BR102019001520A2 - SYNTHETIC PEPTIDE, PROCESS OF OBTAINING AND USE OF SYNTHETIC PEPTIDE IN THE PREPARATION OF AN ANTIMICROBIAL AGENT - Google Patents
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Abstract
peptídeo sintético, processo de obtenção e uso do peptídeo sintético na preparação de um agente antimicrobiano. a presente invenção descreve um novo peptídeo antimicrobiano do tipo defensina (pdef-caj i), composto por 20 aminoácidos e peso molecular de 2,429 kda, que foi sintetizado e modificado a partir da espécie vegetal cajanus cajan e possui atividade antimicrobiana contra staphyloccocus aureus, pseudomonas aeruginosa e acinetobacter baumannii de cepas suscetíveis e resistentes e contra fungos das espécies candida albicans, candida parapsilosis e cryptococcus neoformans e atividade bacteriostática contra escherichia coli e staphyloccocus aureus suscetíveis. a presente invenção se situa nos campos da microbiologia, engenharia de peptídeos, descoberta de fármacos e bioinformática.synthetic peptide, process of obtaining and using synthetic peptide in the preparation of an antimicrobial agent. The present invention describes a new antimicrobial peptide of the defensin type (pdef-caj i), composed of 20 amino acids and a molecular weight of 2.429 kda, which was synthesized and modified from the plant species cajanus cajan and has antimicrobial activity against staphyloccocus aureus, pseudomonas aeruginosa and acinetobacter baumannii of susceptible and resistant strains and against fungi of the species candida albicans, candida parapsilosis and cryptococcus neoformans and bacteriostatic activity against susceptible escherichia coli and staphyloccocus aureus. The present invention is in the fields of microbiology, peptide engineering, drug discovery and bioinformatics.
Description
[0001] A presente invenção descreve um novo peptídeo antimicrobiano do tipo defensina (PDef-Caj I), composto por 20 aminoácidos e peso molecular de 2,429 kDa, que foi sintetizado e modificado a partir da espécie vegetal Cajanus cajan e possui atividade antimicrobiana contra Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii de cepas suscetíveis e resistentes e contra fungos das espécies Candida albicans, Candida parapsilosis e Cryptococcus neoformans e atividade bacteriostática contra Escherichia coli e Staphyloccocus aureus suscetíveis. A presente invenção se situa nos campos da microbiologia, engenharia de peptídeos, planejamento de fármacos e bioinformática.[0001] The present invention describes a new antimicrobial peptide of the defensin type (PDef-Caj I), composed of 20 amino acids and molecular weight of 2.429 kDa, which was synthesized and modified from the plant species Cajanus cajan and has antimicrobial activity against Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii from susceptible and resistant strains and against Candida albicans, Candida parapsilosis and Cryptococcus neoformans fungi and bacteriostatic activity against susceptible Escherichia coli and Staphyloccocus aureus. The present invention is situated in the fields of microbiology, peptide engineering, drug planning and bioinformatics.
[0002] Desde que o primeiro antibiótico foi descoberto por Alexander Fleming em 1949, o uso inadequado de antibióticos se tornou um fator fundamental para desencadear uma enorme resistência bacteriana e isto tem se tornado um problema de saúde pública mundial reconhecido por organizações internacionais, como as Nações Unidas (ONU) e Organização Mundial da Saúde (OMS), bem como pelos centros de controle de doenças dos EUA e da Europa. Uma ferramenta inovadora surge como uma aliada na luta contra infecções graves causadas por bactérias resistentes a inúmeros fármacos já consolidados no mercado, como é o caso dos peptídeos antimicrobianos (AMPs). Tais compostos são considerados menos suscetíveis ao processo de resistência bacteriana do que os antibióticos tradicionais, apresentando potencial para o desenvolvimento de uma nova classe de agentes terapêuticos (Cândido et al, 2014). Atualmente, tem sido utilizada a colistina, considerada como a última linha de terapia antimicrobiana derivada de AMPs usada contra microrganismos resistentes a múltiplos fármacos (Sierra et al, 2017).[0002] Since the first antibiotic was discovered by Alexander Fleming in 1949, the inappropriate use of antibiotics has become a key factor in triggering massive bacterial resistance and this has become a global public health problem recognized by international organizations such as the United Nations (UN) and World Health Organization (WHO), as well as US and European disease control centers. An innovative tool appears as an ally in the fight against serious infections caused by bacteria resistant to numerous drugs already consolidated on the market, such as antimicrobial peptides (AMPs). Such compounds are considered less susceptible to the process of bacterial resistance than traditional antibiotics, presenting potential for the development of a new class of therapeutic agents (Cândido et al, 2014). Currently, colistin, considered as the last line of AMP-derived antimicrobial therapy used against multi-drug resistant microorganisms, has been used (Sierra et al, 2017).
[0003] Vários testes são realizados com inúmeros tipos de peptídeos que adquiriram valor no mercado farmacêutico por apresentar relevância no tratamento de diversas doenças, como é o caso do acetato de glatirâmero (um peptídeo sintético com quatro aminoácidos, Copaxone) que é utilizado para esclerose múltipla e o Exenatide (um análogo sintético do peptídeo-1 do tipo glucagon, Byetta), utilizado para o diabetes tipo 2. Estes são apenas alguns exemplos de fármacos manipulados que foram obtidos a partir de peptídeos sintéticos previamente isolados e modificados.[0003] Several tests are performed with numerous types of peptides that have acquired value in the pharmaceutical market because they are relevant in the treatment of various diseases, such as glatiramer acetate (a synthetic peptide with four amino acids, Copaxone) which is used for sclerosis multiple and Exenatide (a synthetic analogue of glucagon-like peptide-1, Byetta), used for type 2 diabetes. These are just a few examples of engineered drugs that have been obtained from previously isolated and modified synthetic peptides.
[0004] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:[0004] In the search for the state of the art in scientific and patent literature, the following documents were found dealing with the topic:
[0005] O documento CN107022549 (A) intitulado “Pelteobagrus fulvidraco beta defensin gene, and beta defensin antibacterial peptide and application thereof” revela a aplicação de uma proteína da classe das defensinas modificadas derivadas de peixes da espécie Pelteobagrus fulvidraco como um fármaco antibacteriano de amplo espectro em culturas aquáticas.[0005] The document CN107022549 (A) entitled "Pelteobagrus fulvidraco beta defensin gene, and beta defensin antibacterial peptide and application thereof" reveals the application of a protein of the class of modified defensins derived from fish of the species Pelteobagrus fulvidraco as a broad-based antibacterial drug spectrum in aquatic crops.
[0006] O documento JP2017132755 (A) intitulado “Defensin production promoter, and antibacterial agent” revela a produção de promotores de defensinas e a obtenção de um agente antibacteriano a partir de extratos de plantas[0006] The document JP2017132755 (A) entitled "Defensin production promoter, and antibacterial agent" discloses the production of defensin promoters and obtaining an antibacterial agent from plant extracts
[0007] O documento KR20170023352 (A) intitulado “An antibacterial peptide isolated from Hermetia illucens” revela uma composição antimicrobiana para bactérias gram-positivas.[0007] Document KR20170023352 (A) entitled "An antibacterial peptide isolated from Hermetia illucens" discloses an antimicrobial composition for gram-positive bacteria.
[0008] O documento US2017049102 (A1) intitulado “Agents and methods for treatment of pathogens” revela a exposição de patógenos a quantidades efetivas de uma composição contendo defensina vegetal ou derivado funcional natural ou sintético ou variante destes e um peptídeo nãodefensina, como peptídeo de catelicidina, peptídeo de hairpina, peptídeo de hairpina com ligações dissulfeto removidas, indolicidina, peptídeo sintético CP29 ou um peptídeo derivado de cistatina. A combinação da defensina e do peptídeo tem efeito sinérgico comparado ao uso de cada um isoladamente na mesma dose em que são usados em combinação.[0008] The document US2017049102 (A1) entitled "Agents and methods for treatment of pathogens" reveals the exposure of pathogens to effective amounts of a composition containing plant defensin or natural or synthetic functional derivative or variant thereof and a non-defensin peptide, such as defensin peptide cathelicidin, hairpin peptide, disulfide-removed hairpin peptide, indolicidin, CP29 synthetic peptide, or a cystatin-derived peptide. The combination of defensin and the peptide has a synergistic effect compared to using each alone at the same dose as they are used in combination.
[0009] O documento US2017029842 (A1) intitulado “Modified plant defensins useful as anti-pathogenic agents” revela uma molécula de defensina geneticamente modificada com atividade contra patógenos e o uso de plantas geneticamente modificadas, sua progênie ou partes que expressam ou possuem defensinas modificadas ou composições contra patógenos em horticultura, agricultura e como medicamentos para animais e seres humanos.[0009] The document US2017029842 (A1) entitled "Modified plant defensins useful as anti-pathogenic agents" discloses a genetically modified defensin molecule with activity against pathogens and the use of genetically modified plants, their progeny or parts that express or have modified defensins or compositions against pathogens in horticulture, agriculture and as medicines for animals and humans.
[0010] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, não foram encontrados registros em patentes nacionais.[0010] In the search for the state of the art in scientific and patent literature, no records were found in national patents.
[0011] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.[0011] Thus, from what appears from the researched literature, no documents were found anticipating or suggesting the teachings of the present invention, so that the solution proposed here has novelty and inventive step compared to the state of the art.
[0012] Dessa forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de um novo peptídeo sintético (PDef-Caj I) identificado por análise molecular e de bioinformática que apresentou ação contra algumas das principais bactérias que estão na lista da Organização Mundial da Saúde (OMS) por apresentarem multirresistência aos fármacos convencionais do mercado farmacêutico, possuindo também ação contra alguns fungos que provocam doenças oportunistas principalmente em países tropicais, como Brasil. O PDef-Caj I surge como uma proposta bastante promissora, podendo futuramente tornar-se um novo produto terapêutico, visto que possui características relevantes que possivelmente facilitam a penetração na superfície das células e de microrganismos, podendo exercer, assim, uma rápida ação nos tecidos dos organismos[0012] Thus, the present invention aims to solve the problems contained in the state of the art from a new synthetic peptide (PDef-Caj I) identified by molecular and bioinformatics analysis that showed action against some of the main bacteria that are on the list of the World Health Organization (WHO) for presenting multi-resistance to conventional drugs in the pharmaceutical market, also having action against some fungi that cause opportunistic diseases, mainly in tropical countries, such as Brazil. PDef-Caj I appears as a very promising proposal, and may in the future become a new therapeutic product, as it has relevant characteristics that possibly facilitate penetration into the surface of cells and microorganisms, thus being able to exert a rapid action on tissues of the organisms
[0013] O peptídeo denominado PDef-Caj I passou por um processo de modificação no que diz respeito à redução da quantidade de aminoácidos, pois a sequência inteira identificada possuía 55 aminoácidos e foi reduzida a 20 aminoácidos com o auxílio de ferramentas computacionais, a fim de otimizar a ação contra patógenos. A literatura afirma que quanto menor a sequência de aminoácidos, maior a possível eficácia do peptídeo antimicrobiano, se mantida a sua região de maior atividade biológica.[0013] The peptide called PDef-Caj I underwent a modification process with regard to reducing the amount of amino acids, as the entire identified sequence had 55 amino acids and was reduced to 20 amino acids with the aid of computational tools, in order to optimize the action against pathogens. The literature states that the shorter the amino acid sequence, the greater the possible effectiveness of the antimicrobial peptide, if its region of greatest biological activity is maintained.
[0014] O PDef-Caj I foi obtido a partir de uma sequência de defensina de Cajanus cajan. Para a obtenção do novo peptídeo, dois métodos foram aplicados: (1) redução da sequência de defensina de origem para 20 aminoácidos a partir da região do peptídeo maduro; e (2) obtenção de valores próximos à média estabelecida pelo software para os quatro algoritmos (Support Vector Machine (SVM), Random Forest Classifier (RFC), Artificial Neural Network (ANN), Discriminant Analysis Classifier (DAC)), que foram analisados in silico na predição da atividade antimicrobiana com a ferramenta Predict Antimicrobial Peptides (disponível em http://www.camp.bicnirrh.res.in/predict/). Após a avaliação dos parâmetros, o PDef-Caj I apresentou os melhores resultados como candidato entre as outras possíveis sequências e estruturas conformacionais avaliadas.[0014] PDef-Caj I was obtained from a defensin sequence of Cajanus cajan. To obtain the new peptide, two methods were applied: (1) reduction of the original defensin sequence to 20 amino acids from the region of the mature peptide; and (2) obtaining values close to the mean established by the software for the four algorithms (Support Vector Machine (SVM), Random Forest Classifier (RFC), Artificial Neural Network (ANN), Discriminant Analysis Classifier (DAC)), which were analyzed in silico in predicting antimicrobial activity with the Predict Antimicrobial Peptides tool (available at http://www.camp.bicnirrh.res.in/predict/). After evaluating the parameters, PDef-Caj I presented the best results as a candidate among the other possible sequences and conformational structures evaluated.
[0015] Em um primeiro objeto, a presente invenção define um peptídeo sintético, o dito peptídeo compreendendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade da SEQ ID Nº 1.[0015] In a first object, the present invention defines a synthetic peptide, said peptide comprising a sequence with at least 90% identity of SEQ ID No. 1.
[0016] Em um segundo objeto, a presente invenção define um processo de obtenção do peptídeo modificado sintético, o processo compreendendo as seguintes etapas:
- (a) Obtenção de uma sequência de defensina de Cajanus cajan;
- (b) Redução do peptídeo de origem para 20 aminoácidos a partir da região do peptídeo maduro; e
- (c) Adição de cinco resíduos de Arginina (R) e quatro resíduos de Cisteína (C)
- (a) Obtaining a defensin sequence from Cajanus cajan;
- (b) Reduction of the source peptide to 20 amino acids from the mature peptide region; and
- (c) Addition of five Arginine (R) and four Cysteine (C) residues
[0017] Em um terceiro objeto, a presente invenção define o uso do dito peptídeo sintético na preparação de um agente antimicrobiano.[0017] In a third object, the present invention defines the use of said synthetic peptide in the preparation of an antimicrobial agent.
[0018] Em um quarto objeto, a presente invenção define o uso do dito peptídeo sintético para preparação de uma formulação de uso tópico para combater infecções fúngicas ou em medicamentos para combater bactérias gram-positivas e gram-negativas.[0018] In a fourth object, the present invention defines the use of said synthetic peptide for the preparation of a formulation for topical use to combat fungal infections or in drugs to combat gram-positive and gram-negative bacteria.
[0019] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados se referem a um novo peptídeo antimicrobiano sintético do tipo defensina (PDef-Caj I), composto por 20 aminoácidos e peso molecular de 2,429 kDa, que foi sintetizado e modificado a partir da espécie vegetal Cajanus cajan e possui atividade antimicrobiana contra bactérias gramnegativas e gram-positivas de cepas suscetíveis e resistentes e contra fungos causadores de doenças oportunistas em países tropicais e atividade bacteriostática contra Escherichia coli e Staphyloccocus aureus suscetíveis[0019] Still, the inventive concept common to all claimed protection contexts refers to a new synthetic antimicrobial peptide of the defensin type (PDef-Caj I), composed of 20 amino acids and molecular weight of 2.429 kDa, which was synthesized and modified from the plant species Cajanus cajan and has antimicrobial activity against gram-negative and gram-positive bacteria of susceptible and resistant strains and against fungi causing opportunistic diseases in tropical countries and bacteriostatic activity against susceptible Escherichia coli and Staphyloccocus aureus
[0020] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.[0020] These and other objects of the invention will be immediately valued by experts in the art and by companies with interests in the segment, and will be described in sufficient detail for their reproduction in the description below.
[0021] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente são apresentadas as presente figuras:[0021] In order to better define and clarify the content of this patent application, the following figures are presented:
[0022] A figura 1 mostra o alinhamento múltiplo do domínio conservado (Gama-thionin) de defensinas identificadas em Cajanus cajan. As linhas em preto acima do alinhamento predizem as possíveis pontes dissulfeto indicadas pelo Disulfind e DIANNA. Em azul, estão representadas as regiões conservadas dentro do peptídeo maduro. Abaixo do alinhamento encontra-se a predição da estrutura secundária onde é possível observar três folhas-beta (setas em lilás) e uma alfa hélice (espiral em verde). Abaixo da estrutura secundária encontram-se o gráfico de conservação e a sequência-consenso do alinhamento.[0022] Figure 1 shows the multiple alignment of the conserved domain (Gama-thionin) of defensins identified in Cajanus cajan. The black lines above the alignment predict the possible disulfide bridges indicated by Disulfind and DIANNA. In blue, conserved regions within the mature peptide are represented. Below the alignment is the prediction of the secondary structure where it is possible to observe three beta-leaves (purple arrows) and an alpha helix (green spiral). Below the secondary structure are the conservation graph and the alignment consensus sequence.
[0023] A figura 2 mostra o modelo tridimensional do PDef-Caj I composto de duas folhas β antiparalelas (em amarelo), estabilizadas por duas ligações dissulfeto. As ligações dissulfeto ajudam a dar estabilidade à estrutura do peptídeo, favorecendo sua atividade antimicrobiana.[0023] Figure 2 shows the three-dimensional model of PDef-Caj I composed of two antiparallel β sheets (in yellow), stabilized by two disulfide bonds. Disulfide bonds help to give stability to the peptide structure, favoring its antimicrobial activity.
[0024] A figura 3 apresenta o gráfico do RMSD (desvio da raiz quadrada média) do PDef-Caj I ao longo de 100 ns de dinâmica molecular. Em vermelho a conformação adotada pela sequência do PDef-Caj I.[0024] Figure 3 presents the graph of the RMSD (deviation from the mean square) of the PDef-Caj I over 100 ns of molecular dynamics. In red the conformation adopted by the PDef-Caj I sequence.
[0025] A figura 4 mostra o teste de viabilidade celular do PDef-Caj I contra células de macrófagos de ratos.Figure 4 shows the cell viability test of PDef-Caj I against mouse macrophage cells.
[0026] A figura 5 mostra o resultado do teste de hemólise do PDef-Caj I contra eritrócitos humanos, em que pode-se perceber que não ocorre lise em eritrócitos humanos[0026] Figure 5 shows the result of the hemolysis test of PDef-Caj I against human erythrocytes, in which it can be seen that lysis does not occur in human erythrocytes
[0027] A figura 6 mostra o teste de cinética bacteriana do PDef-Caj I, em que pode-se notar uma inibição de 100% da bactéria Gram-negativa E. coli ATCC pelo peptídeo PDef-Caj I. O peptídeo também foi testado contra S. aureus ATCC onde houve inibição de 50% no tempo de 4 h. Com este ensaio, verificou-se que o peptídeo sintetizado teve uma ação bacteriostática no tempo analisado na concentração de 10 µg/mL. *PEP – Pdef-Caj I; *S.a. – Staphyloccocus aureus; *E.c. – Escherichia coli; *Cont = controle.[0027] Figure 6 shows the bacterial kinetics test of PDef-Caj I, in which a 100% inhibition of Gram-negative E. coli ATCC bacteria by the PDef-Caj I peptide can be noted. The peptide was also tested against S. aureus ATCC where there was 50% inhibition at 4 h. With this assay, it was verified that the synthesized peptide had a bacteriostatic action in the analyzed time at the concentration of 10 µg/mL. *PEP – Pdef-Caj I; *S.a. – Staphyloccocus aureus; *E.c. – Escherichia coli; *Count = control.
[0028] A figura 7 mostra o resultado da espectrometria de massas referente ao PDef-Caj I sintetizado, seu peso molecular de 2,429 kDa e a pureza obtida >95 %.[0028] Figure 7 shows the result of mass spectrometry referring to the synthesized PDef-Caj I, its molecular weight of 2.429 kDa and the obtained purity >95%.
[0029] Em um primeiro objeto, a presente invenção define um peptídeo sintético, o dito peptídeo compreendendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade da SEQ ID Nº 1.[0029] In a first object, the present invention defines a synthetic peptide, said peptide comprising a sequence with at least 90% identity of SEQ ID No. 1.
[0030] Em uma concretização, o peptídeo sintético consiste de uma sequência com pelo menos 90% de identidade da sequência SEQ ID Nº 1[0030] In one embodiment, the synthetic peptide consists of a sequence with at least 90% sequence identity SEQ ID No. 1
[0031] Em uma concretização, o peptídeo sintético compreende uma sequência da SEQ ID Nº 1.[0031] In one embodiment, the synthetic peptide comprises a sequence of SEQ ID No. 1.
[0032] Em uma concretização, o peptídeo sintético consiste de uma sequência da SEQ ID Nº 1.[0032] In one embodiment, the synthetic peptide consists of a sequence of SEQ ID No. 1.
[0033] Em um segundo objeto, a presente invenção define um processo de obtenção do peptídeo modificado sintético, o processo compreendendo as seguintes etapas:
- (a) Obtenção de uma sequência de defensina de Cajanus cajan;
- (b) Redução do peptídeo de origem para 20 aminoácidos a partir da região do peptídeo maduro; e
- (c) Adição de cinco resíduos de Arginina (R) e quatro resíduos de Cisteína (C).
- (a) Obtaining a defensin sequence from Cajanus cajan;
- (b) Reduction of the source peptide to 20 amino acids from the mature peptide region; and
- (c) Addition of five Arginine (R) and four Cysteine (C) residues.
[0034] Em um terceiro objeto, a presente invenção define o uso do dito peptídeo sintético na preparação de um agente antimicrobiano.[0034] In a third object, the present invention defines the use of said synthetic peptide in the preparation of an antimicrobial agent.
[0035] Em um quarto objeto, a presente invenção define o uso do dito peptídeo sintético para preparação de uma formulação de uso tópico para combater infecções fúngicas ou em medicamentos para combater bactérias gram-positivas e gram-negativas.[0035] In a fourth object, the present invention defines the use of said synthetic peptide for the preparation of a formulation for topical use to combat fungal infections or in drugs to combat gram-positive and gram-negative bacteria.
[0036] O peptídeo denominado PDef-Caj I apresenta potencial para uso terapêutico, visto que mostrou atividade contra microrganismos de relevante interesse para a saúde pública, partindo do princípio que o mundo enfrenta um cenário da era pós antibiótico ocasionado pelo processo de resistência aos fármacos comercializados e de doenças oportunistas causadas por fungos, necessitando de novos fármacos para substituição. O peptídeo denominado PDef-Caj I é inovador por ter sido identificado a partir de uma planta e modificado por ferramentas computacionais a fim de melhorar sua ação, penetração e efeito, mostrando ser possível identificar através das plantas outras moléculas com atividade antimicrobiana e diversas atividades a serem exploradas. A sua confiabilidade foi comprovada através dos testes de viabilidade celular (MTT) e hemólise, onde foi verificado o possível uso frente às células humanas. A partir de ensaios de concentração mínima inibitória (MIC) e concentração bactericida mínima (MBC), verifica-se que o PDef-Caj I tem uma ação contra alguns dos microrganismos testados por até 24 h e 48 h (para os fungos).[0036] The peptide called PDef-Caj I has potential for therapeutic use, as it showed activity against microorganisms of relevant interest to public health, assuming that the world faces a scenario of the post antibiotic era caused by the process of drug resistance marketed and opportunistic diseases caused by fungi, requiring new drugs for replacement. The peptide called PDef-Caj I is innovative because it was identified from a plant and modified by computational tools in order to improve its action, penetration and effect, showing that it is possible to identify other molecules with antimicrobial activity and various activities through plants. be explored. Its reliability was proven through cell viability tests (MTT) and hemolysis, where the possible use against human cells was verified. From minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) tests, it appears that PDef-Caj I has an action against some of the microorganisms tested for up to 24 h and 48 h (for fungi).
[0037] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.[0037] The examples shown here are intended only to exemplify one of the numerous ways to carry out the invention, however without limiting the scope of the same.
[0038] A fim de verificar a concentração mínima inibitória (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM), o peptídeo reduzido e sintetizado a partir de uma defensina de Cajanuns cajan (PDef-Caj I) foi submetido a ensaios bacterianos e antifúngicos. Os resultados estão apresentados na tabela 1.[0038] In order to verify the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (CBM), the reduced peptide synthesized from a Cajanuns cajan defensin (PDef-Caj I) was submitted to bacterial and antifungal assays. The results are shown in table 1.
[0039] A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) contra PDef-Caj I foram determinadas pelo método de microdiluição em caldo seguindo as recomendações do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI, 2015) com modificações. Para isso, o PDef-Caj I em Cation-adjusted Müeller-Hinton broth (CA-MHB) (Sigma) foi adicionado à placa sob diluição em série (50 μL). Resumidamente, as células bacterianas foram cultivadas em Müller Hinton (Himedia) com 1 mL de CA-MHB durante a noite a 37 °C e foram determinadas pela densidade de oxigênio dissolvido (OD625nn de 0,08-0,13 AU) correspondente a 0,5 da escala McFarland (1-5 × 108 CFU.mL-1). A solução foi diluída (1:1000) em CA-MHB e inoculada nos poços da placa de microdiluição (50 μL) para que a concentração final de densidade bacteriana fosse de aproximadamente 1-5 × 105 UFC.mL-1. Determinaram-se as MIC como a menor concentração de peptídeo que inibiu o crescimento bacteriano após incubação a 37 °C durante 18 a 20 h, sendo utilizado o meio CA-MHB não inoculado como controle negativo e as culturas sem adição de peptídeo serviram como controle positivo.[0039] The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (CBM) against PDef-Caj I were determined by the broth microdilution method following the recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015) with modifications. For this, PDef-Caj I in Cation-adjusted Müeller-Hinton broth (CA-MHB) (Sigma) was added to the plate under serial dilution (50 μL). Briefly, bacterial cells were cultured in Müller Hinton (Himedia) with 1 mL of CA-MHB overnight at 37 °C and were determined by dissolved oxygen density (OD625nn of 0.08-0.13 AU) corresponding to 0 .5 of the McFarland scale (1-5 × 108 CFU.mL-1). The solution was diluted (1:1000) in CA-MHB and inoculated into the wells of the microdilution plate (50 μL) so that the final concentration of bacterial density was approximately 1-5 × 105 CFU.mL-1. The MICs were determined as the lowest concentration of peptide that inhibited bacterial growth after incubation at 37 °C for 18 to 20 h. The uninoculated CA-MHB medium was used as a negative control and cultures without the addition of peptide served as a control positive.
[0040] Para o MBC, foi realizado o plaqueamento de 10 μL de cada poço, que não apresentou crescimento visível na placa do MH e incubado por 24 horas a 37 °C, e o MBC foi considerado a concentração que não apresentou crescimento bacteriano. As cepas bacterianas utilizadas no experimento foram fornecidas pelo laboratório de microbiologia do Instituto Aggeu Magalhães (Fiocruz/PE). O PDef-Caj I foi testado contra as cepas Gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC 25923 e resistente S. aureus MRSA04673 e Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, P. aeruginosa resistente Pa_39 e Klebisiella pneumoniae ATCC 13883 e K. pneumoniae resistentes a Carbapenemase, Acinetobacter baumannii ATCC 19606 e A. baumannii resistente a Acb 45, respectivamente. Os experimentos foram realizados em duplicatas em diferentes intervalos de tempo.[0040] For the MBC, 10 μL of each well was plated, which did not show visible growth on the MH plate and incubated for 24 hours at 37 °C, and the MBC was considered the concentration that did not show bacterial growth. The bacterial strains used in the experiment were supplied by the microbiology laboratory of the Instituto Aggeu Magalhães (Fiocruz/PE). PDef-Caj I was tested against Gram-positive Staphylococcus aureus ATCC 25923 and resistant S. aureus MRSA04673 and Gram-negative Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, resistant P. aeruginosa Pa_39 and Klebisiella pneumoniae ATCC 13883 and K. pneumoniae resistant to K. pneumoniae. Acinetobacter baumannii ATCC 19606 and A. baumannii resistant to Acb 45, respectively. The experiments were performed in duplicates at different time intervals.
[0041] A CIM antifúngica foi realizada seguindo as diretrizes do CLSI M27-A3 (2008). O PDef-Caj I foi diluído em água destilada. O antifúngico comercial Fluconazol® foi utilizado como referência e a linhagem Candida parapsilosis ATCC 22019 como levedura padrão. As leveduras foram cultivadas em Dextrose Agar Sabouraud (SDA; Difco) e incubadas durante 48 h a 37 °C. Para as leveduras, foram realizadas duas diluições seriadas de 1:100 e 1:20 para obtenção do inóculo final contendo 1,0 a 5,0 x 106 UFC.mL-1. Esta solução foi inoculada em toda a placa de 96 poços contendo meio de cultura padrão RPMI 1640, tamponado a pH 7,0 com 0,1 M de ácido morfolinopropanosulfônico (MOPS), para obter a concentração final de 512 μg.mL-1 para cada levedura testada. As leveduras foram incubadas a 37 °C e visualizadas 24 e 48h depois.[0041] Antifungal CIM was performed following CLSI M27-A3 (2008) guidelines. PDef-Caj I was diluted in distilled water. The commercial antifungal Fluconazol® was used as a reference and the Candida parapsilosis ATCC 22019 strain was used as a standard yeast. Yeasts were grown on Dextrose Agar Sabouraud (SDA; Difco) and incubated for 48 h at 37 °C. For yeasts, two serial dilutions of 1:100 and 1:20 were performed to obtain the final inoculum containing 1.0 to 5.0 x 106 CFU.mL-1. This solution was inoculated into the entire 96-well plate containing RPMI 1640 standard culture medium, buffered at pH 7.0 with 0.1 M morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), to obtain a final concentration of 512 μg.mL-1 for each yeast tested. Yeasts were incubated at 37°C and visualized 24 and 48h later.
[0042] Os fungos utilizados no experimento foram provenientes da micoteca-URM localizada no Departamento de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco, sendo Candida albicans 4986, Candida parapsilosis 4970 e Cryptococcus neoformans 5980 resistentes a múltiplas drogas, incluindo cepas de origem clínica. As CIMs corresponderam às menores concentrações de fármaco que apresentaram inibição do crescimento em comparação com fungos não tratados.
[0043] A atividade citotóxica de PDef-Caj I foi avaliada a partir das células do exsudato peritoneal de camundongos, fornecidas pelo laboratório de microbiologia do Instituto Aggeu Magalhães (Fiocruz-PE). Para isso, as células foram semeadas em placas de 96 poços contendo meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute), sem vermelho de fenol, suplementado com 10 % de Soro Fetal Bovino (FBS) e incubadas por 24 h a 37 °C em atmosfera de 5 % de CO2. Cinco diluições seriadas de PDef-Caj I foram realizadas a partir de 1024 μg.mL1. As células cultivadas foram também utilizadas na ausência dos compostos, mas mantidas sob as mesmas condições, como 100 % de controle de viabilidade celular. Após 24 h o meio foi removido e as células foram tratadas na presença das diferentes concentrações de PDef-Caj I e incubadas a 37 °C com 5 % de CO2 durante 24 h. Após o período de incubação, o efeito de PDefCaj I foi determinado pela medida da atividade desidrogenase mitocondrial, adicionando-se 10 μl por poço de MTT (3-(5,4-dimetil-tizol-2-I)-2-5-tretracil) e incubando a 37 °C durante 3 horas. Em seguida, os cristais de formazan foram solubilizados em DMSO e a absorbância foi determinada em espectrofotômetro a 540 nm. A concentração capaz de matar 50 % das células (CC50) foi calculada por regressão linear. Poços contendo meio e MTT foram utilizados como controle de reação. Cada concentração de PDef-Caj I, bem como o controle sem o composto, foi avaliada em quadruplicata em dois experimentos independentes.[0043] The cytotoxic activity of PDef-Caj I was evaluated from the peritoneal exudate cells of mice, provided by the microbiology laboratory of the Instituto Aggeu Magalhães (Fiocruz-PE). For this purpose, cells were seeded in 96-well plates containing RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute), without phenol red, supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and incubated for 24 h at 37 °C in an atmosphere of 5 % CO2. Five serial dilutions of PDef-Caj I were carried out from 1024 μg.mL1. Cultured cells were also used in the absence of compounds, but kept under the same conditions as 100% cell viability control. After 24 h the medium was removed and the cells were treated in the presence of the different concentrations of PDef-Caj I and incubated at 37°C with 5% CO2 for 24 h. After the incubation period, the effect of PDefCaj I was determined by measuring the mitochondrial dehydrogenase activity, adding 10 μl per well of MTT (3-(5,4-dimethyl-thizol-2-I)-2-5- tretracil) and incubating at 37°C for 3 hours. Then, the formazan crystals were solubilized in DMSO and the absorbance was determined in a spectrophotometer at 540 nm. The concentration capable of killing 50% of the cells (CC50) was calculated by linear regression. Wells containing medium and MTT were used as reaction control. Each concentration of PDef-Caj I, as well as the control without the compound, was evaluated in quadruplicate in two independent experiments.
[0044] O teste de viabilidade celular (Tabela 2 – MTT) apresentou capacidade de proliferação celular na presença de PDef-Caj I na concentração de até 244,33 µg/mL, sendo que a partir da desta concentração o peptídeo inibiu a atividade celular em relação ao controle testado. O teste de hemólise mostrou que não houve lise nos eritrócitos humanos na presença do PDef-Caj I em relação ao controle testado.[0044] The cell viability test (Table 2 - MTT) showed cell proliferation capacity in the presence of PDef-Caj I at a concentration of up to 244.33 µg/mL, and from this concentration the peptide inhibited cell activity in relation to the tested control. The hemolysis test showed that there was no lysis in human erythrocytes in the presence of PDef-Caj I compared to the tested control.
[0045] A atividade hemolítica de PDef-Caj I foi medida pela quantidade de hemoglobina liberada pela lise de eritrócitos humanos. Células humanas foram suspensas em solução salina a 2 % (NaCl a 0,85 % + CaCl2) e incubadas em placas de 96 poços com diferentes concentrações de PDef-Caj I (512 a 32 μg.mL-1). As placas foram incubadas durante um período de 3 horas a 37 °C sob agitação constante e centrifugadas a 3500 rpm durante 4 min a 4 °C e a absorbância do sobrenadante medida a 540 nm para estabelecer a percentagem de hemólise. Como controle positivo da lise celular, 1 % de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, EUA) e solução salina (0,85 % NaCl + 10 mM CaCl2) foram utilizados como controle negativo. Os experimentos foram realizados em quadruplicata, com repetição em diferentes intervalos de tempo. Os resultados foram expressos como porcentagem da hemólise determinada pela equação: 
[0046] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas[0046] Those skilled in the art will value the knowledge presented herein and may reproduce the invention in the presented modalities and in other variants, covered in the scope of the attached claims
Claims (7)
- (a) Obtenção de uma sequência de defensina de Cajanus cajan;
- (b) Redução do peptídeo de origem para 20 aminoácidos a partir da região do peptídeo maduro; e
- (c) Adição de cinco resíduos de Arginina (R) e quatro resíduos de Cisteína (C).
- (a) Obtaining a defensin sequence from Cajanus cajan;
- (b) Reduction of the source peptide to 20 amino acids from the mature peptide region; and
- (c) Addition of five Arginine (R) and four Cysteine (C) residues.
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