BR102020004312A2 - Método para produzir planta resistente a inseto praga, planta resistente a inseto praga e moléculas de ácido nucléico utilizadas para obtenção de tal planta através de ds-rnas relacionados à ecdise - Google Patents

Abstract

método para produzir planta resistente a inseto praga, planta resistente a inseto praga e moléculas de ácido nucléico utilizadas para obtenção de tal planta através de ds-rnas relacionados à ecdise. a presente invenção descreve método e composições para o controle genético do inseto-praga anthonomus grandis, por meio da utilização e validação do rna de fita dupla (dsrna) de dois transcritos essenciais ao desenvolvimento do inseto, especificamente no processo de ecdise. a introdução destes dsrnas possuem como genes alvo de silenciamento gênico o receptor de hormônio ecdisona (ecr) e o receptor de hormônio precursor de ecdise (ethr). a invenção provê o controle desta praga, por meio da redução da expressão gênica destes transcritos alvo. a partir da validação funcional destes transcritos como genes essências à sobrevivência e o desenvolvimento deste inseto, demonstrou-se que ambos os receptores de neuropeptídeos analisados são de potencial para uso no controle de a. grandis. neste contexto, a invenção descreve ainda, a composição de uma construção gênica contendo 3 dsrnas, na forma estruturada, visando o silenciamento dos genes alvo de a. grandis, ethr, chs2 e vit.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR PLANTA RESISTENTE A INSETO PRAGA, PLANTA RESISTENTE A INSETO PRAGA E MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO UTILIZADAS PARA OBTENÇÃO DE TAL PLANTA ATRAVÉS DE DS-RNAS RELACIONADOS À ECDISE CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga que atacam lavouras agrícolas e descreve métodos e composições para o controle de insetos-praga Anthonomus grandis (bicudo-do-algodoeiro) por meio do uso de moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA), de um ou mais transcritos em plantas, preferencialmente algodão, essenciais ao desenvolvimento do inseto alvo e especificamente envolvidos no processo de ecdise, e ou na composição de formulações para uso em aplicação tópica. A ação destes dsRNAs possuem como genes alvo para silenciamento, o Receptor de Hormônio Ecdisona (EcR) e/ou o Receptor de Hormônio Precursor de Ecdise (ETHR). A invenção provê um método para o controle do bicudo do algodoeiro, através da redução da expressão gênica destes transcritos alvo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O inseto A. grandis (Coleoptera) é uma das principais pragas da cotonicultura na América Central e na América do Sul, que pode, dependendo da infecção, levar à devastação dos campos de algodão. É um inseto com hábito endofítico durante a fase larval do seu ciclo de vida, dificultando a eficiência da aplicação dos inseticidas químicos para o controle. Assim, o manejo é muito complexo e requer o uso combinado de diversas práticas de controle (Azambuja, R & Degrande, P. E. Trinta anos de bicudo-do-algodoeiro no Brasil. Arq. Inst. Biol., São Paulo. 2014; Gabriel, D. APTA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, Secretaria de Agricultura e Abastecimento. O bicudo do algodoeiro – documento técnico. p. 1-20, 2016). O alto custo dos agrotóxicos e das regulamentações de biossegurança, com foco na saúde humana e meio ambiente, promoveram o desenvolvimento e a aplicação de novas tecnologias para o controle de insetos-praga, como o A. grandis, como exemplo, e o uso da tecnologia de RNA interferente (Firmino, A. et al. “Transcriptome Analysis in Cotton Boll Weevil (Anthonomus grandis) and RNA Interference in Insect Pests”. PLOS ONE., vol. 8, Issue 12, 2013; Coelho, R. et al. “Vitellogenin knockdown strongly affects cotton boll weevil egg viability but not the number of eggs laid by females”. V. 9, p. 173-180, 2016; Garcia, R. et al. “Nucleases as a barrier to gene silencing in the cotton boll weevil, Anthonomus grandis”. PLOS ONE 12(12), 2017; Macedo, L. et al. “Knocking down chitin synthase 2 by RNAi is lethal to the cotton boll weevil”. Volume 1, Issue 1, p. 72-86, 2017; DavisVogel et al. “Knockdown of RNA interference pathway genes impacts the fitness of western corn rootworm”. Scientific REPORTS doi:10.1038/s41598-018-26129-6. 8:7858, 2018).

[003] O RNA interferente (RNAi) é um mecanismo que ocorre naturalmente em diferentes eucariotos, regulando a expressão gênica (Wilson, R & Doudna, J. “Molecular mechanism of RNA interference”. Annu. Rev. Biophys. 42:217–39, 2013; Bronhorst, A. & Rij, R. “The long and short of antiviral defense: small RNA-bases immunity in insects”. Current Opinion in Virology. Vol. 7, p. 19-28, 2014). O mecanismo se baseia em RNAs de dupla fita (dsRNAs), que são moléculas que participam da via de regulação genica pós-transcricional de um gene alvo, de maneira específica para a sequência alvo (Prabha, S. et al. “RNA interference technology with emphasis on delivery vehicles-prospects and limitations”. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, Early Online: 1–9, 2015; Niu, J. et al. “Beyond insects: current status, achievements and future perspectives of RNAi in mite pests”. doi: 10.1002/ps.5071 2018).

[004] Nos últimos anos, o RNAi tem sido aplicado como uma ferramenta para o estudo de genômica funcional e para o controle de insetos-praga (Kola, V. et al. “Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing”. Frontiers in Physiology. V. 6, article 119, 2015; Davis-Vogel et al. “Knockdown of RNA interference pathway genes impacts the fitness of western corn rootworm”. Scientific REPORTS doi:10.1038/s41598-018-26129-6. 8:7858, 2018; Niu, J. et al. “Beyond insects: current status, achievements and future perspectives of RNAi in mite pests”. doi: 10.1002/ps.5071 2018).

[005] Partindo do uso do transcriptoma do bicudo do algodoeiro (Firmino, A. et al. “Transcriptome Analysis in Cotton Boll Weevil (Anthonomus grandis) and RNA Interference in Insect Pests”. PLOS ONE., vol. 8, Issue 12, 2013), a validação funcional via RNA interferente de alguns genes de A. grandis foi anteriormente realizada. Entre estes, o que codifica para a enzima Lacase 2, a qual está relacionada à diversos processos da biologia dos insetos, incluindo a esclerotização da cutícula. O silenciamento do transcrito que codifica para o gene da Lacase 2 do bicudo do algodoeiro resultou em indivíduos apresentando fenótipos intermediários de pupa/adulto, demostrando significativa redução em torno de 15 vezes da expressão do gene da Lacase 2 em comparação ao controle, após administração do dsRNA (BR1020120335069). O gene (CHS2) da enzima Quitina Sintase II, relacionada a síntese da membrana peritrófica em A. grandis, foi alvo de silenciamento, resultando na total mortalidade dos insetos microinjetados com o dsRNA após 240 horas. Observou-se redução em aproximadamente 15 vezes da expressão do transcrito, comparado com a expressão do controle (aplicação de GFPdsRNA) (BR 10 2012 0033539-5). A vitelogenina, uma proteína envolvida na reprodução de insetos foi silenciada em A. grandis e resultou em ovos inviáveis das fêmeas microinjetadas com o dsRNA correspondente, reduzindo em aproximadamente 30 vezes a expressão gênica da vitelogenina, comparada ao controle (Coelho, R. et al. “Vitellogenin knockdown strongly affects cotton boll weevil egg viability but not the number of eggs laid by females”. V. 9, p. 173-180, 2016). As moléculas de neuropeptídeos têm sido alvo de interesse para aplicação em estratégias biotecnológicas para o controle de insetos. O hormônio ecdisona (Ec) é um neuropeptídeo importante para o processo de ecdise e atua sobre morfogênese da epiderme das larvas (Garcia, S. & Fernández, C. Embriologia. Artmed, 3ª edição, p. 241-258, 2012; YU, R. et al. ”The Insect Ecdysone Receptor is a Good Potential Target for RNAi-based Pest Control”. J. Biol. Sci., Vol. 10, 2014). Outro neuropeptídeo fundamental no evento da ecdise é o hormônio desencadeante da ecdise (ETH) (Roller, L. et al. “Ecdysis triggering hormone signaling in arthropods”. Peptides., 31, 429-441, 2010; Areiza, M. et al. “Ecdysis triggering hormone ensures proper timing of juvenile hormone biosynthesis in pharate adult mosquitoes”. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 54 (98-105) 2014; Lenaerts, C. et al. “The ecdysis triggering hormone system is essential for successful moulting of a major hemimetabolous pest insect”, Schistocerca gregaria. Scientific Reports| 7:46502 | DOI: 10.1038/srep46502 2017). Para a ação desses hormônios, o fator determinante para desencadear a cascata reguladora da ecdise é a ligação aos seus respectivos receptores, EcR e ETHR (Iversen, A. et al. “Molecular Identification of the first insect ecdysis triggering hormone receptors”. Biochemical and Biophysical Research Communications.,299, 924-931, 2002; Deshpande, S. “Ecdysis Triggering Hormone Signaling in Adult Drosophila melanogaster”. Tese (Doctor of Philosophy in Entomolgy) – University of California, Riverside, 2012; Shi, Y. et al. “Ecdysis Triggering Hormone signaling (ETH/ETHR-A) is required for the larva-larva ecdysis in Bactrocera dorsalis (Diptera:Tephritidae)”. Frontiers in Physiology. V.8, 587., 2017).

[006] O receptor do hormônio ecdisona (EcR) pertence a uma família de receptores nucleares, correspondendo a fatores de transcrição que estão relacionados à metamorfose que levará a características de adulto (Chawla, G. & Sokol, N. “Hormonal activation of let-7-C microRNAs via EcR is required for adult Drosophila melanogaster morphology and function”. Development,139, 1788–1797, 2012; Rubio, M. & Bellés, X. “Subtle roles of microRNAs let-7, miR- 100 and miR-125 on wing morphogenesis in hemimetabolan metamorphosis”. J. Insect Physiol.,59,1089–1094, 2013). O receptor de hormônio precursor de ecdise (ETHR) desencadeia sua ação pela ligação com o hormônio ETH, que também irá regular o comportamento de ecdise, por meio de uma cascata hormonal, tendo como iniciador a resposta ao hormônio ecdisona (Ec) (Davis, M. et al. “A neuropeptide hormone cascade controls the precise onset of post-eclosion cuticular tanning in Drosophila melanogaster”. Development. 134, 4395-4404, 2007; Deshpande, S. “Ecdysis Triggering Hormone Signaling in Adult Drosophila melanogaster”. Tese (Doctor of Philosophy in Entomology) – University of California, Riverside, 2012).

[007] Atualmente, existem alguns eventos de plantas de algodão geneticamente modificadas (GM) para resistência a determinados insetos-praga e, quase a unanimidade destes, expressando toxinas Bt. Porém, nenhum destes eventos comerciais apresenta resistência ao bicudo do algodoeiro. A adoção da biotecnologia pela aplicação da técnica de RNAi representa a proximidade de uma nova era para o controle de insetos-praga. Um nível efetivo de resistência aos insetos pode ser alcançado em plantas GM expressando dsRNA. Estudos em plantas transgênicas produzindo dsRNA contra genes alvos de insetos demonstraram bons níveis de resistência à insetos-praga, indicando um novo caminho para a obtenção de plantas resistentes a insetos (Agrawal, N. et al. “RNA interference: biology, mechanism, and applications”. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67:657- 85, 2003; Mao, J. & Zeng, F. “Plant mediated RNAi of a gap gene-enhanced tobacco tolerance against the Myzus persicae”. Transgenic Res. 23 (1), 145-152., 2014; Zhang, J. et al. “Next-Generation insect-resistant plants: RNAi mediated crop protection”. Trends in Biotechnology. V.35, Issue 9, 871-882., 2017).

[008] Na presente invenção é descrito um novo método e composição de moléculas de dsRNAs, que possuem como alvo especifico os receptores de neuropeptídios envolvidos na fisiologia de A. grandis, disponibilizando-os para uso no desenvolvimento de métodos de controle biotecnológico do bicudo-do-algodoeiro, pela aplicação de dsRNA inseticida e/ou piramidação do dsRNAs com outra estratégia e diferentes mecanismos de ação.

[009] Em adição, nenhum dos documentos de patentes que descrevem a utilização da modulação gênica para controle da ecdise (US 20120115233 e US 20160122771) está relacionado à aplicação de receptores de neuropeptídeos e ao controle do inseto-praga A. grandis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção está relacionada com um método para reduzir ou inibir a expressão de genes essenciais ao desenvolvimento do inseto alvo e especificamente envolvidos no processo de ecdise, por meio do uso de moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA). Mais especificamente os genes silenciados são os genes relacionados ao Receptor de Hormônio Ecdisona (EcR) e/ou o Receptor de Hormônio Precursor de Ecdise (ETHR), particularmente em células vegetais, resultando na morte, inibição, atrofia ou interrupção de alimentação da praga alvo.

[0011] Em uma concretização, a invenção descreve moléculas sintéticas de ácido nucleicos selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 ou fragmentos ou complementos destas. A invenção descreve moléculas de dsRNA, a partir das sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, ou fragmentos ou complementos destas ou fragmento ou complemento desta, estabilizada ou a expressão de um ou mais dsRNAs para inibição da expressão de um gene-alvo, em coleóptero-praga, expresso a partir destas sequências e fragmentos das mesmas.

[0012] A invenção descreve ainda composições contendo moléculas sintéticas de ácido nucleico selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, ou fragmentos ou complementos destas, para o controle de insetospraga, particularmente o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis).

[0013] São também aspectos da invenção, genes quiméricos e construções gênicas contendo as moléculas sintéticas de ácido nucleico da presente invenção, vetores de transformação e expressão, células e organismos transgênicos, métodos para a expressão da molécula da presente invenção em organismos transgênicos, bem como o uso das mesmas no controle de pragas. Em uma concretização, a invenção descreve um ou mais de um gene quimérico que compreende um polinucleotídeo consistindo da SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, um promotor ativo operacionalmente ligado ao referido polinucleotídeos.

[0014] Em uma concretização da invenção, é descrito uma construção gênica compreendendo uma primeira região compreendendo a SEQ ID NO 3; uma segunda região compreendendo a SEQ ID NO 5; uma terceira região compreendendo a SEQ ID NO 7; onde a primeira, segunda e terceira região são capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual pode ter, além do comprimento total da primeira, segunda e terceira região e uma região espaçadora após compreendendo a SEQ ID NO 9.

[0015] Em uma concretização da invenção, é descrito um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico sintética que consiste das SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 5, onde o referido vetor é capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento da mesma.

[0016] Em uma concretização da invenção, é descrito uma sequência de ácido ribonucleico de filamento duplo produzida a partir da expressão de uma molécula de ácido nucleico consistindo nas das SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, que é ingerido por um coleóptero-praga de plantas. Em uma concretização da invenção, a ingestão por coleópteros-praga de plantas, da sequência de um ribonucleotídeo de filamento duplo, compreende pelo menos um filamento complementar do referido fragmento, para inibir ou reduzir a proliferação da referida praga.

[0017] Em uma concretização da invenção, é descrito uma célula transformada que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4. Em uma concretização da invenção, a célula transformada consiste no gene quimérico que compreende um polinucleotídeo consistindo da SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, um promotor ativo operacionalmente ligado ao referido polinucleotídeos; ou da construção gênica compreendendo uma primeira região compreendendo a SEQ ID NO 3; uma segunda região compreendendo a SEQ ID NO 5; uma terceira região compreendendo a SEQ ID NO 7; onde a primeira, segunda e terceira região são capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual pode ter, além do comprimento total da primeira, segunda e terceira região e uma região espaçadora após compreendendo a SEQ ID NO 9.

[0018] Em uma concretização da invenção, a célula transformada é uma célula procariótica. Em uma concretização da invenção, a célula transformada é uma célula eucariótica. Em uma concretização da invenção, a célula transformada é uma célula de vegetal ou bactéria.

[0019] A invenção compreende, também, uma planta transformada que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4. Em uma concretização da invenção, a planta transformada consiste no gene quimérico que compreende um polinucleotídeo consistindo da SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, um promotor ativo operacionalmente ligado ao referido polinucleotídeos. Em uma concretização da invenção, a planta transformada consiste da construção gênica compreendendo uma primeira região compreendendo a SEQ ID NO 3; uma segunda região compreendendo a SEQ ID NO 5; uma terceira região compreendendo a SEQ ID NO 7; onde a primeira, segunda e terceira região são capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual pode ter, além do comprimento total da primeira, segunda e terceira região e uma região espaçadora após compreendendo a SEQ ID NO 9.

[0020] Em uma concretização da invenção, a planta transformada compreende a molécula de ácido nucleico ser expressa em uma célula vegetal, sob a forma de uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo, e a ingestão de dieta contendo uma quantidade inibidora, para inseto-praga, da referida sequência do ribonucleotídeo de filamento duplo inibe ou reduz a proliferação da referida praga.

[0021] A invenção compreende, também, uma planta transgênica utilizando as construções gênicas da presente invenção e um método de produção das mesmas, compreendendo a obtenção de uma planta transformada com polinucleotídeos contendo uma sequência de nucleotídeos selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, ou fragmentos ou complementos destas, e o preparo de comida ou alimento a partir da referida planta ou parte da mesma.

[0022] Em uma concretização da invenção, é descrito um produto comercializável a partir de uma planta transformada, onde o referido produto comercializável compreende uma planta transformada ou parte de planta que compreende uma quantidade detectável da molécula de ácido nucleico das SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 ou de um ribonucleotídeo expresso a partir das mesmas.

[0023] A invenção também se refere a um método para produzir organismos eucarióticos transgênicos nos quais a expressão de um gene alvo nas células do organismo é reduzida, compreendendo as etapas: I) prover uma molécula de ácido nucleico das SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4; II) inserir a molécula obtida em “I” em célula ou células do organismo para produzir uma célula ou células transgênicas; e III) crescer ou regenerar um organismo eucarioto transgênico da célula ou células transgênicas.

[0024] Em uma concretização, a invenção se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, ou de uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 para controle de infestação de coleópteras onde a referida molécula está presente na dieta de um coleóptera-praga.

[0025] Em uma concretização, é revelado um método para controle de infestação de coleópteras, em que o referido método compreende o fornecimento, na dieta de um coleóptera-praga, de um agente compreendendo uma molécula de ácido nucleico SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 ou uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo produzida a partir da expressão de uma molécula de ácido nucleico SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. Em uma concretização da invenção, o método compreende ainda uma sequência de polinucleotídeo que codifica um agente pesticida selecionado do grupo consistindo de patatina, uma proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, uma proteína Xenorhabdus insecticida, uma proteína Photorhabdus inseticida, uma proteína de Bacillus laterosporous insecticida, uma proteína de Bacillus sphaericus insecticida, e uma lignina. Em uma concretização da invenção o coleóptero-praga é Anthonomus grandis. Em uma concretização da invenção, o modo de atuação da molécula de ácido nucleico ou da sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo, ao ser ingerida pela praga, é o de supressão ou redução da expressão de um gene que execute uma função essencial para sobrevida do inseto. A função essencial para sobrevida do inseto é selecionada do grupo de ecdise, metamorfose, desenvolvimento e processos fisiológicos relacionados. Em uma concretização da invenção, é descrito um método para melhora de rendimento de plantas cultivadas sujeitas à infestação por insetos-pragas que compreende: a) a introdução de uma molécula de ácido nucleico das SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4; e b) o cultivo da planta obtida em “a” de modo a permitir a expressão da referida molécula de ácido nucleico, onde essa expressão inibe ou reduz a proliferação da referida praga.

[0026] Em uma concretização da invenção, é revelado um método para melhora no rendimento de plantas cultivadas sujeitas à infestação por insetos-pragas, onde a melhora no rendimento se dá através do aumento na produção por unidade de área, e consiste na introdução e expressão de molécula de ácido nucleico para produzir uma molécula de RNA que suprime, pelo mesmo, um primeiro gene alvo em um inseto-praga que ingeriu uma porção da referida planta onde o gene alvo exercita, pelo menos uma função essencial para sobrevida do inseto ser selecionada do grupo de ecdise, metamorfose, desenvolvimento e processos fisiológicos relacionados. Em uma concretização da invenção, o inseto-praga é Anthonomus grandis.

[0027] Em uma concretização da invenção, é descrito um método de produção de um produto comerciável que compreende a obtenção de uma planta transformada de acordo com a invenção, ou parte da mesma, e o preparo de um produto comerciável a partir da planta transformada ou parte da mesma.

[0028] Em uma concretização da invenção, é descrito um método de produção de alimento ou ração que compreende a obtenção de uma planta transformada de acordo com a invenção ou parte da mesma, e o preparo de alimento ou ração a partir da referida planta ou parte da mesma.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] Figura 1 - Perfis de expressão do Receptor de Ecdisona (EcR) (A) e do Receptor de Hormônio Precursor da Ecdise (ETHR) (B) durante o ciclo de vida de A. grandis, utilizando RT-qPCR.

[0030] Figura 2 - Os perfis de expressão do Receptor de Ecdisona (A) e Receptor de Hormônio Precursor de Ecdcise (B) fêmeas jovens de A. grandis a cada 12 horas até 48 horas, utilizando RT-qPCR.

[0031] Figura 3 - Síntese do ETHRdsRNA e EcRdsRNA. EcRdsRNA fragmento: aproximadamente 500 pb, ETHRdsRNA fragmento: aproximadamente 454 pb. Legenda: M - Marcador 1Kb, seta vermelha indicando o fragmento do dsRNA sintetizado.

[0032] Figura 4 - Mortalidade larval e insetos normais sobreviventes após microinjecção com dsRNA 500ng e caracterização fenotípica de insetos sobreviventes após microinjeção com dsRNA em larvas de terceiro estádio de A. grandis. (A) Efeitos do Receptor EcR. (B) Efeitos do Receptor ETHR.

[0033] Figura 5 - Fenótipos de A. grandis após microinjeção de dsRNA 500ng em larvas de terceiro instar. Imagens de insetos sobreviventes de tratamentos controle (água e GUSdsRNA (A-B); EcRdsRNA (C-D) e ETHRdsRNA (E-F).

[0034] FIGURA 6 - Níveis de expressão relativa de EcR (A) e ETHR (B) em A. grandis, 48 horas após microinjeção específica de dsRNA em larvas de terceiro estádio.

[0035] FIGURA 7- Mortalidade de fêmeas de A. grandis causadas pelo silenciamento do receptor de EcR (A) e pelo receptor ETHR (B).

[0036] Figura 8- Níveis de expressão relativa de EcR (A) e ETHR (B) em A. grandis, 48 horas após microinjeção específica de dsRNA em fêmeas adultas.

[0037] Figura 9 - Mapa esquemático do cassete de expressão em plantas, pCotton dsRNA Agra-3, que codifica a transcrição de uma molécula de dsRNA estabilizado para o silenciamento de 3 genes alvo em A. grandis, as sequencias codificantes para o dsRNA foram denominadas ETHR, CHS2 e VIT, visando o silenciamento dos genes de Receptor de Hormônio Precursor de Ecdise, Quitina sintase 2 e vitelogenina, respectivamente. (A) Esquema do cassete de expressão pCotton dsRNA Agra-3. UCEA 1.7, trata-se da região do promotor da enzima de conjugação a ubiquitina de G. hirsutum; T7, refere-se à sequência do promotor da T7 RNA polimerase; Rib5', sequência de uma ribozima, localizada na extremidade 5' do dsRNA e que atua em pH 8; Rib3', sequência de uma ribozima, localizada na extremidade 3' do dsRNA e que atua em pH 8; Rib pH4, sequência de uma ribozima que se autocliva em pH abaixo de 4; TI, refere-se à sequência denominada trava de incompatibilidade. (B) Modelo esquemático exibindo a sequência nucleotídica do cassete de expressão em plantas do dsRNA estabilizado. Cassete de expressão = 2339pb.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038] A presente invenção descreve método e composições para o controle genético do inseto-praga A. grandis (bicudo-do-algodoeiro), preferencialmente em algodoeiro, pela inibição do processo de ecdise, causado pelo silenciamento dos genes responsáveis pela síntese do receptor de hormônio ecdisona (EcR) e receptor de hormônio precursor de ecdise (ETHR). A invenção provê composições para o controle dessa praga, pela aplicação de uma ou mais moléculas de RNA de fita dupla capaz de inibir a expressão desses genes no inseto, bloqueando dessa forma, o seu desenvolvimento e sobrevivência. A invenção descreve ainda método de obtenção de planta de algodão transgênica que expressa as moléculas de RNA de fita dupla, por meio da utilização de construção gênica em forma piramidal.

[0039] Primeiramente foram validadas moléculas de dsRNAs para os dois genes (Receptor de Ecdsiona - EcR e Receptor de Hormônio Precursor da Ecdise - ETHR), que se mostraram essenciais ao desenvolvimento do inseto em estudos envolvendo bioensaios com o bicudo do algodoeiro. A redução dos transcritos causados pelo silenciamento destes genes em larvas de 3º instar resultou em fenótipos altamente letais, causado pela interrupção dos eventos moleculares, que caracterizam o início da ecdise na fase de préecdise. Em fêmeas adultas, a administração de EcRdsRNA e ETHRdsRNA demonstrou que esses genes são necessários para a sobrevivência do inseto alvo. A sequência do ETHRdsRNA foi utilizada na construção gênica, denominada pCotton-dsRNA-Agra3, usada para transformação de agrobactéria. O dsRNA foi inserido em plantas de algodão, pelo método de transformação genética de plantas por agrolística.

[0040] No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso serão melhor detalhados a seguir.

[0041] O termo “ácido nucléico” refere-se a uma molécula a qual pode ser fita simples ou fita dupla, composta de monômeros (nucleotídeos) contendo um açúcar, um fosfato e uma base purina ou pirimidina. Um “fragmento de ácido nucléico” é uma fração de uma dada molécula de ácido nucléico. “Complementaridade” refere-se ao pareamento específico de bases purinas e pirimidinas que consistem de ácidos nucléicos: pares de adenina com timina (ou uracila) e pares de guanina com citosina.

[0042] O ácido desoxirribonucléico (DNA) é o material genético enquanto ácido ribonucléico (RNA) está envolvido na transferência da informação do DNA em proteínas. Um “genoma” é toda parte principal do material genético contida em cada célula de um organismo. O termo “sequência de nucleotídeo” refere-se às sequências de polímeros de nucleotídeos, formando uma fita de DNA ou RNA, as quais podem ser simples ou duplafita, opcionalmente sintéticas, não naturais ou com bases de nucleotídeos alteradas capazes de incorporação dentro de polímeros de DNA ou RNA. O termo “oligômero” refere-se a sequências curtas de nucleotídeos, usualmente até 100 bases de comprimento. O termo “homólogo” à ligação entre as sequências de nucleotídeos de duas moléculas de ácido nucléico ou entre as sequências de aminoácidos de duas moléculas de proteínas. A estimativa de tal homologia é provida através da hibridização de DNA-DNA ou RNARNA sob condições de estringência como definido no estado da técnica (como mencionado no documento US20030074685, Hames and Higgins, Ed. (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.K); ou pela comparação de similaridade de sequência entre duas moléculas de ácido nucléico ou proteína (como mencionado no documento US20030074685, Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453).

[0043] “Gene” refere-se ao fragmento de nucleotídeo que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedentes (região 5’ não traduzida) e posteriores (região 3’ não traduzida) à região codificadora. “Gene nativo” refere-se a um gene isolado com sua própria sequência reguladora encontrada na natureza. “Gene quimérico” refere-se ao gene que compreende sequências codificadoras, regulatórias e heterogêneas não encontradas na natureza. O gene quimérico da presente invenção compreende moléculas isoladas de ácido nucleicos, na orientação senso ou antisenso, ligadas operacionalmente a promotores ativos. Construções gênicas da presente invenção podem conter 1 ou mais genes quiméricos e podem ou não apresentar íntrons. “Gene endógeno” refere-se ao gene nativo normalmente encontrado em sua localização natural no genoma e não é isolado. Um “gene exógeno” refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido por transferência gênica. “Pseudogene” refere-se a uma sequência nucleotídica que não codifica uma enzima funcional.

[0044] “Sequência codificadora” refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma “sequência codificadora interrompida” significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais íntrons ligados através de junções). Um “íntron” é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré-mRNA, mas é removida através de clivagem e a religação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de íntrons incluem, mas não são limitados a íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40, íntrons do gene da malato sintase.

[0045] “Transcrito de RNA” refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia perfeita da sequência de DNA, ele é referido com transcrito primário ou ele pode ser uma sequência de RNA derivada de um processo pós-transcricional do transcrito primário e é então referido como transcrito maduro. “RNA mensageiro (mRNA)” refere-se ao RNA que está sem íntrons. “RNA senso” refere-se a um transcrito de RNA que inclui o mRNA. “RNA antisenso” refere-se a um transcrito de RNA que é complementar a todas as partes de um transcrito primário ou mRNA e que pode bloquear a expressão de um gene alvo através da interferência no processamento, transporte e/ou tradução do seu transcrito primário ou mRNA. A complementaridade de um RNA antisenso pode ser com qualquer parte do transcrito gênico específico, isto é, sequência 5’ não traduzida, sequência 3’ não traduzida, íntrons ou sequência codificadora. Além disso, o RNA antisenso pode conter regiões de sequências de ribozima que aumentam a eficácia do RNA antisenso para bloquear a expressão gênica. “Ribozima” refere-se ao RNA catalítico e inclui sequências específicas de endoribonucleases. “dsRNA (dupla-fita)” refere-se a estrutura em grampo formada entre a sequência do mRNA ou RNA senso, a sequência de uma região espaçadora e a sequência do RNA antisenso. “Região espaçadora” refere-se à sequência de nucleotídeo que não está relacionada com a sequência do gene alvo, como a sequência de um íntron. “dsRNA estruturado” refere-se a um dsRNA estabilizado por meio de estruturas secundárias inspiradas na arquitetura de viróides, por exemplo. O termo “vetor” diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Preferencialmente um dos vetores de interesse da presente invenção diz respeito ao fagomídeo. O termo “fagomídeo” diz respeito a um vetor que contém sequência para replicação em fago e em bactéria, este vetor tem características que atendem as especificações da célula hospedeira bem como agentes selecionadores e promotores. Um exemplo é o fagomídeo pComb3X (AndrisWidhopf, J.; Rader, C.; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, C. F. “Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by Phage display”. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000), que tem como característica fusionar a sequência de interesse ao gene da proteína III, do bacteriófago filamentoso M13, localizada no capsídeo viral. O termo “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com moléculas de ácido nucleico da presente invenção operacionalmente ligadas a um promotor de interesse e um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados, são os vetores pCR2.1 e pDONRTM (Invitrogen®), pL4440gtwy (Addgene). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).

[0046] Uma das formas de produzir o dsRNA é estando presente na molécula de DNA a sequência de nucleotídeos do gene alvo na orientação senso, e uma sequência de nucleotídeos na orientação antisenso, podendo haver ou não uma região espaçadora entre as sequências de nucleotídeos senso e antisenso.

[0047] Convenientemente, o dsRNA (RNA de dupla fita) como descrito pode ser introduzido dentro de células hospedeiras pela introdução e possível integração de uma construção gênica contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção, transcrição das mesmas para produção do dsRNA. Os dsRNA utilizados a partir dos fragmentos gênicos de EcR e ETHR utilizados no estudo compreendem duas sequências distintas, em que:

• (a) a primeira sequência compreende a SEQ ID NO 1 (dsRNA EcR senso);
• (b) a primeira sequência compreende a SEQ ID NO 2 (dsRNA EcR antisenso);
• (c) a primeira sequência compreende a SEQ ID NO 3 (dsRNA ETHR senso);
• (d) a primeira sequência compreende a SEQ ID NO 4 (dsRNA ETHR antisenso).

[0048] Além disto, a construção gênica da presente invenção é capaz de ser expressa em células de organismos eucariotos de interesse, operacionalmente ligada a uma molécula de DNA que quando transcrita produz moléculas de dsRNA, em que:

• (a) a primeira região compreende a SEQ ID NO 3 (dsRNA ETHR senso);
• (b) a segunda região compreende a SEQ ID NO 5 (dsRNA CHS2 senso);
• (c) a terceira região compreende a SEQ ID NO 7 (dsRNA VIT senso);
• (d) a primeira, segunda e terceira região são capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual contém, além do comprimento total da primeira, segunda e terceira região, uma região espaçadora após elas compreendendo a SEQ ID NO 9 (Região espaçadora entre os dsRNAs senso).

[0049] “Promotor” refere-se à sequência de DNA em um gene, usualmente localizada a montante da sequência codificadora, a qual controla a expressão da sequência codificadora promovendo o reconhecimento pela RNA polimerase e outros fatores requeridos para a própria transcrição. Em uma construção de DNA artificial, promotores podem também ser utilizados para transcrever dsRNA. Promotores podem também conter sequências de DNA que estão envolvidas na ligação de fatores de proteínas as quais controlam o efeito do início da transcrição em resposta a condições fisiológicas ou de desenvolvimento.

[0050] Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor constitutivo. Em outro aspecto da invenção, a atividade do promotor é estimulada por fatores externos ou internos tais como, mas não limitado a: hormônios, compostos químicos, impulsos mecânicos, e condições de estresse biótico ou abiótico. A atividade do promotor também pode ser regulada de maneira temporal e espacial (como por exemplo, promotores tecidoespecíficos e promotores regulados durante o desenvolvimento). No caso da presente invenção foi utilizado o promotor UCEA 1.7.

[0051] Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Como utilizado aqui, o termo “promotor expresso em plantas” significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal o qual seja capaz de direcionar a expressão em uma célula vegetal, por exemplo, promotores de origem viral ou bacteriana tais como CaMV35S (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hapster et al, 1988 Mol. Gen. Genet. 212, 182-190) e promotores do gene presentes no T-DNA de Agrobaterium; promotores tecidoespecíficos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores sementeespecíficos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de patente US20030175783, An et al., 1996 The Plant Cell 8, 15- 30), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), promotores específicos de folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devel. 3:1639-1646), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotores específicos de estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865); e semelhantes.

[0052] O promotor pode conter elementos “enhancers”. Um “enhancer” é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecidoespecificidade de um promotor. “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimento-específicos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese. O termo “expressão” refere-se a transcrição e acumulação estável do dsRNA derivado dos fragmentos de ácidos nucléicos da invenção que, em conjunto com a aparelhagem de produção de proteína da célula, resulta em níveis alterados do gene de interesse. “Inibição por interferência” refere-se à produção de transcritos de dsRNA capazes de prevenir a expressão da proteína alvo.

[0053] “Sequências regulatórias apropriadas” referem-se a sequências de nucleotídeos em genes nativos ou quiméricos que estão localizadas acima (região 5’ não traduzida), dentro, e/ou abaixo (região 3’ não traduzida) dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção, as quais controlam a expressão dos fragmentos de ácido nucleicos da invenção.

[0054] “Níveis alterados” referem-se à produção de produtos gênicos em organismos transgênicos em quantidades ou proporções que diferem daquelas em organismos normais ou não-transgênicos. A presente invenção também relata vetores, os quais incluem sequências dos genes do receptor de hormônio ecdisona (EcR) e gene do receptor de hormônio precursor de ecdise (ETHR) na orientação senso e antisenso, e células hospedeiras, as quais são geneticamente engenheiradas com vetores da invenção. “Transformação” refere-se à transferência do gene exógeno para dentro do genoma de um organismo hospedeiro e sua herança geneticamente estável.

[0055] O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a: sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Na presente invenção foi utilizado o sinal de terminação T-nos.

[0056] A presente invenção também inclui prover moléculas de dsRNA, as quais podem ser obtidas por transcrição das moléculas contidas nas construções gênicas, e que são úteis para os métodos de acordo com a invenção.

[0057] Um outro objeto da presente invenção é prover células eucariotas, e organismos eucariotas contendo moléculas de dsRNA da invenção, ou contendo os genes quiméricos ou as construções gênicas capazes de produzir moléculas de dsRNA da invenção. As construções gênicas podem estar estavelmente integradas no genoma das células de organismos eucariotas. Preferencialmente para a presente invenção foram usadas células de plantas.

[0058] “Plantas” referem-se a organismos fotossintéticos, ambos eucariotos e procariotos, onde o termo “plantas desenvolvidas” refere-se a plantas eucariotas. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então, a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos gêneros Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Preferencialmente a presente invenção diz respeito a plantas de Gossypium, mais especificamente Gossypium hirsutum.

[0059] Em outro aspecto da invenção, as construções gênicas podem estar providas em uma molécula de DNA capaz de se replicar de forma autônoma nas células de organismos eucariotas, tais como vetores virais. A construção gênica ou o dsRNA pode também estar disposto de forma transiente nas células de organismos eucariotas. As construções gênicas ou gene quimérico da invenção podem ser introduzidas dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, pode ser introduzido diretamente dentro do DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA.

[0060] Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de construções gênicas utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722, 1984 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

[0061] Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro Agrobacterium tumefasciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefasciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803, 1983). Células de plantas transformadas que são derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima pode ser cultivada para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e então o fenótipo desejado tal como problema no processo de ecdise em coleópteras, resultando em insetos com fenótipo letal híbrido entre pupa e adulto. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al., “Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture”, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e “Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts”, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al., Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

[0062] Sem restringir a invenção para um particular modo de ação, espera-se que a enzima, em células eucariotas, responsável por gerar pequenas moléculas de RNA com cerca de 21 nucleotídeos de dsRNA (como a DICER em Drosophila) possa ser saturada através da inclusão de um excesso de sequências de dsRNA (isto é, moléculas de RNA complementares) que não estão relacionadas com a sequência de nucleotídeos do gene alvo ou do gene a ser silenciado.

[0063] A variação natural na regulação posterior da expressão do gene alvo ocorrendo entre diferentes linhagens de organismos eucariotos compreendendo a mesma molécula de dsRNA será substituída através da manipulação do espectro de silenciamento gênico. Esse fato pode ocorrer através da inclusão de sequências de nucleotídeos de dsRNA extras não relacionadas com o gene alvo, as quais são operacionalmente ligadas aos dsRNA formados pela primeira e segunda região.

[0064] As concretizações da presente invenção podem ser efetivas contra uma variedade de pragas. Para os propósitos da presente invenção, as pragas incluem, mas não estão limitadas a insetos, fungos, bactérias, nematóides, ácaros, patógenos protozoários, parasitas animais, e semelhantes. Pragas de particular interesse são insetos-praga, particularmente insetos-praga que causam danos significativos para plantas agrícolas. Entende-se como “insetos-praga” insetos e outras pragas similares tais como, por exemplo, os insetos das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera. Insetos-praga da presente invenção da maioria das cultivares incluem, mas não estão limitadas a: Milho - Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saccharalis, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus leucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Hylemya platura, Agromyza parvicornis, Anaphothrips obscrurus, Solenopsis milesta, Tetranychus urticae; Sorgo - Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltia subterranea, Phyllophaga crinita, Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., Oulema melanopus, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissus leucopterus leucopterus, Contarinia sorghicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae; Trigo - Pseudaletia unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Macrosiphum avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Melanoplus sanguinipes, Mayetiola destructor, Sitodiplosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata, Frankliniella fusca, Cephus cinctus, Aceria tulipae; Girassol - Cylindrocupturus adspersus, Smicronyx fulus, Smicronyx sordidus, Suleima helianthana, Homoeosoma electellum, Zygogramma exclamationis, Bothyrus gibbosus, Neolasioptera murtfeldtiana; Algodão - Heliothis virescens, lagarta-das-maçãs; Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltadora do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca Bemisia tabaci; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto; Thrips tabaci, tripes-dofumo; Franklinkiella fusca, tripes; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro-rajado; Arroz - Diatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophilus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterus leucopterus, Acrosternum hilare; Soja - Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Epilachna varivestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Hylemya platura, Sericothrips variabilis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae; Cevada - Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, Euschistus servus, Jylemya platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Canola - Vrevicoryne brassicae, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum, Meligethes aeneus, Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus, e Meligethes viridescens; Batata - Leptinotarsa decemlineata. Preferencialmente para a presente invenção a praga alvo é da ordem Coleoptera, especialmente Anthonomus grandis.

EXEMPLOS

[0065] A presente invenção é ainda definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.

[0066] Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como “solução de lise”, “SSC”, “SDS”, etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).

Exemplo 1 – Seleção dos genes

[0067] A seleção de genes alvos essenciais e específicos é uma etapa muito importante para o sucesso da tecnologia. Nesta invenção, as sequências dos fragmentos dos genes, relacionados a neuropeptídeos, presentes no transcritoma do bicudo, foram analisadas in silico, em alinhamentos com sequências correspondentes de outros insetos, disponíveis no GenBank, utilizando o programa BLAST N (versão 2.2.15) (Altschul, S. et al. “Basic local alignment search tool”. Journal of Molecular Biology, v. 215, n.1, p. 403-410, 1990). O gene EcR em A. grandis foi identificado por meio de uma sequência publicada no banco de dados-NCBI e representado por um fragmento de 290pb (SEQ ID NO 1), que corresponde a uma porção da região 5’UTR e da região codificante inicial; sequência esta utilizada também para a síntese do EcRdsRNA. O gene ETHR em A. grandis foi identificado pela identidade com Dendocritonus ponderosae (Coleoptera: Curculionidae). O contig selecionado, denominado de c19804, possui 408 pb. A região clonada e utilizada para a síntese do ETHRdsRNA corresponde a 234 pb (SEQ ID NO 2).

[0068] Os oligonucleotídeos iniciadores sintetizados e aplicados nas reações de RT-PCR e RT-qPCR, visando a avaliação da redução da expressão gênica dos genes alvo foram desenhados utilizando o programa Oligo Perfect™ Designer (Life Technologies) (Tabela 1).

[0069] Todos os diferentes estágios (ovos, larvas, pré-pupas, pupas e adultos) de desenvolvimento de A. grandis foram obtidos da colônia mantida no Laboratório de criação de Insetos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia em Brasília, DF.

Exemplo 2- Expressão relativa dos transcritos de EcR e ETHR durante o desenvolvimento de A. grandis

[0070] A extração do RNA total de ovos, larvas de 1º, 2º e 3º instares, pré-pupas, pupas e adultos (machos e fêmeas em conjunto e separadamente) foi feita utilizando o reagente TRIZOL® (Life Technologies), de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. A concentração e qualidade do RNA extraído foram obtidas no espectrofotômetro NanoVue Plus GE Healthcare Life) e confirmados em gel de agarose 1%. Os RNAs foram tratados com 2U de DNase I (Invitrogen®) por 30 minutos. Para as sínteses dos cDNAs foi utilizado o kit comercial “M-MLV Reverse Transcriptase 1st-Strand cDNA Synthesis” (Invitrogen®), conforme protocolo do fabricante. A análise da quantidade relativa de transcritos de EcR e ETHR durante o ciclo de vida do inseto, foi realizada por RT-PCR (termociclador CF X96TM “Real-Time System Bio-Rad”) utilizando os cDNAs de todas as fases de desenvolvimento do inseto e os oligos específicos (Figura 1). Os genes utilizados para normalização interna foram β-tubulina (β-TUB) e Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase (GAPDH) (Tabela 1). As reações foram realizadas no volume final de 10 μL, sendo 5 μL do Kit comercial Mix SYBR Green (LGC), 2 μL de cDNA específico, 2,6 μL de água bidestilada e 0,2 μM de cada oligo, direto e reverso. O programa utilizado foi 95 °C por 10 minutos, 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos e 60 °C por 30 segundos para extensão. Após 40 ciclos foi realizada uma curva de dissociação para confirmar a especificidade dos oligos (65-95 °C, aumentando 0,5 °C a cada 5 segundos). As reações foram realizadas em triplicata técnica e duplicata biológica, e com controles negativos, contendo água, ao invés de cDNA. Os dados brutos de amplificação foram analisados pelo programa “qPCR miner” (http://ewindup.info/miner/) para cálculo das CTs (cycles thresold) e eficiência dos oligos. A quantificação relativa foi realizada pelo programa qBase Plus (Biogazelle, Bélgica). A quantificação relativa dos dois genes foi relativizada com a quantidade da fase de menor expressão, sendo considerada um (1). A quantidade de transcritos dos genes EcR e ETHR em A. grandis foi maior, em ambos os casos, na fase adulta (Figura 1A e B). O gene EcR mostrou expressão relativa mais alta em ovo e adulto, comparado com a dos instares larvais e da pupa. O gene ETHR também apresentou maior expressão de transcritos na fase adulta.

[0071] Para obtenção dos fragmentos gênicos de EcR e ETHR visando a posterior síntese de dsRNAs foram realizadas PCRs utilizando os oligonucleotídeos específicos (Tabela 1). O volume da PCR foi de 20μL a partir de: 14,4μL de água, 0,4μL de cada oligo (10μM), 1,2μL de MgCl2 (50mM), ,2μL de Tampão 10X, 0,4μL de dNTP (0,5 mM), 0,2μL da enzima Taq DNA polimerase (5U/μL) da Ludwing Biotec, e 1μL de cDNA obtido a partir do conjunto de cDNAs de todos os estágios de desenvolvimento de A. grandis. O programa aplicado na PCR foi 94ºC por 5 minutos, 30 ciclos a 95 ºC por 30 segundos; 55 ºC para anelamento por 30 segundos, e 72 ºC por 30 segundos para extensão. Em seguida, 72ºC por 5 minutos. O produto da amplificação dos transcritos foi analisado em gel de agarose 1% e purificado com o Kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN), conforme protocolo do fabricante. O fragmento de EcR (370pb) foi subclonado no vetor pDONR™ 221 utilizando o mix de enzimas BP clonase II do kit comercial “PCR Cloning System with Gateway® Technology” (Invitrogen®) e transferido por recombinação (utilizando o mix de enzimas LR clonasse II) para o vetor pL4440gtwy. A cepa de Escherichia coli OmniMAX™ 2-T1R (Invitrogen®) foi utilizada para estas clonagens. O produto da amplificação do fragmento ETHR (300pb) foi purificado com o kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN) e clonado no vetor pCR2.1 utilizando o kit comercial TOPO® TA cloning (Invitrogen®), seguindo instruções do fabricante. O DNA foi utilizado para transformar a cepa de E. coli XL1-Blue preparada para competência na eletroporação. As clonagens foram confirmadas pela digestão dos DNAs plasmidiais com enzimas de restrição. Para o gene EcR foi utilizada a enzima EcoR V e para o gene ETHR, a enzima EcoR I (ambas da ThermoFisher Scientific). As reações de digestão utilizaram 7,5 μL de água, 1μL do DNA molde (10μg), 0,5μL da enzima de restrição específica (5u na concentração 12 u/μL) e 1μL de Tampão 10X da enzima. As reações foram incubadas por duas horas a 37ºC.

[0072] O perfil de expressão de ambos os receptores, EcR e ETHR, foi analisado entre 12h, 24h, 36h e 48h após a emergência de fêmeas adultas da dieta por RT-qPCR. O resultados demonstraram alta expressão destes receptores de neuropeptídeos logo após a emergência dessas fêmeas, com 12 horas, corroborando com a funcionalidade para a sobrevivência destas fêmeas e sugerindo que a ação destes receptores ocorra inicialmente na fase adulta em fêmeas de A. grandis (Figura 2).

Exemplo 3- Síntese do dsRNA de EcR e ETHR

[0073] As sínteses dos dsRNAs para uso na análise do silenciamento dos genes EcR e ETHR foram realizadas pelo procedimento de transcrição in vitro, utilizando o kit comercial MEGAscript® RNAi Kit (Ambiom, Thermo Fisher Scientific). Para isto foram previamente adicionados às sequencias dos fragmentos, usando PCR, a região mínima do promotor T7 (visando a ativação da enzima T7 RNA polimerase do kit). Para o fragmento do gene EcR, clonado no vetor pL4440gtwy, foi necessária amplificação prévia, partindo de um único ciclo com o oligonucleotídeo T7 (o mesmo aplicado para o sentido direto e reverso). Esta amplificação foi necessária devido à presença de dois sítios de ligação a polimerase T7, externos ao fragmento a ser inserido no vetor. No caso do gene ETHR clonado no vetor pCR2.1 foi realizada a amplificação inicial com os oligonucleotídeos M13, direto e reverso. A primeira PCR foi realizada com 20μL a partir de: 14,4μL de água, 0,4μL de cada oligo (10μM); 1,2μL de MgCl2 (50Mm), 2μL de Tampão 10X, 0,4μL de dNTP (0,5 mM), 0,2μL da enzima Taq DNA polimerase (5u/μl) da Ludwing Biotec, e 1μL de DNA plasmidial (2 μg/μL). O programa da PCR foi 94 ºC por 5 minutos para desnaturação, 30 ciclos a 95ºC por 30 segundos, 55ºC para anelamento por 30 segundos, e 72ºC por 30 segundos para extensão. Em seguida, 72ºC por 5 minutos para extensão final. O produto da amplificação dos transcritos por PCR foi visualizado em gel de agarose 1%. Em seguida, visando a síntese do dsRNA, 1μL do produto desta reação foi utilizado como molde para a reação utilizando os oligonucleotídeos T7 (direto) e T7M13 (reverso), sendo o T7M13 diluído 20 X, a partir da solução estoque (10μM). A reação da segunda PCR foi realizada como descrito para a primeira PCR, com iguais valores e concentrações de reagente, exceto para o molde de DNA. Foram necessárias duas reações de PCR para a amplificação do fragmento, devido à presença de um único sítio de ligação T7 no vetor. Após a síntese, o dsRNA foi purificado conforme protocolo estabelecido pelo fabricante. A concentração dos dsRNAs foram quantificadas no espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare Life Sciences) e analisados em gel de agarose 1%(Figura 3).

Exemplo 4- Efeito altamente letal da administração do dsRNA específico para os genes EcR e ETHR, em larvas de A. grandis

[0074] O efeito da administração de EcRdsRNA e ETHRdsRNA em larvas de A. grandis foi analisado após ensaios de microinjeção, onde 500ng/μL de dsRNA foram microinjetados em larvas de 3º instar e fêmeas adultas. A concentração ideal dos dsRNAs foi estabelecida em experimentos prévios, visando não causar morte imediata e possibilitar a observação de fenótipos. Para a administração dos dsRNAs foi utilizada seringa Hamilton de volume 10 μL, sendo microinjetado 1 μL do dsRNA específico na região dorsal do inseto. Em cada experimento foram utilizados quatro tratamentos: EcRdsRNA e ETHRdsRNA e GUSdsRNA (β-glucoronidase-GUS-dsRNA não específico), como controle negativo junto à água bidestilada.

[0075] Nove insetos microinjetados com os diferentes dsRNAs, sendo quatro repetições no total, foram utilizados para a extração de RNA, síntese de cDNA e aplicação na análise do silenciamento por RT-qPCR. Antes da microinjeção, as larvas de 3º instar foram coletadas da dieta e depositadas em placas de petri de vidro, sobre o gelo, para redução da temperatura e da sua atividade metabólica. Para microinjeção a larva foi colocada com o dorso voltado para cima e a penetração da agulha realizada na região dorso-lateral, visando não atingir a aorta que percorre longitudinalmente a larva. Após a microinjeção, as larvas foram colocadas em dieta nova contendo espaços feitos com contornos circulares de pinça e cobertas suavemente com os resquícios da dieta. Cada placa de repetição continha 40 larvas, todas do mesmo tratamento, exceto as placas com indivíduos para extração de RNA, onde havia 10 larvas de cada tratamento, separadas nos quadrantes da placa. O bioensaio com larvas de 3º instar teve duração máxima de 20 dias, tempo estimado de desenvolvimento normal das larvas até adulto. A coleta das larvas para extração do RNA foi realizada 48 horas após a microinjeção. As larvas mortas foram retiradas ao longo dos dias, contabilizadas e analisadas quanto ao fenótipo: mortalidade, má-formação nos estágios de pupa e adulto e quantidade de sobreviventes que se tornaram adultos viáveis.

[0076] Os dados de mortalidade, resultante dos tratamentos de microinjeção dos dsRNAs dos bioensaios, utilizando larvas foram analisados por análise de variância (ANOVA), e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05). Todos os experimentos foram realizados com delineamento inteiramente casualisado.

[0077] As larvas de terceiro instar microinjetadas com EcRdsRNA apresentaram mediana de mortalidade em torno de 40%, e quando comparado aos controles água e GUSdsRNA, mostrou uma diferença significativa (F3,44= 6,917; p<0,001) (Figura 4A, à direita), representando aproximadamente o dobro da mediana de mortalidade dos controles. As alterações morfofisiológicas, da cutícula, cápsula cefálica, nas asas e élitros, pernas, estruturas reprodutivas externas e modificações no abdômen foram analisadas sob as lentes do microscópio (Olympus, modelo MVX10). A percentagem das larvas de terceiro instar sobreviventes, microinjetadas com EcRdsRNA e que conseguiram chegar a fase adulta sem má formação, portanto adultos viáveis, representou apenas 15% (Figura 4A, à esquerda). Quando comparados aos controles, concluiu-se que o EcRdsRNA inviabiliza os insetos sobreviventes no tratamento, apontando um papel essencial para sobrevivência e viabilidade de A. grandis. Estes resultados corroboram com a descrição da cascata de reações hormonais de ecdise descrita em DAVIS, M. et al., “A neuropeptide hormone cascade controls the precise onset of post-eclosion cuticular tanning in Drosophila melanogaster. Development”. 134, 4395-4404, 2007 e YAMANAKA, N. et al. “Ecdysone Control of Developmental Transitions: Lessons from Drosophila Research”. Annu Rev Entomol., 58: 497–516, 2013, onde o ecdisona é responsável por iniciar este processo, estimulando a produção do próximo hormônio e assim sucessivamente até o término do processo da ecdise. Isto demonstra o papel primordial do ecdisona e EcR na iniciação da ecdise também em A. grandis. A administração do EcRdsRNA em larvas do terceiro instar resultou em vários fenótipos letais, nos insetos que conseguiram chegar à fase adulta, apresentando má-formação nos élitros, asas e abdômen. Os élitros foram reduzidos, as asas e abdômen aparentam uma massa de células única não distinguível. Após a microinjeção, as larvas que morreram em torno de sete dias apresentaram máformações, com uma metamorfose malsucedida na região cefálica, logo acima da cabeça da larva ou na extremidade oposta (Figura 5C e 5D).

[0078] Para compreender os efeitos da administração do EcRdsRNA durante o desenvolvimento de A. grandis, foi realizada a quantificação dos transcritos deste gene por RT-qPCR. O RNA total foi extraído de larvas microinjetadas com os diferentes tratamentos, conforme descrito acima. A quantificação relativa do gene foi relativizada com a quantidade de expressão relativa do controle água, sendo considerado o valor = 1 (um). As análises foram realizadas, separadamente, partindo de repetição biológica dos bioensaios. A quantificação relativa do gene EcR por RT-qPCR, foi realizada 48 horas, após a microinjeção. A análise do EcRdsRNA quando normalizada usando os resultados do tratamento controle indicou diminuição de aproximadamente de 2,5 vezes (Figura 6A), indicando o silenciamento gênico de EcR. O silenciamento gênico de EcR em larvas do terceiro instar de A. grandis por RT-qPCR foi realizado em triplicata. E estes resultados junto aos dados biológicos de mortalidade e porcentagem de adultos normais, mostraram a elevada importância deste transcrito, para o desenvolvimento e sobrevivência de A. grandis. A diminuição, mesmo discreta do nível de transcritos do gene EcR pode alterar o processo de ecdise, sugerindo que sua atuação ocorre já nas etapas iniciais desse processo, podendo ser determinante para uma metamorfose normal para a fase adulta (DAVIS, M. et al., “A neuropeptide hormone cascade controls the precise onset of posteclosion cuticular tanning in Drosophila melanogaster. Development” 134, 4395-4404, 2007 e YAMANAKA, N. et al. “Ecdysone Control of Developmental Transitions: Lessons from Drosophila Research” Annu Rev Entomol., 58: 497–516, 2013).

[0079] As análises de larvas microinjetadas com ETHRdsRNA não apresentaram taxa de mortalidade significativa quando comparado aos controles água e GUSdsRNA (F3,44= 6,917; p<0,001) (Figura 4B). No entanto, a proporção de adultos viáveis, após 20 dias, foi de apenas 1%, significando em números absolutos apenas 1 inseto normal e capaz de sobreviver entre 120 insetos microinjetados inicialmente. Comparando com os controles, que apresentaram 100% de adultos viáveis, ficou clara a função essencial do gene ETHR para a metamorfose deste inseto, sendo o seu silenciamento a causa da interrupção do desenvolvimento normal das larvas de A. grandis e resultando em um fenótipo letal (Figura 5E e 5F). Para compreender os efeitos da administração do ETHRdsRNA durante o desenvolvimento de A. grandis, foi realizada a quantificação dos transcritos deste gene por RT-qPCR. O RNA total foi extraído de larvas microinjetadas com os diferentes tratamentos, conforme descrito acima. As análises de quantificação relativa do gene ETHR foram tratadas da mesma forma como para o gene EcR. A análise do ETHRdsRNA quando normalizada com os resultados do tratamento controle, indicou diminuição em torno de 6 vezes em relação ao controle (Figura 6B). Estes resultados mostraram diminuição significativa da quantidade de transcritos de ETHR, causada pela administração do ETHRdsRNA em larvas do terceiro instar, indicando o silenciamento do gene alvo.

[0080] O fenótipo causado pela administração do ETHRdsRNA foi idêntico em todos os insetos sobreviventes, resultando em um único fenótipo letal predominante. As figuras 5E e 5F ilustram os fenótipos resultantes do silenciamento do gene ETHR, e quando comparado ao grupo controle GUSdsRNA, demonstra-se claramente a inviabilização do desenvolvimento normal e sobrevivência do inseto microinjetados com ETHRdsRNA. Os insetos sobreviventes apresentaram má-formação após os 20 dias de bioensaio, sendo incapazes de se movimentar mesmo vivos, devido às más-formações. As larvas de terceiro instar de A. grandis não conseguiram completar a metamorfose, a ecdise foi iniciada na região anterior, da cabeça até a metade do corpo, mas a região posterior manteve-se como larva. Na região anterior, dos insetos microinjetados com ETHRdsRNA, observou-se presença das pernas e élitros, mas apresentando má-formação e “encolhimento” anormal (Figura 5E). Em adição, a região posterior predominou como larva/pupa, o aparelho reprodutivo externo sofreu exposição e acúmulo de uma massa de gordura próxima a região. Observou-se também esclerotização, marcada pelo escurecimento da cutícula (Figura 5F). Portanto, os resultados mostraram que os insetos microinjetados com o ETHRdsRNA não conseguiram completar ecdise e são insetos inviáveis, sendo caracterizados como “híbridos” quanto aos estágios da ecdise, explicado com base na descrição cronológica hormonal da ecdise, descrito em DAVIS et al. “A neuropeptide hormone cascade controls the precise onset of post-eclosion cuticular tanning in Drosophila melanogaster” Development. 134, 4395-4404, 2007. Se a ecdise foi iniciada pela produção dos hormônios da pré-ecdise, como ecdisona e ETH, mas o ETHR sofreu alteração e não gerou a função fisiológica do hormônio, o inseto fica aprisionado nesta etapa de pré-ecdise e é incapaz de estimular os passos seguintes da cascata hormonal, resultando em um fenótipo drástico para sobrevivência e de alta letalidade.

Exemplo 5- Efeito letal da administração do dsRNA específico para os genes EcR e ETHR, em fêmeas adultas de A. grandis

[0081] Em bioensaios realizados com adultos, os insetos recém-emergidos foram sexados. Os machos foram marcados com cola e glitter nos élitros para a identificação. Apenas as fêmeas foram microinjetadas. O local de administração do tratamento foi no abdômen, região dorso-lateral, elevando-se o élitro e asa para microinjeção. As fêmeas e os machos (proporção de quatro machos para cada grupo com cinco fêmeas) foram colocados em recipientes confeccionados a partir de plásticos comuns com fundo em rede, obtido a partir de peneiras contendo espaços para passagem e coleta dos ovos. A duração do bioensaio com insetos adultos foi de 15 dias. E a coleta das fêmeas, para extração de RNA total, foi realizada 48 horas após a microinjeção. Em seguida, foi realizada a contagem das fêmeas não sobreviventes.

[0082] Os dados de mortalidade, resultante dos tratamentos de microinjeção dos dsRNAs dos bioensaios, utilizando insetos adultos, foram analisados por análise de variância (ANOVA), e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05). Todos os experimentos foram realizados com delineamento inteiramente casualisado. A avaliação quanto ao efeito de silenciamento gênico, resultante da administração de dsRNA dos transcritosalvo, nos insetos de A. grandis, submetidos ao tratamento com microinjeção foi realizada por RT-qPCR. Os cDNAs utilizados foram obtidos a partir do RNA total extraído dos insetos de cada tratamento, EcRdsRNA e ETHRdsRNA, e água, após 48 horas da administração do dsRNA. Os oligonucleotídeos utilizados para cada gene estão descritos na Tabela 1.

[0083] As fêmeas tratadas com EcRdsRNA e ETHRdsRNA apresentaram uma mediana para mortalidade de aproximadamente 60% e acima de 60% respectivamente, elevada e significativa (F3,28 = 7,618, p<0,001) em relação aos controles água e GUSdsRNA, indicando que tanto EcR como ETHR são genes necessários para sobrevivência de A. grandis, mesmo após completada a metamorfose para a fase adulta (Figura 7A e 7B).

[0084] Os experimentos para a quantificação relativa do gene EcR e ETHR por RT-qPCR em fêmeas adultas foram realizados 48 horas após a microinjeção. Os dados do tratamento com microinjeção do EcRdsRNA quando normalizado usando os dados do tratamento controle (água), mostrou diminuição de mais de 10 vezes, no acúmulo de transcritos de EcR, indicando silenciamento gênico de EcR (Figura 8A). A quantificação relativa do gene ETHR por RT-qPCR em fêmeas adultas quando normalizado usando os dados do tratamento controle água, mostrou diminuição no acúmulo de transcritos do ETHR em aproximadamente 5 vezes, indicando que houve silenciamento de ETHR em fêmeas adultas quando comparado ao controle (Figura 8B).

[0085] A mortalidade resultante do silenciamento de EcR e ETHR em fêmeas adultas de A. grandis, sugere que esses transcritos não são necessários somente para o processo de ecdise na fase larval, conforme demonstrado anteriormente em larvas de terceiro instar, mas também para a sobrevivência das fêmeas adultas de A. grandis.

[0086] As análises de quantidade de ovos originados de fêmeas tratadas com EcRdsRNA e ETHRdsRNA, no intervalo de 15 dias não apresentaram diferenças significativas em relação aos controles (dados não apresentados). Foram considerados viáveis, apenas os ovos eclodidos das larvas de primeiro instar, durante até sete dias, após a coleta do ovo. Não se observou alteração quanto a deposição e viabilidade dos ovos depositados pelas fêmeas tratadas com os respectivos dsRNAs, quando comparados aos controles, água e GUSdsRNA (Tukey).

[0087] Pela comparação dos resultados obtidos pelos tratamentos usando ETHRdsRNA e EcRdsRNA conclui-se que: Para o EcRdsRNA, a mortalidade inicial foi maior, em torno de 40%, mas houve maior quantidade de sobreviventes, representando 15% de adultos normais ao final de 20 dias do experimento inicial. Para o ETHRdsRNA, a mortalidade inicial foi menor, em torno de 20% e sem diferença significativa, porém, os fenótipos resultantes foram mais drásticos, onde apenas 1% dos sobreviventes tornou-se adulto sem má-formação e viável ao final de 20 dias do experimento inicial, demonstrando efetiva letalidade através do silenciamento deste gene em larvas de terceiro instar. Para ambos os genes o silenciamento em fêmeas adultas apresentou mortalidade em torno de 60%, demonstrando sua importância também para fêmeas adultas, assim como para o desenvolvimento de larvas de 3º instar de A. grandis.

Exemplo 6 - Composição e síntese química de construção gênica contendo 3 dsRNAs na forma estrutura para inibição de genes alvo de A. grandis.

[0088] Uma composição piramidal aplicando dsRNAs para silenciar três genes alvo do A. grandis, incluindo ETHRdsRNA, resultou em construção gênica sintetizada pela empresa Epoch Life Science, Inc. (Texas-EUA), para aplicação na transformação genética de plantas de algodão (Gossipium hirsutum). O cassete de expressão pCottondsRNAAgra-3 com 16.500 bp (SEQ ID NO 8), é composto de três sequencias nucleotídicas consecutivas, correspondente ao fragmento de dsRNA de genes validados como alvo e potenciais, para o controle de A. grandis, inclui-se ETHR, validado na presente invenção, CHS2 (quitina sintase 2 – Macedo et al, 2016) e Vit (vitelogenina – Coelho et al 2016). O segmento senso e antisenso contém os dsRNAs na forma estruturada conforme Macedo e colaboradores (PCT/BR2018/050087). A sequência do segmento em questão possui o promotor UCEA 1.7 (BRPI0701230-6), seguido do promotor da T7 RNA polimerase. Também compõem a construção a Ribozima de Selaguinella moellendorffii, denominada Rib5’, que se autocliva em faixa de pH > 7, flanqueando a extremidade 5’ do dsRNA, e a Ribozima de Vitis vinifera, flanqueando a extremidade 3’ do dsRNA, que se autocliva em faixa de pH > 7. As sequências gênicas são seguidas de ribozima com atividade autocatalitica em pH 4,0 (Jayasena, V. K.; Gold, L. “In vitro selection of self-cleaving RNAs with a low pH optimum”. Proceedings of the National Academy of Sciences. Volume 94, 10612-10617, 1997), aqui denominada Rib 3. A construção, inserida em planta de algodão, também possui regiões de travas de incompatibilidade, como descritas em Macedo et al, 2018 (PCT/BR2018/050087). Na extremidade 3’ do cassete de DNA foi inserida a sequência do terminador T-Nos, como descrito em Macedo (PCT/BR2018/050087).

[0089] Sintetizando, os dados da presente invenção, pela administração do EcRdsRNA e ETHRdsRNA em larvas de terceiro instar de A. grandis mostrou que estes são genes essenciais envolvidos na sobrevivência e desenvolvimento de A. grandis, e potenciais candidatos para a utilização na aplicação de técnicas biotecnológicas, incluindo a geração de plantas GM e não formulados, visando o controle deste inseto-praga.

Claims (35)

1. Molécula sintética de ácido nucléico caracterizada por ser selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.
2. Molécula sintética de ácido nucléico caracterizada por ser selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4.
3. Gene quimérico caracterizado por compreender:

   • a) um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2; e
   • b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).
4. Construção gênica caracterizada por compreender um ou mais genes quiméricos de acordo com a reivindicação 3.
5. Construção gênica caracterizada por compreender:

   • a) uma primeira região compreendendo a SEQ ID NO 3;
   • b) uma segunda região compreendendo a SEQ ID NO 5;
   • c) uma segunda região compreendendo a SEQ ID NO 7;
   • d) onde a primeira, segunda e terceira região são capazes de formar uma região de RNA dupla-fita, a qual pode ter, além do comprimento total da primeira, segunda e terceira região e uma região espaçadora após compreendendo a SEQ ID NO 9.
6. Vetor caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico sintética de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2.
7. Vetor caracterizado por compreender o gene quimérico da reivindicação 3.
8. Vetor caracterizado por compreender construções gênicas de acordo com a reivindicação 5.
9. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de o referido vetor ser capaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.
10. Seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.
11. Seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2.
12. Seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizada pelo fato da ingestão por coleópteros-praga de plantas, da sequência de um ribonucleotídeo de filamento duplo, compreendendo pelo menos um filamento complementar do referido fragmento, inibir ou reduzir a proliferação da referida praga.
13. Célula transformada caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2.
14. Célula transformada caracterizada por compreender o gene quimérico da reivindicação 3.
15. Célula transformada caracterizada por compreender construções gênicas de acordo com a reivindicação 5.
16. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada por ser uma célula procariótica.
17. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada por ser uma célula eucariótica.
18. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada por ser uma célula de vegetal ou bactéria.
19. Planta transformada caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.
20. Planta transformada caracterizada por compreender o gene quimérico da reivindicação 3.
21. Planta transformada caracterizada por compreender construções gênicas de acordo a reivindicação 5.
22. Planta de acordo com a reivindicação 19 caracterizada pelo fato de a molécula de ácido nucleico ser expressa em uma célula vegetal, sob a forma de uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo, e a ingestão de dieta contendo uma quantidade inibidora para inseto-praga da referida sequência do ribonucleotídeo de filamento duplo inibe ou reduz a proliferação da referida praga.
23. Planta de acordo com a reivindicação 22 caracterizada pelo fato do inseto-praga ser Anthonomus grandis.
24. Produto comerciável caracterizado pelo fato de ser produzido a partir de uma planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22 onde o referido produto comerciável compreende uma quantidade detectável da molécula de ácido nucleico conforme definida nas reivindicações 1 e 2 ou de um ribonucleotídeo expresso a partir da mesma.
25. Método para produzir organismos eucarióticos transgênicos nos quais a expressão de um gene alvo nas células do organismo é reduzida, caracterizado por compreender os estágios de:

    • i. prover uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2;
    • ii. inserir a molécula obtida em “i” em célula ou células do organismo para produzir uma célula ou células transgênicas; e
    • iii. crescer ou regenerar um organismo eucarioto transgênico da célula ou células transgênicas.
26. Uso de uma molécula de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 2, ou de uma sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 12 para controle de infestação de coleópteras caracterizado pelo fato da dita molécula estar presente na dieta de um coleóptera-praga.
27. Método para controle de infestação de coleópteras caracterizado pelo fato da célula do organismo eucarioto compreender ainda uma sequência de polinucleotídeo que codifica um agente pesticida.
28. Método de acordo com a reivindicação 27 caracterizado pelo fato do agente pesticida ser selecionado do grupo consistindo de patatina, uma proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, uma proteína Xenorhabdus insecticida, uma proteína Photorhabdus insecticida, uma proteína de Bacillus laterosporous insecticida, uma proteína de Bacillus sphaericus insecticida, e uma lignina.
29. Método de acordo com a reivindicação 26 caracterizado pelo fato do coleóptero praga ser Anthonomus grandis.
30. Método de acordo qualquer uma das reivindicações 25 a 28 caracterizado pelo fato que o modo de atuação da molécula de ácido nucleico ou da sequência de ribonucleotídeo de filamento duplo, ao ser ingerida pela praga, é o de supressão ou redução da expressão de um gene que execute uma função essencial para sobrevida do inseto, tal como ecdise, metamorfose, desenvolvimento e processos fisiológicos relacionados.
31. Método para melhorar o rendimento de plantas cultivadas, sujeitas à infestação por insetos-praga, caracterizado por compreender as etapas de:

    • i. Introdução de uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2 na referida planta;
    • ii. Cultivo da planta obtida em “i” de modo a permitir a expressão da referida molécula de ácido nucleico, onde essa expressão inibe ou reduz a proliferação da referida praga em que a melhora no rendimento de plantas cultivadas se dá através de aumento na produção por unidade de área.
32. Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizado pelo fato da expressão da molécula de ácido nucleico produzir uma molécula de RNA que suprime, pelo mesmo, um primeiro gene alvo em um inseto-praga que ingeriu uma porção da referida planta onde o gene alvo exercita, pelo menos uma função essencial para sobrevida do inseto ser selecionada do grupo de ecdise, metamorfose, desenvolvimento e processos fisiológicos relacionados.
33. Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizada pelo fato de o insetopraga ser Anthonomus grandis.
34. Método de produção de um produto comerciável caracterizado pelo fato onde o produto comercializável ser parte de planta obtida conforme definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 23, ou parte da mesma, e o preparo de um produto comerciável a partir da planta ou parte da mesma.
35. Método de produção de alimento ou ração caracterizado pelo fato de compreender a obtenção de uma planta definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, ou parte da mesma, e o preparo de alimento ou ração a partir da referida planta ou parte da mesma.