BR102018074938A2

BR102018074938A2 - lipid biomarkers, method and kit for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase from blood plasma

Info

Publication number: BR102018074938A2
Application number: BR102018074938-2A
Authority: BR
Inventors: Vânia Aparecida Mendes Goulart; Rodrigo Ribeiro Resende
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-05-18
Also published as: BR102018074938A8

Abstract

A presente tecnologia trata de um conjunto de 30 biomarcadores lipídicos para o prognóstico laboratorial de acidente vascular isquêmico na fase subaguda a partir de plasma sanguíneo. Trata também de um kit e do método para tal diagnostico. O kit compreende 30 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência para utilização como base de cálculo da concentração dos biomarcadores na amostra de plasma. O método consiste na análise de amostras de plasma sanguíneo por análise por injeção em fluxo e detecção por espectrometria de massas em tandem (FIA-MS/MS), e avaliação das concentrações do painel de lipídeos selecionados na presente tecnologia. O método apresenta alta sensibilidade e especificidade.

The present technology deals with a set of 30 lipid biomarkers for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase from blood plasma. It also deals with a kit and the method for such diagnosis. The kit comprises 30 labeled lipid isotopes as a reference standard for use as a basis for calculating the concentration of biomarkers in the plasma sample. The method consists of analyzing blood plasma samples by flow injection analysis and detection by tandem mass spectrometry (FIA-MS/MS), and evaluating the concentrations of the lipid panel selected in the present technology. The method has high sensitivity and specificity.

Description

LIPID BIOMARKERS, METHOD AND KIT FOR LABORATORY PROGNOSIS OF ISCHEMIC VASCULAR ACCIDENT IN THE SUB-ACUTE PHASE FROM BLOOD PLASMA

[001] A presente tecnologia trata de um conjunto de 30 biomarcadores lipídicos para o prognóstico laboratorial de acidente vascular isquêmico na fase subaguda a partir de plasma sanguíneo. Trata também de um kit e do método para tal diagnostico. O kit compreende 30 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência para utilização como base de cálculo da concentração dos biomarcadores na amostra de plasma. O método consiste na análise de amostras de plasma sanguíneo por análise por injeção em fluxo e detecção por espectrometria de massas em tandem (FIA-MS/MS), e avaliação das concentrações do painel de lipídeos selecionados na presente tecnologia. O método apresenta alta sensibilidade e especificidade.[001] The present technology deals with a set of 30 lipid biomarkers for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase from blood plasma. It also deals with a kit and the method for such diagnosis. The kit comprises 30 labeled lipid isotopes as a reference standard for use as a basis for calculating the concentration of biomarkers in the plasma sample. The method consists of analyzing blood plasma samples by flow injection analysis and detection by tandem mass spectrometry (FIA-MS/MS), and evaluating the concentrations of the lipid panel selected in the present technology. The method has high sensitivity and specificity.

[002] O acidente vascular cerebral (AVC) é uma das principais causas de morte e incapacidade permanente no mundo. O acidente vascular cerebral isquêmico (AVCI) é caracterizado pelo comprometimento do suprimento vascular para o cérebro, sendo o evento primário na maioria (85-90%) dos AVCs agudos. A grande maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são causados pela oclusão da artéria cerebral por um trombo, especialmente da artéria cerebral média. O reconhecimento precoce da lesão isquêmica é crítico para minimizar as consequências, a recorrência e melhorar os resultados terapêuticos.[002] Stroke (CVA) is one of the leading causes of death and permanent disability worldwide. Ischemic stroke (Ischemic stroke) is characterized by impaired vascular supply to the brain, being the primary event in most (85-90%) of acute strokes. The vast majority of ischemic strokes are caused by the occlusion of the cerebral artery by a thrombus, especially the middle cerebral artery. Early recognition of ischemic injury is critical to minimize consequences, recurrence and improve therapeutic outcomes.

[003] O maior risco de mortalidade para pacientes com AVCI ocorre nos primeiros 30 dias, e por essa razão vários estudos têm sido desenvolvidos para encontrar biomarcardores associados ao melhor ou pior prognóstico. Um biomarcador pode ser qualquer característica ou substância fisiológica mensurável que marca o risco ou a manifestação de um processo relacionado ao acidente vascular cerebral. Os biomarcadores de prognóstico são muito relevantes para o desenvolvimento de alvos para terapias neuroprotetoras, monitoramento da resposta ao tratamento e como desfechos substitutos para testes de tratamento. O prognóstico do AVCI depende de vários fatores demográficos e clínicos: idade, sexo, etnia, subtipo de AVCI, hipertensão, AVCI prévio, hipoglicemia, diabetes, fibrilação atrial e doenças cardíacas. Atualmente, os preditores de desfecho de AVC, como o proposto pelo NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale), têm sido utilizados para auxiliar na escolha do tratamento e evitar recidivas, incapacidades e morte. NIHSS é uma ferramenta utilizada pelos profissionais de saúde para quantificar objetivamente os danos causados por um acidente vascular cerebral. Quanto maior for a pontuação obtida pelo paciente usando esta escala, mais severa é a lesão. Entretanto, tendo em vista a subjetividade desse tipo de preditor, a necessidade de biomarcadores bioquímicos com sensibilidade e especificidade adequadas ainda existe.[003] The greatest risk of mortality for patients with stroke occurs within the first 30 days, and for this reason several studies have been developed to find biomarkers associated with better or worse prognosis. A biomarker can be any measurable physiological characteristic or substance that marks the risk or manifestation of a stroke-related process. Prognostic biomarkers are very relevant for developing targets for neuroprotective therapies, monitoring response to treatment, and as surrogate endpoints for treatment trials. The prognosis of stroke depends on several demographic and clinical factors: age, sex, ethnicity, stroke subtype, hypertension, previous stroke, hypoglycemia, diabetes, atrial fibrillation, and heart disease. Currently, stroke outcome predictors, such as the one proposed by the NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale), have been used to help choose the treatment and prevent recurrence, disability and death. NIHSS is a tool used by healthcare professionals to objectively quantify the damage caused by a stroke. The higher the score obtained by the patient using this scale, the more severe the injury. However, given the subjectivity of this type of predictor, the need for biochemical biomarkers with adequate sensitivity and specificity still exists.

[004] Até então, nenhum biomarcador bioquímico para o prognóstico do AVC foi aceito para uso clínico. Muitos potenciais biomarcadores já foram identificados, mas nenhum até agora mostrou suficiente sensibilidade e especificidade para ser usado no cenário clínico. Vários estudos têm pesquisado alterações metabólicas causadas pela isquemia em biofluidos. A isquemia cerebral resulta na ativação de uma cascata de eventos moleculares, na qual vários metabólitos com características de potenciais biomarcadores são liberados no sangue periférico. A análise desses biomarcadores no sangue e seus derivados pode ser útil para a previsão da evolução da lesão isquêmica e do prognóstico clínico.[004] Until then, no biochemical biomarker for stroke prognosis has been accepted for clinical use. Many potential biomarkers have been identified, but none so far has shown sufficient sensitivity and specificity to be used in the clinical setting. Several studies have investigated metabolic alterations caused by ischemia in biofluids. Cerebral ischemia results in the activation of a cascade of molecular events, in which several metabolites with characteristics of potential biomarkers are released into the peripheral blood. The analysis of these biomarkers in blood and its derivatives can be useful for predicting the evolution of the ischemic lesion and the clinical prognosis.

[005] Um biomarcador sanguíneo ideal para o AVCI precisa ser confiável, rapidamente medido e prontamente disponível. As tecnologias atuais de metabolômica podem permitir a descoberta e a validação rápidas de indicadores metabólicos de doenças. As plataformas analíticas utilizadas em metabolômica, como a espectrometria de massas, podem rotineiramente medir dezenas a centenas de metabólitos com excelente precisão, sendo adequadas para pesquisa e para o uso no diagnóstico de amostras humanas. As análises de perfil metabólico (identificação precisa seguida pela quantificação de um conjunto definido de metabólitos) associadas a ferramentas de bioinformática têm sido amplamente utilizadas para descobrir alterações causadas por isquemia em busca de potenciais biomarcadores.[005] An ideal blood biomarker for ischemic stroke needs to be reliable, quickly measured and readily available. Current metabolomics technologies can enable the rapid discovery and validation of metabolic indicators of disease. Analytical platforms used in metabolomics, such as mass spectrometry, can routinely measure tens to hundreds of metabolites with excellent accuracy, making them suitable for research and for use in diagnosing human samples. Metabolic profile analyzes (precise identification followed by quantification of a defined set of metabolites) associated with bioinformatics tools have been widely used to discover changes caused by ischemia in search of potential biomarkers.

[006] Existem no estado da técnica algumas soluções propostas para o prognóstico de acidente vascular isquêmico com base no uso de biomarcadores lipídicos, como as citadas a seguir.[006] There are in the prior art some solutions proposed for the prognosis of ischemic stroke based on the use of lipid biomarkers, such as those mentioned below.

[007] O documento de patente US201715414508, cuja data de prioridade é 24/01/2017, intitulado “Intelligent stroke risk prediction and monitoring system”, descreve um algoritmo que precisa ser alimentado com resultados de vários exames clínicos e dados demográficos de pacientes para a predição do risco de acidente vascular cerebral. O documento supracitado descreve um sistema para predição de risco, para o qual são necessários três conjuntos de testes laboratoriais: Painel Metabólico (14 testes laboratoriais em amostras de sangue para a análise de eletrólitos, equilíbrio ácido-base, níveis de glicose e proteínas), Contagem de Sangue (teste laboratorial similar ao hemograma que visa analisar e quantificar células e componentes do sangue) e Painel lipídico. O Painel Lipídico é um conjunto de testes para a análise de colesterol e triglicérides no sangue.[007] The patent document US201715414508, whose priority date is 01/24/2017, entitled "Intelligent stroke risk prediction and monitoring system", describes an algorithm that needs to be fed with results from various clinical examinations and patient demographics for predicting the risk of stroke. The aforementioned document describes a system for risk prediction, for which three sets of laboratory tests are needed: Metabolic Panel (14 laboratory tests on blood samples for the analysis of electrolytes, acid-base balance, glucose and protein levels), Blood Count (laboratory test similar to hemogram that aims to analyze and quantify blood cells and components) and Lipid Panel. The Lipid Panel is a set of tests for the analysis of cholesterol and triglycerides in the blood.

[008] O documento de patente UA20122012012346U, cuja data de prioridade é 29/10/2012, intitulado “Method for prognosis of ischemic stroke consequences”, descreve um método para prognóstico das consequências de AVCI que compreende Doppler, ressonância magnética, tomografia computadorizada e a determinação do perfil lipídico e do açúcar sanguíneo.[008] Patent document UA20122012012346U, whose priority date is 10/29/2012, entitled "Method for prognosis of ischemic stroke consequences", describes a method for predicting the consequences of stroke that comprises Doppler, magnetic resonance, computed tomography and determination of lipid profile and blood sugar.

[009] No estado da técnica não foi encontrada uma seleção de biomarcadores lipídicos para prognóstico específico de acidente vascular isquêmico na fase subaguda a partir de plasma sanguíneo, para detecção por um método simples e de baixo custo, conforme descrito na presente invenção. A presente invenção apresenta vantagens em relação ao estado da técnica, pois trata de um método para o prognóstico laboratorial de acidente vascular isquêmico na fase subaguda utilizando um painel de 30 lipídeos biomarcadores da doença, com alta sensibilidade e especificidade. Trata-se de um método pouco invasivo, baseado apenas em punção venosa, que utiliza um pequeno volume de amostra para análise, apenas 10 µl. Além disso, o tempo de análise por FIA é pequeno, apenas 3 minutos; e já existem programas disponíveis para interpretação rápida dos resultados. O método proposto permite a identificação e quantificação de esfingomielinas e glicerofosfolipídeos em uma única análise e em uma única fração de 10µL de amostra de plasma. Trata-se de uma forma direta e precisa de quantificação e identificação de metabólitos a partir de padrões marcados. Utiliza-se uma faixa de concentração (µM) de metabólitos mensurável e capaz de caracterizar pacientes com acidente vascular isquêmico na fase subaguda, utilizando uma única técnica (FIA-MS).[009] In the prior art, there was no selection of lipid biomarkers for specific prognosis of ischemic stroke in the subacute phase from blood plasma, for detection by a simple and low-cost method, as described in the present invention. The present invention has advantages over the prior art, as it is a method for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase using a panel of 30 lipid biomarkers of the disease, with high sensitivity and specificity. It is a minimally invasive method, based only on venipuncture, which uses a small sample volume for analysis, only 10 µl. Furthermore, the analysis time by FIA is short, just 3 minutes; and there are already programs available for quick interpretation of results. The proposed method allows the identification and quantification of sphingomyelins and glycerophospholipids in a single analysis and in a single fraction of 10µL of plasma sample. It is a direct and accurate way of quantifying and identifying metabolites from marked standards. A measurable concentration range (µM) of metabolites is used, capable of characterizing patients with ischemic stroke in the subacute phase, using a single technique (FIA-MS).

[010] Neste contexto, a presente tecnologia foi desenvolvida a partir da investigação de um painel de lipídeos presentes no plasma sanguíneo de pacientes com acidente vascular isquêmico na fase subaguda e de indivíduos sem a doença (controles). Um painel de 30 lipídeos que conjuntamente são capazes de caracterizar o acidente vascular isquêmico na fase subaguda e diferenciar pacientes com a doença de indivíduos controles é o objeto da presente tecnologia.[010] In this context, the present technology was developed from the investigation of a panel of lipids present in the blood plasma of patients with ischemic stroke in the subacute phase and individuals without the disease (controls). A panel of 30 lipids that together are able to characterize ischemic stroke in the subacute phase and differentiate patients with the disease from control individuals is the object of this technology.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[011] A figura 1 mostra plotagens dos resultados da Análise de Componentes Principais (PCA). Escore de pontuação discriminando os perfis metabólicos em amostras de plasma entre pacientes com AVCI subagudo e controles. Os parâmetros dos modelos foram: 7 PCs, R2=0.784 e Q2=0.538.[011] Figure 1 shows plots of the Principal Component Analysis (PCA) results. Scoring score discriminating metabolic profiles in plasma samples between patients with subacute IS and controls. The parameters of the models were: 7 PCs, R2=0.784 and Q2=0.538.

[012] A figura 2 representa gráficos dos escores da Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) e validação do modelo. (A) Plotagem dos escores discriminando os perfis metabólicos em amostras de plasma entre pacientes com AVCI subagudo versus controles. Os parâmetros dos modelos foram: 7 variáveis latentes, R2Y=0.919 e Q2Y=0.828. (B) Plotagem do teste de permutação de PLS-DA de AVCI subagudo versus grupo controle. A validação do modelo foi feita com o número de permutações igual a 200.[012] Figure 2 represents graphs of the scores of the Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) and model validation. (A) Plot of scores discriminating metabolic profiles in plasma samples between patients with subacute IS versus controls. The parameters of the models were: 7 latent variables, R2Y=0.919 and Q2Y=0.828. (B) PLS-DA permutation test plot of subacute ISCA versus control group. Model validation was performed with the number of permutations equal to 200.

[013] A figura 3 representa a avaliação da sensibilidade e especificidade do modelo PLS-DA. AUROC= 1, Taxa de verdadeiros positivos (sensibilidade); Taxa de falsos positivos (especificidade).[013] Figure 3 represents the assessment of sensitivity and specificity of the PLS-DA model. AUROC= 1, True positive rate (sensitivity); False positive rate (specificity).

[014] A figura 4 representa gráficos dos escores de projeção ortogonal para resultados de análise discriminante de estruturas latentes (OPLS-DA). Plotagem de escores discriminando os perfis metabólicos em amostras de plasma entre pacientes com AVCI subagudo versus controles. Os parâmetros do modelo foram: 2 PCs, R2Y=0.87 e Q2=0.813.[014] Figure 4 represents graphs of orthogonal projection scores for latent structures discriminant analysis results (OPLS-DA). Score plot discriminating metabolic profiles in plasma samples between patients with subacute IS versus controls. The model parameters were: 2 PCs, R2Y=0.87 and Q2=0.813.

DETAILED DESCRIPTION OF THE TECHNOLOGY

[015] A presente tecnologia trata de um conjunto de 30 biomarcadores lipídicos para o prognóstico laboratorial de acidente vascular isquêmico na fase subaguda a partir de plasma sanguíneo. Trata também de um kit e do método para tal diagnostico. O kit compreende 30 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência para utilização como base de cálculo da concentração dos biomarcadores na amostra de plasma. O método consiste na análise de amostras de plasma sanguíneo por análise por injeção em fluxo e detecção por espectrometria de massas em tandem (FIA-MS/MS), e avaliação das concentrações do painel de lipídeos selecionados na presente tecnologia. O método apresenta alta sensibilidade e especificidade.[015] The present technology deals with a set of 30 lipid biomarkers for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase from blood plasma. It also deals with a kit and the method for such diagnosis. The kit comprises 30 labeled lipid isotopes as a reference standard for use as a basis for calculating the concentration of biomarkers in the plasma sample. The method consists of analyzing blood plasma samples by flow injection analysis and detection by tandem mass spectrometry (FIA-MS/MS), and evaluating the concentrations of the lipid panel selected in the present technology. The method has high sensitivity and specificity.

[016] Os biomarcadores lipídicos para prognóstico de acidente vascular isquêmico na fase subaguda a partir de plasma sanguíneo de pacientes compreende o seguinte conjunto de lipídeos ou uma combinação de dois ou mais dos seguintes lipídeos: PC aa C34:3; PC ae C34:3; PC ae C36:2; PC aa C36:1; PC ae C36:3; PC aa C36:3; PC ae C32:2; PC ae C42:2; PC aa C32:3; PC aa C36:6; PC ae C38:6; PC aa C30:0; PC ae C38:2; PC aa C38:0; PC aa C42:2; SM C24:0; PC ae C30:0; PC ae C42:3; PC aa C42:5; PC ae C36:0; PC ae C40:6; lysoPC a C16:0; SM OH C16:1; lysoPC a C18:1; PC aa C34:2; PC aa C38:5; PC aa C40:1; lysoPC a C16:1; PC ae C40:2 e PC aa C42:4.[016] Lipid biomarkers for prognosis of ischemic stroke in the subacute phase from blood plasma of patients comprises the following set of lipids or a combination of two or more of the following lipids: PC aa C34:3; PC ae C34:3; PC ae C36:2; PC aa C36:1; PC ae C36:3; PC aa C36:3; PC ae C32:2; PC ae C42:2; PC aa C32:3; PC aa C36:6; PC ae C38:6; PC aa C30:0; PC ae C38:2; PC aa C38:0; PC aa C42:2; SM C24:0; PC ae C30:0; PC ae C42:3; PC aa C42:5; PC ae C36:0; PC ae C40:6; lysoPC at C16:0; SM OH C16:1; lysoPC at C18:1; PC aa C34:2; PC aa C38:5; PC aa C40:1; lysoPC at C16:1; PC ae C40:2 and PC aa C42:4.

[017] O método para prognóstico laboratorial de acidente vascular isquêmico na fase subaguda compreende as seguintes etapas:

a. Obtenção de no mínimo 10 microlitros de plasma sanguíneo, a partir de centrifugação do sangue coletado do paciente em tubo de vácuo sem anticuagulante;
b. Preparação do plasma sanguíneo coletado em “a” para análise pelo método de injeção em fluxo (FIA) utilizando padrões internos marcados com isótopos estáveis de lipídeos;
c. Análise das amostras obtidas em “b” através de espectrometria de massas, utilizando a intensidade dos sinais MS/ MS de cada biomarcador definido na reivindicação 1 em relação ao seu padrão interno marcado com isótopo, como base de cálculo da concentração do biomarcador na amostra;
d. Avaliação das faixas de concentração obtidas em c, sendo que, nas seguintes faixas de concentração (em µmol/L) o prognóstico é considerado positivo para AVCI na fase subaguda: PC aa C34:3 (5,89 ± 2,57); PC ae C34:3 (2,89 ± 0,85); PC ae C36:2 (5,95 ± 2,32); PC aa C36:1 (29,37 ± 7,47); PC ae C36:3 (3,26 ± 0,94); PC aa C36:3 (76,10 ± 25,63); PC ae C32:2 (0,32 ± 0,07); PC ae C42:2 (0,29 ± 0,08); PC aa C32:3 (0,32 ± 0,09); PC aa C36:6 (0,33±0,12); PC ae C38:6 (3,92 ± 0,78); PC aa C30:0 (1,89 ± 0,42); PC ae C38:2 (1,69 ± 0,47); PC aa C38:0 (1,55 ± 0,36); PC aa C42:2 (0,16 ± 0,03); SM C24:0 (32,00 ± 8,26); PC ae C30:0 (0,14 ± 0,04); PC ae C42:3 (0,41±0,12); PC aa C42:5 (0,29 ± 0,06); PC ae C36:0 (0,43 ± 0,12); PC ae C40:6 (3,22 ± 0,74); lysoPC a C16:0 (279,85 ± 158,89);SM OH C16:1(4,04 ± 1,20); lysoPC a C18:1 (44,56 ± 25,62); PC aa C34:2 (129,14 ± 31,54); PC aa C38:5 (39,89 ± 10,80); PC aa C40:1 (0,32 ± 0,05); lysoPC a C16:1(6,01 ± 2,42); PC ae C40:2 (1,78 ± 0,47) e PC aa C42:4 (0,21 ± 0,06)..

[017] The method for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase comprises the following steps:

The. Obtaining at least 10 microliters of blood plasma, from the centrifugation of blood collected from the patient in a vacuum tube without anticoagulant;
B. Preparation of blood plasma collected in “a” for analysis by the flow injection method (FIA) using internal standards marked with stable lipid isotopes;
ç. Analysis of the samples obtained in "b" through mass spectrometry, using the intensity of the MS/MS signals of each biomarker defined in claim 1 in relation to its internal standard labeled with isotope, as a basis for calculating the concentration of the biomarker in the sample;
d. Evaluation of the concentration ranges obtained in c, and in the following concentration ranges (in µmol/L) the prognosis is considered positive for ischemic stroke in the subacute phase: PC aa C34:3 (5.89 ± 2.57); PC ae C34:3 (2.89 ± 0.85); PC ae C36:2 (5.95 ± 2.32); PC aa C36:1 (29.37 ± 7.47); PC ae C36:3 (3.26 ± 0.94); PC aa C36:3 (76.10 ± 25.63); PC ae C32:2 (0.32 ± 0.07); PC ae C42:2 (0.29 ± 0.08); PC aa C32:3 (0.32 ± 0.09); PC aa C36:6 (0.33±0.12); PC ae C38:6 (3.92 ± 0.78); PC aa C30:0 (1.89 ± 0.42); PC ae C38:2 (1.69 ± 0.47); PC aa C38:0 (1.55 ± 0.36); PC aa C42:2 (0.16 ± 0.03); SM C24:0 (32.00 ± 8.26); PC ae C30:0 (0.14 ± 0.04); PC ae C42:3 (0.41±0.12); PC aa C42:5 (0.29 ± 0.06); PC ae C36:0 (0.43 ± 0.12); PC ae C40:6 (3.22 ± 0.74); lysoPC at C16:0 (279.85 ± 158.89);SM OH C16:1 (4.04 ± 1.20); lysoPC at C18:1 (44.56 ± 25.62); PC aa C34:2 (129.14 ± 31.54); PC aa C38:5 (39.89 ± 10.80); PC aa C40:1 (0.32 ± 0.05); lysoPC at C16:1(6.01 ± 2.42); PC ae C40:2 (1.78 ± 0.47) and PC aa C42:4 (0.21 ± 0.06).

[018] O kit para o prognóstico laboratorial de acidente vascular isquêmico na fase subaguda compreende 30 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência (PC aa C34:3; PC ae C34:3; PC ae C36:2; PC aa C36:1; PC ae C36:3; PC aa C36:3; PC ae C32:2; PC ae C42:2; PC aa C32:3; PC aa C36:6; PC ae C38:6; PC aa C30:0; PC ae C38:2; PC aa C38:0; PC aa C42:2; SM C24:0; PC ae C30:0; PC ae C42:3; PC aa C42:5; PC ae C36:0; PC ae C40:6; lysoPC a C16:0; SM OH C16:1; lysoPC a C18:1; PC aa C34:2; PC aa C38:5; PC aa C40:1; lysoPC a C16:1; PC ae C40:2 e PC aa C42:4) para base de cálculo da concentração dos biomarcadores definidos acima na amostra de plasma.[018] The kit for laboratory prognosis of ischemic stroke in the subacute phase comprises 30 lipid isotopes labeled as a reference standard (PC aa C34:3; PC ae C34:3; PC ae C36:2; PC aa C36:1 ; PC ae C36:3; PC aa C36:3; PC aa C32:2; PC aa C42:2; PC aa C32:3; PC aa C36:6; PC aa C38:6; PC aa C30:0; PC aa C30:0; PC ae C38:2; PC aa C38:0; PC aa C42:2; SM C24:0; PC ae C30:0; PC ae C42:3; PC aa C42:5; PC ae C36:0; PC ae C40: 6; lysoPC to C16:0; SM OH C16:1; lysoPC to C18:1; PC aa C34:2; PC aa C38:5; PC aa C40:1; lysoPC a C16:1; PC aa C40:2 and PC aa C42:4) for calculating the concentration of the biomarkers defined above in the plasma sample.

[019] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.[019] The present invention can be better understood through the following non-limiting examples.

EXAMPLE 1 - SELECTION OF BIOMARKERS

[020] Amostras de plasma (n = 23) de pacientes com acidente vascular isquêmico foram obtidas em aproximadamente 72h após a hospitalização, ou seja, na fase subaguda da doença. Foram recrutados pacientes com resultados positivos para AVCI obtidos através da técnica de imagem por ressonância magnética, que é considerada a técnica padrão ouro para o diagnóstico. De acordo com o NIHSS, os pacientes foram avaliados e classificados com os seguintes escores: 1-normal (sem sintomas), 2- acidente vascular cerebral leve, 3- acidente vascular cerebral moderado e 4- acidente vascular cerebral grave. Para compor o grupo controle (n = 19) foram recrutados indivíduos que nunca tiveram doença cardíaca ou acidente vascular cerebral. Os participantes foram recrutados no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (Belo Horizonte, MG, Brasil). Os dados clínicos e demográficos dos pacientes estão apresentados na Tabela 1.[020] Plasma samples (n = 23) from patients with ischemic stroke were obtained approximately 72h after hospitalization, ie, in the subacute phase of the disease. Patients with positive ISVA results obtained through the magnetic resonance imaging technique, which is considered the gold standard technique for diagnosis, were recruited. According to the NIHSS, patients were evaluated and classified with the following scores: 1-normal (no symptoms), 2-mild stroke, 3-moderate stroke, and 4-severe stroke. To compose the control group (n = 19) individuals who had never had heart disease or stroke were recruited. Participants were recruited at the Hospital das Clínicas of the Federal University of Minas Gerais (Belo Horizonte, MG, Brazil). Clinical and demographic data of patients are shown in Table 1.

[021] Tabela 1 - Dados demográficos e clínicos de pacientes com AVCI e controles

*HAS= Hipertensão Arterial Sistêmica; * NIHSS= National Institutes of Health Stroke Scale (escala de classificação de prognóstico de AVC); *SD= desvio padrão; Fase subaguda= ~72h após o infarto.[021] Table 1 - Demographic and clinical data of patients with stroke and controls

*HAS= Systemic Arterial Hypertension; * NIHSS = National Institutes of Health Stroke Scale (stroke prognosis rating scale); *SD= standard deviation; Subacute phase = ~72h after infarction.

[022] O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque, e seu protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais, sob o número 312.840. As amostras de sangue (4 mL) foram coletadas com tubos do sistema Vacuette® contendo ácido etilenodiaminotetracético anticoagulante (EDTA) para obtenção do plasma. As amostras de sangue obtidas foram rapidamente centrifugadas a 3.000 rotações por minuto (RPM), por 10 minutos, para a separação do plasma e depois distribuídas em várias alíquotas para microtubos e imediatamente armazenadas a -80 ° C.[022] The study was carried out in accordance with the Declaration of Helsinki, and its protocol was approved by the Research Ethics Committee of the Federal University of Minas Gerais, under number 312,840. Blood samples (4 mL) were collected with tubes of the Vacuette® system containing anticoagulant ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) to obtain plasma. The blood samples obtained were rapidly centrifuged at 3,000 revolutions per minute (RPM) for 10 minutes to separate the plasma and then distributed in several aliquots into microtubes and immediately stored at -80 °C.

[023] Para a preparação de amostras e análises por FIA, cada amostra de plasma (10 μl) foi pipetada em um poço de placa de 96 poços equipada com um sistema de filtragem e sensibilizada com padrões internos marcados com isótopos estáveis de lipídeos (Biocrates Life Science AG, Áustria). Em seguida a placa foi colocada em um evaporador sob um fluxo de nitrogênio (pressão de 3-4 bars), sob temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a secagem, foram adicionados 50 μl de uma solução contendo 300 µl de fenilisotiocianato (PITC) + 1900 µl de etanol + 1900 µl de H2O + 1900 µl de piridina em cada poço e a placa ficou incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após, a placa foi submetida à secagem durante 60 minutos no evaporador sob um fluxo de nitrogênio (pressão de 3-4 bars). Em seguida foram adicionados 300 µl de uma solução de acetato de amônio em metanol (5 mM) a cada poço e incubado em um agitador (450 rpm) por 30 minutos. A placa foi centrifugada a 100 g por 2 minutos. Após a filtragem, 250 μl de amostra foram transferidos para a placa de análise por injeção em fluxo (FIA). Foram adicionados 400 μl de solvente de corrida (todo conteúdo de 1 ampola de solvente I - Biocrates diluído em 290 mL de metanol). Após, a placa foi incubada por 2 minutos em um agitador a 600 rpm. Em seguida, 20 μl de cada amostra foram analisados em um espectrômetro de massa quadrupolo em tandem XevoTQ-S (Waters Technologies, Massachusetts, EUA). As amostras foram injetadas através de um amostrador automático diretamente em uma fonte de íons do tipo electrospray e analisadas em modo positivo. Como solução carreadora foi utilizada água ultrapura (mili-Q) contendo 0,2% de ácido fórmico, seguindo a taxa de fluxo de acordo com a tabela 2. O tempo total de corrida para cada amostra foi de 3 minutos. A intensidade dos sinais MS/ MS de cada analito (lipídeo) em relação ao seu padrão interno marcado com isótopo foi utilizada como base de cálculo da concentração do analito na amostra. Os cálculos das concentrações foram realizados de forma automatizada pelo software MetIDQ (Biocrates Life Science AG, Áustria).[023] For sample preparation and FIA analysis, each plasma sample (10 μl) was pipetted into a 96-well plate well equipped with a filtration system and sensitized with internal standards labeled with stable lipid isotopes (Biocrates Life Science AG, Austria). Then the plate was placed in an evaporator under a flow of nitrogen (pressure of 3-4 bars) at room temperature for 30 minutes. After drying, 50 µl of a solution containing 300 µl phenylisothiocyanate (PITC) + 1900 µl ethanol + 1900 µl H2O + 1900 µl pyridine was added to each well and the plate was incubated for 20 minutes at room temperature. Afterwards, the plate was subjected to drying for 60 minutes in the evaporator under a flow of nitrogen (pressure of 3-4 bars). Then, 300 µl of a solution of ammonium acetate in methanol (5 mM) were added to each well and incubated on a shaker (450 rpm) for 30 minutes. The plate was centrifuged at 100 g for 2 minutes. After filtering, 250 μl of sample was transferred to the analysis plate by flow injection (FIA). 400 μl of running solvent (all content of 1 ampoule of solvent I - Biocrates diluted in 290 mL of methanol) was added. Afterwards, the plate was incubated for 2 minutes on a shaker at 600 rpm. Then, 20 μl of each sample was analyzed in an XevoTQ-S tandem quadrupole mass spectrometer (Waters Technologies, Massachusetts, USA). The samples were injected through an autosampler directly into an electrospray type ion source and analyzed in a positive mode. As carrier solution, ultrapure water (milli-Q) containing 0.2% formic acid was used, following the flow rate according to table 2. The total running time for each sample was 3 minutes. The intensity of the MS/MS signals of each analyte (lipid) in relation to its internal standard labeled with isotope was used as the basis for calculating the analyte concentration in the sample. Concentration calculations were performed automated by the MetIDQ software (Biocrates Life Science AG, Austria).

[024] Tabela 2. Taxa de fluxo da solução carreadora durante as análises por injeção em fluxo

[024] Table 2. Carrier solution flow rate during flow injection analysis

[025] O conjunto de dados obtidos foi submetido a análises estatísticas multivariadas utilizando o software SIMCA 14.0 (Umetrics, Umea, Suécia). Os dados foram normalizados por escala de variância unitária (UV) e depois foram submetidos à análise de componentes principais (PCA), análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e projeção ortogonal para análise discriminante de estruturas latentes (OPLS- DA). Os modelos OPLS-DA foram examinados para determinar quais variáveis foram as principais responsáveis por qualquer separação observada entre os grupos (AVCI hiperagudo e controles). Para identificar quais variáveis foram responsáveis por essa separação, a influência da variável no parâmetro de projeção (VIP) acima de 1 foi utilizada para selecionar as variáveis que tiveram a contribuição mais significativa na discriminação entre os perfis de ácidos graxos. As análises de PCA apresentaram que houve uma tendência de separação em pacientes com AVCI hiperagudo e controles com base no perfil de lipídeos (Fig. 1). Essa tendência foi confirmada pelas análises de PLS-DA (Fig. 2A). O modelo PLS-DA foi validado pelo teste de permutação (200 permutações) de acordo com o parâmetro de ajuste do modelo (R2) e pelo parâmetro de capacidade preditiva (Q2). Ambos os parâmetros apresentaram resultados significativos (Fig. 2B). A sensibilidade e especificidade dos perfis de lipídeos em separar controles e pacientes com acidente vascular isquêmico na fase subaguda foi calculado através da área acima da curva (AUROC). Quanto mais próximos de 1 estiverem os valores da AUROC melhor é discriminação entre grupos, sendo que 1 indica discriminação perfeita entre grupos e valores iguais ou inferiores a 0,5 geralmente significam nenhuma discriminação. Em nosso modelo encontramos como resultado AUROC (Fig.3). As análises por OPLS-DA demonstraram total separação entre os grupos (Fig. 4) através dos perfis lipídicos e a subsequente análise de VIP apresentou quais lipídeos foram mais importantes para tal separação e que possuem potencial para serem biomarcadores de AVCI subagudo (Tabela 3). Esse painel de lipídeos está associado a um bom prognóstico, considerando que 87% dos pacientes na fase subaguda apresentaram os escores 2 e 3 na escala NIHSS, ou seja, lesões leves a moderadas (Tabela 1).[025] The data set obtained was submitted to multivariate statistical analysis using the SIMCA 14.0 software (Umetrics, Umea, Sweden). Data were normalized by scale of unit variance (UV) and then subjected to principal component analysis (PCA), discriminant analysis by partial least squares (PLS-DA) and orthogonal projection for discriminant analysis of latent structures (OPLS-DA) . The OPLS-DA models were examined to determine which variables were primarily responsible for any observed separation between groups (hyperacute stroke and controls). To identify which variables were responsible for this separation, the influence of the variable on the projection parameter (VIP) above 1 was used to select the variables that had the most significant contribution in discriminating between fatty acid profiles. PCA analyzes showed that there was a trend towards separation in patients with hyperacute stroke and controls based on the lipid profile (Fig. 1). This trend was confirmed by PLS-DA analyzes (Fig. 2A). The PLS-DA model was validated by the permutation test (200 permutations) according to the model fit parameter (R2) and the predictive capability parameter (Q2). Both parameters showed significant results (Fig. 2B). The sensitivity and specificity of lipid profiles in separating controls and patients with ischemic stroke in the subacute phase was calculated using the area above the curve (AUROC). The closer to 1 the AUROC values are, the better is discrimination between groups, with 1 indicating perfect discrimination between groups and values equal to or less than 0.5 generally mean no discrimination. In our model we found AUROC as a result (Fig.3). The OPLS-DA analyzes showed complete separation between groups (Fig. 4) through lipid profiles and the subsequent VIP analysis showed which lipids were most important for such separation and which have the potential to be biomarkers of subacute IS (Table 3) . This lipid panel is associated with a good prognosis, considering that 87% of patients in the subacute phase had scores 2 and 3 on the NIHSS scale, that is, mild to moderate lesions (Table 1).

[026] Tabela 3. Principais lipídeos encontrados como potenciais biomarcadores para AVCI subagudo

a Importância da variável na projeção (VIP) foi obtida do modelo OPLS-DA com um limiar acima de 1,0; b Fold-change (FC) foi calculada pelo valor da média de concentração de lipídeos do grupo AVCI subagudo em relação ao grupo Controle, sendo que os valores indicam quantas vezes o metabólito está mais alto ou mais baixo entre os grupos;c O valor de p foi calculado pelo teste de Wilcoxon Mann Whitney; d q-values foram calculados usando o valor p ajustado com a taxa de descoberta falsa (FDR). “Baixo” e “alto” se referem aos resultados obtidos no cálculo de foldchange (FC).[026] Table 3. Main lipids found as potential biomarkers for subacute stroke

the Importance of the variable in the projection (VIP) was obtained from the OPLS-DA model with a threshold above 1.0; b Fold-change (FC) was calculated by the mean value of lipid concentration in the subacute ISVC group in relation to the Control group, and the values indicate how many times the metabolite is higher or lower between the groups; c The value of p was calculated using the Wilcoxon Mann Whitney test; d q-values were calculated using p-value adjusted with false discovery rate (FDR). “Low” and “high” refer to the results obtained in the foldchange (FC) calculation.

Claims

LIPID BIOMARKERS, characterized by comprising the following set of lipids or a combination of two or more of the following lipids: PC aa C34:3; PC ae C34:3; PC ae C36:2; PC aa C36:1; PC ae C36:3; PC aa C36:3; PC ae C32:2; PC ae C42:2; PC aa C32:3; PC aa C36:6; PC ae C38:6; PC aa C30:0; PC ae C38:2; PC aa C38:0; PC aa C42:2; SM C24:0; PC ae C30:0; PC ae C42:3; PC aa C42:5; PC ae C36:0; PC ae C40:6; lysoPC at C16:0; SM OH C16:1; lysoPC at C18:1; PC aa C34:2; PC aa C38:5; PC aa C40:1; lysoPC at C16:1; PC ae C40:2 and PC aa C42:4.

METHOD FOR LABORATORY PROGNOSIS OF ISCHEMIC VASCULAR ACCIDENT IN THE SUBAUDUDA PHASE, characterized by comprising the following steps:

a) Obtaining at least 10 microliters of blood plasma, from the centrifugation of blood collected from the patient in a vacuum tube without anticoagulant;
b) Preparation of blood plasma collected in “a” for analysis by the flow injection method (FIA) using internal standards marked with stable lipid isotopes;
c) Analysis of the samples obtained in "b" through mass spectrometry, using the intensity of the MS/MS signals of each biomarker defined in claim 1 in relation to its internal standard labeled with isotope, as a basis for calculating the concentration of the biomarker in the sample;
d) Evaluation of the concentration ranges obtained in c, and in the following concentration ranges (in µmol/L) the prognosis is considered positive for stroke in the subacute phase: PC aa C34:3 (5.89 ± 2.57) ; PC ae C34:3 (2.89 ± 0.85); PC ae C36:2 (5.95 ± 2.32); PC aa C36:1 (29.37 ± 7.47); PC ae C36:3 (3.26 ± 0.94); PC aa C36:3 (76.10 ± 25.63); PC ae C32:2 (0.32 ± 0.07); PC ae C42:2 (0.29 ± 0.08); PC aa C32:3 (0.32 ± 0.09); PC aa C36:6 (0.33±0.12); PC ae C38:6 (3.92 ± 0.78); PC aa C30:0 (1.89 ± 0.42); PC ae C38:2 (1.69 ± 0.47); PC aa C38:0 (1.55 ± 0.36); PC aa C42:2 (0.16 ± 0.03); SM C24:0 (32.00 ± 8.26); PC ae C30:0 (0.14 ± 0.04); PC ae C42:3 (0.41±0.12); PC aa C42:5 (0.29 ± 0.06); PC ae C36:0 (0.43 ± 0.12); PC ae C40:6 (3.22 ± 0.74); lysoPC at C16:0 (279.85 ± 158.89);SM OH C16:1 (4.04 ± 1.20); lysoPC at C18:1 (44.56 ± 25.62); PC aa C34:2 (129.14 ± 31.54); PC aa C38:5 (39.89 ± 10.80); PC aa C40:1 (0.32 ± 0.05); lysoPC at C16:1(6.01 ± 2.42); PC ae C40:2 (1.78 ± 0.47) and PC aa C42:4 (0.21 ± 0.06).

KIT FOR THE LABORATORY PROGNOSIS OF ISCHEMIC VASCULAR ACCIDENT IN THE SUB-ACUTE PHASE, characterized by comprising 30 lipid isotopes labeled as a reference standard (PC aa C34:3; PC ae C34:3; PC aa C36:2; PC aa C36:1; PC ae C36:3; PC aa C36:3; PC ae C32:2; PC ae C42:2; PC aa C32:3; PC aa C36:6; PC ae C38:6; PC aa C30:0; PC ae C38:2; PC aa C38:0; PC aa C42:2; SM C24:0; PC ae C30:0; PC ae C42:3; PC aa C42:5; PC aa C36:0; PC ae C40:6 ; lysoPC to C16:0; SM OH C16:1; lysoPC to C18:1; PC aa C34:2; PC aa C38:5; PC aa C40:1; lysoPC a C16:1; PC aa C40:2 and PC aa C42:4) for calculating the concentration of the biomarkers defined in claim 1 in the plasma sample.