BR102019017289A2

BR102019017289A2 - process for obtaining fibrous polymeric frameworks with vancomycin by means of rotofiation, products obtained and their application

Info

Publication number: BR102019017289A2
Application number: BR102019017289-4A
Authority: BR
Inventors: Arnaldo Rodrigues Dos Santos Jr.; Jean Jacques Bonvent; Juliana Da Costa Rosa
Original assignee: Fundação Universidade Federal Do Abc - Ufabc
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-03-02

Abstract

A presente invenção descreve um processo para obtenção de um biomaterial polimérico biorreabsorvível, na forma de arcabouço (A) de fibras poliméricas de εpolicaprolactona (PCL) e poli (L- ácido lático) (PLA), adicionadas do fármaco vancomicina (VAN), a ser empregado em terapias de pacientes com feridas crônicas ou queimaduras, visando a minimização e o desaparecimento de infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas. Para tanto, o processo utiliza a técnica de rotofiação (E6), a qual emprega forças centrífugas para formar nanofibras e microfibras, a partir de fusão ou solução, sem requisitos de polaridade de solução e campo eletrostático de alta tensão. Assim, a presente invenção resolve problemas presentes no campo técnico, no que diz respeito à possibilidade de tratamento local de infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas, por meio da adição do arcabouço (A) na lesão, onde haverá liberação controlada do antibiótico por meio do biomaterial, e; à obtenção de fibras (F) com morfologia diferenciada, a qual favorece a obtenção de arcabouços poliméricos, de maneira mais rápida e com alto rendimento, quando comparada às técnicas usualmente empregadas para a produção de nanofibras e microfibras contínuas.

The present invention describes a process for obtaining a bioresorbable polymeric biomaterial, in the form of εpolicaprolactone (PCL) and poly (L-lactic acid) (PLA) polymeric fibers, added by the drug vancomycin (VAN), to be used in therapies for patients with chronic wounds or burns, aiming at minimizing and eliminating severe staphylococcal infections, especially in patients allergic to penicillins. For this, the process uses the technique of rotofiation (E6), which uses centrifugal forces to form nanofibers and microfibers, from fusion or solution, without requirements for solution polarity and high voltage electrostatic field. Thus, the present invention solves problems present in the technical field, with regard to the possibility of local treatment of severe staphylococcal infections, especially in patients allergic to penicillins, by adding the framework (A) in the lesion, where there will be controlled release antibiotic through biomaterial, and; obtaining fibers (F) with differentiated morphology, which favors the obtaining of polymeric frameworks, more quickly and with high yield, when compared to the techniques usually used for the production of nanofibers and continuous microfibers.

Description

PROCESS FOR OBTAINING FIBROUS POLYMERIC FRAMES WITH VANCOMYCIN THROUGH ROTATION, PRODUCTS OBTAINED AND THEIR APPLICATION

BRIEF DESCRIPTION

[001] Trata a presente solicitação de patente de invenção de um inédito “PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE ARCABOUÇOS POLIMÉRICOS FIBROSOS COM VANCOMICINA POR MEIO DE ROTOFIAÇÃO, PRODUTOS OBTIDOS E SUA APLICAÇÃO”, que descreve a obtenção de um biomaterial polimérico, biorreabsorvível e adicionado do antibiótico vancomicina, a partir da técnica de rotofiação, a qual utiliza forças centrífugas para formar nanofibras e microfibras, para ser empregado no tratamento de lesões tissulares, visando a minimização e o desaparecimento de infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas.[001] This present patent application for an unprecedented “PROCESS FOR OBTAINING FIBROUS POLYMERIC ARCHITECTS WITH VANCOMYCIN THROUGH ROTOFIAÇÃO, PRODUCTS OBTAINED AND THEIR APPLICATION”, which describes the obtaining of a polymeric bio-material, bioresorbable and added with the antibiotic vancomycin, based on the rotofiation technique, which uses centrifugal forces to form nanofibers and microfibers, to be used in the treatment of tissue injuries, aiming at minimizing and disappearing severe staphylococcal infections, especially in patients allergic to penicillins.

APPLICATION FIELD

[002] A presente invenção pertence à seção de necessidades humanas, ao campo de saúde, mais especificamente, ao de preparações para finalidades médicas e ao de preparações medicinais caracterizadas por formas físicas especiais, por descrever a obtenção de um biomaterial polimérico, biorreabsorvível e adicionado do antibiótico vancomicina, a partir da técnica de rotofiação, para ser empregado no tratamento de lesões tissulares.[002] The present invention belongs to the section of human needs, the field of health, more specifically, that of preparations for medical purposes and that of medicinal preparations characterized by special physical forms, for describing the obtaining of a biomaterial, bioabsorbable and added of the antibiotic vancomycin, based on the rotofiation technique, to be used in the treatment of tissue injuries.

CONVENTION

[003] A estrutura da pele é formada por tecido epitelial pavimentoso estratificado que se denomina epiderme, no qual, só se diferenciam o estrato córneo e o estrato germinativo; e derme, no qual distingue uma zona superficial, a camada papilar que dá origem as papilas dérmicas, sendo, uma zona profunda formada por tecido conjuntivo denso (FIORE, 2001).[003] The skin structure is formed by stratified squamous epithelial tissue that is called epidermis, in which, only the stratum corneum and the germ stratum are differentiated; and dermis, in which a superficial zone is distinguished, the papillary layer that gives rise to the dermal papillae, being a deep zone formed by dense connective tissue (FIORE, 2001).

[004] Alguns fatores são causadores de lesões de pele, tais como: acidentes com queimaduras, tempo prolongado nos leitos com complicações e presença de feridas, infecções bacterianas graves e diabetes. No caso de diabetes, as feridas podem evoluir para infecções graves causando amputações. Com 10 milhões de diabéticos no Brasil, a quantidade de feridas com dificuldade de cura é muito grande (PIRES, MORAES, 2015). Feridas crônicas, queimaduras e lesões cutâneas, causadas por diabetes, têm dificuldade de recuperação, podendo levar a riscos de amputação e a óbito.[004] Some factors cause skin lesions, such as: accidents with burns, prolonged time in beds with complications and the presence of wounds, serious bacterial infections and diabetes. In the case of diabetes, the wounds can progress to serious infections causing amputations. With 10 million diabetics in Brazil, the number of wounds with healing difficulties is very large (PIRES, MORAES, 2015). Chronic wounds, burns and skin lesions, caused by diabetes, have difficulty recovering, which can lead to risks of amputation and death.

[005] As principais causas de complicações em feridas são as infecções bacterianas. O Staphylococcus aureus é um importante agente causador de infecções, apesar de ser encontrado frequentemente na microbiota normal do corpo humano, é uma das bactérias patogênicas mais importantes, atuando desde uma infecção superficial e localizada, até infecções com elevada gravidade (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).[005] The main causes of complications in wounds are bacterial infections. Staphylococcus aureus is an important causative agent of infections, despite being frequently found in the normal microbiota of the human body, it is one of the most important pathogenic bacteria, acting from a superficial and localized infection, to infections with high severity (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008 ).

[006] A cicatrização é um processo fisiológico e dinâmico que busca restaurar o tecido lesado. Estimulantes de regeneração e reparação celular, como biomateriais poliméricos, podem ser utilizados no tecido lesado, a fim de melhorar o processo de cicatrização. A aplicação de biomateriais incluí: suturas, dispositivos de distribuição controlada de drogas, fixação de dispositivos ortopédicos, prevenção de adesão, vasos sanguíneos temporários e matriz para engenharia de tecidos (ORÉFICE, PEREIRA, MANSUR, 2006).[006] Healing is a physiological and dynamic process that seeks to restore damaged tissue. Stimulants for cell regeneration and repair, such as polymeric biomaterials, can be used in injured tissue in order to improve the healing process. The application of biomaterials includes: sutures, devices for controlled drug distribution, fixation of orthopedic devices, prevention of adhesion, temporary blood vessels and matrix for tissue engineering (ORÉFICE, PEREIRA, MANSUR, 2006).

[007] Os polímeros mais utilizados em pesquisa para esses fins, são os α–hidróxi ácidos, dentre eles, diferentes composições do poli (ácido láctico) (PLA), como: o poli (L-ácido láctico) (PLLA), poli (D-ácido lático) (PDLA), poli (DL-ácido lático) (PDLLA), além do poli (ácido glicólico) (PGA) e da poli (ε-caprolactona) (PCL).[007] The most used polymers in research for these purposes are α – hydroxy acids, among them, different compositions of poly (lactic acid) (PLA), such as: poly (L-lactic acid) (PLLA), poly (D-lactic acid) (PDLA), poly (DL-lactic acid) (PDLLA), in addition to poly (glycolic acid) (PGA) and poly (ε-caprolactone) (PCL).

[008] Blendas poliméricas tridimensionais, também conhecida como arcabouços ou scaffolds, são utilizadas na engenharia de tecidos como suporte físico e biológico para a cultura de células. Com diversas finalidades, permite a fixação, proliferação e diferenciação celular, sustenta e retêm células assim como fatores de crescimento, e, por permitirem a difusão de nutrientes e oxigênio celulares, possibilitam o estabelecimento de um ambiente mecânico e biológico apropriado para regeneração de tecidos.[008] Three-dimensional polymeric blends, also known as scaffolds or scaffolds, are used in tissue engineering as physical and biological support for cell culture. With various purposes, it allows cell fixation, proliferation and differentiation, supports and retains cells as well as growth factors, and, by allowing the diffusion of cellular nutrients and oxygen, allows the establishment of an appropriate mechanical and biological environment for tissue regeneration.

[009] A PCL é amplamente utilizada na produção de suportes para aplicações de engenharia de tecidos devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, estabilidade estrutural e propriedades mecânicas. No entanto, ela apresenta alta hidrofobicidade, levando à redução da afinidade celular e à pequena taxa de regeneração tecidual. Para diminuir essas limitações, se faz necessária sua combinação com o PLA, a fim de produzir construções menos hidrofóbicas, com degradabilidade ajustável e propriedades mecânicas adequadas (DOMINGOS; BARTOLO, 2013).[009] PCL is widely used in the production of supports for tissue engineering applications due to its biocompatibility, biodegradability, structural stability and mechanical properties. However, it has high hydrophobicity, leading to reduced cell affinity and a low rate of tissue regeneration. To reduce these limitations, it is necessary to combine them with PLA, in order to produce less hydrophobic constructions, with adjustable degradability and adequate mechanical properties (DOMINGOS; BARTOLO, 2013).

[010] Nas últimas décadas, o setor de biomateriais não só cresceu em número de produtos disponíveis e em desenvolvimento, mas, também avançou economicamente de maneira significativa. Seu impacto na melhoria da qualidade da vida humana é inegável e sua contribuição futura deve ser numericamente mais elevada, tendo em vista a tendência bem estabelecida de envelhecimento populacional. Entretanto, apesar da grande disponibilidade atual de biomateriais, os desenvolvimentos nessa área são ainda uma necessidade, visto que boa parte dos dispositivos tecnologicamente mais avançados está restrita ao uso somente por uma pequena parcela da população mundial.[010] In the last few decades, the biomaterials sector has not only grown in number of products available and under development, but has also made significant economic progress. Its impact on improving the quality of human life is undeniable and its future contribution must be numerically higher, in view of the well-established trend of population aging. However, despite the great current availability of biomaterials, developments in this area are still a necessity, since most of the most technologically advanced devices are restricted to use by only a small portion of the world population.

[011] A eletrofiação ou electrospinning é o método mais utilizado para gerar nanofibras contínuas, as quais são empregadas em grande parte dos biomateriais, sendo um processo no qual, a solução de fiação é forçada através de uma agulha que é carregada em alta tensão. A repulsão eletrostática faz com que a gota pingente se espalhe e um jato seja ejetado quando a tensão superficial é superada. O jato sofre então, uma série de instabilidades de flexão que resultam em diâmetros de fibra ultrafinos, devido ao alongamento envolvido nesse processo. Existem muitas vantagens para o processo de eletrofiação, tais como: a simplicidade e versatilidade da técnica e seu baixo custo (equipamento mínimo necessário) (KHAMFOROUSH, 2015).[011] Electrospinning or electrospinning is the most used method to generate continuous nanofibers, which are used in most biomaterials, being a process in which the spinning solution is forced through a needle that is loaded at high voltage. Electrostatic repulsion causes the droplet to spread and a jet to eject when the surface tension is overcome. The jet then suffers a series of flexing instabilities that result in ultrafine fiber diameters, due to the elongation involved in this process. There are many advantages to the electrospinning process, such as: the simplicity and versatility of the technique and its low cost (minimum necessary equipment) (KHAMFOROUSH, 2015).

[012] Embora o método de eletrofiação seja considerado simples, pelos procedimentos atualmente utilizados, ele é um processo lento e de rendimento reduzido, enquanto o método de rotofiação produz elevado número de fibras quando comparado a ele, apresentando um rendimento maior, em escala de tempo muito menor, além de apresentar grande reprodutibilidade.[012] Although the electrospinning method is considered simple, according to the procedures currently used, it is a slow and low-yielding process, while the rotofining method produces a high number of fibers when compared to it, presenting a higher yield, on a scale of much shorter time, besides presenting great reproducibility.

[013] A rotofiação é uma técnica que utiliza forças centrífugas para formar nanofibras e microfibras, tanto a partir da solução quanto da fusão, a técnica tem atraído muita atenção quando comparada com a eletrofiação, devido ao seu alto rendimento, sem requisitos de polaridade de solução e campo eletrostático de alta tensão. As características como o efeito da temperatura de fusão, distância do coletor, velocidade de rotação e concentração (para soluções de polímero) são importantes para estudo para a produção dessas fibras (ZANDE, 2014).[013] Rotofining is a technique that uses centrifugal forces to form nanofibers and microfibers, both from solution and from fusion, the technique has attracted a lot of attention when compared to electrospinning, due to its high performance, with no polarity requirements. high voltage electrostatic field and solution. Characteristics such as the effect of the melting temperature, distance from the collector, speed of rotation and concentration (for polymer solutions) are important for study for the production of these fibers (ZANDE, 2014).

[014] A produção de biomateriais utilizando a técnica de rotofiação proporciona dispositivos que entram em contato com sistemas biológicos (incluindo fluidos biológicos), com aplicações diagnósticas ou cirúrgicas, podendo ser constituídos de compostos de origem sintética ou natural, possibilitando a incorporação de fármacos para tratamentos terapêuticos. Os polímeros mais utilizados para a engenharia de materiais são o poli (L-ácido láctico) PLLA e o poli (ε-caprolactona) PCL.[014] The production of biomaterials using the rotofiation technique provides devices that come into contact with biological systems (including biological fluids), with diagnostic or surgical applications, which may consist of compounds of synthetic or natural origin, enabling the incorporation of drugs for therapeutic treatments. The most used polymers for material engineering are poly (L-lactic acid) PLLA and poly (ε-caprolactone) PCL.

[015] As lesões de pele são frequentes, principalmente, em pessoas com permanência prolongada em leitos hospitalares, indivíduos que sofreram queimaduras, pacientes que apresentam infecções bacterianas graves ou diabetes, sendo, nesses casos, o tratamento com a Vancomicina o mais indicado. Os casos de hospitalização, geralmente, são iniciados por presença de lesões graves com necessidade de drenagem cirúrgica; áreas com dor intensa, bolhas, hemorragia da pele; anestesia cutânea e presença de ar nos tecidos. Tais lesões aumentam rapidamente de tamanho resultando no aparecimento de necrose tecidual, sinais potencialmente perigosos que, demandam cobertura antibiótica vigorosa, normalmente, feita com a Vancomicina.[015] Skin lesions are frequent, mainly in people with prolonged hospital stays, individuals who have suffered burns, patients who have severe bacterial infections or diabetes, in which case, treatment with Vancomycin is the most indicated. Hospitalization cases are usually initiated by the presence of serious injuries requiring surgical drainage; areas with severe pain, blisters, bleeding from the skin; cutaneous anesthesia and presence of air in the tissues. Such lesions rapidly increase in size resulting in the appearance of tissue necrosis, potentially dangerous signs that require vigorous antibiotic coverage, usually done with Vancomycin.

[016] Assim a presente invenção descreve a obtenção de arcabouços poliméricos fibrosos de PLA e PCL, biomaterial polimérico e biorreabsorvíveis, produzido por rotofiação que, se decompõem tanto in vitro, quanto in vivo. O biomaterial descrito é adicionado de concentrações do fármaco Vancomicina, antibiótico indicado a infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas, para que tenha utilização terapêutica em pacientes com feridas crônicas ou queimaduras. A escolha Vancomicina se deu por dois principais motivos: possibilitar o tratamento de pacientes alérgicos à penicilina, e, devido à alta prevalência de cepas Staphylococcus aureus em condições de internação prolongada, conforme demonstrado em diversos estudos, sendo esse o fármaco indicado para o tratamento.[016] Thus the present invention describes the obtaining of fibrous polymeric frameworks of PLA and PCL, polymeric and bioresorbable biomaterial, produced by rotofiation that, decompose both in vitro and in vivo. The biomaterial described is added with concentrations of the drug Vancomycin, an antibiotic indicated for severe staphylococcal infections, especially in patients allergic to penicillins, so that it has therapeutic use in patients with chronic wounds or burns. The Vancomycin choice was made for two main reasons: to enable the treatment of patients allergic to penicillin, and, due to the high prevalence of Staphylococcus aureus strains in conditions of prolonged hospitalization, as demonstrated in several studies, this being the drug indicated for treatment.

[017] As fibras poliméricas adicionadas do antibiótico Vancomicina, obtidas a partir da técnica de rotofiação, e utilizadas nos arcabouços propostos, demonstraram possibilidade de uso no tratamento de infecções graves, devido à liberação, por meio de um biomaterial adicionado ao local da lesão, que, contém pequenas quantidades do antibiótico. A presença do fármaco na composição da fibra produzida demonstrou atividade farmacológica e liberação total nas primeiras 24h. Além disso, o processo de rotofiação também foi capaz de diminuir o diâmetro das fibras produzidas, possibilitando, dessa maneira, a obtenção de produtos que podem ser usados no tratamento de feridas crônicas e infeções graves causadas por Staphylococcus aureus, diabetes e queimaduras, em grande escala, de maneira rápida e reprodutível, com liberação controlada do fármaco.[017] The polymeric fibers added with the Vancomycin antibiotic, obtained from the rotofiation technique, and used in the proposed frameworks, demonstrated the possibility of use in the treatment of serious infections, due to the release, through a biomaterial added to the injury site, which, contains small amounts of the antibiotic. The presence of the drug in the composition of the fiber produced demonstrated pharmacological activity and total release in the first 24 hours. In addition, the rotofiation process was also able to decrease the diameter of the fibers produced, thus making it possible to obtain products that can be used in the treatment of chronic wounds and serious infections caused by Staphylococcus aureus, diabetes and burns, to a large extent. scale, quickly and reproducibly, with controlled drug release.

[018] É importante ressaltar que um dos maiores impasses enfrentados pelas indústrias farmacêuticas consiste em aumentar a solubilidade e a biodisponibilidade dos fármacos. A maioria desses compostos é pouco solúvel em meio aquoso, apresentando elevadas hidrofobicidade e massa molar, o que contribui para uma menor biodisponibilidade desses compostos e um perfil cinético de liberação indefinido, principalmente de fármacos administrados oralmente. Os sistemas de administração convencionais implicam na administração das doses de medicamentos em intervalos de tempo, o que não garante que a concentração de medicamentos permaneça na faixa terapêutica, no intervalo entre as administrações. Sistemas de liberação controlada de fármacos, além de reduzir o número de administrações, ajuda a minimizar possíveis efeitos colaterais no paciente, além de poderem aumentar o tempo de princípio ativo no local de liberação, melhorando sua biodisponibilidade (FONSECA, 2016).[018] It is important to note that one of the biggest impasses faced by the pharmaceutical industries is to increase the solubility and bioavailability of drugs. Most of these compounds are poorly soluble in aqueous media, presenting high hydrophobicity and molar mass, which contributes to a lower bioavailability of these compounds and an indefinite release kinetic profile, especially of drugs administered orally. Conventional administration systems imply the administration of doses of drugs at intervals of time, which does not guarantee that the concentration of drugs remains in the therapeutic range, in the interval between administrations. Controlled drug delivery systems, in addition to reducing the number of administrations, help to minimize possible side effects in the patient, in addition to being able to increase the time of active principle at the release site, improving its bioavailability (FONSECA, 2016).

BACKGROUND OF THE INVENTION

[019] No atual estado da técnica estão presentes anterioridades que relatam sobre a produção de arcabouços de fibras poliméricas biocompatíveis e biorreabsorvíveis que, são empregadas no tratamento de lesões tissulares. No entanto, nenhuma delas descreve um processo de obtenção de um biomaterial, constituído de fibras poliméricas de PLA e PCL adicionadas de vancomicina, obtido pela técnica de rotofiação, possibilitando o tratamento de infecções estafilocócicas graves em lesões tissualares, especialmente, de pacientes alérgicos a penicilinas.[019] In the current state of the art, priorities are present that report on the production of frameworks of biocompatible and bioresorbable polymer fibers that are used in the treatment of tissue injuries. However, none of them describes a process for obtaining a biomaterial, consisting of polymeric PLA and PCL fibers added with vancomycin, obtained by the rotofiation technique, enabling the treatment of severe staphylococcal infections in tissue lesions, especially from patients allergic to penicillins. .

[020] A anterioridade CN103648536B9, intitulada "A biodegradable graded layer system for regeneration medicine and tissue support for biocompatible", descreve um sistema em camadas biocompatível para regeneração de tecidos constituído de: pelo menos uma camada de fibras de polímeros reticulados e biocompatíveis e biodegradáveis; pelo menos uma camada de suporte biocompatível, constituída de fibras de PCL, PLA, PGA ou PLGA. O sistema apresenta fibras entre 1 nm e 50µm e possibilita a adição de fármacos a ele, dentre eles, a adição de vancomicina. A principal diferença da anterioridade em relação à presente invenção reside na técnica de obtenção das fibras poliméricas, enquanto a anterioridade descreve o emprego de eletrofiação, a presente invenção emprega rotofiação, a qual utiliza forças centrífugas para formar nanofibras e microfibras, tanto a partir da solução quanto da fusão. A rotofiação possui alto rendimento, sem requisitos de polaridade de solução e campo eletrostático de alta tensão, diferentemente da eletrofiação. Além disso, processo de rotofiação possibilita maior controle dos parâmetros temperatura de fusão, distância do coletor, velocidade de rotação e concentração (para soluções de polímero), os quais são importantes para a produção de fibras.[020] Formerly CN103648536B9, entitled "A biodegradable graded layer system for regeneration medicine and tissue support for biocompatible", describes a biocompatible layered system for tissue regeneration consisting of: at least one layer of crosslinked and biocompatible and biodegradable polymer fibers ; at least one biocompatible support layer, consisting of PCL, PLA, PGA or PLGA fibers. The system has fibers between 1 nm and 50 µm and allows the addition of drugs to it, including the addition of vancomycin. The main difference from the previous one in relation to the present invention resides in the technique of obtaining polymeric fibers, while the previous one describes the use of electrospinning, the present invention employs rotofining, which uses centrifugal forces to form nanofibers and microfibers, both from the solution how much of the merger. Rotofining has a high performance, with no solution polarity requirements and high voltage electrostatic field, unlike electrospinning. In addition, the rotating process allows greater control of the melting temperature, collector distance, rotation speed and concentration parameters (for polymer solutions), which are important for the production of fibers.

[021] A anterioridade US10245353, intitulada "Hydrophilic electrospinning biological composite stent material used for tissue regeneration and preparation method and application thereof", descreve a obtenção de um material para reparo de tecido corporal a ser usado na obtenção de materiais para reparo, tais como stents, sendo obtido a partir de técnicas de eletrofiação, a partir de uma mistura aquosa de fibrogênio, Larginina, ou seu hidrocloreto, com um P(LLA-CL). O material descrito possui capacidade de absorção de proteínas relacionadas com a cicatrização e de adesão celular relacionada com a regeneração e reparação tecidual, prevenindo eficazmente a formação de biofilme bacteriano. A anterioridade se difere da presente invenção por empregar a eletrofiação, método mais utilizado para gerar nanofibras contínuas, no qual a solução de fiação é forçada através de uma agulha que é carregada em alta tensão. Para tanto, a repulsão eletrostática faz com que a gota pingente se espalhe e um jato seja ejetado quando a tensão superficial é superada; o jato sofre então uma série de instabilidades de flexão que resultam em diâmetros de fibra ultrafinos devido ao alongamento envolvido nesse processo. Embora o método de eletrofiação seja considerado simples, pelos procedimentos atualmente utilizados, ele é um processo lento e de rendimento reduzido. A técnica de rotofiação, empregada na presente invenção, possibilita a obtenção de elevado número de fibras quando comparado à eletrofiação, apresentando um rendimento maior em escala de tempo muito menor.[021] Priority US10245353, entitled "Hydrophilic electrospinning biological composite stent material used for tissue regeneration and preparation method and application thereof", describes obtaining a material for repairing body tissue to be used in obtaining materials for repair, such as stents, being obtained from electrospinning techniques, from an aqueous mixture of fibrogen, Larginine, or its hydrochloride, with a P (LLA-CL). The material described has the ability to absorb proteins related to healing and cell adhesion related to tissue regeneration and repair, effectively preventing the formation of bacterial biofilm. The anteriority differs from the present invention in that it uses electrospinning, the most used method to generate continuous nanofibers, in which the spinning solution is forced through a needle that is loaded at high voltage. For this, the electrostatic repulsion causes the pendant drop to spread and a jet to be ejected when the surface tension is overcome; the jet then suffers a series of bending instabilities that result in ultrafine fiber diameters due to the elongation involved in this process. Although the electrospinning method is considered simple, due to the procedures currently used, it is a slow and low-yield process. The rotofying technique, employed in the present invention, makes it possible to obtain a high number of fibers when compared to electrospinning, presenting a higher yield in a much smaller time scale.

[022] Já a anterioridade WO2016094669, intitulada "Methods of orienting multifilament yarn and monofilaments of poly-4-hydroxybutyrate and copolymers thereof", descreve a obtenção de filamentos poliméricos, que podem ser empregados na indústria médica e farmacêutica, obtidos a partir de trefilagem à quente, após a trefilagem à frio, a uma temperatura superior à temperatura de fusão do polímero ou copolímero empregado, sendo os filamentos passíveis de serem adicionados de fármacos, dentre eles, a vancomicina. Novamente, a principal diferença entre a anterioridade e a presente invenção reside no processo de obtenção, o qual emprega a técnica de trefilagem, a qual promove a obtenção de fibras a partir da tração e compressão exercida ao material por uma matriz chamada fieira com forma e canal convergente, diferentemente da técnica de rotofiação, empregada na presente invenção, que possibilita a produção de fibras poliméricas, devido à força de reação à ação da força centrípeta do movimento circular.[022] Previously WO2016094669, entitled "Methods of orienting multifilament yarn and monofilaments of poly-4-hydroxybutyrate and copolymers thereof", describes obtaining polymeric filaments, which can be used in the medical and pharmaceutical industry, obtained from wire drawing hot, after cold drawing, at a temperature higher than the melting temperature of the polymer or copolymer used, the filaments being liable to be added with drugs, among them, vancomycin. Again, the main difference between the previous and the present invention resides in the process of obtaining, which employs the drawing technique, which promotes the obtaining of fibers from the traction and compression exerted on the material by a matrix called die with shape and convergent channel, differently from the rotofiation technique, used in the present invention, which allows the production of polymeric fibers, due to the reaction force to the action of the centripetal force of the circular movement.

[023] Além das anterioridades mencionadas, ainda estão presentes outros documentos que descrevem a obtenção de arcabouços poliméricos para tratamentos tissulares e ósseos, tais como: US20110038921, intitulada "Methods and compositions for temporal release of agents from a biodegradable scaffold"; WO2013166566, intitulada "Material tridimensional polimérico biodegradável e processo de preparo de material tridimensional polimérico biodegradável"; US20090123509, intitulada "Biodegradable colloidal gels as moldable tissue engineering scaffolds"; WO2011130812, intitulada "Suspensões para preparação de enxertos ósseos (scaffolds) à base de biosilicato, enxertos ósseos obtidos e processos de obtenção dos mesmos"; US8685432, intitulada "Controlled release tissue graft combination biomaterials"; WO2014194391, intitulada "Blendas de poliestireno e poli ácido lático"; WO2013126975, intitulada "Material poroso tridimensional biorreabsorvível e bioativo e seu processo de obtenção"; WO 2013/163704, intitulada "Membrana biorreabsorvivel bioativa porosa e seu processo de obtenção"; EP2507278, intitulada "Preparación de polímeros con impronta molécula"; WO2014094087, "Nanoparticulas polimericas contendo Amitraz e/ou Fluazuron, método de produção, formulação e usos"; CN103100109B, intitulada "Silk fibroin scaffolds load and preparation method vancomycin / gelatin microspheres".[023] In addition to the aforementioned priorities, there are still other documents that describe obtaining polymeric frameworks for tissue and bone treatments, such as: US20110038921, entitled "Methods and compositions for temporal release of agents from a biodegradable scaffold"; WO2013166566, entitled "Biodegradable polymeric three-dimensional material and process for preparing biodegradable polymeric three-dimensional material"; US20090123509, entitled "Biodegradable colloidal gels as moldable tissue engineering scaffolds"; WO2011130812, entitled "Suspensions for the preparation of bone grafts (scaffolds) based on biosilicate, bone grafts obtained and processes for obtaining them"; US8685432, entitled "Controlled release tissue graft combination biomaterials"; WO2014194391, entitled "Blends of polystyrene and poly lactic acid"; WO2013126975, entitled "Bioreabsorbable and bioactive three-dimensional porous material and its process of obtaining"; WO 2013/163704, entitled "Bioactive porous bioresorbable membrane and its process of obtaining"; EP2507278, entitled "Preparation of polymers with imprinted molecule"; WO2014094087, "Polymeric nanoparticles containing Amitraz and / or Fluazuron, production method, formulation and uses"; CN103100109B, entitled "Silk fibroin scaffolds load and preparation method vancomycin / gelatin microspheres".

[024] Apesar do grande número de anterioridades presentes no atual estado da técnica relacionada à invenção descrita, nenhuma delas descreve processo de obtenção, por meio de rotofiação, de fibras poliméricas de PLA e PCL adicionadas de vancomicina, capaz de resolver problemas presente no campo técnico, tais como: a possibilidade de tratamento local de infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas, por meio da adição das fibras produzidas com o fármaco na lesão, onde haverá liberação do antibiótico por meio do biomaterial, e a obtenção de fibras com morfologia diferenciada e que favorece a obtenção de arcabouços, decorrente do processo de rotofiação, pela força de reação existente à força centrípeta, exercida pelo equipamento acionado sobre a solução.[024] Despite the large number of priorities present in the current state of the art related to the described invention, none of them describes the process of obtaining, through rotofiation, polymeric PLA and PCL fibers added with vancomycin, capable of solving problems present in the field technical, such as: the possibility of local treatment of severe staphylococcal infections, especially in patients allergic to penicillins, by adding the fibers produced with the drug in the lesion, where the antibiotic will be released through the biomaterial, and obtaining fibers with differentiated morphology and that favors the obtaining of frameworks, resulting from the rotofiation process, by the existing reaction force to the centripetal force, exerted by the equipment activated on the solution.

OBJECTIVE OF THE INVENTION

[025] A invenção tem por objetivo disponibilizar um biomaterial polimérico, biorreabsorvível, produzido por rotofiação, com propriedades farmacológicas, a ser empregado no tratamento de lesões tissulares, tais como feridas crônicas e queimaduras, visando a minimização e o desaparecimento de infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas.[025] The objective of the invention is to provide a polymeric bio-material, bioresorbable, produced by rotofiation, with pharmacological properties, to be used in the treatment of tissue injuries, such as chronic wounds and burns, aiming at minimizing and disappearing serious staphylococcal infections, especially, in patients allergic to penicillins.

THE INVENTION

[026] A presente invenção descreve um processo para obtenção de um biomaterial polimérico biorreabsorvíveis, na forma de arcabouços de fibras poliméricas de PLA e PCL, adicionadas do fármaco vancomicina, a ser empregado em terapias de pacientes com feridas crônicas ou queimaduras, visando a minimização e o desaparecimento de infecções estafilocócicas graves, especialmente, em pacientes alérgicos a penicilinas.[026] The present invention describes a process for obtaining a bioresorbable polymeric biomaterial, in the form of polymeric frameworks of PLA and PCL, added by the drug vancomycin, to be used in therapies of patients with chronic wounds or burns, in order to minimize and the disappearance of severe staphylococcal infections, especially in patients allergic to penicillins.

[027] Para tanto, é utilizada a técnica de rotofiação, a qual emprega forças centrífugas para formar nanofibras e microfibras, a partir de fusão ou solução, sem requisitos de polaridade de solução e campo eletrostático de alta tensão.[027] For this purpose, the rotofiation technique is used, which uses centrifugal forces to form nanofibers and microfibers, from fusion or solution, without requirements for solution polarity and high voltage electrostatic field.

ADVANTAGES OF THE INVENTION

[028] A presente invenção apresenta como principais vantagens:

✓ Possibilitar obtenção de um biomaterial polimérico biorreabsorvível, na forma de arcabouço de fibras poliméricas de PLA e PCL, adicionadas do fármaco Vancomicina, a ser empregado em terapias de pacientes com feridas crônicas ou queimaduras que possa utilizado no tratamento de pacientes alérgicos à penicilina;
✓ Possibilitar obtenção de um biomaterial polimérico biorreabsorvível, na forma de arcabouço de fibras poliméricas de PLA e PCL, adicionadas do fármaco Vancomicina, por meio da técnica de rotofiação, a qual emprega forças centrífugas para formar nanofibras e microfibras, a partir de fusão ou solução, sem requisitos de polaridade de solução e campo eletrostático de alta tensão;
✓ Possibilitar obtenção de um biomaterial polimérico biorreabsorvível, na forma de arcabouço de fibras poliméricas de PLA e PCL, adicionadas do fármaco Vancomicina por meio da técnica de rotofiação, capaz de proporcionar uma liberação controlada da vancomicina, sendo mais efetivo no tratamento de infecções por S. aureus;
✓ Possibilitar um processo de obtenção, por rotofiação, de um biomaterial polimérico biorreabsorvível, na forma de arcabouços de fibras poliméricas de PLA e PCL, adicionadas do fármaco Vancomicina, de grande reprodutibilidade e rendimento maior, em escala de tempo muito menor, quando comparado à técnica de eletrofiação.

[028] The present invention has as main advantages:

✓ Make it possible to obtain a bioresorbable polymeric biomaterial, in the form of a framework of polymeric PLA and PCL fibers, added by the drug Vancomycin, to be used in therapies for patients with chronic wounds or burns that can be used in the treatment of patients allergic to penicillin;
✓ Enable obtaining of a bioresorbable polymeric biomaterial, in the form of a framework of polymeric fibers of PLA and PCL, added by the drug Vancomycin, by means of the rotofiation technique, which uses centrifugal forces to form nanofibers and microfibers, from fusion or solution , with no solution polarity requirements and high voltage electrostatic field;
✓ Enable obtaining a bioresorbable polymeric biomaterial, in the form of polymeric PLA and PCL scaffolding, added by the drug Vancomycin by means of the rotofiation technique, capable of providing a controlled release of vancomycin, being more effective in the treatment of infections by S aureus;
✓ Enable a process of obtaining, by rotofiation, a bioresorbable polymeric biomaterial, in the form of polymeric frameworks of PLA and PCL, added by the drug Vancomycin, of great reproducibility and greater yield, in a much shorter time scale, when compared to the much smaller scale electrospinning technique.

DESCRIPTION OF THE FIGURES

[029] A invenção será descrita em uma realização preferencial, assim, para melhor entendimento, serão feitas referências às figuras:

✓ FIG. 1: Fluxograma do processo para obtenção de arcabouços poliméricos fibrosos com Vancomicina;
✓ FIG. 2: Análise morfológica das células observadas em contraste de fase, previamente à fixação e incubadas com os extratos das amostras por 48h. Barra de aumento: 50 µm;
✓ FIG. 3: Análise morfológica das células incubadas com os extratos das amostras por 48h, fixadas e coradas com cristal violeta. Barra de aumento: 50µm;
✓ FIG 4: Ensaio de toxicidade por extratos com células incubadas por 48h. A ISO 10993-5 define como tóxico a redução de viabilidade superior a 30% do controle negativo. As letras indicam os grupos com diferenças estatísticas (0,05);
✓ FIG 5: Análise morfológica das células que cresceram sobre os polímeros com 48h de incubação e coradas com cristal violeta. Barra de aumento: 20µm;
✓ FIG 6: Análise citoquímica das células que cresceram sobre os polímeros com 48h de incubação e coradas com Xylidine Ponceau em pH 2,5. Barra de aumento: 20µm;
✓ FIG 7: Análise citoquímica das células que cresceram sobre os polímeros com 48h de incubação e coradas com Picrossirus-Hematoxiloina. Barra de aumento: 20µm;
✓ FIG 8: Microscopia eletrônica de varredura das células cultivadas sobre as blendas poliméricas 75% e 50%;
✓ FIG 9: Teste microbiológico em caldo. A e B representam os controles para 75%, em caldo e placa respectivamente; C e D representam os controles para 50%, em caldo e placa respectivamente; E e F representa o teste de inoculação para caldo e placa para 50% e 75%, respectivamente;
✓ FIG 10: Teste em caldo. A e B são a amostra 75% 9/1; C e D são a amostra 75% 9/2; E e F são a amostra 50% 9/1; G e H são a amostra 50% 9/2; de A até G teste de caldo; de B até H teste em placa;
✓ FIG. 11: Antibiograma. A representa o controle sem VAN; B controle positivos de análise padrão; C as amostras 75% 9/1 e 9/2; D as amostras 50% 9/1 e 9/2;
✓ FIG 12: Análise morfológica das membranas 50% com Vancomicina por contraste de fase. Barra de aumento 50µm;
✓ FIG 13: Análise morfológica das membranas 75% com Vancomicina por contraste de fase. Barra de aumento 50µm;
✓ FIG 14: Análise morfológica das blendas fibrosas 75% com vancomicina por microscopia óptica de luz. Barra de aumento 50 µm;
✓ FIG 15: Análise morfológica das blendas fibrosas 50% com vancomicina por microscopia óptica de luz. Barra de aumento 50 µm;
✓ FIG 16: Ensaio de toxicidade com a incorporação da Vancomicina com ou sem sua eluição. A ISO 10993-5 define como tóxico a redução de viabilidade superior a 30% do controle negativo. As letras indicam os grupos com diferenças estatísticas (0,05).

[029] The invention will be described in a preferred embodiment, thus, for better understanding, references will be made to the figures:

✓ FIG. 1: Flowchart of the process for obtaining fibrous polymeric frameworks with Vancomycin;
✓ FIG. 2: Morphological analysis of cells observed in phase contrast, prior to fixation and incubated with sample extracts for 48 hours. Magnifying bar: 50 µm;
✓ FIG. 3: Morphological analysis of the cells incubated with the extracts of the samples for 48 hours, fixed and stained with violet crystal. Magnifying bar: 50µm;
✓ FIG 4: Toxicity test for extracts with cells incubated for 48 hours. ISO 10993-5 defines a viability reduction greater than 30% of the negative control as toxic. The letters indicate the groups with statistical differences (0.05);
✓ FIG 5: Morphological analysis of the cells that grew on the polymers with 48 hours of incubation and stained with violet crystal. Magnifying bar: 20µm;
✓ FIG 6: Cytochemical analysis of cells that grew on polymers after 48 hours of incubation and stained with Xylidine Ponceau at pH 2.5. Magnifying bar: 20µm;
✓ FIG 7: Cytochemical analysis of cells that grew on polymers after 48 hours of incubation and stained with Picrossirus-Hematoxiloina. Magnifying bar: 20µm;
✓ FIG 8: Scanning electron microscopy of cells grown on the polymer blends 75% and 50%;
✓ FIG 9: Microbiological test in broth. A and B represent the controls for 75%, in broth and plate respectively; C and D represent the controls for 50%, in broth and plate respectively; E and F represent the inoculation test for broth and plate for 50% and 75%, respectively;
✓ FIG 10: Broth test. A and B are the sample 75% 9/1; C and D are the sample 75% 9/2; E and F are the sample 50% 9/1; G and H are the sample 50% 9/2; from A to G broth test; from B to H plate test;
✓ FIG. 11: Antibiogram. A represents control without VAN; B positive control of standard analysis; C the samples 75% 9/1 and 9/2; D the samples 50% 9/1 and 9/2;
✓ FIG 12: Morphological analysis of membranes 50% with Vancomycin by phase contrast. Magnifying bar 50µm;
✓ FIG 13: Morphological analysis of the membranes 75% with Vancomycin by phase contrast. Magnifying bar 50µm;
✓ FIG 14: Morphological analysis of fibrous blends 75% with vancomycin by light optical microscopy. Magnifying bar 50 µm;
✓ FIG 15: Morphological analysis of fibrous blends 50% with vancomycin by light optical microscopy. Magnifying bar 50 µm;
✓ FIG 16: Toxicity test with the incorporation of Vancomycin with or without its elution. ISO 10993-5 defines a viability reduction greater than 30% of the negative control as toxic. The letters indicate the groups with statistical differences (0.05).

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[030] Para iniciar o processo de obtenção de arcabouços poliméricos fibrosos com vancomicina por meio de rotofiação (Fig. 1), os polímeros utilizados, a εpolicaprolactona (PCL) CAS 24980-41-04 com massa molar reportada de 70.000 g/mol, obtido da empresa Sigma Aldrich e o poli (L- ácido lático) (PLA) com massa molecular entre 185.000 e 259.000 g/mol CAS 4511-42-6-95-6-5, fornecidos pela empresa PURAC, foram pesados (E1), utilizando balança analítica nas proporções 1/1 (m/m), e, em seguida, foram solubilizados (E2) em duas concentrações: a primeira com DMF 75% (1) e Clorofórmio 25% (2) e, a segunda, com DMF 50% (3), Clorofórmio 25% (2) e Acetona 25% (4) sob agitação mecânica (E3), à 1.000 RPM, por 24h, em temperatura ambiente. A concentração final de ambas as soluções poliméricas, DMF/ Clorofórmio – 75%/ 25% - PLA/PCL (5) e DMF/ Clorofórmio/ Acetona – 50%/25%/25% - PLA/PCL, (6) foi de 150 mg/ml.[030] To start the process of obtaining fibrous polymeric frameworks with vancomycin by means of rotofiation (Fig. 1), the polymers used, εpolicaprolactone (PCL) CAS 24980-41-04 with a reported molar mass of 70,000 g / mol, obtained from the company Sigma Aldrich and the poly (L- lactic acid) (PLA) with molecular mass between 185,000 and 259,000 g / mol CAS 4511-42-6-95-6-5, supplied by the company PURAC, were weighed (E1) , using an analytical balance in 1/1 (m / m) proportions, and then they were solubilized (E2) in two concentrations: the first with 75% DMF (1) and 25% Chloroform (2) and, the second, with DMF 50% (3), Chloroform 25% (2) and Acetone 25% (4) under mechanical stirring (E3), at 1,000 RPM, for 24 hours, at room temperature. The final concentration of both polymeric solutions, DMF / Chloroform - 75% / 25% - PLA / PCL (5) and DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL, (6) was 150 mg / ml.

[031] Os solventes utilizados na solubilização dos polímeros foram: Clorofórmio [CHCL3, 99%] , Acetona [(CH3)2CO, 99.5%] e Dimetilformamida DMF (CH3)2NC(O)H todos obtidos pelo laboratório Sigma Aldrich.[031] The solvents used in the solubilization of the polymers were: Chloroform [CHCL3, 99%], Acetone [(CH3) 2CO, 99.5%] and Dimethylformamide DMF (CH3) 2NC (O) H all obtained by the Sigma Aldrich laboratory.

[032] Após a obtenção das soluções poliméricas: DMF/ Clorofórmio – 75%/ 25% - PLA/PCL (5) e DMF/ clorofórmio/ Acetona – 50%/25%/25% - PLA/PCL (6), ambas foram adicionadas (E4) de uma solução de Vancomina (7), constituída de 20mg de Vancomicina (VAN) dissolvida em 10 ml de dimetilsulfóxido (DMSO), após a adição (E4), as misturas (8) e (9) foram mantidas sob agitação mecânica (E5) à 1.000 RPM, por 24h, em temperatura ambiente, sendo, que, após esse período, foram rotofiadas (E6) em duas proporções, sendo 9 ml de solução polimérica para 1 ml de solução Vancomicina (7), e 9 ml de solução polimérica, DMF/ Clorofórmio – 75%/ 25% - PLA/PCL (5) e DMF/ Clorofórmio/ Acetona – 50%/25%/25% - PLA/PCL (6), para 2 ml da solução de Vancomicina (7), acrescentando diferentes combinações de porções de 25%, 50% e 75% de solventes, conforme indicado na tabela 2.

[032] After obtaining the polymeric solutions: DMF / Chloroform - 75% / 25% - PLA / PCL (5) and DMF / chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6), both a Vancomine solution (7), consisting of 20mg of Vancomycin (VAN) dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), was added (E4), after the addition (E4), the mixtures (8) and (9) were maintained under mechanical agitation (E5) at 1,000 RPM, for 24 hours, at room temperature, and, after that period, they were rotated (E6) in two proportions, with 9 ml of polymeric solution for 1 ml of Vancomycin solution (7), and 9 ml of polymeric solution, DMF / Chloroform - 75% / 25% - PLA / PCL (5) and DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6), for 2 ml of Vancomycin solution (7), adding different combinations of portions of 25%, 50% and 75% of solvents, as indicated in table 2.

[033] Para a rotofiação (E6), as soluções foram vertidas no aparelho, de maneira manual com auxílio de uma seringa, com o equipamento desligado, sendo, em seguida ligado a uma velocidade de 9.000 RPM e temperatura de 36°C, e mantido nessas condições até a formação das fibras, o que leva entre 1 e 5 minutos. Foram produzidos 20 ml de cada solução, sendo adicionados 3 ml por vez. Após a finalização da rotofiação (E6), as fibras (F) são retiradas (E7) do equipamento e dispostas sobre papel alumínio para secagem (E8) em condições ambientes de pressão e temperatura, estando prontas para serem dispostas (E9) como arcabouços (A).[033] For rotating (E6), the solutions were poured into the device, manually with the aid of a syringe, with the equipment turned off, and then connected at a speed of 9,000 RPM and a temperature of 36 ° C, and maintained in these conditions until the formation of the fibers, which takes between 1 and 5 minutes. 20 ml of each solution were produced, with 3 ml added at a time. After the end of the rotofiation (E6), the fibers (F) are removed (E7) from the equipment and placed on aluminum foil for drying (E8) under ambient conditions of pressure and temperature, being ready to be arranged (E9) as frameworks ( THE).

[034] Através da técnica de rotofiação foi possível a produção das fibras. A efetiva produção da fibra melhora quando a solução é colocada no compartimento do equipamento antes de iniciar a rotação. Foi produzida uma boa quantidade de membrana com as soluções apresentadas. A adição da vancomicina (VAN) foi capaz de diminuir o diâmetro das fibras produzidas.[034] Through the rotofying technique it was possible to produce the fibers. The effective production of the fiber improves when the solution is placed in the equipment compartment before starting the rotation. A good amount of membrane was produced with the solutions presented. The addition of vancomycin (VAN) was able to decrease the diameter of the fibers produced.

[035] Após a produção dos arcabouços fibrosos foram realizadas análises para caracterização das amostras, a fim de se avaliar possível toxicidade e capacidade de estimular a adesão celular na blenda polimérico. Para isso foram realizados os métodos de cultura celular, toxicidade in vitro por extrato, análise morfológica e citoquímica por microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura nas amostras produzidas.[035] After the production of the fibrous frameworks, analyzes were carried out to characterize the samples, in order to assess possible toxicity and the ability to stimulate cell adhesion in the polymeric blend. For that, the methods of cell culture, in vitro toxicity by extract, morphological and cytochemical analysis by light microscopy and scanning electron microscopy were performed on the produced samples.

[036] As fibras produzidas sem Vancomicina não foram consideradas tóxicas nas condições de cultivo celular. A presença do fármaco à fibra produzida demonstrou atividade farmacológica, exceto na amostra 50% 9/1. A análise microbiológica demonstrou atividade antibacteriana da Vancomicina em relação a bactéria Staphylococcus aureus e também a liberação total do fármaco nas primeiras 24h, sendo que, apenas as blendas fibrosas 50% 9/2 e 75% 9/1 foram consideradas toxicas com 24h de incubação sem eluição da Vancominina. Com a eluição do antibiótico, apenas a amostra 50% 9/2 foi considerada tóxica. Através dos testes microbiológicos e de citoxidade, pode-se observar que a Vancomicina é liberada em maior parte nas primeiras 24h de incubação no meio de cultivo. Dessa maneira, as análises apontaram que as melhores amostras são as 75% 9/2 e 50% 9/1.[036] Fibers produced without Vancomycin were not considered to be toxic under cell culture conditions. The presence of the drug in the fiber produced showed pharmacological activity, except in the sample 50% 9/1. The microbiological analysis showed Vancomycin antibacterial activity in relation to Staphylococcus aureus bacteria and also the total release of the drug in the first 24 hours, and only fibrous blends 50% 9/2 and 75% 9/1 were considered toxic with 24 hours of incubation. without Vancominine elution. With the elution of the antibiotic, only the 50% 9/2 sample was considered toxic. Through microbiological and cytotoxicity tests, it can be seen that Vancomycin is released mostly in the first 24 hours of incubation in the culture medium. Thus, the analyzes showed that the best samples are 75% 9/2 and 50% 9/1.

[037] A técnica de rotofiação mostrou-se capaz de produzir fibras e membranas em quantidades significativas e em um tempo curto. A incorporação da Vancomicina foi possível em valores importantes para a atividade farmacológica e não interferiu na produção das fibras nas condições empregadas. A partir da caracterização morfológica de superfície, utilizando a microscopia eletrônica de varredura (MEV), verificou-se uma porosidade heterogênea nas fibras. Ensaios com células Vero mostraram nãotoxicidade e adesão celular. Na análise de cultura celular os resultados não indicaram citotoxicicidade, as células apresentaram confluência sobre a placa de cultura, e se mostram bem espalhadas, com morfologia não alongada. Os resultados demonstraram que a técnica de rotofiação produz fibras em quantidades satisfatórias e capazes de manter o cultivo celular. A seguir, são apresentadas as análises realizadas, de maneira detalhada, com o material obtido.[037] The rotofying technique was able to produce fibers and membranes in significant quantities and in a short time. The incorporation of Vancomycin was possible at important values for pharmacological activity and did not interfere with the production of fibers under the conditions employed. From the surface morphological characterization, using scanning electron microscopy (SEM), a heterogeneous porosity in the fibers was verified. Assays with Vero cells showed non-toxicity and cell adhesion. In the analysis of cell culture, the results did not indicate cytotoxicity, the cells presented confluence on the culture plate, and are well spread out, with non-elongated morphology. The results demonstrated that the rotofiation technique produces fibers in satisfactory quantities and capable of maintaining cell culture. Below, the analyzes performed, in detail, with the material obtained are presented.

[038] Cultura Celular.[038] Cell Culture.

[039] Foram utilizadas células Vero, uma linhagem celular estabelecida a partir de células do rim do macaco verde africano (Cercopithecus aeothiops). Essas células foram cultivadas em meio de cultura 199 (Lonza) com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB, Nutricell Nutrientes Celulares, Campinas, SP, Brazil) a 37°C em estufa com 5% de CO2. As trocas de meio ocorreram sempre que houve acidificação do mesmo e os subcultivos foram efetuados de uma a duas vezes por semana. As células Veros são recomendadas para estudos sobre citotoxicidade e interações entre células em biomateriais (Kirkpatrick, 1992; ISO 10993-5: 2009).[039] Vero cells, a cell line established from cells of the kidney of the African green monkey (Cercopithecus aeothiops), were used. These cells were grown in culture medium 199 (Lonza) with 10% Bovine Fetal Serum (SFB, Nutricell Nutrientes Celulares, Campinas, SP, Brazil) at 37 ° C in a greenhouse with 5% CO2. The changes of medium occurred whenever there was acidification of the medium and the subcultures were carried out once or twice a week. Veros cells are recommended for studies on cytotoxicity and interactions between cells in biomaterials (Kirkpatrick, 1992; ISO 10993-5: 2009).

[040] Toxicidade in vitro por extratos das amostras sem Vancomicina.[040] In vitro toxicity from extracts of samples without Vancomycin.

[041] Análise da toxicidade por extrato das amostras PCL/PLA 7,5% com 75%, DMF e 25% Clorofórmio (passando a ser chamadas de 75%) e PCL/PLA 7,5% com 50% DMF, 25% Clorofórmio 25% Acetona (passando a ser chamadas de 50%).[041] Analysis of the toxicity by extract of the samples PCL / PLA 7.5% with 75%, DMF and 25% Chloroform (now called 75%) and PCL / PLA 7.5% with 50% DMF, 25% Chloroform 25% Acetone (now called 50%).

[042] Os polímeros escolhidos foram PLA e PCL que são biodegradáveis e utilizados para a produção de biomateriais na engenharia de tecidos. A produção foi iniciada utilizando-se um equipamento para o controle da alimentação do polímero no compartimento de rotação do equipamento, porém houve degradação do material pois para dissolver os polímeros, foram utilizados como solventes DMF, Clorofórmio e Acetona. Então, foi decidido fazer a alimentação através de uma seringa com 3ml da solução, percebendo-se a formação de fibras em pequenas quantidades.[042] The polymers chosen were PLA and PCL which are biodegradable and used for the production of biomaterials in tissue engineering. Production was started using equipment to control the polymer feed in the equipment's rotation compartment, but there was material degradation because to dissolve the polymers, DMF, Chloroform and Acetone solvents were used. So, it was decided to feed through a syringe with 3 ml of the solution, perceiving the formation of fibers in small amounts.

[043] Contraste de fase.[043] Phase contrast.

[044] Após 48h horas de cultivo (Fig. 2), foram observadas no controle negativo (não tóxico) células confluentes sobre a placa de cultura. As células se mostraram bem espalhadas e com morfologia não alongada. No controle positivo (tóxico), foram observadas poucas células arredondadas, sinalizando morte celular. As células que cresceram incubadas com os extratos, seja das amostras 50% ou 75%, mostraram um padrão morfológico semelhante ao controle negativo de toxicidade.[044] After 48 hours of culture (Fig. 2), confluent cells on the culture plate were observed in the negative control (non-toxic). The cells were well spread and had an unstretched morphology. In the positive (toxic) control, few round cells were observed, signaling cell death. The cells that grew incubated with the extracts, either from the samples 50% or 75%, showed a morphological pattern similar to the negative toxicity control.

[045] Células coradas com o cristal violeta.[045] Cells stained with violet crystal.

[046] Após a fixação, foram observados resultados semelhantes a quando se corou com o cristal violeta (Fig. 3). No controle negativo foram observadas células achatadas, com cromatina descondensada e nucléolos evidentes. No controle positivo foram observadas células retraídas e pignóticas. As células que cresceram em contato com os extratos mostram um padrão semelhante ao controle negativo.[046] After fixation, results similar to when stained with violet crystal were observed (Fig. 3). In the negative control, flattened cells were observed, with condensed chromatin and evident nucleoli. In the positive control, retracted and pignotic cells were observed. The cells that grew in contact with the extracts show a pattern similar to the negative control.

[047] Ensaio de quantificação do cristal violeta.[047] Violet crystal quantification test.

[048] A seguir, é apresentada a quantificação do ensaio realizado com o cristal violeta.[048] The quantification of the test performed with the violet crystal is presented below.

[049] Foi observado que as células que cresceram incubadas com os extratos mostraram um padrão de crescimento semelhante ao controle negativo (Fig. 4).[049] It was observed that the cells that grew incubated with the extracts showed a growth pattern similar to the negative control (Fig. 4).

[050] Análise morfológica e citoquímica das células sobre as fibras.[050] Morphological and cytochemical analysis of cells on fibers.

[051] Células coradas com cristal violeta.[051] Violet crystal-stained cells.

[052] Após a coloração com o corante cristal violeta, foi observada a morfologia do crescimento celular das células nas placas controle e nas placas com células ao redor das fibras 75% e 50%. Como podem ser visualizadas na figura 5, as células que cresceram nas placas com fibras demonstram um padrão morfológico em conformidade com o crescimento da placa controle. Por outro lado, nas blendas 75% e 50% as células estão presentes e mostram, como esperado, um padrão morfológico diferente.[052] After staining with the crystal violet dye, the cell growth morphology of the cells was observed in the control plates and in the plates with cells around the fibers 75% and 50%. As can be seen in figure 5, the cells that grew on the fiber plates demonstrate a morphological pattern in accordance with the growth of the control plate. On the other hand, in the blends 75% and 50% the cells are present and show, as expected, a different morphological pattern.

[053] As células crescem aderidas as fibras e entre elas, demonstrando uma boa capacidade de adesão e crescimento ao substrato.[053] The cells grow adhered to the fibers and between them, demonstrating a good capacity for adhesion and growth to the substrate.

[054] Células coradas com Xylidine Ponceau (XP).[054] Cells stained with Xylidine Ponceau (XP).

[055] De maneira geral, observa-se com o método de coloração de Xylidine Ponceau o citoplasma e o núcleo levemente acidófico. Exceto pela menor quantidade de células, não foram observadas variações citoquímicas entre o controle e as células que cresceram nas placas 75% e 50% (Fig. 6). As células que cresceram aderidas as fibras, muitas vezes mostram uma acidofilia mais intensa, porém, o citoplasma dessas células estava menos espalhado que nas placas, sendo que, o mesmo foi visto na morfologia.[055] In general, the cytoplasm and the slightly acidophilic nucleus are observed with the Xylidine Ponceau staining method. Except for the smaller number of cells, no cytochemical variations were observed between the control and the cells that grew in the 75% and 50% plates (Fig. 6). The cells that grew attached to the fibers, often show a more intense acidophilia, however, the cytoplasm of these cells was less spread than in the plates, and the same was seen in the morphology.

[056] Células coradas com Picrossirus-hematoxilina.[056] Cells stained with Picrossirus-hematoxylin.

[057] A coloração com Picrosirius permite uma análise qualitativa das fibras colágenas do tecido conjuntivo, através da diferente interferência de cores, intensidade e birrefringência dos tecidos corados. A partir da análise, não foi observada marcação significativa das células com o uso dessa coloração, seja nas placas, seja sobre as fibras (Fig. 7).[057] Staining with Picrosirius allows a qualitative analysis of the collagen fibers of the connective tissue, through the different interference of colors, intensity and birefringence of the stained tissues. From the analysis, no significant marking of the cells was observed with the use of this staining, either on the plates or on the fibers (Fig. 7).

[058] Microscopia eletrônica de varredura (MEV).[058] Scanning electron microscopy (SEM).

[059] Para analisar o crescimento, adesão e espalhamento as células foram cultivadas sobre os materiais e observadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Para tanto, os materiais foram colocados sobre lamínula circular com 13 mm e em seguida foi inoculada uma suspensão celular na concentração de 3x106 células/ml e a placa foi incubada por 24 h a 37°C. Em seguida, as lamínulas e os materiais foram fixados por 2h em temperatura ambiente em solução de paraformoldeído 2,5%, glutaraldeído 2,5% (Sigma, St Louis, MO, USA) dissolvidos em tampão cacodilato 0,1M, pH 7,4). Em seguida os materiais foram lavados em três banhos com solução de PBS por 15 minutos, e desidratados em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 95% e 100%). Em seguida, as lamínulas e os materiais foram secos em equipamento de Ponto Crítico (Balzers, CTD-030), submetidos à metalização a ouro (Balzers, CTD-050) e observados em Microscópio Eletrônico de Varredura (JEOL, 5800).[059] To analyze growth, adhesion and spreading, cells were grown on the materials and observed by Scanning Electron Microscopy (SEM). For this, the materials were placed on a 13 mm circular cover slip and then a cell suspension at a concentration of 3x106 cells / ml was inoculated and the plate was incubated for 24 h at 37 ° C. Then, the coverslips and materials were fixed for 2 hours at room temperature in a 2.5% paraformoldehyde, 2.5% glutaraldehyde solution (Sigma, St Louis, MO, USA) dissolved in 0.1M cacodylate buffer, pH 7, 4). Then the materials were washed in three baths with PBS solution for 15 minutes, and dehydrated in increasing concentrations of ethanol (50%, 70%, 95% and 100%). Then, the coverslips and the materials were dried in Critical Point equipment (Balzers, CTD-030), subjected to gold plating (Balzers, CTD-050) and observed in a Scanning Electron Microscope (JEOL, 5800).

[060] Na figura 8, é possível observar que as fibras produzidas por rotofiação após, método de cultivo celular, apresentam morfologia que proporciona a adesão e crescimento celular. A microscopia eletrônica de varredura, indica adesão celular nas blendas poliméricas, sendo observado que, tanto a amostra 75%, quanto a 50% apresentam favorecimento ao crescimento celular, possibilitando estudos de regeneração tecidual.[060] In figure 8, it is possible to observe that the fibers produced by rotofiation after, a cell culture method, present a morphology that provides cell adhesion and growth. Scanning electron microscopy indicates cell adhesion in polymeric blends, and it is observed that both the sample 75% and 50% favor cell growth, enabling studies of tissue regeneration.

[061] Espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR).[061] Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy.

[062] Para a análise de FTIR foi utilizado o equipamento SPOTLIGHT 400 FTIR, no intervalo de medida entre 4000 a 550 cm-1, sendo adotada a técnica de Reflexão Total Atenuada (ATR, Attenuated total Reflectance) no modo de transmitância, com resolução de 4 cm-1 em 60 varreduras para cada medida. A finalidade da análise foi verificar a presença dos polímeros PCL, PLA e a Vancomicina utilizados nas soluções poliméricas.[062] For the FTIR analysis, the SPOTLIGHT 400 FTIR equipment was used, in the measurement range between 4000 to 550 cm-1, using the Attenuated Total Reflectance (ATR) technique in the transmittance mode, with resolution of 4 cm-1 in 60 scans for each measurement. The purpose of the analysis was to verify the presence of the PCL, PLA and Vancomycin polymers used in the polymeric solutions.

[063] Para o PCL foi observado que o modo vibracional de 2947 cm-1, característico do grupo CH3 simétrico, em 2867 cm-1 corresponde ao CH2 simétrico, em 1471 cm-1 temos o trecho do CH3 assimétrico e em 1242 cm-1 temos o comportamento dos complexos pertencentes aos éteres COOH. Para o PLA foi observado que o modo vibracional 1454 cm-1 correspondendo ao clorofórmio, CHCl3, e em 1185 cm-1 temos a cetona, referente a deformação axial da ligação C-O-C, da estrutura polimérica. Em 2882 cm-1, foi identificado o comportamento das estruturas de CH. Para a Vancomicina, foram encontrados os seus modos vibracionais de estiramento característicos nas regiões de 3693 a 3030 cm-1 e somente nos espectros das membranas com Vancomicina, evidenciando a incorporação da mesma à blenda.[063] For the PCL it was observed that the 2947 cm-1 vibrational mode, characteristic of the symmetrical CH3 group, at 2867 cm-1 corresponds to the symmetrical CH2, at 1471 cm-1 we have the asymmetric CH3 section and at 1242 cm- 1 we have the behavior of the complexes belonging to the COOH ethers. For the PLA it was observed that the vibrational mode 1454 cm-1 corresponding to the chloroform, CHCl3, and in 1185 cm-1 we have the ketone, referring to the axial deformation of the C-O-C bond, of the polymeric structure. At 2882 cm-1, the behavior of the CH structures was identified. For Vancomycin, its characteristic vibrational stretching modes were found in the regions from 3693 to 3030 cm-1 and only in the membranes spectra with Vancomycin, showing its incorporation into the blend.

[064] Análise microbiológica das fibras com Vancomicina.[064] Microbiological analysis of the fibers with Vancomycin.

[065] Análise microbiológica em caldo.[065] Microbiological analysis in broth.

[066] Todos os testes foram realizados em triplicatas. Na figura 9, A e B representam os controles para 75%, em caldo e placa respectivamente, C e D representam os controles para 50%, em caldo e placa respectivamente; E e F representa o teste de inoculação para caldo e placa para 50% e 75%, respectivamente. Na figura 10, A e B são a amostra 75% 9/1, C e D são a amostra 75% 9/2, E e F são a amostra 50% 9/1, G e H são a amostra 50% 9/2. De A até G teste de caldo, de B até H teste em placa, sendo observada inibição bacteriana nas concentrações de 75% 9/1 e 9/2 e 50% 9/1 e 9/2.[066] All tests were performed in triplicates. In figure 9, A and B represent the controls for 75%, in broth and plate respectively, C and D represent the controls for 50%, in broth and plate respectively; E and F represent the inoculation test for broth and plate for 50% and 75%, respectively. In figure 10, A and B are the sample 75% 9/1, C and D are the sample 75% 9/2, E and F are the sample 50% 9/1, G and H are the sample 50% 9 / two. From A to G broth test, from B to H plate test, with bacterial inhibition observed at concentrations of 75% 9/1 and 9/2 and 50% 9/1 and 9/2.

[067] Antibiograma.[067] Antibiogram.

[068] Foi utilizado o método antibiograma para testar a sensibilidade da bactéria S. aureus aos antimicrobianos com o objetivo clínico na escolha apropriada para a terapia com o fármaco Vancomicina. No caso de formação de halo inibitório, esse deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada será comparada com tabelas padronizadas, de modo geral estas tabelas determinam medidas de diâmetro e, dessa forma, a medida encontrada pode ser enquadrada em categorias como: sensível, intermediaria ou resistente. O meio de cultura utilizado foi o ágar Muller-Hinton, e foram usadas concentrações pré-estabelecidas do antibiótico Vancomicina.[068] The antibiogram method was used to test the sensitivity of the S. aureus bacteria to antimicrobials with the clinical goal of making the appropriate choice for therapy with the drug Vancomycin. In the case of the formation of an inhibitory halo, it must have its diameter measured, and the measurement found will be compared with standardized tables, in general these tables determine diameter measurements and, thus, the measurement found can be classified into categories such as: sensitive , intermediate or resistant. The culture medium used was Muller-Hinton agar, and pre-established concentrations of the antibiotic Vancomycin were used.

[069] Todos os testes foram realizados em triplicatas. Na figura 11, em A, tem-se controle 50% e 75% demonstram crescimento amplo da bactéria Staphylococcus aureus sobre a membrana e assim pode-se observar que não houve inibição de crescimento microbiano sobre a membrana, já na figura B, observa-se discos de Vancomicina utilizados na análise de antibiogramas e podemos constatar a presença de halo de inibição, demonstrando assim a viabilidade farmacológica. As figuras C e D demonstram a ação da Vancomicina em duas concentrações, tendo assim, tendo sido verificado melhor eficiência nas concentrações 75% 9/2 e 50% 9/2.[069] All tests were performed in triplicates. In figure 11, in A, there is 50% control and 75% demonstrate broad growth of the Staphylococcus aureus bacteria on the membrane and thus it can be observed that there was no inhibition of microbial growth on the membrane, in figure B, observed Vancomycin discs used in the analysis of antibiograms and we can verify the presence of an inhibition halo, thus demonstrating the pharmacological viability. Figures C and D demonstrate the action of Vancomycin in two concentrations, thus having a better efficiency in the concentrations 75% 9/2 and 50% 9/2.

[070] Os testes em caldo controle 75% e controle 50% demonstraram a presença da S. Aureus na amostra, devido ao crescimento de colônias após a inoculação em placa e turbidez do caldo em incubação por 48h a 37°C. Já na blenda polimérica com Vancomicina houve inibição, em todas as concentrações apresentadas, através da ausência de colônias após a inoculação.[070] Tests in 75% control and 50% control broth showed the presence of S. Aureus in the sample, due to the growth of colonies after plate inoculation and turbidity of the broth in incubation for 48 hours at 37 ° C. In the polymeric blend with Vancomycin, there was inhibition, in all concentrations presented, through the absence of colonies after inoculation.

[071] Nota-se que, no grupo controle, a blenda polimérica não inibe o crescimento microbiano, seja na concentração 75%, seja na concentração 50%. Os discos contendo 30mg de Vancomicina, utilizados em testes padrões de antibiograma, demostram inibição através da formação de um halo com raio superior a 15mm, referência apresentada em tabelas de padronização (Vermelho, 2007). Entretanto, nas amostras de PLA e PCL, contendo a Vancomicina, observou-se a formação do halo de inibição com raio inferior ao disco de Vancomicina, utilizados em testes de antibiograma. Ainda assim, foi possível observar uma inibição no crescimento do S. Aureus nas concentrações apresentadas, em destaque à amostra 50%, 9/2, onde pode ser observado um diâmetro maior, comparado à concentração 9/1.[071] It is noted that, in the control group, the polymer blend does not inhibit microbial growth, either in the 75% concentration or in the 50% concentration. Discs containing 30mg of Vancomycin, used in antibiogram patterns, show inhibition by forming a halo with a radius greater than 15mm, a reference presented in standardization tables (Vermelho, 2007). However, in the samples of PLA and PCL, containing Vancomycin, it was observed the formation of the inhibition halo with a radius smaller than the Vancomycin disc, used in antibiogram tests. Even so, it was possible to observe an inhibition in the growth of S. Aureus in the concentrations presented, especially the sample 50%, 9/2, where a larger diameter can be observed, compared to the concentration 9/1.

[072] Toxicidade in vitro por extratos das amostras com Vancomicina.[072] In vitro toxicity by extracting samples with Vancomycin.

[073] São mostrados os resultados da análise da toxicidade por extrato das amostras com Vancomicina, já haviam sido comentados os resultados para as amostras 75% e 50%. Agora são apresentados os resultados para PCL/PLA 7,5% cada 75%, 25% Clorofórmio e Vancomicina 9/1 (passando a ser chamada de 75% 9/1), PCL/PLA 7,5% cada 75%, 25% Clorofórmio e Vancomicina 9/2 (passando a ser chamada de 75% 9/2), PCL/PLA 7,5% cada 50%, 25% Clorofórmio, 25% Acetona e Vancomicina 9/1 (passando a ser chamada de 50% 9/1) e finalmente PCL/PLA 7,5% cada 50%, 25% clorofórmio, 25% acetona e vancomicina 9/2 (passando a ser chamada de 50% 9/2).[073] The results of the analysis of the toxicity by extract of the samples with Vancomycin are shown, the results for the samples 75% and 50% had already been commented. Now the results are presented for PCL / PLA 7.5% each 75%, 25% Chloroform and Vancomycin 9/1 (now called 75% 9/1), PCL / PLA 7.5% each 75%, 25 % Chloroform and Vancomycin 9/2 (now called 75% 9/2), PCL / PLA 7.5% each 50%, 25% Chloroform, 25% Acetone and Vancomycin 9/1 (now 50) % 9/1) and finally PCL / PLA 7.5% each 50%, 25% chloroform, 25% acetone and vancomycin 9/2 (now called 50% 9/2).

[074] Contraste de fase.[074] Phase contrast.

[075] Esse ensaio teve objetivo avaliar se a Vancomicina apresentava toxicidade às células Vero. Devido ao grande número de amostras, foram separadas as imagens das fibras 75% e 50%, com e sem Vancomicina.[075] This trial aimed to assess whether Vancomycin was toxic to Vero cells. Due to the large number of samples, 75% and 50% fiber images were separated, with and without Vancomycin.

[076] Para a amostra 75%, no controle negativo, notou-se células espalhadas, com morfologia normal. No controle positivo que receberam Vancomicina foram observadas células mortas e arredondadas (Fig. 12). Para a amostra 50%, no controle negativo, notam-se células espalhadas, com morfologia normal. No controle positivo das amostras que receberam Vancomicina foram, novamente, observadas células mortas e arredondadas (Fig. 13).[076] For the sample 75%, in the negative control, scattered cells with normal morphology were noted. In the positive control that received Vancomycin, dead and rounded cells were observed (Fig. 12). For the 50% sample, in the negative control, scattered cells with normal morphology are noted. In the positive control of samples that received Vancomycin, dead and rounded cells were again observed (Fig. 13).

[077] Células coradas com o cristal violeta.[077] Cells stained with violet crystal.

[078] Após a fixação e coloração com o corante cristal violeta, as amostras foram observadas (Fig. 14 e Fig. 15). No controle negativo, células confluentes sobre a placa de cultura, as células se mostraram bem espalhadas e com morfologia não alongada.[078] After fixation and staining with crystal violet dye, samples were observed (Fig. 14 and Fig. 15). In the negative control, confluent cells on the culture plate, the cells showed to be well spread and with unstretched morphology.

[079] O núcleo mostrava cromatina descondensada e nucléolo evidentes. No controle positivo, observamos poucas células arredondadas, sinalizando morte celular. As células que cresceram incubadas com as amostras 75%, 75% 9/1 (Vancomicina), 75% 9/2 (Vancomicina), demonstraram um melhor crescimento celular após 48h, assim como as amostras 50%, 50% 9/1 (Vancomicina), exceto a amostra 50% 9/2 (Vancomicina), que apresentou poucas células.[079] The nucleus showed evident condensed chromatin and nucleolus. In the positive control, we observed few rounded cells, signaling cell death. The cells that grew incubated with the samples 75%, 75% 9/1 (Vancomycin), 75% 9/2 (Vancomycin), showed better cell growth after 48 hours, as well as the samples 50%, 50% 9/1 ( Vancomycin), except for the 50% 9/2 sample (Vancomycin), which had few cells.

[080] Ensaio de quantificação do cristal violeta.[080] Violet crystal quantification test.

[081] A seguir, é apresentada a quantificação do ensaio realizado com o cristal violeta (Fig. 16). Observa-se que as células que cresceram incubadas com os extratos mostraram um padrão de crescimento semelhante ao controle negativo.[081] Next, the quantification of the test performed with the violet crystal is presented (Fig. 16). It is observed that the cells that grew incubated with the extracts showed a growth pattern similar to the negative control.

[082] As células mostraram um bom padrão de crescimento sobre as fibras. Mesmo espaçadas, as células foram capazes de adere a fibras e estabelecer ligações por meio de prolongamento entre diferentes fibras. A análise, dos resultados revelaram uma biocompatibilidade, pois não houve citotoxidade.[082] The cells showed a good growth pattern over the fibers. Even spaced, the cells were able to adhere to fibers and establish connections by means of prolongation between different fibers. The analysis of the results revealed a biocompatibility, as there was no cytotoxicity.

[083] Uma propriedade importante de se conhecer na avaliação biológica de um biomaterial, é o efeito inicial e potencialmente tóxico do mesmo para as células. Os testes de citotoxicidade têm por base a exposição de uma cultura de linhagem celular recomendada, ou linhagem primária (se pertinente), ao contato direto, indireto ou por extrato com determinada substância ou material alvo de análise, avaliando-se as alterações celulares resultantes da interação por tempo e condições apropriadas de exposição com o mesmo (MASSON, 2014). Os resultados obtidos para cada uma das amostras, reforçam o caráter atóxico dos biomateriais testados.[083] An important property to be known in the biological evaluation of a biomaterial, is the initial and potentially toxic effect of the same for the cells. The cytotoxicity tests are based on the exposure of a culture of recommended cell line, or primary line (if pertinent), to direct, indirect or extract contact with a certain substance or target material for analysis, evaluating the cellular changes resulting from the interaction for time and appropriate exposure conditions with the same (MASSON, 2014). The results obtained for each of the samples, reinforce the non-toxic character of the tested biomaterials.

[084] A biocompatibilidade, a aplicação de um biomaterial polimérico e biorreabsorvível, com propriedades antimicrobianas, é altamente desejável para o estudo de regeneração tecidual. Foram realizadas análises em relação à incorporação da Vancomina na blenda polimérica e sua ação farmacológica, sensibilidade à S. Aureus, através de testes em caldo e placa.[084] Biocompatibility, the application of a polymeric and bioresorbable biomaterial, with antimicrobial properties, is highly desirable for the study of tissue regeneration. Analyzes were carried out in relation to the incorporation of Vancomine in the polymer blend and its pharmacological action, sensitivity to S. Aureus, through tests in broth and plate.

[085] Os testes em caldo controle 75% e controle 50% demonstraram a presença da S. Aureus na amostra, devido ao crescimento de colônias após a inoculação em placa e turbidez do caldo em incubação por 48h a 37°C. Já na blenda polimérica com Vancomina, houve inibição em todas as concentrações apresentadas, através da ausência de colônias após a inoculação. Nota-se que no grupo controle a blenda polimérica não inibe o crescimento microbiano, seja na concentração 75%, seja na concentração 50%. Os discos contendo 30mg de Vancomina, utilizados em testes padrões de antibiograma, demostram inibição através da formação de um halo com raio superior a 15mm, referência apresentada em tabelas de padronização (VERMELHO et al., 2007).[085] Tests in 75% control and 50% control broth showed the presence of S. Aureus in the sample, due to the growth of colonies after plate inoculation and turbidity of the broth in incubation for 48 hours at 37 ° C. In the polymeric blend with Vancomine, there was inhibition in all concentrations presented, through the absence of colonies after inoculation. It is noted that in the control group, the polymer blend does not inhibit microbial growth, either in the 75% concentration or in the 50% concentration. The disks containing 30mg of Vancomina, used in antibiogram tests, show inhibition through the formation of a halo with a radius greater than 15mm, a reference presented in standardization tables (VERMELHO et al., 2007).

[086] A partir do exposto, nota-se que tanto o processo para obtenção de arcabouços poliméricos fibrosos com Vancomicina por meio de rotofiação, quanto os produtos a partir dele obtidos e sua aplicação no tratamento de lesões tissulares, para a minimização e o desaparecimento de infecções estafilocócicas, são merecedores do privilégio de patente.[086] From the above, it is noted that both the process for obtaining fibrous polymeric frameworks with Vancomycin through rotofiation, as well as the products obtained from it and its application in the treatment of tissue injuries, for minimization and disappearance of staphylococcal infections, are worthy of the patent privilege.

Claims

PROCESS FOR OBTAINING FIBROUS POLYMERIC FRAMEWORKS WITH VANCOMYCIN THROUGH ROTOFIAATION characterized by starting with ε-polycaprolactone (PCL) polymers, the poly (L-lactic acid) (PLA) being weighed (E1), in 1/1 proportions ( m / m), and then be solubilized (E2) in two concentrations: the first with DMF 75% (1) and Chloroform 25% (2) and the second with DMF 50% (3), Chloroform 25% ( 2) and Acetone 25% (4), under mechanical stirring (E3), 1000 RPM, for 24 hours, at room temperature, with final concentration of both polymeric solutions, DMF / Chloroform - 75% / 25% - PLA / PCL ( 5) and DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6) of 150 mg / ml; after obtaining the polymeric solutions, a solution of Vancomine (7), consisting of 20mg of Vancomycin (VAN) dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), was added to both (E4), after the addition (E4), the mixtures ( 8) and (9) were kept under mechanical agitation (E5), 1000 RPM, for 24 hours, at room temperature, and, after that period, they were rotated (E6); after the end of the rotofiation (E6), the fibers (F) are removed (E7) from the equipment and placed on aluminum foil for drying (E8) under ambient conditions of pressure and temperature, being ready to be arranged (E9) as frameworks ( THE).

PROCESS FOR OBTAINING FIBROUS POLYMERIC FRAMEWORKS WITH VANCOMYCIN THROUGH ROTOFIAÇÃO, according to claim 1, characterized in that in the rotofiation step (E6), the solutions are poured into the rotating apparatus, manually with the aid of a syringe, with the aid of a syringe. equipment turned off, then connected at a speed of 9000 RPM and temperature of 36 ° C, and maintained in these conditions until the formation of the fibers (F).

PROCESS FOR OBTAINING FIBROUS POLYMERIC FRAMES WITH VANCOMYCIN THROUGH ROTOFIAÇÃO, according to claim 1, characterized by the rotofiation step (E6) to be carried out in two proportions, being:

✓ 9 ml of DMF / Chloroform polymer solution - 75% / 25% - PLA / PCL (5) or DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6) for 1 ml of Vancomycin solution (7), and;
✓ 9 ml of polymeric solution, DMF / Chloroform - 75% / 25% - PLA / PCL (5) or DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6), for 2 ml of Vancomycin solution (7).

FIBROUS POLYMERIC FRAMEWORKS WITH VANCOMYCIN OBTAINED BY ROTOFIAATION, from the process described in claim 1, characterized by constituting:

✓ DMF / Chloroform polymer solution - 75% / 25% - PLA / PCL (5): consisting of ε-polycaprolactone (PCL) and poly (L- lactic acid) (PLA), in 1/1 (m / m) proportions ; solubilized in DMF 75% (1) and Chloroform 25% (2), in a concentration of 150 mg / ml, and;
✓ Vancomycin solution (7): consisting of Vancomycin (VAN) dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), in a ratio of 2: 1 mg / ml.

FIBROUS POLYMERIC FRAMES WITH VANCOMYCIN OBTAINED THROUGH ROTOFIAATION, obtained through the process described in claim 1, characterized by constituting:

✓ DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6): consisting of ε-polycaprolactone (PCL) and poly (L- lactic acid) (PLA), in 1/1 (m / m); solubilized in DMF 50% (3), Chloroform 25% (2) and Acetone 25% (4), in a concentration of 150 mg / ml, and;
✓ Vancomycin solution (7): consisting of Vancomycin (VAN) dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), in a ratio of 2: 1 mg / ml.

FIBROUS POLYMERIC FRAMEWORKS WITH VANCOMYCIN OBTAINED BY ROTOFIAÇÃO, according to any one of the claims 4 or 5, characterized by constituting a proportion of 9 parts of polymeric solution, DMF / Chloroform - 75% / 25% - PLA / PCL ( 5) or DMF / Chloroform / Acetone - 50% / 25% / 25% - PLA / PCL (6), and 1 to 2 parts of Vancomycin solution (7).

APPLICATION OF FIBROUS POLYMERIC FRAMES WITH VANCOMYCIN OBTAINED THROUGH ROTOFIAÇÃO, according to any one of the claims 4, 5 or 6, characterized for the treatment of tissue lesions, for the minimization and the disappearance of infections by E. Aureus.