BR102019007735A2

BR102019007735A2 - semi-synthesis process of polycarboxylic ulvan by oxidation with periodate-chlorite and synthesized compounds

Info

Publication number: BR102019007735A2
Application number: BR102019007735-2A
Authority: BR
Inventors: Maria Eugênia Duarte Noseda; Mariana Mazetto De Carvalho; Rilton Alves Freitas; Diogo Ricardo Bazan Ducatti; Alan Guilherme Gonçalves; Miguel Daniel Noseda
Original assignee: Universidade Federal Do Parana
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2020-10-27
Also published as: BR102019007735A8

Abstract

A presente invenção se insere no campo das preparações medicinais e compreende o processo de síntese de Ulvanas policarboxílicas obtidas via oxidação com periodato-clorito a partir das ulvanas extraídas de Ulva fasciata. A rota de oxidação promoveu inserção de grupos carboxila na Ulvana, caracterizando um alto caráter iônico do polímero devido a concomitância de grupos sulfato, naturalmente presentes na estrutura após extração. As ulvanas policarboxílicas obtidas contém unidades de 2,3-dicarboxil-xilose, 2,3,6- tricarboxil-ácido idurônico e 2,3,6-tricarboxil-ácido glucurônico, e apresentaram maior atividade anticoagulante do que as ulvanas nativas.

The present invention is part of the field of medicinal preparations and comprises the process of synthesis of polycarboxylic Ulvanes obtained via oxidation with periodate-chlorite from the Ulvanas extracted from Ulva fasciata. The oxidation route promoted the insertion of carboxyl groups in Ulvana, featuring a high ionic character of the polymer due to the concomitance of sulfate groups, naturally present in the structure after extraction. The polycarboxylic ulcans obtained contain units of 2,3-dicarboxyl-xylose, 2,3,6-tricarboxyl-iduronic acid and 2,3,6-tricarboxyl-glucuronic acid, and showed greater anticoagulant activity than native ulvanes.

Description

SEMI-SYNTHESIS PROCESS OF POLYCARBOXYL ULVANES BY OXIDATION WITH PERIODATE-CHLORITE AND SYNTHESIZED COMPOUNDS

Field of the invention:

[1] A presente invenção se insere no campo das preparações medicinais sendo estes: derivados de polissacarídeos, especificamente de algas verdes (Ulva sp.), denominados de ulvanas. O processo de semi-síntese das ulvanas se baseia em uma rota de oxidação com periodato-clorito, que promoveu a formação de ulvanas policarboxílicas, que são moléculas poliméricas bioativas, e apresentaram atividade anticoagulante superior em relação à fração de ulvana nativa.[1] The present invention falls within the field of medicinal preparations, these being: derivatives of polysaccharides, specifically from green algae (Ulva sp.), Called ulvanas. The process of semi-synthesis of the ulvan is based on an oxidation route with periodate-chlorite, which promoted the formation of polycarboxylic ulvan, which are bioactive polymeric molecules, and presented superior anticoagulant activity in relation to the native ulvan fraction.

Fundamentals of the invention:

[2] Os polissacarídeos representam uma matéria-prima renovável e de fácil obtenção, podendo compor a formação de novos compostos bioativos, que apresentam potenciais diversos para aplicações biológicas.[2] Polysaccharides represent a renewable and easily obtained raw material, being able to compose the formation of new bioactive compounds, which present different potentials for biological applications.

[3] No que se refere ao potencial anticoagulante, comumente utiliza-se a heparina, um polissacarídeo da classe dos glicososaminoglicanos obtido da mucosa intestinal de suínos, para o tratamento de distúrbios na hemostasia. Entretanto, existem efeitos adversos relacionados ao uso da heparina, tais como osteoporose, trombocitopenia complicações hemorrágicas, além do risco de contaminação por patógenos de fonte animal.[3] Regarding the anticoagulant potential, heparin, a polysaccharide of the class of glycosaminoglycans obtained from the intestinal mucosa of pigs, is commonly used for the treatment of disorders in hemostasis. However, there are adverse effects related to the use of heparin, such as osteoporosis, thrombocytopenia, hemorrhagic complications, in addition to the risk of contamination by pathogens from animal sources.

[4] O processo de extração de ulvanas visa isolar esses polissacarídeos produzidos naturalmente pelas algas. As ulvanas extraídas possuem naturalmente em sua estrutura química unidades de ramnose, xilose, ácidos urônicos e grupos sulfatos reativos.[4] The ulvan extraction process aims to isolate these polysaccharides naturally produced by algae. The extracted ulvanas naturally have in their chemical structure units of rhamnose, xylose, uronic acids and reactive sulfate groups.

[5] Neste contexto, as ulvanas apresentam propriedades que caracterizam potencial de aplicação no tratamento supracitado, visto que apresentam grupos reativos a partir dos quais podem ser introduzidos grupos funcionais direcionados para a atividade biológica específica, uma vez que modificações regioseletivas em polímeros podem modular sua atividade biológica de acordo com o seu perfil e com a aplicabilidade desejada.[5] In this context, the ulvanas have properties that characterize the potential for application in the aforementioned treatment, since they have reactive groups from which functional groups directed to specific biological activity can be introduced, since regioselective modifications in polymers can modulate their biological activity according to your profile and the desired applicability.

State of the art:

[6] Alguns documentos do estado da técnica descrevem processos que envolvem modificações químicas de ulvanas com o intuito de implmentar diversas propriedades nas mesmas visando múltiplas aplicações, inclusive para melhoria da atividade anticoagulante.[6] Some state-of-the-art documents describe processes that involve chemical modifications of ulvanas in order to implement several properties in them aiming at multiple applications, including for improving anticoagulant activity.

[7] A Patente CN103483460 relaciona-se a extração da ulvana, sendo essa um polissacarídeo derivado de Ulva fasciata, que apresentou atividades antitumorais. A extração é realizada por esmagamento e extração ultrasônica em água e outros processos de separação de mistura utilizando uma coluna cromatográfica de fluxo radial. Neste caso, não ocorreu uma modificação química da ulvana com o intuito de promover a adição de grupos funcionais direcionados ao desenvolvimento de propriedades específicas, visto que a ulvana já possui alguns grupos atrelados a certas atividades biológicas.[7] Patent CN103483460 relates to the extraction of ulvana, which is a polysaccharide derived from Ulva fasciata, which showed antitumor activities. Extraction is carried out by crushing and ultrasonic extraction in water and other mixture separation processes using a radial flow chromatographic column. In this case, there was no chemical modification of the ulvana in order to promote the addition of functional groups aimed at the development of specific properties, since the ulvana already has some groups linked to certain biological activities.

[8] Desse modo, verifica-se grandes diferenças de escopo, visto que o cerne da presente invenção é o processo de modificação química das ulvanas já extraídas, com o intuito de aumentar os grupos carboxilas em sua estrutura química, em conjunto com os grupos sulfatos já existentes, para melhorar os efeitos anticoagulantes da molécula.[8] Thus, there are great differences in scope, since the core of the present invention is the process of chemical modification of the already extracted ulvanas, in order to increase the carboxyl groups in their chemical structure, together with the groups existing sulfates, to improve the anticoagulant effects of the molecule.

[9] O pedido de Patente FR3047179 aborda a obtenção de ulvanas sulfatadas e seu uso na regulação dos distúrbios de coagulação, particularmente como agente antitrombótico e/ou anticoagulante em formulações farmacêuticas. A sulfatação é realizada usando complexo de sulfeto de piridina, e o aumento dos grupos sulfatos na estrutura, em teores de sulfatação maiores do que 15%, está diretamente relacionado à melhoria da atividade anticoagulante.[9] Patent application FR3047179 addresses the acquisition of sulfated ulvan and its use in the regulation of coagulation disorders, particularly as an antithrombotic and / or anticoagulant agent in pharmaceutical formulations. Sulfation is performed using a pyridine sulfide complex, and the increase in sulfate groups in the structure, at sulfation levels greater than 15%, is directly related to the improvement of anticoagulant activity.

[10] Corrobora-se que não há adição de grupos sulfatos na estrutura da ulvana policarboxílica pelo processo da presente invenção, em contrapartida ao relatado no pedido de Patente FR304717. A melhoria da atividade anticoagulante nessa invenção se desenvolveu com a adição de grupos carboxílicos na estrutura, por meio de uma rota de oxidação específica, enquanto que, em FR3047179, houve somente aumento dos grupos sulfato.[10] It is corroborated that there is no addition of sulfate groups in the structure of the polycarboxylic ulvana by the process of the present invention, in contrast to that reported in patent application FR304717. The improvement of anticoagulant activity in this invention was developed with the addition of carboxylic groups in the structure, through a specific oxidation route, whereas, in FR3047179, there was only an increase in the sulfate groups.

[11] No artigo "Structural features and anticoagulant activity of the sulphated polysaccharides ps-cf from a green alga Capsosiphon fulvescens"aborda-se o isolamento e purificação de polissacarídeos sulfatados a partir de alga verde coreana Maesaengi (Capsosiphon fulvescens), obtendo ulvana com teor molar de 38,6 e 49,4% de xilose na estrutura.[11] The article "Structural features and anticoagulant activity of the sulphated polysaccharides ps-cf from a green alga Capsosiphon fulvescens" deals with the isolation and purification of sulfated polysaccharides from Korean green algae Maesaengi (Capsosiphon fulvescens), obtaining ulvana with molar content of 38.6 and 49.4% of xylose in the structure.

[12] No documento supracitado não há rota química de sulfatação e nem inserção de grupos carboxila na estrutura da Ulvana e, além disso, considera-se importante ressaltar que os grupos carboxilas das ulvanas da presente invenção foram inseridos em posições diferentes daquelas previamente existentes na ulvana original. Esse diferencial permitiu a síntese de produtos com propriedades completamente diferentes e mais pronunciadas em relação à ulvanas nativas que passam somente por extração e/ou sulfatação.[12] In the aforementioned document, there is no chemical route of sulfation or insertion of carboxyl groups in the Ulvana structure and, in addition, it is considered important to note that the carboxyl groups of the ulvanas of the present invention were inserted in positions different from those previously existing in original ulvana. This differential allowed the synthesis of products with completely different properties and more pronounced in relation to native ulvanas that only undergo extraction and / or sulfation.

Brief description of the invention:

[13] A presente invenção se insere no campo das preparações medicinais e compreende o processo de síntese de Ulvanas policarboxílicas obtidas via oxidação com periodato-clorito a partir das ulvanas extraídas de Ulva fasciata. A rota de oxidação promoveu inserção de grupos carboxila na Ulvana, caracterizando um alto caráter iônico do polímero devido a concomitância de grupos sulfato, naturalmente presentes na estrutura após extração. As ulvanas policarboxílicas obtidas contém unidade de 2,3-dicarboxil-xilose, 2,3,6-tricarboxil-ácido idurônico e 2,3,6-tricarboxil-ácido glucurônico, e apresentaram maior atividade anticoagulante do que as ulvanas nativas.[13] The present invention is in the field of medicinal preparations and comprises the process of synthesis of polycarboxylic Ulvanes obtained via oxidation with chlorate periodate from the Ulvanas extracted from Ulva fasciata. The oxidation route promoted the insertion of carboxyl groups in Ulvana, featuring a high ionic character of the polymer due to the concomitance of sulfate groups, naturally present in the structure after extraction. The polycarboxylic ulcans obtained contain 2,3-dicarboxyl-xylose, 2,3,6-tricarboxyl-iduronic acid and 2,3,6-tricarboxyl-glucuronic acid units, and showed greater anticoagulant activity than native ulvanes.

Brief description of the figures:

[14] Para obter uma visualização completa do processo desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.[14] To obtain a complete visualization of the process of this invention, the figures to which reference is made are presented, as follows.

[15] Na Figura 1 apresenta-se um macro fluxograma reacional destacando-se os compostos intermediários (1)(2) e os compostos principais sintetizados (3)(4)(5).[15] Figure 1 shows a macro reaction flowchart, highlighting the intermediate compounds (1) (2) and the main synthesized compounds (3) (4) (5).

[16] Na Figura 2 apresenta-se a estrutura químicas dos compostos principais obtidos contendo as unidades de 2,3-dicarboxil-xilose, 2,3,6-tricarboxil-ácido idurônico e 2,3,6-tricarboxil-ácido glucurônico, bem como todas as etapas do processo de obtenção: Extração (A), Oxidação com periodato (B-G), Oxidação com clorito (H-N), Fracionamento (O-S) .[16] Figure 2 shows the chemical structure of the main compounds obtained containing the units of 2,3-dicarboxyl-xylose, 2,3,6-tricarboxyl-iduronic acid and 2,3,6-tricarboxyl-glucuronic acid, as well as all the stages of the obtaining process: Extraction (A), Oxidation with periodate (BG), Oxidation with chlorite (HN), Fractionation (OS).

Detailed description of the invention:

[17] A presente invenção compreende a obtenção de derivados bioativos a partir de polissacarídeos de algas verdes (Ulva sp.) . De acordo com o método de extração estes polissacarídeos podem se apresentar na sua forma nativa, carboxi-reduzida e/ou dessulfatada. Um conjunto de reações oxidativas permite a introdução de grupos carboxila na estrutura, de modo a aumentar a atividade anticoagulante dessas moléculas.[17] The present invention comprises obtaining bioactive derivatives from polysaccharides from green algae (Ulva sp.). According to the extraction method, these polysaccharides can be present in their native form, carboxy-reduced and / or desulfated. A set of oxidative reactions allows the introduction of carboxyl groups in the structure, in order to increase the anticoagulant activity of these molecules.

[18] As Ulvanas são polissacarídeos naturalmente sulfatados, que são biossintetizados por algas verdes dos gêneros Ulva sp e Enteromorpha sp. Sua estrutura química é formada por díades repetitivas de ácido urônico(α-L-idurônico ou β-D-glucurônico) ou β-D-xilose ligados a α-L-ramnose 3-sulfato por meio de ligações 1-4. Ainda, de acordo com a espécie e a época da coleta, as unidades de ramnose podem estar ramificadas em C-2 por unidades de β-D-glucurônico .[18] Ulvanas are naturally sulfated polysaccharides, which are biosynthesized by green algae of the genera Ulva sp and Enteromorpha sp. Its chemical structure is formed by repetitive dyads of uronic acid (α-L-iduronic or β-D-glucuronic) or β-D-xylose linked to α-L-rhamnose 3-sulfate through bonds 1-4. Also, according to the species and the time of collection, the rhamnose units may be branched into C-2 by β-D-glucuronic units.

[19] As ulvanas policarboxílicas obtidas por meio do referido processo de oxidação com periodato-clorito são primeiramente funcionalizadas com grupos aldeído pela reação de oxidação com periodato, pois este íon promove uma clivagem oxidativa de hidroxilas vicinais, acarretando na ruptura da ligação carbono-carbono e na formação de dois grupos aldeído em cada monômero oxidado. Dessa maneira, são obtidos derivados de Ulvana contendo unidades 2,3-dialdeído.[19] The polycarboxylic ulcans obtained by means of the oxidation process with periodate-chlorite are first functionalized with aldehyde groups by the oxidation reaction with periodate, since this ion promotes an oxidative cleavage of vicinal hydroxyls, resulting in the rupture of the carbon-carbon bond and in the formation of two aldehyde groups in each oxidized monomer. In this way, Ulvana derivatives containing 2,3-dialdehyde units are obtained.

[20] A oxidação com periodato promove uma ruptura da ligação C-C, permitindo obter um polímero de cadeia menos rígida em comparação ao polímero original. Além disso, esta reação induz uma extensa despolimerização devido à formação de radicais livres, mesmo em baixas temperaturas, na ausência de luz e na presença de antioxidantes.[20] Periodate oxidation promotes a breakdown of the C-C bond, allowing to obtain a less rigid polymer compared to the original polymer. In addition, this reaction induces extensive depolymerization due to the formation of free radicals, even at low temperatures, in the absence of light and in the presence of antioxidants.

[21] A oxidação com periodato foi realizada de acordo com as seguintes etapas, em tempos totais de 24h , 48h e 72h :

(A) Solubilização completa da ulvana nativa (1-200 mg.mL-1) em uma solução aquosa com 0,01-0,5 mol.L-1 de metaperiodato de sódio(m-NaIO4) ;
(B) Agitação magnética no escuro à4 - 70°C;
(C) Adição de etilenoglicol(0,1 - 15 mL de etilenoglicol para cada 15 mL da solução de ulvana) para consumir o excesso de reagente;
(D) Diálise sequencial em membranas de 1 à 2 ou 6 à 8 ou 12 - 14 kDa contra NaCl (0 - 5 mol.L-1) e água destilada;
(E) Congelamentode0 à -80°C;
(F) Liofilização;

[21] Periodate oxidation was carried out according to the following steps, in total times of 24h, 48h and 72h:

(A) Complete solubilization of native ulvana (1-200 mg.mL-1) in an aqueous solution with 0.01-0.5 mol.L-1 of sodium metaperiodate (m-NaIO4);
(B) Magnetic stirring in the dark at 4 - 70 ° C;
(C) Addition of ethylene glycol (0.1 - 15 mL of ethylene glycol for each 15 mL of the ulvana solution) to consume excess reagent;
(D) Sequential dialysis in membranes from 1 to 2 or 6 to 8 or 12 - 14 kDa against NaCl (0 - 5 mol.L-1) and distilled water;
(E) Freezing from 0 to -80 ° C;
(F) Lyophilization;

[22] Posteriormente, os grupos aldeído são convertidos em carboxila pela reação de oxidação com clorito de sódio. A reação se inicia com a protonação do oxigênio carbonílico do grupo aldeído (1) seguido do ataque dos elétrons da hidroxila clorito ao carbono deste grupamento e, com a saída do cloro, ocorre a formação do ácido carboxílico.[22] Subsequently, the aldehyde groups are converted to carboxyl by the oxidation reaction with sodium chlorite. The reaction begins with the protonation of carbonyl oxygen of the aldehyde group (1) followed by the attack of electrons of hydroxyl chlorite on the carbon of this group and, with the exit of chlorine, the formation of carboxylic acid occurs.

[23] A oxidação com clorito foi realizada de acordo com as seguintes etapas:
(G) Solubilização completa da ulvana em água (1 - 200 mg.mL-1) ;
(H) Adição de NaH2PO4(0 - 3000 mg) e H2O2(20 - 36 %)(0,1 - 15 mL para cada 15 mL da solução de ulvana);
(I) Gotejamento de uma solução de 2-10 equivalentes grama de NaClO2(240 - 1215 mg em 1 - 500 mL de água);
(J) Agitação magnética por 30 min a 48 h à 4 - 70 °C;
(K) Adição de 0,1 - 5g g de Na2SO3;
(L) Diálise sequencial em membranas de 1 à 2 ou 6 à 8 ou 12-14 kDa contra NaCl (0 - 5 mol.L-1) e água destilada;
(M) Liofilização;[23] Chlorite oxidation was carried out according to the following steps:
(G) Complete solubilization of the ulvana in water (1 - 200 mg.mL-1);
(H) Addition of NaH2PO4 (0 - 3000 mg) and H2O2 (20 - 36%) (0.1 - 15 ml for each 15 ml of the ulvana solution);
(I) Dripping a solution of 2-10 grams equivalent of NaClO2 (240 - 1215 mg in 1 - 500 mL of water);
(J) Magnetic stirring for 30 min at 48 h at 4 - 70 ° C;
(K) Addition of 0.1 - 5g g of Na2SO3;
(L) Sequential dialysis in membranes from 1 to 2 or 6 to 8 or 12-14 kDa against NaCl (0 - 5 mol.L-1) and distilled water;
(M) Lyophilization;

[24] A oxidação do derivado 2,3-dialdeído de ulvanas com clorito origina derivados policarboxílicos, os quais apresentam tempo de protrombina parcialmente ativada (APTT) maior quando comparado com a ulvana nativa, apresentando, portanto, potencial para aplicação na terapia anticoagulante.[24] The oxidation of the 2,3-dialdehyde derivative of ulvan with chlorite gives rise to polycarboxylic derivatives, which have a partially activated prothrombin time (APTT) when compared to native ulvana, thus presenting potential for application in anticoagulant therapy.

[25] Além disso, ressalta-se o fracionamento em DEAE-Sephacel da fração 3C, que foi anteriormente oxidada com periodato por 72h e oxidada por clorito. Este fracionamento é realizado por cromatografia de troca aniônica em coluna contendo DEAE-Sephacel na forma Cl-.[25] In addition, the DEAE-Sephacel fractionation of the 3C fraction is highlighted, which was previously oxidized with periodate for 72 hours and oxidized by chlorite. This fractionation is performed by anion exchange chromatography on a column containing DEAE-Sephacel in Cl- form.

[26] O processo de fracionamento foi realizado de acordo com as seguintes etapas:
(N) Solubilização de 560 mg de Ulvana (3C) em 10mL de água destilada;
(O) Centrifugação por 1 - 60 minutos com rotação de 1500 - 12.500rpm;
(P) Eluição do sobrenadante com água destilada e concentrações crescentes de NaCl(0 - 4 mol.L-1);
(Q) Diálise (1 à 2 ou 6 à 8 ou 12 à 14kDa)das subfrações obtidas contra água destilada;
(R) Liofilização.[26] The fractionation process was carried out according to the following steps:
(N) Solubilization of 560 mg of Ulvana (3C) in 10mL of distilled water;
(O) Centrifugation for 1 - 60 minutes with rotation of 1500 - 12,500 rpm;
(P) Elution of the supernatant with distilled water and increasing concentrations of NaCl (0 - 4 mol.L-1);
(Q) Dialysis (1 to 2 or 6 to 8 or 12 to 14kDa) of the subfractions obtained against distilled water;
(R) Lyophilization.

[27] O composto principal (3) obtido por meio dos processos de oxidação via periodato-clorito da ulvana nativa (1), perpassando pelo composto intermediário (2), pode ser descrito pela seguinte fórmula química:

na qual o Rrepresenta um grupo CH2OH ou um grupo COO-.[27] The main compound (3) obtained through oxidation processes via native ulvana chlorate periodate (1), passing through the intermediate compound (2), can be described by the following chemical formula:

in which R represents a CH2OH group or a COO- group.

[28] Este composto principal (3) pode ainda ser submetidos a um processo de dessulfatação, gerando o composto dessulfatado (4):

[28] This main compound (3) can also be subjected to a desulfation process, generating the desulfated compound (4):

[29] Ademais, o composto principal (3) pode ser submetido a um processo de carboxi-redução, gerando o composto carboxi-reduzido (5):

[29] Furthermore, the main compound (3) can be subjected to a carboxy-reduction process, generating the carboxy-reduced compound (5):

[30] O composto fracionado (3Cb/c) não sofre nenhuma mudança química em relação ao composto (3), pois foi submetido somente à uma cromatografia de troca iônica, com o objetivo de obter as frações com diferentes propriedades (massa e caráter iônico, por exemplo), evidenciando-se que ambas as frações apresentam como principais monossacarídeos neutros ramnose, xilose e glucose.[30] The fractionated compound (3Cb / c) does not undergo any chemical change in relation to the compound (3), as it was subjected only to an ion exchange chromatography, in order to obtain fractions with different properties (mass and ionic character) , for example), showing that both fractions have as main neutral monosaccharides rhamnose, xylose and glucose.

[31] Pelas representações da Figura 1 salienta-se que R1 pode ser CH2OH ou COO-, sendo CH2OH no composto carboxi-reduzido, enquanto que R2 é OSO3-, exceto no composto dessulfatado em que R2 é OH.[31] From the representations in Figure 1, it should be noted that R1 can be CH2OH or COO-, with CH2OH being in the carboxy-reduced compound, while R2 is OSO3-, except in the desulfated compound where R2 is OH.

Anticoagulant activity tests

[32] A avaliação da atividade anticoagulante foi realizada por meio de três tipos de ensaio, relacionados as vias da coagulação, sendo estes: Ensaio de coagulação baseado em tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT), Ensaio de coagulação baseado em tempo de protrombina (PT) e Ensaio de coagulação baseado em tempo de trombina (TT). Os ensaios foram realizados nas ulvanas nativas e para os produtos modificados pela rota de oxidação com periodatoclorito.[32] The evaluation of anticoagulant activity was performed using three types of assay, related to the coagulation pathways, namely: Coagulation assay based on activated partial thromboplastin time (APTT), Coagulation assay based on prothrombin time ( PT) and thrombin time-based coagulation assay (TT). The tests were carried out in native ulvanas and for products modified by the oxidation route with periodatochlorite.

[33] Estes ensaios avaliam o prolongamento do tempo necessário para a coagulação sanguínea em relação ao plasma normal, de acordo com a modificação das ulvanas. O teste APTT avalia avia intrínseca da cascata de coagulação utilizando um substituto plaquetário (cefalina), um ativador do FXI (cloreto de cálcio) e um fator de contato (caulim ou sílica).[33] These tests evaluate the prolongation of the time required for blood clotting in relation to normal plasma, according to the modification of the ulvanas. The APTT test evaluates the intrinsic pathway of the coagulation cascade using a platelet substitute (cephaline), an FXI activator (calcium chloride) and a contact factor (kaolin or silica).

[34] Para a avaliação da atividade anticoagulante foram utilizadas concentrações crescentes das frações citadas acima (10-150 μg.mL-1). Como controle positivo (valores normais de coagulação) e negativo de coagulação foram utilizadas a salina e a heparina (1-10 μg.mL-1), respectivamente. Os resultados dos ensaios foram expressos como médias APTT (s) ± DPM e estão listados na tabela a seguir:

[34] For the evaluation of anticoagulant activity, increasing concentrations of the fractions mentioned above (10-150 μg.mL-1) were used. As positive control (normal coagulation values) and negative coagulation, saline and heparin (1-10 μg.mL-1) were used, respectively. The test results were expressed as means APTT (s) ± DPM and are listed in the following table:

[35] O ensaio de APTT demonstrou que a fração de Ulvana nativa (1A) apresenta baixa atividade anticoagulante, visto que a mesma só é desempenhada a partir de 80 µg.mL-1. Ou seja, inferiu-se em concordância com os conhecimentos na área, que a atividade anticoagulante destes polímeros pode ser atribuída a presença simultânea dos grupos sulfato e carboxila.[35] The APTT assay demonstrated that the native Ulvana fraction (1A) has low anticoagulant activity, since it is only performed from 80 µg.mL-1. That is, it was inferred in agreement with the knowledge in the area, that the anticoagulant activity of these polymers can be attributed to the simultaneous presence of the sulfate and carboxyl groups.

[36] A Ulvana dialdeídica (3B) foi utilizada como modelo para avaliar adicionalmente o efeito de grupos aldeídos sobre a atividade anticoagulante, demonstrando maior atividade do que a ulvana nativa, possivelmente pela reação com os grupos amino das proteínas da cascata de coagulação sanguínea por uma interação inespecífica e irreversível (covalente). A Ulvana dialdeídica provavelmente apresenta uma cadeia polimérica mais flexível devido a clivagem do anel em C-2 e C-3.[36] Ulde-dialdehyde (3B) was used as a model to further assess the effect of aldehyde groups on anticoagulant activity, demonstrating greater activity than native ulvana, possibly by reacting with the amino groups of proteins in the blood coagulation cascade by a nonspecific and irreversible (covalent) interaction. The dialdehydic Ulvana probably has a more flexible polymer chain due to ring cleavage at C-2 and C-3.

[37] As Ulvanas policarboxílicas (3A, 3B e 3C) apresentaram um aumento da atividade anticoagulante de maneira dose-dependente em toda a faixa de concentração testada (10-150 µg.ml-1) . Além disso, é importante ressaltar que a fração com maior teor de grupos carboxila (3C) apresentou maior APTT (222s) na maior concentração utilizada (150 µg.ml-1) quando comparada com as demais ulvanas policarboxílicas.[37] Polycarboxylic Ulvanas (3A, 3B and 3C) showed an increase in anticoagulant activity in a dose-dependent manner throughout the tested concentration range (10-150 µg.ml-1). In addition, it is important to note that the fraction with the highest content of carboxyl groups (3C) presented the highest APTT (222s) at the highest concentration used (150 µg.ml-1) when compared with the other polycarboxylic ulvan.

[38] Dentre as frações obtidas após o fracionamento em DEAE-Sephacel, a fração 3Cc, a qual apresentou maior teor de grupos sulfato e carboxila, apresentou também maior atividade anticoagulante pelo teste de APTT.[38] Among the fractions obtained after fractionation in DEAE-Sephacel, the 3Cc fraction, which had a higher content of sulfate and carboxyl groups, also showed greater anticoagulant activity by the APTT test.

[39] A ulvana R-3C, obtida após a oxidação via periodato-clorito a partir das ulvanas carboxi-reduzidas R também apresentou atividade anticoagulante. O aumento na atividade indica que a introdução do grupo carboxila em C-2 e C-3 aumenta esta atividade mesmo na ausência do grupo carboxila em C-6.[39] The R-3C ulvana, obtained after oxidation via periodate-chlorite from the carboxy-reduced ulvan R also showed anticoagulant activity. The increase in activity indicates that the introduction of the carboxyl group at C-2 and C-3 increases this activity even in the absence of the carboxyl group at C-6.

[40] Foram realizadas reações de dessulfatação e carboxi-redução nas Ulvanas modificadas com o intuito de validar a hipótese do aumento da atividade anticoagulante atrelado ao teor de carboxilas e sulfatos na estrutura química da Ulvana. Ambas reações supracitadas promoveram redução da atividade anticoagulante, confirmando a necessidade concomitante de grupos sulfato e carboxila, para promover o aumento significativo da atividade anticoagulante.[40] Desulfation and carboxy-reduction reactions were carried out on the modified Ulvanas in order to validate the hypothesis of increased anticoagulant activity linked to the content of carboxyls and sulfates in Ulvana's chemical structure. Both of the aforementioned reactions promoted a reduction in anticoagulant activity, confirming the concomitant need for sulfate and carboxyl groups, to promote a significant increase in anticoagulant activity.

[41] O teste de tempo de protrombina é utilizado para avaliar a via extrínseca da cascata de coagulação e, para este ensaio, foram selecionadas as frações de ulvana não modificada (1A), as ulvanas policarboxílicas (3A, 3B2C e 3C) e as ulvanas fracionadas em DEAE-Sephacel (3Cb e 3Cc).[41] The prothrombin time test is used to evaluate the extrinsic pathway of the coagulation cascade and, for this assay, the unmodified ulvana fractions (1A), polycarboxylic ulvanas (3A, 3B2C and 3C) and DEAE-Sephacel fractionated ulcans (3Cb and 3Cc).

[42] O teste supracitado não demonstrou mudança de atividade na via extrínseca, conforme pode ser verificado estatisticamente na tabela de resultados:

[42] The aforementioned test did not show a change in activity in the extrinsic pathway, as can be statistically verified in the results table:

[43] O teste de tempo de trombina (TT) avalia o tempo necessário para que a trombina converta a fibrina em fibrinogênio. Este é a última etapa da cascata de coagulação sanguínea.[43] The thrombin time test (TT) assesses the time required for thrombin to convert fibrin into fibrinogen. This is the last stage of the blood clotting cascade.

[44] As ulvanas nativas (1A) e os produtos obtidos após a oxidação via periodato-clorito (3A) (3B) (3C) (3Cb) (3Cc) também não apresentaram atividade pelo teste de TT, conforme pode ser observado nos dados:

[44] Native ulvanas (1A) and products obtained after oxidation via periodate-chlorite (3A) (3B) (3C) (3Cb) (3Cc) also showed no activity by the TT test, as can be seen in the data :

[45] Portanto, conclui-se que, a atividade anticoagulante destes polissacarídeos não envolve ação na trombina. E, considerando-se que também não houve atividade pelo teste de PT, estes polissacarídeos devem atuar nos fatores da via intrínseca da cascata de coagulação.[45] Therefore, it is concluded that the anticoagulant activity of these polysaccharides does not involve action on thrombin. And, considering that there was also no activity by the PT test, these polysaccharides must act on the factors of the intrinsic pathway of the coagulation cascade.

[46] Em suma, verifica-se que a oxidação periodato-clorito das ulvanas originou novos biopolímeros com um alto caráter iônico devido à presença natural de grupos sulfato e ao aumento nos teores de grupos carboxila. Estes novos produtos apresentaram uma maior atividade anticoagulante quando comparado com o polímero nativo, e atuam diretamente na via intrínseca da cascata de coagulação.[46] In short, it appears that the periodate-chlorite oxidation of the ulvanas gave rise to new biopolymers with a high ionic character due to the natural presence of sulfate groups and the increase in the contents of carboxyl groups. These new products showed a greater anticoagulant activity when compared to the native polymer, and act directly on the intrinsic pathway of the coagulation cascade.

Determination of molar mass

[47] A determinação da massa molar das ulvanas nativas e de seus produtos obtidos via oxidação com periodato e periodato-clorito foi realizada através da técnica de cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a um detector de índice de refração, de espalhamento de luz a 90 ° e 7° e detector viscosimétrico.[47] The molar mass determination of native ulvanas and their products obtained via oxidation with periodate and periodate-chlorite was performed using the size exclusion chromatography technique coupled to a refractive index detector, with light scattering at 90 ° and 7 ° and viscosimetric detector.

[48] Os dados mostram que os produtos obtidos após a oxidação com periodato/clorito apresentaram menor massa molar e cadeia polimérica menos rígida quando comparado com a ulvana nativa. Os referidos valores de massa molar obtidos estão dispostos na tabela a seguir:

[48] The data show that the products obtained after oxidation with periodate / chlorite showed lower molar mass and less rigid polymer chain when compared to native ulvana. These molar mass values obtained are shown in the table below:

[49] Estes dados mostram que a oxidação com periodato provocou uma diminuição na massa molar das ulvanas. Após a oxidação com clorito houve um aumento no Mw para as ulvanas policarboxílicas3A, 3B e 3C. Este aumento foi atribuído à inserção de dois grupos oxigênio para cada uma das unidades oxidadas. Dentre as sub-frações de 3C, 3Cc apresentou maior massa molar quando comparado com 3Cb.[49] These data show that oxidation with periodate caused a decrease in the molar mass of the ulvan. After oxidation with chlorite, there was an increase in Mw for polycarboxylic ulcans 3A, 3B and 3C. This increase was attributed to the insertion of two oxygen groups for each of the oxidized units. Among the sub-fractions of 3C, 3Cc had higher molar mass when compared to 3Cb.

[50] De modo geral os polímeros modificados apresentaram Mw até 6,9 vezes menor quando comparada com o polímero nativo, sendo esta uma característica importante na projeção de novas moléculas bioativas para a atividade anticoagulante.[50] In general, the modified polymers showed Mw up to 6.9 times lower when compared to the native polymer, which is an important feature in the projection of new bioactive molecules for anticoagulant activity.

Claims

POLYCARBOXYLIC ULVANAS SYNTHESIS PROCESS VIA OXIDATION WITH PERIODATE-CHLORITE characterized by understanding the steps of:

- Extraction of ulvana (1) from Ulva sp (A);
- Oxidation of the ulvana (2) with periodate (BG);
- Oxidation of the ulvana (3) with chlorite (HN);
- Fractionation of the ulvana by anion exchange column chromatography (OS).

POLYCARBOXYLIC ULVANAS SYNTHESIS PROCESS VIA OXIDATION WITH PERIODATE-CHLORITE, according to claim 1, characterized by understanding the substeps composing the oxidation step with periodate (BG):
(B) Complete solubilization of the native ulvana (1-200 mg.mL-1) in an aqueous solution with a concentration of 0.01 to 0.5 mol.L-1 of sodium metaperiodate (m-NaIO4);
(C) Magnetic stirring in the dark at 4 - 70 ° C;
(D) Addition of 0.1 to 15 ml of ethylene glycol for each 15 ml of the solution of ulvana;
(E) Sequential dialysis in membranes from 1 to 2 or 6 to 8 or 12 to 14 kDa against NaCl (0 - 5 mol.L-1) and distilled water;
(F) Freezing from 0 ° C to -80 ° C;
(G) Lyophilization;

POLYCARBOXYLIC ULVANAS SYNTHESIS PROCESS VIA OXIDATION WITH PERIODATE-CHLORITE, according to claims 1 to 2, characterized by understanding the substeps composing the oxidation step with chlorite (HN):
(H) Complete solubilization of the ulvana in water (1 - 200 mg.mL-1);
(I) Addition of 0 to 3000 mg of NaH2PO4 and 0.1 to 15 ml of H2O2 (20 - 36%) for each 15 ml of the ulvana solution);
(J) Dripping a solution of 2-10 grams equivalent of NaClO2 (240 - 1215 mg in 1 - 500 mL of water);
(K) Magnetic stirring for 30 min at 48 h and at 4 - 70 ° C;
(L) Addition of 0.1 to 5g of Na2SO3;
(M) Sequential dialysis in membranes from 1 to 2 or 6 to 8 or 12 to 14 kDa against NaCl (0 - 5 mol.L-1) and distilled water;
(N) Lyophilization;

POLYCARBOXYLIC ULVANAS SYNTHESIS PROCESS VIA OXIDATION WITH PERIODATE-CHLORITE, according to claims 1 to 3, characterized by understanding the substeps composing the fractionation step (OS):
(O) Solubilization of 560 mg of Ulvana (3C) in 10mL of distilled water;
(P) Centrifugation for 1 - 60 minutes with rotation of 1500 - 12,500 rpm;
(Q) Elution of the supernatant with distilled water in increasing concentrations of NaCl (0 - 4 mol.L-1);
(R) Dialysis (1 to 2 or 6 to 8 or 12 to 14 kDa) of the subfractions obtained against distilled water;
(S) Lyophilization;

COMPOSITE, synthesized by the process described in claims 1 to 3, characterized by

where R represents a CH2OH group or a COO- group.

DESULFATATED COMPOUND, synthesized by the process described in claims 1 to 3, followed by desulfation ration characterized by

CARBOXI-REDUCED COMPOUND, synthesized by the process described in claims 1 to 3, followed by carboxy-reduction reaction characterized by