BR102019020892A2

BR102019020892A2 - process of obtaining chitosan from crustacean exoskeletons and application in hydrogel and membrane

Info

Publication number: BR102019020892A2
Application number: BR102019020892-9A
Authority: BR
Inventors: Galba Maria De Campos Takaki; Laryssa Alves De Farias; Luciana De Oliveira Franco; Vanessa Pimentel Santos
Original assignee: Universidade Federal Rural De Pernambuco; Universidade Católica De Pernambuco
Priority date: 2019-10-04
Filing date: 2019-10-04
Publication date: 2021-04-20

Abstract

O presente pedido de patente se refere a um processo de obtenção de quitosana a partir de carapaças de camarão, resíduos da carcinicultura, que normalmente são descartadas no meio ambiente sem qualquer tipo de tratamento. Este processo envolve extração físico-química usual de quitina das carapaças e conversão em quitosana através da desacetilação. Esta etapa envolve aquecimento em forno micro-ondas, método mais rápido comparado aos métodos convencionais. A partícula de quitosana obtida preferencialmente de 300 mm com alto grau de desacetilação (85- 95%) pode ser utilizada na preparação de hidrogel e membrana. Dessa forma, a referida invenção possibilita fabricação de materiais biocompatíveis, biodegradáveis, atóxicos e com propriedades antimicrobianas que possuem potencial aplicação no meio biotecnológico e biomédico, como por exemplo em sistemas de liberação controlada de fármacos e engenharia de tecidos cutâneos.

The present patent application refers to a process for obtaining chitosan from shrimp shells, shrimp farming residues, which are normally discarded into the environment without any type of treatment. This process involves the usual physicochemical extraction of chitin from the carapaces and conversion to chitosan through deacetylation. This step involves heating in a microwave oven, which is faster compared to conventional methods. The chitosan particle obtained preferably of 300 mm with a high degree of deacetylation (85-95%) can be used in the preparation of hydrogel and membrane. Thus, said invention enables the manufacture of biocompatible, biodegradable, non-toxic materials with antimicrobial properties that have potential application in the biotechnological and biomedical environment, such as in controlled drug release systems and skin tissue engineering.

Description

PROCESS FOR OBTAINING CHITOSAN FROM CRUSTACEANS EXOSKELETONS AND APPLICATION IN HYDROGEL AND MEMBRANE

DESCRIPTIVE REPORT Field of Invention

[001] O presente pedido de patente de invenção trata de um processo de obtenção de partículas de quitosana de 300 mm de tamanho a partir de resíduos de crustáceos e preparação de hidrogel e membrana de quitosana visando aplicação na área biotecnológica. A presente invenção proporciona o reaproveitamento dos resíduos gerados dos exoesqueletos de crustáceos, reduzindo os impactos ambientais relacionados ao descarte e contaminação ambiental.[001] The present patent application deals with a process of obtaining chitosan particles of 300 mm in size from crustacean residues and preparation of hydrogel and chitosan membrane aiming application in the biotechnological area. The present invention provides the reuse of waste generated from crustacean exoskeletons, reducing environmental impacts related to disposal and environmental contamination.

Background of the Invention

[002] A região Nordeste é uma das regiões do Brasil que mais se destaca nas atividades de carcinicultura, sendo responsável por 94% do total da produção brasileira. No entanto, a indústria pesqueira gera grande contaminação ambiental devido ao descarte sem tratamento desses resíduos sólidos derivados das carapaças de crustáceos. 0 aproveitamento desse resíduo para extração da quitosana torna essa cadeia de produção sustentável, renovável e reciclável. Uma vez que os resíduos se tornam matéria-prima para obtenção de produtos altamente aplicáveis para outras finalidades. A quitosana da presente invenção é obtida através de partículas de 300 mm, que apresenta alto grau de desacetilação, excelente qualidade, características antibacterianas e antifúngicas.[002] The Northeast region is one of the regions of Brazil that stands out in shrimp farming activities, accounting for 94% of the total Brazilian production. However, the fishing industry generates great environmental contamination due to the untreated disposal of these solid residues derived from the shells of crustaceans. The use of this residue for the extraction of chitosan makes this production chain sustainable, renewable and recyclable. Once the residues become raw material for obtaining products that are highly applicable for other purposes. The chitosan of the present invention is obtained through 300 mm particles, which have a high degree of deacetylation, excellent quality, antibacterial and antifungal characteristics.

[003] A quitosana é um polissacarídeo, obtida pela reação de desacetilação da quitina através de uma hidrólise alcalina e posteriores tratamentos com soluções ácidas, sendo formada por unidades 2-amino-2-deoxi-D-glicopiranose unidas por ligações glicosídicas β (1→4). É bastante uƟlizada como biomaterial, por apresentar propriedades biológicas de biocompatibilidade, biodegradabilidade, atoxicidade, bioatividade, mucoadesividade, aceleração do processo de formação de osteoblastos, hemostática e aceleração do processo cicatricial. Pode ser utilizada como agente terapêutico por apresentar características antibacterianas e antifúngicas (Wu, H. et al; Carbohydr. Polym. v. 180, p. 304-313, 2018).[003] Chitosan is a polysaccharide, obtained by the deacetylation reaction of chitin through an alkaline hydrolysis and subsequent treatments with acidic solutions, being formed by 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose units joined by β glycosidic bonds (1 →4). It is widely used as a biomaterial, as it has biological properties of biocompatibility, biodegradability, non-toxicity, bioactivity, mucoadhesiveness, acceleration of the osteoblast formation process, hemostatics and acceleration of the healing process. It can be used as a therapeutic agent because it has antibacterial and antifungal characteristics (Wu, H. et al; Carbohydr. Polym. v. 180, p. 304-313, 2018).

[004] A quitosana apresenta característica de solubilidade em meios ácidos devido aos grupamentos aminos livres serem protonados (NH3+), onde a tendência de preciptação aumenta a partir do momento que o pH se aproxima de 6,0, referente ao aumento de grupamentos –NH2 na estrutura molecular. Logo, os grupamentos amina possibilitam sua ligação com materiais de cargas negativas, como por exemplo outros polissacarídeos, enzimas e células. Sendo insolúvel em água, ácidos concentrados, acetona e álcool (Monteiro, A. et al; Polim., v. 25, p. 31-39, 2015).[004] Chitosan has a solubility characteristic in acidic media due to the free amino groups being protonated (NH3+), where the precipitation tendency increases as the pH approaches 6.0, referring to the increase in -NH2 groups in molecular structure. Therefore, amine groups make it possible to bond with negatively charged materials, such as other polysaccharides, enzymes and cells. Being insoluble in water, concentrated acids, acetone and alcohol (Monteiro, A. et al; Polim., v. 25, p. 31-39, 2015).

[005] Esse polímero pode ser encontrado na natureza em pequenas quantidades, nas paredes celulares de alguns fungos ou pode ser obtida através da hidrólise alcalina da quitina dos exoesqueletos de crustáceos e artrópodes. As cascas de crustáceos contêm 15 a 20% de quitina, 25 a 40% de proteínas e 40 a 55% de carbonato de cálcio, sendo este último responsável pela rigidez do crustáceo (Lima, M. et al; Sci. Plena, v.8, p. 1-9, 2012).[005] This polymer can be found in nature in small amounts, in the cell walls of some fungi or can be obtained through the alkaline hydrolysis of chitin from the exoskeletons of crustaceans and arthropods. Crustacean shells contain 15 to 20% chitin, 25 to 40% protein and 40 to 55% calcium carbonate, the latter being responsible for the rigidity of the crustacean (Lima, M. et al; Sci. Plena, v. 8, p. 1-9, 2012).

[006] A carcinicultura é um ramo específico da aquicultura voltada para a criação de camarão em cativeiro, sendo uma atividade que tem apresentado grande crescimento a nível mundial nos últimos anos. O Brasil, por apresentar um clima favorável e o domínio de tecnologias de produção de camarões, se estabeleceu como um dos principais países produtores de camarão das Américas, onde atualmente, ocupa o sexto lugar na lista mundial de produtores, tendo como principais consumidores a França, o Japão e a Espanha, que juntos importam 96% do que é produzido no país (Costa-Aquino, A. et al. Rev. Geo. Agr. v. 12, p. 366-387, 2017).[006] Shrimp farming is a specific branch of aquaculture focused on the creation of shrimp in captivity, being an activity that has shown great growth worldwide in recent years. Brazil, due to its favorable climate and mastery of shrimp production technologies, has established itself as one of the main shrimp producing countries in the Americas, where it currently ranks sixth in the world list of producers, with France as its main consumers. , Japan and Spain, which together import 96% of what is produced in the country (Costa-Aquino, A. et al. Rev. Geo. Agr. v. 12, p. 366-387, 2017).

[007] Uma grande parte da produção de camarões é comercializado descascado e descabeçado, onde os resíduos representam aproximadamente 47% do peso total do animal. Logo, estas carapaças são responsáveis por grande parte da contaminação causada pela indústria pesqueira, gerando um problema de ordem social pelo seu desagradável odor, atração e proliferação de insetos e, além disso, podem acarretar danos à saúde humana, devido ao descarte sem qualquer tipo de tratamento prévio (Souza, F. et al; Scire, v.7, p. p.1 – 11, 2015).[007] A large part of shrimp production is marketed peeled and headless, where the residues represent approximately 47% of the total weight of the animal. Therefore, these shells are responsible for a large part of the contamination caused by the fishing industry, generating a social problem due to their unpleasant odor, attraction and proliferation of insects and, in addition, can cause damage to human health, due to disposal without any type of previous treatment (Souza, F. et al; Scire, v.7, pp1 – 11, 2015).

[008] Em relação ao reaproveitamento dos resíduos da carcinicultura no Brasil, observamos que não é uma prática comum, onde cerca de 50% da biomassa é destinada as indústrias de farinha de pescado e o percentual restante da biomassa é descartado, onde uma grande parte desse descarte é direcionado diretamente para os rios, provocando uma degradação ambiental. Nos últimos anos foram realizados muitos estudos com quitosana que demonstraram haver uma estreita relação de dependência entre as características estruturais e morfológicas de quitina, quitosana e seus derivados, suas propriedades e aplicações potenciais (Rolim, A. et al; Rev. Virtual Quim. v. 10, p. 1-8, 2018).[008] Regarding the reuse of shrimp farming waste in Brazil, we note that it is not a common practice, where about 50% of the biomass is destined for the fish flour industries and the remaining percentage of the biomass is discarded, where a large part This disposal is directed directly to rivers, causing environmental degradation. In recent years, many studies have been carried out with chitosan that have shown that there is a close relationship of dependence between the structural and morphological characteristics of chitin, chitosan and their derivatives, their properties and potential applications (Rolim, A. et al; Rev. Virtual Quim. v 10, p. 1-8, 2018).

[009] O que faz da quitosana um material de interesse industrial é seu amplo espectro de propriedades, como a insolubilidade em água, comportamento de biopolímero catiônico, carga global positiva em pH biológico e de fácil formação de géis, tornando-a interessante para aplicações na agricultura, medicina, meio ambiente e alimentos (Arias, J. et al; Food Chem. v. 240, p. 1243-1253, 2018). A quitosana é um excelente polímero para produzir membranas, esferas e esponjas devido suas características de hidrofilicidade, reatividade, moldabilidade, biocompatibilidade e propriedades mecânicas. As membranas de quitosana podem ser utilizadas em diversas áreas, tais como alimentos, ciências, bioquímica, produtos farmacêuticos, agricultura, medicina entre outros (Wang, Y. et al; Expert Opin. Drug. Deliv. v. 14, p. 77-91, 2018).[009] What makes chitosan a material of industrial interest is its broad spectrum of properties, such as insolubility in water, cationic biopolymer behavior, positive overall charge at biological pH and easy gel formation, making it interesting for applications in agriculture, medicine, environment and food (Arias, J. et al; Food Chem. v. 240, p. 1243-1253, 2018). Chitosan is an excellent polymer to produce membranes, spheres and sponges due to its hydrophilicity, reactivity, moldability, biocompatibility and mechanical properties. Chitosan membranes can be used in several areas, such as food, science, biochemistry, pharmaceuticals, agriculture, medicine, among others (Wang, Y. et al; Expert Opin. Drug. Deliv. v. 14, p. 77- 91, 2018).

[010] O documento BR 102016004572-0 descreve um processo de produção de quitina e quitosana que é realizada a partir de exoesqueleto de camarão do gênero Litopenaeus, em que a desacetilação é realizada por meio de uma reação alcalina da quitina que é congelada a uma temperatura entre -20 °C a -70 °C. O documento difere da presente invenção por utilizar baixas temperaturas no processo de desacetilação da quitina.[010] The document BR 102016004572-0 describes a process for the production of chitin and chitosan that is carried out from shrimp exoskeleton of the genus Litopenaeus, in which the deacetylation is carried out through an alkaline reaction of the chitin that is frozen to a temperature between -20 °C to -70 °C. The document differs from the present invention in that it uses low temperatures in the chitin deacetylation process.

[011] No documento BR 102017010377-3 o processo de trituração é realizado em meio aquoso para evitar o aquecimento, no entanto, não descreve os tamanhos de partículas utilizados. O documento difere da presente invenção por utilizar meio aquoso como forma de trituração das carapaças de camarão e por não padronizar o tamanho de partícula a ser utilizado.[011] In document BR 102017010377-3 the grinding process is carried out in an aqueous medium to avoid heating, however, it does not describe the particle sizes used. The document differs from the present invention in that it uses aqueous medium as a form of grinding shrimp shells and does not standardize the particle size to be used.

[012] O documento PI0904084-6 descreve o bioprocessamento de resíduos de camarão ou carapaças de outros crustáceos, através da fermentação semi-sólida para obtenção de quitina e quitosana. O documento difere da presente invenção por utilizar resíduos de caranguejo e lagosta para obtenção de quitosana e utilização de fermentador no bioprocessamento de resíduos.[012] The document PI0904084-6 describes the bioprocessing of shrimp residues or shells of other crustaceans, through semi-solid fermentation to obtain chitin and chitosan. The document differs from the present invention by using crab and lobster waste to obtain chitosan and using a fermenter in the bioprocessing of waste.

[013] O documento BR 102017022250-0 descreve o preparo do exoesqueleto que compreende a lavagem, secagem a 100 oC e trituração até que as partículas tenham o tamanho de 1 mm ou menos. E para realizar a desacetilação da quitina, o material é lavado para a neutralização do pH e após a lavagem é mantido sob agitação em uma solução básica, temperatura ambiente, sob agitação em 14 dias, até a obtenção da quitosana. O documento difere da presente invenção por utilizar partículas tamanho de 1 mm e por apresentar um processo de obtenção de quitosana que envolve muitos dias.[013] The document BR 102017022250-0 describes the preparation of the exoskeleton which comprises washing, drying at 100 oC and grinding until the particles have a size of 1 mm or less. And to carry out the deacetylation of chitin, the material is washed to neutralize the pH and after washing it is kept under stirring in a basic solution, at room temperature, under stirring for 14 days, until the chitosan is obtained. The document differs from the present invention by using particles size of 1 mm and by presenting a process for obtaining chitosan that involves many days.

[014] O documento MX2017012190 utiliza resíduos de camarão para tratamento de água residual a partir da quitosana, que é extraída através de solução de NaOH a 50%, mantida em agitação, a 85 oC durante 2 horas. O documento difere da presente invenção por utilizar um processo de desacetilação mais longo, que envolve dois dias. Além disso, a presente invenção utiliza metodologia de aquecimento em forno micro-ondas, processo mais rápido quando comparado a maioria dos documentos que utilizam autoclave.[014] The document MX2017012190 uses shrimp waste to treat wastewater from chitosan, which is extracted through a 50% NaOH solution, kept under stirring, at 85 oC for 2 hours. The document differs from the present invention in that it uses a longer deacetylation process, which involves two days. In addition, the present invention uses microwave oven heating methodology, a faster process when compared to most documents that use an autoclave.

[015] No documento BR 102013033952-0 é descrito o método de extração verde de quitosana e/ou biopolímero nitrogenado utilizando escamas de peixe como matériaprima, com granulometria entre 45 a 50 mesh. O documento difere da presente invenção pela utilização de escamas de peixe para obtenção da quitosana, assim como tamanho de partículas diferentes.[015] In document BR 102013033952-0 the green extraction method of chitosan and/or nitrogenous biopolymer is described using fish scales as raw material, with granulometry between 45 to 50 mesh. The document differs from the present invention by the use of fish scales to obtain chitosan, as well as different particle sizes.

[016] O documento KB20110078376 refere-se a um método para produzir quitina e quitosana, cuja desmineralização é realizada adicionando os exoesqueletos de crustáceo a uma solução de ácido lático, as cinzas são extraídas e separadas por ebulição, a desproteinização é realizada através da extração do carbonato de potássio, fervura para extração e separação das proteínas. A quitina neutralizada através de lavagem e desacetilada através de microrganismo inoculado em tanque de fermentação. O documento difere da presente invenção por utilizar ácido lático no processo de desmineralização, o carbonato de cálcio para o processo de desproteinização e a desacetilação da quitina através de fermentação.[016] The document KB20110078376 refers to a method to produce chitin and chitosan, whose demineralization is carried out by adding the crustacean exoskeletons to a lactic acid solution, the ashes are extracted and separated by boiling, the deproteinization is carried out through extraction of potassium carbonate, boil for extraction and separation of proteins. Chitin is neutralized by washing and deacetylated by a microorganism inoculated in a fermentation tank. The document differs from the present invention in that it uses lactic acid in the demineralization process, calcium carbonate for the deproteinization process and the deacetylation of chitin through fermentation.

[017] No documento CN106967772 descreve método para extrair proteína de casca de camarão usando protease alcalina fixa magnética. O documento difere da presente invenção por utilizar caranguejo como matéria prima e solução de ácido cítrico no processo de obtenção da quitina.[017] In the document CN106967772 describes method to extract shrimp shell protein using magnetic fixed alkaline protease. The document differs from the present invention by using crab as raw material and citric acid solution in the process of obtaining chitin.

[018] O documento CN106893005 refere-se à um processo de fabricação de quitosana solúvel. Onde realiza limpeza das carapaças com água, tratamento das carapaças com ácido clorídrico e hidróxido de sódio. Também utiliza solução de permanganato de potássio com objetivo de remoção de pigmentos. Para obter quitosana solúvel, é adicionando 40% de uma solução de soda cáustica, em agitação por 24 horas, a 60-65°C, resultando uma quitosana pura e com brilho. O documento difere da presente invenção por utilizar soução de ácido clorídrico no processo de obtenção da quitiona, permaganato de potássio no processo de remoção de pigmentos e realizar todo o processo de secagem no sol.[018] The document CN106893005 refers to a process for manufacturing soluble chitosan. Where it cleans the shells with water, treats the shells with hydrochloric acid and sodium hydroxide. It also uses potassium permanganate solution to remove pigments. To obtain soluble chitosan, 40% of a caustic soda solution is added, stirring for 24 hours, at 60-65°C, resulting in pure and shiny chitosan. The document differs from the present invention by using hydrochloric acid solution in the process of obtaining chithione, potassium permaganate in the process of removing pigments and performing the entire process of drying in the sun.

[019] Nos documentos acimas citados, embora nos processos neles descritos possam empregar alguns dos mesmos reagentes, hidróxido de sódio e ácido clorídrico, que são comuns neste tipo de separação, a diferença para o processo do presente pedido de patente reside no emprego de aquecimento em pelo menos uma das etapas.[019] In the aforementioned documents, although the processes described therein may employ some of the same reagents, sodium hydroxide and hydrochloric acid, which are common in this type of separation, the difference for the process of the present patent application lies in the use of heating in at least one of the steps.

[020] O documento BR 102016018180-1 refere-se a um processo de produção de nanopartículas de quitosana-tripolifosfato dispersas em hidrogéis comerciais de poloxamers contendo naproxeno com aplicação na área farmacêutica para liberação controlada de fármacos. O documento difere da presente invenção com relação ao tamanho das partículas de quitosana, em milímetros, e ao preparar hidrogel da própria quitosana extraída a partir dos resíduos da carcinicultura, não associada a outras substâncias. Porém, o pedido desta patente se aproxima do documento citado a medida que tem potencial para ser utilizado também para aplicação farmacêutica com a vantagem de ser uma composição basicamente com apenas quitosana diminuindo as possibilidades de interações bioquímicas das outras substâncias associadas.[020] The document BR 102016018180-1 refers to a process for the production of chitosan-tripolyphosphate nanoparticles dispersed in commercial hydrogels of poloxamers containing naproxen with application in the pharmaceutical area for controlled drug release. The document differs from the present invention with respect to the size of chitosan particles, in millimeters, and when preparing hydrogel of chitosan itself extracted from shrimp farming waste, not associated with other substances. However, the application for this patent is close to the cited document as it has the potential to be used also for pharmaceutical application with the advantage of being a composition basically with only chitosan, reducing the possibilities of biochemical interactions of other associated substances.

[021] O documento PI0520742-8 diz respeito a uma composição de quitosana comercial neutralizada termoestável aquosa que forma um hidrogel transparente, sem fosfato, a uma temperatura mais alta do que 5ºC. O documento difere da presente invenção por utilizar quitosana comercial para produzir um hidrogel. Porém neste pedido de patente não foram avaliadas as características do hidrogel em temperaturas próximas a 5ºC com banho de gelo. E essa habilidade específica de aumentar a viscosidade com a temperatura pode ser vantajosamente utilizada para a distribuição de drogas ou para o aumento de tecidos na área biomédica.[021] The document PI0520742-8 relates to an aqueous thermostable neutralized commercial chitosan composition that forms a transparent hydrogel, without phosphate, at a temperature higher than 5ºC. The document differs from the present invention in that it uses commercial chitosan to produce a hydrogel. However, in this patent application, the characteristics of the hydrogel at temperatures close to 5ºC with an ice bath were not evaluated. And this specific ability to increase viscosity with temperature can be advantageously used for drug delivery or tissue augmentation in the biomedical field.

[022] O documento BR202017022372-3 visa utilização de membranas de quitosana para liberação controlada de insulina. As membranas de quitosana pura são preparadas através de dissolução do polímero 1% (p/v) em ácido acético 1% (v/v) e gotejamento de hidróxido de sódio sob agitação magnética por 24 horas. Esse método é bastante semelhante ao método de produção das membranas desta referida invenção diferindo apenas na origem própria da quitosana utilizada, na preparação apenas de quitosana pura sem insulina e no acréscimo de temperatura sob agitação magnética, demonstrando o potencial uso das membranas desta invenção em sistema de liberação controlada de fármacos.[022] The document BR202017022372-3 aims to use chitosan membranes for controlled release of insulin. Pure chitosan membranes are prepared by dissolving polymer 1% (w/v) in acetic acid 1% (v/v) and dropping sodium hydroxide under magnetic stirring for 24 hours. This method is quite similar to the method of production of the membranes of this invention, differing only in the origin of the chitosan used, in the preparation only of pure chitosan without insulin and in the increase in temperature under magnetic stirring, demonstrating the potential use of the membranes of this invention in a system of controlled drug release.

[023] O documento PI0902681-9 relata o preparo e utilização de membranas hemostáticas de derivados de quitosana e colágeno, com ou sem aditivos, para tratamento de ferimentos e sangramentos. Este documento difere do presente pedido de patente, apesar da quitosana produzida também possuir atividade cicatrizante e hemostática, em utilizar colágeno associado e congelamento como técnica para armazenar as membranas.[023] The document PI0902681-9 reports the preparation and use of hemostatic membranes from chitosan and collagen derivatives, with or without additives, for the treatment of wounds and bleeding. This document differs from the present patent application, although the chitosan produced also has healing and hemostatic activity, in using associated collagen and freezing as a technique to store the membranes.

[024] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.[024] Thus, from what appears from the researched literature, no documents were found anticipating or suggesting the teachings of the present invention, so that the solution proposed here has novelty and inventive step compared to the state of the art.

Description of the Invention

[025] A invenção poderá ser melhor compreendida através da seguinte descrição detalhada, onde o processo possui as seguintes etapas: a) Realizar a preparação completa das carapaças de camarão (lavagem, secagem e trituração); b) Extrair a quitina a partir de carapaças de camarão; c) Converter a quitina em quitosana; d) Caracterizar a quitosana obtida quanto ao grau de desacetilação; e) Analisar a atividade antimicrobiana da quitosana obtida; f) Preparar hidrogel a partir da quitosana obtida; g) Caracterizar o hidrogel quanto às propriedades físico-químicas; h) Preparar membranas de quitosana a partir do hidrogel; i) Analisar a membrana através da microscopia eletrônica de varredura; j) Analisar a atividade antimicrobiana da membrana de quitosana.[025] The invention can be better understood through the following detailed description, where the process has the following steps: a) Perform the complete preparation of shrimp shells (washing, drying and grinding); b) Extract chitin from shrimp shells; c) Convert chitin into chitosan; d) Characterize the chitosan obtained as to the degree of deacetylation; e) Analyze the antimicrobial activity of the obtained chitosan; f) Prepare hydrogel from the chitosan obtained; g) Characterize the hydrogel in terms of physicochemical properties; h) Preparing chitosan membranes from the hydrogel; i) Analyze the membrane through scanning electron microscopy; j) Analyze the antimicrobial activity of the chitosan membrane.

[026] A invenção poderá ser melhor compreendida através da seguinte descrição detalhada, em consonância com as figuras em anexo, onde:[026] The invention can be better understood through the following detailed description, in line with the attached figures, where:

[027] A FIGURA 1 representa um fluxograma do processo de obtenção de quitina e quitosana a partir de resíduos de crustáceos.[027] FIGURE 1 represents a flowchart of the process of obtaining chitin and chitosan from crustacean residues.

[028] A FIGURA 2 representa os resíduos de camarão triturados em partículas com 300 mm.[028] FIGURE 2 represents the shredded shrimp residues in 300 mm particles.

[029] A FIGURA 3 representa a quitina obtida a partir da biomassa de camarão com partículas de 300 mm.[029] FIGURE 3 represents the chitin obtained from shrimp biomass with 300 mm particles.

[030] A FIGURA 4 representa a quitosana convertida a partir da quitina extraída dos resíduos de camarão de partículas com 300 mm.[030] FIGURE 4 represents the chitosan converted from chitin extracted from shrimp residues of particles with 300 mm.

[031] A FIGURA 5 representa o hidrogel de quitosana utilizando partículas com 300 mm.[031] FIGURE 5 represents the hydrogel of chitosan using particles with 300 mm.

[032] A FIGURA 6 representa a membrana de quitosana utilizando partículas com 300 mm.[032] FIGURE 6 represents the chitosan membrane using particles with 300 mm.

[033] A FIGURA 7 representa o corte transversal da membrana na microscopia eletrônica de varredura, mostrando uma estrutura compatível e uma espessura de 86,5μm.[033] FIGURE 7 represents the cross-section of the membrane in scanning electron microscopy, showing a compatible structure and a thickness of 86.5μm.

[034] A FIGURA 8 representa o resultado do teste difusão para atividade antibacteriana com membrana central e halo inibitório sensível ao redor.[034] FIGURE 8 represents the result of the diffusion test for antibacterial activity with central membrane and sensitive inhibitory halo around.

[035] A etapa (a) compreende a lavagem, despigmentação, secagem e tamização das carapaças de camarão. Os resíduos de camarão (figura 2) são lavados em água corrente e subsequentemente despigmentados com uma solução salina preferencialmente hipoclorito de sódio a 2,5% (p/v) durante 40-52 h, preferencialmente 48 horas. Após a despigmentação, as biomassas foram secas à alta temperatura, preferencialmente 80 °C durante 4 horas e, finalmente, foi pulverizada e separada por granulometria através de uma fina malha de 300 mm. A remoção dos pigmentos pode ser realizada por extração com solventes, sendo que etanol e acetona são os mais empregados, ou por branqueamento, utilizando permaganato de potássio, hipoclorito de sódio ou peróxido de hidrogênio.[035] Step (a) comprises washing, depigmentation, drying and sieving of shrimp shells. The shrimp residues (figure 2) are washed in running water and subsequently depigmented with a saline solution preferably 2.5% sodium hypochlorite (w/v) for 40-52 h, preferably 48 hours. After depigmentation, the biomasses were dried at high temperature, preferably 80 °C for 4 hours and, finally, it was pulverized and separated by particle size through a fine mesh of 300 mm. The removal of pigments can be carried out by solvent extraction, with ethanol and acetone being the most used, or by bleaching, using potassium permaganate, sodium hypochlorite or hydrogen peroxide.

[036] Na etapa (b) do processo de obtenção da quitina (figura 3) são utilizados partículas de 300 mm. A biomassa de camarão é desmineralizada com solução de ácido clorídrico a 2% (v/v) (10:1 v/w), e mantida preferencialmente a 30 °C durante 10-16 horas, de perferência 12 horas. Subsequentemente, a fração insolúvel em álcalis é separada por centrifugação a 4000 rpm cerca de 15 a 20 minutos. O precipitado é lavado vezes com água destilada e desproteinizado para adição de solução de hidróxido de sódio a 4% (w/v) (10:1 v/w), a 80-100 °C, preferencialmente a 90 °C por cerca de 12 horas. As amostras são centrifugadas nas mesmas condições mencionadas acima, subsequentemente lavadas com água destilada e secas em overnight preferencialmente a 40ºC. Os produtos obtidos após a secagem é a quitina. As soluções aquosas de diferentes ácidos, como ácido clorídrico, ácido nitrico, ácido sulfúrico, ácido metanóico, ácido acético, podem ser empregadas na desmineralização, etapa na qual são eliminados os sais minerais, principalmente carbonato e fosfato de cálcio. As proteínas podem ser eliminadas por tratamento com soluções aquosas de diferentes bases, como hidróxido de sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, hidróxido de cálcio, mas o emprego de hidróxido de sódio é a prática mais comum.[036] In step (b) of the process of obtaining chitin (figure 3) particles of 300 mm are used. Shrimp biomass is demineralized with a 2% (v/v) hydrochloric acid solution (10:1 v/w), and preferably kept at 30°C for 10-16 hours, preferably 12 hours. Subsequently, the alkali-insoluble fraction is separated by centrifugation at 4000 rpm about 15 to 20 minutes. The precipitate is washed times with distilled water and deproteinized for addition of 4% sodium hydroxide solution (w/v) (10:1 v/w), at 80-100 °C, preferably at 90 °C for about 12 hours. The samples are centrifuged under the same conditions mentioned above, subsequently washed with distilled water and dried overnight, preferably at 40ºC. The products obtained after drying is chitin. Aqueous solutions of different acids, such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, methanoic acid, acetic acid, can be used in demineralization, a step in which mineral salts, mainly calcium carbonate and phosphate, are eliminated. Proteins can be eliminated by treatment with aqueous solutions of different bases, such as sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium hydroxide, potassium carbonate, calcium hydroxide, but the use of sodium hydroxide is the most common practice. ordinary.

[037] Na etapa (c) é realizada a desacetilação da quitina, onde foi misturada com uma solução de hidróxido de sódio a 45% (w/v) (15:1 v/w). Em seguida, as soluções são colocadas em erlenmeyer tamponado, em forno micro-ondas para irradiação a 500- 700W, preferencialmente a 600w através de 6 pulsos de 5 minutos. Entre cada intervalo as soluções são agitadas para homogeneização. As amostras são filtradas e lavadas com água destilada até a neutralização. E em seguida, a quitosana (figura 4) é lavada com acetona preferencialmente a 100%, na proporção de 2:1 (v/w) e colocadas no dessecador até peso constante. Geralmente a quitina é suspensa em soluções aquosas concentradas de hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio para que ocorra o processo de desacetilação.[037] In step (c) the deacetylation of chitin is performed, where it was mixed with a solution of sodium hydroxide at 45% (w/v) (15:1 v/w). Then, the solutions are placed in a buffered Erlenmeyer flask, in a microwave oven for irradiation at 500-700W, preferably at 600W through 6 pulses of 5 minutes. Between each interval the solutions are stirred for homogenization. Samples are filtered and washed with distilled water until neutralized. And then, the chitosan (figure 4) is washed with preferably 100% acetone, in the proportion of 2:1 (v/w) and placed in the desiccator until constant weight. Chitin is usually suspended in concentrated aqueous solutions of sodium hydroxide or potassium hydroxide to allow the deacetylation process to take place.

[038] Na etapa (d) caracterizou-se a quitosana quanto ao grau de desacetilação, através do método de titulação, a amostra de 0,05 gramas de quitosana foi dissolvida em 10 ml de solução de ácido clorídrico a 0,1 M (preparada com água deionizada) e colocada sob agitação durante 20-40 minutos, preferencialmente 30 minutos. Quando completamente dissolvida, é adicionado o indicador fenolftaleína a 1 % e em seguida realizada a titulação com hidróxido de sódio a 0,1 M. O grau de desacetilação da quitosana (DA) foi calculado utilizando a seguinte fórmula:

onde: m= massa da amostra; V2, V1= Volumes de 0,1 mol da solução de hidróxido de sódio que corresponde a deflexão de pontos; 2,03= coeficiente resultante do peso do monômero quitina; 0,0042= coeficiente resultante da diferença dos pesos moleculares dos monômeros de quitina e quitosana.[038] In step (d) the chitosan was characterized as to the degree of deacetylation, through the titration method, the 0.05 gram sample of chitosan was dissolved in 10 ml of 0.1 M hydrochloric acid solution ( prepared with deionized water) and placed under stirring for 20-40 minutes, preferably 30 minutes. When completely dissolved, the 1% phenolphthalein indicator is added and then titrated with 0.1 M sodium hydroxide. The degree of deacetylation of chitosan (DA) was calculated using the following formula:

where: m= sample mass; V2, V1= 0.1 mol volumes of sodium hydroxide solution corresponding to point deflection; 2.03= coefficient resulting from the weight of chitin monomer; 0.0042= coefficient resulting from the difference in molecular weights of chitin and chitosan monomers.

[039] Na etapa (e) a concentração inibitória mínima foi avaliada pela técnica de diluição em série de microplacas com 96 orifícios. Os poços 1 e 2 foram preenchidos com 100µL de Caldo Nutriente ou Sabouraud dextrose líquido, seguido de 180 µL até a última coluna. Em seguida, colocou-se o mesmo volume nas sequências lineares de A a H. Na coluna 3, adicionou-se 20 μL da solução de quitosana a uma concentração de 120 μg/mL para diluição em série, transferindo 100 μL do poço anterior para o poço seguinte até à coluna 12. Por outro lado, na primeira linha designada como A, foram adicionados 20 μL de suspensão bacteriana ou fúngica a todos os poços da coluna 2 a 12. As microplacas foram incubadas a 37 °C durante 24 horas e após esse período o crescimento bacteriano ou fúngico foi determinado adicionando 30 μL do revelador de resazurina (100 μg/mL) em cada poço, para a indicação de ausência ou presença de crescimento bacteriano ou fúngico.[039] In step (e) the minimum inhibitory concentration was evaluated by the technique of serial dilution of 96-well microplates. Wells 1 and 2 were filled with 100µL of Nutrient Broth or liquid Sabouraud dextrose, followed by 180 µL until the last column. Then, the same volume was placed in the linear sequences from A to H. In column 3, 20 μL of the chitosan solution was added at a concentration of 120 μg/mL for serial dilution, transferring 100 μL from the previous well to the next well to column 12. On the other hand, in the first row designated as A, 20 µl of bacterial or fungal suspension was added to all wells of column 2 to 12. The microplates were incubated at 37°C for 24 hours and after this period, bacterial or fungal growth was determined by adding 30 μL of resazurin developer (100 μg/mL) to each well, to indicate the absence or presence of bacterial or fungal growth.

[040] Na etapa (f) hidrogel de quitosana (figura 5) a 2.5% (p/v) foi preparado utilizando a quitosana de 300 mm, sendo pesados 3 gramas de quitosana e adicionada a uma solução contendo 120mL de ácido acético à 1% (v/v). O gel permaneceu em agitação magnética durante 20-28 horas, preferencialmente 24 horas, a 30-50 °C, e preferencialmente a 40°C. Em seguida, o gel, foi levado ao sonicador para maior dissolução da quitosana e eliminação das bolhas.[040] In step (f) chitosan hydrogel (figure 5) at 2.5% (w/v) was prepared using 300 mm chitosan, weighing 3 grams of chitosan and added to a solution containing 120mL of acetic acid at 1 % (v/v). The gel remained under magnetic stirring for 20-28 hours, preferably 24 hours, at 30-50°C, and preferably at 40°C. Then, the gel was taken to the sonicator to further dissolve the chitosan and eliminate the bubbles.

[041] Na etapa (g) o hidrogel foi caracterizado através da determinação do pH utilizando o potenciômetro Orion modelo 310, previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 com temperatura entre 20-30 oC, preferencialmente a 25 oC. também foi realizada a viscosidade de 1% de quitosana em solução de ácido acético a 1%, utilizando um viscosímetro com uma amostra de 1,5 mL com temperatura entre 20- 30 oC, preferencialmente a 25 oC, após a preparação dos hidrogéis.[041] In step (g) the hydrogel was characterized by determining the pH using the Orion model 310 potentiometer, previously calibrated with buffer solutions pH 4.0 and 7.0 with a temperature between 20-30 oC, preferably at 25 oC. the viscosity of 1% chitosan in 1% acetic acid solution was also performed using a viscometer with a 1.5 mL sample with a temperature between 20-30 oC, preferably at 25 oC, after the preparation of the hydrogels.

[042] Na etapa (h) 2 gramas de hidrogel utilizando quitosana de 300 mm, foi seco em dessecador, em temperatura ambiente, onde se transformam em membranas (figura 6), por volta de 8-15 dias. Posteriormente, os hidrogel foi adicionado em moldes de silicone e material emborrachado, e secos em estufa em temperatura 30-50ºC, preferencialmente a 40 ºC, por cerca de 6-10 horas, preferenciamnete 8 horas, transformando-se em membranas para análise das características microscópicas e da atividade antimicrobiana.[042] In step (h) 2 grams of hydrogel using 300 mm chitosan was dried in a desiccator at room temperature, where they turn into membranes (figure 6), around 8-15 days. Subsequently, the hydrogel was added in silicone molds and rubberized material, and dried in an oven at a temperature of 30-50°C, preferably at 40°C, for about 6-10 hours, preferably 8 hours, becoming membranes for analysis of the characteristics microscopic and antimicrobial activity.

[043] Na etapa (i) a rugosidade das membranas preparadas foi analisada macroscopicamente e por microscopia eletrônica de varredura. Para análise em microscopia (figura 7), as membranas foram cortadas com tesoura em corpos de prova de 1 cm x 1 cm e mantidas em dessecador com sílica por no mínimo 24 horas. Em seguida, os corpos de prova foram recobertos com uma camada ultrafina de ouro (92Å) em um mini sputter coater.[043] In step (i) the roughness of the prepared membranes was analyzed macroscopically and by scanning electron microscopy. For analysis under microscopy (figure 7), the membranes were cut with scissors into 1 cm x 1 cm specimens and kept in a desiccator with silica for at least 24 hours. Then, the specimens were covered with an ultra thin layer of gold (92Å) in a mini sputter coater.

[044] Na etapa (j) a atividade antimicrobiana das membranas de quitosana (figura 8) foi analisada através de difusão em placa e mensuração da zona de inibição ao redor da membrana teste central de 1,0cm x 1,0cm, imediatamente colocada após a inoculação das mesmas bactérias. Utilizou-se meio Agar Müeller-Hinton em placa de Petri através da inoculação da suspensão de bactérias 108 UFC mL-1. As bactérias utilizadas foram Staphylococcus aureus (UCP 01602), Escherichia coli (UCP 01575) e Salmonella enterica (UCP 01595), pertencentes ao Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambienais Universidade Católica de Pernambuco, registradas na World Federation for Culture Collection (WFCC). As placas foram incubadas em temperatura entre 35-40 ºC, preferencialmente a 37°C, entre 20-28 horas, preferencialmente por 24 horas. Os resultados foram obtidos através da mensuração das zonas de inibição formadas ao redor dos discos, expressos em milímetro, sendo considerado sensível (≥18 mm), intermediário (15-17 mm) e resistente (≤14 mm).[044] In step (j) the antimicrobial activity of chitosan membranes (figure 8) was analyzed through plate diffusion and measurement of the inhibition zone around the central test membrane of 1.0cm x 1.0cm, immediately placed after the inoculation of the same bacteria. Agar Müeller-Hinton medium in a Petri dish was used by inoculating the suspension of bacteria 108 CFU mL-1. The bacteria used were Staphylococcus aureus (UCP 01602), Escherichia coli (UCP 01575) and Salmonella enterica (UCP 01595), belonging to the Center for Research in Environmental Sciences Universidade Católica de Pernambuco, registered in the World Federation for Culture Collection (WFCC). The plates were incubated at a temperature between 35-40 ºC, preferably at 37°C, between 20-28 hours, preferably for 24 hours. The results were obtained by measuring the inhibition zones formed around the discs, expressed in millimeters, being considered sensitive (≥18 mm), intermediate (15-17 mm) and resistant (≤14 mm).

[045] Na etapa (l) foi avaliada a permeação das bactérias através das membranas adicionando 30μL da suspensão de cada bactéria na superfície dessas membranas. As placas foram incubadas em temperatura entre 35-40 ºC, preferencialmente a 37°C, entre 20-28 horas, preferenciamnete por 24 horas. Avaliou-se a presença de colônias que indicassem crescimento bacteriano na membrana e no meio de cultura ao redor.[045] In step (l) the permeation of bacteria through the membranes was evaluated by adding 30μL of the suspension of each bacteria on the surface of these membranes. The plates were incubated at a temperature between 35-40 ºC, preferably at 37°C, between 20-28 hours, preferably for 24 hours. The presence of colonies that indicated bacterial growth in the membrane and in the surrounding culture was evaluated.

Claims

"PROCESS FOR OBTAINING CHITOSAN FROM CRUSTACEANS EXOSKELETONS AND APPLICATION IN HYDROGEL AND MEMBRANE" characterized by a process of complete preparation of shrimp shells involving washing, drying and grinding, followed by chitin demineralization from shrimp shells with conversion chemistry of chitin in chitosan particles of 300 mm with a degree of deacetylation of 93% followed by preparation of the hydrogel from the obtained chitosan and elaboration of chitosan membranes.

"PROCESS FOR OBTAINING CHITOSAN FROM CRUSTACEANS EXOSKELETONS AND APPLICATION IN HYDROGEL AND MEMBRANE", according to claim 1, characterized in that the crushing occurs with 300 mm sieving.

"PROCESS FOR OBTAINING CHITOSAN FROM CRUSTACEANS EXOSKELETONS AND APPLICATION IN HYDROGEL AND MEMBRANE", according to claim 1, characterized in that the demineralization of chitin occurs in an acidic environment through aqueous solution, the deproteinization of chitone occurs through aqueous solution with alkaline medium and the deacetylation of chitin into chitosan also occur in alkaline medium, but with heating in microwave oven, a faster method compared to conventional methods.

"PROCESS FOR OBTAINING CHITOSAN FROM CRUSTACEANS EXOSKELETONS AND APPLICATION IN HYDROGEL AND MEMBRANE", according to claim 1, characterized by obtaining the hydrogel from chitosan particles with 300 mm, presenting good stability and viscosity.

"PROCESS FOR OBTAINING CHITOSAN FROM CRUSTACEANS EXOSKELETONS AND APPLICATION IN HYDROGEL AND MEMBRANE", according to claim 1, characterized in that the membrane is obtained through hydrogel synthesized with 300 mm particles of chitosan, dried in an oven or at room temperature , have compatible microscopic properties for application in the biotechnological and biomedical areas, such as in controlled drug delivery systems and cutaneous tissue engineering.