BR102019026730A2

BR102019026730A2 - ANTIMICROBIAL NANOSTRUCTURED LIPID CARRIERS

Info

Publication number: BR102019026730A2
Application number: BR102019026730-5A
Authority: BR
Inventors: Simone Ramos De Castro; Eneida De Paula; Talita Cesarim Mendonça; Lígia Nunes De Morais Ribeiro; Marcelo Lancellotti; Márcia Cristina Breitkreitz
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2019-12-15
Filing date: 2019-12-15
Publication date: 2021-06-29

Abstract

carreadores lipídicos nanoestruturados antimicrobianos . a presente invenção se refere a carreadores lipídicos nanoestruturados capazes de potencializar a ação antimicrobiana e aumentar a solubilidade de fármacos da classe das fluoroquinolonas. a presente invenção se insere na área médica e farmacêutica, mais especificamente, no ramo de produtos para uso médico-hospitalar.antimicrobial nanostructured lipid carriers. the present invention refers to nanostructured lipid carriers capable of enhancing the antimicrobial action and increasing the solubility of drugs of the fluoroquinolones class. the present invention is inserted in the medical and pharmaceutical area, more specifically, in the field of products for medical and hospital use.

Description

ANTIMICROBIAL NANOSTRUCTURED LIPID CARRIERS

field of invention

[1] A presente invenção se refere a carreadores lipídicos nanoestruturados capazes de potencializar a ação antimicrobiana e aumentar a solubilidade de fármacos da classe de fluoroquinolona.[1] The present invention refers to nanostructured lipid carriers capable of enhancing the antimicrobial action and increasing the solubility of drugs of the fluoroquinolone class.

[2] A presente invenção se insere na área médica e farmacêutica, mais especificamente, no ramo de produtos para uso médico-hospitalar.[2] The present invention is inserted in the medical and pharmaceutical area, more specifically, in the field of products for medical and hospital use.

Fundamentals of Invention

[3] A Ciprofloxacina (CIP) é um agente antibacteriano de amplo espectro da família fluoroquinolona, que bloqueia a atividade da enzima girasse de DNA bacteriano. Este fármaco tem uma solubilidade aquosa limitada e rápida taxa de depuração. Desta forma, os portadores lipídicos nanoestruturados (NLC) são os transportadoras muito apropriados para medicamentos hidrofóbicos, melhorando a sua biodisponibilidade, estabilidade e potência.[3] Ciprofloxacin (CIP) is a broad-spectrum antibacterial agent of the fluoroquinolone family that blocks the activity of the bacterial DNA enzyme gyrase. This drug has limited aqueous solubility and rapid clearance rate. Thus, nanostructured lipid carriers (NLC) are very suitable carriers for hydrophobic drugs, improving their bioavailability, stability and potency.

[4] No artigo científico de Shazly (2017), intitulado "Ciprofloxacin Controlled-Solid Lipid Nanoparticles: Characterization, In Vitro Release, and Antibacterial Activity Assessment", o objetivo do estudo era formular ciprofloxacino em nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) em uma tentativa de desenvolver um sistema de liberação controlada do ativo. Foram utilizados diferentes lipídeos sintéticos, com nome comercial conhecido (Softisan® 154, Dynasan® 118, and Imwitor® 900 K) e uma mistura de Tween 80 e desoxicolato de sódio como surfactante. Estas partículas tendem a apresentar menor estabilidade a longo prazo e menor eficiência de encapsulação do fármaco, como de fato encontrado (%EE = 64 a 71% no referido documento). Mesmo assim, verificou-se que SLNs carregadas com ciprofloxacino exibiram uma atividade antibacteriana superior e uma liberação controlada do ativo. Além disso, o documento descreve nanopartículas lipídicas de primeira geração (SLN), que contém somente lipídeos sólidos no seu interior. Nos resultados relatados, as nanopartículas de CIP apresentam liberação relativamente rápida, (100% em ca. 12h) e atividade antibacteriana superior à solução de CIP livre demonstrada contra 2 cepas bacterianas, embora sem relação quantitativa descrita. Diferentemente, a presente invenção utiliza lipídeos de origem natural (extraídos de fontes vegetais) e descreve uma formulação com segunda geração de nanocarreadores lipídicos, chamados carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC), que se caracterizam por ter um interior formado pela blenda de pelo menos um lipídio sólido e um lipídio líquido, na temperatura ambiente ou corpórea. Essa mistura confere menor grau de cristalinidade ao interior da partícula dos NLC (em relação às SLN), permitindo incorporação de maior quantidade de fármacos e maior estabilidade. Os resultados demonstram que as composições proporcionaram uma liberação mais prolongada e maior estabilidade de prateleira, além de serem capazes de aumentar em 30% a atividade de fármaco antimicrobiano da classe das fluoroquinolonas.[4] In Shazly's scientific paper (2017), entitled "Ciprofloxacin Controlled-Solid Lipid Nanoparticles: Characterization, In Vitro Release, and Antibacterial Activity Assessment", the aim of the study was to formulate ciprofloxacin into solid lipid nanoparticles (SLN) in one trial to develop a controlled asset release system. Different synthetic lipids, with known trade names (Softisan® 154, Dynasan® 118, and Imwitor® 900 K) and a mixture of Tween 80 and sodium deoxycholate as surfactant were used. These particles tend to have lower long-term stability and lower drug encapsulation efficiency, as actually found (%EE = 64 to 71% in that document). Even so, SLNs loaded with ciprofloxacin were found to exhibit superior antibacterial activity and controlled release of the active. In addition, the document describes first-generation lipid nanoparticles (SLN), which contain only solid lipids in their interior. In the results reported, the CIP nanoparticles show relatively fast release (100% in ca. 12h) and antibacterial activity superior to the free CIP solution demonstrated against 2 bacterial strains, although with no quantitative relationship described. Differently, the present invention uses lipids of natural origin (extracted from plant sources) and describes a formulation with second generation lipid nanocarriers, called nanostructured lipid carriers (NLC), which are characterized by having an interior formed by the blend of at least one lipid solid and a liquid lipid, at room or body temperature. This mixture confers a lower degree of crystallinity inside the NLC particle (compared to SLN), allowing the incorporation of a greater amount of drugs and greater stability. The results demonstrate that the compositions provided a longer release and greater shelf stability, in addition to being able to increase the activity of an antimicrobial drug of the fluoroquinolones class by 30%.

[5] O artigo científico de Nnamani et al (2019), intitulado "Preparation, characterization and in vitro antibacterial property of Ciprofloxacin-loaded nanostructured lipid carrier for treatment of Bacillus subtilis infection", refere-se ao estudo de carreadores lipídicos nanoestruturados sem atividade antimicrobianas de ciprofloxacino (CIPRO), compostos por lipídeos sintéticos como Precirol® ATO 5/Transcutol ® HP ou sebo bovino/Transcutol HP, além do surfactante poloxamer 188. Dentre os lipídios, o Precirol e o sebo bovino foram as gorduras sólidas e o Transcutol o lipídio líquido. É mencionado que o surfactante como o Poloxamer 188 comumente aumenta a porosidade da matriz para penetração do fluido mais fácil e liberação do ativo. Contudo, a formulação de que trata o documento foi somente testada contra a linhagem de B. subtilis, não podendo seu uso ser generalizado para cepas bacterianas de interesse na saúde, como as testadas na presente invenção. Diferentemente, a presente invenção utiliza lipídeos de origem natural (extraídos de fontes vegetais) e descreve uma formulação com segunda geração de nanocarreadores lipídicos, chamados carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC). Essa mistura confere menor grau de cristalinidade ao interior da partícula dos NLC (em relação às SLN), permitindo incorporação de maior quantidade de fármacos e maior estabilidade. Os nanocarreadores são de menor diâmetro que do documento apresentado, o que promove maior liberação do fármaco (maior área superficial) e pode potencializar sua internalização em células bacterianas. A atividade bactericida da composição e formulação foi testada contra uma dezena de cepas bacterianas gram positivas e negativas, todas patogênicas.[5] The scientific article by Nnamani et al (2019), entitled "Preparation, characterization and in vitro antibacterial property of Ciprofloxacin-loaded nanostructured lipid carrier for the treatment of Bacillus subtilis infection", refers to the study of nanostructured lipid carriers without activity ciprofloxacin antimicrobials (CIPRO), composed of synthetic lipids such as Precirol® ATO 5/Transcutol® HP or bovine tallow/Transcutol HP, in addition to the surfactant poloxamer 188. Among the lipids, Precirol and bovine tallow were solid fats and Transcutol the liquid lipid. It is mentioned that surfactant such as Poloxamer 188 commonly increases the porosity of the matrix for easier fluid penetration and active release. However, the formulation referred to in the document was only tested against the strain of B. subtilis, and its use cannot be generalized to bacterial strains of interest to health, such as those tested in the present invention. Differently, the present invention uses lipids of natural origin (extracted from plant sources) and describes a formulation with second generation lipid nanocarriers, called nanostructured lipid carriers (NLC). This mixture confers a lower degree of crystallinity inside the NLC particle (compared to SLN), allowing the incorporation of a greater amount of drugs and greater stability. The nanocarriers are smaller in diameter than in the document presented, which promotes greater release of the drug (greater surface area) and can enhance its internalization in bacterial cells. The bactericidal activity of the composition and formulation was tested against ten gram positive and negative bacterial strains, all pathogenic.

[6] O pedido de patente US 2013/0017239 refere-se a um sistema de liberação para ingredientes ativos o qual compreende nanopartículas lipídicas, tais como nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) ou carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) polimericamente revestidos, preparados preferencialmente por homogeneização a alta pressão ou pelo método de microemulsão. O referido documento prevê uma série de lipídios: sólidos e líquidos sintéticos (selecionados de uma variação enorme, desde triglicerídeos, glicerídeos, álcoois alifáticos de cadeia longa, ácidos graxos de cadeia média e longa, etc) ou naturais (óleos e ceras vegetais tais como cera de abelha). Igualmente os tensoativos foram selecionados a partir uma diversidade de tensoativos não iônicos (dentre os quais é citado o poloxamer 188, como exemplo) catiônicos, aniônicos, anfotéricos e suas misturas. Dentre os princípios ativos, são citados os agentes antimicrobianos, além de uma variedade de outras classes terapêuticas. Trata-se, o documento, de uma formulação genérica, cujo diferencial da presente invenção reside no revestimento das nanocarreadores lipídicos com agentes poliméricos. As composições das matrizes lipídicas das nanopartículas não são especificadas, que reivindica o uso de uma variedade de lipídios, sólidos e líquidos, naturais ou não, em surfactantes não iônicos ou não, para formar nanopartículas lipídicas recobertas por polímeros, naturais ou sintéticos, que podem ser usados para encapsular diferentes classes de fármacos. Diferentemente, a presente invenção não requer o uso de agente polimerizante e é específica para nanocarreadores de segunda geração (CLN). Os nanocarreadores são preparados exclusivamente com lipídios de origem natural e que tem uma ação intrínseca adjuvante. A ação bactericida da presente invenção é destacadamente maior que a do fármaco livre, contra mais de uma dezena de cepas bacterianas patogênicas, gram negativas e gram positivas.[6] Patent application US 2013/0017239 refers to a delivery system for active ingredients which comprises lipid nanoparticles, such as solid lipid nanoparticles (SLN) or polymerically coated nanostructured lipid carriers (NLC), preferably prepared by homogenization at high pressure or by the microemulsion method. The aforementioned document provides for a series of lipids: synthetic solids and liquids (selected from a huge range, from triglycerides, glycerides, long chain aliphatic alcohols, medium and long chain fatty acids, etc.) or natural (vegetable oils and waxes such as beeswax). Likewise, the surfactants were selected from a variety of nonionic surfactants (among which poloxamer 188 is cited as an example) cationic, anionic, amphoteric and their mixtures. Among the active principles, antimicrobial agents are mentioned, in addition to a variety of other therapeutic classes. It is, the document, a generic formulation, whose differential of the present invention resides in the coating of the lipid nanocarriers with polymeric agents. The compositions of the lipid matrices of the nanoparticles are not specified, which claims the use of a variety of lipids, solids and liquids, natural or not, in non-ionic surfactants or not, to form lipid nanoparticles coated with polymers, natural or synthetic, which can be used to encapsulate different classes of drugs. In contrast, the present invention does not require the use of a polymerizing agent and is specific for second generation nanocarriers (CLN). Nanocarriers are prepared exclusively with lipids of natural origin and which have an intrinsic adjuvant action. The bactericidal action of the present invention is remarkably greater than that of the free drug, against more than a dozen pathogenic bacterial strains, gram negative and gram positive.

[7] A tese de doutorado de Santiago (2018), intitulada "Carreadores lipídicos nanoestruturados contendo anfotericina B: desenvolvimento, avaliação das propriedades farmacêuticas e estabilidade sob acondicionamento", teve como objetivo o desenvolvimento de uma CLN contendo anfotericina B (AmB), conhecido antifúngico, e avaliação das suas propriedades físico-químicas e farmacêuticas. As CLNs formulados com óleo de gergelim exibiram melhores resultados e um desenho experimental foi utilizado para determinar a concentração dos componentes da formulação. Uma combinação de lipídio sólido e líquido na proporção de 7:3(p/p) e tensoativo na concentração de 3%(p/v) foi utilizada e sugerem que os CLNs desenvolvidos e analisados nesse trabalho podem ser uma alternativa para o tratamento de doenças que envolvam o uso da AmB, pois verificou-se que o CLN formulado com esse óleo de gergelim exibiu melhores resultados. Adicionalmente, utilizou-se o tensoativo Pluronic® F68, porém o lipídio sólido utilizado (monoestearato de glicerila) foi único, sintético e diferente dos usados na presente invenção, sem qualquer descrição de atividade antimicrobiana. Diferentemente, a presente invenção refere-se a matriz lipídica é totalmente de origem natural e apresentaram atividade antibacteriana intrínseca, além de potencializar o efeito das fluoroquinolonas.[7] Santiago's doctoral thesis (2018), entitled "Nanostructured lipid carriers containing amphotericin B: development, evaluation of pharmaceutical properties and stability under packaging", aimed at the development of a CLN containing amphotericin B (AmB), known antifungal, and evaluation of its physicochemical and pharmaceutical properties. CLNs formulated with sesame oil exhibited better results and an experimental design was used to determine the concentration of formulation components. A combination of solid and liquid lipid at a ratio of 7:3(w/w) and surfactant at a concentration of 3%(w/v) was used and suggest that the CLNs developed and analyzed in this work may be an alternative for the treatment of diseases involving the use of AmB, as it was found that CLN formulated with this sesame oil exhibited better results. Additionally, the surfactant Pluronic® F68 was used, but the solid lipid used (glyceryl monostearate) was unique, synthetic and different from those used in the present invention, without any description of antimicrobial activity. In contrast, the present invention refers to the lipid matrix that is totally of natural origin and showed intrinsic antibacterial activity, in addition to enhancing the effect of fluoroquinolones.

[8] A dissertação de mestrado de Oliveira (2018), intitulado "Caracterização físico-química e desenvolvimento de métodos analíticos para manteiga de tucumã (Astrocaryum aculeatum)" caracterizou a manteiga da amêndoa de tucumã e propôs métodos analíticos para doseamento desta matéria prima com a caracterização físico-química pelos testes de densidade de massa e relativa, índices de refração, acidez, saponificação, peróxido, umidade, faixa de fusão, viscosidade e espectrofotometria de absorção na região do IV, doseamento de ácidos graxos, estudos de análise térmica e fotoestabilidade, potencial antioxidante, carotenóides totais e avaliação da atividade antimicrobiana. Após o teste de fotodegradação, os lotes apresentaram perda menor que 10% no teor de ácidos graxos e não apresentaram mudança no espectro de infravermelho, sugerindo que a manteiga é fotoestável. A manteiga apresentou-se termicamente estável e com mais de 50% de atividade antioxidante, além de possuir ampla atividade antibacteriana. Diferentemente, a presente invenção tem como vantagem a aplicabilidade da manteiga de tucumã num sistema carreador de fármacos de base nanotecnológica (NLC). Desta forma, a manteiga de tucumã, além dos outros lipídios sólidos naturais testados, agrega ao sistema sua atividade antimicrobiana intrínseca (já determinada isoladamente).[8] Oliveira's master's thesis (2018), entitled "Physicochemical characterization and development of analytical methods for tucumã butter (Astrocaryum aculeatum)" characterized tucumã almond butter and proposed analytical methods for measuring this raw material with physical-chemical characterization by mass and relative density tests, refractive indices, acidity, saponification, peroxide, moisture, melting range, viscosity and absorption spectrophotometry in the IR region, fatty acid assay, thermal analysis studies and photostability, antioxidant potential, total carotenoids and evaluation of antimicrobial activity. After the photodegradation test, the batches showed a loss of less than 10% in fatty acid content and showed no change in the infrared spectrum, suggesting that the butter is photostable. Butter was thermally stable and had more than 50% antioxidant activity, in addition to having broad antibacterial activity. Differently, the present invention has the advantage of the applicability of tucumã butter in a drug carrier system based on nanotechnology (NLC). Thus, tucumã butter, in addition to the other natural solid lipids tested, adds its intrinsic antimicrobial activity to the system (already determined in isolation).

[9] O documento de patente de invenção WO 2016/065444 refere-se a processo de obtenção de um carreador lipídico nanoestruturado (CLN) usando surfactantes do tipo dos poloxamers (copolímeros tribloco de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno) através da homogeneização a quente, sob alta pressão. Tais CLN, compreenderam uma mistura de dois lipídios sólidos com um lipídio líquido, mais surfactante selecionado dentre a família dos poloxamers. A invenção do documento possui aplicação cosmética somente, especificamente para tratamento capilar, contribuindo para a retenção da umidade nas fibras capilares por tempo prolongado, redução do frizz dos fios e maior brilho. Não há menção ao carreamento de moléculas ativas, nem há dados sobre a estabilidade da mesma. Diferentemente, a presente invenção desenvolveu nanocarreadores lipídicos a partir de lipídios (sólidos e líquidos) que já possuíssem alguma atividade antimicrobiana intrínseca relatada, a fim de otimizar carreadores que potencializassem ou trabalhassem sinergicamente com a atividade antimicrobiana das fluoroquinolonas.[9] The patent document WO 2016/065444 refers to a process for obtaining a nanostructured lipid carrier (CLN) using poloxamers type surfactants (polyoxyethylene-polyoxypropylene-polyoxyethylene triblock copolymers) through hot homogenization, under high pressure. Such CLN comprised a mixture of two solid lipids with a liquid lipid, plus a surfactant selected from the family of poloxamers. The invention of the document has cosmetic application only, specifically for hair treatment, contributing to the retention of moisture in the hair fibers for a long time, reducing the frizz of the strands and greater shine. There is no mention of the carrying of active molecules, nor are there data on its stability. In contrast, the present invention developed lipid nanocarriers from lipids (solids and liquids) that already had some reported intrinsic antimicrobial activity, in order to optimize carriers that potentiate or work synergistically with the antimicrobial activity of fluoroquinolones.

[10] O artigo científico de Yamaguchi (2012), intitulado "Óleo de copaíba e suas propriedades medicinais: revisão bibliográfica", faz uma revisão bibliográfica sobre o óleo de copaíba, no que se refere às suas propriedades medicinais e toxicológicas. O óleo de copaíba, extraído de uma árvore nativa do Brasil, a Copaifera sp., apresenta múltiplas aplicações de grande interesse medicinal. O óleo é utilizado para diversas indicações, como exemplo, anti-inflamatória, antimicrobiana, antitumoral, antinociceptivo, atividade sobre a mucosa gástrica, função renal e hepática. Diferentemente, a presente invenção desenvolveu nanocarreadores lipídicos a partir de lipídios (sólidos e líquidos), que já possuíssem alguma atividade antimicrobiana intrínseca, como o óleo de copaíba (ou outros óleos vegetais), no preparo de sistema nanoparticulado (NLC) capaz de carrear fluoroquinolonas, potencializando a atividade antimicrobiana destas.[10] The scientific article by Yamaguchi (2012), entitled "Copaiba oil and its medicinal properties: literature review", makes a literature review on copaiba oil, with regard to its medicinal and toxicological properties. Copaiba oil, extracted from a tree native to Brazil, Copaifera sp., has multiple applications of great medicinal interest. The oil is used for various indications, such as anti-inflammatory, antimicrobial, antitumor, antinociceptive, activity on the gastric mucosa, kidney and liver function. Differently, the present invention developed lipid nanocarriers from lipids (solids and liquids), which already had some intrinsic antimicrobial activity, such as copaiba oil (or other vegetable oils), in the preparation of a nanoparticulate system (NLC) capable of carrying fluoroquinolones , enhancing their antimicrobial activity.

Brief description of the invention

[11] A presente invenção se refere a carreadores lipídicos nanoestruturados capazes de potencializar a ação antimicrobiana e aumentar a solubilidade de fármacos da classe da fluoroquinolona.[11] The present invention refers to nanostructured lipid carriers capable of enhancing the antimicrobial action and increasing the solubility of drugs in the fluoroquinolone class.

[12] Os carreadores lipídicos nanoestruturados compreendem:

- 4 a 7% de lipídios sólidos;
- 3 a 6% de lipídios líquidos;
- 2,5 e 5% de surfactante; e
- 0,3 a 3% de composto antimicrobiano.

[12] Nanostructured lipid carriers comprise:

- 4 to 7% solid lipids;
- 3 to 6% of liquid lipids;
- 2.5 and 5% surfactant; and
- 0.3 to 3% of antimicrobial compound.

Brief description of the figures

[13] Na Figura 1 apresentam-se dados relativos ao tamanho (A), PDI (B) e potencial Zeta (C) das formulações controle (CLN sem CIP), analisadas durante o período de estocagem de 365 dias, em temperatura ambiente (25 ± 2 °C).[13] Figure 1 presents data on the size (A), PDI (B) and Zeta potential (C) of the control formulations (CLN without CIP), analyzed during the 365-day storage period, at room temperature ( 25 ± 2 °C).

[14] Na Figura 2 apresentam-se dados relativos ao tamanho (A), PDI (B) e potencial Zeta (C) das CLN/CIP com o fármaco, analisadas durante o período de estocagem de 365 dias em temperatura ambiente (25 ± 2°C).[14] Figure 2 presents data on the size (A), PDI (B) and Zeta potential (C) of the CLN/CIP with the drug, analyzed during the 365-day storage period at room temperature (25 ± 2°C).

[15] Na Figura 3 apresentam-se fotomicrografias (MET), mostrando a morfologia das partículas de CLN. A e B = CLN6 controle (sem CIP), C e D CLN6/CIP. As imagens apresentam-se em duas magnificações diferentes: de 60.000x (esquerda) e 100.000x (direita).[15] In Figure 3, photomicrographs (TEM) are presented, showing the morphology of the CLN particles. A and B = CLN6 control (without CIP), C and D CLN6/CIP. The images are presented in two different magnifications: 60,000x (left) and 100,000x (right).

[16] Na Figura 4 apresenta-se o perfil de liberação in vitro de CIP livre e encapsulada em nanocarreadores (CLN6), na temperatura de 37°C.[16] Figure 4 shows the in vitro release profile of free and encapsulated CIP in nanocarriers (CLN6) at 37°C.

Detailed description of the invention

[17] A presente invenção se refere a carreadores lipídicos nanoestruturados capazes de potencializar a ação antimicrobiana e aumentar a solubilidade de fármacos da classe das fluoroquinolonas.[17] The present invention refers to nanostructured lipid carriers capable of enhancing the antimicrobial action and increasing the solubility of drugs from the fluoroquinolone class.

[18] Os carreadores lipídicos nanoestruturados compreendem:

- 4 a 7 % de lipídios sólidos;
- 3 a 6 % de lipídios líquidos;
- 2,5 a 5% de surfactante; e
- 0,3 a 3 % de composto antimicrobiano.

[18] Nanostructured lipid carriers comprise:

- 4 to 7% solid lipids;
- 3 to 6% of liquid lipids;
- 2.5 to 5% surfactant; and
- 0.3 to 3% of antimicrobial compound.

[19] Os lipídios sólidos podem ser selecionados do grupo: cera de abelha, manteiga de tucumã e manteiga de ucuuba.[19] Solid lipids can be selected from the group: beeswax, tucumã butter and ucuuba butter.

[20] Os lipídios líquidos podem ser selecionados do grupo: óleo de gergelim, óleo de andiroba, óleo de copaíba e óleo de alecrim.[20] Liquid lipids can be selected from the group: sesame oil, andiroba oil, copaiba oil and rosemary oil.

[21] O surfactante pode ser selecionado do grupo dos copolímeros tribloco (polioxietileno / polioxipropileno / polioxietileno) como o poloxamer 188 (ou Pluronic® F68).[21] The surfactant can be selected from the group of triblock copolymers (polyoxyethylene / polyoxypropylene / polyoxyethylene) such as poloxamer 188 (or Pluronic® F68).

[22] O composto antimicrobiano pode ser selecionado da classe das fluoroquinolonas, preferencialmente ciprofloxacina.[22] The antimicrobial compound can be selected from the class of fluoroquinolones, preferably ciprofloxacin.

Selection of different natural lipid matrices

[23] As matrizes lipídicas dos carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são constituídas por diferentes combinações lipídicas naturais, sendo os lipídios sólidos: cera de abelha, manteiga de tucumã e manteiga de ucuuba, e os lipídios líquidos: óleo de gergelim, óleo de andiroba, óleo de copaíba e óleo de alecrim (Tabela 1).[23] The lipid matrices of nanostructured lipid carriers (CLN) are constituted by different natural lipid combinations, the solid lipids being: beeswax, tucumã butter and ucuuba butter, and the liquid lipids: sesame oil, andiroba oil , copaiba oil and rosemary oil (Table 1).

[24] Os CLN preparados apresentam como composição padrão as seguintes concentrações: 7% de lipídio sólido, 3% de lipídio líquido, 2,5% de surfactante (Poloxamer 188 ou Pluronic® F68) e 0,3% do antimicrobiano ciprofloxacina - CIP (fármaco modelo para a classe fluoroquinolonas com ação antimicrobiana). As diferentes combinações de excipientes resultaram num total de 11 formulações, além de seus controles - preparados sem incorporação do fármaco CIP - de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1: Excipientes estruturais dos CLN desta invenção.

[24] The prepared CLN have as standard composition the following concentrations: 7% solid lipid, 3% liquid lipid, 2.5% surfactant (Poloxamer 188 or Pluronic® F68) and 0.3% of the antimicrobial ciprofloxacin - CIP (model drug for the fluoroquinolone class with antimicrobial action). The different combinations of excipients resulted in a total of 11 formulations, in addition to their controls - prepared without incorporation of the CIP drug - according to Table 1.
Table 1: Structural excipients of the CLNs of this invention.

Preparation of nanostructured lipid carriers (CLN)

[25] O preparo foi realizado pelo método da emulsificação-ultrasonicação, com a utilização diferentes lipídios estruturais naturais (ver Tabela 1). Ambos os lipídios (sólido e líquido) foram aquecidos em banho-maria 10 °C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido. Logo após, 0,3% do antimicrobiano CIP (fármaco modelo) foi incorporado ao meio lipídico. Simultaneamente, a fase aquosa composta pelo surfactante polimérico Poloxamer 188 e água, foi aquecida na mesma temperatura. Para a formação da pré-emulsão, a fase aquosa foi adicionada à fase lipídica, sob agitação de 10000 rpm por 3 min, utilizando-se agitador Ultra-Turrax. A pré-emulsão formada foi submetida à ultrassonicação, na potência de 50W e 20 kHz, em ciclos de 30 seg. (ligado/desligado) durante 30 min. Ao final a nanoemulsão foi arrefecida em banho de gelo, até 25 °C. Todas as formulações apresentaram aparência opaca, homogênea, líquida e livre de agregados.[25] The preparation was carried out using the emulsification-ultrasonication method, using different natural structural lipids (see Table 1). Both lipids (solid and liquid) were heated in a water bath 10 °C above the melting temperature of the solid lipid. Soon after, 0.3% of the antimicrobial CIP (model drug) was incorporated into the lipid medium. Simultaneously, the aqueous phase composed of the polymeric surfactant Poloxamer 188 and water was heated at the same temperature. To form the pre-emulsion, the aqueous phase was added to the lipid phase, under agitation at 10000 rpm for 3 min, using an Ultra-Turrax agitator. The pre-emulsion formed was subjected to ultrasonication, at power of 50W and 20 kHz, in cycles of 30 sec. (on/off) for 30 min. At the end, the nanoemulsion was cooled in an ice bath to 25 °C. All formulations presented opaque, homogeneous, liquid and aggregate-free appearance.

Size determination, particle polydispersion index and Zeta potential

[26] A técnica espectroscópica de correlação por fótons (DLS) foi empregada para determinar o diâmetro médio das partículas e o índice de polidispersão (PDI) dos diferentes sistemas preparados, no equipamento ZetaSizer Nano ZS 90 (Malvern) a 25 °C. Os valores do potencial Zeta (ZP, em mV) foram determinados de acordo com o método de microeletroforese no mesmo equipamento. Para ambos os testes os diferentes sistemas foram diluídos 1:1000 (v/v), e os resultados expressos pela média de 3 medidas.[26] The spectroscopic photon correlation (DLS) technique was used to determine the mean particle diameter and polydispersion index (PDI) of the different prepared systems, in the ZetaSizer Nano ZS 90 (Malvern) equipment at 25 °C. Zeta potential values (ZP, in mV) were determined according to the microelectrophoresis method in the same equipment. For both tests, the different systems were diluted 1:1000 (v/v), and the results expressed as the average of 3 measurements.

[27] Os nanocarreadores lipídicos controle (preparadas sem fármaco) apresentaram diâmetro médio de 202,2 ± 2,65 a 351,4 ± 7,04 nm, PDI de 0,10 ± 0,01 a 0,23 ± 0,01 e ZP = -24,3 ± 0,4 a -38,3 ± 1,3 mV (Figura 1). Por outro lado, as formulações contendo fármaco apresentaram diâmetro médio entre 215,8 ± 18 nm e 355,5 ± 4,79 nm, PDI de 0,08 ± 0,03 a 0,26 ± 0,02 e ZP = -20,7 ± 0,5 a -43,7 ±1,7 mV (Figura 2). Esses parâmetros (tamanho, PDI e ZP) foram avaliados ao longo de 365 dias em amostras armazenadas na temperatura de 25°C sem variação significativa, indicando boa estabilidade das formulações. Também não foi observada separação de fases ou formação de agregados nas formulações, ao longo desse período.[27] The control lipid nanocarriers (prepared without drug) had a mean diameter of 202.2 ± 2.65 to 351.4 ± 7.04 nm, PDI of 0.10 ± 0.01 to 0.23 ± 0.01 and ZP = -24.3 ± 0.4 to -38.3 ± 1.3 mV (Figure 1). On the other hand, the drug-containing formulations had a mean diameter between 215.8 ± 18 nm and 355.5 ± 4.79 nm, PDI from 0.08 ± 0.03 to 0.26 ± 0.02 and ZP = -20 .7 ± 0.5 to -43.7 ± 1.7 mV (Figure 2). These parameters (size, PDI and ZP) were evaluated over 365 days in samples stored at a temperature of 25°C without significant variation, indicating good stability of the formulations. Also, no phase separation or formation of aggregates was observed in the formulations during this period.

Particle Tracking Analysis (NTA)

[28] A técnica de NTA utiliza um vídeo-microscópio para analisar as propriedades de partículas em suspensão. Os experimentos realizados no e espalhamento de luz e o movimento browniano de equipamento NanoSight NS300 (com um feixe de laser verde, λ = 532 nm, a 25 oC) permitiram mensurar o tamanho e a concentração de nanocarreadores lipídicos em suspensão líquida. As medidas foram feitas após diluição das amostras em água deionizada (1:5000 v/v).[28] The NTA technique uses a video microscope to analyze the properties of suspended particles. The experiments carried out in the light scattering and Brownian motion of a NanoSight NS300 equipment (with a green laser beam, λ = 532 nm, at 25 oC) allowed to measure the size and concentration of lipid nanocarriers in liquid suspension. The measurements were made after diluting the samples in deionized water (1:5000 v/v).

[29] A tabela 2 mostra os resultados obtidos quanto o número de partículas/mL, que serão usados na interpretação dos resultados de atividade antimicrobiana. Observa-se que as formulações apresentaram número de partículas na faixa de 1013 (partículas/mL), tendo a incorporação de CIP alterado significativamente o número de partículas/mL de todas as formulações testadas (1 a 11) quando comparadas aos seus respectivos controles.
Tabela 2: Número de partículas/mL dos CLN preparados sem (CLN 1-11) e com CIP (CLN 1-11/CIP). Dados obtidos por NTA.

Análise estatística Two-way ANOVA. Teste Bonferroni's. (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001), **** (p<0,0001). CLN1 vs CLN1/CIP, CLN2 vs CLN2/CIP, CLN3 vs CLN3/CIP, CLN4 vs CLN4/CIP, CLN5 vs CLN5/CIP, CLN6 vs CLN6/CIP, CLN7 vs CLN7/CIP, CLN8 vs CLN8/CIP, CLN9 vs CLN9/CIP, CLN10 vs CLN10/CIP e CLN11 vs CLN11/CIP.[29] Table 2 shows the results obtained for the number of particles/mL, which will be used in interpreting the results of antimicrobial activity. It is observed that the formulations had a number of particles in the range of 1013 (particles/mL), with the incorporation of CIP significantly changing the number of particles/mL of all tested formulations (1 to 11) when compared to their respective controls.
Table 2: Number of particles/ml of CLN prepared without (CLN 1-11) and with CIP (CLN 1-11/CIP). Data obtained by NTA.

Two-way ANOVA statistical analysis. Bonferroni's Test. (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001), **** (p<0.0001). CLN1 vs CLN1/CIP, CLN2 vs CLN2/CIP, CLN3 vs CLN3/CIP, CLN4 vs CLN4/CIP, CLN5 vs CLN5/CIP, CLN6 vs CLN6/CIP, CLN7 vs CLN7/CIP, CLN8 vs CLN8/CIP, CLN9 vs CLN9/CIP, CLN10 vs CLN10/CIP and CLN11 vs CLN11/CIP.

Validation of the analytical methodology for the quantification of ciprofloxacin

[30] A quantificação da ciprofloxacina foi feita por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os parâmetros cromatográficos utilizados foram: fase estacionária: coluna 250 x 4, 6 mm Luna® C18 (2) de fase reversa; fase móvel: solução de ácido fosfórico 0,025 M (pH 2,0) e solução de acetonitrila (82:18% v:v), fluxo de 1,5 mL/min, a 25 oC. Os parâmetros avaliados foram linearidade, especificidade, exatidão, precisão, limite de quantificação e detecção. Para isso, a curvas analíticas foram feitas em tampão fosfato (pH 7,4) e o fármaco determinado em comprimento de onda de 275 nm.[30] The quantification of ciprofloxacin was performed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The chromatographic parameters used were: stationary phase: 250 x 4.6 mm column Luna® C18 (2) reversed phase; mobile phase: 0.025 M phosphoric acid solution (pH 2.0) and acetonitrile solution (82:18% v:v), flow 1.5 ml/min, at 25°C. The parameters evaluated were linearity, specificity, accuracy, precision, quantification limit and detection. For this, analytical curves were made in phosphate buffer (pH 7.4) and the drug determined at a wavelength of 275 nm.

[31] Obteve-se um tempo de retenção em 3,9 min correspondente ao fármaco CIP. As curvas de calibração realizadas foram feitas em concentrações entre de 0,07-1,5 mM, tendo como equação da reta: y=29346666x + 29939,05, com R2 de 0,9998 que confirmou a linearidade do método. A precisão (DPR < 3%), a exatidão (98 - 102% de recuperação), o limite de detecção (4,06 x 10-4 M) e o limite de quantificação (1,35 x 10-3 M) mostraram-se de acordo com o exigido pela ANVISA 2017 (Resolução da Diretoria Colegiada - RDC N° 166, de 24 de julho de 2017 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária).[31] A retention time of 3.9 min corresponding to the CIP drug was obtained. Calibration curves were performed at concentrations between 0.07-1.5 mM, with the equation of the straight line: y=29346666x + 29939.05, with R2 of 0.9998 which confirmed the linearity of the method. Precision (DPR < 3%), accuracy (98 - 102% recovery), limit of detection (4.06 x 10-4 M) and limit of quantification (1.35 x 10-3 M) showed to comply with the requirements of ANVISA 2017 (Resolution of the Collegiate Board - RDC No. 166, of July 24, 2017 of the National Health Surveillance Agency).

Determination of the encapsulation efficiency (EE%) of ciprofloxacin

[32] A eficiência de encapsulação de CIP foi determinada pelo método de ultrafiltração-centrifugação. Inicialmente 0,4 mL de amostra de CLN/CIP foi transferida para uma unidade de filtração com poros de 10 kDa acoplada a tubos tipo Eppendorf e centrifugadas por 20 min. a 4100g. A concentração de CIP livre foi quantificada por CLAE, no filtrado. A eficiência de encapsulação (%EE) de ciprofloxacina foi calculada pela relação entre a [CIP] no filtrado e concentração inicial (100%).[32] The encapsulation efficiency of CIP was determined by the ultrafiltration-centrifugation method. Initially 0.4 mL of CLN/CIP sample was transferred to a filtration unit with 10 kDa pores coupled to Eppendorf tubes and centrifuged for 20 min. to 4100g. The concentration of free CIP was quantified by HPLC in the filtrate. The encapsulation efficiency (%EE) of ciprofloxacin was calculated by the relationship between [CIP] in the filtrate and initial concentration (100%).

[33] A tabela 3 mostra os resultados de eficiência de encapsulação de CIP pelas 11 formulações de CLN produzidas. As formulações exibiram uma boa eficiência de encapsulação (>72%), apresentando diferenças significativas entre os CLN de diferentes matrizes lipídicas. Esses resultados mostraram que a elevada lipofilicidade do fármaco favoreceu sua interação com a maioria dos lipídios formadores dos nanocarreadores.
Tabela 3: Porcentagem de encapsulação de ciprofloxacina nos CLN desenvolvidos.

Análise estatística One-way ANOVA. Teste Tukey's. * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001), **** (p<0,0001). a CLN1/CIP vs CLN2/CIP, b CLN1/CIP vs CLN3/CIP, c CLN1/CIP vs CLN4/CIP, d CLN1/CIP vs CLN8/CIP, e CLN1/CIP vs CLN10/CIP, f CLN2/CIP vs CLN3/CIP, g CLN2/CIP vs CLN4/CIP, h CLN2/CIP vs CLN5/CIP, i CLN2/CIP vs CLN6/CIP, j CLN2/CIP vs CLN7CIP, k CLN2/CIP vs CLN8/CIP, l CLN2/CIP vs CLN9/CIP, m CLN2/CIP vs CLN10/CIP, n CLN2/CIP vs CLN11/CIP, o CLN3/CIP vs CLN4/CIP, p CLN3/CIP vs CLN6/CIP, q CLN3/CIP vs CLN8/CIP, r CLN3/CIP vs CLN10/CIP, s CLN4/CIP vs CLN5/CIP, t CLN4/CIP vs CLN6/CIP, u CLN4/CIP vs CLN7/CIP, v CLN4/CIP vs CLN8/CIP, w CLN4/CIP vs CLN9/CIP, x CLN4/CIP vs CLN10/CIP, y CLN4/CIP vs CLN11/CIP, z CLN5/CIP vs CLN10/CIP, ab CLN6/CIP vs CLN8/CIP, ac CLN6/CIP vs CLN10/CIP, ad CLN7/CIP vs CLN8/CIP, ae CLN7/CIP vs CLN10/CIP, af CLN8/CIP vs CLN10/CIP e ag CLN10/CIP vs CLN11/CIP.[33] Table 3 shows the CIP encapsulation efficiency results for the 11 produced CLN formulations. The formulations exhibited good encapsulation efficiency (>72%), showing significant differences between CLN from different lipid matrices. These results showed that the high lipophilicity of the drug favored its interaction with most lipids that form nanocarriers.
Table 3: Percentage of ciprofloxacin encapsulation in developed CLN.

One-way ANOVA statistical analysis. Tukey's Test. * (p<0.05), ** (p<0.01), *** (p<0.001), **** (p<0.0001). a CLN1/CIP vs CLN2/CIP, b CLN1/CIP vs CLN3/CIP, c CLN1/CIP vs CLN4/CIP, d CLN1/CIP vs CLN8/CIP, and CLN1/CIP vs CLN10/CIP, f CLN2/CIP vs CLN3/CIP, g CLN2/CIP vs CLN4/CIP, h CLN2/CIP vs CLN5/CIP, i CLN2/CIP vs CLN6/CIP, j CLN2/CIP vs CLN7CIP, k CLN2/CIP vs CLN8/CIP, 1 CLN2/ CIP vs CLN9/CIP, m CLN2/CIP vs CLN10/CIP, n CLN2/CIP vs CLN11/CIP, o CLN3/CIP vs CLN4/CIP, p CLN3/CIP vs CLN6/CIP, q CLN3/CIP vs CLN8/CIP , r CLN3/CIP vs CLN10/CIP, s CLN4/CIP vs CLN5/CIP, t CLN4/CIP vs CLN6/CIP, u CLN4/CIP vs CLN7/CIP, v CLN4/CIP vs CLN8/CIP, w CLN4/CIP vs CLN9/CIP, x CLN4/CIP vs CLN10/CIP, y CLN4/CIP vs CLN11/CIP, x CLN5/CIP vs CLN10/CIP, ab CLN6/CIP vs CLN8/CIP, ac CLN6/CIP vs CLN10/CIP, ad CLN7/CIP vs CLN8/CIP, ae CLN7/CIP vs CLN10/CIP, af CLN8/CIP vs CLN10/CIP and ag CLN10/CIP vs CLN11/CIP.

Transmission electron microscopy (TEM) of lipid nanocarriers

[34] As amostras foram visualizadas em microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss - LEO 906). Para o preparo da amostra uma gota da formulação, contendo ou não CIP, foi adicionada a uma grade de ouro. Após 10 s, o excesso da amostra foi retirado e uma gota de solução aquosa de uranila a 2% (p/p) adicionada, no intuito de melhorar o contraste das imagens. Após cerca de 8s, o excesso foi retirado com papel de filtro e, em seguida, uma gota de água Milli-Q foi adicionada à grade e o excesso retirado, após 5 s. Em seguida, a grade permaneceu em repouso, até a secagem das amostras e medida.[34] The samples were visualized in a transmission electron microscope (Zeiss - LEO 906). To prepare the sample, a drop of the formulation, containing or not CIP, was added to a gold grid. After 10 s, the excess sample was removed and a drop of 2% (w/w) aqueous uranyl solution was added, in order to improve the contrast of the images. After about 8s the excess was removed with filter paper and then a drop of Milli-Q water was added to the grid and the excess removed after 5s. Then, the grid remained at rest until the samples dried and measured.

[35] As imagens de microscopia eletrônica foram realizadas para caracterização da morfologia dos CLN. Para esse experimento foi selecionada a CLN6/CIP e seu controle, que apresentaram as melhores características físico-químicas para esses sistemas (ex. menor tamanho e PDI, maior %EE, liberação prolongada e potencialização da atividade antimicrobiana). As Figuras 3A e B mostram CLN6 controle e as Figura 4C e D CLN6/CIP (com rarmaco). As imagens revelaram que as partículas apresentavam morfologia aproximadamente esférica e com superfícies bem delimitadas. O tamanho das partículas variou entre 200 e 240 nm, sem e com fármaco, respectivamente. Esses resultados corroboram os achados do DLS (Fig. 1 e 2). Além disso, ficou evidente que a encapsulação de CIP não perturbou a integridade das nanocarreadores lipídicos produzidos, confirmando os resultados de DLS e NTA.[35] Electron microscopy images were taken to characterize the morphology of the CLN. For this experiment, CLN6/CIP and its control were selected, which presented the best physicochemical characteristics for these systems (eg smaller size and PDI, higher %EE, prolonged release and potentiation of antimicrobial activity). Figures 3A and B show control CLN6 and Figure 4C and D CLN6/CIP (with arm). The images revealed that the particles had an approximately spherical morphology and well-defined surfaces. Particle size ranged between 200 and 240 nm, without and with drug, respectively. These results corroborate the DLS findings (Figs 1 and 2). Furthermore, it was evident that the encapsulation of CIP did not disturb the integrity of the produced lipid nanocarriers, confirming the results of DLS and NTA.

In Vitro Ciprofloxacin Release Assay

[36] Para os ensaios de liberação in vitro foram utilizadas células de difusão vertical do tipo Franz, um sistema de dois compartimentos separado por uma barreira semi-seletiva. Usamos uma membrana de diálise de poro de 100 nm como modelo de barreira, separando a amostra (0,2 mL no compartimento doador) do compartimento aceptor (15 mL) com solução de tampão fosfato-salino (PBS 5 mM, pH 7,4). A solução do compartimento aceptor foi mantida sob leve agitação (300 rpm) a 37°C. Em intervalos padronizados, 0,2 mL de amostra foi retirado do compartimento aceptor, com reposição do volume retirado, até completa liberação. CIP foi quantificada por CLAE.[36] For the in vitro release assays, Franz-type vertical diffusion cells were used, a two-compartment system separated by a semi-selective barrier. We used a 100 nm pore dialysis membrane as a barrier model, separating the sample (0.2 mL in the donor compartment) from the acceptor compartment (15 mL) with a phosphate-buffered saline solution (5 mM PBS, pH 7.4 ). The acceptor compartment solution was kept under gentle agitation (300 rpm) at 37°C. At standardized intervals, 0.2 mL of sample was removed from the acceptor compartment, with replacement of the removed volume, until complete release. CIP was quantified by HPLC.

[37] A figura 4 apresenta o perfil de liberação de CIP, a partir de uma solução controle (CIP livre) e de CLN6/CIP por um período de 24 horas, a 37°C. Nota-se que a liberação da CIP a partir da solução controle foi relativamente rápida, com 100% de liberação na fase receptora após 4 horas. No perfil de liberação de CLN6/CIP observou-se uma evolução mais lenta em função do tempo, com 36,6% de CIP liberada após 24h, confirmando a formulação como um sistema de liberação sustentada (Drug Delivery System), em relação ao fármaco livre.[37] Figure 4 shows the release profile of CIP from a control solution (free CIP) and from CLN6/CIP for a period of 24 hours at 37°C. Note that CIP release from the control solution was relatively fast, with 100% release in the receptor phase after 4 hours. In the release profile of CLN6/CIP, a slower evolution was observed as a function of time, with 36.6% of CIP released after 24 hours, confirming the formulation as a sustained release system (Drug Delivery System) in relation to the drug free.

Antimicrobial Susceptibility Test - Inhibition Halo

[38] Para determinar a atividade antimicrobiana dos nanocarreadores com e sem fármaco e da ciprofloxacina livre, foi realizado o teste de difusão em ágar de camada dupla, utilizando-se diferentes estirpes bacterianas, Gram-positivas e Gram-negativas: SA - Staphylococcus aureus ATTC 25922, S.EP - Staphylococcus epidermidis, 31NM - Pseudomonas aeruginosa cepa clínica, BEC 9393 - Staphylococcus aureus, PA 26 -Pseudomonas aeruginosa, PA-ATCC 25619 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619, KP230 Klebsiella pneumoniae ATTC 25619, 76JF - Pseudomonas aeruginosa, (E. coli) Escherichia coli ATCC 129214, RIB 1 - Staphylococcus aureus MRSA.[38] To determine the antimicrobial activity of nanocarriers with and without drug and free ciprofloxacin, a double-layer agar diffusion test was performed using different bacterial strains, Gram-positive and Gram-negative: SA - Staphylococcus aureus ATTC 25922, S.EP - Staphylococcus epidermidis, 31NM - Pseudomonas aeruginosa clinical strain, BEC 9393 - Staphylococcus aureus, PA 26 -Pseudomonas aeruginosa, PA-ATCC 25619 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619, KP56se Pseudomonas aureus 76Kle pneumoniae (E. coli) Escherichia coli ATCC 129214, RIB 1 - Staphylococcus aureus MRSA.

[39] As placas contendo ágar Mueller Hinton preparadas antecipadamente foram retiradas da geladeira e deixadas até atingir a temperatura ambiente. Foram feitos poços de 12 mm de diâmetro. Com um swab estéril, o inóculo bacteriano com turvação de 0,5 na escala de MacFarland de acordo com as diretrizes do NCCLS 2012, foi distribuído uniformemente sobre a superfície do ágar e deixado em repouso em temperatura ambiente, por aproximadamente 5 min. Foi dispensado em cada poço devidamente identificado, 25 μL de cada formulação, assim como dos controles positivo (solução de ciprofloxacina a 0,009 M) e negativo (álcool etílico hidratado - 96 ° Gl). As placas foram incubadas em estufa a 35 ± 1 °C, por 24 h. Após esse tempo mediu-se em milímetros o halo de inibição do crescimento bacteriano, utilizando-se régua milimetrada. Os testes foram realizados em duplicata e em dias diferentes.[39] The plates containing Mueller Hinton agar prepared in advance were removed from the refrigerator and allowed to reach room temperature. 12 mm diameter wells were made. Using a sterile swab, the bacterial inoculum with a turbidity of 0.5 on the MacFarland scale according to the NCCLS 2012 guidelines was evenly distributed over the agar surface and allowed to stand at room temperature for approximately 5 min. 25 μL of each formulation was dispensed into each well identified, as well as positive controls (ciprofloxacin solution at 0.009 M) and negative controls (hydrated ethyl alcohol - 96 ° Gl). The plates were incubated in an oven at 35 ± 1 °C for 24 h. After this time, the halo of inhibition of bacterial growth was measured in millimeters, using a millimeter ruler. Tests were performed in duplicate and on different days.

[40] Foram testadas 22 formulações, 11 com CIP e 11 controle (sem fármaco). Os ensaios de atividade antimicrobiana foram realizados frente a cepas de bactérias gram-positivas e gram-negativas, resistentes e não-resistentes a CIP. Todas as formulações sem fármaco testadas apresentaram atividade antimicrobiana contra alguma cepa bacteriana. Dentre as formulações, a CLN 6, CLN 7, CLN 8 foram as que apresentaram maior espectro de ação, com atividade antimicrobiana frente a 10, 7 e 8 das 10 cepas testadas, respectivamente (Tabela 4). Estes resultados possivelmente resultam da composição da matriz lipídica (neste caso combinações de manteiga de tucumã, óleo de gergelim, cera de abelha, óleo de andiroba e óleo de copaíba - ver Tabela 1), excipientes naturais que já encontram na literatura descrição de suas atividades antimicrobianas. As formulações com fármaco tiveram seus resultados comparados ao controle positivo (CIP livre, na mesma concentração de 0,009 M) e apresentaram aumento na atividade antimicrobiana em relação ao controle (CIP livre) cerca de 11 a 30%. Resultados significativos foram obtidos especialmente em cepas que apresentam alguma resistência ao antibiótico livre (e.g. 76 JF - ver Tabela 4). Esses resultados demonstram, sem sombra de dúvidas, que as formulações de CLN potencializaram a ação antibacteriana da ciprofloxacina.
Tabela 4: Teste de suscetibilidade antimicrobiana (halo de inibição, em cm) após adição das formulações de CLN às diferentes cepas microbianas.

SA - Staphylococcus aureus ATTC 25922; S.EP - Staphylococcus epidermidis; 31NM - Pseudomonas aeruginosa cepa clínica; BEC 9393 - Staphylococcus aureus; PA 26 - Pseudomonas aeruginosa; PA-ATCC 25619 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619; KP230 Klebsiella pneumoniae ATTC 25619; 76JF - Pseudomonas aeruginosa; (E. coli) Escherichia coli ATCC 129214; RIB 1 - Staphylococcus aureus MRSA.[40] Twenty-two formulations were tested, 11 with CIP and 11 control (without drug). The antimicrobial activity assays were performed against gram-positive and gram-negative bacterial strains, resistant and non-resistant to CIP. All drug-free formulations tested showed antimicrobial activity against some bacterial strain. Among the formulations, CLN 6, CLN 7, CLN 8 were the ones with the greatest spectrum of action, with antimicrobial activity against 10, 7 and 8 of the 10 strains tested, respectively (Table 4). These results possibly result from the composition of the lipid matrix (in this case combinations of tucumã butter, sesame oil, beeswax, andiroba oil and copaiba oil - see Table 1), natural excipients that have already been described in the literature. antimicrobials. The drug formulations had their results compared to the positive control (free CIP, at the same concentration of 0.009 M) and showed an increase in antimicrobial activity compared to the control (free CIP) about 11 to 30%. Significant results were obtained especially in strains that show some resistance to the free antibiotic (eg 76 JF - see Table 4). These results demonstrate, without a shadow of a doubt, that CLN formulations potentiated the antibacterial action of ciprofloxacin.
Table 4: Antimicrobial susceptibility test (halo of inhibition, in cm) after addition of the CLN formulations to the different microbial strains.

SA - Staphylococcus aureus ATTC 25922; S.EP - Staphylococcus epidermidis; 31NM - Pseudomonas aeruginosa clinical strain; BEC 9393 - Staphylococcus aureus; PA 26 - Pseudomonas aeruginosa; PA-ATCC 25619 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619; KP230 Klebsiella pneumoniae ATTC 25619; 76JF - Pseudomonas aeruginosa; (E. coli) Escherichia coli ATCC 129214; RIB 1 - Staphylococcus aureus MRSA.

Claims

Nanostructured lipid carriers characterized by comprising:

Carriers according to claim 1 characterized in that solid lipids can be selected from the group of beeswax, tucumã butter and ucuuba butter.

Carriers according to claim 1, characterized in that the liquid lipids can be selected from the group of sesame oil, andiroba oil, copaiba oil and rosemary oil.

Carriers according to claim 1 characterized in that the surfactant can be selected from the group of form triblock copolymers.

Carriers according to claim 1 characterized in that the antimicrobial compound can be selected from the class of fluoroquinolones, preferably ciprofloxacin.