BR102020004695A2 - RECOMBINANT YEASTS INCLUDING PENTOSES TRANSPORTER GENE, USES OF THE SAME AND FERMENTATION METHOD - Google Patents
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Abstract
leveduras recombinantes compreendendo gene de transportador de pentoses, usos das mesmas e método de fermentação. a presente invenção ensina leveduras recombinantes que expressam gene de transportador de pentose. compreende ainda o uso do gene de transportador de pentose para obtenção de linhagens de leveduras recombinantes capazes de cofermentar pentoses e hexoses, em especial xilose e glicose. as leveduras da presente invenção são especialmente úteis na fermentação de um mosto compreendendo pentoses, reduzindo o tempo total de fermentação e chances de contaminações bacterianas, bem como aumentando a produtividade do processo. são providos ainda método de obtenção de composto com valor agregado à partir da fermentação de fonte de carbono e uso de proteínas transportadores de pentose para promover aumento do uso de pentose por levedura recombinante.recombinant yeasts comprising pentose transporter gene, uses thereof and fermentation method. the present invention teaches recombinant yeasts which express the pentose transporter gene. it also comprises the use of the pentose transporter gene to obtain recombinant yeast strains capable of co-fermenting pentoses and hexoses, especially xylose and glucose. the yeasts of the present invention are especially useful in fermenting a wort comprising pentoses, reducing overall fermentation time and chances of bacterial contamination, as well as increasing the productivity of the process. method of obtaining value-added compost from carbon source fermentation and use of pentose carrier proteins to promote increased use of pentose by recombinant yeast are also provided.
Description
[1] A presente invenção está relacionada aos campos da biotecnologia, biologia molecular, biologia celular e microbiologia aplicada. A invenção fornece leveduras recombinantes capazes de consumir pentose, as quais contêm transportador de pentose, e uso de proteína transportadora de pentose para construção de linhagens de leveduras recombinantes capazes de cofermentar pentoses e hexoses, em especial xilose e glicose, presentes em mosto. Também são providos métodos de fermentação de biomassa usando as leveduras recombinantes desenvolvidas para a produção de compostos de valor agregado, especialmente biocombustíveis.[1] The present invention is related to the fields of biotechnology, molecular biology, cell biology and applied microbiology. The invention provides recombinant yeasts capable of consuming pentose, which contain pentose transporter, and use of pentose transporter protein for construction of recombinant yeast strains capable of cofermenting pentoses and hexoses, especially xylose and glucose, present in must. Biomass fermentation methods using recombinant yeasts developed for the production of value-added compounds, especially biofuels, are also provided.
[2] A produção de combustíveis e produtos químicos a partir da biomassa lignocelulósica pode ser realizada via fermentação de açúcares, sendo que a biomassa passa inicialmente por processos de pré-tratamento e hidrólise enzimática para obtenção dos açúcares fermentescíveis.[2] The production of fuels and chemical products from lignocellulosic biomass can be carried out via sugar fermentation, and the biomass initially undergoes pre-treatment and enzymatic hydrolysis processes to obtain fermentable sugars.
[3] Os açúcares fermentescíveis contidos em hidrolisados de biomassa lignocelulósica incluem hexoses e pentoses, provenientes da celulose e hemicelulose, respectivamente. As pentoses, como xilose, representam até 20% dos açúcares presentes na biomassa lignocelulósica. A xilose é o segundo carboidrato mais abundante na natureza, atrás apenas da glicose, sendo o principal açúcar presente na hemicelulose de várias biomassas, o que aponta para um grande potencial na obtenção de combustíveis e outros produtos químicos.[3] Fermentible sugars contained in lignocellulosic biomass hydrolysates include hexoses and pentoses, derived from cellulose and hemicellulose, respectively. Pentoses, such as xylose, represent up to 20% of the sugars present in lignocellulosic biomass. Xylose is the second most abundant carbohydrate in nature, second only to glucose, being the main sugar present in hemicellulose of various biomasses, which points to a great potential for obtaining fuels and other chemical products.
[4] Os processos de fermentação de hidrolisados de biomassa lignocelulósica utilizam leveduras. A espécie Saccharomyces cerevisiae é utilizada industrialmente para produção de etanol a partir da fermentação de açúcares. Entretanto, S. cerevisiae não consome pentoses devido à ausência de um metabolismo robusto para esta finalidade. Embora existam outras espécies de levedura que fermentam pentoses, S. cerevisiae possui características que justificam o seu uso para fermentação de hidrolisados de biomassa lignocelulósica, como a alta produtividade de etanol, alta tolerância ao etanol, tolerância a compostos inibidores presentes nos hidrolisados e crescimento em pH relativamente baixo, que previne contaminações por bactérias.[4] The fermentation processes of lignocellulosic biomass hydrolysates use yeasts. The species Saccharomyces cerevisiae is industrially used for ethanol production from sugar fermentation. However, S. cerevisiae does not consume pentoses due to the absence of a robust metabolism for this purpose. Although there are other yeast species that ferment pentoses, S. cerevisiae has characteristics that justify its use for fermentation of lignocellulosic biomass hydrolysates, such as high ethanol productivity, high ethanol tolerance, tolerance to inhibitor compounds present in hydrolysates and growth in Relatively low pH, which prevents bacterial contamination.
[5] Uma das formas de viabilizar o uso de xilose, pela S. cerevisiae, em processos fermentativos é pela inserção de vias metabólicas de pentoses por engenharia metabólica nessa levedura. Estratégias de engenharia metabólica frequentemente usadas em S. cerevisiae incluem: i) otimização de vias de assimilação de xilose; ii) engenharia de vias metabólicas endógenas que possibilitem aumento das taxas de conversão. Entretanto, essas estratégias não permitem a plena utilização de xilose por essa levedura, devido ao lento transporte de xilose na membrana celular. Dessa forma, a identificação e expressão de transportadores de açúcar com alta afinidade por xilose e sem inibição por glicose se faz necessária.[5] One of the ways to enable the use of xylose, by S. cerevisiae, in fermentation processes is by inserting pentose metabolic pathways by metabolic engineering in this yeast. Metabolic engineering strategies often used in S. cerevisiae include: i) optimization of xylose assimilation pathways; ii) engineering of endogenous metabolic pathways that enable an increase in conversion rates. However, these strategies do not allow the full utilization of xylose by this yeast, due to the slow transport of xylose in the cell membrane. Thus, the identification and expression of sugar transporters with high affinity for xylose and without inhibition by glucose is necessary.
[6] Transportadores de açúcar são proteínas de membrana que permitem o transporte de moléculas de açúcar do meio extracelular para o citoplasma celular. O transporte de açúcares nas membranas celulares é considerado o primeiro passo para a realização das principais atividades metabólicas de um organismo.[6] Sugar transporters are membrane proteins that allow the transport of sugar molecules from the extracellular medium to the cell cytoplasm. The transport of sugars across cell membranes is considered the first step in carrying out the main metabolic activities of an organism.
[7] Na levedura S. cerevisiae, o transporte de açúcares é realizado essencialmente por transportadores de hexoses. Esses transportadores apresentam alta afinidade por glicose, enquanto o transporte de pentoses, como xilose e arabinose, é de baixa afinidade. Desse modo, em fermentações utilizando hidrolisados ricos tanto em açúcares C6 como C5, as pentoses serão consumidas apenas após a utilização de maior parte das hexoses. Esse perfil de consumo é responsável por prolongar o tempo total de fermentação, reduzindo a produtividade do processo, aumentando as chances de contaminações bacterianas.[7] In the yeast S. cerevisiae, sugar transport is carried out essentially by hexose transporters. These transporters have a high affinity for glucose, while the transport of pentoses, such as xylose and arabinose, is of low affinity. Thus, in fermentations using hydrolysates rich in both C6 and C5 sugars, pentoses will only be consumed after using most of the hexoses. This consumption profile is responsible for extending the total fermentation time, reducing the productivity of the process, increasing the chances of bacterial contamination.
[8] Para o estudo da função de transportadores de açúcares, linhagens específicas de S. cerevisiae foram desenvolvidas, sem os transportadores nativos de hexose, pois alguns deles podem assimilar xilose. A linhagem EBY.VW400 é uma das mais usadas em estudos envolvendo o transporte de açúcares nessa levedura (HOU, J., QIU, C., SHEN, Y., LI, H., BAO, X. Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the efficient coutilization of glucose and xylose. FEMS yeast research, 17(4), 2017).[8] To study the function of sugar transporters, specific strains of S. cerevisiae were developed without native hexose transporters, as some of them can assimilate xylose. The EBY.VW400 strain is one of the most used in studies involving the transport of sugars in this yeast (HOU, J., QIU, C., SHEN, Y., LI, H., BAO, X. Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the efficient coutilization of glucose and xylose. FEMS yeast research, 17(4), 2017).
[9] Transportadores de pentoses oriundos de leveduras e fungos filamentosos naturalmente capazes de metabolizar xilose foram identificados previamente. Entre eles, os transportadores An25 de Neurospora crassa e Xyp29 de Scheffersomyces stipitis foram os únicos facilitadores com atividade exclusiva para xilose (DU J, LI S, ZHAO H. Discovery and characterization of novel d-xylose-specific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis. Molecular Biosystems, 6(11), 2150-2156, 2010). Outro transportador relevante é o Xut1, também nativo de S. stipitis, capaz de transportar xilose com uma afinidade e velocidade maior de reação do que para o transporte de glicose (Young, E., Poucher, A., Comer, A., Bailey, A., & Alper, H. Functional survey for heterologous sugar transport proteins, using Saccharomyces cerevisiae as a host. Appl. Environ. Microbiol., 77(10), 3311-3319, 2011). Gxf1 e Gxs1 de Candida intermedia; Mgt05196p de Meyerozyma guilliermondii são exemplos de outros transportadores (LEANDRO, M. J., GONÇALVES, P., SPENCER-MARTINS, I. Two glucose/xylose transporter genes from the yeast Candida intermedia: first molecular characterization of a yeast xylose–H+ symporter. Biochemical Journal, 395(3), 543-549, 2006; WANG, C., BAO, X., Li, Y., JIAO, C., HOU, J., ZHANG, Q., ZHANG, W., LIU, W., SHEN, Y.. Cloning and characterization of heterologous transporters in Saccharomyces cerevisiae and identification of important amino acids for xylose utilization. Metabolic engineering, 30, 79-88, 2015). A expressão heteróloga de alguns destes transportadores permitiu o transporte de xilose em linhagens de EBY.VW400. Entretanto, a maioria destes transportadores selvagens não é específica para xilose, levando a inibição competitiva por glicose. Mesmo os transportadores específicos para xilose, que não podem transportar glicose, são inibidos por glicose (HOU, J., QIU, C., SHEN, Y., LI, H., BAO, X. Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the efficient co-utilization of glucose and xylose. FEMS yeast research, 17(4), 2017).[9] Pentose transporters from yeasts and filamentous fungi naturally capable of metabolizing xylose have been previously identified. Among them, the An25 transporters from Neurospora crassa and Xyp29 from Scheffersomyces stipitis were the only facilitators with exclusive activity for xylose (DU J, LI S, ZHAO H. Discovery and characterization of novel d-xylose-specific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis Molecular Biosystems, 6(11), 2150-2156, 2010). Another relevant transporter is Xut1, also native to S. stipitis, capable of transporting xylose with a higher affinity and reaction speed than glucose transport (Young, E., Poucher, A., Comer, A., Bailey , A., & Alper, H. Functional survey for heterologous sugar transport proteins, using Saccharomyces cerevisiae as a host. Appl. Environ. Microbiol., 77(10), 3311-3319, 2011). Candida intermedia Gxf1 and Gxs1; Mgt05196p from Meyerozyma guilliermondii are examples of other transporters (LEANDRO, MJ, GONÇALVES, P., SPENCER-MARTINS, I. Two glucose/xylose transporter genes from the yeast Candida intermedia: first molecular characterization of a yeast xylose–H+ symporter. Biochemical Journal , 395(3), 543-549, 2006; WANG, C., BAO, X., Li, Y., JIAO, C., HOU, J., ZHANG, Q., ZHANG, W., LIU, W ., SHEN, Y.. Cloning and characterization of heterologous transporters in Saccharomyces cerevisiae and identification of important amino acids for xylose utilization. Metabolic engineering, 30, 79-88, 2015). The heterologous expression of some of these transporters allowed the transport of xylose in EBY.VW400 strains. However, most of these wild type transporters are not specific for xylose, leading to competitive inhibition by glucose. Even xylose-specific transporters, which cannot transport glucose, are inhibited by glucose (HOU, J., QIU, C., SHEN, Y., LI, H., BAO, X. Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the efficient co -utilization of glucose and xylose. FEMS yeast research, 17(4), 2017).
[10] Desta forma, a identificação de novos transportadores de açúcares que permitam o coconsumo de hexoses e pentoses é de grande importância para o desenvolvimento de linhagens de S. cerevisiae eficientes para cofermentação de glicose e xilose. Estas linhagens recombinantes de leveduras S. cerevisiae são essenciais para a diminuição do tempo de fermentação, aumentando a produtividade do processo e reduzindo as chances de contaminações generalizadas.[10] Therefore, the identification of new sugar transporters that allow the co-consumption of hexoses and pentoses is of great importance for the development of efficient S. cerevisiae strains for the co-fermentation of glucose and xylose. These recombinant strains of S. cerevisiae yeast are essential for reducing fermentation time, increasing the productivity of the process and reducing the chances of widespread contamination.
[11] A presente invenção está relacionada ao provimento de leveduras geneticamente modificadas para aumento de eficiência de processos de fermentação de glicose, xilose e hidrolisados de biomassa lignocelulósica contendo hexoses e pentoses.[11] The present invention is related to the provision of genetically modified yeasts to increase the efficiency of fermentation processes of glucose, xylose and lignocellulosic biomass hydrolysates containing hexoses and pentoses.
[12] Uma primeira concretização da invenção refere-se a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico com sequência possuindo pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 7.[12] A first embodiment of the invention relates to a recombinant yeast comprising a nucleic acid molecule with sequence having at least 95% identity with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7.
[13] Uma segunda concretização da invenção está relacionada a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico com sequência idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 7.[13] A second embodiment of the invention relates to a recombinant yeast comprising a nucleic acid molecule with sequence identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7.
[14] Outra concretização da invenção refere-se a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de polipetídeo cuja sequência de aminoácidos possui pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9.[14] Another embodiment of the invention relates to a recombinant yeast comprising a polypeptide molecule whose amino acid sequence has at least 95% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 6 and SEQ ID NO: 9.
[15] A invenção também se refere a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos seja selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9.[15] The invention also relates to a recombinant yeast comprising a polypeptide molecule whose amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9.
[16] Um outro aspecto da invenção se refere ao uso de uma levedura recombinante, conforme definida em qualquer uma das concretizações anteriores, para a fermentação de um mosto compreendendo pentoses.[16] Another aspect of the invention relates to the use of a recombinant yeast, as defined in any of the above embodiments, for the fermentation of a wort comprising pentoses.
[17] A invenção também está relacionada com um método de converter pelo menos uma parte de uma fonte de carbono de lignocelulose em um composto com valor agregado, compreendendo uma levedura recombinante na presença de fonte de carbono bruto, caracterizado pelas seguintes etapas:
- a) crescimento da levedura recombinante em meio seletivo;
- b) inoculação da levedura recombinante de (a) em alta densidade celular em uma fonte de carbono;
- c) fermentação de pelo menos uma parte da fonte de carbono de (b) para obtenção de um composto com valor agregado;
- d) recuperação de um composto com valor agregado do produto da fermentação de (c).
- a) growth of recombinant yeast in selective medium;
- b) inoculation of the recombinant yeast from (a) at high cell density into a carbon source;
- c) fermentation of at least a part of the carbon source of (b) to obtain a value-added compound;
- d) recovery of a value-added compound from the fermentation product of (c).
[18] Outra modalidade da invenção está relacionada com o uso de um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos apresenta pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9 para promover aumento no uso de pentoses pela levedura recombinante.[18] Another embodiment of the invention relates to the use of a polypeptide whose amino acid sequence exhibits at least 95% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9 to promote increased use of pentoses by recombinant yeast.
[19] Figura 1. Estratégia de expressão (1A) e confirmação de clonagem (1B) do transportador Saico. A: o gene Saico foi retirado do vetor pGAPZB-Saico (Thermo fisher) e clonado no vetor p425-GPD. B: Eletroforese em gel de agarose (0,8%) confirmando a clonagem do gene de transportador em plasmídeo epissomal p425-GDP utilizando os sítios de restrição BamHI e PstI. O marcador molecular utilizado foi o GeneRulerTM DNA Ladder Mix da empresa Thermo Scientific. O tamanho esperado para o transportador é: Saico1.[19] Figure 1. Expression strategy (1A) and cloning confirmation (1B) of the Saico transporter. A: The Saico gene was taken from the pGAPZB-Saico vector (Thermo fisher) and cloned into the p425-GPD vector. B: Agarose gel electrophoresis (0.8%) confirming the cloning of the transporter gene in episomal plasmid p425-GDP using the BamHI and PstI restriction sites. The molecular marker used was the GeneRulerTM DNA Ladder Mix from Thermo Scientific. The expected size for the carrier is: Saico1.
[20] Figura 2. Crescimento de linhagens EBY-Transportador em meio sólido contendo apenas um açúcar como fonte de carbono. A) Modelo esquemático do plaqueamento e das diluições realizadas a partir de um pré-inóculo. Foram testados os diferentes açúcares: B) Maltose 20 g.L-1, C) Frutose 20 g.L-1, D) Glicose 20 g.L-1, E) Sacarose 20 g.L-1 e F) Xilose 40 g.L-1.[20] Figure 2. Growth of EBY-Transporter strains on solid medium containing only one sugar as a carbon source. A) Schematic model of plating and dilutions made from a pre-inoculum. The different sugars were tested:
[21] Figura 3. Capacidade de internalização de xilose por linhagens de S. cerevisiae transformadas com genes putativos para transportadores de xilose. As barras de erro representam as variações entre as triplicatas. Azul: 30 minutos, vermelho: 60 minutos, verde: 120 minutos, roxo: 24 horas.[21] Figure 3. Xylose uptake capacity by S. cerevisiae strains transformed with putative genes for xylose transporters. Error bars represent variations between triplicates. Blue: 30 minutes, red: 60 minutes, green: 120 minutes, purple: 24 hours.
[22] Figura 4. Eletroforese com os produtos da PCR de colônia para confirmação da presença dos genes XYLA, XKS1 e Saico na levedura EBY-XIXK-Saico. (A) Amplificação dos genes XYLA e XKS. Os controles positivos utilizados foram os plasmídeos p424-XI e p426-XK. (B) Amplificação dos genes XYLA e Saico a partir do promotor GPD e terminador CYC. Como controle positivo foi utilizado o plasmídeo p425-Saico, construído nesse trabalho. A colônia 3 revelou todas as bandas esperadas, do mesmo tamanho que os controles utilizados. O marcador molecular utilizado foi o GeneRuler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific).[22] Figure 4. Electrophoresis with colony PCR products to confirm the presence of XYLA, XKS1 and Saico genes in EBY-XIXK-Saico yeast. (A) Amplification of XYLA and XKS genes. The positive controls used were plasmids p424-XI and p426-XK. (B) Amplification of XYLA and Saico genes from GPD promoter and CYC terminator. The plasmid p425-Saico, constructed in this work, was used as a positive control. Colony 3 revealed all expected bands, the same size as the controls used. The molecular marker used was the GeneRuler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific).
[23] Figura 5. Cofermentação com as linhagens EBY-XIXK-Saico (A, B, C e D) e EBY-XIXK-p425Ø (E, F, G e H). As fermentações foram realizadas em frasco e sob as condições: 28°C e 200 rpm em meio sintético com a adição de glicose e xilose em diferentes concentrações. As barras de erros representam as variações entre as triplicatas. Biomassa (preto, círculo), Etanol (laranja, losango), Glicose (quadrado, verde), Xilitol (azul, triângulo) e Xilose (vermelho, triângulo).[23] Figure 5. Cofermentation with EBY-XIXK-Saico (A, B, C and D) and EBY-XIXK-p425Ø (E, F, G and H) strains. Fermentations were carried out in a flask and under the conditions: 28°C and 200 rpm in synthetic medium with the addition of glucose and xylose at different concentrations. Error bars represent variations between triplicates. Biomass (black, circle), Ethanol (orange, diamond), Glucose (square, green), Xylitol (blue, triangle) and Xylose (red, triangle).
[24] Figura 6. Consumo de açúcar e formação de produtos em linhagem expressando transportador Saico e controle após 72h de fermentação.[24] Figure 6. Sugar consumption and product formation in lineage expressing Saico transporter and control after 72h of fermentation.
[25] Figura 7. Cinética de fermentação com linhagens EBY-XIXK-Saico (superior) e controle (inferior) em meio contendo hidrolisado de bagaço de cana de açúcar.[25] Figure 7. Fermentation kinetics with EBY-XIXK-Saico (upper) and control (lower) lines in medium containing sugarcane bagasse hydrolyzate.
[26] A produção eficiente de combustíveis, especificamente etanol, e de produtos químicos a partir de biomassa lignocelulósica depende da rápida cofermentação de glicose e xilose. A levedura S. cerevisiae é o organismo usado industrialmente para produção de etanol pela fermentação de caldos contendo principalmente sacarose como, por exemplo, caldo de cana-de-açúcar. Entretanto, essa espécie de levedura não metaboliza pentoses, particularmente xiloses, de maneira eficiente. Embora existam leveduras que fermentam pentoses, elas não possuem as vantagens da S. cerevisiae que fizeram dela a mais importante levedura em escala industrial. Portanto, o desenvolvimento de processos de fermentação de pentose está baseado em linhagens de S. cerevisiae geneticamente modificadas com vias metabólicas heterólogas de xilose, incluindo transportadores de pentoses heterólogos.[26] The efficient production of fuels, specifically ethanol, and chemicals from lignocellulosic biomass depends on the rapid cofermentation of glucose and xylose. The yeast S. cerevisiae is the organism used industrially for the production of ethanol by the fermentation of juices containing mainly sucrose, such as sugarcane juice. However, this yeast species does not efficiently metabolize pentoses, particularly xyloses. Although there are yeasts that ferment pentoses, they do not have the advantages of S. cerevisiae that made it the most important yeast on an industrial scale. Therefore, the development of pentose fermentation processes is based on genetically modified S. cerevisiae strains with heterologous xylose metabolic pathways, including heterologous pentose transporters.
[27] Desta forma, com o objetivo de promover a utilização de pentoses por S. cerevisiae na fermentação de hidrolisados de biomassa lignocelulósica, transportadores de pentoses foram usados no desenvolvimento de linhagens recombinantes de S. cerevisiae expressando estes transportadores, para aplicação na cofermentação de glicose e xilose.[27] Thus, in order to promote the use of pentoses by S. cerevisiae in the fermentation of lignocellulosic biomass hydrolysates, pentose transporters were used in the development of recombinant strains of S. cerevisiae expressing these transporters, for application in the cofermentation of glucose and xylose.
[28] No contexto da presente descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso alguns deles serão mais bem detalhados a seguir.[28] In the context of this description, numerous terms will be used and therefore some of them will be further detailed below.
[29] O termo “ácido nucleico” refere-se a uma molécula a qual pode ser fita simples ou fita dupla, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, um fosfato e uma base purina ou pirimidina. Um “fragmento de ácido nucleico” é uma fração de uma dada molécula de ácido nucleico. “Complementariedade” refere-se ao pareamento específico de bases purinas e pirimidinas que consistem de ácidos nucleicos: pares de adenina com timina e pares de guanina com citosina. Então, o “complemento” de um primeiro fragmento de ácido nucleico refere-se ao segundo fragmento de ácido nucleico cuja sequência de nucleotídeos é complementar à primeira sequência de nucleotídeos.[29] The term “nucleic acid” refers to a molecule which can be single-stranded or double-stranded, composed of monomers (nucleotides) containing a sugar, a phosphate, and a purine or pyrimidine base. A "nucleic acid fragment" is a fraction of a given nucleic acid molecule. "Complementarity" refers to the specific pairing of purine and pyrimidine bases that consist of nucleic acids: adenine-thymine pairs and guanine-cytosine pairs. Thus, the "complement" of a first nucleic acid fragment refers to the second nucleic acid fragment whose nucleotide sequence is complementary to the first nucleotide sequence.
[30] Em organismos mais complexos, o ácido desoxirribonucleico (DNA) é um ácido nucléico que contém a informação do material genético de um dado organismo, enquanto o ácido ribonucleico (RNA) é um ácido nucléico que está envolvido na transferência da informação do DNA em proteínas. Um “genoma” é toda parte principal do material genético contida em cada célula de um organismo. O termo “sequência de nucleotídeo” refere-se às sequências de polímeros de nucleotídeos, formando uma fita de DNA ou RNA, as quais podem ser simples ou dupla-fita, opcionalmente sintéticas, não naturais ou com bases de nucleotídeos alteradas capazes de incorporação dentro de polímeros de DNA ou RNA. O termo “oligômero” refere-se a sequências curtas de nucleotídeos, usualmente até 100 bases de comprimento. O termo “homólogo” faz referência à ligação ancestral entre as sequências de nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucleico ou entre as sequências de aminoácidos de duas moléculas de proteínas. A estimativa de tal homologia é provida através da hibridização de DNA-DNA ou RNA-RNA sob condições de estringência como definido no estado da técnica (como mencionado no documento US20030074685, Hames, B. D. and Higgins, S. J. (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press Oxford, U.K); ou pela comparação de similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou proteína (como mencionado no documento US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).[30] In more complex organisms, deoxyribonucleic acid (DNA) is a nucleic acid that contains information from the genetic material of a given organism, while ribonucleic acid (RNA) is a nucleic acid that is involved in the transfer of information from DNA into proteins. A “genome” is every major part of the genetic material contained in every cell in an organism. The term "nucleotide sequence" refers to polymer sequences of nucleotides, forming a strand of DNA or RNA, which may be single or double-stranded, optionally synthetic, unnatural or with altered nucleotide bases capable of incorporation into of DNA or RNA polymers. The term "oligomer" refers to short nucleotide sequences, usually up to 100 bases in length. The term "homologous" refers to the ancestral linkage between the nucleotide sequences of two nucleic acid molecules or between the amino acid sequences of two protein molecules. Estimation of such homology is provided by hybridizing DNA-DNA or RNA-RNA under stringent conditions as defined in the prior art (as mentioned in US20030074685, Hames, BD and Higgins, SJ (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press Oxford, UK); or by comparing sequence similarity between two nucleic acid or protein molecules (as mentioned in US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).
[31] “Gene” refere-se ao fragmento de nucleotídeo que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedentes (região 5’ não traduzida) e posteriores (região 3’ não traduzida) à região codificadora. “Gene endógeno” refere-se ao gene nativo normalmente encontrado em sua localização natural no genoma e não é isolado. Um “gene exógeno” refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido por transferência gênica. “Pseudogene” refere-se a uma sequência nucleotídica que não codifica uma enzima funcional.[31] "Gene" refers to the nucleotide fragment that expresses a specific protein, including regulatory sequences preceding (5' untranslated region) and later (3' untranslated region) the coding region. "Endogenous gene" refers to the native gene normally found in its natural location in the genome and is not isolated. An “exogenous gene” refers to a gene that is not normally found in the host organism but is introduced by gene transfer. "Pseudogene" refers to a nucleotide sequence that does not encode a functional enzyme.
[32] “Sequência codificadora” refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma “sequência codificadora interrompida” significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais íntrons ligados através de junções). Um “íntron” é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de clivagem e a religação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína.[32] “Coding sequence” refers to the DNA sequence that encodes a specific protein and excludes the non-coding sequence. An "interrupted coding sequence" means the sequence that acts as a separator (for example, one or more introns linked through junctions). An “intron” is a nucleotide sequence that is transcribed and is present in pre-mRNA, but is removed through cleavage and religation of the mRNA within the cell generating a mature mRNA that can be translated into a protein.
[33] O termo “vetor” diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores, mas não limitados, são os vetores pKannibal (Wesley SV, Heliwell CA, Smith NA, Wang M, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green A G, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and highthroughput Gene silencing in plants. Plant J. 27:581590) pGLYP, pAC321, série pCambia (BioForge Co.), pBI121 (Chen, Po-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching; To, Kin-Ying. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. . Molecular Breeding vol. 11 issue 4 May 2003. p. 287-293), pBSK (Addgene Co.), pGEMT easy (Promega Corporation), pET101/ D-TOPO (Invitrogen), p424-GPD de E. coli (ATCC 87357), p425 de E. coli (ATCC 87359), p426-GPD de E.coli (ATCC 87369). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).[33] The term “vector” refers to a replicon, such as a plasmid, phage, or virus, to which other genetic sequences or elements (be they DNA or RNA) can be linked. In this way, genes can be replicated along with the vector. Such vectors are commercially available, including those supplied by Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) and Promega (Madison, Wis.). Some examples of vectors, but not limited to, are pKannibal vectors (Wesley SV, Heliwell CA, Smith NA, Wang M, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput Gene silencing in plants. Plant J. 27:581590) pGLYP, pAC321, pCambia series (BioForge Co.), pBI121 (Chen, Po-Yen; Wang, Chen-Kuen; Soong, Shaw-Ching; To, Kin-Ying. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Molecular Breeding vol. 11 issue 4 May 2003. p. -293), pBSK (Addgene Co.), pGEMT easy (Promega Corporation), pET101/D-TOPO (Invitrogen), E. coli p424-GPD (ATCC 87357), E. coli p425 (ATCC 87359), p426 -GPD of E. coli (ATCC 87369). Obtaining recombinant vectors comprising promoters linked to nucleic acids is known in the state of the art and can be found in Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D.W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
[34] “Promotor” refere-se à sequência de DNA em um gene, usualmente localizada a montante da sequência codificadora, a qual controla a expressão da sequência codificadora promovendo o reconhecimento pela RNA polimerase e outros fatores requeridos para a própria transcrição. Promotores podem também conter sequências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteínas as quais controlam o efeito do início da transcrição em resposta a condições fisiológicas ou de desenvolvimento. “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos do organismo e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimento-específicos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese.[34] "Promoter" refers to the DNA sequence in a gene, usually located upstream of the coding sequence, which controls the expression of the coding sequence by promoting recognition by RNA polymerase and other factors required for transcription itself. Promoters may also contain DNA sequences that are involved in the binding of protein factors which control the effect of transcription initiation in response to physiological or developmental conditions. "Constitutive promoters" refer to those that drive gene expression in all tissues of the body and throughout time. "Tissue-specific" or "development-specific" promoters are those that drive gene expression almost exclusively in specific tissues, such as leaves, roots, stems, flowers, fruits or seeds, or at specific stages of development in a tissue, as at the beginning or end of embryogenesis.
[35] O termo “expressar” ou “codificar” refere-se à transcrição de uma dada sequência de DNA. Mais especificamente nessa invenção, refere-se à transcrição de genes de proteínas transportadoras de pentoses.[35] The term “express” or “encode” refers to the transcription of a given DNA sequence. More specifically in this invention, it relates to the transcription of pentose transporter protein genes.
[36] “Transformação” refere-se a transferência do gene exógeno para dentro do genoma de um organismo hospedeiro e sua consequente inclusão na herança geneticamente estável.[36] “Transformation” refers to the transfer of the exogenous gene into the genome of a host organism and its consequent inclusion in genetically stable inheritance.
[37] “Leveduras” referem-se a organismos unicelulares, microscópicos, heterotróficos pertencentes ao Reino Fungii.[37] “Yeasts” refer to unicellular, microscopic, heterotrophic organisms belonging to the Kingdom Fungii.
[38] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico com sequência possuindo pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 7.[38] In a first aspect, the present invention relates to a recombinant yeast comprising a nucleic acid molecule with sequence having at least 95% identity with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7.
[39] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico com sequência idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 7. Em um escopo preferido, a levedura recombinante compreende a molécula de ácido nucleico descrita em SEQ ID NO:1. Em um escopo mais preferido, a levedura recombinante compreende sequência de nucleotídeos degenerada de sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 7 codificando uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9. Em um aspecto particular, a levedura recombinante codifica uma proteína transportadora de pentose.[39] In a second aspect, the invention relates to a recombinant yeast comprising a nucleic acid molecule with sequence identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO : 7. In a preferred scope, the recombinant yeast comprises the nucleic acid molecule described in SEQ ID NO:1. In a more preferred scope, the recombinant yeast comprises degenerate nucleotide sequence of sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7 encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9. In a particular aspect, the recombinant yeast encodes a pentose transporter protein.
[40] Outra concretização da invenção refere-se a uma levedura recombinante que compreende uma molécula de polipetídeo cuja sequência de aminoácidos possui pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9.[40] Another embodiment of the invention relates to a recombinant yeast comprising a polypeptide molecule whose amino acid sequence has at least 95% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 6 and SEQ ID NO: 9.
[41] Em outro aspecto da invenção, a levedura recombinante compreende uma molécula de polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos seja selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9. Preferencialmente, a levedura recombinante é caracterizada por a molécula de polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 3. De modo mais preferencial, a molécula de polipeptídeo da levedura recombinante é uma proteína transportadora de pentose. Em um modo ainda mais preferencial, a levedura recombinante da presente invenção é caracterizada pelo transportador de pentose permitir o coconsumo de hexose e pentose.[41] In another aspect of the invention, the recombinant yeast comprises a polypeptide molecule whose amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9. Preferably, the recombinant yeast is characterized in that the polypeptide molecule comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. More preferably, the recombinant yeast polypeptide molecule is a pentose transporter protein. In an even more preferential way, the recombinant yeast of the present invention is characterized by the pentose transporter allowing the co-consumption of hexose and pentose.
[42] A levedura recombinante da presente invenção é uma Saccharomyces spp. Preferencialmente, a levedura recombinante é uma Saccharomyces cerevisiae.[42] The recombinant yeast of the present invention is a Saccharomyces spp. Preferably, the recombinant yeast is a Saccharomyces cerevisiae.
[43] Adicionalmente, as linhagens de leveduras de acordo com a invenção também podem ser obtidas a partir de outras espécies de leveduras, não se restringindo apenas à Saccharomyces cerevisiae. Outras espécies de leveduras incluem, sem limitações, Candida boidinii, Enteroramus dimorphus, Candida jeffriesii, Debaryomyces hansenii, Candida Guillermondii, Candida shehatae, Brettanomyces naardensis, Candida guillermondii, Candida lyxosophilia, Candida intermedia, Candida tenuis, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces thermotolerans, Pachysolen tannophilus, Komagataella phaffii, Pichia segobiensis e Spathaspora passalidarum.[43] Additionally, the yeast strains according to the invention can also be obtained from other yeast species, not restricted to Saccharomyces cerevisiae. Other yeast species include, without limitation, Candida boidinii, Enteroramus dimorphus, Candida jeffriesii, Debaryomyces hansenii, Candida Guillermondii, Candida shehatae, Brettanomyces naardensis, Candida guillermondii, Candida lyxosophilia, Candida intermedia, Candida tenuis, Hansenula polyvermondii, Kluynuveromyces , Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces thermotolerans, Pachysolen tannophilus, Komagataella phaffii, Pichia segobiensis and Spathaspora passalidarum.
[44] Em outro aspecto, a invenção está relacionada com o uso de uma levedura recombinante de acordo com a invenção para a fermentação de um mosto compreendendo pentoses. Em um aspecto preferencial, a fermentação é para a produção de etanol, xilitol ou ácidos orgânicos.[44] In another aspect, the invention is related to the use of a recombinant yeast according to the invention for the fermentation of a wort comprising pentoses. In a preferred aspect, the fermentation is for the production of ethanol, xylitol or organic acids.
[45] O mosto compreendendo pentoses é proveniente de hidrolisado de toda ou de parte de biomassa lignocelulósica. O hidrolisado de toda ou de parte da biomassa lignocelulósica pode ser obtido por uma etapa de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, eventualmente seguida por uma etapa de hidrólise parcial ou total de polímeros de açúcar, por via enzimática e/ou química e/ou térmica.[45] The wort comprising pentoses comes from the hydrolyzate of all or part of lignocellulosic biomass. The hydrolyzate of all or part of the lignocellulosic biomass can be obtained by a pre-treatment step of the lignocellulosic biomass, possibly followed by a step of partial or total hydrolysis of sugar polymers, enzymatic and/or chemical and/or thermal .
[46] O hidrolisado de todo ou de parte de biomassa lignocelulósica compreende assim uma mistura de açúcares provenientes da hidrólise de polímeros de açúcares, tais como a celulose e a hemicelulose. A mistura de açúcares inclui hexoses e pentoses, preferencialmente glicose e xilose.[46] The hydrolyzate of all or part of lignocellulosic biomass thus comprises a mixture of sugars from the hydrolysis of sugar polymers, such as cellulose and hemicellulose. The mixture of sugars includes hexoses and pentoses, preferably glucose and xylose.
[47] Os ácidos orgânicos podem incluir ácido acético, ácido lático, ácido fórmico, ácido málico, ácido succínico e ácido fumárico.[47] Organic acids can include acetic acid, lactic acid, formic acid, malic acid, succinic acid, and fumaric acid.
[48] A invenção também se refere a um método de converter pelo menos uma parte de uma fonte de carbono em um composto com valor agregado, compreendendo uma levedura recombinante na presença de fonte de carbono bruto, caracterizado pelas seguintes etapas:
- a) crescimento da levedura recombinante em meio seletivo;
- b) inoculação da levedura recombinante de (a) em alta densidade celular em uma fonte de carbono;
- c) fermentação de pelo menos uma parte da fonte de carbono de (b) para obtenção de um composto com valor agregado;
- d) recuperação de um composto com valor agregado do produto da fermentação de (c).
- a) growth of recombinant yeast in selective medium;
- b) inoculation of the recombinant yeast from (a) at high cell density into a carbon source;
- c) fermentation of at least a part of the carbon source of (b) to obtain a value-added compound;
- d) recovery of a value-added compound from the fermentation product of (c).
[49] Em um modo preferencial, o método de converter pelo menos uma parte de uma fonte de carbono em um composto com valor agregado é caracterizado por compreender uma molécula de polipetídeo cuja sequência de aminoácidos possui pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9. De um modo mais preferencial, a fonte de carbono compreende hexose e pentose. De um modo ainda mais preferencial, a fonte de carbono é selecionada do grupo consistindo de biomassa vegetal, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido urbano, resíduo de papel ou resíduo de industrial.[49] In a preferred mode, the method of converting at least a part of a carbon source into a value-added compound is characterized by comprising a polypeptide molecule whose amino acid sequence has at least 95% identity with a sequence of amino acids selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9. More preferably, the carbon source comprises hexose and pentose. Even more preferably, the carbon source is selected from the group consisting of plant biomass, herbaceous material, agricultural waste, forestry waste, municipal solid waste, paper waste or industrial waste.
[50] O composto de valor agregado obtido pelo método da presente invenção é um biocombustível. Preferencialmente, o composto de valor agregado é etanol. Em outro modo preferencial, o composto de valor agregado é xilitol ou um ácido orgânico.[50] The value-added compound obtained by the method of the present invention is a biofuel. Preferably, the value-added compound is ethanol. In another preferred mode, the value-added compound is xylitol or an organic acid.
[51] De um modo ainda mais preferencial, o método de converter pelo menos uma parte de uma fonte de carbono em um composto com valor agregado é caracterizado por a levedura recombinante compreender pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína transportadora de pentose. De modo muito mais preferencial, a levedura recombinante compreende pelo menos um gene codificando uma proteína cuja sequência de aminoácidos é idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9.[51] Even more preferably, the method of converting at least a part of a carbon source into a value-added compound is characterized in that the recombinant yeast comprises at least one nucleic acid molecule encoding a pentose transporter protein. Most preferably, the recombinant yeast comprises at least one gene encoding a protein whose amino acid sequence is identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9 .
[52] Outra modalidade da invenção está relacionada com o uso de um polipeptídeo que compreenda qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9 para promover aumento no uso de pentoses pela levedura recombinante. Preferencialmente, a pentose é uma xilose. Mais preferencialmente, a célula hospedeira é de espécie selecionada de grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae, Candida boidinii, Enteroramus dimorphus, Candida jeffriesii, Debaryomyces hansenii, Candida Guillermondii, Candida shehatae, Brettanomyces naardensis, Candida guillermondii, Candida lyxosophilia, Candida intermedia, Candida tenuis, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces thermotolerans, Pachysolen tannophilus, Komagataella phaffii, Pichia segobiensis e Spathaspora passalidarum.[52] Another embodiment of the invention relates to the use of a polypeptide comprising any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9 to promote increased use of pentoses by recombinant yeast. Preferably, the pentose is a xylose. Most preferably, the host cell is a species selected from the group consisting of Saccharomyces cerevisiae, Candida boidinii, Enteroramus dimorphus, Candida jeffriesii, Debaryomyces hansenii, Candida Guillermondii, Candida shehatae, Brettanomyces naardensis, Candida guillermondii, Candida lyxosophilia, Candida intermedia Hansenula polymorpha, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces thermotolerans, Pachysolen tannophilus, Komagataella phaffii, Pichia segobiensis and Spathaspora passalidarum.
[53] Os exemplos a seguir destinam-se a compreender melhor a invenção. Estes exemplos não limitam a invenção de modo algum.[53] The following examples are intended to better understand the invention. These examples do not limit the invention in any way.
[54] Transportadores de açúcares são proteínas de membrana que permitem o transporte de moléculas de açúcares do meio extracelular para o citoplasma celular. O transportador Saico1 foi demonstrado ser funcional em S. cerevisiae na linhagem EBY.VW4000, a qual possui uma série de deleções no genoma para transportadores de açúcar. O uso dessa linhagem facilita a demonstração ou não da funcionalidade de um determinado transportador.[54] Sugar transporters are membrane proteins that allow the transport of sugar molecules from the extracellular medium to the cell cytoplasm. The Saico1 transporter has been shown to be functional in S. cerevisiae in the EBY.VW4000 strain, which has a series of deletions in the genome for sugar transporters. The use of this lineage facilitates the demonstration or not of the functionality of a given transporter.
[55] As transformações de levedura foram realizadas por choque térmico. O protocolo utilizado foi adaptado de Gietz & Schiestl (GIETZ RD1, SCHIESTL RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2(1): 31- 4. 2007). Foi feito um pré-inóculo de S. cerevisiae em 5 mL de meio YPM, que foi incubado overnight a 28°C e 200 rpm. No dia seguinte, 1 mL do pré-inóculo foi inoculado em 50 mL de YPM. As células foram crescidas por 3 gerações para alcançarem a densidade celular desejada. Após centrifugação a 4000 rpm por 5 minutos, as células foram ressuspendidas em água estéril e alíquotas de 1 mL foram feitas em tubos eppendorf de 1,5 mL. As alíquotas foram centrifugadas à velocidade máxima em centrífuga de bancada, o sobrenadante foi cuidadosamente descartado. O pellet foi ressuspendido em 1 mL de LiAc 100 mM e incubado a 30°C por 15 minutos. Após a incubação, a suspensão foi centrifugada, o sobrenadante retirado e foram adicionados, nessa ordem: 240 µL de PEG (50% p/v), 36 µL de LiAc 1 M, 52 µL de ssDNA 2 mg/mL, 30 µL de água Milli-Q e 400-700 ng de DNA a ser utilizado. Após a adição dos reagentes, a suspensão foi vortexada vigorosamente, incubada a 30°C por 30 minutos, seguido por uma incubação de 20 minutos a 42°C. Em seguida, as células foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido e o pellet foi ressuspendido em água estéril e incubado a 30°C por 2 horas. As células foram então plaqueadas em meio de seleção adequado.[55] Yeast transformations were performed by heat shock. The protocol used was adapted from Gietz & Schiestl (GIETZ RD1, SCHIESTL RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2(1): 31- 4. 2007). A pre-inoculum of S. cerevisiae was made in 5 mL of YPM medium, which was incubated overnight at 28°C and 200 rpm. The next day, 1 ml of the pre-inoculum was inoculated into 50 ml of YPM. Cells were grown for 3 generations to reach the desired cell density. After centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, cells were resuspended in sterile water and 1 mL aliquots were made in 1.5 mL eppendorf tubes. Aliquots were centrifuged at maximum speed in a benchtop centrifuge, the supernatant carefully discarded. The pellet was resuspended in 1 ml of 100 mM LiAc and incubated at 30°C for 15 minutes. After incubation, the suspension was centrifuged, the supernatant removed and added, in that order: 240 µL of PEG (50% w/v), 36 µL of 1 M LiAc, 52 µL of ssDNA 2 mg/mL, 30 µL of Milli-Q water and 400-700 ng of DNA to be used. After addition of reagents, the suspension was vortexed vigorously, incubated at 30°C for 30 minutes, followed by a 20-minute incubation at 42°C. Then, the cells were centrifuged, the supernatant was removed and the pellet was resuspended in sterile water and incubated at 30°C for 2 hours. Cells were then plated on appropriate selection medium.
[56] A seleção de transformantes foi feita por meio de seleção auxotrófica no caso de leveduras ou pela resistência a antibiótico, para a seleção de bactérias. Também foram realizadas reações de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de colônia. Para bactérias, uma colônia foi inoculada diretamente no tubo de reação de PCR e as etapas de desnaturação foram feitas a 98°C. Para leveduras, as colônias foram inoculadas inicialmente em 10 µL de NaOH 0,02M em tubo de PCR incubados a 99°C por 10 minutos. Após a incubação, os tubos foram centrifugados por 2 minutos em centrífuga de bancada. 2 µL dos sobrenadantes foram utilizados como DNA molde. Os oligonucleotídeos estão especificados na Tabela 2 e a estratégia de expressão e confirmação de clonagem é mostrada na Figura 1.[56] Transformant selection was done by auxotrophic selection in the case of yeasts or by antibiotic resistance for bacterial selection. Colony PCR (Polymerase Chain Reaction) reactions were also performed. For bacteria, a colony was inoculated directly into the PCR reaction tube and the denaturation steps were performed at 98°C. For yeasts, colonies were initially inoculated in 10 µL of 0.02M NaOH in a PCR tube incubated at 99°C for 10 minutes. After incubation, the tubes were centrifuged for 2 minutes in a bench centrifuge. 2 µl of supernatants were used as template DNA. The oligonucleotides are specified in Table 2 and the expression and cloning confirmation strategy is shown in Figure 1.
[57] Três genes putativos foram utilizados para transformação de células de levedura: 132|Torde1, oriundo de Torulaspora delbrueckii, 23154|Canta1, gene pertencente a Candida tanzawensis e 63870|Saico1, de Saitoella complicata. As sequências naturais de cada gene de transportador foram otimizadas para expressão em levedura. A Tabela 1 a seguir apresenta características dos genes e a identificação de suas sequencias, naturais e otimizadas.
Tabela 1. Genes utilizados para geração de leveduras geneticamente modificadas.
Table 1. Genes used to generate genetically modified yeasts.
[58] O transportador Hxt11 (SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11) de S. cerevisae (SHIN, H. Y., NIJLAND, J. G., DE WAAL, P. P., DE JONG, R. M., KLAASSEN, P., DRIESSEN, A. J. An engineered cryptic Hxt11 sugar transporter facilitates glucose– xylose co-consumption in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for biofuels, 8(1), 176, 2015), que apresenta potencial para a utilização no aproveitamento de hidrolisados lignocelulósicos, por meio de cofermentação dos açúcares devido sua maior afinidade por xilose do que por glicose, foi utilizado como parâmetro nas análises de desempenho dos transportadores selecionados.[58] The Hxt11 transporter (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11) from S. cerevisae (SHIN, HY, NIJLAND, JG, DE WAAL, PP, DE JONG, RM, KLAASSEN, P., DRIESSEN, AJ An engineered cryptic Hxt11 sugar transporter facilitates glucose–xylose co-consumption in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for biofuels, 8(1), 176, 2015), which has potential for use in the exploitation of lignocellulosic hydrolysates through co-fermentation of sugars due to its greater affinity for xylose than for glucose was used as a parameter in the performance analysis of selected transporters.
[59] Os genes de transportadores foram sintetizados por empresa privada (GenOne Biotechnologies).[59] The transporter genes were synthesized by a private company (GenOne Biotechnologies).
[60] Para expressão em S. cerevisiae, os genes foram clonados em plasmídeo epissomal de expressão p425 de E. coli (ATCC 87359), controlado pelo promotor constitutivo GPD e terminador Cyc (MUMBERG D, MÜLLER R, FUNK M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene, 156(1), 119-22, 1995), resultando nas construções p425-GPD-Saico (SEQ ID NO: 16), p425-GPD-Canta (SEQ ID NO: 17), p425-GPD-Torde (SEQ ID NO: 18) e p425-GPD-Hxt11 (SEQ ID NO: 19).[60] For expression in S. cerevisiae, genes were cloned into E. coli p425 episomal expression plasmid (ATCC 87359), controlled by the constitutive GPD promoter and Cyc terminator (MUMBERG D, MÜLLER R, FUNK M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene, 156(1), 119-22, 1995), resulting in the constructions p425-GPD-Saico (SEQ ID NO: 16), p425-GPD-Canta (SEQ ID NO: :17), p425-GPD-Torde (SEQ ID NO:18) and p425-GPD-Hxt11 (SEQ ID NO:19).
[61] Após a construção dos plasmídeos, foi realizada a transformação desses vetores na levedura S. cerevisiae EBY.VW4000. Em um primeiro momento, os plasmídeos p425- GPD abrigando os genes de transportadores foram inseridos juntamente com o plasmídeo p424-GPD de E. coli (ATCC 87357), sendo os transformantes selecionados em meio YNBM + Histidina + Uracila. O plasmídeo p424-GPD foi utilizado na transformação para evitar a necessidade de suplementar o meio com triptofano. Foram então geradas 4 novas linhagens EBY-Transportador (EBY-Hxt11, EBY-Canta, EBY-Saico e EBYTorde), além de uma levedura controle negativo com os plasmídeos p424-GPD e p425- GPD vazios, ou seja, sem genes codificantes para transportadores (EBY-p425Ø).
Tabela 2. Oligonucleotídeos utilizados nesse trabalho
Table 2. Oligonucleotides used in this work
[62] As linhagens de S. cerevisiae EBY-Hxt11, EBY-Canta, EBY-Saico, EBY-Torde e EBY-p425Ø foram analisadas quanto sua capacidade de crescimento em diferentes fontes de carbono. Em um momento inicial, essas leveduras foram inoculadas, em diluições seriadas, em placas contendo meio mínimo, os aminoácidos suplementares e apenas uma fonte de carbono, sendo elas: frutose, glicose, maltose, sacarose e xilose. Para tal, a partir de células recém-plaqueadas, as leveduras foram crescidas em 5 mL de meio YNBMHU por 24 horas. Foram feitas duas lavagens e as células foram ressuspendidas em água para a DO600nm final ser igual a 2. Foram feitas diluições seriadas de 10, 100 e 1000x. Dessas diluições, foram plaqueados 20 µL em placas contendo os meios sólidos desejados: YNB suplementado com histidina e uracila, contendo como fonte de carbono 20 g.L-1 de maltose, ou de frutose, ou de glicose, ou de sacarose, ou 40 g.L-1 de xilose. As placas foram mantidas em estufa a 28°C. Após 7 dias de crescimento, as placas foram analisadas por contador de colônia automático Scan® 1200 (InterscienceTM) e fotografadas utilizando o software Scan®, da mesma marca.[62] The strains of S. cerevisiae EBY-Hxt11, EBY-Canta, EBY-Saico, EBY-Torde and EBY-p425Ø were analyzed for their capacity to grow on different carbon sources. Initially, these yeasts were inoculated, in serial dilutions, in plates containing minimal medium, supplementary amino acids and only one carbon source, namely: fructose, glucose, maltose, sucrose and xylose. For this purpose, from newly plated cells, yeasts were grown in 5 ml of YNBMHU medium for 24 hours. Two washes were done and the cells were resuspended in water so that the final OD600nm was equal to 2. Serial dilutions of 10, 100 and 1000x were made. From these dilutions, 20 µL were plated on plates containing the desired solid media: YNB supplemented with histidine and uracil, containing as a
[63] Como esperado, todas as linhagens conseguiram crescer em maltose, uma vez que o transporte desse açúcar ocorre através de transportadores específicos, codificados por genes MALX1 (X representa um dos cinco loci MAL presente em S. cerevisiae) presentes na levedura e, portanto, não depende dos transportadores deletados (Figura 2 B). Foi então observado que, quando avaliado o crescimento em glicose e sacarose, apenas as linhagens contendo os transportadores Canta e Saico apresentaram capacidade de crescimento (Figura 2D e E).[63] As expected, all strains were able to grow on maltose, as the transport of this sugar occurs through specific transporters, encoded by MALX1 genes (X represents one of the five MAL loci present in S. cerevisiae) present in yeast and, therefore, it does not depend on the deleted transporters (Figure 2B). It was then observed that, when the growth in glucose and sucrose was evaluated, only the strains containing the transporters Canta and Saico showed growth capacity (Figure 2D and E).
[64] Quando analisados sob a disponibilidade de frutose ou xilose como fonte de carbono, nenhuma linhagem apresentou crescimento (Figura 2C e F). É importante lembrar que nesta etapa a via de metabolismo de xilose não havia sido inserida nas leveduras, impossibilitando uma análise completa do funcionamento ou não dos transportadores para internalização dessa pentose. Como esperado, a linhagem controle negativo, construída com os plasmídeos p424-GPD e p425-GPD vazios, apresentou crescimento apenas na placa contendo maltose como única fonte de carbono. Confirmando que essa linhagem, sem a inserção de genes codificantes para transportadores, não é capaz de internalizar hexoses. (Figura 2).[64] When analyzed under the availability of fructose or xylose as a carbon source, no strains showed growth (Figure 2C and F). It is important to remember that, at this stage, the xylose metabolism pathway had not been inserted in yeasts, making it impossible to carry out a complete analysis of the functioning or not of the transporters for the internalization of this pentose. As expected, the negative control strain, constructed with the empty plasmids p424-GPD and p425-GPD, showed growth only on the plate containing maltose as the only carbon source. Confirming that this strain, without the insertion of genes encoding transporters, is not capable of internalizing hexoses. (Figure 2).
[65] Ensaios foram realizados com o objetivo de determinar a capacidade de internalização de xilose pelas linhagens construídas (HECTOR RE, QURESHI N, HUGHES SR, COTTA MA. Expression of a heterologous xylose transporter in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to utilize xylose improves aerobic xylose consumption. Appl Microbiol Biotechnol, 80(4), 675-84, 2008; DU J, LI S, ZHAO H. Discovery and characterization of novel d-xylose-specific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis. Mol Biosyst, 6(11), 2150-6, 2010; WANG C, BAO X, LI Y, JIAO C, HOU J, ZHANG Q, ZHANG W, LIU W, SHEN Y. Cloning and characterization of heterologous transporters in Saccharomyces cerevisiae and identification of important amino acids for xylose utilization. Metab Eng, 30, 79-88, 2015). Para tal, as leveduras foram recuperadas a partir de estoque de glicerol mantido a -80 °C e plaqueadas em meio sólido YNB contendo 2% de maltose e 100 µg.L-1 de histidina e uracila (YNBMHU). Nesse momento foram utilizadas as leveduras EBY-Transportador, nas quais os plasmídeos inseridos conferem a habilidade de produzir triptofano e uracila, suprindo as necessidades auxotróficas da linhagem. As placas foram incubadas em estufa a 28°C por 72 horas. Então, foram feitos pré-inóculos em 5 mL de meio YNBMHU e incubados a 28°C e 200 rpm por 48 horas. Os inóculos foram transferidos para 50 mL do mesmo meio. Após 24 horas de crescimento nas mesmas condições, as células foram centrifugadas, lavadas duas vezes com água destilada estéril e inoculadas em 50 mL de meio YNB + Xilose (40 g.L-1 ) + Histidina + Uracila em Erlenmeyer de 125 mL. As células foram crescidas a 28°C e 200 rpm, sendo retiradas alíquotas de 5 mL nos tempos: 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos e 24 horas após o inóculo. As alíquotas foram lavadas duas vezes em água destilada, ressuspendidas em água deionizada e mantidas em shaker a 37°C e 250 rpm durante 48 horas. A concentração celular durante o experimento foi de aproximadamente 1,5 g.L-1 . Os sobrenadantes das suspensões celulares foram analisados em HPLC. Xilose e xilitol foram medidos para a análise do açúcar acumulado intracelularmente. (HECTOR RE, QURESHI N, HUGHES SR, COTTA MA. Expression of a heterologous xylose transporter in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to utilize xylose improves aerobic xylose consumption. Appl Microbiol Biotechnol, 80(4), 675-84, 2008; Du J, Li S, Zhao H. Discovery and characterization of novel d-xylosespecific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis. Mol Biosyst, 6(11), 2150-6, 2010; Wang C, Bao X, Li Y, Jiao C, Hou J, Zhang Q, Zhang W, Liu W, Shen Y. Cloning and characterization of heterologous transporters in Saccharomyces cerevisiae and identification of important amino acids for xylose utilization. Metab Eng, 30, 79-88, 2015).[65] Assays were performed to determine the internalization capacity of xylose by the constructed strains (HECTOR RE, QURESHI N, HUGHES SR, COTTA MA. Expression of a heterologous xylose transporter in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use xylose improves aerobic aerobics xylose consumption. Appl Microbiol Biotechnol, 80(4), 675-84, 2008; DU J, LI S, ZHAO H. Discovery and characterization of novel d-xylose-specific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis. Mol Biosyst, 6( 11), 2150-6, 2010; WANG C, BAO X, LI Y, JIAO C, HOU J, ZHANG Q, ZHANG W, LIU W, SHEN Y. Cloning and characterization of heterologous transporters in Saccharomyces cerevisiae and identification of important amino acids for xylose utilization. Metab Eng, 30, 79-88, 2015). For this purpose, yeasts were recovered from a glycerol stock kept at -80 °C and plated on YNB solid medium containing 2% maltose and 100 µg.L-1 of histidine and uracil (YNBMHU). At that time, EBY-Transporter yeasts were used, in which the plasmids inserted confer the ability to produce tryptophan and uracil, supplying the auxotrophic needs of the strain. The plates were incubated in an oven at 28°C for 72 hours. Then, pre-inoculates were made in 5 mL of YNBMHU medium and incubated at 28°C and 200 rpm for 48 hours. Inocula were transferred to 50 ml of the same medium. After 24 hours of growth under the same conditions, the cells were centrifuged, washed twice with sterile distilled water and inoculated in 50 mL of YNB medium + Xylose (40 g.L-1 ) + Histidine + Uracil in a 125 mL Erlenmeyer flask. Cells were grown at 28°C and 200 rpm, and 5 ml aliquots were removed at times: 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes and 24 hours after inoculum. The aliquots were washed twice in distilled water, resuspended in deionized water and kept in a shaker at 37°C and 250 rpm for 48 hours. The cell concentration during the experiment was approximately 1.5 g.L-1. Supernatants from cell suspensions were analyzed on HPLC. Xylose and xylitol were measured for the analysis of intracellular accumulated sugar. (HECTOR RE, QURESHI N, HUGHES SR, COTTA MA. Expression of a heterologous xylose transporter in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use xylose improves aerobic xylose consumption. Appl Microbiol Biotechnol, 80(4), 675-84, 2008; Du J , Li S, Zhao H. Discovery and characterization of novel d-xylosespecific transporters from Neurospora crassa and Pichia stipitis. Mol Biosyst, 6(11), 2150-6, 2010; Wang C, Bao X, Li Y, Jiao C, Hou J, Zhang Q, Zhang W, Liu W, Shen Y. Cloning and characterization of heterologous transporters in Saccharomyces cerevisiae and identification of important amino acids for xylose utilization. Metab Eng, 30, 79-88, 2015).
[66] A análise de metabólitos em HPLC revelou que a linhagem EBY.VW4000 transformada com o plasmídeo contendo o transportador Saico apresentou uma capacidade de internalização de xilose consideravelmente maior que as outras linhagens (Figura 3).[66] HPLC analysis of metabolites revealed that the EBY.VW4000 strain transformed with the plasmid containing the Saico transporter had a considerably higher xylose internalization capacity than the other strains (Figure 3).
[67] A comparação das concentrações de xilose internalizada indica claramente que o transportador Saico atua no transporte de xilose. De fato, o acúmulo de xilose aumentou de 39,18 ± 0,52 mg.L-1 em 30 min para 75,67 ± 4,38 mg.L-1 em 24 horas (Figura 3).[67] Comparison of internalized xylose concentrations clearly indicates that the Saico transporter acts to transport xylose. In fact, xylose accumulation increased from 39.18 ± 0.52 mg.L-1 in 30 min to 75.67 ± 4.38 mg.L-1 in 24 hours (Figure 3).
[68] Apesar de ter sido responsável por recuperar o fenótipo de crescimento em glicose no crescimento em placa, o transportador Canta não apresentou capacidade de internalização de xilose nesse experimento (Figura 3).[68] Although it was responsible for recovering the glucose growth phenotype in plaque growth, the Canta transporter did not show the ability to internalize xylose in this experiment (Figure 3).
[69] Diferente do esperado, as linhagens EBY-Hxt11 e EBY-Torde não foram capazes de crescer em nenhum açúcar. Por ser o controle positivo desse trabalho, esperava-se que EBY-Hxt11 fosse capaz de crescer pelo menos em glicose, uma vez que esse fenótipo foi observado no trabalho que identificou esse transportador como um gene críptico pela primeira vez (SHIN HY, NIJLAND JG, DE WAAL PP, DE JONG RM, KLAASSEN P, DRIESSEN AJ. AN engineered cryptic Hxt11 sugar transporter facilitates glucose-xylose co-consumption in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Biofuels, 2, 8, 176, 2015). Como EBY-Torde contém o gene mais semelhante a Hxt11, era esperado que essa linhagem também apresentasse o fenótipo de crescimento. Tendo em vista esses resultados, os transportadores Canta e Saico foram escolhidos para serem utilizados nos próximos experimentos.[69] Unlike expected, the EBY-Hxt11 and EBY-Torde strains were not able to grow on any sugar. As the positive control of this work, it was expected that EBY-Hxt11 would be able to grow at least in glucose, since this phenotype was observed in the work that identified this transporter as a cryptic gene for the first time (SHIN HY, NIJLAND JG , DE WAAL PP, DE JONG RM, KLAASSEN P, DRIESSEN AJ. AN engineered cryptic Hxt11 sugar transporter facilitators glucose-xylose co-consumption in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Biofuels, 2, 8, 176, 2015). As EBY-Torde contains the gene most similar to Hxt11, it was expected that this strain would also have the growth phenotype. In view of these results, the Canta and Saico transporters were chosen to be used in the next experiments.
[70] A fim de confirmar a funcionalidade do transportador em levedura, a linhagem EBY.VW4000 foi transformada não apenas com o plasmídeo p425-GPD-Saico (SEQ ID NO: 16), como também com o plasmídeo p424-XI (SEQ ID NO: 20), constituído de plasmídeo p424-GPD de E.coli (ATCC 87357) contendo o gene xylA de Pyromyces sp. (SEQ ID NO: 12 q SEQ ID NO: 13), e o plasmídeo p426-XK (SEQ ID NO: 21), constituído de plasmídeo p426-GPD de E.coli (ATCC 87369) contendo o gene XKS1 de Saccharomyces cerevisiae I (SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15). A introdução dos genes xylA e XKS1 permite a utilização de xilose pelas leveduras por meio da via da Xilose Isomerase. Nesse passo, foram geradas 2 linhagens: EBY-XIXK-Saico, contendo a via de aproveitamento de xilose e o transportador Saico, e EBY-XIXK-p425Ø contendo os plasmídeos com a via da metabolização de xilose e o plasmídeo p425-GPD sem transportador. Primeiramente foram inseridos os plasmídeos contendo a via de metabolização da xilose, e em uma segunda transformação foi inserido o transportador e o plasmídeo p425Ø.[70] In order to confirm the functionality of the transporter in yeast, the EBY.VW4000 strain was transformed not only with the plasmid p425-GPD-Saico (SEQ ID NO: 16), but also with the plasmid p424-XI (SEQ ID NO: 20), consisting of plasmid p424-GPD from E.coli (ATCC 87357) containing the xylA gene from Pyromyces sp. (SEQ ID NO: 12 q SEQ ID NO: 13), and plasmid p426-XK (SEQ ID NO: 21), consisting of plasmid p426-GPD from E.coli (ATCC 87369) containing the XKS1 gene from Saccharomyces cerevisiae I (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15). The introduction of the xylA and XKS1 genes allows the use of xylose by yeasts through the Xylose Isomerase pathway. In this step, 2 strains were generated: EBY-XIXK-Saico, containing the xylose utilization pathway and the Saico transporter, and EBY-XIXK-p425Ø containing the plasmids with the xylose metabolization pathway and the p425-GPD plasmid without the transporter . First, plasmids containing the xylose metabolization pathway were inserted, and in a second transformation, the transporter and plasmid p425Ø were inserted.
[71] A confirmação da presença desses plasmídeos com os genes na nova linhagem foi realizada por meio de PCR de colônia. A Figura 4 exemplifica os dados para a linhagem EBY-XIXK-Saico, a qual expressa o transportador Saico. Nessa reação de PCR foram utilizados oligonucleotídeos que amplificam especificamente os genes xylA e XKS1. Além disso, foram utilizados oligonucleotídeos responsáveis por amplificar fragmentos a partir da porção terminal 3' do promotor GPD e da porção inicial 5' do terminador CYC, os quais estão na Tabela 2. Após o processo de PCR, uma análise eletroforética revelou, para um transformante, bandas condizentes aos tamanhos de fragmentos esperados (Figura 4).[71] Confirmation of the presence of these plasmids with the genes in the new lineage was performed using colony PCR. Figure 4 exemplifies the data for the EBY-XIXK-Saico lineage, which expresses the Saico transporter. In this PCR reaction, oligonucleotides that specifically amplify the xylA and XKS1 genes were used. In addition, oligonucleotides responsible for amplifying fragments from the 3' terminal portion of the GPD promoter and the initial 5' portion of the CYC terminator were used, which are shown in Table 2. After the PCR process, an electrophoretic analysis revealed, for a transformant, bands consistent with the expected fragment sizes (Figure 4).
[72] Dessa maneira, foi possível confirmar que os plasmídeos e genes foram corretamente inseridos nas leveduras transformadas. Os tamanhos esperados dos fragmentos são: 1,4 kb para o fragmento amplificando xylA e 1,8 kb para o fragmento de XKS1 (Figura 2A). Para a PCR de colônia amplificando o promotor GPD e terminador CYC, espera-se que a PCR amplifique dois fragmentos, um relativo ao gene xylA flanqueado por GPD e CYC e outro relativo ao gene Saico flanqueado pelo promotor e terminador (Figura 4B).[72] In this way, it was possible to confirm that plasmids and genes were correctly inserted into the transformed yeasts. Expected fragment sizes are: 1.4 kb for the fragment amplifying xylA and 1.8 kb for the XKS1 fragment (Figure 2A). For colony PCR amplifying the GPD promoter and CYC terminator, it is expected that the PCR amplify two fragments, one related to the xylA gene flanked by GPD and CYC and the other related to the Saico gene flanked by the promoter and terminator (Figure 4B).
[73] O desempenho da linhagem expressando EBY-XIXK-Saico em experimentos de fermentação com a presença glicose e xilose como fontes de carbono em meio definido (YNB – Sigma Aldrich) foi avaliado por meio de fermentações em batelada usando diferentes concentrações dos açúcares e altas densidades celulares (Figura 5). Os experimentos foram realizados em triplicata, sendo quatro fermentações utilizando as linhagens EBY-XIXK-Saico e EBY-XIXK-p425Ø. A DO600nm inicial utilizada nas fermentações variou de 13 a 20.[73] The performance of the strain expressing EBY-XIXK-Saico in fermentation experiments with glucose and xylose as carbon sources in defined medium (YNB – Sigma Aldrich) was evaluated by means of batch fermentations using different concentrations of sugars and high cell densities (Figure 5). The experiments were carried out in triplicate, with four fermentations using the EBY-XIXK-Saico and EBY-XIXK-p425Ø strains. The initial OD600nm used in fermentations ranged from 13 to 20.
[74] Ao analisar os resultados confirmou-se que a linhagem controle não foi capaz de consumir nem glicose e nem xilose, conforme esperado (Figura 5 E; F; G; H). Observouse que, em concentrações iguais, os açúcares são consumidos concomitantemente pela linhagem S. cerevisiae EBY-XIXK-Saico (Figura 5A e B). Após 196 horas de fermentação com 25 g.L-1 de açúcar disponível, a linhagem conseguiu consumir 69% da glicose e 59% de xilose disponível, enquanto consumiu praticamente todo açúcar presente no meio após 120 horas quando disponibilizado apenas 5 g.L-1 dos açúcares (Figura 5A e B).[74] In analyzing the results, it was confirmed that the control strain was not able to consume neither glucose nor xylose, as expected (Figure 5 E; F; G; H). It was observed that, in equal concentrations, sugars are concomitantly consumed by the S. cerevisiae EBY-XIXK-Saico strain (Figure 5A and B). After 196 hours of fermentation with 25 gL-1 of available sugar, the strain was able to consume 69% of glucose and 59% of available xylose, while consuming virtually all sugar present in the medium after 120 hours when only 5 gL-1 of sugars were available ( Figure 5A and B).
[75] Nas fermentações com aproximadamente duas vezes mais xilose que glicose, novamente observou-se que o consumo dos dois açúcares ocorre concomitantemente, e o aumento das concentrações não alterou o perfil de consumo dos açúcares (Figura 5C e D). A velocidade e quantidade do consumo dos açúcares foi maior quando as concentrações iniciais eram maiores. Ao longo de todos os processos fermentativos, não foi observada uma alteração significativa no crescimento celular. Além disso, o principal produto obtido nessas fermentações foi o xilitol, alcançando um rendimento de 0,62 ± 0,07. Em fermentações com aproximadamente 25 g.L-1 de glicose e xilose, foi observada uma pequena produção de etanol (Figura 5B).[75] In fermentations with approximately twice as much xylose as glucose, it was again observed that the consumption of the two sugars occurred concurrently, and the increase in concentrations did not change the sugar consumption profile (Figure 5C and D). The speed and quantity of sugar consumption was higher when the initial concentrations were higher. Throughout all fermentation processes, no significant change in cell growth was observed. Furthermore, the main product obtained in these fermentations was xylitol, reaching a yield of 0.62 ± 0.07. In fermentations with approximately 25 g.L-1 of glucose and xylose, a small ethanol production was observed (Figure 5B).
[76] As linhagens de leveduras EBY-XIXK-Saico e EBY-XIXK-p425 (controle) foram crescidas em meio seletivo (Meio YNB + Histidina 100 mg/L + Maltose 20 g/L) por 48 h, e posteriormente coletadas por centrifugação e inoculadas com alta densidade celular (acima de 10 g/L) em 50 mL de hidrolisado de bagaço de cana de açúcar suplementado com YNB e glicose. As concentrações dos componentes do meio de cultivo foram aproximadamente: glicose 40 g/L, xilose 20 g/L, ácido acético 2,15 g/L, furfural 0,3 g/L. O hidrolisado foi obtido por explosão a vapor seguida de hidrólise ácida do bagaço de cana de açúcar. Amostras foram retiradas regularmente para análise do consumo de açúcares e formação de produtos. A concentração de metabólitos em cada amostra foi analisada por HPLC.[76] Yeast strains EBY-XIXK-Saico and EBY-XIXK-p425 (control) were grown in selective medium (YNB Medium + Histidine 100 mg/L + Maltose 20 g/L) for 48 h, and later collected for centrifugation and inoculated with high cell density (above 10 g/L) in 50 mL of sugarcane bagasse hydrolyzate supplemented with YNB and glucose. The concentrations of the components of the culture medium were approximately: glucose 40 g/L, xylose 20 g/L, acetic acid 2.15 g/L, furfural 0.3 g/L. The hydrolyzate was obtained by steam explosion followed by acid hydrolysis of sugarcane bagasse. Samples were taken regularly for analysis of sugar consumption and product formation. The concentration of metabolites in each sample was analyzed by HPLC.
[77] A capacidade do transportador Saico de internalizar glicose e xilose foi avaliada em meio contendo hidrolisado de bagaço de cana de açúcar. Para tanto, o desempenho fermentativo da linhagem controle EBY-XIXK-p425 (super-expressa as enzimas xilose isomerase e xiluloquinase) foi comparado com a linhagem EBY-XIXK-Saico (semelhante à EBY-XIXK-p425, exceto pela super-expressão do transportador Saico). Após 72 horas do inóculo das leveduras em meio mínimo contendo hidrolisado de bagaço de cana de açúcar, amostras foram coletadas e o consumo de açúcares e formação de produtos medido. Os resultados demonstraram claramente o efeito do transpordor Saico no transporte de glicose e xilose (Figura 6). Foi observado que a linhagem EBY-XIXKSaico consumiu aproximadamente 30 g/L de glicose e 10 g/L de xilose e produziu 5 g/L de xilitol. Por outro lado, a linhagem controle apresentou uma variação de glicose no meio inferior a 3 g/L, sendo que a quantidade de xilose permaneceu inalterada no meio.[77] The ability of Saico transporter to internalize glucose and xylose was evaluated in medium containing sugarcane bagasse hydrolyzate. Therefore, the fermentative performance of the control strain EBY-XIXK-p425 (overexpresses the enzymes xylose isomerase and xylulokinase) was compared with the strain EBY-XIXK-Saico (similar to EBY-XIXK-p425, except for the overexpression of the Saico conveyor). After 72 hours of yeast inoculation in minimal medium containing sugarcane bagasse hydrolyzate, samples were collected and sugar consumption and product formation measured. The results clearly demonstrated the effect of the Saico transporter on glucose and xylose transport (Figure 6). It was observed that the EBY-XIXKSaico strain consumed approximately 30 g/L of glucose and 10 g/L of xylose and produced 5 g/L of xylitol. On the other hand, the control strain showed a variation in glucose in the medium of less than 3 g/L, and the amount of xylose remained unchanged in the medium.
[78] Na fermentação realizada com a linhagem EBY-XIXK-Saico, o consumo de açúcares se iniciou logo ao início da fermentação e observou-se o consumo concomitante de glicose e xilose, e mesmo com altas concentrações de glicose no meio a captação de xilose não foi inibida nesse microrganismo (Figura 7). A levedura foi capaz de produzir xilitol e etanol. Conforme esperado, a linhagem controle não demonstrou o consumo eficiente de açúcares e formação de produtos (Figura 6). Esse resultado demonstra que o transportador em questão é eficiente não apenas em situações na qual apenas a porção C5 da biomassa está presente (com uma grande disponibilidade de xilose), mas também é efetivo quando a porção C6 de biomassa também está presente no meio fermentativo, não havendo sua inibição por glicose.[78] In the fermentation carried out with the EBY-XIXK-Saico strain, the consumption of sugars started right at the beginning of the fermentation and the concomitant consumption of glucose and xylose was observed, and even with high concentrations of glucose in the medium, the uptake of xylose was not inhibited in this microorganism (Figure 7). Yeast was able to produce xylitol and ethanol. As expected, the control strain did not demonstrate efficient consumption of sugars and product formation (Figure 6). This result demonstrates that the transporter in question is efficient not only in situations where only the C5 portion of the biomass is present (with a high availability of xylose), but it is also effective when the C6 portion of biomass is also present in the fermentation medium, not having its inhibition by glucose.
Claims (27)
- a. crescimento da levedura recombinante em meio seletivo;
- b. inoculação da levedura recombinante de (a) em alta densidade celular em uma fonte de carbono;
- c. fermentação de pelo menos uma parte da fonte de carbono de (b) para obtenção de um composto com valor agregado;
- d. recuperação de um composto com valor agregado do produto da fermentação de (c).
- The. recombinant yeast growth on selective medium;
- B. inoculation of recombinant yeast from (a) at high cell density into a carbon source;
- ç. fermenting at least a part of the carbon source of (b) to obtain a value-added compost;
- d. recovery of a value-added compound from the fermentation product of (c).
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