BR102019000359A2

BR102019000359A2 - IN VITRO METHOD FOR MONITORING THE PROGRESSION OF AN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE, USE OF THE COMBINATION OF CD3/CD8/CD62L SURFACE T-LYMPHOCYTES RECEPTORS AND KIT FOR MONITORING THE PROGRESSION OF AN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

Info

Publication number: BR102019000359A2
Application number: BR102019000359-6A
Authority: BR
Inventors: Karina Inacio Ladislau De Carvalho
Original assignee: Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2021-11-16

Abstract

método in vitro para monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, uso da combinação dos receptores de superfície cd3/cd8/cd62l de linfócitos t e kit para monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal. a presente invenção se refere a um método in vitro para monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, em particular, da doença de crohn, que compreende a quantificação da subpopulação linfocitária cd3+/cd8+/cd62l+ em uma amostra de sangue periférico de um paciente, ao uso da combinação dos ditos receptores de superfície de linfócitos t como um marcador biológico e a um kit para monitoramento da progressão de uma doença intestinal, tal como a doença de crohn.in vitro method for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, use of the combination of cd3/cd8/cd62l surface receptors on t lymphocytes and a kit for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease. The present invention relates to an in vitro method for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, in particular, Crohn's disease, which comprises quantifying the cd3+/cd8+/cd62l+ lymphocyte subpopulation in a peripheral blood sample from a patient, to the use of the combination of said t-lymphocyte surface receptors as a biological marker and to a kit for monitoring the progression of an intestinal disease, such as Crohn's disease.

Description

IN VITRO METHOD FOR MONITORING THE PROGRESSION OF AN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE, USE OF THE COMBINATION OF CD3/CD8/CD62L SURFACE T-LYMPHOCYTES RECEPTORS AND KIT FOR MONITORING THE PROGRESSION OF AN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

FIELD OF INVENTION

[001] A presente invenção se refere a um método in vitro para monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, em particular, da doença de Crohn, que compreende a quantificação da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ em uma amostra de sangue periférico de um paciente, ao uso da combinação dos ditos receptores de superfície de linfócitos T como um marcador biológico e a um kit para monitoramento da progressão de uma doença intestinal, tal como a doença de Crohn.[001] The present invention relates to an in vitro method for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, in particular, Crohn's disease, which comprises the quantification of the lymphocyte CD3+/CD8+/CD62L+ subpopulation in a peripheral blood sample from a patient using a combination of said T lymphocyte surface receptors as a biological marker and a kit for monitoring the progression of an intestinal disease such as Crohn's disease.

BACKGROUND OF THE INVENTION

[002] O trato gastrointestinal é composto por uma camada simples de células epitelias que separa o lúmen intestinal dos tecidos convencionais e o sistema imune. Por representar uma porta de entrada ao organismo, o trato intestinal está constantemente exposto a antígenos do meio ambiente, além de abrigar cerca de 1014 bactérias comensais. Portanto, o sistema imune é confrontado com a difícil tarefa de aumentar a tolerância a antígenos inofensivos e, paralelamente, proteger o organismo contra patógenos invasores.[002] The gastrointestinal tract is composed of a simple layer of epithelial cells that separates the intestinal lumen from conventional tissues and the immune system. As it represents a gateway to the organism, the intestinal tract is constantly exposed to antigens from the environment, in addition to harboring around 1014 commensal bacteria. Therefore, the immune system is faced with the difficult task of increasing tolerance to harmless antigens and, at the same time, protecting the organism against invading pathogens.

[003] Uma inapropriada e contínua resposta inflamatória frente à microbiota comensal do trato caracteriza as Doenças Inflamatórias Intestinais. Nessas doenças, percebe-se uma liberação espontânea de citocinas próinflamatórias que levam a alterações da homeostase da mucosa.[003] An inappropriate and continuous inflammatory response to the commensal tract microbiota characterizes the Inflammatory Bowel Diseases. In these diseases, there is a spontaneous release of proinflammatory cytokines that lead to changes in mucosal homeostasis.

[004] Dentre as doenças inflamatórias intestinais, a doença de Crohn tem recebido especial atenção em virtude do aumento de sua incidência nos últimos anos. Em algumas áreas dos Estados Unidos, esta incidência chega em torno de 7 a 8 milhões de casos por ano e, na Europa, vem crescendo o número de adultos diagnosticados.[004] Among the inflammatory bowel diseases, Crohn's disease has received special attention due to the increase in its incidence in recent years. In some areas of the United States, this incidence reaches around 7 to 8 million cases per year and, in Europe, the number of diagnosed adults is increasing.

[005] A doença de Crohn é caracterizada por um processo inflamatório crônico recidivante do trato gastrointestinal, que pode comprometer todo o tubo digestivo, com invasão de todas as camadas da parede intestinal. Embora a patogênese permaneça desconhecida, acredita-se que a ativação crônica de células do sistema imune, a alteração da cascata inflamatória e a suscetibilidade genética dos indivíduos, acompanhados de componentes não conhecidos da microflora intestinal, podem participar ativamente da patogênese desta doença.[005] Crohn's disease is characterized by a chronic relapsing inflammatory process of the gastrointestinal tract, which can compromise the entire digestive tract, with invasion of all layers of the intestinal wall. Although the pathogenesis remains unknown, it is believed that the chronic activation of cells of the immune system, the alteration of the inflammatory cascade and the genetic susceptibility of individuals, accompanied by unknown components of the intestinal microflora, may actively participate in the pathogenesis of this disease.

[006] Os medicamentos biológicos têm sido, com sucesso, cada vez mais indicados no tratamento da doença de Crohn, seja pela gravidade da doença, seja pelo aumento do número de casos, e representam hoje uma das mais promissoras armas terapêuticas para o tratamento desta patologia. Ocorre, contudo, que pela sua própria natureza, a droga biológica favorece o desenvolvimento de anticorpos pelo paciente, e, como consequência, a diminuição da sua eficácia terapêutica. Isso porque os anticorpos produzidos contra a droga biológica a inativam, diminuindo suas concentrações plasmáticas e, assim, a sua eficácia.[006] Biological drugs have been, with success, increasingly indicated in the treatment of Crohn's disease, whether due to the severity of the disease or the increase in the number of cases, and represent today one of the most promising therapeutic weapons for the treatment of this disease. pathology. However, by its very nature, the biological drug favors the development of antibodies by the patient, and, as a consequence, the reduction of its therapeutic efficacy. This is because the antibodies produced against the biological drug inactivate it, decreasing its plasmatic concentrations and, thus, its effectiveness.

[007] Os inibidores de Fator de necrose tumoral alfa (anti-TNF-α), incluindo infliximabe e adalimumabe, têm oferecido avanços significativos no tratamento da doença de Crohn. Vários ensaios clínicos randomizados e controlados têm demonstrado a eficácia de ambas as drogas biológicas na indução e manutenção da remissão da doença de Crohn. Tanto infliximabe quanto adalimumabe são anticorpos que se ligam com alta afinidade ao TNF-α, comprometendo a ligação dessa citocina ao seu receptor e promovendo a lise de células que a expressam em sua superfície.[007] Tumor Necrosis Factor alpha (anti-TNF-α) inhibitors, including infliximab and adalimumab, have offered significant advances in the treatment of Crohn's disease. Several randomized controlled clinical trials have demonstrated the effectiveness of both biological drugs in inducing and maintaining remission of Crohn's disease. Both infliximab and adalimumab are antibodies that bind with high affinity to TNF-α, compromising the binding of this cytokine to its receptor and promoting the lysis of cells that express it on its surface.

[008] A doença de Crohn é caracterizada principalmente pela presença de citocinas do tipo Th1, tais como interleucina 12 (IL-12) e interferon gama (IFN-γ) e TNF-α. Pesquisas recentes mostram que este perfil de citocinas e da resposta imunológica dependem de outros fatores. É sabido que, no momento da atividade da doença, ocorre uma infiltração na lâmina própria de células imunes inatas e adaptativas, levando ao aumento do número e perfil ativado destas células no local da inflamação. Portanto, a resposta imune inicial na microbiota intestinal é regulada de uma maneira tênue, e esta regulação determina a tolerância imunológica ou a resposta inflamatória do paciente.[008] Crohn's disease is mainly characterized by the presence of Th1 type cytokines, such as interleukin 12 (IL-12) and interferon gamma (IFN-γ) and TNF-α. Recent research shows that this cytokine profile and immune response depend on other factors. It is known that, at the time of disease activity, innate and adaptive immune cells infiltrate the lamina propria, leading to an increase in the number and activated profile of these cells at the site of inflammation. Therefore, the initial immune response in the intestinal microbiota is finely regulated, and this regulation determines the patient's immune tolerance or inflammatory response.

[009] A imunidade inata promove uma resposta inicial rápida aos patógenos e constitui a primeira linha de defesa do organismo. Já a imunidade adaptativa (ou adquirida) é uma resposta específica mediada pelos linfócitos B e T, e desencadeada pela apresentação pelas células do sistema imune de receptores que reconhecem certos padrões microbianos. Os linfócitos T CD4+ e todos seus subtipos (Th1, Th2, Th17 e T regulatórios) são capazes de secretar diversas citocinas, mantendo a homeostase da imunologia intestinal.[009] Innate immunity promotes a rapid initial response to pathogens and constitutes the body's first line of defense. Adaptive (or acquired) immunity, on the other hand, is a specific response mediated by B and T lymphocytes, and triggered by the presentation by cells of the immune system of receptors that recognize certain microbial patterns. CD4+ T lymphocytes and all their subtypes (Th1, Th2, Th17 and regulatory T) are capable of secreting several cytokines, maintaining the homeostasis of intestinal immunology.

[0010] São vários os mecanismos envolvidos na regulação da homeostase intestinal, sendo que a quebra deste equilíbrio pode desencadear o processo inflamatório crônico das doenças inflamatórias intestinais, entre elas, a doença de Crohn.[0010] There are several mechanisms involved in the regulation of intestinal homeostasis, and the disruption of this balance can trigger the chronic inflammatory process of inflammatory bowel diseases, including Crohn's disease.

[0011] Métodos de diagnóstico e tratamento de doenças inflamatórias intestinais utilizando marcadores de superfície de linfócitos T ativos foram descritos no estado da técnica. O documento WO 2007/133147 ensina um método de tratamento baseado na imobilização de anticorpos contra marcadores de superfície de linfócitos T em uma coluna de filtração por onde passa parte do sangue periférico do paciente. Em WO 2015/158857, é descrito um método de identificação de células T regulatórias (Treg) CD4+ para uso como material de partida na imunoterapia celular.[0011] Methods of diagnosis and treatment of inflammatory bowel diseases using surface markers of active T lymphocytes have been described in the prior art. The document WO 2007/133147 teaches a treatment method based on the immobilization of antibodies against T lymphocyte surface markers in a filtration column through which part of the patient's peripheral blood passes. In WO 2015/158857, a method of identifying CD4+ regulatory T cells (Treg) for use as starting material in cell immunotherapy is described.

[0012] O documento WO 2014/122467 descreve equipamentos, sistemas e métodos para a detecção em tempo real de doenças por meio de biomoléculas, particularmente, no contexto do tratamento de câncer. Já WO 2014/179202 ensina um método de diagnóstico da doença celíaca a partir da detecção de linfócitos T αβ CD8+ e linfócitos T γδ no sangue periférico de um indivíduo.[0012] The document WO 2014/122467 describes equipment, systems and methods for real-time detection of diseases by means of biomolecules, particularly in the context of cancer treatment. WO 2014/179202 already teaches a method of diagnosing celiac disease from the detection of αβ CD8+ T lymphocytes and γδ T lymphocytes in the peripheral blood of an individual.

[0013] Contudo, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve o uso, método e/ou kit para o monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, tal como a doença de Crohn, a partir de marcadores de superfície celular em linfócitos T CD3+/CD8+/CD62+.[0013] However, none of the prior art documents describe the use, method and/or kit for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, such as Crohn's disease, from cell surface markers on CD3+ T lymphocytes /CD8+/CD62+.

[0014] Assim sendo, surpreendentemente foi descoberto que o aumento da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62+ no sangue periférico se correlaciona com a progressão de uma doença inflamatória crônica, como a doença de Crohn. Em vista disso, a presente invenção fornece um método simples e rápido de monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, permitindo ao médico tomar uma decisão imediata e assertiva acerca da eventual necessidade de alteração ou até mesmo suspensão do tratamento do paciente.Therefore, it has surprisingly been found that the increase in the CD3+/CD8+/CD62+ lymphocyte subpopulation in the peripheral blood correlates with the progression of a chronic inflammatory disease such as Crohn's disease. In view of this, the present invention provides a simple and rapid method of monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, allowing the physician to make an immediate and assertive decision about the eventual need for changing or even suspending the patient's treatment.

[0015] A importância da presente invenção deriva, principalmente, do fato de que os exames e testes clínicos convencionalmente usados para o monitoramento de doenças inflamatórias intestinais, tais como a colonoscopia e o teste de calprotectina fecal por imunoensaio de enzima (ELISA) serem invasivos, complexos, mais caros e não estarem disponíveis em todos os laboratórios de análise públicos e/ou privados.[0015] The importance of the present invention derives mainly from the fact that the examinations and clinical tests conventionally used for the monitoring of inflammatory bowel diseases, such as colonoscopy and the fecal enzyme immunoassay (ELISA) calprotectin test are invasive , complex, more expensive and not available in all public and/or private analytical laboratories.

[0016] A adoção de um teste laboratorial mais simples, realizado a partir de uma amostra de sangue total periférico de um paciente, como ocorre na quantificação da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62+ da presente invenção, permite otimizar e universalizar os métodos de monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, como a doença de Crohn.[0016] The adoption of a simpler laboratory test, performed from a sample of peripheral whole blood from a patient, as in the quantification of the CD3+/CD8+/CD62+ lymphocyte subpopulation of the present invention, allows to optimize and universalize the monitoring methods progression of an inflammatory bowel disease such as Crohn's disease.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0017] A presente invenção revela um inventivo método in vitro para monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal, em particular, da doença de Crohn, compreendendo as etapas de (a) quantificar a subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ em uma amostra de sangue total periférico e (b) comparar o resultado obtido na etapa (a) com um valor de referência e o uso da combinação dos receptores de superfície CD3/CD8/CD62L de linfócitos T como um marcador biológico da progressão.[0017] The present invention discloses an inventive in vitro method for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, in particular Crohn's disease, comprising the steps of (a) quantifying the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation in a sample of peripheral whole blood and (b) compare the result obtained in step (a) with a reference value and the use of the combination of CD3/CD8/CD62L surface receptors of T lymphocytes as a biological marker of progression.

[0018] Um terceiro objeto da presente invenção se refere a um kit para monitorar a progressão de uma doença inflamatória intestinal, em particular, da doença de Crohn, compreendendo anticorpos monoclonais de superfície anti-CD3, anti-CD8 e anti-CD62L para a quantificação da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ em uma amostra de sangue total periférico.[0018] A third object of the present invention relates to a kit for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease, in particular Crohn's disease, comprising anti-CD3, anti-CD8 and anti-CD62L surface monoclonal antibodies for quantification of CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation in a peripheral whole blood sample.

[0019] Ao contrário dos biomarcadores do estado da técnico, a presente invenção fornece um método e um kit para monitorar a progressão de uma doença inflamatória intestinal como, por exemplo, a doença de Crohn, que é mais simples e mais barato, e que permite ao médico tomar decisões rápidas acerca do tratamento do paciente antes do agravamento da doença, aumentando assim sua qualidade vida.[0019] Unlike prior art biomarkers, the present invention provides a method and a kit to monitor the progression of an inflammatory bowel disease such as Crohn's disease, which is simpler and cheaper, and which allows the physician to make quick decisions about the patient's treatment before the disease worsens, thus increasing their quality of life.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0020] Figura 1: Relação entre CD3+/CD8+/CD62L+ e Calprotectina entre indivíduos do grupo controle (n = 26) e indivíduos portadores da doença de Crohn (casos, n = 40). Resultados expressos por medianas e analisados por teste t de Student e teste de Mann-Whitney.[0020] Figure 1: Relationship between CD3+/CD8+/CD62L+ and Calprotectin between control subjects (n = 26) and individuals with Crohn's disease (cases, n = 40). Results expressed as medians and analyzed by Student's t test and Mann-Whitney test.

[0021] Figura 2: Relação entre calprotectina entre indivíduos do grupo controle (n = 26) e indivíduos portadores da doença de Crohn (casos, n = 36). Resultados expressos por medianas e analisados por teste t de Student e teste de Mann-Whitney.[0021] Figure 2: Relationship between calprotectin between control subjects (n = 26) and individuals with Crohn's disease (cases, n = 36). Results expressed as medians and analyzed by Student's t test and Mann-Whitney test.

[0022] Figura 3: Curvas ROC para Calprotectina e CD3+/CD8+/CD62L+ como marcadores da doença de Crohn (n = 62). Valor-p para teste de DeLong.Figure 3: ROC curves for Calprotectin and CD3+/CD8+/CD62L+ as markers of Crohn's disease (n=62). P-value for DeLong test.

DEFINITIONS

[0023] O termo “doença inflamatória intestinal” significa um processo inflamatório crônico do aparelho intestinal, de causa desconhecida, com períodos de recidiva e de remissão. As principais doenças inflamatórias intestinais conhecidas são a retocolite ulcerativa e a doença de Crohn.[0023] The term "inflammatory bowel disease" means a chronic inflammatory process of the intestinal tract, of unknown cause, with periods of relapse and remission. The main known inflammatory bowel diseases are ulcerative colitis and Crohn's disease.

[0024] O termo “doença de Crohn” significa um processo inflamatório crônico que pode comprometer todo o tubo digestivo, com a invasão de todas as camadas da parede intestinal. Embora sua etiologia permaneça desconhecida, acredita-se que, além de fatores genéticos, uma ativação crônica de células do sistema imune, alteração da cascata inflamatória e componentes da microflora intestinal sejam responsáveis pelo surgimento da doença.[0024] The term "Crohn's disease" means a chronic inflammatory process that can compromise the entire digestive tract, with invasion of all layers of the intestinal wall. Although its etiology remains unknown, it is believed that, in addition to genetic factors, a chronic activation of immune system cells, changes in the inflammatory cascade and components of the intestinal microflora are responsible for the onset of the disease.

[0025] O termo “subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+” significa a parcela dos linfócitos T no sangue que expressam simultaneamente os receptores antígeno-específicos CD3, CD8 e CD62L na superfície das referidas células.[0025] The term "CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation" means the portion of T lymphocytes in the blood that simultaneously express the antigen-specific receptors CD3, CD8 and CD62L on the surface of said cells.

[0026] Os termos “marcador biológico” ou “biomarcador” significam um parâmetro que é objetivamente medido e avaliado como um indicador de processos biológicos normais, processos patogenéticos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Um marcador biológico pode ser uma substância que indica um estado patológico particular ou um estado fisiológico específico. O marcador biológico de acordo com a presente invenção é a combinação particular de receptores de superfície de linfócitos T do sistema imune.The terms "biological marker" or "biomarker" mean a parameter that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes or pharmacological responses to a therapeutic intervention. A biological marker can be a substance that indicates a particular disease state or a specific physiological state. The biological marker according to the present invention is the particular combination of T lymphocyte surface receptors of the immune system.

[0027] O termo “progressão” significa o agravamento de uma doença ou o avanço para fases mais agudas de uma doença.[0027] The term "progression" means the aggravation of a disease or the advancement to more acute stages of a disease.

[0028] De acordo com a presente invenção, a expressão “amostra de sangue total periférico” significa uma amostra de sangue contendo plasma, leucócitos (glóbulos brancos), plaquetas e eritrócitos (glóbulos vermelhos).According to the present invention, the expression "peripheral whole blood sample" means a blood sample containing plasma, leukocytes (white blood cells), platelets and erythrocytes (red blood cells).

[0029] O termo “Índice de Atividade de Doença de Crohn (IADC)” significa um sistema métrico para avaliação do grau de atividade da doença de Crohn baseado no padrão de fezes, avaliação média da dor abdominal e bemestar geral relatados pelo paciente nos últimos sete dias, na presença de complicações associadas ao quadro inflamatório intestinal, tais como artrite ou artralgia, irite ou uveíte, eritema nodoso, fístula, entre outros, na massa abdominal e na anemia e alteração de peso.[0029] The term "Crohn's Disease Activity Index (IADC)" means a metric system for assessing the degree of Crohn's disease activity based on the stool pattern, mean assessment of abdominal pain and general well-being reported by the patient in the past. seven days, in the presence of complications associated with the intestinal inflammatory condition, such as arthritis or arthralgia, iritis or uveitis, erythema nodosum, fistula, among others, in the abdominal mass and in anemia and weight change.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0030] A presente invenção é direcionada a um método in vitro para monitoramento da progressão de uma doença inflamatório intestinal em um paciente que compreende as seguintes etapas:

(a) quantificar a subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ em uma amostra de sangue total periférico; e
(b) comparar o resultado obtido na etapa (a) com um valor de referência.

[0030] The present invention is directed to an in vitro method for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease in a patient comprising the following steps:

(a) quantify the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation in a peripheral whole blood sample; and
(b) compare the result obtained in step (a) with a reference value.

[0031] Preferencialmente, a doença inflamatória intestinal é a doença de Crohn.[0031] Preferably, the inflammatory bowel disease is Crohn's disease.

[0032] De acordo com a presente invenção, o valor de referência é a quantificação da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ em uma amostra previamente obtida do paciente portador da doença inflamatória intestinal.[0032] According to the present invention, the reference value is the quantification of the lymphocyte CD3+/CD8+/CD62L+ subpopulation in a sample previously obtained from a patient with inflammatory bowel disease.

[0033] De acordo com a presente invenção, um aumento da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ indica a progressão da doença inflamatória intestinal.According to the present invention, an increase in the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation indicates the progression of the inflammatory bowel disease.

[0034] Em uma realização preferencial, a subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ é quantificada por citometria de fluxo.[0034] In a preferred embodiment, the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation is quantified by flow cytometry.

[0035] Outro objeto da presente invenção se refere ao uso da combinação particular dos receptores de superfície CD3/CD8/CD62L de linfócitos T como um marcador biológico da progressão de uma doença inflamatória intestinal.[0035] Another object of the present invention relates to the use of the particular combination of CD3/CD8/CD62L surface receptors on T lymphocytes as a biological marker of the progression of an inflammatory bowel disease.

[0036] De acordo com a presente invenção, a doença inflamatória intestinal é a doença de Crohn.According to the present invention, the inflammatory bowel disease is Crohn's disease.

[0037] Outro objeto da presente invenção se refere a um kit de monitoramento da progressão de uma doença inflamatória intestinal compreendendo anticorpos monoclonais de superfície anti-CD3, anti-CD8 e anti-CD62L para a quantificação da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L em uma amostra de sangue total periférico de um paciente portador de uma doença inflamatória intestinal.[0037] Another object of the present invention relates to a kit for monitoring the progression of an inflammatory bowel disease comprising anti-CD3, anti-CD8 and anti-CD62L monoclonal antibodies for the quantification of the CD3+/CD8+/CD62L lymphocyte subpopulation in a peripheral whole blood sample from a patient with an inflammatory bowel disease.

[0038] De acordo com a presente invenção, a doença inflamatória intestinal é a doença de Crohn.According to the present invention, the inflammatory bowel disease is Crohn's disease.

[0039] Os seguintes exemplos se destinam a ilustrar a invenção a partir de algumas realizações preferenciais, sem estarem limitados aos detalhes mostrados. Pelo contrário, várias modificações podem ser feitas sem, com isso, se distanciar do escopo e espírito da presente invenção.[0039] The following examples are intended to illustrate the invention from some preferred embodiments, without being limited to the details shown. On the contrary, various modifications can be made without thereby departing from the scope and spirit of the present invention.

EXAMPLES EXAMPLE 1 Casuistry

[0040] Nesses exemplos, foram incluídos apenas indivíduos com doença de Crohn diagnosticada e controles saudáveis. Todos os participantes assinaram um “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” (TCLE) antes de serem incluídos no estudo. A inclusão de voluntários seguiu os seguintes critérios:In these examples, only individuals with diagnosed Crohn's disease and healthy controls were included. All participants signed an “Informed Consent Form” (FICF) before being included in the study. The inclusion of volunteers followed the following criteria:

[0041] Grupo 1: Indivíduos com doença de Crohn moderada com boa resposta aos tratamentos anti-TNF-α (Adalimumabe e Infliximabe (n = 20).[0041] Group 1: Individuals with moderate Crohn's disease with good response to anti-TNF-α treatments (Adalimumab and Infliximab (n = 20).

[0042] Grupo 2: Indivíduos com doença de Crohn grave sem resposta aos tratamentos disponíveis, encaminhados para cirurgia (n = 20).[0042] Group 2: Individuals with severe Crohn's disease unresponsive to available treatments, referred for surgery (n = 20).

[0043] Grupo 3: Indíviduos recém-diagnosticados livres de tratamentos (n = 20).[0043] Group 3: Newly diagnosed individuals free from treatments (n = 20).

[0044] Grupo 4: Indivíduos controle saudáveis (n = 20).[0044] Group 4: Healthy control subjects (n = 20).

[0045] Os critérios de inclusão no grupo estudo com boa resposta ao tratamento biológico (Grupo 1) foram os seguintes:

• Idade igual ou superior a 18 anos completos;
• Indivíduos com sorologia negativa para: HIV1-2; HTLV1/2; sífilis; HCV e HBV;
• Critério universalmente utilizado de níveis maiores ou iguais a 220, do Índice de Atividade de Doença de Crohn (IADC); e
• Utilizam drogas biológicas, infliximabe (IFX) ou adalimumabe (ADA), há mais de 1 ano, nos quais o efeito terapêutico tenha mostrado sinais de diminuição ou ausência de resposta do ponto de vista clínico e laboratorial.

[0045] The criteria for inclusion in the study group with good response to biological treatment (Group 1) were as follows:

• Age 18 years or older;
• Individuals with negative serology for: HIV1-2; HTLV1/2; syphilis; HCV and HBV;
• Universally used criterion of levels greater than or equal to 220 of the Crohn's Disease Activity Index (IADC); and
• Use biological drugs, infliximab (IFX) or adalimumab (ADA), for more than 1 year, in which the therapeutic effect has shown signs of decrease or lack of response from a clinical and laboratory point of view.

[0046] Os critérios de inclusão no grupo de estudo com perda de resposta das terapias disponíveis (Grupo 2) foram os seguintes:

• Idade igual ou superior a 18 anos completos;
• Indivíduos com sorologia negativa para: HIV1-2; HTLV1/2; sífilis; HCV e HBV;
• Critério universalmente utilizado de níveis maiores ou iguais a 220, do Índice de Atividade de Doença de Crohn (IADC);
• Indivíduos encaminhados para cirurgia; e
• Indivíduos livres de medicações biológicas e/ou imunossupressores.

[0046] The criteria for inclusion in the study group with loss of response to available therapies (Group 2) were as follows:

• Age 18 years or older;
• Individuals with negative serology for: HIV1-2; HTLV1/2; syphilis; HCV and HBV;
• Universally used criterion of levels greater than or equal to 220 of the Crohn's Disease Activity Index (IADC);
• Individuals referred for surgery; and
• Individuals free from biological and/or immunosuppressive medications.

[0047] Os critérios de inclusão no grupo de estudo com perda de resposta das terapias disponíveis (Grupo 3) foram os seguintes:

• Idade igual ou superior a 18 anos completos;
• Indivíduos com sorologia negativa para: HIV1-2; HTLV1/2; sífilis; HCV e HBV;
• Critério universalmente utilizado de níveis maiores ou iguais a 220, do Índice de Atividade de Doença de Crohn (IADC);
• Pacientes com diagnóstico recente, virgem de tratamento; e
• Uso de corticóide dose estável de 20mg por 3 semanas.

[0047] The criteria for inclusion in the study group with loss of response to available therapies (Group 3) were as follows:

• Age 18 years or older;
• Individuals with negative serology for: HIV1-2; HTLV1/2; syphilis; HCV and HBV;
• Universally used criterion of levels greater than or equal to 220 of the Crohn's Disease Activity Index (IADC);
• Patients with a recent diagnosis, untreated; and
• Use of steroids at a stable dose of 20mg for 3 weeks.

[0048] Os critérios de inclusão no grupo de estudo com perda de resposta das terapias disponíveis (Grupo 4) foram os seguintes:

• Idade igual ou superior a 18 anos completos;
• Indivíduos com sorologia negativa para: HIV1-2; HTLV1/2; sífilis; HCV e HBV; e
• Indivíduos sem doença crônica diagnosticada.

[0048] The criteria for inclusion in the study group with loss of response to available therapies (Group 4) were as follows:

• Age 18 years or older;
• Individuals with negative serology for: HIV1-2; HTLV1/2; syphilis; HCV and HBV; and
• Individuals without diagnosed chronic disease.

EXAMPLE 2 Peripheral blood collection

[0049] Trinta mililitros (mL) de sangue periférico foram coletados por punção venosa em membro superior dos indivíduos participantes do estudo (Exemplo 1), após cuidadosa assepsia local.[0049] Thirty milliliters (mL) of peripheral blood were collected by venipuncture in the upper limb of the subjects participating in the study (Example 1), after careful local asepsis.

[0050] Para tanto, foi realizada a técnica de coleta a vácuo que compreende a punção da veia do paciente permitindo que o sangue flua diretamente para o tubo de coleta contendo o anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) a vácuo. Esta técnica é ideal, pois possibilita a coleta de vários tubos e se caracteriza por ser um sistema fechado, sem a necessidade de manuseio da amostra.[0050] To do so, the technique of vacuum collection was performed, which comprises the puncture of the patient's vein allowing the blood to flow directly into the collection tube containing the anticoagulant EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) in vacuum. This technique is ideal, as it allows the collection of several tubes and is characterized by being a closed system, without the need to handle the sample.

[0051] O material foi coletado em laboratório, processado dentro de 24 horas e armazenados em biorrepositório.[0051] The material was collected in the laboratory, processed within 24 hours and stored in a biorepository.

EXAMPLE 3 Quantification of lymphocyte subpopulations by flow cytometry

[0052] Foi realizada a quantificação de subpopulações linfocitárias, com o painel CD3, CD8 e CD62L, nas amostras de sangue total periférico dos indivíduos dos Grupos 1, 2, 3 e 4 (Exemplo 1).[0052] The quantification of lymphocyte subpopulations was performed, with the panel CD3, CD8 and CD62L, in samples of peripheral whole blood from individuals in Groups 1, 2, 3 and 4 (Example 1).

[0053] A imunofenotipagem de superfície de linfócitos foi realizada no FACSFortessa de 10 cores e as análises foram processadas pelo software FlowJo. Todas as técnicas de citometria de fluxo foram realizadas com controles positivos e negativos, segundo as etapas abaixo:

1. Identificação da placa de 96 poços fundo em “V” utilizada;
2. Transferência das células respectivamente na placa fundo em “V”;
3. Centrifugação da placa a 1700 rpm por 5 minutos;
4. Descarte do sobrenadante;
5. Adição dos anticorpos monoclonais de superfície anti-CD3, anti-CD8 e anti-CD62L e de 100 µL de FACS Buffer descontando o volume dos anticorpos;
6. Homogenização e incubação por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente;
7. Após o término da incubação, centrifugação a 1700 rpm por 5 minutos;
8. Descarte do sobrenadante;
9. Adição de 170 µL de FACS Buffer e homogenização com auxílio da ponteira;
10. Centrifugação da placa a 1700 rpm por 5 minutos;
11. Descarte do sobrenadante;
12. Ressuspensão das células em 100 µL de Formaldeído 1% em cada poço, homogenização com o auxílio da ponteira e transferência das células para o tubo de citometria;
13. Lavagem da placa em fundo “V” com 200 µL de FACS Buffer, acrescentando esse volume no tubo de citometria respectivo;
14. Armazenamento das amostras a 4°C até leitura no citômetro de fluxo dentro de 7 dias após a realização da marcação.

[0053] Lymphocyte surface immunophenotyping was performed on the 10-color FACSFortessa and the analyzes were processed by the FlowJo software. All flow cytometry techniques were performed with positive and negative controls, according to the steps below:

1. Identification of the 96-well “V” bottom plate used;
2. Transfer the cells respectively to the bottom “V” plate;
3. Centrifuge the plate at 1700 rpm for 5 minutes;
4. Discard the supernatant;
5. Addition of surface monoclonal antibodies anti-CD3, anti-CD8 and anti-CD62L and 100 µL of FACS Buffer discounting the volume of antibodies;
6. Homogenization and incubation for 30 minutes in the dark at room temperature;
7. After the end of the incubation, centrifugation at 1700 rpm for 5 minutes;
8. Discard the supernatant;
9. Addition of 170 µL of FACS Buffer and homogenization with the aid of the tip;
10. Centrifuge the plate at 1700 rpm for 5 minutes;
11. Discard the supernatant;
12. Resuspension of cells in 100 µL of 1% Formaldehyde in each well, homogenization with the aid of a tip and transfer of cells to the cytometry tube;
13. Wash the plate in a “V” bottom with 200 µL of FACS Buffer, adding this volume in the respective cytometry tube;
14. Storage of samples at 4°C until reading on the flow cytometer within 7 days of marking.

EXAMPLE 4 Fecal collection and Calprotectin assay by enzyme immunoassay (ELISA)

[0054] Amostras de fezes, sem contaminação com água ou urina, foram coletadas em recipientes com tampa e enviadas ao laboratório clínico para a realização do teste de dosagem de calprotectina usando o kit comercial BÜHLMANN fCAL® ELISA Calprotectin (Bühlmann Laboratories AG, Suíça, Ref. EK-CAL), segundo instruções do fabricante. As leituras de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro a um comprimento de onda 450 nm.[0054] Stool samples, without contamination with water or urine, were collected in lidded containers and sent to the clinical laboratory to perform the calprotectin dosage test using the commercial BÜHLMANN fCAL® ELISA Calprotectin kit (Bühlmann Laboratories AG, Switzerland, Ref. EK-CAL), according to the manufacturer's instructions. Absorbance readings were taken in a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.

EXAMPLE 5 Correlation between calprotectin and the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation

[0055] Foram avaliados 40 indivíduos portadores da doença de Crohn dos Grupos 1, 2, 3 e 4 do Exemplo 1 (Grupo Casos) e 26 indivíduos controles saudáveis (Grupo Controles).[0055] Forty individuals with Crohn's disease from Groups 1, 2, 3 and 4 of Example 1 (Case Group) and 26 healthy control individuals (Control Group) were evaluated.

[0056] Foram investigadas as diferenças em relação à subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ entre os pacientes com doença de Crohn e indivíduos controles saudáveis (Tabela 1, Figura 1). Os testes para a hipótese de igualdade entre os grupos mostraram evidência de diferença de p=0,014. A quantidade de linfócitos CD3+/CD8+/CD62L+ é maior no grupo Casos em comparação ao indivíduos do grupo Controles.
TABELA 1
Subpopulação de linfócitos nos grupos de estudo

[0056] Differences regarding the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation between Crohn's disease patients and healthy control subjects were investigated (Table 1, Figure 1). Tests for the hypothesis of equality between groups showed evidence of a difference of p=0.014. The amount of CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocytes is greater in the Cases group compared to individuals in the Control group.
TABLE 1
Lymphocyte subpopulation in study groups

[0057] Com relação aos níveis de calprotectina (Tabela 2 e Figura 2), observou-se evidência de diferença entre os indivíduos com doença de Crohn e indivíduos controles saudáveis (p<0,001), sendo a mediana igual a 321,7 µg/g (IIQ: 147,6 a 1010,0 µg/g) no grupo Casos e 61,6 µg/g (IIQ: 40,3 a 109,0 µg/g) no grupo Controles. No grupo de indivíduos com a doença de Crohn, 58,3% apresentava calprotectina maior que 200, enquanto no grupo Controles de indivíduos saudáveis esta taxa foi 19,2%, com evidência de diferença entre os grupos (p = 0,003).[0057] Regarding calprotectin levels (Table 2 and Figure 2), there was evidence of a difference between individuals with Crohn's disease and healthy control individuals (p<0.001), with a median equal to 321.7 µg/ g (IIQ: 147.6 to 1010.0 µg/g) in the Cases group and 61.6 µg/g (IIQ: 40.3 to 109.0 µg/g) in the Control group. In the group of individuals with Crohn's disease, 58.3% had calprotectin greater than 200, while in the Control group of healthy individuals this rate was 19.2%, with evidence of difference between groups (p = 0.003).

[0058] Na classificação de atividade da doença pelo índice CDAI, 52,5% dos pacientes estavam com a doença em atividade e 47,5% em remissão.
TABELA 2
Calprotectina e índice de atividade da doença de Crohn, segundo o grupo de estudo

[0058] In the classification of disease activity by the CDAI index, 52.5% of patients had the disease in activity and 47.5% in remission.
TABLE 2
Calprotectin and Crohn's Disease Activity Index, according to study group

[0059] Os modelos de regressão logística binária ajustados (Tabela 3) mostraram evidência de associação significante entre calprotectina e a doença de Crohn, sendo que a cada acréscimo de 1 µg/g na calprotectina espera-se um acréscimo médio de 0,9% na chance de apresentar a doença (IC 95% de 0,3% a 1,5%). Para um acréscimo de 10 µg/g, espera-se um acréscimo médio de 9,4% (1,009 à décima potência). Também foi observada evidência de relação significativa entre CD3+/CD8+/CD62L+ e a doença de Crohn, sendo que a cada acréscimo de 1% estima-se um acréscimo médio de 6,3% (IC 95% de 0,5% a 12,6%).
TABELA 3
Modelos para explicação de doença de Crohn

[0059] The adjusted binary logistic regression models (Table 3) showed evidence of a significant association between calprotectin and Crohn's disease, with each addition of 1 µg/g in calprotectin expected to have a mean increase of 0.9% in the chance of having the disease (95% CI from 0.3% to 1.5%). For an increase of 10 µg/g, an average increase of 9.4% (1.009 at the tenth potency) is expected. Evidence of a significant relationship between CD3+/CD8+/CD62L+ and Crohn's disease was also observed, with each 1% increase being estimated to have a mean increase of 6.3% (95% CI from 0.5% to 12, 6%).
TABLE 3
Models for explaining Crohn's disease

[0060] Para avaliar o potencial da quantificação da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ como um marcador para a doença de Crohn, curvas ROC foram construídas considerando as medidas obtidas (Tabela 4 e Figura 3), e aferiu-se a estimativa de área sob a curva em cada um dos casos. Foi observado que a subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ apresenta uma área de 0,681 sob a curva (0,681) e evidência de diferença significativa em relação ao valor 0,5.
TABELA 4
Curvas ROC dos marcadores para a doença de Crohn

[0060] To assess the potential of quantifying the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation as a marker for Crohn's disease, ROC curves were constructed considering the measurements obtained (Table 4 and Figure 3), and the area estimate was measured under the curve in each case. It was observed that the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation has an area of 0.681 under the curve (0.681) and evidence of a significant difference in relation to the 0.5 value.
TABLE 4
ROC curves of Crohn's disease markers

[0061] Comparando o desempenho da calprotectina e da subpopulação linfocitária CD3+/CD8+/CD62L+ (Figura 3) como marcadores para a doença de Crohn, notou-se que não há diferença estatisticamente significativa entre as duas medidas (p = 0,174).[0061] Comparing the performance of calprotectin and the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation (Figure 3) as markers for Crohn's disease, it was noted that there is no statistically significant difference between the two measures (p = 0.174).

Claims

IN VITRO METHOD FOR MONITORING THE PROGRESSION OF AN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE, in a patient, characterized by comprising the following steps:

METHOD, according to claim 1, characterized in that the inflammatory bowel disease is Crohn's disease.

METHOD, according to any one of claims 1 to 2, characterized in that the reference value is a quantification of the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation in a sample previously obtained from a patient with inflammatory bowel disease.

METHOD, according to any one of claims 1 to 3, characterized in that an increase in the lymphocyte CD3+/CD8+/CD62L+ subpopulation indicates the progression of the inflammatory bowel disease.

METHOD, according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the lymphocyte CD3+/CD8+/CD62L+ subpopulation is quantified by flow cytometry.

USE OF THE COMBINATION OF T-LYMPHOCYTES CD3/CD8/CD62L SURFACE RECEPTORS, characterized by being a biological marker of the progression of inflammatory bowel diseases.

USE according to claim 6, characterized in that the inflammatory bowel disease is Crohn's disease.

KIT FOR MONITORING THE PROGRESSION OF AN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE, characterized in that it comprises anti-CD3, anti-CD8 and anti-CD62L monoclonal antibodies for the quantification of the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation in a peripheral whole blood sample from a patient carrier of an inflammatory bowel disease.

KIT according to claim 8, characterized in that the inflammatory bowel disease is Crohn's disease.

KIT, according to any one of claims 8 to 9, characterized in that the quantification of the CD3+/CD8+/CD62L+ lymphocyte subpopulation is performed by flow cytometry.