BR102020005977A2

BR102020005977A2 - Lectina de cascas de jenipapo (genipa americana l.) com atividade inseticida contra adultos do besouro tribolium castaneum (herbst 1797) (coleoptera: tenebrionidae)

Info

Publication number: BR102020005977A2
Application number: BR102020005977-7A
Authority: BR
Inventors: Francis Soares Gomes; Janaína Kívia Alves Lima; Camila Pereira De Lima Chicuta; Antônio Thomás Da Silva; Luciano Aparecido Meireles Grillo
Original assignee: Universidade Federal De Alagoas
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2021-10-05

Abstract

lectina de cascas de jenipapo (genipa americana l.) com atividade inseticida contra adultos do besouro tribolium castaneum (herbst 1797) (coleoptera: tenebrionidae). estratégias de controle de insetos-praga de grãos armazenados são de interesse das indústrias agrícolas e alimentícias. o tribolium castaneum, uma das mais relevantes, economicamente, pragas de produtos armazenados, tem apresentado alta resistência contra pesticidas sintéticos. neste sentido, a busca por produtos botânicos que apresentem mecanismos de ação com menores efeitos residuais e baixa toxicidade aos demais animais têm aumentado consideravelmente. entre esses, as moléculas oriundas do metabolismo das plantas que geram efeitos não tóxicos, em especial as proteínas, têm recebido maior atenção. a genipa americana l., reconhecida devido a sua importância econômica e uso na culinária tradicional, não apresenta na literatura trabalhos que descrevam seu potencial inseticida a insetos da ordem coleóptera, e nenhum contra o t. castaneum. assim, na presente invenção a lectina isolada de g. americana inibiu a alimentação dos insetos, além de interferir na sobrevivência e reprodução destes, quando inserida na dieta alimentar, tendo a concentração de 2mg reunido as melhores características. isso sugere que a lectina de g. americana é uma importante molécula para o controle de t. castaneum seja por meio da incorporação em iscas tóxicas, ou aplicação em técnicas de recombinação gênica para melhoramento genético de plantas.

Description

LECTINA DE CASCAS DE JENIPAPO (GENIPA AMERICANA L.) COM ATIVIDADE INSETICIDA CONTRA ADULTOS DO BESOURO TRIBOLIUM CASTANEUM (HERBST 1797) (COLEOPTERA: TENEBRIONIDAE)

[001] A presente invenção refere-se ao uso de uma lectina extraída da casca da planta Genipa americana L. (Rubiaceae) que interferiu na sobrevivência e reprodução dos insetos adultos de Tribolium castaneum (Herbst 1797) (Coleoptera: Tenebrionidae).

PROBLEMA QUE A INVENÇÃO SE PROPÕE A RESOLVER

[002] As estimativas sugerem que 228,5 milhões de toneladas de grãos foram produzidas nas colheitas brasileiras em 2018 (Conab, 2018). Segundo a FAO, 70% da produção agrícola é armazenada por agricultores para diferentes fins (LORINI et al, 2015). Insetos e ácaros são os principais responsáveis pela deterioração dos alimentos armazenados, e causam perdas anuais estimadas em cerca de 30% da produção (BOYER et al, 2012).

[003] Os insetos da ordem Coleoptera, pragas de produtos armazenados e cerais, são um problema recorrente em lojas de varejo, onde danificam e inviabilizam a comercialização de produtos alimentícios. O Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae), uma das mais relevantes, economicamente, pragas de produtos armazenados, tem apresentado alta resistência contra pesticidas sintéticos (BOSSOU et al., 2015; CABALLERO-GALLARDO, 2010). As fêmeas depositam de 300 a 500 ovos durante a sua vida, ovipositam nas fendas das paredes dos armazéns, na sacaria e sobre os grãos. As fases de ovos e pupas (estado intermediário entre larvas e fase adulta) apresentam maior resistência à ação dos inseticidas, sendo uma das primeiras espécies a reinfestar os grãos após o tratamento.

[004] Além do aumento da resistência aos inseticidas convencionais, a expansão do mercado orgânico aumentou a busca por novos produtos botânicos para controlar pragas, com enfoque em alternativas com um novo modo de ação, que não tenha ou apresente menor efeito residual sobre o produto aplicável, ao ambiente e a saúde humana (KIRAN; PRAKASH, 2015).

[005] Neste sentido, a presente invenção visa minimizar os danos causados por este inseto em grãos armazenados, auxiliando os produtores no que se refere ao controle e monitoramento destas pragas, através do uso de preparação contendo lectina com potencial inseticida contra o referido inseto.

CAMPO DE ATUAÇÃO

[006] Na presente invenção, sugere-se a utilização em galpões e armazéns, na forma de isca dietética da preparação de lectina a fim de conferir resistência aos grãos armazenados contra insetos. As preparações têm possibilidade de ser empregadas em diferentes regiões geográficas no Brasil, bem como em outros países produtores de grãos a fim de reduzir os danos causados por essa praga.

[007] Outra perspectiva de utilização da lectina descrita na presente invenção está associada ao uso de métodos que aumentem a resistência de plantas a insetospragas, a partir da engenharia genética que pode aumentar a expressão da lectina e técnicas de recombinação gênica que proporcionam a inserção nas células vegetais de genes clonados contendo as lectinas em questão.

ESTADO DA TÉCNICA

[008] O uso excessivo de agrotóxicos na agricultura brasileira tornou-se um problema de saúde pública, devido as contaminações no ambiente, aos alimentos e as intoxicações causadas ao homem. Aliado a isso, há de se levar em conta o aumento da resistência aos inseticidas usualmente empregados, onde mais de 15.000 espécies já demonstram resistência a um ou mais ingredientes disponíveis no mercado (SPARKS; LORSBACH, 2016). Muitos insetos tais como T. castaneum, S. zeamais e S. oryzae, todos da ordem Coleoptera e importantes pragas de grãos armazenados, já apresentam raças resistentes, o que estimula a busca por novos agentes e a adoção do Manejo Integrado de Pragas (MIP) para estes tipos de praga (SPARKS; NAUEN, 2015; PIGNATI et al, 2017).

[009] O controle de insetos-praga visa reduzir as populações, a níveis que não causem problemas aos demais animais e abaixo do nível de dano econômico. Todos os fatores relativos as espécies praga devem ser consideradas, tais como aspectos ecológicos, comportamentais e climáticos (ISMAN, 2006). O conhecimento do hábito alimentar em especial constitui um elemento importante para definir o manejo adequado a ser realizado (LORINI, 2008).

[010] Os produtos vegetais são abundantemente disponíveis a baixo custo e possuem amplo espectro de ação como agentes inseticidas, anti-alimentares, repelentes, larvicidas, ovicidas e reguladores de crescimento de insetos (GURUPIRASANNA-PANDI et al, 2018).

[011] As proteínas, produtos do metabolismo primário das plantas têm a capacidade de interferir na sobrevivência e desenvolvimentos dos insetos. Neste grupo de proteínas de defesa três classes se destacam: os inibidores de proteases, inibidores de amilases e lectinas. Existem ainda outras classes de proteínas que têm sido estudadas sobre os seus efeitos tóxicos, com ênfase nos seus mecanismos de ação sobre os herbívoros (DANG; VAN DAME, 2015; JONGSMA; BEEKWILDER, 2011; ZAKIR, 2011).

[012] As lectinas vegetais são conhecidas por seus efeitos tóxicos e antinutricionais aos insetos. Seu potencial inseticida entre as diversas atividades associadas as lectinas, tem sido apontado como um dos mais promissores métodos de controle (MACEDO et al, 2015).

[013] Uma das principais técnicas utilizadas para avaliar o potencial inseticida das lectinas consiste na incorporação dessas moléculas em dietas artificiais, método descrito por Xie e colaboradores em 1996, e adaptado e reproduzido por pesquisadores desde então (DE ARAÚJO RIBEIRO). A partir desta técnica diversos autores já constataram as propriedades tóxicas de lectinas às pragas pertencentes às diversas ordens, tais como, Coleoptera, Diptera, Hemiptera e Lepdoptera (LIMA, et al, 2017; NAPOLEÃO et al, 2011; VANDENBORRE et al, 2011).

[014] Muitos pesquisadores têm avaliado o potencial inseticida das lectinas, e buscado elucidar os mecanismos de ação associados a elas. Macedo e colaboradores (2007) demonstrou a atividade da lectina das folhas de Bauhinia monandra (BmoLL) contra Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae), Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae), enfatizando a não degração de BmoLL quando incubada com enzimas proteolíticas destas espécies. OLIVEIRA et al (2011), mostrou o efeito da lectina de sementes Moringa oleifera Lamarck (cMoL) contra larvas de Anagasta kuehniella mostrando seus efeitos antinutricionais por redução da eficiência de conversão alimentar e do ganho de biomassa, o que afetou o crescimento e a sobrevivência dos insetos. Roy e Das (2015) também demonstraram os efeitos da lectina de Colocasia esculenta Tuber (CEA) contra o percevejo do algodão Dysdercus cingulatus, da ordem hemiptera, evidenciando a interação de CEA com o epitélio de revestimento do intestino do inseto, fato que corrobora com os efeitos entomotóxicos que têm sido associados às lectinas vegetais.

[015] O uso das lectinas como estratégia para o controle de pragas é uma possibilidade real tanto em relação a redução dos impactos ambientais e à saúde quanto ao desenvolvimento de resistência. Comparadas aos inibidores de proteases, a outra classe de proteínas inseticidas bastante estudadas, as lectinas são menos propensas a ter seus mecanismos superados, pois sua ação envolve vários alvos moleculares (NAPOLEÃO et al, 2018).

[016] No que diz respeito a espécie vegetal desta invenção, G. americana, há relatos na literatura sobre as ações analgésica, diurética, antimalárica e antipirética (MOURA et al., 2016). Há poucos relatos sobre o potencial inseticida da referida planta sobre insetos de interesse na saúde pública (BARBOSA et al., 2014), mas nenhum sobre insetos de grãos armazenados.

[017] Nos bancos de dados de patente (INPI, EPO, USPTO e WIPO) há 88 registros de patentes com G. americana, a maior parte delas apresentam o código A61K que está relacionado a produtos para fins médicos, odontológicos e higiene (BARBOSA et al., 2014), nenhuma relacionada a atividade inseticida. E, no que se refere às lectinas com atividade inseticida dois depósitos estão registrados. PI 0301547-5 relata a presença da atividade destas moléculas sem maiores caracterizações. Já a patente PI 9405668-4, descreve a utilização de processos de melhoramento genético utilizando o DNA a fim de aumentar a expressão do gene codificador da lectina em espécies vegetais alvo.

[018] Dada à importância dos bioativos de plantas no controle de insetos-praga, vários estudos têm sido realizados com objetivo de identificar espécies vegetais com atividade inseticida e relatadas em trabalhos publicados e em documentos de patente como alguns dos exemplos citados anteriormente. Isso, torna essas proteínas potenciais produtos que podem ser aplicados sob a forma de técnicas e preparações específicas e industrialmente aceitáveis.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA

[019] Os inventores da presente composição identificaram a presença de uma lectina inseticida, obtida da casca de G. americana, que pode estar associada tanto a preparações de uso na dieta alimentar e outras preparações ou por meio de métodos que aumentem a resistência de plantas a insetos-pragas.

[020] No que se refere a aplicação na dieta alimentar, a composição da invenção pode incluir um ou mais aditivos para aumentar a atração de T. castaneum, tais como, compostos sintéticos que já foram identificados como atraentes para o inseto, como o composto 2,6-dimetil octilformato identificado como atraente, cuja deposito de patente (US4970069 A), mas não se limita somente a ele.

[021] Pode incluir também estimulantes de apetite nas composições da invenção, tais como, óleo de semente de algodão, ésteres de ácido graxo de fitol, ésteres de ácido graxo de geranil geraniol, extratos de plantas, álcoois de plantas e suas combinações.

[022] As composições da invenção podem incluir ainda, desde que em baixas concentrações, um ou mais inseticidas químicos, que apresentam mecanismos de ação diferente dos demonstrados nesta invenção tais como ciflutrin, permetrin, cipermetrin, bifintrin, fenvalerato, flucitrinato, azinfosmetil, metil paration, malation e outros. As composições da invenção também podem incluir inseticidas biológicos, tais como toxinas e piretrinas naturais, e outras proteínas de Bacillus thuringiensis e de Beauveria bassiana.

[023] Na perspectiva de utilização em plantas geneticamente modificadas, uma importante estratégia para o Manejo Integrado de Pragas (MIP), é possível a partir da inserção de genes de plantas codificadores para a produção aumentada de lectinas, tal qual sugere o depósito da patente PI 9405668-4.

[024] As etapas que se seguem são referentes a experimentos para caracterização da atividade biológica inseticida da lectina de G. americana contra os adultos de T. castaneum.

Insetos

[025] Os insetos de T. castaneum utilizados na presente invenção foram obtidos da criação mantida pelo Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM) - UFAL Campus A.C Simões, em condições controladas de temperatura ± 30º, com umidade relativa entre 70 e 80% e fotoperíodo claro/escuro de 12h em BOD, e alimentados com farinha de trigo comercial. Nos experimentos foram testados os insetos adultos, machos e fêmeas, de 10 dias de idade.

Identificação da Espécie G. americana

[026] A espécie G. americana foi coletada em Coruripe, Alagoas, armazenadas em sacos plásticos transparentes e conduzidas até o laboratório de Proteômica e Metabologia (LAMP) onde foram preparadas as exsicatas botânicas, identificadas e depositadas junto ao Herbário MAC do Instituto de Meio Ambiente de Alagoas – IMA (número 64576). A coleta do material vegetal foi realizada sob a autorização do Sistema Nacional de Gerenciamento do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) (processo número A87C1CC).

Obtenção das cascas de G. americana

[027] As cascas de G. americana foram coletadas de diferentes espécimes encontrados em Coruripe, Alagoas, armazenadas em sacos plásticos transparentes e conduzidas até o laboratório de Proteômica e Metabologia (LAMP) onde foram higienizadas, processadas e armazenadas. O pó resultante foi acondicionado no freezer a - 20°C.

Isolamento da lectina das cascas de G. americana

[028] A lectina foi isolada por metodologia descrita por Costa et al., 2018. O extrato da casca de G. americana foi preparado usando o pó (10 g) em 50 mL de tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 8,0) por 16 h a 4°C sob agitação magnética. Em seguida, o material foi centrifugado (15000 × g por 15 min a 4°C) e o sobrenadante correspondeu ao extrato. Este extrato foi tratado com sulfato de amônio a 20% de saturação durante 4 h. Após centrifugação (15000 g, 15 min, 4°C), a fração precipitada (F1) foi coletada e dialisada contra tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 8,0) durante 2 h. Uma alíquota de F1 (0,3 mL; 0,512 mg de proteína) foi cromatografada em uma coluna Hiprep 16/60 Sephacryl S-100HR (16 mm × 60 cm) acoplada ao sistema AKTA Püre M1 (GE 115 Healthcare Life Sciences, Suécia) e equilibrada com Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0. A cromatografia foi realizada no mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 0,1 mL / min. Foram coletadas frações de 2,0 mL. As frações eluídas foram avaliadas quanto à concentração de proteínas e atividade hemaglutinante. Os picos ativos foram reunidos e denominados G. americana bark lectin (GaBL).Todas as amostras foram mantidas sob refrigeração até o momento do uso.

Dosagem de proteínas

[029] Para determinar a concentração de proteínas nas amostras em avaliação foi utilizado o método de Bradford (1976), usando albumina de soro bovino como padrão (250- 0,009 μg/mL). Para isso, 10 μL das amostras (extrato bruto, fração 20% e GaBL) diluídas (1: 10), e 190 μL do reagente de Bradford. As amostras foram incubadas por 5 min, e posteriormente medida a absorbância a 595 nm. As unidades correspondentes são (mg/mL) de proteína.

Atividade Hemaglutinante

[030] Foi realizada para todas as amostras, a fim de confirmar a presença de lectinas, o ensaio de atividade hemaglutinante (AH), característico dessas moléculas. O ensaio foi realizado em placas de 96 poços de microtitulação, de acordo com a metodologia descrita por Paiva e Coelho (1992), onde alíquotas de 50 μL das amostras foram diluídas serialmente em NaCl 0,15 M antes da adição de 50 μL de suspensão (2,5 % v/v) de eritrócitos de coelho. A AH foi expressa como o inverso da maior diluição da amostra que promoveu hemaglutinação. AH específica (AHE) foi definida pela razão entre o título e a concentração proteica (mg/mL).

Bioensaios

[031] Os bioensaios foram realizados no laboratório de Bioquímica Metabólica da UFAL, através de uma adaptação do método descrito por Xie e colaboradores (1996) e reproduzido por Napoleão e colaboradores (2013), onde 5mL da amostra em tampão Tris-HCl 50mM pH 8,0 foi misturado a 2g de farinha e agitada por 5 min. Posteriormente, 5 alíquotas de 200µL da suspensão foi colocado na placa de Petri e incubado a 56 ºC por 16 horas. Após este período foram adicionados 20 insetos adultos de T. castaneum. O peso das larvas e dos discos foram acompanhados semanalmente até o final do experimento. O ensaio foi realizado em quadruplicata com Tris-HCl 50mM pH 8,0 como controle negativo.

Análise da sobrevivência de T. castaneum

[032] Foi realizada após a ingestão da dieta artificial contendo 500μg, 1mg, 2mg e 4mg de GaBL. Durante 28 dias ou até a morte de 100% dos indivíduos foi observado e contabilizado diariamente o número de insetos sobreviventes em cada unidade experimental. Os insetos foram considerados mortos quando não respondiam aos estímulos táteis. Todos os testes foram realizados em quadruplicata, com 15 insetos adultos em cada repetição.

Avaliação dos efeitos de G. americana sobre a alimentação de T. castaneum

[033] Após 28 dias em dieta artificial com os discos de farinha contendo ou não as preparações de G. americana, foi possível avaliar o índice de alimentar (IDA) que foi calculado por meio da fórmula: IDA (%) = 100 x (A-B)/(A), onde A é a massa de alimento ingerida pelo inseto no ensaio controle, e B é a massa de alimento ingerida pelo inseto no ensaio com a amostra. As amostras com base na deterrência alimentar classificam-se em: sem deterrência alimentar (IDA <20%), fraca deterrência alimentar (50%> IDA > 20%), moderada deterrência alimentar (70%> IDA > 50%), ou forte deterrência alimentar (IDA > 70%) (Liu et al., 2007).

Efeito sobre a reprodução

[034] A capacidade de se reproduzir após os 28 dias expostos à dieta artificial contendo a lectina de G. americana foi avaliada através do número de larvas emergidas ao longo do bioensaio. O ensaio foi realizado em quadruplicata com TrisHCl 50 mM pH 8.0 como controle negativo,

Análise Estatística

[035] Os dados foram analisados pela ANOVA seguida de teste de Tukey para detecção de diferença significativa e comparação entre tratamentos utilizando o Os dados da mortalidade ao longo dos 28 dias foram utilizados para traçar a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier. Todas as análises foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism versão 6.0.

RESULTADOS OBTIDOS Efeitos da lectina de G. americana sobre a sobrevivência de T. castaneum

[036] As lectinas estão entre as principais classes de proteínas com potencial inseticida e são, em geral, avaliadas quanto ao seu potencial no controle de pragas por meio da metodologia da dieta artificial, uma vez que são relatados como agentes antinutricionais para os insetos (SOETAN, 2008). Com base nisso, para avaliar se a lectina é o principal responsável pelos efeitos deletérios provocados pela ingestão de G. americana, GaBL, foi inserida na dieta artificial nas concentrações de 500μg, 1mg, 2mg e 4mg.

[037] Pode-se observar que as concentrações que causaram a maior mortalidade de T. castaneum, reduzindo até 55% da sobrevivência dos insetos, foram 2mg e 4mg de GaBL, não havendo diferença significativa entre as duas concentrações (figura 1).

[038] A atividade defensiva de lectinas de plantas contra insetos pragas tem sido amplamente avaliada ao longo da última década, e evidências quanto a não toxicidade destas moléculas a humanos tem possibilitado o aumento significativo da aplicação das lectinas enquanto agentes inseticidas contra insetos sugadores. Seus efeitos entomotóxicos já foram descritos contra insetos das ordens Lepdoptera, Diptera, Isoptera, Hemiptera, Hymenoptera, Homoptera, Coleoptera, entre outras (MACEDO et al, 2015; NAPOLEÃO et al, 2011; OLIVEIRA et al, 2017; REYESMONTAÑO; VEGA-CASTRO, 2018; ROY; DAS, 2015; SÁ et al, 2009).

[039] Além de provocar a mortalidade, principalmente pela ingestão, as lectinas se destacam por interferir em funções necessárias ao desenvolvimento dos insetos, tais como a inibição da absorção e digestão de nutrientes (MACEDO et al, 2015; REYESMONTAÑO; VEGA-CASTRO, 2018). Considerando que o completo mecanismo de ação de lectinas de plantas contra insetos ainda estão pouco esclarecidos, os efeitos sobre a alimentação do T. castaneum foram avaliados.

[040] A figura 2 mostra que nas doses de 500μg, 1mg, 2mg GaBL apresentou moderado efeito deterrente alimentar e a dose de 4mg teve índice de deterrência alimentar considerado baixo de acordo com Liu e colaboradores (2007). O uso de mecanismos não tóxicos, como repelentes, tem despertado cada vez mais interesse no controle de pragas. Napoleão e colaboradores (2013), também descreve o impedimento alimentar provocado pela ingestão da lectina da folha de Myracrodruon urundeuva em adultos de Sitophilus zeamais. Outras lectinas como a lectina de Galanthus nivalis e Canavalia ensiformis (Con A), também apresentaram efeito deterrente sobre Nilaparvata lugens e Acyrthosiphon pisum (GATEHOUSE et al, 1998; SAUVION et al, 2004).

[041] Embora pouco se saiba sobre a capacidade que as lectinas tem de interferir na oviposição ou eclosão dos ovos, muitos autores têm atribuído esta atividade às lectinas (MACEDO et al, 2007). Neste trabalho, houve redução significativa na eclosão de larvas em todos os tratamentos contendo GaBL em comparação ao controle (figura 3). Neste sentido, GaBL na concentração de 2mg foi a que apresentou a maior quantidade de efeitos inseticidas avaliados, sendo deterrente, indutor de mortalidade, além de também interferir na eclosão de larvas de T. castaneum, podendo ser agente de grande interesse com potencial aplicação no MIP de grãos e produtos armazenados.

[042] Sabe-se que a função principal dos adultos é relacionada a reprodução e essa função depende da interação e integração de processos comportamentais e fisiológicos que estão correlacionados ao consumo, conversão e utilização do alimento (PARRA et al, 2009).

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[043] Figura 1: sobrevivência dos adultos de T. castaneum tratados com diferentes doses da lectina de G. americana expressos pela curva de Kaplan-Meier.

[044] Figura 2: efeito deterrente da lectina de G. americana sobre adultos de T. castaneum mantidos 28 dias em dieta artificial.

[045] Figura 3: Eclosão de larvas de T. castaneum mantidos 28 dias em dieta artificial contendo a lectina de G. americana.

[046] VANTAGENS DA PATENTE

[047] Muitos insetos tais como T. castaneum, Sitophilus zeamais e Sitophilus oryzae, todos da ordem Coleoptera, são importantes pragas de grãos armazenados e já apresentam raças resistentes a um ou mais ingredientes dos inseticidas sintéticos já disponíveis no mercado, o que estimula a busca por novos agentes e a adoção do MIP para estes tipos de praga (SPARKS; NAUEN, 2015; PIGNATI et al, 2017).

[048] O potencial das lectinas enquanto molécula inseticida a ser utilizada nestessistemas de manejo de pragas tem sido cada vez mais estudado. Entre os mecanismos de ação associados a atividade das lectinas vegetais sugere-se a associação com estruturas glicosiladas presente nas membranas, em especial na membrana peritrófica que reveste o intestino dos insetos, provocando a desorganização da estrutura do epitélio da membrana peritrófica afetando assim a alimentação, por meio da redução da digestão e absorção dos nutrientes; interferência nas vias de sinalização e transporte e modulação de atividades enzimáticas que reflete diretamente na organização e eficiência do processo de digestão (LARGADA-DIAZ et al, 2016; LIMA et al, 2018; MACEDO et al, 2014; NAPOLEÃO et al, 2018; ROY;DAS, 2015; SPRAWKA et al, 2014).

[049] Vários fatores influenciam o número de produtos inseticidas que entram no mercado, principalmente a necessidade de novos mecanismos de ação para atender à crescente resistência dos organismos que tendem a excluir muitos dos produtos, principalmente os químicos, com modos de ação conhecidos e que impactam a taxa de introdução de novas ferramentas (SPARKS; LORSBACH, 2016). Por muito tempo a proteção de plantas se baseou apenas no uso dos pesticidas químicos sintéticos, mas as mudanças na legislação e os diversos fatores associados a resistencia têm fortalecido a busca por novas alternativas (CHANDLER et al, 2011).

[050] A fim de minimizar os danos causados por esse inseto-praga por meio de métodos menos agressivos, a referida invenção propõe a utilização de dietas alimentares contendo preparações da lectina de G. americana, capaz de interferir na sobrevivência e na ingestão alimentar do inseto T. castaneum, trazendo assim uma nova possibilidade de controle da praga em estudo, podendo servir como mais um método para ser agregado ao Manejo integrado de grãos e sementes armazenadas (MIPGRÃOS/MIPSEMENTES).

[051] Além disso, a descoberta de genes e produtos de genes que expressam características de defesa em cultivares de resistência é de fundamental importância para o Manejo de Resistência de Insetos, e por consequência para o Manejo Integrado de Pragas.

Claims

Preparação com uma lectina inseticida de G. americana, caracterizada por compreender as seguintes etapas:
- a) a proteína de casas de G. americana (GaBL) com extrato bruto preparado em tampão Tris-HCl 50mM pH 8,0 submetido a agitação constante por 12h a 4°C;
- b) Filtrar centrifugada e manter sob refrigeração;
- c) Submeter o extrato ao fracionamento salino com sulfato de amônio ((NH4)2SO4), a fração de interesse (20%), deve então ser utilizada para a obtenção da lectina isolada de G. americana (GaBL);
- d) O GaBL é isolado por meio de cromatografia de gel filtração em matriz Sephacryl S-100, em cromatografia líquida de alta resolução (FPLC) automatizada (ÄKTA Pure M1, GE Healthcare Life Science;
- e) Por fim a preparação em meio aquoso da lectina isolada de casas de G. americana, onde a amostra em tampão Tris-HCl 50mM pH 8,0 é misturada a farinha e agitada por 5 min;
- f) Posteriormente, 5 alíquotas de 200µL da suspensão é colocada na placa de Petri e incubado a 56 °C por 16 horas.