after preparation. The invention foresees an oral mouthwash formulation with antimicrobial activity to be used directly as a final product, or which can be diluted using water, intended for application in intraoral photodynamic therapy for dental purposes.
[13] . Exemplo 1 - Solubilidade da curcumina [13] . Example 1 - Solubility of curcumin
[14] . A solubilidade da curcumina (10 mg; [1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1,6-heptadieno-3,5-diona] - 65% de curcumina e 35% de outros curcuminoides) nos solventes (12 mL) azeite de oliva, óleo de rícino, óleo de abacate, óleo de macadâmia, óleo de linhaça, propilenoglicol e polietilenoglicol 400 (PEG 400) foi avaliada a 25 °C. As amostras foram levadas ao banho ultrassônico por 2 horas, e posteriormente embaladas em papel alumínio para proteção contra a luz e deixadas em repouso por 24h. Após este tempo, as amostras foram visualmente analisadas quanto à precipitação da curcumina e aspecto túrbido ou translúcido. Os solventes PEG 400, propilenoglicol, óleo de linhaça e óleo de rícino apresentaram solubilização completa da curcumina, formando soluções límpidas e translúcidas. [14] . The solubility of curcumin (10 mg; [1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione] - 65% of curcumin and 35% of other curcuminoids) in solvents (12 mL) olive oil, castor oil, avocado oil, macadamia oil, linseed oil, propylene glycol and polyethylene glycol 400 (PEG 400) was evaluated at 25 °C. The samples were taken to an ultrasonic bath for 2 hours, and then wrapped in aluminum foil for protection against light and left to rest for 24 hours. After this time, the samples were visually analyzed for curcumin precipitation and turbid or translucent appearance. The solvents PEG 400, propylene glycol, linseed oil and castor oil showed complete solubilization of curcumin, forming clear and translucent solutions.
[15] . Exemplo 2 - Obtenção da microemulsão [15] . Example 2 - Obtaining the microemulsion
[16] . As proporções de fase, fase aquosa, tensoativo e co-tensoativos foram selecionadas após construção de diagrama de fases pseudoternário por método titulométrico. Os componentes usados foram polissorbato 80 (tensoativo), água, polietilenoglicol 400 e sorbitol 70% na proporção 6:3:1 m/m (fase aquosa contendo co-tensoativo) e óleo de linhaça (fase oleosa). A partir do diagrama de fases pseudoternário, selecionou-se um ponto para caracterização do sistema microemulsionado concentrado, com a seguinte composição: 25 % de polissorbato 80, 72,5 % de água, polietilenoglicol 400 e sorbitol 70% e 2,5 % de óleo de linhaça. [16] . The phase, aqueous phase, surfactant and co-surfactant proportions were selected after construction of a pseudoternary phase diagram by the titrimetric method. The components used were polysorbate 80 (surfactant), water, polyethylene glycol 400 and sorbitol 70% in the proportion 6:3:1 m/m (aqueous phase containing co-surfactant) and linseed oil (oily phase). From the pseudoternary phase diagram, a point was selected to characterize the concentrated microemulsified system, with the following composition: 25% polysorbate 80, 72.5% water, polyethylene glycol 400 and 70% sorbitol and 2.5% linseed oil.
[17] . O tamanho médio das gotículas foi obtido por medidas de espalhamento dinâmico de luz. A microemulsão concentrada apresentou diâmetro hidrodinâmico de gotícula com tamanho médio de 94 nm, e índice de polidispersão 0,487. [17] . The average droplet size was obtained by dynamic light scattering measurements. The concentrated microemulsion had a hydrodynamic droplet diameter with an average size of 94 nm, and a polydispersion index of 0.487.
[18] . Exemplo 3 - Diluição da microemulsão concentrada [18] . Example 3 - Dilution of concentrated microemulsion
[19] . A diluição da microemulsão concentrada para formulação de enxaguatório microemulsionado foi realizada em água ultrapurificada na proporção de 1:5 v/v. [19] . The dilution of the concentrated microemulsion for the formulation of a microemulsified mouthwash was carried out in ultra-purified water at a ratio of 1:5 v/v.
[20] . Exemplo 4 - Incorporação da curcumina no enxaguatório microemulsionado [20] . Example 4 - Incorporation of curcumin into the microemulsified mouthwash
[21] . A curcumina foi incorporada na forma solúvel na formulação nas concentrações de 30, 60 e 150 μg/mL. Os parâmetros físico-químicos se encontram na tabela 1. [21] . Curcumin was incorporated in soluble form in the formulation at concentrations of 30, 60 and 150 μg/mL. The physicochemical parameters are shown in table 1.
[22]. Tabela 1 - Caracterização física das formulações de enxaguatório oral (n=3). nm, nanômetro; PDI, índice de polidispersividade; DP: Desvio padrão [22]. Table 1 - Physical characterization of mouthwash formulations (n=3). nm, nanometer; PDI, polydispersity index; SD: Standard deviation
[23] . Exemplo 5 - Estabilidade física e química do enxaguatório microemulsionado contendo curcumina [23] . Example 5 - Physical and chemical stability of microemulsified mouthwash containing curcumin
[24] . A estabilidade física e química do preparado foi avaliada imediatamente após o preparo e nos intervalos de tempo de 15, 30 e 60 dias após armazenamento a 40 °C em estufa acondicionado em frasco de polipropileno com tampa. As características organolépticas e sensoriais do preparado mantiveram-se inalteradas dentro deste intervalo de tempo, com o preparado apresentando fluidez e aspecto translúcido, o que é um atributo requerido para sua aplicação como enxaguatório oral aplicado em terapia fotodinâmica intraoral. Os ensaios realizados foram determinação do teor de curcumina usando espectrofotometria no ultravioleta-visível a 430 nm, determinação do tamanho de gotícula usando espalhamento de luz dinâmico, medidas de potencial zeta, e determinação do pH. Os resultados indicados na Tabela 2 demonstram que os parâmetros determinados apresentaram pequenas variações, que não foram consideradas indicativas de instabilidade da formulação. [24] . The physical and chemical stability of the preparation was evaluated immediately after preparation and at time intervals of 15, 30 and 60 days after storage at 40 °C in an oven placed in a polypropylene bottle with a lid. The organoleptic and sensory characteristics of the preparation remained unaltered within this period of time, with the preparation presenting fluidity and translucent appearance, which is a required attribute for its application as an oral rinse applied in intraoral photodynamic therapy. The tests performed were determination of curcumin content using ultraviolet-visible spectrophotometry at 430 nm, determination of droplet size using dynamic light scattering, measurements of zeta potential, and determination of pH. The results shown in Table 2 demonstrate that the parameters determined presented small variations, which were not considered indicative of formulation instability.
[25]. Tabela 2. Estudo da estabilidade e química. ND, não determinado; DP, desvio padrão; PDI, índice de polidispersividade [25]. Table 2. Stability and chemistry study. ND, not determined; SD, standard deviation; PDI, polydispersity index
[26]. A avaliação do perfil reológico usando reômetro para determinação da viscosidade determinou que a tensão de cisalhamento foi diretamente proporcional a taxa de cisalhamento (r>0,999). Os coeficientes de viscosidade dinâmicos foram de 1,64 ± 0,01 cP no tempo inicial e 1,70 ± 0,01 cP após 60 dias de armazenamento a 40 °C, caracterizando a fluidez do preparado, que se apresentou como fluido newtoniano, sem alteração deste comportamento após o armazenamento a 40 °C. [26]. The evaluation of the rheological profile using a rheometer for viscosity determination determined that the shear stress was directly proportional to the shear rate (r>0.999). The dynamic viscosity coefficients were 1.64 ± 0.01 cP in the initial time and 1.70 ± 0.01 cP after 60 days of storage at 40 °C, characterizing the fluidity of the preparation, which was presented as a Newtonian fluid, no change in this behavior after storage at 40 °C.
[27] . Exemplo 6 - Atividade antimicrobiana [27] . Example 6 - Antimicrobial activity
[28] . Grupos experimentais [28] . experimental groups
[29] . Foram utilizados como corpos-de-prova 270 stops de silicone de utilização odontológica, medindo 1,5 mm de diâmetro e 1 mm de altura, que foram esterilizados e armazenados. Para a realização do experimento, cada grupo foi constituído por 10 corpos de prova divididos de acordo com o microrganismo a ser testado, tipo e concentração do fotossensibilizante além de diferentes tempos de irradiação. Os grupos experimentais foram: controle sem nenhum tratamento (L-C-); somente corante FS (L-C+); somente luz a 430 nm em tempos de irradiação definidos (L+C-) e grupos usando luz a 430 nm e o enxaguatório oral contendo curcumina em diferentes concentrações (L+C+). Os preparados L-C+ e L+C+ foram filtrados através de filtros de membrana com poros de 0,22 μm e armazenadas em condições adequadas até a realização dos ensaios. [29] . 270 stops of silicone for dental use were used as specimens, measuring 1.5 mm in diameter and 1 mm in height, which were sterilized and stored. To carry out the experiment, each group consisted of 10 specimens divided according to the microorganism to be tested, type and concentration of the photosensitizer, in addition to different irradiation times. The experimental groups were: control without any treatment (L-C-); FS dye only (L-C+); only light at 430 nm at defined irradiation times (L+C-) and groups using light at 430 nm and the oral rinse containing curcumin at different concentrations (L+C+). The L-C+ and L+C+ preparations were filtered through membrane filters with 0.22 µm pores and stored under appropriate conditions until the tests were carried out.
[30] . Formação dos biofilmes [30] . Biofilm formation
[31] . Para a formação dos biofilmes monoespécies usados experimentalmente, foi realizada primeiramente a ativação das espécies bacterianas Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus aureus meticilino resistente (ATCC 33591) em caldo Brain Heart Infusion - BHI incubado por 24 horas a 35° + 2° C usando estufa B.O.D (Demanda Bioquímica do Oxigênio-SPlabor). A ativação de Candida albicans (ATCC 90029) foi realizada em caldo Sabouraud dextrose usando os mesmos padrões de incubação descritos anteriormente. Após a ativação, alíquotas de 100 μL do caldo de crescimento foram semeadas em placas de Petri contendo ágar BHI para Escherichia coli e Staphylococcus aureus meticilino resistente ou ágar Saboraud para cultivo de Candida albicans. As placas foram incubadas por 24 horas a 35° ± 2° C em estufa B.O.D. [31] . For the formation of experimentally used monospecies biofilms, activation of the bacterial species Escherichia coli (ATCC 25922) and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (ATCC 33591) was performed first in Brain Heart Infusion - BHI broth incubated for 24 hours at 35° + 2°C using BOD oven (Biochemical Oxygen Demand-SPlabor). Activation of Candida albicans (ATCC 90029) was performed in Sabouraud dextrose broth using the same incubation patterns described above. After activation, 100 μL aliquots of the growth broth were seeded onto Petri dishes containing BHI agar for Escherichia coli and methicillin-resistant Staphylococcus aureus or Saboraud agar for Candida albicans cultivation. The plates were incubated for 24 hours at 35° ± 2° C in a B.O.D.
[32] . As culturas de 24h de incubação foram utilizadas para padronização de suspensões contendo 1x106 cél./mL dos microrganismos. As suspensões foram padronizadas em espectrofotômetro, cujos valores de densidade óptica (D.O.) e comprimento de onda (λ) para a quantidade de 1x106 cél./mL foram 0,284 a 530 nm para Candida albicans, 0,324 a 590 nm para Escherichia coli e para 0,374 a 490 nm Staphylococcus aureus meticilino resistente. [32] . The 24-hour incubation cultures were used to standardize suspensions containing 1x106 cells/mL of the microorganisms. The suspensions were standardized in a spectrophotometer, whose optical density (OD) and wavelength (λ) values for the amount of 1x106 cells/mL were 0.284 at 530 nm for Candida albicans, 0.324 at 590 nm for Escherichia coli and for 0.374 at 490 nm methicillin resistant Staphylococcus aureus.
[33] . No interior do fluxo laminar, placas estéreis de cultura de células de 24 poços foram preenchidas contendo 3 mL do meio de cultura previamente usado para cada microrganismo avaliado. Após a contaminação dos poços das placas de cultura de células, foram acrescidos os corpos-de-prova estéreis de silicone para formação dos biofilmes. As placas foram vedadas e incubadas a 35° ± 2° C por 7 dias, e durante o período de incubação as condições de cultivo (umidade e nutrição) foram monitoradas diariamente. [33] . Within the laminar flow, sterile 24-well cell culture plates were filled containing 3 ml of the culture medium previously used for each microorganism evaluated. After the contamination of the cell culture plate wells, the sterile silicone specimens were added to form biofilms. The plates were sealed and incubated at 35° ± 2° C for 7 days, and during the incubation period the culture conditions (humidity and nutrition) were monitored daily.
[34] . Fonte de luz [34] . Light source
[35] . Para a realização dos testes experimentais, utilizou-se o equipamento Biotable® RGB baseado em uma mesa iluminadora de light emitting diodes (LEDs), com emissão dos comprimentos de onda de 430, 530 e 630 nm (azul, verde e vermelho, respectivamente). Os LEDs estão dispostos no equipamento de maneira que cada poço da placa de cultura de células de 24 poços seja iluminado por apenas um dos comprimentos de onda, permitindo produzir iluminação uniforme em toda placa. O sistema possui resfriamento por passagem de água corrente para que o calor gerado seja dissipado. O comprimento de onda utilizado foi 430 nm, com intensidade de 18 mW/cm2. [35] . To carry out the experimental tests, the Biotable® RGB equipment was used based on a light emitting diodes (LEDs) illuminating table, with emission of wavelengths of 430, 530 and 630 nm (blue, green and red, respectively) . The LEDs are arranged in the equipment so that each well of the 24-well cell culture plate is illuminated by only one of the wavelengths, allowing uniform illumination to be produced across the entire plate. The system is cooled by running water so that the heat generated is dissipated. The wavelength used was 430 nm, with an intensity of 18 mW/cm2.
[36] . Condições experimentais [36] . experimental conditions
[37] . Os corpos-de-prova com o crescimento dos biofilmes monoespécies foram lavados e tiveram o excesso de caldo de cultura removidos usando 1 mL de soro fisiológico estéril. Logo após, os corpos-de-prova foram transferidos para poços de placa de cultura de células contendo 1 mL do enxaguatório nas concentrações 30 ou 60 μg.mL-1, para avaliação dos grupos L-C+ e L+C+. Os mesmos foram deixados em repouso em ambiente escuro pelo período de 5 minutos (período de pré-irradiação). Após este tempo, os corpos-de-prova foram transferidos para novos poços vazios e submetidos à irradiação pelos tempos de 10 e 30 minutos (grupos L+C+ e L+C-). Após a irradiação, os corpos de prova foram introduzidos individualmente em tubos de polipropileno estéreis (de 1,5 mL) contendo 1 mL de soro fisiológico estéril e agitados em aparelho agitador de tubos tipo vortex durante 1 minuto para desprendimento do biofilme, obtendo-se uma suspensão inicial. A partir desta, foram realizadas diluições decimais de 10-1, 10-2 e 10-3. A suspensão inicial e as demais diluições foram semeadas em duplicata, em placas de Petri contendo meio de cultura ágar BHI para Escherichia coli e Staphylococcus aureus meticilino resistente ou ágar Saboraud para cultivo de Candida albicans. As placas foram incubadas a 35° ± 2°C durante 24 horas. Após o período de incubação, foi realizada contagem das unidades formadoras de colônias (UFC.mL-1) com o auxílio de um contador de colônias. Nos grupos controle (L-C-), nenhum tratamento foi realizado, sendo que os corpos-de-prova impregnados pelo biofilme foram apenas submetidos a etapa de lavagem e remoção do excesso e introduzidos diretamente nos tubos de polipropileno contendo soro fisiológico estéril. Em seguida, os corpos-de-prova impregnados pelo biofilme foram agitados para obtenção da suspensão inicial e demais diluições, conforme descrito nos demais grupos experimentais. [37] . The specimens with the growth of monospecies biofilms were washed and had the excess of culture broth removed using 1 ml of sterile saline solution. Soon after, the specimens were transferred to cell culture plate wells containing 1 mL of the mouthwash at concentrations of 30 or 60 μg.mL-1, for evaluation of the L-C+ and L+C+ groups. They were left to rest in a dark environment for a period of 5 minutes (pre-irradiation period). After this time, the specimens were transferred to new empty wells and subjected to irradiation for 10 and 30 minutes (groups L+C+ and L+C-). After irradiation, the specimens were individually introduced into sterile polypropylene tubes (1.5 mL) containing 1 mL of sterile saline and shaken in a vortex tube agitator apparatus for 1 minute to detach the biofilm, obtaining an initial suspension. From this, decimal dilutions of 10-1, 10-2 and 10-3 were performed. The initial suspension and the other dilutions were seeded in duplicate in Petri dishes containing BHI agar culture medium for Escherichia coli and methicillin resistant Staphylococcus aureus or Saboraud agar for Candida albicans cultivation. Plates were incubated at 35° ± 2°C for 24 hours. After the incubation period, colony forming units (CFU.mL-1) were counted with the aid of a colony counter. In the control groups (L-C-), no treatment was performed, and the specimens impregnated by the biofilm were only submitted to a washing step and excess removal and introduced directly into polypropylene tubes containing sterile saline solution. Then, the specimens impregnated by the biofilm were shaken to obtain the initial suspension and other dilutions, as described in the other experimental groups.
[38] . Análise estatística [38] . Statistical analysis
[39] . A análise estatística foi realizada a partir da transformação dos dados em UFC.mL-1 para log 10. Em seguida, foi aplicado o teste de normalidade Shapiro-Wilk para verificação da aderência aos pressupostos de normalidade. Verificada a normalidade dos dados, o teste de análise de variância (ANOVA) a 5% com teste de médias de Bonferroni para comparação entre os grupos. [39] . Statistical analysis was performed by transforming the data into CFU.mL-1 for
[40] . Perfil antimicrobiano do enxaguatório oral contendo curcumina [40] . Antimicrobial profile of oral rinse containing curcumin
[41] . Após comparar os dados na figura 1, observou-se que houve diferença estatística entre todos os grupos experimentais (p < 0,0001) em comparativo ao grupo controle (L-C-), com ênfase aos grupos que utilizaram o enxaguatório contendo curcumina L-C+; L+C+ (10 minutos) e L+C+ (30 minutos) a 30 μg.mL-1 e 60 μg.mL-1 (Figuras 1.E e 1.F). Desta forma, houve um indicativo da atividade antimcrobiana nas espécies representativas de microrganismos Gram-positivo (Staphylococcus aureus), Gram-negativo (Escherichia coli) e fungo (Candida albicans) na forma de biofilmes. [41] . After comparing the data in Figure 1, it was observed that there was a statistical difference between all experimental groups (p < 0.0001) compared to the control group (LC-), with emphasis on the groups that used the mouthwash containing curcumin L-C+ ; L+C+ (10 minutes) and L+C+ (30 minutes) at 30 μg.mL-1 and 60 μg.mL-1 (Figures 1.E and 1.F). Thus, there was an indication of antimicrobial activity in representative species of Gram-positive (Staphylococcus aureus), Gram-negative (Escherichia coli) and fungus (Candida albicans) microorganisms in the form of biofilms.
[42] . Figura 1. Avaliação da atividade antimicrobiana utilizando enxaguatório microemulsionado contendo curcumina em diferentes concentrações e tempos de irradiação. 1.A: Staphylococcus aureus meticilino resistente com curcumina a 30 pg.mL-1, 1.B: Staphylococcus aureus meticilino resistente com curcumina a 60 μg.mL-1; 1.C: Escherichia coli com curcumina a 30 μg.mL-1; 1.D: Escherichia coli com curcumina a 60 μg.mL-1 1.E: Candida albicans com curcumina a 30 μg.mL-1; 1.F: Candida albicans com curcumina a 60 μg.mL-1. Controle: L-C-; Enxaguatório contendo curcumina: L-C+; Luz 10 minutos: L+C-(10’); Luz 30 minutos: L+C- (30’); PDT 10 minutos: L+C+ (10’); PDT 30 minutos: L+C+ (30’). Análise estatística usando análise de variância. [42] . Figure 1. Evaluation of antimicrobial activity using a microemulsified mouthwash containing curcumin at different concentrations and irradiation times. 1.A: methicillin resistant Staphylococcus aureus with curcumin at 30 pg.mL-1, 1.B: methicillin resistant Staphylococcus aureus with curcumin at 60 μg.mL-1; 1.C: Escherichia coli with 30 μg.mL-1 curcumin; 1.D: Escherichia coli with curcumin at 60 μg.mL-1 1.E: Candida albicans with curcumin at 30 μg.mL-1; 1.F: Candida albicans with curcumin at 60 μg.mL-1. Control: L-C-; Curcumin-containing mouthwash: L-C+;
[43] . Para Staphylococcus aureus meticilino resistente (Figura 1.A e 1.B) foi evidenciada uma redução significativa nos grupos que utilizaram terapia fotodinâmica com 10 e 30 minutos e formulação contendo curcumina a 30 μg.mL-1 (3,497 log 10 UFC.mL-1 e 5,181 log 10 UFC.mL-1, respectivamente). Ao se comparar os protocolos de terapia fotodinâmica, observa-se diferença estatística entre os grupos que receberam radiação de 10 e 30 minutos (p < 0,05), demonstrando que a irradiação de 30 minutos foi mais eficaz na redução microbiana. No entanto, ao se comparar os grupos terapia fotodinâmica com 30 μg.mL-1 e 60 μg.mL-1 e usando o mesmo tempo de irradiação, não houve diferença significativa (p > 0,05), o que evidencia que o efeito antimicrobiano sobre esta espécie depende do tempo de irradiação sem efeito da concentração da curcumina no tratamento. [43] . For methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Figure 1.A and 1.B), a significant reduction was observed in the groups that used photodynamic therapy with 10 and 30 minutes and a formulation containing curcumin at 30 μg.mL-1 (3,497
[44] . Para a Escherichia coli (Figura 1.C e 1.D), foi evidenciada uma redução significativa nos grupos que utilizaram terapia fotodinâmica e formulação contendo curcumina a 30 pg.mL-1 nos tempos de 10 e 30 minutos (5,6175 log 10 UFC.mL-1 em ambos os tempos), o que equivale a 99,9% de morte microbiana em ambos os tempos de irradiação. O mesmo ocorreu com a curcumina na concentração de 60 μg.mL-1 nos tempos de 10 e 30 minutos (redução de 4,134 log 10 UFC.mL-1 e 3,96 log 10 UFC.mL-1, respectivamente). [44] . For Escherichia coli (Figure 1.C and 1.D), a significant reduction was evidenced in the groups that used photodynamic therapy and a formulation containing curcumin at 30 pg.mL-1 at times of 10 and 30 minutes (5.6175
[45] . Para a Candida albicans (Figura 1.E e 1.F), observa-se uma redução significativa no grupo terapia fotodinâmica com 30 minutos e formulação contendo curcumina a 60 μg.mL-1 (3,497 log 10 UFC.mL-1, 89,4%). Ao se comparar os protocolos de terapia fotodinâmica deste microrganismo, observa-se diferença estatística (p < 0,05) entre os grupos que receberam radiação de 10 e 30 minutos e mesma concentração (L+C+ 10’; L+C+ 30’), indicando que o efeito antimicrobiano sobre Candida albicans depende tanto da concentração de curcumina quanto do tempo de irradiação, com resultados superiores em maior tempo de irradiação e maior concentração de curcumina. [45] . For Candida albicans (Figure 1.E and 1.F), there is a significant reduction in the photodynamic therapy group with 30 minutes and a formulation containing curcumin at 60 μg.mL-1 (3,497
[46] . Com base nos resultados, demonstra-se que a terapia fotodinâmica pode suprimir de forma considerável a viabilidade de microrganismos Gram-positivos, Gram-negativos e fungos em cavidade oral, independentemente do status de resistência antibiótica que o microrganismo apresente. Entre as estratégias terapêuticas disponíveis, a terapia fotodinâmica tem sido uma das respostas mais bem-sucedidas em pesquisa clínica, pois o efeito antimicrobiano ocorre devido a geração de EROs a partir da terapia fotodinâmica, não causando resistência microbiana. [46] . Based on the results, it is demonstrated that photodynamic therapy can considerably suppress the viability of Gram-positive and Gram-negative microorganisms and fungi in the oral cavity, regardless of the antibiotic resistance status of the microorganism. Among the available therapeutic strategies, photodynamic therapy has been one of the most successful responses in clinical research, as the antimicrobial effect occurs due to the generation of ROS from photodynamic therapy, not causing microbial resistance.
[47] . Dentre os maiores percentuais de redução microbiana encontrada, a classe de Gram-negativa teve a maior redução de UFC.mL-1, seguido pelo Staphylococcus aureus meticilino resistente (Gram-positiva) e Candida albicans (fungo). A presença de tensoativo não-iônico (polissorbato 80) e das gotículas lipídicas de ordem nanométrica na formulação desenvolvida são fatores determinantes para aumentar a interação do corante fotossensibilizante com os biofilmes, bem como aumentar a interação com as barreiras biológicas das células microbianas, facilitando assim a interação com lipopolissacarídeos presentes na membrana exterior em microrganismos Gram-negativos. Deste modo, as EROs geradas na terapia fotodinâmica podem ter maior efeito nas células microbianas, levando a morte celular não tóxica. [47] . Among the highest percentages of microbial reduction found, the Gram-negative class had the greatest reduction in CFU.mL-1, followed by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Gram-positive) and Candida albicans (fungus). The presence of non-ionic surfactant (polysorbate 80) and lipid droplets of nanometric order in the developed formulation are determining factors to increase the interaction of the photosensitizing dye with biofilms, as well as to increase the interaction with the biological barriers of microbial cells, thus facilitating the interaction with lipopolysaccharides present in the outer membrane in Gram-negative microorganisms. Thus, the ROS generated in photodynamic therapy can have a greater effect on microbial cells, leading to non-toxic cell death.
[48] . O enxaguatório microemulsionado desenvolvido pode também ser aplicado para descontaminar cavidades orais em pacientes que sofrem de imunidade comprometida e possuem diversas infecções orais. Além disso, o preparado contendo curcumina é efetivo em baixa intensidade de luz e concentração do corante fotossensibilizante para atingir uma redução mínima de 2-log10 na população microbiana dos três microrganismos testados. A partir disso, protocolos terapêuticos com tempos de irradiação e concentrações menores podem ser adotados em pacientes com maior sensibilidade da mucosa oral sem, no entanto, comprometer a eficiência antimicrobiana. Assim, o encapsulamento da curcumina em gotículas nanométricas no enxaguatório microemulsionado permite contornar obstáculos enfrentados na utilização clínica do corante, aumentando a compatibilidade do preparado com o fluido aquoso da cavidade oral, retardando a degradação química da curcumina no meio aquoso, aumentando o espalhamento do preparado fluido na cavidade oral e melhorando a interação do corante com as barreiras biológicas dos microrganismos devido à presença de tensoativo no preparado. [48] . The developed microemulsified mouthwash can also be applied to decontaminate oral cavities in patients who suffer from compromised immunity and have various oral infections. Furthermore, the preparation containing curcumin is effective in low light intensity and photosensitizing dye concentration to achieve a minimum 2-log10 reduction in the microbial population of the three microorganisms tested. From this, therapeutic protocols with lower irradiation times and concentrations can be adopted in patients with greater sensitivity of the oral mucosa without, however, compromising the antimicrobial efficiency. Thus, the encapsulation of curcumin in nanometric droplets in the microemulsified mouthwash allows overcoming obstacles faced in the clinical use of the dye, increasing the compatibility of the preparation with the aqueous fluid of the oral cavity, delaying the chemical degradation of curcumin in the aqueous medium, increasing the spread of the preparation fluid in the oral cavity and improving the interaction of the dye with the biological barriers of microorganisms due to the presence of surfactant in the preparation.
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