BR102019010866A2 - A HUMANIZED ANTI-IFN-ALPHA2B ANTIBODY - Google Patents
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Abstract
um anticorpo humanizado anti-ifn-alfa2b. a presente invenção refere-se, em geral, à caracterização, síntese ou obtenção de anticorpos neutralizantes anti ifn alfa, seu uso para tratamento de doenças autoimunes como o lúpus eritematoso sistêmico (les) e algumas manifestações da doença relacionada à igg4 (er igg4) como pancreatite autoimune tipo i (pai), sialoadenite e fibrose retroperitoneal.a humanized anti-ifn-alfa2b antibody. The present invention relates, in general, to the characterization, synthesis or obtaining of anti ifn alpha neutralizing antibodies, their use for the treatment of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (les) and some manifestations of the disease related to igg4 (er igg4) such as autoimmune pancreatitis type I (parent), sialoadenitis and retroperitoneal fibrosis.
Description
[001] A presente invenção refere-se, em geral, à caracterização, síntese ou obtenção de anticorpos neutralizantes anti-IFN-alfa, seu uso para tratamento de doenças autoimunes como o lúpus eritematoso sistêmico (LES) e algumas manifestações da doença relacionada à IgG4 (ER-IgG4) como pancreatite autoimune tipo I (PAI), sialoadenite e fibrose retroperitoneal.[001] The present invention refers, in general, to the characterization, synthesis or obtaining of anti-IFN-alpha neutralizing antibodies, their use for the treatment of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) and some manifestations of the disease related to IgG4 (ER-IgG4) as type I autoimmune pancreatitis (AIP), sialoadenitis and retroperitoneal fibrosis.
[002] O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença inflamatória autoimune que afeta múltiplos tecidos, caracterizando-se por uma alta variabilidade de manifestações clínicas. Tradicionalmente, o tratamento dessa doença tem se baseado no emprego de hidroxicloroquina, corticosteróides e imunossupressores (Eildirim-Toruner, C.; Diamond, B. J. Allerge Clin. Immunol., 127(2):303-314, 2011). A liberação excessiva do IFN-alfa (citocina importante do sistema imunológico inato por sua atividade antiviral, imunomoduladora e antiproliferativa) pelo próprio organismo em pacientes com LES influencia o desenvolvimento e a progressão dessa patologia, e incide nas manifestações clínicas da doença (KONTSEK, P. Acta Virol., 38(6):345-360, 1994; BEKISZ, J. et al. Growth Fators. , 22(4):243-251, 2004). Existem várias linhas de pesquisa que relacionam o IFN-alfa como um potencial agente causador dessa doença autoimune, inclusive já se relatou que altos níveis de IFN-alfa no soro constituem um fator de risco hereditário para contrair LES. Por essa razão, o tratamento com anticorpos recombinantes anti-IFN-alfa surgiu como estratégia frente a essa patologia.[002] Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is an autoimmune inflammatory disease that affects multiple tissues, characterized by a high variability of clinical manifestations. Traditionally, the treatment of this disease has been based on the use of hydroxychloroquine, corticosteroids and immunosuppressants (Eildirim-Toruner, C.; Diamond, B. J. Allerge Clin. Immunol., 127(2):303-314, 2011). Excessive release of IFN-alpha (an important cytokine of the innate immune system due to its antiviral, immunomodulatory and antiproliferative activity) by the body itself in patients with SLE influences the development and progression of this pathology, and affects the clinical manifestations of the disease (KONTSEK, P. Acta Virol., 38(6):345-360, 1994; BEKISZ, J. et al. Growth Factors., 22(4):243-251, 2004 ). There are several lines of research that link IFN-alpha as a potential causative agent of this autoimmune disease, and high levels of IFN-alpha in serum have already been reported as a hereditary risk factor for contracting SLE. For this reason, treatment with recombinant anti-IFN-alpha antibodies emerged as a strategy against this pathology.
[003] Em março de 2011, a FDA aprovou o primeiro fármaco para tratar o LES. O Belimumab é um anticorpo monoclonal (mAb) IgG1 humano cujo alvo molecular é a proteína BLyS, fator que estimula a produção de linfócitos B (STOHL, W. Expert Rev Clin Immunol. 0(0):1-11, 2017). Ainda que há alguns anos, o IFN-alfa seja considerado um dos alvos mais promissores no tratamento do LES (NIEWOLD, T. B. et al. J. Biomed. Biotechnol., 2010:1-8, 2010; EAN, B. et al. Arthritis Rheum. 58(3):801-812, 2008; LICHTMAN, E. I. et al. Clin. Immunol., 143(3):210-221, 2012), nos últimos tempos foram iniciados ensaios clínicos de mAbs contra o IFN-alfa ou seu receptor (IFNAR), e inclusive foi promovido o desenvolvimento de imunoterapia ativa para induzir uma resposta anti-IFN-alfa pelo hospedeiro (KIROU, K.A. et al. Clin. Immunol., 148(3):303-312, 2013; DING, H.J. et al. Curr. Opin. Pharmacol., 13(3):405-412, 2013; ZAGURE, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 106(13):5294-5299, 2009).[003] In March 2011, the FDA approved the first drug to treat SLE. Belimumab is a human IgG1 monoclonal antibody (mAb) whose molecular target is the BLyS protein, a factor that stimulates the production of B lymphocytes (STOHL, W. Expert Rev Clin Immunol. 0(0):1-11, 2017). Although for some years now, IFN-alpha has been considered one of the most promising targets in the treatment of SLE (NIEWOLD, TB et al. J. Biomed. Biotechnol., 2010:1-8, 2010; EAN, B. et al. Arthritis Rheum. 58(3):801-812, 2008; LICHTMAN, EI et al. Clin. Immunol., 143(3):210-221, 2012), in recent times, clinical trials of mAbs against IFN- alpha or its receptor (IFNAR), and the development of active immunotherapy to induce an anti-IFN-alpha response by the host has even been promoted (KIROU, KA et al. Clin. Immunol., 148(3):303-312, 2013 DING, HJ et al. Curr. Opin. Pharmacol., 13(3):405-412, 2013; ZAGURE, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(13):5294-5299 , 2009).
[004] Outros anticorpos anti-IFN-alfa IgG1 desenvolvidos com fins terapêuticos são: Rontalizumab e Sifalimumab. O primeiro é um mAb humanizado contra todos os subtipos de IFN-alfa. Apresenta uma constante de dissociação de 0,018 nM para o IFN-alfa2 (MAURER, B. et al. Protein. Sci., 24(9):1440-1450, 2015). O Sifalimumab é um mAb humano contra o hIFN-alfa2a, que apresenta afinidade por todos os subtipos de IFN-alfa e cuja constante de dissociação para o IFN-alfa2b é de 0,12 nM (DU, P. et al. Mabs., 7(5):969-980, 2015). Em ambos os casos, os resultados da fase clínica I demonstraram a segurança e tolerância dessas drogas em pacientes LES moderado (MCBRIDE, J. M. et al. Arthritis Rheum. 64(11):3666-3676, 2012; MERRILL, J. T. et al. Ann. Rheum. Dis., 70(11):1905-1913, 2011). Foi observada uma diminuição dose-dependente na inibição dos níveis de expressão dos genes de resposta à IFN. Na fase clínica II, foram obtidos resultados aceitáveis quanto à segurança e tolerância dessas drogas, contudo não foram observados efeitos clínicos comparados aos pacientes que receberam placebo (KALUNIAN, K.C. et al. Na.n Rheum. Dis. 75(1):196- 202, 2016; KHAMASHTA, M. et al. Ann. Rheum. Dis. 75(11):1909-1916, 2016). Também pode-se mencionar o desenvolvimento de um mAb humanizado IgG4, ASG-009. A fase clínica I foi realizada em pacientes com LES de leve a moderado. A droga foi tolerada e foi observada uma significativa neutralização, em forma dose-dependente, determinada por qPCR de 27 genes de resposta à IFN (KIROU, K.A. et al. Clin. Immunol. 148(3):303-312, 2013).[004] Other anti-IFN-alpha IgG1 antibodies developed for therapeutic purposes are: Rontalizumab and Sifalimumab. The first is a humanized mAb against all IFN-alpha subtypes. It has a dissociation constant of 0.018 nM for IFN-alpha2 (MAURER, B. et al. Protein. Sci., 24(9):1440-1450, 2015 ). Sifalimumab is a human mAb against hIFN-alpha2a, which has affinity for all IFN-alpha subtypes and whose dissociation constant for IFN-alpha2b is 0.12 nM (DU, P. et al. Mabs., 7(5):969-980, 2015). In both cases, the clinical phase I results demonstrated the safety and tolerance of these drugs in moderate SLE patients (MCBRIDE, JM et al. Arthritis Rheum. 64(11):3666-3676, 2012; MERRILL, JT et al. Ann Rheum. Dis., 70(11):1905-1913, 2011 ). A dose-dependent decrease in inhibition of expression levels of IFN-response genes was observed. In clinical phase II, acceptable results were obtained regarding the safety and tolerance of these drugs, however, no clinical effects were observed compared to patients who received placebo (KALUNIAN, KC et al. Na.n Rheum. Dis. 75(1):196- 202, 2016; KHAMASHTA, M. et al. Ann. Rheum. Dis. 75(11):1909-1916, 2016 ). One can also mention the development of a humanized IgG4 mAb, ASG-009. Clinical phase I was performed in patients with mild to moderate SLE. The drug was tolerated and a significant dose-dependent neutralization was observed, determined by qPCR of 27 IFN-response genes ( KIROU, K.A. et al. Clin. Immunol. 148(3):303-312, 2013 ).
[005] Por outro lado, a doença relacionada à IgG4 (ER-IgG4) é uma desordem fibroinflamatória crônica que afeta múltiplos órgãos, e se caracteriza por apresentar elevados níveis séricos de IgG4 e infiltração de células plasmáticas que expressam essa imunoglobulina nos órgãos afetados. Doenças como pancreatite autoimune tipo I (PAI), sialoadenite e fibrose retroperitoneal, são consideradas manifestações específicas em órgãos da ER-IgG4 (WATANABE, T. et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 401:115-128, 2016). Um estudo recente em pacientes com PAI, propõe que a ativação das células dendríticas plasmocitoides (pDCs), as quais formam parte da resposta inata, e da conseguinte liberação de IFN-alfa, são características da resposta imune patogênica associada a essa manifestação específica no órgão. Até o momento não foram propostos anticorpos recombinantes como tratamento anti-IFN-alfa para ER-IgG4.[005] On the other hand, IgG4-related disease (ER-IgG4) is a chronic fibroinflammatory disorder that affects multiple organs, and is characterized by high serum levels of IgG4 and infiltration of plasma cells that express this immunoglobulin in Organs affected organs. Diseases such as autoimmune pancreatitis type I (AIP), sialoadenitis and retroperitoneal fibrosis are considered organ-specific manifestations of ER-IgG4 (WATANABE, T. et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 401:115-128, 2016) . A recent study in patients with AIP proposes that the activation of plasmacytoid dendritic cells (pDCs), which form part of the innate response, and the consequent release of IFN-alpha, are characteristics of the pathogenic immune response associated with this specific manifestation in the organ. . So far, no recombinant antibodies have been proposed as an anti-IFN-alpha treatment for ER-IgG4.
[006] O estado da técnica descreve uma grande variedade de anticorpos monoclonais anti-IFN-alfa, sendo esses anticorpos de diferentes origens, humana, murina e outras. Tais construções de anticorpos compreendendo sequências de origem humana e sequências de origem murina conjuntas são conhecidas como anticorpos humanizados.[006] The state of the art describes a wide variety of anti-IFN-alpha monoclonal antibodies, these antibodies being of different origins, human, murine and others. Such antibody constructs comprising sequences of human origin and sequences of murine origin together are known as humanized antibodies.
[007] O documento MXPA03007529(A)descreve anticorpos anti-IFN em que se pode observar que a molécula compreende uma porção de origem humana e porções de origem murina. O documento MX2010012052(A) descreve anticorpos anti-IFN-I humanizados em que as porções murinas provêm das variantes ACO-1 e ACO-2.[007] MXPA03007529(A) describes anti-IFN antibodies wherein the molecule can be seen to comprise a portion of human origin and portions of murine origin. MX2010012052(A) describes humanized anti-IFN-I antibodies in which the murine portions are from the ACO-1 and ACO-2 variants.
[008] De outro lado, o estado da técnica mostra outras variantes de anticorpos monoclonais que se unem a diferentes variantes ou subtipos de interferons como os descritos nos documentos WO2008021976 (A2), WO2015001013 (A2), ES2399050 (T3), MX2007009466 (A).[008] On the other hand, the state of the art shows other variants of monoclonal antibodies that bind to different variants or subtypes of interferons such as those described in documents WO2008021976 (A2), WO2015001013 (A2), ES2399050 (T3), MX2007009466 (A ).
[009] A presente invenção descreve um anticorpo anti-IFN-alfa, preferencialmente anti-IFN-alfa2b, cujas cadeias leves e pesadas compreendem regiões determinantes da complementariedade (CDRs) que neutralizam esse interferon e concedem uma estabilidade adequada e capacidade de unir ao ligante.[009] The present invention describes an anti-IFN-alpha antibody, preferably anti-IFN-alpha2b, whose light and heavy chains comprise complementarity determining regions (CDRs) that neutralize this interferon and grant adequate stability and ability to bind to the ligand. .
[010] A invenção poderá ser mais bem compreendida com base nas Figuras de 1 a 2, cuja descrição segue abaixo:[010] The invention can be better understood based on Figures 1 to 2, whose description follows below:
[011] A Figura 1 exibe gel de SDS-PAGE do anticorpo humanizado produzido pelos diferentes clones celulares comparando as condições redutoras e não redutoras com a dimerização do anticorpo.[011] Figure 1 shows SDS-PAGE gel of the humanized antibody produced by the different cell clones comparing reducing and non-reducing conditions with antibody dimerization.
[012] A Figura 2 mostra a estabilidadeda molécula da presente invenção em função do pH comparando com outros anticorpos.[012] Figure 2 shows the stability of the molecule of the present invention as a function of pH compared to other antibodies.
[013] A presente invenção descreve um anticorpo humanizado anti-rhIFN-alfa2b que compreende ao menos uma cadeia leve e ao menos uma cadeia pesada, em que as regiões determinantes da complementariedade (CDRs) dessas cadeias leves e pesadas compreendem as seguintes sequências :
- a. Uma sequência CDR1 VL representada por SEQ ID NO: 16;
- b. Uma sequência CDR2 VL representada por SEQ ID NO: 17;
- c. Uma sequência CDR3 VL representada por SEQ ID NO: 18;
- d. Uma sequência CDR1 VH representada por SEQ ID NO: 19;
- e. Uma sequência CDR2 VH representada por SEQ ID NO: 20;
- f. Uma sequência CDR3 VH representada por SEQ ID NO: 21.
- The. A CDR1 VL sequence represented by SEQ ID NO: 16;
- B. A CDR2 VL sequence represented by SEQ ID NO: 17;
- ç. A CDR3 VL sequence represented by SEQ ID NO: 18;
- d. A CDR1 VH sequence represented by SEQ ID NO: 19;
- and. A CDR2 VH sequence represented by SEQ ID NO: 20;
- f. A CDR3 VH sequence represented by SEQ ID NO: 21.
[014] Esse anticorpo humanizado é selecionado do conjunto compreendido por: anticorpo completo, um fragmento Fab, um fragmento F(ab´)2, um fragmento F(ab´), scFv, bivalente (minibody), parte de um Ac biespecífico (diabody), trivalente (triabody), tetravalente (tetrabody). De forma preferencial, esse anticorpo humanizado compreende um fragmento de anticorpo do tipo scFv.[014] This humanized antibody is selected from the set comprising: complete antibody, a Fab fragment, an F(ab')2 fragment, an F(ab') fragment, scFv, bivalent (minibody), part of a bispecific Ab ( diabody), trivalent (triabody), tetravalent (tetrabody). Preferably, such a humanized antibody comprises an scFv-like antibody fragment.
[015] Além disso, as cadeias do anticorpo da presente invenção estão unidas por uma sequência linker. Em que essa sequência linker é representada pela SEQ ID NO: 22.[015] Furthermore, the antibody chains of the present invention are joined by a linker sequence. Wherein this linker sequence is represented by SEQ ID NO: 22.
[016] Em uma forma alternativa de realização da presente invenção, esse anticorpo humanizado compreende um fragmento Fc da IgG1 humana representado pela SEQ ID NO: 4, em que esse fragmento Fc compreende os domínios CH2 e CH3 da IgG1 humana.[016] In an alternative embodiment of the present invention, such a humanized antibody comprises an Fc fragment of human IgG1 represented by SEQ ID NO: 4, wherein that Fc fragment comprises the CH2 and CH3 domains of human IgG1.
[017] Em uma forma preferencial de realização da presente invenção, o domínio variável de cadeia leve é representado pela SEQ ID NO: 1.[017] In a preferred embodiment of the present invention, the light chain variable domain is represented by SEQ ID NO: 1.
[018] Em uma forma preferencial de realização da presente invenção, o domínio variável de cadeia pesada é representado pela SEQ ID NO: 2.[018] In a preferred embodiment of the present invention, the heavy chain variable domain is represented by SEQ ID NO: 2.
[019] Em uma forma preferencial de realização da presente invenção, o anticorpo humanizado tipo scFv é representado pela SEQ ID NO: 3.[019] In a preferred embodiment of the present invention, the humanized scFv-like antibody is represented by SEQ ID NO: 3.
[020] Em uma forma preferencial de realização da presente invenção, o fragmento Fc é representado pela SEQ ID NO: 4.[020] In a preferred embodiment of the present invention, the Fc fragment is represented by SEQ ID NO: 4.
[021] Em uma forma preferencial de realização da presente invenção, a molécula scFv-Fc é representada pela SEQ ID NO: 5.[021] In a preferred embodiment of the present invention, the scFv-Fc molecule is represented by SEQ ID NO: 5.
[022] O anticorpo humanizado da presente invenção compreende uma constante de dissociação entre 4,6nM e 13,2nM, preferencialmente 9nM.[022] The humanized antibody of the present invention comprises a dissociation constant between 4.6nM and 13.2nM, preferably 9nM.
[023] Igualmente, descreve-se uma sequência de ácido nucleico que codifica para o anticorpo da presente invenção representada pela SEQ ID NO: 9 . Uma sequência de ácido nucleico que codifica para o anticorpo tipo scFv representada pela SEQ ID: 8. Uma sequência de ácido nucleico que codifica para o domínio variável da cadeia leve (VL) e uma sequência de ácido nucleico que codifica para o domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo da presente invenção representadas pelas sequências SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente. Em uma forma preferencial, a sequência de DNA do fragmento scFv compreende a sequência SEQ ID NO: 8. Em uma forma preferencial, a sequência de DNA da molécula scFv-Fc compreende a sequência SEQ ID NO: 9.[023] Likewise, a nucleic acid sequence encoding the antibody of the present invention represented by SEQ ID NO: 9 is described. A nucleic acid sequence encoding the scFv-like antibody represented by SEQ ID: 8. A nucleic acid sequence encoding the light chain variable domain (VL) and a nucleic acid sequence encoding the light chain variable domain heavy (VH) of the antibody of the present invention represented by the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively. In a preferred form, the DNA sequence of the scFv fragment comprises the sequence SEQ ID NO: 8. In a preferred form, the DNA sequence of the scFv-Fc molecule comprises the sequence SEQ ID NO: 9.
[024] De outra parte, a presente invenção descreve linhagens e clones de células de mamífero transformados com as sequências de DNA para a expressão do anticorpo da presente invenção. Tais linhagens e clones de células de mamífero são selecionados do conjunto compreendido por células CHO-K1, HEK293 e NS0.[024] On the other hand, the present invention describes lines and clones of mammalian cells transformed with the DNA sequences for the expression of the antibody of the present invention. Such mammalian cell lines and clones are selected from the pool comprised of CHO-K1, HEK293 and NS0 cells.
[025] Também se descrevem os possíveis usos do anticorpo da presente invenção para o tratamento de lúpus eritematoso sistêmico, doenças relacionadas à IgG4 (ER-IgG4). Em que tal tratamento deve-se realizar através de uma composição farmacêutica terapeuticamente aceitável do anticorpo da presente invenção.[025] The possible uses of the antibody of the present invention for the treatment of systemic lupus erythematosus, diseases related to IgG4 (ER-IgG4) are also described. Wherein such treatment is to be carried out via a therapeutically acceptable pharmaceutical composition of the antibody of the present invention.
[026] Desta forma, a presente invenção descreve um anticorpo humanizado neutralizante anti-interferon alfa humano. O presente anticorpo tem afinidade para o interferon alfa2b tanto humano como sua forma recombinante humana. A presente invenção descreve um anticorpo antiIFN-alfa2b, que compreende ao menos uma cadeia leve VL e uma cadeia pesada VH. Em uma forma preferencial, esse anticorpo humanizado é um fragmento de anticorpo humanizado. Em uma forma ainda mais preferencial, esse fragmento de anticorpo humanizado é selecionado do conjunto compreendido por: anticorpos completos, fragmentos de anticorpos do tipo Fab, F(ab´)2, F(ab´), scFv, bivalente (minibody), parte de um Ac biespecífico (diabody), trivalente (triabody), tetravalente (tetrabody). Preferencialmente, o anticorpo humanizado da presente invenção é do tipo de cadeia única (chamado scFv).[026] Thus, the present invention describes a neutralizing humanized anti-human interferon alpha antibody. The present antibody has affinity for both human interferon alfa2b and its human recombinant form. The present invention describes an anti-IFN-alpha2b antibody, which comprises at least a VL light chain and a VH heavy chain. In a preferred form, such a humanized antibody is a humanized antibody fragment. In an even more preferred form, this humanized antibody fragment is selected from the group comprising: whole antibodies, Fab-type antibody fragments, F(ab')2, F(ab'), scFv, bivalent (minibody), part of a bispecific (diabody), trivalent (triabody), tetravalent (tetrabody) Ac. Preferably, the humanized antibody of the present invention is of the single chain type (called scFv).
[027] Na presente invenção por anticorpo completo entende-se uma molécula conformada por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, unidas por pontes dissulfeto intercadeia (que conectam as cadeias pesadas entre si e as cadeias leves a uma cadeia pesada). No caso de uma IgG, cada cadeia pesada é composta por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3) e um domínio variável (VH). Entre os domínios CH1 e CH2 encontra-se uma região de dobradiça que permite a formação de pontes dissulfeto que conectam ambas as cadeias pesadas entre si. Cada cadeia leve é composta por um domínio constante (CL) e um domínio variável (VL). Os domínios CH1 e CL se conectam também mediante a formação de pontes dissulfeto.[027] In the present invention, a complete antibody is understood to be a molecule formed by two heavy chains and two light chains, joined by interchain disulfide bonds (which connect the heavy chains to each other and the light chains to a heavy chain). In the case of an IgG, each heavy chain is composed of three constant domains (CH1, CH2 and CH3) and a variable domain (VH). Between the CH1 and CH2 domains is a hinge region that allows the formation of disulfide bonds that connect both heavy chains to each other. Each light chain is composed of a constant domain (CL) and a variable domain (VL). The CH1 and CL domains are also connected through the formation of disulfide bonds.
[028] O fragmento Fab se define como molécula composta pelo domínio VH e CH1 da cadeia pesada, e VL e CL da cadeia leve. Ambas as cadeias estão conectadas por uma ponte dissulfeto entre CH1 e CL. Geralmente são obtidos de forma recombinante. Não há região de dobradiça.[028] The Fab fragment is defined as a molecule composed of the VH and CH1 domain of the heavy chain, and VL and CL of the light chain. Both chains are connected by a disulfide bridge between CH1 and CL. They are usually obtained recombinantly. There is no hinge region.
[029] Por fragmento F(ab´) entende-se uma molécula composta pelos mesmos domínios que o fragmento Fab mas possui além disso uma porção da região de dobradiça.[029] By F(ab') fragment is meant a molecule composed of the same domains as the Fab fragment but has in addition a portion of the hinge region.
[030] Por fragmento F(ab´)2 entende-se como uma molécula composta por duas regiões Fab´. Ao incluir a região de dobradiça, se estabelecem pontes dissulfeto entre as cadeias pesadas, permitindo que ambas as regiões permaneçam unidas.[030] F(ab')2 fragment is understood as a molecule composed of two Fab' regions. By including the hinge region, disulfide bonds are established between the heavy chains, allowing both regions to remain together.
[031] Por fragmento scFv (single-chain variable fragment) entende-se uma molécula composta pelos domínios VH e VL unidos entre si por meio de uma região de união (linker), a qual geralmente corresponde à sequência (G4S)3, adquirindo uma conformação 3D que a permite comportar-se como parátopo.[031] By scFv fragment (single-chain variable fragment) is meant a molecule composed of the VH and VL domains joined together through a linker region, which generally corresponds to the sequence (G4S)3, acquiring a 3D conformation that allows it to behave like a paratope.
[032] O Fragmento Fc define-se como uma molécula composta pela região de dobradiça, e os domínios CH2 e CH3.[032] The Fc Fragment is defined as a molecule composed of the hinge region, and the CH2 and CH3 domains.
[033] Os bivalente (minibody), biespecífico (diabody), trivalente (triabody), tetravalente (tetrabody) são moléculas multiméricas resultantes da combinação de fragmentos scFv. Em que um bivalente ou minibody é uma molécula composta por dois scFv(s) unidos entre si por meio dos domínios CH3. Cada VH, nesse caso, está unido ao domínio CH3. Essa união pode corresponder à região de dobradiça denominando-se de bivalente flexível, ou geralmente por meio de um aminoácido Asp (D). Um biespecífico ou diabody é um dímero de scFv(s)com diferentes especificidades que podem estar unidos de forma covalente ou não covalente e tal molécula é biespecífica.[033] The bivalent (minibody), bispecific (diabody), trivalent (triabody), tetravalent (tetrabody) are multimeric molecules resulting from the combination of scFv fragments. Where a bivalent or minibody is a molecule composed of two scFv(s) joined together through the CH3 domains. Each VH, in this case, is joined to the CH3 domain. This union can correspond to the hinge region, being called flexible bivalent, or usually through an Asp (D) amino acid. A bispecific or diabody is a dimer of scFv(s) with different specificities that can be covalently or non-covalently joined and such a molecule is bispecific.
[034] Um trivalente ou triabody é um trímero de scFv(s) unidos geralmente em forma covalente por meio de moléculas de união. Um tetravalente ou tetrabody é um tetrâmero de scFv(s) unidos também geralmente em forma covalente por meio de moléculas de união.[034] A trivalent or triabody is a trimer of scFv(s) joined together generally in covalent form by means of linker molecules. A tetravalent or tetrabody is a tetramer of scFv(s) joined together also generally in covalent form by means of linker molecules.
[035] Em uma forma alternativa de realização da presente invenção, esse fragmento de anticorpo humanizado de cadeia única (scFv) anti-IFN-alfa2b, compreende ainda um fragmento Fc de IgG1. A fusão do fragmento Fc ao anticorpo da presente invenção consegue aumentar sua vida média em circulação. Por um lado, por meio do aumento de tamanho anula-se a rápida filtração glomerular e, por outro lado, por meio da união ao receptor neonatal (FcRn) consegue-se a reciclagem dos anticorpos que tenham formado complexos imunes, devolvendo a eles circulação para continuar com sua função de neutralização do antígeno.[035] In an alternative embodiment of the present invention, that anti-IFN-alpha2b single chain humanized antibody (scFv) fragment further comprises an IgG1 Fc fragment. Fusion of the Fc fragment to the antibody of the present invention succeeds in increasing its circulating half-life. On the one hand, through the increase in size, the rapid glomerular filtration is annulled and, on the other hand, through binding to the neonatal receptor (FcRn) the recycling of antibodies that have formed immune complexes is achieved, returning them to circulation. to continue its function of neutralizing the antigen.
[036] O anticorpo humanizado da presente invenção é composto pelas regiões determinantes da complementariedade (CDRs) murinas de um anticorpo monoclonal, e regiões de frameworks (FRs) ou arcabouços humanas obtidas de sequências homólogas às sequências murinas correspondentes. A sequência do anticorpo humanizado foi primeiro gerada in silico e não se encontra como tal na natureza.[036] The humanized antibody of the present invention is composed of the murine complementarity determining regions (CDRs) of a monoclonal antibody, and human framework regions (FRs) obtained from sequences homologous to the corresponding murine sequences. The humanized antibody sequence was first generated in silico and is not found as such in nature.
[037] Cabe mencionar que os ensaios realizados e os anticorpos obtidos foram realizados com um interferon-alfa2b humano recombinante (rhIFN-alfa2b), no entanto, qualquer especialista na matéria sabe que um anticorpo anti-rhIFN-alfa2b tem afinidade e neutraliza o alelo selvagem do interferon-alfa2b-humano. Dessa maneira, apesar de os ensaios terem sido realizados com rhIFN-alfa2b, a invenção não se limita apenas a esse IFN, mas também possui afinidade e poder de neutralização para uma ampla variedade de IFN-alfa2b humanos, incluído o alelo selvagem.[037] It should be mentioned that the tests carried out and the antibodies obtained were carried out with a recombinant human interferon-alpha2b (rhIFN-alpha2b), however, any expert in the field knows that an anti-rhIFN-alpha2b antibody has affinity and neutralizes the allele wild type of interferon-alpha2b-human. Thus, although the assays were performed with rhIFN-alpha2b, the invention is not limited to this IFN alone, but also has affinity and neutralizing power for a wide variety of human IFN-alpha2b, including the wild-type allele.
[038] Os exemplos abaixo são representados a fim de ilustrar a melhor execução da invenção. Vale destacar que a presente invenção não se limita aos exemplos citados, podendo ser utilizada em todas as aplicações descritas ou em quaisquer outras variações equivalentes.[038] The examples below are represented in order to illustrate the best execution of the invention. It is worth noting that the present invention is not limited to the examples cited, and can be used in all the applications described or in any other equivalent variations.
[039] Como ponto de partida foi empregada a molécula scFv anti-rhIFN-alfa2b murina de sequência representada por sequência SEQ ID NO: 3.[039] As a starting point, the murine anti-rhIFN-alpha2b scFv molecule of sequence represented by sequence SEQ ID NO: 3 was used.
[040] Especificamente, a sequência das CDRs murinas são:
- a. CDR1murino – VH representada por SEQ ID NO: 19
- b. CDR2 murino – VH representada por SEQ ID NO: 20
- c. CDR3 murino - VH representada por SEQ ID NO: 21
- d. CDR1 murino – VL representada por SEQ ID NO: 16
- e. CDR2 murino – VL representada por SEQ ID NO: 17
- f. CDR3 murino – VL representada por SEQ ID NO: 18
- The. Murine CDR1 - VH represented by SEQ ID NO: 19
- B. Murine CDR2 - VH represented by SEQ ID NO: 20
- ç. Murine CDR3 - VH represented by SEQ ID NO: 21
- d. Murine CDR1 - VL represented by SEQ ID NO: 16
- and. Murine CDR2 - VL represented by SEQ ID NO: 17
- f. Murine CDR3 - VL represented by SEQ ID NO: 18
[041] Logo foi realizada uma busca de sequências humanas de linhagem germinativa na base de dados IGBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi), empregando-se as sequências correspondentes da cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) murinas.[041] A search for human germline sequences was then performed in the IGBLAST database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi), using the corresponding sequences of the heavy chain (VH) and murine light chain (VL).
[042] Em primeiro lugar foi realizado o procedimento para VH. Foi escolhida a sequência humana de linhagem germinativa mais próxima à sequência VH murina. Onde a VH murina é representada por SEQ ID NO: 23, a VH humana IGHV1-46 é representada por SEQ ID NO: 24 com a CDR1 VH humana representada por SEQ ID NO: 25 e a CDR2 VH humana representada por SEQ ID NO: 26.[042] First, the procedure for HV was performed. The human germline sequence closest to the murine VH sequence was chosen. Where the murine VH is represented by SEQ ID NO: 23, the human VH IGHV1-46 is represented by SEQ ID NO: 24 with the human VH CDR1 represented by SEQ ID NO: 25 and the human VH CDR2 represented by SEQ ID NO: 26.
[043] Posteriormente substituíram-se as CDRs humanas pelas CDRs murinas, obtendo-se a cadeia pesada humanizada representada por SEQ ID NO: 2 (VH humanizada).[043] Subsequently, the human CDRs were replaced by the murine CDRs, obtaining the humanized heavy chain represented by SEQ ID NO: 2 (humanized VH).
[044] Como foi realizada a busca de sequências de linhagem germinativa, não se obteve a região correspondente à FR4, portanto adicionou-se uma região correspondente, a qual possui a sequência: WGQGTTVTVSSR.[044] As the search for germline sequences was performed, the region corresponding to FR4 was not obtained, so a corresponding region was added, which has the sequence: WGQGTTVTVSSR.
[045] O mesmo procedimento foi realizado para a sequência VL, onde a VL murina é representada por SEQ ID NO: 27, a VL humana IGKV1D-13 é representada por SEQ ID NO: 28 com a CDR1 VL humano representada por SEQ ID NO: 29, a CDR2 VL humano representada por SEQ ID NO: 30 e a CDR3 VL humano é representada por SEQ ID NO: 31.[045] The same procedure was performed for the VL sequence, where the murine VL is represented by SEQ ID NO: 27, the human VL IGKV1D-13 is represented by SEQ ID NO: 28 with the CDR1 human VL represented by SEQ ID NO : 29 , the human VL CDR2 is represented by SEQ ID NO: 30 and the human VL CDR3 is represented by SEQ ID NO: 31.
[046] Posteriormente substituíram-se as CDRs humanas pelas CDRs murinas, obtendo-se a cadeia leve humanizada representada por SEQ ID NO: 1 (VL humanizada).[046] Subsequently, the human CDRs were replaced by the murine CDRs, obtaining the humanized light chain represented by SEQ ID NO: 1 (humanized VL).
[047] Da mesma maneira que para a VH, optou-se por incorporar uma região correspondente para a FR4 de VL pelo fato de que a busca foi realizada entre sequências de linhagem germinativa. Essa região correspondente compreende sequência representada por SEQ ID NO: 32.[047] In the same way as for the VH, it was decided to incorporate a corresponding region for the FR4 of the VL due to the fact that the search was performed among germline sequences. That corresponding region comprises sequence represented by SEQ ID NO: 32.
[048] As sequências VH e VL humanizadas foram empregadas para gerar a sequência do scFv (SEQ ID NO: 3) por meio da fusão das mesmas com a sequência de peptídeo conector linker representada por SEQ ID NO: 22.[048] Humanized VH and VL sequences were employed to generate the scFv sequence (SEQ ID NO: 3) by fusing them with the linker peptide sequence represented by SEQ ID NO: 22.
[049] Uma vez obtida a molécula scFv anti-rhIFN-alfa2b humanizada, fundiu-se a porção Fc da IgG1 humana por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR). Foi empregado como molde uma molécula gerada previamente no laboratório que possui a região [dobradiça, CH2 e CH3] da IgG1 humana representada por SEQ ID NO: 4 com a sequência de dobradiça representada por SEQ ID NO: 33, a sequência CH2 representada por SEQ ID NO: 34, e a sequência CH3 representada por SEQ ID NO: 35.[049] Once the humanized anti-rhIFN-alpha2b scFv molecule was obtained, the Fc portion of human IgG1 was fused by polymerase chain reaction (PCR). A molecule previously generated in the laboratory was used as a template that has the [hinge, CH2 and CH3] region of human IgG1 represented by SEQ ID NO: 4 with the hinge sequence represented by SEQ ID NO: 33, the sequence CH2 represented by SEQ ID NO: 34, and the CH3 sequence represented by SEQ ID NO: 35.
[050] Ao incorporar uma sequência sinal para que a molécula scFv-Fc seja secretada no meio de cultivo, foi incorporada a sequência codificante para o seguinte peptídeo sinal representado por SEQ ID NO: 36.[050] By incorporating a signal sequence for the scFv-Fc molecule to be secreted into the culture medium, the coding sequence for the following signal peptide represented by SEQ ID NO: 36 was incorporated.
[051] O ponto de clivagem para a protease sinal predito pelo servidor SignalP 4.1(PETERSEN, T.N. et al. Nat Methods.;8:785-786, 2011; http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) é entre os resíduos 23 e 24. Essa predição foi confirmada por meio do sequenciamento dos primeiros aminoácidos da molécula scFv-Fc realizado pelo Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en péptidos y proteínas - Estudios por espectrometría de masas (LANAIS-PROEM). Portanto, a sequência do scFv-Fc é representada por sequência SEQ ID NO: 5.[051] The cleavage point for the signal protease predicted by the SignalP 4.1 server(PETERSEN, TN et al. Nat Methods.;8:785-786, 2011; http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP /) is between residues 23 and 24. This prediction was confirmed through the sequencing of the first amino acids of the scFv-Fc molecule carried out by the Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en peptidos yproteins - Estudios por mass spectrometry (LANAIS-PROEM). Therefore, the scFv-Fc sequence is represented by sequence SEQ ID NO: 5.
[052] A molécula scFv-Fc foi clonada no vetor de expressão para células de mamíferos pLV, entre os sítios de restrição BamH I/Sal I. Foram transfectadas células CHO-K1, HEK293 e NS0 por meio de lipofecção com o emprego de um reagente de transfecção, tal como Lipofectamine® 2000 , em uma proporção 1:1 com respeito ao DNA. Passadas 48 horas da lipofecção, foi iniciada a pressão seletiva das células com concentrações crescentes do antibiótico puromicina a fim de obter linhagens estáveis com alta produtividade do anticorpo. Na Tabela 1 é indicada a produção específica expressa por célula e por dia e a máxima concentração de puromicina empregada para cada linhagem (assinalada entre parêntesis). Uma vez obtidas as mesmas, foi realizada uma clonagem através do método de diluição limitante e foi selecionado um clone produtor de cada tipo celular (Tabela 1).[052] The scFv-Fc molecule was cloned into the expression vector for pLV mammalian cells, between the BamH I/Sal I restriction sites. CHO-K1, HEK293 and NS0 cells were transfected by means of lipofection using a transfection reagent, such as Lipofectamine® 2000, in a 1:1 ratio with respect to DNA. After 48 hours of lipofection, the selective pressure of the cells was started with increasing concentrations of the antibiotic puromycin in order to obtain stable lines with high antibody productivity. Table 1 shows the specific production expressed per cell and per day and the maximum concentration of puromycin used for each strain (marked in parentheses). Once obtained, cloning was performed using the limiting dilution method and a producer clone of each cell type was selected (Table 1).
[053] Para a determinação da produtividade específica, 48 horas prévias à avaliação, as células foram semeadas com uma densidade de 100000 cél.ml-1. Após 24 horas, foi alterado o meio de cultivo das células por meio fresco e, no dia da determinação, foi realizada a recontagem das células.[053] For the determination of the specific productivity, 48 hours prior to the evaluation, the cells were seeded with a density of 100000 cel.ml-1. After 24 hours, the cell culture medium was changed to fresh medium and, on the day of determination, the cells were recounted.
[054] A análise de produtividade foi realizada por meio de um teste imunoenzimático (ELISA) específico indireto empregando como padrão a proteína previamente purificada e quantificada por espectrofotometria a λ=280 nm. Para o ELISA foi sensibilidade uma placa de 96 poços com rhIFN-alfa2b. Então foram realizadas diluições seriadas aos sobrenadantes do meio dos cultivos a avaliar. Posteriormente, foram encubadas as placas com um anticorpo de coelho anti-humano, que foi detectado através de um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado a peroxidase . Por último, as placas foram encubadas com ácido cítrico 50 mM em tampão fosfato (pH 5,3) contendo 3 mg/ml de ofenilenodiamina e 0,12% (v/v) de H2O2 (solução de substrato). Entre as diferentes etapas foram realizadas lavagens com Tampão Fosfato – Polissorbato 0,05% (v/v). A reação foi interrompida com H2SO4 2N. A absorbância foi determinada a λ=492 nm com um leitor de placas. A tabela 1 apresenta a produtividade específica das diferentes linhagens e clones celulares. 
[055] A fim de obter a proteína de interesse, foram amplificados os cultivos celulares correspondentes a cada clone e foi colhido o sobrenadante destes durante aproximadamente 2 semanas. O meio de cultivo empregado para a produção da proteína foi o mesmo meio de crescimento e manutenção (Tabela 2) mas com uma redução do soro fetal bovino (SFB) a 0,5% (v/v) para evitar interferências na purificação. Esta foi realizada por meio de uma cromatografia de afinidade para a proteína A, empregando uma matriz de rProtein A. A pureza dos anticorpos foi avaliada por meio de SDS–PAGE e posterior coloração com o corante azul brilhante de Coomasie (Figura 1). A tabela 2 apresenta os meios de cultivo de crescimento e manutenção empregados para cada tipo celular, onde DMEM indica a abreviação de Dulbecco's modified-Eagle's médium.
[056] Foi avaliada a constante de dissociação (Tabela 3). Para a determinação dessa constante, foi selecionado o procedimento desenvolvido por Friguet et al. (FRIGUET, B. et al. J Immunol Methods., 77(3):305-319, 1985). Este se baseia em um ensaio imunoenzimático para o qual, previamente, se realiza uma pré-incubação do antígeno e seu anticorpo correspondente até que se alcance o equilíbrio de associação-dissociação. Posteriormente, se determina a presença do anticorpo livre por meio de ELISA específico indireto e representados os dados experimentais por meio de gráficos Scatchard (ROSENTHAL H. E., Anal Biochem., 20(3):525-532, 1967) é possível obter a KA a partir do declive da reta obtida por regressão linear dos dados experimentais. Ao calcular a inversa da KA, se obtém a KD.[056] The dissociation constant was evaluated (Table 3). To determine this constant, the procedure developed by Friguet et al. (FRIGUET, B. et al. J Immunol Methods., 77(3):305-319, 1985). This is based on an enzyme immunoassay for which, previously, a pre-incubation of the antigen and its corresponding antibody is carried out until the association-dissociation equilibrium is reached. Subsequently, the presence of free antibody is determined by means of indirect specific ELISA and the experimental data are represented by means of Scatchard graphs (ROSENTHAL HE, Anal Biochem., 20(3):525-532, 1967) it is possible to obtain the KA a from the slope of the line obtained by linear regression of the experimental data. By calculating the inverse of the KA, the KD is obtained.
[057] Pode-se observar na Tabela 3 que a molécula humanizada possui a capacidade de unir-se ao rhIFN-alfa2b. Dependendo da célula que expressa o anticorpo, a afinidade é afetada ou não pelo processo de humanização. A proteína produzida em HEK293 apresenta diferenças significativas com respeito à proteína scFv-Fc original produzida nos três tipos de célula. A tabela 3 apresenta o KD para a molécula scFv-Fc humanizada e original, respectivamente, produzida pelos diferentes clones celulares, onde ** (dois asteriscos) indica a diferença significativa segundo o ANOVA post test ad hoc (p<0,01).
[058] Por outro lado, por meio de um SDS-PAGE em condições redutoras e não-redutoras, foi determinada a capacidade de dimerizar espontaneamente para formar uma molécula funcional (Figura 1).[058] On the other hand, by means of an SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions, the ability to spontaneously dimerize to form a functional molecule was determined (Figure 1).
[059] Por um lado, foram empregadas as células repórteres HeLa-Mx2/EGFP geradas no nosso laboratório (BÜRGI, M. et al. BMC Proc., 5(Suppl 8):P4, 2011; BÜRGI, M. et al. J Biotechnol. 233:6-16, 2016). Essas células codificam o gene da proteína verde fluorescente (EGFP), cuja expressão é regulada por um promotor induzível (Mx2) por IFNs de tipo I. Os ensaios utilizados para avaliar a neutralização da atividade biológica do rhIFN-alfa foram realizados a partir da incubação de diferentes concentrações de anticorpo e a mesma concentração de citocina, e posterior incubação com as células HeLa-Mx2/EGFP.[059] On the one hand, HeLa-Mx2/EGFP reporter cells generated in our laboratory were used (BÜRGI, M. et al. BMC Proc., 5(Suppl 8):P4, 2011; BÜRGI, M. et al. J Biotechnol. 233:6-16, 2016). These cells encode the green fluorescent protein (EGFP) gene, whose expression is regulated by an inducible promoter (Mx2) by type I IFNs. The assays used to evaluate the neutralization of the biological activity of rhIFN-alpha were performed after the incubation of different antibody concentrations and the same cytokine concentration, and subsequent incubation with HeLa-Mx2/EGFP cells.
[060] Ao fim de 24 horas, as células foram separadas por meio do emprego de tripsina e foi avaliada a fluorescência destas por meio de citometria de fluxo. Os valores de fluorescência com respeito à concentração de anticorpo foram diagramados e foi calculada a concentração deste para reduzir 50% da atividade do rhIFN-alfa2b: FL-IC50 (Tabela 4). A tabela 4 apresenta o FL-IC50 para a molécula scFv-Fc produzida pelos diferentes clones celulares, onde * (um asterisco) indica a diferença significativa segundo o ANOVA post test ad hoc (p<0,05). 
[061] A proteína produzida em HEK293 apresenta uma menor capacidade neutralizante da atividade do rhIFNalfa2b em relação à proteína produzida em CHO-K1. A partir dos valores da tabela 4 pode-se evidenciar que o scFv-Fc possui capacidade de neutralizar o rhIFN-alfa2b evitando sua união ao receptor das células HeLa-Mx2/EGFP e o consequente desencadeamento da expressão de EGFP. Dependendo do tipo celular empregado para produzir o scFv-Fc, são necessários entre 18 e 24 nM de anticorpo para neutralizar 50% de rhIFN-alfa empregado no ensaio (50 UI/ml).[061] The protein produced in HEK293 has a lower ability to neutralize the activity of rhIFNalpha2b in relation to the protein produced in CHO-K1. From the values in Table 4, it can be seen that scFv-Fc has the ability to neutralize rhIFN-alpha2b, preventing its binding to the receptor of HeLa-Mx2/EGFP cells and the consequent triggering of EGFP expression. Depending on the cell type used to produce the scFv-Fc, between 18 and 24 nM of antibody are needed to neutralize 50% of rhIFN-alpha used in the assay (50 IU/ml).
[062] Por outro lado, foi avaliada a neutralização da atividade biológica antiviral in vitro dos IFNs por meio de um ensaio desenvolvido previamente em nosso laboratório, com base na quantificação do efeito protetor da citocina sobre células suscetíveis à ação citopática (MDBK, do inglês Madin-Darbebovinekidnee) produzida por uma infecção viral (FAMILLETTI, P.C et al. Antimicrob Agents Chemother., 20(1):1-4, 1981; RUBINSTEIN, S. J Virol., 37(2):755-758, 1981). Foi empregado o vírus da estomatite vesicular (VEV) para realizar o ensaio. Foram incubadas diferentes concentrações de scFv-Fc com a mesma concentração de rhIFN-alfa2b durante 2 horas, e posteriormente essa mistura foi incubada com as células MDBK. Passadas 6 horas, o sobrenadante das células foi retirado e adicionou-se VEV. Após 18 horas da adição do vírus, foi avaliado o efeito citopático por meio de coloração com o corante vital cristal violeta. Foi calculado o quociente da absorbância obtida a partir da mistura scFv-Fc/rhIFN-alfa2b e a absorbância obtida a partir da incubação de células e vírus somente em presença de rhIFN-alfa2b. Esse quociente foi diagramado considerando-se a concentração de scFv-Fc. Foi calculado o valor de scFv-Fc necessário para inibir a 65% a atividade antiviral do rhIFN-alfa2b: AV-IC65 (Tabela 5). A tabela 5 apresenta a AV-IC65 para a molécula scFv-Fc produzida pelos diferentes clones celulares, onde * (um asterisco) indica diferença significativa segundo o ANOVA post test ad hoc (p<0,05).
[063] A proteína produzida em HEK293 apresenta uma menor capacidade neutralizante da atividade antiviral do rhIFN-alfa2b. A partir dos valores da tabela 5 pode-se evidenciar que o scFv-Fc possui capacidade de neutralizar o rhIFN-alfa2b a fim de evitar a ação antiviral do rhIFN-apha2b. Dependendo do tipo celular empregado para produzir o scFv-Fc, são necessários entre 33 e 174 nM de anticorpo para neutralizar 65% de rhIFN-alfa empregado no ensaio (10 UI/ml).[063] The protein produced in HEK293 has a lower ability to neutralize the antiviral activity of rhIFN-alpha2b. From the values in Table 5, it can be seen that scFv-Fc has the ability to neutralize rhIFN-alpha2b in order to avoid the antiviral action of rhIFN-apha2b. Depending on the cell type used to produce the scFv-Fc, between 33 and 174 nM of antibody are needed to neutralize 65% of rhIFN-alpha used in the assay (10 IU/ml).
[064] Além disso, foi avaliada a neutralização da atividade biológica anti-proliferativa in vitro dos IFNs por meio do emprego da linhagem celular linfoblástica humana Daudi (RATH, P.C. et al. J Interferon Cetokine Res., 21(7):523-528, 2001). Foram incubadas diferentes concentrações de scFv-Fc com a mesma concentração de rhIFN-alfa2b durante 2 horas, e posteriormente essa mistura foi incubada com as células Daudi. Após 96 horas, foi avaliada a proliferação celular por meio de ensaio colorimétrico que evidencia a presença de desidrogenases intracelulares. O ensaio consiste na adição do reagente MTS:3-(4,5-dimethelthiazol-2-o)-5-(3-carboxemethoxephene l)-2-(4-sulfophenel)-2H-tetrazolium em presença de PMS: phenazinemethosulfate (BUTTKE, T. M. J Immunol Methods., 157(1-2):233-240, 1993).[064] In addition, the neutralization of the in vitro anti-proliferative biological activity of IFNs was evaluated through the use of the Daudi human lymphoblastic cell line (RATH, PC et al. J Interferon Cetokine Res., 21(7):523- 528, 2001). Different concentrations of scFv-Fc were incubated with the same concentration of rhIFN-alpha2b for 2 hours, and then this mixture was incubated with Daudi cells. After 96 hours, cell proliferation was evaluated by means of a colorimetric assay that shows the presence of intracellular dehydrogenases. The assay consists of the addition of the reagent MTS:3-(4,5-dimethelthiazol-2-o)-5-(3-carboxemethoxephene l)-2-(4-sulfophenel)-2H-tetrazolium in the presence of PMS: phenazinemethosulfate ( BUTTKE, TM J Immunol Methods., 157(1-2):233-240, 1993).
[065] Foi calculado o quociente da absorbância obtida a partir da mistura scFv Fc/rhIFN alfa2b e a absorbância obtida a partir da incubação de células Daudi em presença somente de rhIFN-alfa2b. Esse quociente foi diagramado considerando-se a concentração de scFv-Fc. Foi calculado o valor de scFv-Fc necessário para inibir a 50% a atividade antiviral do rhIFN-alfa2b: AP IC50 (Tabela 6). A tabela 6 apresenta a AP-IC50 para a molécula scFv-Fc produzida pelos diferentes clones celulares onde * (um asterisco) indica diferença significativa segundo o ANOVA post test ad hoc (p<0,05).
[066] A proteína produzida em HEK293 apresenta uma menor capacidade neutralizante da atividade antiproliferativa do rhIFN-alfa2b. A partir dos valores da tabela 6 pode-se evidenciar que o scFv-Fc possui capacidade de neutralizar o rhIFN-alfa2b a fim de evitar a ação antiproliferativa do rhIFN-apha2b. Dependendo do tipo celular empregado para produzir o scFv-Fc, são necessários entre 22 e 35nM de anticorpo para neutralizar 50% do rhIFN-alfa empregado no ensaio (20 UI/ml).[066] The protein produced in HEK293 has a lower ability to neutralize the antiproliferative activity of rhIFN-alpha2b. From the values in Table 6, it can be seen that scFv-Fc has the ability to neutralize rhIFN-alpha2b in order to avoid the antiproliferative action of rhIFN-apha2b. Depending on the cell type used to produce the scFv-Fc, between 22 and 35nM of antibody are needed to neutralize 50% of the rhIFN-alpha used in the assay (20 IU/ml).
[067] Em conclusão, foi gerada uma molécula scFv-Fc humanizada que, dependendo do tipo celular no qual se expressa, apresenta diferente capacidade neutralizante da atividade do rhIFN-alfa2b. Esses anticorpos apresentam tamanho menor que os anticorpos anti-IFN-alfa que se encontram em fases clínicas de desenvolvimento (105 kDa vs. 150 kDa).[067] In conclusion, a humanized scFv-Fc molecule was generated that, depending on the cell type in which it is expressed, has different neutralizing capacity for rhIFN-alpha2b activity. These antibodies are smaller in size than anti-IFN-alpha antibodies that are in clinical stages of development (105 kDa vs. 150 kDa).
[068] Foi avaliada a estabilidade frente ao pH da porção peptídica da molécula scFv-Fc humanizada em comparação com duas variantes existentes na bibliografia e, atualmente, em fases de estudo clínico: Sifalimumab e Rontalizamab.[068] The pH stability of the peptide portion of the humanized scFv-Fc molecule was evaluated in comparison with two variants existing in the literature and currently in clinical study phases: Sifalimumab and Rontalizamab.
[069] O pH, medida indireta da concentração de prótons, é um determinante maior da estabilidade proteica assim como também de sua função. Por essa razão, compreender os fatores que determinam os pK dos aminoácidos nas proteínas vem sendo um problema físicoquímico clássico. O problema teórico básico para o cálculo do pKa é estabelecer como o entorno proteico perturba o pKa de um dado aminoácido ao ser este incorporado a partir de uma solução. Na atualidade existem vários métodos para realizar essas previsões, baseadas em princípios diferentes e com diferentes níveis de complexidade: baseados na resolução da equação de Poisson-Boltzmann (KIESERITZKE, G. et al., Proteins, 71(3):1335-1348, 2008; ULLMANN, R. T. et al., J. Comput. Chem., 33(8):887-900, 2012) Dinâmica Molecular (ULLMANN, R. T. et al., J. Comput. Chem., 33(8):887-900, 2012; WALLACE, J. et al., J. Chem. Theore. Comput., 7(8):2617-2629, 2011; WILLIAMS, S. L. et al., J. Chem. Theore. Comput., 6(2):560-568, 2010; DONNINI, S. et al., J. Chem. Theore. Comput., 7(6):1962-1978, 2011) e empíricos (Li, H. et al., Proteins. Struct. Funct. Bioinforma., 61(4):704-721, 2005; Tan, K. P., Nucleic Acids Res. 41(Web Server issue):314-321, 2013). Os métodos empíricos são extremamente simples mas têm dado resultados comparáveis ou superiores aos outros métodos mais sofisticados (LEE, A. et al., J. Chem. Inf. Model., 49(9):2013-2033, 2009; DAVIES, M. N. et al., BMC Biochem. 7(1):18, 2006; OLSSÃO, M. et al., J. Chem. Theore. Comput. 7(2):525-537, 2011) motivo pelo qual que se decidiu empregar esta ferramenta para o estudo e comparação da estabilidade das proteínas estudadas.[069] pH, an indirect measure of proton concentration, is a major determinant of protein stability as well as its function. For this reason, understanding the factors that determine the pK of amino acids in proteins has been a classic physicochemical problem. The basic theoretical problem for the calculation of pKa is to establish how the protein environment perturbs the pKa of a given amino acid when it is incorporated from a solution. Currently, there are several methods to make these predictions, based on different principles and with different levels of complexity: based on solving the Poisson-Boltzmann equation (KIESERITZKE, G. et al., Proteins, 71(3):1335-1348, 2008; ULLMANN, RT et al., J. Comput. Chem., 33(8):887-900, 2012) Molecular Dynamics (ULLMANN, RT et al., J. Comput. Chem., 33(8):887 -900, 2012; WALLACE, J. et al., J. Chem. Theore. Comput., 7(8):2617-2629, 2011; WILLIAMS, SL et al., J. Chem. Theore. Comput., 6 (2):560-568, 2010; DONNINI, S. et al., J. Chem. Theore. Comput., 7(6):1962-1978, 2011) and empirical (Li, H. et al., Proteins Struct. Funct. Bioinforma., 61(4):704-721, 2005; Tan, KP, Nucleic Acids Res. 41(Web Server issue):314-321, 2013 ). Empirical methods are extremely simple but have given results comparable or superior to other more sophisticated methods (LEE, A. et al., J. Chem. Inf. Model., 49(9):2013-2033, 2009; DAVIES, MN et al., BMC Biochem. 7(1):18, 2006; OLSÃO, M. et al., J. Chem. Theore. Comput. 7(2):525-537, 2011) reason why it was decided to employ this tool for the study and comparison of the stability of the proteins studied.
[070] Foi realizada a previsão dos estados de protonação dos resíduos de aminoácidos das proteínas: scFv-humanizada partindo de uma estrutura equilibrada por meio de Dinâmica Molecular (DM) de tempo: 750ns; Anticorpo monoclonal Sifalimumab (4EPG) obtido da base de dados PDB (Protein Data Bank); e Anticorpo monoclonal Rontalizumab (4Z5R) obtido da mesma base de dados, PDB.[070] The prediction of the protonation states of the amino acid residues of the proteins was performed: scFv-humanized starting from a balanced structure by means of Molecular Dynamics (DM) of time: 750ns; Monoclonal antibody Sifalimumab (4EPG) obtained from the PDB (Protein Data Bank) database; and Rontalizumab monoclonal antibody (4Z5R) obtained from the same database, PDB.
[071] Na previsão foi empregado o programa PropKa3.110. A Figura 2 descreve a variação de energia livre de Gibbs (ΔG) associada à passagem do estado desordenado ao enovelado em solução, calculado para cada proteína (normalizado por resíduo) em diferentes pHs, e tendo em conta apenas as contribuições dos resíduos ionizáveis. Um mínimo mais pronunciado indica que a proteína alcançou um enovelamento mais estável e poderia ser empregada para realizar comparações entre diferentes proteínas (GREAVES, R. B. et al., BMC. Struct .Biol., 7(1):18, 2007). Por exemplo, uma proteína pode estabilizar seu estado enovelado ao formar pontes salinas e estabilizar um par de resíduos carregados, ou em forma relativa apresentar mais resíduos Glu que Asp em sua superfície exposta ao solvente, os quais ao apresentar uma cadeia mais comprida podem apresentar uma maior solvatação (menor Energia Livre) que os Asp (cadeia lateral mais curta). A curva mostra o fragmento compreendido pelas cadeias variáveis pesada e leve de 4EPG (Sifalimumab), 4Z5R (Rontalizumab), e o scFv-humanizado (Modelo obtido a partir da Dinâmica Molecular em 750 ns). A tabela 7 apresenta o valor de Energia livre por resíduo de Sifalimumab, Rontalizumab e scFv humanizado se tomarmos como referência a energia livre com pH=7, onde ∆G1 indica Energia livre por resíduo a pH=7; e ∆∆G* indica a diferença de ∆G: ∆G1 - ∆G Humanizado.
[072] Esses resultados mostram que o valor de Energia livre por resíduo de Sifalimumab e Rontalizumab é 121% e 220% maior, e, portanto, menos estáveis que o correspondente ao scFv humanizado da presente invenção, todos avaliados com pH=7. Dessa forma, o anticorpo da presente invenção é 2,2 vezes mais estável que o Sifalimumab e 3,2 vezes mais estável que o Rontalizumab com pH 7.[072] These results show that the value of Free Energy per residue of Sifalimumab and Rontalizumab is 121% and 220% higher, and therefore less stable than the corresponding humanized scFv of the present invention, all evaluated with pH=7. Thus, the antibody of the present invention is 2.2 times more stable than Sifalimumab and 3.2 times more stable than Rontalizumab at pH 7.
Claims (18)
- a. Uma sequência CDR1 VL representada por SEQ ID NO: 16;
- b. Uma sequência CDR2 VL representada por SEQ ID NO: 17;
- c. Uma sequência CDR3 VL representada por SEQ ID NO: 18;
- d. Uma sequência CDR1 VH representada por SEQ ID NO: 19;
- e. Uma sequência CDR2 VH representada por SEQ ID NO: 20;
- f. Uma sequência CDR3 VH representada por SEQ ID NO: 21.
- The. A CDR1 VL sequence represented by SEQ ID NO: 16;
- B. A CDR2 VL sequence represented by SEQ ID NO: 17;
- ç. A CDR3 VL sequence represented by SEQ ID NO: 18;
- d. A CDR1 VH sequence represented by SEQ ID NO: 19;
- and. A CDR2 VH sequence represented by SEQ ID NO: 20;
- f. A CDR3 VH sequence represented by SEQ ID NO: 21.
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