BR102019014081A2 - compostos imunomoduladores e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, composição farmacêutica compreendendo compostos imunomoduladores e uso de compostos imunomoduladores na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de doenças virais - Google Patents

Abstract

A presente invenção descreve compostos imunomoduladores, uma composição farmacêutica compreendendo tais compostos e o uso desses compostos na preparação de uma composição farmacêutica e para tratamento de doenças virais. Mais especificamente, a presente invenção compreende compostos imunomoduladores, uma composição farmacêutica e seu uso na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de doenças virais respiratórias, principalmente do VSR.

Description

COMPOSTOS IMUNOMODULADORES E/OU SEUS SAIS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO COMPOSTOS IMUNOMODULADORES E USO DE COMPOSTOS IMUNOMODULADORES NA PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS VIRAIS Campo da Invenção

[1] A presente invenção descreve compostos imunomoduladores, uma composição farmacêutica compreendendo tais compostos e o uso destes compostos na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de doenças virais. A presente invenção situa-se nos campos da química, farmácia e medicina.

Antecedentes da Invenção Doenças Virais

[2] Infecções virais são uma importante causa de morte no mundo. Vírus como Influenza, Ebola, Zica vírus e Chikungunya são responsáveis por epidemias emergentes que afetam a população em extensão mundial. A resposta imune contra os vírus é uma ferramenta importante para o controle destas infecções. o sistema imune reage frente uma infecção viral recrutando componentes da resposta imune inata (células NK, macrófagos e interferon do tipo 1) e da resposta imune adaptativa (células T e B).

[3] A indução de interferon do tipo 1 por vírus é crucial para resposta imune e é mediada por receptores de padrão, tais como os receptores do tipo toll, RIG ou MDA-5, através da ativação de NF-kB e fatores reguladores de interferon (IRFs). A resposta de interferon do tipo 1 é controlada a partir dos genes responsivos do interferon após ativação do seu receptor o IFNAR. Interferon do tipo 1 previne a replicação dos vírus dentro da célula hospedeira, além disso, atua como molécula sinalizadora avisando as células vizinhas da presença do vírus. Pode também atuar recrutando células do sistema imune inato e adaptativo para o local da infecção.

[4] Infecções virais das vias áreas superiores (IVAS), otite média aguda viral, rinossinusite são exemplos de doenças virais que acometem as vias respiratórias. Além destas, as doenças respiratórias inflamatórias, que podem estar relacionadas também a infecções virais, tais como exacerbação da asma, bronquite, bronquiolite e pneumonia fazem mais de 4 milhões de vítimas por ano e afetam centenas de milhões de pessoas mundialmente (Bousquet, J and Khaltaev, N. et al. ISBN 978 92 4 156346 8, World Health Organization 2007). Estas doenças prejudicam a saúde e o bem-estar dos doentes e têm um impacto negativo na família e na sociedade. A faixa etária com maior prevalência de mortalidade nas doenças respiratórias inflamatórias são crianças de 0-12 anos, sendo uma importante parte acometida por doenças respiratórias agudas do trato inferior (bronquiolite) e asma (Ralston SL, Lieberthal AS, Meissner HC, Alverson BK, Baley JE, Gadomski AM, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis, management, and prevention of bronchiolitis. Pediatrics. 2014;134(5):e1474-502).

[5] E m especial, a bronquiolite é uma doença respiratória que acomete crianças menores de 2 anos de idade e é caracterizada pela vasta inflamação e edema das vias aéreas, causando um aumento na produção de muco e necrose das células epiteliais pulmonares, especificamente os bronquíolos (Ralston SL, Lieberthal AS, Meissner HC, Alverson BK, Baley JE, Gadomski AM, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis, management, and prevention of bronchiolitis. Pediatrics. 2014;134(5):e1474-502.). A bronquiolite é tipicamente ocasionada por infecção viral, sendo o Vírus sincicial respiratório (VSR) do gênero Pneumovirus, cepa A ou B, o mais frequente, representando 50-80% das bronquiolites virais agudas.

[6] A infecção por VSR também pode levar ao acometimento de outras doenças respiratórias, como por exemplo pneumonia e exacerbação da asma. A pneumonia é uma infecção do parênquima pulmonar que pode ser causada por diferentes organismos (Grant Mackenzie The definition and classification of pneumonia Pneumonia 2016 8:14). A maior incidência de pneumonia associada à bronquiolite é causada pela infecção por VSR, o que contribui significativamente para piora do quadro clínico do paciente (Turner C, Turner P, Cararra V, Eh Lwe N, Watthanaworawit W, Day NP, White NJ, Goldblatt D, Nosten F. A high burden of respiratory syncytial virus associated pneumonia in children less than two years of age in a South East Asian refugee population. PLoS One. 2012;7(11):e50100). Já a exacerbação da asma, é uma doença heterogênea, multifatorial, que também pode estar associada à infecção por VSR ou outros agentes, com obstrução reversível da via respiratória devido a uma reação inflamatória crônica bronquial. Os sintomas são tosse, ronquidão, sibilância, dificuldade respiratória (Fritz Horak. Diagnosis and management of asthma - Statement on the 2015 GINA Guidelines Wien Klin Wochenschr. 2016; 128(15): 541-554).

[7] Entretanto, há outros vírus que podem desencadear doenças respiratórias, porém em menor escala quando comparados ao VSR, como por exemplo a bronquiolite. São eles rinovírus, parainfluenza vírus (frequência de 5-25%), metapneumovírus, coronavírus, adenovírus (frequência de 5-10%), influenza vírus e enterovírus (frequência de 1-5%) (Meissner HC. Viral Bronchiolitis in Children. The New England journal of medicine. 2016;374(18): 1793-4).

[8] Cerca de 30% das crianças com bronquiolite apresentam co-infecções de dois vírus, sendo, mais comumente, a combinação de VSR e rinovírus. A incidência do pico da infecção ocorre entre o terceiro e sexto mês de idade (Mansbach JM, McAdam AJ, Clark S, Hain PD, Flood RG, Acholonu U, et al. Prospective multicenter study of the viral etiology of bronchiolitis in the emergency department. Academic emergency medicine: official journal of the Society for Academic Emergency Medicine. 2008;15(2):111-8). Os sinais clínicos clássicos começam com sintomas típicos de infecção viral do trato respiratório superior, com congestão nasal, progredindo para o trato respiratório inferior em alguns dias. Quando a infecção atinge o trato inferior, a criança pode apresentar apneia, tosse persistente e taquipneia, o que aumenta a força de respiração, resultando em retrações intercostais e supraclaviculares e uso intenso dos músculos abdominais. Através de ausculta pulmonar, quando a bronquiolite já está instaurada, podem ser identificadas crepitações e sibilância (Florin TA, Plint AC, Zorc JJ. Viral bronchiolitis. Lancet. 2016).

[9] Para causar a doença, o VSR se liga às células epiteliais e inicia a sua replicação, resultando em necrose do tecido epitelial e destruição ciliar. A destruição celular decorrente da infecção acarreta em uma resposta inflamatória intensa com a proliferação de células polimorfonucleares e linfócitos. A submucosa e outros tecidos pulmonares se tornam edematosos com o aumento da secreção de muco em resposta às citocinas pró-inflamatórias (Aherne W, Bird T, Court SD, Gardner PS, McQuillin J. Pathological changes in virus infections of the lower respiratory tract in children. Journal of clinical pathology. 1970;23(1):7-18). No lúmen do bronquíolo há a formação de tampões constituídos por debris celular e muco, levando a uma obstrução brônquica parcial ou completa, aprisionamento de ar e diferentes graus de colapso lobar, podendo ocasionar o óbito da criança (Ralston SL, Lieberthal AS, Meissner HC, Alverson BK, Baley JE, Gadomski AM, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis, management, and prevention of bronchiolitis. Pediatrics. 2014;134(5):e1474-502).

[10] Crianças com algumas condições pré-existentes, como prematuridade (<29 semanas de gestação), doença pulmonar crônica decorrente da prematuridade e doença cardíaca congênita podem apresentar uma bronquiolite mais intensa em comparação às crianças sem essas condições (Hall CB. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. The New England journal of medicine. 2001;344(25):1917-28). A bronquiolite intensa em bebês recém-nascidos está fortemente associada ao aumento de risco para o desenvolvimento de asma durante a infância tardia, principalmente após bronquiolite causada por VSR, além de também aumentar o risco de asma persistir durante a vida adulta (Sigurs N, Aljassim F, Kjellman B, Robinson PD, Sigurbergsson F, Bjarnason R, et al. Asthma and allergy patterns over 18 years after severe RSV bronchiolitis in the first year of life. Thorax. 2010;65(12):1045-52; Chan JY, Stern DA, Guerra S, Wright AL, Morgan WJ, Martinez FD. Pneumonia in childhood and impaired lung function in adults: a longitudinal study. Pediatrics. 2015;135(4):607-16; Caliskan M, Bochkov YA, Kreiner-Moller E, Bonnelykke K, Stein MM, Du G, et al. Rhinovirus wheezing illness and genetic risk of childhood-onset asthma. The New England journal of medicine. 2013;368(15):1398-407). Uma característica singular da doença causada pelo VSR é que o hospedeiro pode ser reinfectado com o mesmo patógeno de mesma cepa viral e apresentar os mesmos sintomas. Reinfecções com VSR são observadas ao longo da vida, apesar de haver indução de respostas tanto de anticorpos como de células T após uma infecção primária e a ausência de alteração antigênica detectável nas glicoproteínas de superfície do vírus (Collins PL, Melero JA. Progress in understanding and controlling respiratory syncytial virus: still crazy after all these years. Virus research. 2011 ;162(1 -2):80-99).

[11] No que tange os cuidados de saúde pública, mundialmente, em 2005, o VSR causou, sozinho, cerca de 66.000 a 199.000 mortes de crianças menores de cinco anos de idade, com um número desproporcionado dessas mortes ocorrendo em países com recursos limitados (Hall CB, Weinberg GA, Iwane MK, Blumkin AK, Edwards KM, Staat MA, et al. The burden of respiratory syncytial virus infection in young children. The New England journal of medicine. 2009;360(6):588-98). Além disso, os custos com hospitalizações de crianças menores de dois anos e com bronquiolite causada por VSR ultrapassam U$ 1,7 bilhões anuais (Hall CB, Weinberg GA, Blumkin AK, Edwards KM, Staat MA, Schultz AF, et al. Respiratory syncytial virus-associated hospitalizations among children less than 24 months of age. Pediatrics. 2013;132(2):e341-8; Jain S, Williams DJ, Arnold SR, Ampofo K, Bramley AM, Reed C, et al. Community-acquired pneumonia requiring hospitalization among U.S. children. The New England journal of medicine. 2015;372(9):835-45).

[12] No Brasil, segundo o informe epidemiológico do Ministério da Saúde de Influenza, até maio de 2018 entre os indivíduos menores de 10 anos predomina maior circulação de VSR, Parainfluenza e Adenovírus. Além disso, existe um predomínio de VSR (80%) entre os outros vírus que não influenza na causa da síndrome respiratória aguda grave em UTI (BRASIL MdS. Informe epidemiológico - Influenza: Monitoramento até a Semana Epidemiológica 10 de 2018. Secretaria de Vigilância em Saúde. 2018). Em 2017 em São Paulo foi registrado aumento nos casos graves de crianças infectadas pelo VSR necessitando de UTI (Machado L. Casos graves de vírus respiratório em crianças aumentam em hospitais de SP G1 São Paulo: Globo; 2017 [cited 2017 21 de maio]. Available from: http://g1.globo.com/sao-paulo/noticia/casos-graves-de-virus-respiratorio-em-criancas-aumentam-em-hospitais-de-sp.ghtml). Fato este que chama atenção da comunidade médica e científica para o desenvolvimento de terapias relacionadas à doença. Esses fatores tornaram a prevenção da infecção causada pelo VSR uma prioridade de saúde pública global. Ainda assim, nenhuma estratégia eficaz de vacinação está disponível. Intervenções com novos tratamentos para diminuir a replicação viral e consequente redução na intensidade das doenças têm recebido grande atenção de pesquisadores da área. Portanto, o desenvolvimento de novos métodos terapêuticos não dispendiosos, com alvo no combate à mortalidade causada pelo VSR, se tornou um desafio imposto aos profissionais da área da saúde da criança.

Compostos Imunomoduladores

[13] Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) são compostos orgânicos que possuem um grupamento carboxílico ligado a uma cadeia carbonílica de 1 a 5 carbonos em sua estrutura. Entre 90 a 95% dos AGCCs formados no organismo são acetato, propionato e butirato, estes com dois, três e quatro carbonos respectivamente. Os 5-10% restantes são representados por isobutirato, valerato, isovalerato e caproato (Ambroze WL, Jr., Pemberton JH, Phillips SF, Bell AM, Haddad AC. Fecal short-chain fatty acid concentrations and effect on ileal pouch function. Diseases of the colon and rectum. 1993;36(3):235-9). Os AGCCs são produtos provenientes, principalmente, do metabolismo de carboidratos não digeridos por bactérias presentes na microbiota, tais como lactobacilos, bifidobacterias e proteobactérias (Flint HJ, Duncan SH, Scott KP, Louis P. Links between diet, gut microbiota composition and gut metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 2015;74(1):13-22). Carboidratos incluindo as fibras alimentares solúveis são componentes importantes na produção intestinal de AGCCs (Flint HJ, Bayer EA, Rincon MT, Lamed R, White BA. Polysaccharide utilization by gut bacteria: potential for new insights from genomic analysis. Nature reviews Microbiology. 2008;6(2):121-31). A fermentação desses carboidratos no ceco produz uma taxa de 400-600 mM de AGCCs/dia (Bergman EN. Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species. Physiological reviews. 1990;70(2):567-90) e cerca de 70 a 140 mM no cólon proximal (Wong JM, de Souza R, Kendall CW, Emam A, Jenkins DJ. Colonic health: fermentation and short chain fatty acids. Journal of clinical gastroenterology. 2006;40(3):235-43). Após a metabolização, os AGCCs são liberados pelas bactérias para o lúmen intestinal de onde podem ser captados e utilizados por outras bactérias. Além disso, os AGCCs também são absorvidos pelas células do epitélio intestinal exercendo funções tanto locais (no epitélio intestinal), como no restante do corpo. A maior parte do butirato metabolizado é utilizada como fonte de energia por colonócitos, enquanto que o propionato é utilizado no metabolismo hepático. Já o acetato pode ser encontrado em maiores concentrações no sangue, com cerca de ± 79 mmol/L na circulação periférica (den Besten G, van Eunen K, Groen AK, Venema K, Reijngoud DJ, Bakker BM. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. Journal of lipid research. 2013;54(9):2325-40; Cummings JH, Pomare EW, Branch WJ, Naylor CP, Macfarlane GT. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 1987;28(10):1221-7).

[14] Estudos mostram que a suplementação de dieta com prebióticos (fibras alimentares solúveis), especialmente Galacto-oligosacarideo (GOS) e Fruto-oligossacarido (FOS), previne o desenvolvimento de infecções respiratórias virais (Luoto R, Ruuskanen O, Waris M, Kalliomaki M, Salminen S, Isolauri E. Prebiotic and probiotic supplementation prevents rhinovirus infections in preterm infants: a randomized, placebo-controlled trial. The Journal of allergy and clinical immunology. 2014;133(2):405-13; Li F, Jin X, Liu B, Zhuang W, Scalabrin D. Follow-up formula consumption in 3- to 4-year-olds and respiratory infections: an RCT. Pediatrics. 2014;133(6):e1533-40; Lohner S, Kullenberg D, Antes G, Decsi T, Meerpohl JJ. Prebiotics in healthy infants and children for prevention of acute infectious diseases: a systematic review and meta-analysis. Nutrition reviews. 2014;72(8):523-31). Lactentes até os 6 primeiros meses de vida alimentados com fórmula suplementada com 8 g/L de GOS/FOS apresentaram menos episódios de doença respiratória no trato respiratório superior (Arslanoglu S, Moro GE, Schmitt J, Tandoi L, Rizzardi S, Boehm G. Early dietary intervention with a mixture of prebiotic oligosaccharides reduces the incidence of allergic manifestations and infections during the first two years of life. The Journal of nutrition. 2008;138(6):1091-5). Bebês prematuros que receberam uma mistura de polidextrose e GOS, na dose de 600 mg por dia durante 30 dias, apresentaram menor incidência de infecções respiratórias, especialmente, associadas a Rhinovirus e não apresentaram nenhum efeito adverso (Haak BW, Littmann ER, Chaubard JL, Pickard AJ, Fontana E, Adhi F, et al. Impact of gut colonization with butyrate-producing microbiota on respiratory viral infection following allo-HCT. Blood. 2018;131(26):2978-86). Fórmulas enriquecidas com esses prebióticos, por sua vez, aumentam em até 3 vezes as concentrações de AGCCs, principalmente de acetato, nas fezes dos pacientes que receberam a intervenção em comparação aos controles (Majid HA, Emery PW, Whelan K. Faecal microbiota and short-chain fatty acids in patients receiving enteral nutrition with standard or fructo-oligosaccharides and fibre-enriched formulas. Journal of human nutrition and dietetics: the official journal of the British Dietetic Association. 2011 ;24(3):260-8; Vandenplas Y, De Greef E, Veereman G. Prebiotics in infant formula. Gut microbes. 2014;5(6):681-7), sugerindo que os AGCCs produzidos a partir do consumo de prebióticos na dieta possam contribuir para a proteção frente a infecções respiratórias. Além disso, foi demonstrado que os hábitos alimentares das gestantes têm o potencial de modificar a gravidade da infecção pelo VSR em crianças. Dietas ricas em carboidratos simples estão associadas a graves desfechos da infecção pelo VSR. Em contraste, a ingestão de frutas e vegetais (fontes importantes de fibras alimentares) parece conferir proteção materna (Ferolla FM, Hijano DR, Acosta PL, Rodriguez A, Duenas K, Sancilio A, et al. Macronutrients during pregnancy and life-threatening respiratory syncytial virus infections in children. American journal of respiratory and critical care medicine. 2013;187(9):983-90). De fato, a amamentação (o leite é rico em oligossacarídeos) ou fórmulas infantis ricas em fibras solúveis podem ter algum papel na imunidade protetora contra vírus e na prevenção de infecções respiratórias (Luoto R, Ruuskanen O, Waris M, Kalliomaki M, Salminen S, Isolauri E. Prebiotic and probiotic supplementation prevents rhinovirus infections in preterm infants: a randomized, placebo-controlled trial. The Journal of allergy and clinical immunology. 2014;133(2):405-13). Foi recentemente demonstrado que em pacientes transplantados a presença de bactérias produtoras de butirato confere resistência contra infecções respiratórias do trato inferior (Haak BW, Littmann ER, Chaubard JL, Pickard AJ, Fontana E, Adhi F, et al. Impact of gut colonization with butyrate-producing microbiota on respiratory viral infection following allo-HCT. Blood. 2018;131(26):2978-86).

[15] Estudo realizado em modelo experimental demonstrou que a utilização de uma dieta rica em fibras a base de prebióticos (scGOS/IcFOS/pAOS) reduziu significativa a presença de células T CD4 produtoras de citocinas Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) nos pulmões após infecção por VSR. A intervenção foi capaz de reduzir, também, a eosinofilia nas vias aéreas, bem como diminuiu o influxo de células dendríticas ativadas nos pulmões (Schijf MA, Kruijsen D, Bastiaans J, Coenjaerts FE, Garssen J, van Bleek GM, et al. Specific dietary oligosaccharides increase Th1 responses in a mouse respiratory syncytial virus infection model. Journal of virology. 2012;86(21):11472-82). Além disso, dieta rica em fibra confere proteção contra infecção pelo vírus influenza em camundongos e este efeito é mediado por butirato (Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C, et al. Gut microbiota metabolism of dietary fiber influences allergic airway disease and hematopoiesis. Nature medicine. 2014;20(2):159-66). Recentemente foi demonstrado que suplementação com propionato em camundongos prenhas e durante o período neonatal protege da infeção pelo VSR (Lynch JP, Werder RB, Loh Z, Sikder MAA, Curren B, Zhang V, et al. Plasmacytoid dendritic cells protect from viral bronchiolitis and asthma through semaphorin 4a-mediated T reg expansion. The Journal of experimental medicine. 2017).

[16] No que tange o início da atividade intrínseca e eficácia dos ligantes do receptor acoplado à proteína G (GPCR - GPR43, GPR41, GPR109a, Olfr78), os eventos de sinalização celular podem variar. Dependendo da eficácia, os ligantes do receptor podem ser classificados em: agonistas totais, agonistas parciais, antagonistas neutros e agonistas inversos. Esta classificação é normalmente feita sob condições experimentais específicas, porque a classificação pode ser afetada pela quantidade de receptor expresso e pela força do acoplamento estímulo-resposta. Além disso, evidências cumulativas sugerem que os agonistas podem induzir diferentes mudanças na conformação de um GPCR particular, o que leva à ativação de diferentes vias de sinalização, mesmo quando o nível de expressão do receptor e a força do acoplamento estímulo-resposta são os mesmos.

[17] Além disto, a acetilação e a deacetilação de histonas desempenham um papel importante na regulação da transcrição gênica de células eucarióticas. O estado de acetilação das histonas é determinado pelas histonas desacetilases (HDACs) e histonas acetil-transferases (HATs). As HATs adicionam grupos de acetil em resíduos de lisina das proteínas, enquanto HDACs fazem o inverso ou seja removem os grupos acetil. Em geral, a acetilação de histona produz uma estrutura de cromatina mais relaxada, permitindo a ativação transcricional. As HDACs podem ser repressores de transcrição, devido à desacetilação de histonas e conseqüentemente por promover a condensação da cromatina. Os inibidores de HDACs (HDACi) alteram a transcrição por remodelarem a cromatina e modificarem a estrutura de proteínas em complexos de fatores de transcrição.

[18] Desta forma, a conduta preventiva com ácidos graxos de cadeia curta já é bem descrita na literatura, mas a solução de problemas envolvendo o tratamento de doenças virais com estes compostos, ou mesmo com outros compostos agonistas de seus receptores ou promotores de mecanismo de ação semelhante, não foi exatamente resolvido anteriormente. Assim, não existem tratamentos efetivos contra doenças virais inflamatórias, especialmente as que acometem o sistema respiratório, incluindo o VSR. Além disso, os tratamentos disponíveis e profiláticos são caros e nem sempre eficientes. A conduta atual com crianças que são internadas consiste em dar basicamente suporte clínico para tratamento de sintomas, como por exemplo, a oxigênio terapia, fisioterapia respiratória, etc. Propõe-se assim um novo tratamento para doenças inflamatórias virais, principalmente as respiratórias, tais como bronquiolite, pneumonia, exacerbação da asma, infecções das vias áreas superiores (IVAS), otite média aguda viral e/ou rinossinusite, causadas por infecções e/ou co-infecções compreendendo pneumovírus, rinovírus, parainfluenza vírus, metapneumovírus, coronavírus, adenovírus, influenza vírus e/ou enterovírus, em especial o Vírus Sinsicial Respiratório (VSR).

[19] A busca na literatura apontou alguns documentos relevantes que serão descritos a seguir.

[20] O documento "Sodium acetate, infection, USP, 2 mEq/mL” (bula do acetato de sódio), é somente indicado como fonte de sódio em grandes volumes intravenosos para prevenir ou corrigir a hiponatremia em pacientes com restrição ou ausência de alimentação por via oral. Nossa invenção indica que o uso do acetato, ou outros ácidos graxos de cadeia curta, associados ao seu distinto mecanismo de ação, apresenta efeitos relevantes no tratamento de doenças virais.

[21] No documento intitulado "Plasmacytoid dendritic cells protect from viral bronchiolitis and asthma through semaphorin 4a-mediated T reg expansion’ (Lynch et al, J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 2 537-557) Lynch et al demonstraram que o lavado nasal de crianças infectadas com VSR, significativamente, tem menos propionato do que o de crianças VSR negativas, porém sem diferenças nos níveis do acetato. Além disso, os autores demonstraram que o tratamento com propionato via oral de camundongos fêmeas grávidas e a subsequente administração de propionato na prole por via intraperitoneal previne o desenvolvimento de bronquiolite grave causada pelo Pneumovírus de camundongo (similar ao VSR em humanos) e asma. Entretanto este fenômeno ocorre somente em camundongos com depleção de células dendríticas plasmacitoides. O documento não menciona o uso de outros AGCCs para tratamento de doenças virais. Além disto, no presente pedido de patente demonstrou-se que outros compostos também foram efetivos contra a infecção pelo VSR. Adicionalmente, o grande diferencial do presente trabalho é que não se está sugerindo um tratamento profilático, pois demonstrou-se que, tanto in vitro como in vivo, o tratamento com ácidos graxos de cadeia curta foi efetivo, mesmo após o início da infecção viral, bem como indicou-se os mecanismos de ação envolvidos.

[22] O Palivizumab é um anticorpo monoclonal humanizado anti-Proteína F do VSR que inibe a entrada do vírus nas células, sendo recomendado como conduta preventiva de bronquiolite grave causada por VSR, protegendo 50% das crianças que o utilizam. Entretanto, em um ensaio clínico controlado randomizado, este anticorpo mostrou reduzir as internações e a gravidade clínica da infecção por VSR em apenas 55% das crianças em alto risco (Palivizumab, a Humanized Respiratory Syncytial Virus Monoclonal Antibody, Reduces Hospitalization From Respiratory Syncytial Virus Infection in High-risk Infants. Pediatrics. 1998;102(3):531-7). Igualmente, dada a despesa de administração do palivizumabe - US $ 800 a US $ 3.000 por dose - a profilaxia universal não é considerada viável (Hampp C, Kauf TL, Saidi AS, Winterstein AG. Cost-effectiveness of respiratory syncytial virus prophylaxis in various indications. Archives of pediatrics & adolescent medicine. 2011;165(6):498-505). A presente invenção difere pelo fato de que os ácidos graxos de cadeia curta são utilizados como tratamento e não como prevenção. Adicionalmente, têm um custo muito inferior.

[23] A Ribavirina é um fármaco antiviral análogo sintético da guanosina que está na lista de medicamentos essenciais da Organização Mundial de Saúde (OMS). Atua por inibição da enzima inosina monofosfato desidrogenase, contudo, é recomendada apenas em casos especiais por ser tóxica para crianças pequenas. A presente invenção difere da Ribavirina pelo fato de que os ácidos graxos de cadeia curta são presentes no organismo e, quando testados in vitro em células A549 ou in vivo em camundongos, nas concentrações inibitórias de replicação viral e diferentes das fisiológicas, não induziram citotoxicidade.

[24] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção no estado da técnica.

Sumário da Invenção

[25] Considerando a alta ocorrência de doenças virais em crianças menores de 2 anos de idade, os altos custos de internações hospitalares destes pacientes e a falta de condutas preventivas, a presente invenção propõe uma nova abordagem a partir de compostos imunomoduladores para tratamento de doenças virais.

[26] Conforme antecedentes apontados, as condutas preventivas e de tratamento existentes são ineficientes e demandam alternativas em níveis de saúde pública. Em se tratando de doenças virais inflamatórias, mais precisamente do trato respiratório, as principais doenças que apontam nas estatísticas, não limitadas a essas, são: bronquiolite, pneumonia, exacerbação da asma, infecções das vias áreas superiores (IVAS), otite média aguda viral e rinossinusite. Destas, os agentes virais comumente envolvidos são pneumovírus, rinovírus, parainfluenza vírus, metapneumovírus, coronavírus, adenovírus, influenza vírus e enterovírus, sendo o gênero Pneumovírus o mais importante, principalmente o Vírus Sincicial Respiratório (VSR).

[27] Visando analisar o efeito de tratamento nas doenças virais respiratórias a partir de AGCCs e outros compostos imunomoduladores, tais como agonistas de receptores de AGCCs, agonistas de receptores de INF-β, moduladores de HDAC e HAT, no presente estudo foram investigados os mecanismos de ação associados com o papel protetor de compostos como acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e CTPB, sem limitação a estes.

[28] Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona compostos imunomoduladores selecionados do grupo dentre ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), agonistas sintéticos de receptores de AGCCs e/ou de interferon beta (INF-β), moduladores de histona desacetilase (HDAC) e/ou moduladores de histona acetil transferase (HAT). Mais precisamente, os compostos imunomoduladores são selecionados dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21, CTPB e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[29] Os presentes compostos imunomoduladores atuam como ativadores de receptores de AGCCs, ativadores de receptores de INF-β, inibidores de HDAC e/ou ativadores de HAT, desencadeando resposta anti-viral e anti-inflamatória mediada por INF-β. Os receptores ativados compreendem GPR43, GPR41, GPR109a, Olfr78 e/ou IFNAR; as histonas desacetilases compreendem HDAC 1 e/ou 3.

[30] O mecanismo de ação ocorre por modificações epigenéticas tais como metilação de histonas e controle da transcrição gênica. Mais especificamente, os presentes compostos atuam desencadeando resposta anti-viral e anti-inflamatória, através do uso de sinalizações por meio de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-β) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS. A consequência da ativação destas vias é a redução de carga viral.

[31] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo tais compostos imunomoduladores e/ou seus sais e veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos imunomoduladores podem ser utilizados isoladamente ou em combinação, preferencialmente isolados.

[32] E m um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de tais compostos imunomoduladores e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de doenças virais.

[33] E m uma realização preferencial, as evidencias demonstram melhores resultados em doenças virais respiratórias, tais como bronquiolite, pneumonia, exacerbação da asma, infecções das vias áreas superiores (IVAS), otite média aguda viral e/ou rinossinusite, causadas por infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, dentre pneumovírus, rinovírus, parainfluenza vírus, metapneumovírus, coronavírus, adenovírus, influenza vírus e/ou enterovírus, em especial, pelo Vírus Sincicial Respiratório (VSR).

[34] E m um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, compreendendo a seleção e a administração de uma quantidade suficiente dos compostos imunomoduladores acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e/ou CTPB, ou a mistura deles, desencadeando resposta anti-viral e anti-inflamatória, por meio de sinalizações de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-beta) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS e consequente redução de carga viral em pelo menos 80%. Tal método de tratamento compreende tais compostos imunomoduladores sendo eles agonistas de receptores de AGCCs, agonistas de receptores de INF-β, moduladores de HDAC e HAT.

[35] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[36] A figura 1 demonstra que a profilaxia com AGCCs in vitro em células epiteliais de pulmão humanas A549 diminui a replicação viral. A- Células A549 foram tratadas com propionato, butirato e acetato (260 uM) durante 24hs antes da infecção com 104 PFU/mL de VSR (cepa A2) e foram avaliadas quanto a viabilidade celular após 96h. B- Análise da expressão do gene da proteína F do VSR por PCR em tempo real. C- Análise da produção de IFN-β no sobrenadante das células infectadas por VSR e tratadas com os AGCCs (propionato, butirato e acetato) durante 24h. Legenda: (*) representa a diferença entre o controle; (#) representa a diferença entre o VSR; as diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas utilizando o teste ANOVA de duas vias seguido do post-test de Bonferroni; *,#p < 0.05, **,##p < 0.01, ***,###p < 0.001.

[37] A figura 2 demonstra o tratamento com AGCCs (propionato, butirato e acetato) in vitro após infecção com VSR, em células epiteliais de pulmão humanas A549: as células foram infectadas e posteriormente tratadas com os AGCCs 260uM, durante 4 dias e a viabilidade celular foi analisada utilizando MTT. Demonstrou-se que o tratamento com os AGCCs também teve efeito de proteção contra morte celular mediada pelo VSR.

[38] A figura 3 demonstra o tratamento in vivo com AGCCs (propionato, butirato e acetato) protege contra a infecção pelo VSR. Camundongos Balb/c foram infectados pela via intranasal com 107 PFU de VSR e tratados na água de beber com os AGCCs. A- Carga viral nos pulmões dos animais não-infectados e infectados com VSR tratados com os AGCCs obtida através de PCR em tempo real. ND: não detectado B- Percentual de perda de peso em relação ao peso original (dia 0). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

[39] A figura 4 demonstra a análise in vivo da produção de IFN-β em Camundongos Balb/c: homogenato do pulmão dos animais tratados com acetato e infectados por 5 dias infecção induz aumento de IFN-β. Os animais iniciaram o tratamento com acetato 200 mM na água de beber e foram infectados com VSR pela via intranasal no mesmo dia. Após 5 dias o pulmão foi coletado e foi analisada a quantidade de IFN- β no homogenato do pulmão.

[40] A figura 5 demonstra que a proteção contra infecção pelo VSR mediada pelo acetato é dependente dos receptores IFNAR e GPR43. Camundongos Balb/c foram infectados pela via intranasal com 107 PFU de VSR e tratados com água de beber com acetato, propionato ou butirato. A) Carga viral através de PCR em tempo real nos pulmões dos animais WT (selvagens) e IFNARKO (nocautes) infectados com VSR e tratados com os AGCCs; B) Percentual de perda de peso em relação ao peso original (dia 0); C) Carga viral através de PCR em tempo real nos pulmões dos animais WT (selvagens) e GPR43KO (nocautes) infectados com VSR e tratados com os AGCCs; D) Percentual de perda de peso em relação ao peso original (dia 0). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

[41] A figura 6 demonstra que a ativação específica de GPR43 protege in vitro contra a infecção por VSR. Células A549 foram tratadas com acetato de 260 uM ou um agonista sintético de GPR43 (10 uM 4-CMTB) durante 24 h e depois infectadas com VSR (104 PFU/mL). Quatro dias depois, os parâmetros de resposta foram analisados. A) viabilidade celular verificada pelo ensaio de MTT. B) Percentagem de morte celular foi determinada por coloração de iodeto de propídio (PI). C) Expressão do VSR foi detectada usando PCR em tempo real (análise 2-ΔCt). D) Concentrações de IFN-β no sobrenadante das células 12h após a infecção. A detecção foi feita por ELISA. Todos os dados são expressos como média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

[42] A figura 7 demonstra que a inibição de HDAC 1 e 3 protege contra a infecção causada por VSR in vitro. Células A549 foram plaqueadas e pré-tratadas com butirato (260 uM) ou com diferentes inibidores de HDAC (10 uM) por 24h e infectadas com VSR por 96h. Após, a viabilidade das células foi realizada por MTT. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

[43] A figura 8 demonstra representação esquemática de dieta rica em fibras ou administração de acetato na resposta contra a infecção por RSV. Uma dieta rica em fibras aumenta a produção de acetato no lúmen intestinal. Da mesma forma, o acetato administrado oralmente entra na corrente sanguínea e alcança os pulmões através da ligação ao seu receptor (GPR43). No acetato de pulmão aumenta os genes estimulados por interferon (Oas1 e Isg15) e o gene interferon-beta (Ifnb), que contribui para diminuir a carga viral do RSV.

Descrição Detalhada da Invenção

[44] Na presente invenção, resta evidenciado que AGCCs e outros compostos imunomoduladores, tais como agonistas de receptores de AGCCs, agonistas de receptores de INF-β, moduladores de HDAC e HAT, e seus respectivos mecanismos de ação, associados com o papel protetor de compostos como acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e CTPB demonstraram notável eficiência para tratamento de infecções virais.

[45] Assim, para demonstração de efetividade, modelos experimentais de doenças virais respiratórias in vitro, em células epiteliais de pulmão humanas A549, e in vivo, em diferentes linhagens de camundongos, associda a infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, dentre pneumovírus, rinovírus, parainfluenza vírus, metapneumovírus, coronavírus, adenovírus, influenza vírus e/ou enterovírus, mais especificamente pelo Vírus Sincicial Respiratório (VSR), foram consideradas.

[46] Para os ensaios iniciais, a cepa viral de VSR A2 foi identificada por placas virais formadoras de unidades (PFU) utilizando um anticorpo anti-VSR (Millipore, Billerica, MA, USA). Para os procedimentos in vivo, foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas, camundongos 129/Sv machos e fêmeas deficientes em receptor de interferon tipo 1 (Ifnar-1) e do tipo selvagem, camundongos fêmeas deficientes em Rag-1 (Rag1-/-), camundongos C57BL/6 fêmeas deficientes em GPR43 (Gpr43-/-), todos com idade de 6-8 semanas. Os animais foram alojados no biotério do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo CEUA/UNICAMP (protocolos 4022-1 e 4599-1). Para a infecção por VSR, os camundongos foram anestesiados com 5% de isoflurano e infectados intranasalmente com 107 PFU/mL da cepa A2 de VSR. Todos os animais foram pesados diariamente. A análise dos dados foi realizada 5 dias após a infecção. O lavado broncoalveolar (BAL) foi coletado ou, após a perfusão com formalina, o pulmão esquerdo foi removido para realização de análises histopatológica e imuno-histoquímica.

[47] E m relação à dieta e ao tratamento com AGCCs, os animais foram alimentados com dieta rica em fibras (HF) ou dieta controle (CF) por 4 semanas antes da infecção. Ambas as dietas foram baseadas no AIN93M (American Society for Nutrition, EUA), as quais difeririam na presença ou não de pectina cítrica (10%). Alternativamente, camundongos alimentados com dieta rica em fibras receberam uma mistura de antibióticos (canamicina (0,4 mg/mL), gentamicina (0,035 mg/mL), metronidazol (0,045 mg/mL), vancomicina (0,045 mg/mL) e colistina (0,035 mg/mL) diluído em água potável por 3 dias antes da infecção. Todos os antibióticos foram comprados da Sigma-Aldrich. Os camundongos receberam AGCCs (acetato de sódio, propionato de sódio ou butirato de sódio; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em água potável estéril na concentração final de 200 mM por 3 semanas antes da infecção pelo VSR. Outro tratamento com AGCCs foi realizado começando simultaneamente com a infecção na mesma concentração final. O consumo de volume de água foi medido diariamente e nenhuma diferença na ingestão de água foi observada entre os grupos.

[48] Com relação às análises histopatológica e imuno-histoquímica, amostra de pulmão esquerdo foi embebido em blocos de parafina, cortado em cortes de 4 μm, corado com H&E ou submetido à recuperação antigênica e subsequente marcação com anticorpo anti-proteína do F de VSR (Millipore, MA, EUA). A análise de slides foi realizada de maneira cega. A inflamação peribrônquica e perivascular foi pontuada de acordo com escala de Barends et al (4), como ausente (0), mínima (1), leve (2), moderada (3), acentuada (4) ou grave (5).

[49] Para a quantificação da carga viral, o RNA total do pulmão dos animais foi extraído e o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando GoScript transcriptional reverse (Promega). A amplificação do gene da proteína F do VSR foi realizada utilizando iniciadores específicos e sondas em PCR tempo real. Sequências iniciadoras, sintetizadas e clonadas em plasmídeos pUC57 (GenScript, Piscataway, NJ, EUA) foram utilizadas para realizar uma diluição de 10 vezes e gerar uma curva padrão para o cálculo da carga viral.

[50] A citometria de fluxo foi realizada com células isoladas de baço ou linfonodos axilares e mesentéricos. As células foram incubadas com Mouse Fc Block (BD Biosciences®) por 20 min e então marcadas com anticorpos de superfície anti-CD11c (clone HL3), anti-I-Ad/I-Ed (clone 2G9), anti-CD86 (clone GL1), anti-CD8 (clone 53-6.7), anti-CD4 (clone RM4-5) e anti-CD62L (clone MEL-14) (BD Biosciences®). Para a coloração intracelular, as células foram fixadas com cytofix/cytoperm (BD Biosciences®) e marcadas com anticorpo anti-IL-4. As amostras foram adquiridas num Citômetro de fluxo Gallios (Beckman Coulter®). Os dados foram analisados utilizando o software FlowJo (versão 7.5, Tree Star Inc., MA, EUA).

[51] A análise microbiológica em fezes de camundongos alimentados com dieta rica em fibras ou dieta controle e infectadas com VSR foram realizadas com amostras colhidas em condições estéreis. As mesmas foram armazenadas a -80°C. O DNA bacteriano foi então isolado utilizando o kit QiaAMP DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi amplificado usando primers selecionados para cobrir a região V4 do rRNA 16s bacteriano com a enzima Phusion. Os amplicons foram purificados com um kit de captura de esferas magnéticas (AMPure XP; Agencourt) indexado com índices Nextera XT e normalizado seguindo o protocolo Illumina. O sequenciamento do gene 16s rRNA foi realizado na plataforma Miseq, com kit v2 500 cycle (Ilumina, CA, EUA), que gera leitura final pareada (2 x 250 pb). O pipeline analítico usado incorpora abordagens baseadas em filogenia e alinhamento para maximizar a resolução de dados. Os pares lidos foram analisados com base em códigos de barras moleculares únicos adicionados via PCR durante a geração da biblioteca usando USEARCH v7.0.1090. As etapas de análise subsequentes do pipeline alavancam os pacotes analíticos personalizados desenvolvidos no Alkek Center for Metagenomics e Microbiome Research (CMMR) na Baylor College of Medicine para produzir estatísticas resumidas e medidas de controle de qualidade para caracterizar comunidades microbianas em grandes números de amostras ou grupos de amostras. As sequências de 16S v4 rDNA foram agrupadas em Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs), a um valor de corte de similaridade de 97%, usando o algoritmo UPARSE. As OTUs foram subsequentemente mapeadas para uma versão otimizada do banco de dados SILVA contendo apenas sequências da região v4 do gene 16S rRNA para determinar taxonomias. As abundâncias foram recuperadas mapeando as leituras para UPARSE OTUs. Um script personalizado constrói uma tabela OTU a partir dos arquivos de saída gerados nas duas etapas anteriores para análises posteriores usando um kit de ferramentas de visualização também desenvolvido no CMMR chamado ATIMA (Agile Toolkit for Incisive Microbial Analyzes).

[52] Em relação aos AGCCs, amostras de conteúdo luminal colônico de camundongos foram coletadas e usadas para quantificação de AGCCs. Esta análise foi realizada utilizando um protocolo semelhante ao Fellows et al. As amostras foram pesadas, esmagadas e homogeneizadas em água. Cloreto de sódio, ácido cítrico, ácido clorídrico e butanol foram adicionados às amostras, que foram então agitadas em vórtice e centrifugadas e o sobrenadante foi coletado. Uma curva de calibração com AGCCs (faixa de 0,015 a 0,1 mg/mL) foi utilizada na quantificação. As análises cromatográficas foram realizadas utilizando um espectrômetro de massa com cromatógrafo gasoso (modelo GCMS-QP2010 Ultra; Shimadzu) e uma coluna Stabilwax capilar com sílica fundida (Restec Corporation, EUA) com dimensões de 30m×0,25mm de diâmetro interno (i.d.) com filtro de 0,25μm de espessura de polietilenoglicol. As amostras (1μL) foram injetadas a 250°C usando uma razão de aproximadamente 25:1. Hélio puro high quality (He) foi usado como gás de arraste com uma vazão constante de 1,0 mL/min. As condições de massa foram as seguintes: voltagem de ionização, 70 eV; temperatura da fonte de íons 200°C; modo de varredura total no intervalo de massa 35-500 com velocidade de 0,2 s/scan. O tempo de execução para cada análise foi de 11,95 min.

[53] Para análise de interferon do tipo 1, utilizou-se DNAc de pulmão para realizar a expressão relativa de IFN-α e IFN-β utilizando iniciadores e sondas para TaqMan (Mm03030145_gH Ifna1, Mm00439552_s1 Ifnb1 Thermo Fisher Scientific) e β-Actina de camundongo (Mm02619580_g1 Actb) como controlo endógeno. A expressão de genes responsivos do IFN (ISGs) foi acessada utilizando iniciadores para Oas1, Isg15 e B2M. As condições de PCR foram recomendadas pelo protocolo GoTaq ™ Probe qPCR Master Mix (Promega ™, Madison, WI, EUA) ou Master Mix SYBR Green/ROX qPCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A quantificação da expressão gênica foi realizada utilizando StepOneTM (Applied Biosystems). A análise de ΔΔCt ou 2-ΔCt foi usada para calcular a alteração de dobra. Os níveis de proteínas IFN-α e IFN-β foram quantificados no sobrenadante de BAL usando um kit de ensaio IFN-a/IFN-β 2-Plex Mouse ProcartaPlex (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante e lidos no Instrumento de Multiplexagem MAGPIX b350 (Merck Millipore, Billerica, MA).

[54] Para o tratamento in vitro, células Vero, MRC-5, and A549, and A549 Ifnar1 -/- foram pré-tratadas com acetato de sódio, propionato de sódio e butirato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em diferentes concentrações (60μM, 120μM, 200μM e 260μM) por 6, 12 e 24h em DMEM contendo 10% de FBS e então as células foram infectadas com 104 PFU/mL de VSR em meio fresco. Alternativamente, as células foram tratadas com AGCCs 2h após infecção. Após 96 horas, a viabilidade celular foi analisada utilizando o ensaio MTT ou a coloração com iodeto de propídio, utilizando citometria de fluxo. A carga viral foi quantificada por PCR em tempo real e por ensaio de placa viral. O ensaio de placa viral foi conduzido com células A549 e MRC-5, cultivadas em placa de 6 poços, pré-tratadas com acetato a 260μM por 24h e infectadas com 104 PFU/mL de VSR por 96h. As células foram coletadas e submetidas ao congelamento-descongelamento e inoculadas em monocamadas de células Vero. As unidades formadoras de placas virais (PFU) foram identificadas usando um anticorpo anti-VSR (Millipore, Billerica, MA, EUA) após 4 dias.

[55] As análises estatísticas de todos os experimentos in vitro foram realizadas em triplicata. Experimentos in vivo foram realizados pelo menos 2 vezes (n = 3-5 camundongos/grupo/experimento). Para dados paramétricos, análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida de pós-teste de Bonferroni foi aplicada para determinar a significância estatística entre os vários grupos experimentais e o teste t de Student foi aplicado para comparar dois grupos experimentais usando o software GraphPad Prism (San Diego, CA, EUA). EUA). Os valores apresentados nos gráficos representam média ± erro padrão da média (SEM) e um nível de significância de p <0,05 foi considerado significativo.

[56] Os resultados preliminares obtidos, conforme exemplo de realização preferencial a seguir, demonstram um papel antiviral para estes compostos imunomoduladores. Estes dados indicam que o acetato de sódio de derivados de microbiota, através da ativação do receptor Gpr43, aumenta a produção de interferon-β (IFN-β) por células epiteliais, proporcionando assim um tratamento efetivo contra a infecção por VSR.

[57] Também demonstrou-se que os mecanismos de ação envolvidos são dependentes de 2 vias, uma delas relacionada aos receptores GPR43, GPR41, GPR109a, Olfr78 e IFNAR e/ou seus agonistas sintéticos, e a segunda relacionada à inibição de histona desacetilacetilase (HDAC) e/ou ativação de histonas acetil transferase (HAT). Tais mecanismos ocorrem em paralelo, simultaneamente ou não, por modificações epigenéticas tais como metilação de histonas e controle da transcrição gênica, com consequente resposta antiviral e anti-inflamatória. Estas sinalizações são mediadas por meio de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN- β) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS. A consequência da ativação destas vias resulta em evidente redução de carga viral.

[58] Desta forma, a presente invenção propõe compostos imunomoduladores e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos imunomoduladores são ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), agonistas de receptores de AGCCs e/ou de interferon beta (INF-β), moduladores de histona desacetilase (HDAC), moduladores de histona acetil transferase (HAT) ou seus sais, sendo preferencialmente escolhidos dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e CTPB.

[59] Os compostos imunomoduladores da presente invenção atuam como como ativadores de receptores de AGCCs ou de INF-β (GPR43, GPR41, GPR109a, Olfr78 e/ou IFNAR), inibidores de HDAC (HDAC 1 e/ou 3) e/ou ativadores de HAT, desencadeando resposta anti-viral e anti-inflamatória, por sinalizações pelo fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-β) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS, com consequente redução de carga viral.

[60] A presente invenção propõe ainda uma composição farmacêutica compreendendo tais compostos imunomoduladores, utilizados isoladamente ou em combinação, preferencialmente isolados, e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[61] A presente invenção propõe também a utilização dos compostos imunomoduladores no preparo de um medicamento para tratamento de doenças virais, especialmente as respiratórias, tais como bronquiolite, pneumonia, exacerbação da asma, infecções das vias áreas superiores (IVAS), otite média aguda viral e/ou rinossinusite, causadas por infecções e/ou co-infecções compreendendo pneumovírus, rinovírus, parainfluenza vírus, metapneumovírus, coronavírus, adenovírus, influenza vírus e/ou enterovírus, especialmente pelo Pneumovirus, mais especificamente pelo Vírus Sincicial Respiratório (VSR).

[62] Por fim, a presente invenção proporciona um método de tratamento de infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, compreendendo a seleção e a administração de uma quantidade suficiente dos compostos imunomoduladores acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e/ou CTPB, ou a mistura deles, desencadeando resposta anti-viral e anti-inflamatória, por meio de sinalizações de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-beta) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS e consequente redução de carga viral em pelo menos 80%. Tal método de tratamento compreende tais compostos imunomoduladores sendo eles agonistas de receptores de AGCCs, agonistas de receptores de INF-β, moduladores de HDAC e HAT.

Exemplo de Realização Preferencial Via dos receptores de AGCCs, de IFN-β e seus agonistas

[63] As concentrações dos AGCCs utilizadas in vitro foram determinadas de forma que não resultasse em citotoxicidade e, ainda assim, permanecendo seu efeito protetor contra o vírus, estabelecendo-se uma faixa de concentração de 30 a 260 μΜ. Optou-se pela concentração mais alta por oferecer maior proteção. As concentrações de AGCCs utilizadas in vivo foram determinadas através de artigos previamente publicados que utilizavam o mesmo tratamento na água de beber na concentração de 200 mM.

[64] Os dados pré-clínicos demonstram que o tratamento dose-dependente com os AGCCs propionato, butirato e acetato (in vitro 260 uM) em células epiteliais de pulmão protege a cultura contra a morte celular causada pelo pneumovírus VSR cepa A2 (Figura 1A) e diminui a carga viral em pelo menos 80% ou aproximadamente 5 vezes em relação ao controle não tratado (Figura 1B). Além disso, o acetato e o propionato induzem também a produção de IFN-β (Figura 1C). Estes dados demonstram que apesar dos três AGCCs (propionato, butirato e acetato) protegerem contra a infecção, os mesmos possuem mecanismos de ação distintos, uma vez que o butirato não induz a produção de IFN- β, comparado com o propionato e o acetato. Os Interferons do tipo 1 (α e β) são citocinas que constituem a primeira linha de defesa contra as infecções virais e o aumento dessas citocinas é responsável pelo fenômeno de proteção dos AGCCs frente à infecção pelo VSR. Já foi previamente demonstrado que o VSR inibe a produção de interferons do tipo 1 principalmente através das proteínas NS1 e NS2 (Hall CB. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. The New England journal of medicine. 2001 ;344(25):1917-28).

[65] Realizando tratamento após a infecção viral da cultura, na mesma linhagem de células epiteliais de pulmão humanas A549, também demonstrou-se o efeito de proteção da morte celular mediada pelo VSR como demonstrado na Figura 2.

[66] Testou-se também se o tratamento com os AGCCs propionato, butirato e acetato protegeria contra a infecção in vivo de forma similar aos resultados obtidos in vitro. O tratamento em camundongos Balb/c com os AGCCs em água de beber (200 mM) protegeu contra a infecção por VSR, reduzindo significativamente a carga viral e a perda de peso dos animais infectados (Figura 3), demonstrando que o uso dos AGCCs tem potencial como uma nova abordagem terapêutica para tratamento contra o VSR.

[67] Demonstrou-se também a produção de IFN-β no homogenato do pulmão dos animais que foram tratados com acetato e infectados com VSR por 5 dias e foi demonstrado que o acetato induz produção de IFN-β (Figura 4).

[68] Dentre os AGCCs, investigou-se primeiramente o mecanismo de ação do acetato e demonstrou-se que é dependente de seu receptor (GPR43) e do receptor de interferon do tipo I - IFNAR (Figura 5). Os outros AGCCs estão tendo seus mecanismos de ação confirmados em relação aos receptores e/ou moléculas solúveis GPR43, GPR41, GPR109a, interferon do tipo I (IFNAR) e/ou seus agonistas sintéticos, e à inibição de HDAC (histona desacetilase).

[69] Quando testou-se o pré-tratamento com o agonista sintético de GPR43 (4-CMTB), assim como o acetato, verificou-se que essa molécula também foi capaz de proteger contra a morte celular causada pelo vírus, bem como redução da RNA viral nas células (Figura 6, A-C). Mostrando que a ativação específica do GPR43 está envolvida no mecanismo de proteção. Além disso, quando inibimos a ativação de NF-kB p65 no momento anterior ao tratamento, o efeito protetor desaparece (Figura 6, D).

Via de inibição de HDAC e ativação de HAT

[70] Ao se investigar a via de inibição de HDAC - um dos principais mecanismos utilizados pelos AGCCs - percebeu-se que o pré-tratamento com compostos inibidores de HDACs, como MS 275 (iHDACs 1 e 3), PCI-34051 (iHDACs 8), RGFP966 (iHDAC 3) e CI994 (iHDACs 1, 2 e 3), além de butirato (260 uM) protegem contra a citotoxicidade causada pelo VSR (Figura 7). Esse dado demonstra que a inibição de HDAC 1 e 3 está envolvida no mecanismo de proteção contra o VSR.

[71] Uma vez que Histonas acetil transferases (HAT) e Histonas desacetilases (HDAC) são conhecidas por modular processos fisiológicos como transcrição genica, ciclo celular, silenciamento gênico, diferenciação, replicação do DNA e a atividade de HAT é contraria à HDAC, é esperado que o efeito dos ácidos graxos interfira diretamente na ação destas duas enzimas, ou seja, inibição de HDACs e ativação de HATs.

Claims (15)

1. Compostos imunomoduladores, caracterizados por serem escolhidos do grupo dentre ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), agonistas de receptores de AGCCs e/ou de interferon beta (INF-β), moduladores de histona desacetilase (HDAC), moduladores de histona acetil transferase (HAT) e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
2. Compostos imunomoduladores, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelos AGCCs, agonistas de receptores de AGCCs ou INF-β, moduladores de HDAC e/ou moduladores de HAT serem selecionados dentre acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e/ou CTPB.
3. Compostos imunomoduladores, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizados por atuarem como agonistas de receptores de AGCCs, agonistas de receptores de INF-β, inibidores de HDAC e/ou ativadores de HAT.
4. Compostos imunomoduladores, de acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelos receptores serem GPR43, GPR41, GPR109a, Olfr78 e/ou IFNAR e as HDAC serem HDAC 1 e/ou 3.
5. Compostos imunomoduladores, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizados por desencadearem resposta anti-viral e anti-inflamatória, por meio de sinalizações de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-beta) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS e redução de carga viral.
6. Composição farmacêutica, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender compostos imunomoduladores selecionados dentre AGCCs, agonistas de receptores de AGCCs e/ou de INF-β, moduladores de HDAC, moduladores de HAT e/ou seus sais, ou a mistura destes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051 TTK21, CTPB e/ou seus sais e veículos farmaceuticamente aceitáveis.
8. Uso de compostos imunomoduladores, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por serem utilizados na preparação de um medicamento para tratamento de doenças virais.
9. Uso de compostos imunomoduladores, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por serem utilizados na preparação de um medicamento para tratamento de doenças virais respiratórias.
10. Uso de compostos imunomoduladores, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por serem utilizados na preparação de um medicamento para tratamento de bronquiolite, pneumonia, exacerbação da asma, infecções das vias áreas superiores (IVAS), otite média aguda viral e/ou rinossinusite.
11. Uso de compostos imunomoduladores, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por serem utilizados na preparação de um medicamento para tratamento de infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, dentre pneumovírus, rinovírus, parainfluenza vírus, metapneumovírus, coronavírus, adenovírus, influenza vírus e/ou enterovírus.
12. Uso de compostos imunomoduladores, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratamento de infecções pelo Pneumovirus, mais especificamente pelo Vírus Sincicial Respiratório (VSR).
13. Método de tratamento de infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender a seleção e a administração dos compostos imunomoduladores acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e/ou CTPB, ou a mistura destes, onde os compostos imunomoduladores desencadeiam resposta anti-viral e anti-inflamatória, por meio de sinalizações de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-beta) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS e redução de carga viral.
14. Método de tratamento de infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender a seleção e a administração de uma quantidade de compostos imunomoduladores acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e/ou CTPB, ou a mistura destes, suficiente para desencadear a resposta anti-viral e anti-inflamatória, por meio de sinalizações de fator nuclear de transcrição kappa beta (NFkb), produção de interferon beta (IFN-beta) e consequente ativação de genes responsivos do IFN (ISGs) como ISG15, OAS, RIG-1 e MAVS e redução de carga viral em pelo menos 80%.
15. Método de tratamento de infecções e/ou co-infecções de dois ou mais vírus, de acordo com quaisquer uma das reivindicações 13 e 14, caracterizado pelo fato de compreender a seleção e a administração dos compostos imunomoduladores acetato, propionato, butirato, isobutirato, valerato, isovalerato, caproato, valproato, tributirina, 4CMTB, AR420626, MS275, CI994, RGFP966, PCI-34051, TTK21 e/ou CTPB, ou a mistura destes, onde os compostos imunomoduladores são agonistas de receptores de AGCCs, agonistas de receptores de INF-β, moduladores de HDAC e HAT.

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