BR102018069587A2

BR102018069587A2 - simultaneous pressurized liquid extraction process with ultrasound to obtain more concentrated fractions of active substances present in spondia mombim x spondia tuberosa leaves

Info

Publication number: BR102018069587A2
Application number: BR102018069587A
Authority: BR
Inventors: Ciro Ribeiro Brito Amorim; Cláudio Dariva; Klebson Silva Santos; Jorge Alberto López Rodríguez; Elton Franceschi; Gustavo Rodrigues Borges
Original assignee: Instituto De Tecnologia E Pesquisa; Universidade Tiradentes
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2020-04-07

Abstract

a presente patente de invenção (pi) descreve um processo de extração por liquido pressurizado e ultrassom simultâneo para obtenção de extratos bioativos a partir de folhas de s. mombin x s. tuberosa. mais especificamente, o processo compreende a aplicação de dois métodos de extração de forma simultânea para melhorar a capacidade de extração e obtenção de frações ricas em flavonoides e outros compostos fenólicos. além disso, os compostos bioativos obtidos na presente invenção tem escopo de aplicação nas indústrias de cosméticos, agrícola, alimentos e farmacêuticas como substâncias bioativas de formulações e/ou produtos naturais para o combate de micro-organismos patogênicos e/ou nos cuidados de desordens fisiológicas que comprometem a qualidade de vida da população.the present invention patent (pi) describes a process of extraction by pressurized liquid and simultaneous ultrasound to obtain bioactive extracts from s leaves. mombin x s. tuberous. more specifically, the process comprises the application of two extraction methods simultaneously to improve the extraction capacity and obtain fractions rich in flavonoids and other phenolic compounds. in addition, the bioactive compounds obtained in the present invention have scope of application in the cosmetics, agricultural, food and pharmaceutical industries as bioactive substances in formulations and / or natural products for combating pathogenic microorganisms and / or in the care of physiological disorders that compromise the population's quality of life.

Description

PROCESSO DE EXTRAÇÃO POR LÍQUIDO PRESSURIZADO SIMULTÂNEO COM ULTRASSOM PARA OBTER FRAÇÕES MAIS CONCENTRADAS DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS PRESENTES NAS FOLHAS DE Spondia mombim x Spondia tuberosaSIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES IN THE LEAVES OF Spondia mombim x Spondia tuberosa

BREVE APRESENTAÇÃO [001] A presente patente de invenção (PI) diz respeito a um processo de extração por líquidos pressurizados simultâneo com ultrassom para a obtenção de extratos fracionados, concentrados em flavonoides totais e outros compostos fenólicos de partes vegetais, mais especificamente, de folhas de Spondia mombim x Spondia tuberosa, conhecida popularmente como umbu-cajá. O referido extrato fracionado possui uma elevada aplicação industrial e farmacológica, devido as suas características fitoquímicas, bem como, potencial atividade antioxidante, devidamente comprovado. Para a obtenção do referido extrato das folhas de umbu-cajá, rico em compostos fenólicos, como os flavonoides e com atividade antioxidante, aplica-se um inovador processo de extração com líquidos pressurizados e ultrassom, sendo utilizado como solventes o hexano, o acetato de etila e o etanol em condições de vazão, temperatura e pressão adequadas e previamente estabelecidas nesta invenção, o que torna o extrato obtido passível de aplicação industrial. Assim, o processo tecnológico de extração desenvolvido na presente patente, torna-se eficaz para obtenção de extrato concentrados em compostos bioativos, a partir de folhas de umbu-cajá com elevada capacidade antioxidante e potencial de aplicação em diferentes produtos farmacêuticos, cosméticos e agropecuários, podendo ainda, ser utilizado como componente ativo de matrizes poliméricas (de liberação controlada), e também, como ingrediente ativo de formulações e composições de alimentos funcionais e/ou nutracêuticos.BRIEF PRESENTATION [001] The present invention patent (PI) concerns a process of extraction by pressurized liquids simultaneous with ultrasound to obtain fractionated extracts, concentrated in total flavonoids and other phenolic compounds of plant parts, more specifically, of leaves Spondia mombim x Spondia tuberosa, popularly known as umbu-cajá. This fractionated extract has a high industrial and pharmacological application, due to its phytochemical characteristics, as well as, potential antioxidant activity, duly proven. To obtain the aforementioned extract from the umbu-cajá leaves, rich in phenolic compounds, such as flavonoids and with antioxidant activity, an innovative extraction process with pressurized liquids and ultrasound is applied, using hexane, acetate and ethyl and ethanol under conditions of flow, temperature and pressure adequate and previously established in this invention, which makes the obtained extract liable to industrial application. Thus, the technological extraction process developed in this patent, becomes effective for obtaining extracts concentrated in bioactive compounds, from umbu-cajá leaves with high antioxidant capacity and potential for application in different pharmaceutical, cosmetic and agricultural products, it can also be used as an active component of polymeric matrices (controlled release), and also, as an active ingredient in formulations and compositions of functional and / or nutraceutical foods.

[002] Mais especificamente, ressalta-se que a invenção se refere a um ‘PROCESSO DE EXTRAÇÃO POR LÍQUIDO PRESSURIZADO SIMULTÂNEO[002] More specifically, it is emphasized that the invention refers to a ‘SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS

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COM ULTRASSOM PARA OBTER FRAÇÕES MAIS CONCENTRADAS DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS PRESENTES NAS FOLHAS DE Spondia mombim x Spondia tuberosa”, caracterizado por ser um processo eficaz para a obtenção de um extrato, que apresenta atividade antioxidante devido ao elevado teor de flavonoides e outros compostos fenólicos, obtido pelo inovador processo de extração desenvolvido.WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES PRESENT IN THE LEAVES OF Spondia mombim x Spondia tuberosa ”, characterized by being an effective process for obtaining an extract, which has antioxidant activity due to the high content of flavonoids and other phenolic compounds, obtained for the innovative extraction process developed.

[003] É importante ressaltar que a matriz vegetal utilizada, e fonte para obtenção do referido extrato, não possui atualmente nenhuma aplicação industrial farmacologicamente relevante, e, além disso, os extratos disponíveis na literatura científica, extraídos a partir das partes vegetais da S. mombin x S. tuberosa, são obtidos por métodos a baixa pressão utilizando solventes orgânicos, e por isso, apresenta características distintas do extrato obtido nas condições reveladas neste pedido de patente de invenção.[003] It is important to note that the plant matrix used, and source for obtaining the said extract, currently has no pharmacologically relevant industrial application, and, in addition, the extracts available in the scientific literature, extracted from the plant parts of S. mombin x S. tuberosa, are obtained by low pressure methods using organic solvents, and therefore have different characteristics from the extract obtained under the conditions disclosed in this patent application.

[004] Ressalta-se que as condições de processo aplicadas nesta invenção, associada à utilização de alta pressão e ultrassom em uma única etapa, utilizando assim solventes pressurizados, é capaz extrair componentes de interesse farmacologicamente ativos, diferenciando assim dos processos e produtos já disponíveis e revelados no estado da técnica. Como vantagem adicional ressalta-se a manutenção das propriedades antioxidantes dos extratos obtidos devido à utilização de baixas temperaturas, e esta característica é de extrema importância para a aplicação destes extratos nas indústrias farmacêuticas, de alimentos e agrícola. As características apresentadas garantem o caráter diferenciado e vantajoso do referido processo para obtenção de extrato/frações bioativas com atividade antioxidante, quando comparado a outros processos aplicados a obtenção de extratos de S. mombin x S. tuberosa (umbu-cajá) disponíveis no estado da técnica, seja em artigos científicos, documentos de patentes e/ou produtos disponíveis no mercado.[004] It is emphasized that the process conditions applied in this invention, associated with the use of high pressure and ultrasound in a single step, thus using pressurized solvents, is able to extract components of pharmacologically active interest, thus differentiating from the processes and products already available and disclosed in the prior art. An additional advantage is the maintenance of the antioxidant properties of the extracts obtained due to the use of low temperatures, and this characteristic is extremely important for the application of these extracts in the pharmaceutical, food and agricultural industries. The characteristics presented guarantee the differentiated and advantageous character of the referred process for obtaining bioactive extract / fractions with antioxidant activity, when compared to other processes applied to obtaining extracts of S. mombin x S. tuberosa (umbu-cajá) available in the state of São Paulo. technical, whether in scientific articles, patent documents and / or products available on the market.

[005] Assim, neste documento de patente de invenção são descritas todas as características do produto obtido, ou seja, do referido extrato bioativo com elevado teor de flavonoides e outros compostos fenólicos, e elevada capacidade,[005] Thus, in this patent document all characteristics of the product obtained are described, that is, of said bioactive extract with high content of flavonoids and other phenolic compounds, and high capacity,

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3/16 bem como, é descrita de forma detalhada o seu respectivo processo de obtenção, identificando todos os parâmetros empregados e condições que devem ser aplicadas.3/16 as well as, its respective procurement process is described in detail, identifying all the parameters employed and conditions that must be applied.

CAMPO DE INVENÇÃO [006] A invenção aqui descrita, se insere no campo da química de produtos naturais, mais especificamente no que se refere à obtenção de bioativos, e faz referência a um processo de extração por liquido pressurizado e ultrassom simultâneo na obtenção de frações de extratos concentrados em compostos bioativos a partir de folhas de S. mombin x S. tuberosa.FIELD OF INVENTION [006] The invention described here falls within the field of natural product chemistry, more specifically with regard to obtaining bioactive substances, and refers to a process of simultaneous pressurized liquid extraction and ultrasound in obtaining fractions of extracts concentrated in bioactive compounds from leaves of S. mombin x S. tuberosa.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [007] Spondias tuberosa x Spondias mombin /Família Anacardiaceae, gênero Spondias), popularmente conhecida como umbu-cajá, é uma planta frutífera nativa do nordeste brasileiro (LIRA JUNIOR, 2005; MACHADO et al.,FUNDAMENTALS OF THE TECHNIQUE [007] Spondias tuberosa x Spondias mombin / Family Anacardiaceae, genus Spondias), popularly known as umbu-cajá, is a fruit plant native to northeastern Brazil (LIRA JUNIOR, 2005; MACHADO et al.,

2015). As partes vegetais do umbu-cajá, como por exemplo as suas folhas, contêm substâncias bioativas como os compostos fenólicos, entres eles os flavonoides (SILVA et al. 2014). Estes compostos bioativos têm apresentado atividades biológicas relevantes como antioxidante, cicatrizante e antimicrobiana (OZCAN et al., 2014; BRGLEZ MOJZER et al., 2016; CHAKRABORTYA, 2018). Com isso, a comunidade científica e industrial tem despertado o interesse para obter estas substâncias ativas a partir de plantas medicinais (AZWANIDA, 2015; SELVAMUTHUKUMARAN; SHI, 2017).2015). The plant parts of umbu-cajá, such as its leaves, contain bioactive substances such as phenolic compounds, including flavonoids (SILVA et al. 2014). These bioactive compounds have shown relevant biological activities such as antioxidant, healing and antimicrobial (OZCAN et al., 2014; BRGLEZ MOJZER et al., 2016; CHAKRABORTYA, 2018). With this, the scientific and industrial community has aroused the interest to obtain these active substances from medicinal plants (AZWANIDA, 2015; SELVAMUTHUKUMARAN; SHI, 2017).

[008] Os compostos fenólicos têm sido obtidos por métodos de extração como, marceração microondas, ultrassom e fluidos pressurizado (SELVAMUTHUKUMARAN; SHI, 2017). Porém, a escolha do processo extração é de extrema relevância para obtenção de compostos bioativos, por ser uma etapa fundamental para a melhor retirada de moléculas bioativas como os compostos fenólicos de partes vegetais (BELWAL et al., 2018). Com isso,[008] Phenolic compounds have been obtained by extraction methods such as microwave marking, ultrasound and pressurized fluids (SELVAMUTHUKUMARAN; SHI, 2017). However, the choice of the extraction process is extremely relevant for obtaining bioactive compounds, as it is a fundamental step for the better removal of bioactive molecules such as phenolic compounds from plant parts (BELWAL et al., 2018). Thereby,

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4/16 processos de extração tal como ultrassom (CHEMAT et al., 2017) e líquido pressurizado (BELWAL et al., 2018) tem sido uma alternativa importante para obter concentrações de compostos bioativos.4/16 extraction processes such as ultrasound (CHEMAT et al., 2017) and pressurized liquid (BELWAL et al., 2018) have been an important alternative to obtain concentrations of bioactive compounds.

[009] A extração assistida por ultrassom é um processo comumente realizado para obter produtos naturais, por apresenta uma boa capacidade para extrair substâncias bioativas (CHEMAT et al., 2017), o referido processo de extração por ultrassom consiste em uma corrente de um líquido ou mistura líquida que vibra numa cavidade ressonante, cujo efeito de expansão e compressão cria bolhas, que são convertidas em energia mecânica de alta frequência, capaz de aumentar a capacidade de extração de biocompostos (BIJTTEBIER et al., 2016; CHEN et al., 2018).[009] Ultrasound-assisted extraction is a process commonly performed to obtain natural products, as it has a good ability to extract bioactive substances (CHEMAT et al., 2017), the referred ultrasound extraction process consists of a liquid stream or liquid mixture that vibrates in a resonant cavity, whose expansion and compression effect creates bubbles, which are converted into high frequency mechanical energy, capable of increasing the extraction capacity of biocomposites (BIJTTEBIER et al., 2016; CHEN et al., 2018).

[010] A extração por líquido pressurizado é outro processo com grande capacidade de obtenção de compostos bioativos, devido uso de solventes líquidos à pressão elevada, o que aumenta a capacidade de extração em comparação ao processo de extração sob pressão atmosférica. Além disso, este processo de extração surge como uma alternativa para diminuir o consumo de solventes e permitir o ajuste de parâmetros operacionais considerando a seletividade do processo para um determinado grupo de compostos (SILVA et al., 2016; BELWAL et al., 2018; SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2017).[010] Pressurized liquid extraction is another process with a great capacity to obtain bioactive compounds, due to the use of liquid solvents at high pressure, which increases the extraction capacity compared to the extraction process under atmospheric pressure. In addition, this extraction process appears as an alternative to reduce the consumption of solvents and allow the adjustment of operational parameters considering the selectivity of the process for a given group of compounds (SILVA et al., 2016; BELWAL et al., 2018; SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2017).

[011] O processo de extração assistida por ultrassom pode ser acoplado a técnicas realizadas sob alta pressão. Estudos destacam a possibilidade em superar desvantagens desses métodos quando aplicados individualmente (BALACHANDRAN, et al., 2006; RIERA, et al., 2010; SANTOS, et al., 2015; DIAS, et al., 2016; MACHADO, et al., 2017). A aplicação simultânea de ultrassom e fluidos pressurizados, como método de extração afeta a cinética e o rendimento extrativo, pois propicia meio prático de produzir o rompimento da parede celular da matriz vegetal durante a extração por fluidos pressurizados (RIERA, et al., 2004; RIERA, et al., 2010).[011] The ultrasound-assisted extraction process can be coupled with techniques performed under high pressure. Studies highlight the possibility of overcoming disadvantages of these methods when applied individually (BALACHANDRAN, et al., 2006; RIERA, et al., 2010; SANTOS, et al., 2015; DIAS, et al., 2016; MACHADO, et al. , 2017). The simultaneous application of ultrasound and pressurized fluids as an extraction method affects the kinetics and extractive yield, as it provides a practical means of producing the rupture of the cell wall of the plant matrix during extraction by pressurized fluids (RIERA, et al., 2004; RIERA, et al., 2010).

[012] De acordo com o exposto, o processo de extração por ultrassom e por líquido pressurizado apresenta distintos princípios que contribuem para a[012] According to the above, the extraction process by ultrasound and pressurized liquid presents different principles that contribute to the

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5/16 melhoria da capacidade de obtenção de compostos bioativos, dessa forma, é de grande importância o desenvolvimento de um novo sistema de extração, utilizando a combinação de processos com o intuito de melhorar a taxa de transferência de massa de compostos bioativos (AZWANIDA, 2015, KHAW, 2017; BELWAL et al., 2018). Outrossim, os fluidos pressurizados tal como o CO2, têm sido relatado na literatura combinado com o ultrassom, o que desperta o interesse para o desenvolvimento de processo que use solvente como CO2 e/ou hexano, para remover as frações mais apolares e outros solventes mais polares como o acetato de etila e etanol para obter frações mais concentradas em flavonoides e outros compostos fenólicos a partir de um processo sequencial em leito fixo.5/16 improving the ability to obtain bioactive compounds, therefore, it is of great importance to develop a new extraction system, using the combination of processes in order to improve the mass transfer rate of bioactive compounds (AZWANIDA, 2015, KHAW, 2017; BELWAL et al., 2018). Furthermore, pressurized fluids such as CO2 have been reported in the literature combined with ultrasound, which arouses interest for the development of a process that uses solvent such as CO2 and / or hexane, to remove the most non-polar fractions and other more solvents polar particles such as ethyl acetate and ethanol to obtain fractions more concentrated in flavonoids and other phenolic compounds from a sequential fixed bed process.

LITERATURA TÉCNICA ESPECIALIZADA [013] A literatura técnica especializada revela alguns documentos de patentes que fazem referência a processo de obtenção de extrato e/ou uso de Spondias tuberosa x Spondias mombin para diversos fins. Para embasar o critério de novidade e atividade inventiva foi realizada uma pesquisa na base de patentes do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) que disponibiliza o acervo de patentes depositadas do Brasil, e na base europeia de Patentes (Espacenet) que reúne o acervo de patentes depositadas em mais de 90 países. Na pesquisa realizada não foi identificada nenhum documento de patente que faz referência ao processo de obtenção de extrato bioativo das folhas de Spondias tuberosa x Spondias mombin por extração com líquidos pressurizados e ultrassom em uma única etapa e produto obtido com as mesmas características e potencial de aplicação.SPECIALIZED TECHNICAL LITERATURE [013] The specialized technical literature reveals some patent documents that make reference to the process of obtaining extract and / or using Spondias tuberosa x Spondias mombin for various purposes. To support the criterion of novelty and inventive step, a search was carried out on the patent base of the National Institute of Industrial Property (INPI), which makes available the collection of patents deposited in Brazil, and on the European Patent base (Espacenet), which gathers the collection of patents filed in more than 90 countries. In the research carried out, no patent document was identified that refers to the process of obtaining bioactive extract from the leaves of Spondias tuberosa x Spondias mombin by extraction with pressurized liquids and ultrasound in a single step and a product obtained with the same characteristics and application potential. .

[014] Os documentos de maior relevância serão descritos a seguir, entretanto, é importante destacar que nenhum deles é limitante para o quesito de inovação da patente de invenção requerida nesse documento, tendo em vista[014] The most relevant documents will be described below, however, it is important to note that none of them is limiting for the innovation item of the invention patent required in this document, in view of

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6/16 que o conceito inventivo aqui proposto difere consideravelmente dos documentos citados e revelados a seguir.6/16 that the inventive concept proposed here differs considerably from the documents cited and revealed below.

[015] O documento de patente brasileiro BR 10 2016 014976 2 A2 revela um processo de extração sequencial para obtenção de frações de extratos bioativos a partir de bagaço de Maracujá Amarelo (Passiflora edulis sp.), utilizando um etapa que envolve a extração com fluido supercrítico seguida por uma segunda etapa de extração com líquidos pressurizados, este processo permite a obtenção de frações concentradas em tocotrienóis, ácidos graxos poliinsaturados, carotenoides e compostos fenólicos. Entretanto, no referido documento de patente acima não é reivindicado o uso do ultrassom e líquido pressurizado simultâneo para extrair princípios ativos. Além disso, apresente divergência na matriz vegetal utilizada, e, portanto, não pode ser considerada como limitante para a solicitação de exclusividade do que é proposto neste documento, bem como, não pode limitar a atividade inventiva do mesmo.[015] The Brazilian patent document BR 10 2016 014976 2 A2 reveals a sequential extraction process to obtain fractions of bioactive extracts from Yellow Passion fruit (Passiflora edulis sp.), Using a step that involves fluid extraction supercritical followed by a second extraction step with pressurized liquids, this process allows the obtaining of fractions concentrated in tocotrienols, polyunsaturated fatty acids, carotenoids and phenolic compounds. However, the aforementioned patent document does not claim the use of ultrasound and pressurized liquid simultaneously to extract active ingredients. In addition, there is a divergence in the plant matrix used, and, therefore, it cannot be considered as limiting the request for exclusivity of what is proposed in this document, nor can it limit the inventive activity of the same.

[016] O documento de patente EP1547 679 A1 descreve detalhadamente um processo de extração que utiliza ultrassom assistida e CO2 supercrítico simultaneamente, para a separação e extração de compostos ativos, preferencialmente do óleo de amêndoa (Prunus dulcis). Apesar de referenciar e relatar a utilização do ultrassom simultâneo com um fluido pressurizado (CO2 supercrítico) para extração de substâncias bioativas de partes vegetais, tal invenção é consideravelmente distinta do que é solicitado nesse documento de patente, tendo em vista que apresenta condições termodinâmicas distintas, solventes, e ainda, planta medicinal utilizadas. Assim, não podendo ser considerada como limitante do estado da técnica para a invenção aqui reivindicada.[016] Patent document EP1547 679 A1 describes in detail an extraction process that uses assisted ultrasound and supercritical CO2 simultaneously, for the separation and extraction of active compounds, preferably almond oil (Prunus dulcis). Despite referring and reporting the use of simultaneous ultrasound with a pressurized fluid (supercritical CO2) for the extraction of bioactive substances from plant parts, this invention is considerably different from what is requested in this patent document, given that it presents different thermodynamic conditions, solvents, and also, medicinal plant used. Thus, it cannot be considered as limiting the state of the art for the invention claimed here.

[017] Assim, e a partir dos documentos revelados, ressalta-se que o desenvolvimento e aplicação do dito ‘PROCESSO DE EXTRAÇÃO POR LÍQUIDO PRESSURIZADO SIMULTÂNEO COM ULTRASSOM PARA OBTER FRAÇÕES MAIS CONCENTRADAS DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS PRESENTES NAS FOLHAS DE Spondia mombim x Spondia tuberosa’[017] Thus, and based on the documents disclosed, it is emphasized that the development and application of the so-called ‘SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED ACTIVE SUBSTANCES FRACTIONS PRESENT IN THE SHEETS OF Spondia mombim ´ tuberous dia

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7/16 proposto neste documento de patente de invenção possui um potencial inovador, e, portanto, atende ao critério de novidade, pois até o presente momento nenhum trabalho científico ou técnico compreendido no estado da técnica possui a tecnologia de desenvolvimento, obtenção e aplicação semelhantes do que é revelado e requerido.7/16 proposed in this invention patent document has an innovative potential, and therefore meets the criterion of novelty, as until now no scientific or technical work understood in the state of the art has the same development, acquisition and application technology of what is revealed and required.

[018] Por fim, é importante destacar que a tecnologia proposta neste documento de patente de invenção apresenta também outros critérios de patenteabilidade, como atividade inventiva e aplicação industrial, requisitos estes necessários para a concessão da patente requerida.[018] Finally, it is important to highlight that the technology proposed in this patent document also presents other criteria for patentability, such as inventive step and industrial application, requirements which are necessary for the granting of the requested patent.

VANTAGENS DA INVENÇÃO [019] Em relação às vantagens e diferenciais apresentados pelo dito ‘PROCESSO DE EXTRAÇÃO POR LÍQUIDO PRESSURIZADO SIMULTÂNEO COM ULTRASSOM PARA OBTER FRAÇÕES MAIS CONCENTRADAS DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS PRESENTES NAS FOLHAS DE Spondia mombim x Spondia tuberosa, pode-se destacar como mais relevantes:ADVANTAGES OF THE INVENTION [019] In relation to the advantages and differentials presented by the 'SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES PRESENT IN THE SHEETS OF Spondia mombim x tuberous Spondia as more relevant, it can be highlighted as more relevant. :

[020] O inovador processo de extração simultâneo por líquido pressurizado e ultrassom permite extrair concentradas quantidade de compostos bioativos, como os flavonoides e outros compostos fenólicos, superior à quantidade destes compostos obtido pela extração por líquido pressurizado e ultrassom, quando analisadas separadamente.[020] The innovative process of simultaneous extraction by pressurized liquid and ultrasound allows extracting concentrated quantities of bioactive compounds, such as flavonoids and other phenolic compounds, higher than the quantity of these compounds obtained by extraction by pressurized liquid and ultrasound, when analyzed separately.

[021] Processo que permite a utilização de um e/ou mais diferentes solventes, para extrair compostos bioativos a partir das folhas de umbu-cajá. Entretanto, a eficiência da extração de flavonoides e outros compostos fenólicos de folhas de umbu-cajá (S. mombim x S. tuberosa) é melhorado com o uso dos solventes: hexano, acetato de etila e etanol de maneira sequencial, obtendo frações mais concentradas em flavonoides e outros compostos fenólicos.[021] Process that allows the use of one and / or more different solvents, to extract bioactive compounds from the umbu-cajá leaves. However, the efficiency of extracting flavonoids and other phenolic compounds from umbu-cajá leaves (S. mombim x S. tuberosa) is improved with the use of solvents: hexane, ethyl acetate and ethanol in a sequential manner, obtaining more concentrated fractions in flavonoids and other phenolic compounds.

[022] Processo que permite uma extração mais seletiva e por isso um maior aproveitamento de folhas de umbu-cajá, por utilizar o resíduo de uma[022] Process that allows for a more selective extraction and therefore a greater use of umbu-cajá leaves, by using the residue of a

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8/16 extração para realizar uma nova extração com solvente de diferente polaridade, dessa forma, é possível também obter um produto de melhor qualidade quando comparado com extrações utilizando apenas um solvente como agente extrator.8/16 extraction to perform a new extraction with solvent of different polarity, in this way, it is also possible to obtain a better quality product when compared to extractions using only one solvent as an extraction agent.

[023] Processo que permite a obtenção de extratos com elevado potencial biotecnológica, podendo, ser aplicado como componente/ingrediente ativo de novas formulações farmacêuticas, cosméticas e alimentícias, por exemplo;[023] Process that allows extracts with high biotechnological potential to be obtained and can be applied as an active component / ingredient in new pharmaceutical, cosmetic and food formulations, for example;

[024] Extrato obtido por processo seletivo e eficiente que apresenta elevado teor de flavonoides e outros compostos fenólicos e elevada atividade antioxidante;[024] Extract obtained by a selective and efficient process that has a high content of flavonoids and other phenolic compounds and high antioxidant activity;

[025] Processo que envolve a obtenção de extrato natural a partir de espécie vegetal (planta medicinal) utilizando solvente polar, apolar ou em escala de polaridade;[025] Process that involves obtaining a natural extract from a plant species (medicinal plant) using polar, nonpolar or polarity scale solvents;

[026] Extrato que apresenta composição diferenciada com a presença de compostos antioxidantes;[026] Extract that presents a different composition with the presence of antioxidant compounds;

[027] Processo que permite a produção em escala e aplicação industrial do extrato de umbu-cajá;[027] Process that allows the scale production and industrial application of umbu-cajá extract;

[028] O processo de obtenção é prático, seguro, e, pode ser aplicado em escala industrial.[028] The procurement process is practical, safe, and can be applied on an industrial scale.

[029] Assim, após apresentada às vantagens do referido processo e produto obtido, e, para que o processo da invenção proposta nesse documento de patente possa ser mais bem compreendido e avaliado, a descrição dos desenhos será feita a seguir.[029] Thus, after presenting the advantages of the aforementioned process and product obtained, and, so that the process of the invention proposed in that patent document can be better understood and evaluated, the description of the drawings will be made below.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [030] Para obter total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue:DESCRIPTION OF THE FIGURES [030] In order to obtain a total and complete visualization of the object of this invention, the figures to which reference is made are presented, as follows:

[031] A Figura 1 apresenta de forma ilustrativa, e em hipótese alguma de forma limitante, a unidade de extração típica habilitada para processos de extração com fluidos pressurizados e ultrassom. A unidade de extração é[031] Figure 1 shows, in an illustrative way, and in no way limiting, the typical extraction unit enabled for extraction processes with pressurized fluids and ultrasound. The extraction unit is

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 20/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 20/39

9/16 composta por Bomba de deslocamento positivo (Reaxus, 6010R, Teledyne, USA), bomba de seringa do tipo 500D (Teledine, D-series Pump Controller, Alemanha), célula extratora de aço inoxidável, filtros de aço sinterizado, transdutor de pressão, indicador de pressão, cuba ultrassônica (Eco-sonics, Q5.9/40A, Brasil), Válvulas de agulha e válvulas de esfera.9/16 consisting of positive displacement pump (Reaxus, 6010R, Teledyne, USA), 500D syringe pump (Teledine, D-series Pump Controller, Germany), stainless steel extraction cell, sintered steel filters, transducer pressure, pressure indicator, ultrasonic bowl (Eco-sonics, Q5.9 / 40A, Brazil), needle valves and ball valves.

[032] A Figura 2 apresenta de forma ilustrativa, e em hipótese alguma de forma limitante, a célula de extração desenvolvida para acoplamento dos processos, com líquidos pressurizados e ultrassom simultaneamente.[032] Figure 2 shows, in an illustrative way, and in no way limiting, the extraction cell developed for coupling the processes, with pressurized liquids and ultrasound simultaneously.

[033] A figura 3 apresenta de forma ilustrativa, e em hipótese alguma de forma limitante, apresenta-se gráficos com o rendimento global, quantidade total de compostos fenólicos e flavonoides totais dos extratos e frações obtidos com o processo desenvolvido.[033] Figure 3 presents illustratively, and under no circumstances is it limiting, graphs showing the overall yield, total amount of phenolic compounds and total flavonoids from the extracts and fractions obtained with the developed process.

[034] A figura 4 apresenta de forma ilustrativa, e em hipótese alguma de forma limitante, gráficos com os resultados dos testes in vitro de atividades antioxidantes dos extratos e frações obtidas com o processo desenvolvido.[034] Figure 4 presents, in an illustrative way, and in no way limiting, graphs with the results of the in vitro tests of antioxidant activities of the extracts and fractions obtained with the developed process.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [035] O objeto principal deste pedido de patente de invenção é descrever com detalhes o processo e o produto relacionado ao ‘PROCESSO DE EXTRAÇÃO POR LÍQUIDO PRESSURIZADO SIMULTÂNEO COM ULTRASSOM PARA OBTER FRAÇÕES MAIS CONCENTRADAS EM FLAVONOIDES E OUTROS COMPOSTOS FENÓLICOS A PARTIR DE FOLHAS DE S. mombim x S. tuberosa. Assim, mais especificamente, a invenção aqui revelada se refere a um processo para obtenção de extratos mais concentrados em compostos bioativos, como flavonoides e outros compostos fenólicos, com atividades antioxidantes a partir das folhas do umbu-cajá (S. mombim x S. tuberosa) por fluido pressurizado combinado a ultrassom simultaneamente em extração sequencial ou não, utilizando os solventesSUMMARY OF THE INVENTION [035] The main object of this patent application is to describe in detail the process and the product related to the 'SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS IN FLAVONOIDS AND OTHER PHENOLIC COMPOUNDS FROM LEAVES OF S. mombim x S. tuberosa. Thus, more specifically, the invention disclosed here refers to a process for obtaining extracts more concentrated in bioactive compounds, such as flavonoids and other phenolic compounds, with antioxidant activities from the leaves of umbu-cajá (S. mombim x S. tuberosa ) by pressurized fluid combined with ultrasound simultaneously in sequential or non-sequential extraction, using the solvents

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 21/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 21/39

10/16 hexano, acetato de etila e etanol. O dito extrato obtido pelo processo revelado possui uma maior capacidade antioxidante, superior em relação aos extratos obtidos pela extração por líquidos pressurizado e ultrassom, quando analisadas separadamente. É importante deixar claro que estes extratos podem usados posteriormente em formulações para a indústria farmacêutica, alimentícia e cosmética, por exemplo, devido a sua composição em compostos antioxidantes com importantes propriedades biológicas.10/16 hexane, ethyl acetate and ethanol. Said extract obtained by the revealed process has a greater antioxidant capacity, superior in relation to the extracts obtained by the extraction by pressurized liquids and ultrasound, when analyzed separately. It is important to make it clear that these extracts can be used later in formulations for the pharmaceutical, food and cosmetic industry, for example, due to their composition in antioxidant compounds with important biological properties.

[036] Para obtenção dos extratos com elevado potencial biotecnológico, o processo em questão deve envolver condições de temperatura, pressão e vazão favoráveis (definidas nessa invenção) para que assim, o dito extrato apresente concentrados extratos bioativos.[036] To obtain extracts with a high biotechnological potential, the process in question must involve favorable temperature, pressure and flow conditions (defined in this invention) so that the said extract presents concentrated bioactive extracts.

[037] Dentro do contexto apresentado, e, para que o processo desenvolvido e o produto obtido, objeto de proteção desse pedido de patente, possam ser compreendidos e avaliados de forma mais clara e objetiva, sua descrição detalhada será feita a seguir.[037] Within the context presented, and, so that the process developed and the product obtained, the object of protection of this patent application, can be understood and evaluated more clearly and objectively, its detailed description will be made below.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [038] A presente invenção trata-se de um processo de extração desenvolvido com o intuito de melhorar a capacidade de extração de flavonoides e outros compostos fenólicos a partir de folhas de S. mombin x S. tuberosa, usando um processo de extração por liquido pressurizado e ultrassom simultâneo. As folhas de S. mombin x S. tuberosa foram submetidas em uma etapa de extração com liquido pressurizado e ultrassom simultâneo, para melhorar a capacidade de extração de flavonoides e outros compostos fenólicos.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [038] The present invention is an extraction process developed in order to improve the extraction capacity of flavonoids and other phenolic compounds from S. mombin x S. tuberosa leaves, using a process of extraction by pressurized liquid and simultaneous ultrasound. The leaves of S. mombin x S. tuberosa were submitted to an extraction step with pressurized liquid and simultaneous ultrasound, to improve the extraction capacity of flavonoids and other phenolic compounds.

[039] Nesta seção serão descritos todos os detalhes do processo de desenvolvimento e obtenção do dito ‘PROCESSO DE EXTRAÇÃO POR LÍQUIDO PRESSURIZADO SIMULTÂNEO COM ULTRASSOM PARA OBTER FRAÇÕES MAIS CONCENTRADAS DE SUBSTÂNCIAS ATIVAS[039] In this section, all details of the development and obtaining process referred to as ‘SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO GET MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 22/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 22/39

11/1611/16

PRESENTES NAS FOLHAS DE Spondia mombimx Spondia tuberosa”, cujo intuito é descrever suficiente e clara, todas as etapas que envolvem o processo de obtenção do dito extrato com atividade antioxidante, oriundo de partes vegetais, mais especificamente folhas de umbu-cajá, e dessa forma, embasar a suficiência descritiva desta invenção. Assim, conforme mencionado anteriormente, a presente invenção se refere à um processo inovador de extração de compostos bioativos antioxidantes a partir das folhas secas do umbu-cajá por fluido pressurizado simultâneo com ultrassom, no qual o processo consiste na preparação das folhas, extração, identificação dos compostos e atividade antioxidante.PRESENTS ON THE LEAVES OF Spondia mombimx Spondia tuberosa ”, whose purpose is to describe sufficiently and clearly, all the stages that involve the process of obtaining the said extract with antioxidant activity, coming from plant parts, more specifically umbu-cajá leaves, and in this way , support the descriptive sufficiency of this invention. Thus, as previously mentioned, the present invention refers to an innovative process of extracting bioactive antioxidant compounds from the dried leaves of umbu-cajá by pressurized fluid simultaneously with ultrasound, in which the process consists of the preparation of the leaves, extraction, identification compounds and antioxidant activity.

[040] Para o desenvolvimento do referido extrato de folhas do umbu-cajá com atividade antioxidante as seguintes etapas de 1 a 4 devem ser consideradas:[040] For the development of the referred umbu-cajá leaf extract with antioxidant activity, the following steps 1 to 4 should be considered:

[041] Etapa 1 Preparação de folhas do umbu-cajá (S. mombim x S. tuberosa) [042] As folhas do umbu-cajá (S. mombim x S. tuberosa) devem ser preferencialmente secas, utilizando, por exemplo, secagem em estufa com circulação de ar em temperatura de 30 a 60°C, mais especificamente 40 a 45°C. Após a secagem o material deve ser triturado e separado por granulometria com preferencia para partículas com tamanho entre 16-32 mesh.[041] Step 1 Preparation of umbu-cajá leaves (S. mombim x S. tuberosa) [042] Umbu-cajá leaves (S. mombim x S. tuberosa) should preferably be dried, using, for example, drying in an oven with air circulation at a temperature of 30 to 60 ° C, more specifically 40 to 45 ° C. After drying, the material must be crushed and separated by granulometry, preferably for particles with size between 16-32 mesh.

[043] Etapa 2 (a) Processo de extração em alta pressão: líquidos pressurizados e (b) processo de extração em pressão atmosférica: ultrassom.[043] Step 2 (a) High pressure extraction process: pressurized liquids and (b) atmospheric pressure extraction process: ultrasound.

(a) Processo de extração em alta pressão:(a) High pressure extraction process:

[044] A extração com líquido pressurizada ou por líquido pressurizado acoplado com ultrassom foi realizada em uma célula extratora de aço inoxidável, que previamente a sua extremidade inferior contendo uma válvula de agulha e um filtro de aço sinterizado foi fechada, e em seguida foi colocado algodão, e esferas de vidro para melhoras a distribuição do fluido de extração e evitar possíveis entupimento do sistema de extração.[044] Extraction with pressurized liquid or by pressurized liquid coupled with ultrasound was performed in a stainless steel extraction cell, which previously had its lower end containing a needle valve and a sintered steel filter, and was then placed cotton, and glass beads to improve the distribution of the extraction fluid and avoid possible clogging of the extraction system.

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 23/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 23/39

12/16 [045] Após essa etapa, foi inserida a amostra vegetal, na quantidade 0.0001 g a 10 kg, preferencialmente, 2 g das partes vegetais do umbu-cajá, preferencialmente suas folhas. Em seguida, foi colocado novamente as esferas de vidro e algodão, e posteriormente a extremidade superior da célula de extração foi fechada. Todas as extrações foram realizadas dentro de um banho ultrassônico, preferencialmente na posição horizontal. Após a referida etapa, a extremidade superior da célula de extração foi conectada a uma bomba de deslocamento positivo, para a pressurização dos solventes líquidos e a uma bomba de seringa para pressurizar o CO2.12/16 [045] After this stage, the vegetable sample was inserted, in the amount 0.0001 g to 10 kg, preferably 2 g of the vegetable parts of the umbu-cajá, preferably its leaves. Then, the glass and cotton balls were placed again, and then the upper end of the extraction cell was closed. All extractions were performed in an ultrasonic bath, preferably in a horizontal position. After that step, the upper end of the extraction cell was connected to a positive displacement pump, for pressurizing liquid solvents and to a syringe pump to pressurize CO2.

[046] Antes de iniciar todas as extrações com a referida célula extratora mencionada anteriormente, o sistema foi pressurizado até uma pressão isobárica de 0,00001 bar a 1000 bar, preferencial, 100 bar e temperatura de 1 a 200°C, preferencialmente 40 °C. Em seguida o sistema foi mantido em modo estática durante 0.001 minutos á 48 h, preferencialmente 10 min, após este período, foi iniciado a extração em modo dinâmica, com a renovação de solvente em um fluxo continuo de 0.00001 mL a 1000 mL/min, preferencialmente 1 mL.[046] Before starting all extractions with the aforementioned extraction cell, the system was pressurized to an isobaric pressure of 0.00001 bar at 1000 bar, preferably 100 bar and temperature from 1 to 200 ° C, preferably 40 ° Ç. Then the system was kept in static mode for 0.001 minutes at 48 h, preferably 10 min, after this period, extraction in dynamic mode was started, with the renewal of solvent in a continuous flow from 0.00001 mL to 1000 mL / min, preferably 1 ml.

[047] Os solventes n-hexano, acetato de etila e etanol foram usados individualmente ou sequencialmente de acordo com as condições experimentais reveladas anteriormente. Todas as extrações podem ser realizadas durante 1 minuto ou 96 h, preferencialmente 120 min para cada solvente utilizado.[047] The solvents n-hexane, ethyl acetate and ethanol were used individually or sequentially according to the experimental conditions revealed above. All extractions can be carried out for 1 minute or 96 h, preferably 120 min for each solvent used.

[048] Para as extrações com líquido pressurizado acoplado com o ultrassom, o ultrassom foi ligado todo processo de extração. As condições experimentais foram as mesmas da extração líquido pressurizado sem ultrassom, reveladas anteriormente.[048] For extractions with pressurized liquid coupled with the ultrasound, the ultrasound was turned on throughout the extraction process. The experimental conditions were the same as for pressurized liquid extraction without ultrasound, previously revealed.

(b) Processo de extração em pressão atmosférica:(b) Extraction process at atmospheric pressure:

[049] Para as extrações utilizando o ultrassom em pressão atmosférica foi utilizada uma quantidade de amostra de 0.0001 g a 10 kg, preferencialmente, 2[049] For extractions using atmospheric pressure ultrasound, a sample amount of 0.0001 g to 10 kg, preferably 2

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 24/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 24/39

13/16 g das folhas de umbu-cajá. As amostras foram inseridas em erlenmeyer, contendo de 1 mL a 100 L de solvente, preferencialmente 120 mL de cada solvente n-hexano, acetato de etila e etanol. Em seguida, o erlenmeyer foi colocado dentro do banho ultrassônico com temperatura de 1 a 200°C, preferencialmente 40°C. As extrações foram realizadas em modo estático, durante o tempo de 1 min a 120 h, preferencialmente 120 min.13/16 g of the umbu-cajá leaves. The samples were inserted in a conical flask containing from 1 mL to 100 L of solvent, preferably 120 mL of each n-hexane solvent, ethyl acetate and ethanol. Then, the conical flask was placed inside the ultrasonic bath at a temperature of 1 to 200 ° C, preferably 40 ° C. The extractions were performed in static mode, during the time from 1 min to 120 h, preferably 120 min.

[050] Etapa 3 Secagem dos extratos [051] Após a extração, e, independente do método escolhido, todos os extratos devem ser secos em estufas com circulação de ar em temperatura de 30 a 60°C, mais especificamente de 35 a 40°C. Estufas á vácuo, desidratador ou rota-evaporador também podem ser utilizados para a secagem do extrato com o objetivo de realizar a evaporação total do solvente utilizado e, ao final do processo, obter o extrato puro de folhas de umbu-cajá, com elevado teor de compostos com atividade antioxidante.[050] Step 3 Drying the extracts [051] After extraction, and regardless of the method chosen, all extracts must be dried in greenhouses with air circulation at a temperature of 30 to 60 ° C, more specifically from 35 to 40 ° Ç. Vacuum greenhouses, dehydrator or route-evaporator can also be used to dry the extract in order to fully evaporate the solvent used and, at the end of the process, obtain the pure extract of umbu-cajá leaves, with high content of compounds with antioxidant activity.

[052] Após descritos todos os detalhes do processo de obtenção do dito extrato de umbu-cajá rico em compostos bioativos e com atividade antioxidante por meio da extração com fluidos pressurizados e ultrassom, serão apresentados os resultados da caracterização dos extratos utilizando técnicas específicas com o objetivo de evidenciar o potencial biotecnológico do dito extrato concretizado.[052] After describing all the details of the process of obtaining the said extract of umbu-cajá rich in bioactive compounds and with antioxidant activity through extraction with pressurized fluids and ultrasound, the results of the characterization of the extracts will be presented using specific techniques with the objective of highlighting the biotechnological potential of said extract.

[053] Rendimento dos extratos [054] Os resultados dos rendimentos obtidos no processo de extração por líquido pressurizado e ultrassom das folhas do umbu-cajá é apresentada na Figura 3. O resultado apresentado foi obtido a partir de 2 g de folhas de umbucajá secas a cerca de 40°C em estufa de circulação de ar. O presente gráfico apresenta a porcentagem dos rendimentos dos extratos de umbu-cajá com ultrassom (US), líquidos pressurizados (LP), simultâneo (LP-US) e sequencial simultâneo (ESS) com hexano (Hx), acetato de etila (Ac), etanol (Et). Todos os valores são reportados a partir da média ± desvio padrão.[053] Extract yield [054] The yield results obtained in the pressurized liquid and ultrasound extraction process of the umbu-cajá leaves are shown in Figure 3. The result presented was obtained from 2 g of dried umbucajá leaves at about 40 ° C in an air circulation oven. This graph shows the percentage of yields of umbu-cajá extracts with ultrasound (US), pressurized liquids (LP), simultaneous (LP-US) and simultaneous sequential (ESS) with hexane (Hx), ethyl acetate (Ac) , ethanol (Et). All values are reported from the mean ± standard deviation.

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 25/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 25/39

14/16 [055] Com base nos resultados apresentados na Figura 3, foi identificada maior porcentagem de rendimento global para o solvente de maior polaridade, o etanol. As extrações a alta pressão foram mais eficientes em termos de rendimento global do que as extrações em pressão atmosférica usando o ultrassom, porém a combinação de líquidos pressurizados simultâneo com ultrassom foi o processo de extração mais eficiente para a obtenção de extratos das folhas do umbu-cajá. O somatório das frações obtidas no processo sequencial simultâneo demonstrou maior relevância em termos de rendimento global, comparado com extrações individuais e simultâneas. Sugere-se, além disso, que a fração etanol (Et) obtido após as sequenciais extrações por hexano (Hx) e por acetato de etila (Ac) apresentou um menor rendimento. Assim é possível observar que a extração sequencial pode apresentar um maior aproveitamento das folhas do umbu-cajá, haja vista que essa extração por três solventes produz três extratos diferentes, enquanto a extração não sequencial produz apenas um extrato. É importante frisar que os três extratos Hx, Ac, Et, obtidos pelo processo sequencial poderão ser de importância para o que diz respeito a atividade antioxidante, em virtude dos compostos bioativos extraídos. Para uma melhor avaliação da qualidade dos bioativos extraídos é interessante quantificar os flavonoides e os compostos fenólicos totais dos extratos do umbucajá Hx, Ac e Et.14/16 [055] Based on the results presented in Figure 3, a higher percentage of global yield was identified for the most polar solvent, ethanol. High pressure extractions were more efficient in terms of overall performance than atmospheric pressure extractions using ultrasound, however the combination of pressurized liquids simultaneously with ultrasound was the most efficient extraction process for obtaining umbu leaf extracts. cajá. The sum of the fractions obtained in the simultaneous sequential process demonstrated greater relevance in terms of overall yield, compared to individual and simultaneous extractions. It is also suggested that the ethanol fraction (Et) obtained after the sequential extractions by hexane (Hx) and ethyl acetate (Ac) showed a lower yield. Thus it is possible to observe that the sequential extraction can present a greater use of the umbu-cajá leaves, given that this extraction by three solvents produces three different extracts, while the non-sequential extraction produces only one extract. It is important to note that the three extracts Hx, Ac, Et, obtained by the sequential process may be of importance for the antioxidant activity, due to the extracted bioactive compounds. For a better evaluation of the quality of the extracted bioactive it is interesting to quantify the flavonoids and the total phenolic compounds of the umbucajá extracts Hx, Ac and Et.

[056] Etapa 4 Caracterização química dos extratos: (a) Fenóis totais e (b) Flavonoides totais e (c) atividade antioxidante.[056] Step 4 Chemical characterization of the extracts: (a) Total phenols and (b) Total flavonoids and (c) antioxidant activity.

Preparação da amostra para caracterização química dos extratos [058] Para a realização dos ensaios de fenóis, flavonoides e DPPH, foi pesado 10 mg de extrato das folhas de umbu-cajá, diluído em 5 ml de metanol, gerando uma solução mãe de extrato. A partir desta solução que foi realizado todos os ensaios quantitativos desta presente invenção (fenóis, flavonoides e atividade antioxidante).Sample preparation for chemical characterization of the extracts [058] To perform the phenols, flavonoids and DPPH tests, 10 mg of umbu-cajá leaf extract was weighed, diluted in 5 ml of methanol, generating a mother extract solution. From this solution, all quantitative tests of this invention (phenols, flavonoids and antioxidant activity) were carried out.

Quantificação dos teores de flavonoides totaisQuantification of total flavonoid levels

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 26/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 26/39

15/16 [059] Para a determinação dos teores dos flavonoides totais, foi pesado 10 g de nitrato de alumínio, e diluído em 100 mL de metanol, usando um balão volumétrico. Além disso, também foi pesado 9,8 g de acetato de potássio, diluído em 100 mL de água destilada. Ambas as diluições relatadas acima foram deixadas separadamente em banho ultrassônico por 30 min.15/16 [059] To determine the levels of total flavonoids, 10 g of aluminum nitrate was weighed and diluted in 100 mL of methanol using a volumetric flask. In addition, 9.8 g of potassium acetate, diluted in 100 mL of distilled water, were also weighed. Both dilutions reported above were left separately in an ultrasonic bath for 30 min.

[060] Após esse período, foram adicionados em tubos de ensaio 0,5 mL da solução contendo o extrato das folhas de umbu-cajá, 0,1 mL de nitrato de alumínio, 0,1 mL de acetato de potássio e por fim, 4,3 mL de metanol.[060] After this period, 0.5 ml of the solution containing the extract of the umbu-cajá leaves, 0.1 ml of aluminum nitrate, 0.1 ml of potassium acetate and finally, 4.3 mL of methanol.

[075] A quantificação foi determinada através da interpolação da absorbância das amostras contra uma curva de calibração construída com o padrão rutina (y = 0,001x; R² = 0,9998), nas concentrações de 0, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 e 600 Dg rutina/mL. Todas as amostras foram analisadas em espectrofotômetro, utilizando um comprimento de onda de 415 nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.[075] Quantification was determined by interpolating the absorbance of the samples against a calibration curve constructed with the rutin standard (y = 0.001x; R ² = 0.9999), at concentrations of 0, 5, 10, 25, 50 , 100, 200, 300, 400 and 600 Dg rutin / mL. All samples were analyzed on a spectrophotometer, using a wavelength of 415 nm. All tests were performed in triplicate.

Quantificação dos teores de compostos fenólicos totais [061] Os compostos fenólicos totais foram quantificados utilizando 7 mL do reagente de Folin-Ciocalteu, diluído em água destilada em um balão volumétrico até 100 mL. Também foi pesado 7,5 g de carbonato de cálcio que foi diluído em 100 mL de água destilada, utilizando um balão volumétrico. A referida diluição foi deixada no ultrassom durante 30 min.Quantification of the contents of total phenolic compounds [061] The total phenolic compounds were quantified using 7 mL of the Folin-Ciocalteu reagent, diluted in distilled water in a volumetric flask up to 100 mL. 7.5 g of calcium carbonate was also weighed, which was diluted in 100 ml of distilled water, using a volumetric flask. The said dilution was left on the ultrasound for 30 min.

[062] Após esse período, foram adicionados em tubos de ensaios 0,5 mL de solução contendo o extrato das folhas de umbu-cajá, 2,5 mL de FolinCiocalteu, 2,0 mL de carbonato de cálcio.[062] After this period, 0.5 ml of solution containing the extract of the umbu-cajá leaves, 2.5 ml of FolinCiocalteu, 2.0 ml of calcium carbonate were added in test tubes.

[063] A quantificação foi determinada através da interpolação da absorbância das amostras contra uma curva de calibração construída com o padrão ácido gálico (y = 0,0108x; R2 = 0,9997), nas concentrações de 0, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 e 600 pg ácido gálico /mL. Todas as amostras foram analisadas em um espectrofotômetro utilizando um comprimento de onda de 715 nm. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.[063] Quantification was determined by interpolating the absorbance of the samples against a calibration curve constructed with the gallic acid standard (y = 0.0108x; R2 = 0.9999), at concentrations of 0, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 and 600 pg gallic acid / ml. All samples were analyzed on a spectrophotometer using a wavelength of 715 nm. All tests were performed in triplicate.

Petição 870180134142, de 25/09/2018, pág. 27/39Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 27/39

16/1616/16

Determinação da capacidade antioxidante (DPPH) [064] Para a determinação da atividade antioxidante dos extratos de umbu-cajá, foram utilizadas 5 concentrações de extrato (3,1, 6,2, 12,5, 25 e 50 g/mL). A solução de DPPH foi preparada utilizando 2,4 mg de DPPH diluídas em 100 mL de metanol. Esta solução foi solubilizada no ultrassom durante 30 min.Determination of antioxidant capacity (DPPH) [064] To determine the antioxidant activity of umbu-cajá extracts, 5 extract concentrations were used (3.1, 6.2, 12.5, 25 and 50 g / mL). The DPPH solution was prepared using 2.4 mg of DPPH diluted in 100 ml of methanol. This solution was solubilized on ultrasound for 30 min.

[065] A capacidade antioxidante foi realizada utilizando 400 pL de amostra diluída em 2600 pL da solução de DPPH. Os testes foram mantidos protegidos da luz, para evitar os efeitos de degradação por fatores externos. Todos os ensaios foram realizados em triplicata utilizando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 517 nm.[065] The antioxidant capacity was performed using 400 pL of sample diluted in 2600 pL of the DPPH solution. The tests were kept protected from light, to avoid the effects of degradation by external factors. All tests were performed in triplicate using a spectrophotometer at a wavelength of 517 nm.

Claims

1. SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES PRESENT IN THE LEAVES OF Spondia mombim x Spondia tuberosa, CHARACTERIZED by obtaining extracts rich in flavonoids and other phenolic compounds, obtained more specifically from the plant parts, obtained from the more specific parts of the plants of leaves, of S. mombin x S. tuberosa (umbu-cajá), using the extraction process with pressurized liquids and ultrasound simultaneously or separately, using polar and nonpolar solvents, by means of direct and / or sequential extraction, preferably through steps (1), (2), (3) and (4).

2. PROCESS, according to claim 1, CHARACTERIZED IN that step (1) involves the preparation of the leaves of S. mombin x S. tuberosa (umbucajá), which, after collected, should preferably be dried, using, for example , oven drying with air circulation at a temperature of 30 to 60 ° C, more specifically 40 to 45 ° C, or using a vacuum oven or dehydrator, and after drying the material must be crushed and separated by granulometry with preference for particles with size between 8-16 mesh.

3. EXTRACTION PROCESS, according to claims 1 and 2, CHARACTERIZED BY the fact that step (2) involves obtaining said extract, where 0.0001 g to 10 kg, preferably 2 g of the material obtained in the previous step, should be used (step 1), and, the material must be accommodated in a closed extraction cell and connected by pressurization pumps in suitable supercritical extraction equipment, of any make, model and / or capacity, and the extraction must take place under isobaric pressure from 0.00001 to 1000 bar, more specifically from 100 bar, at a temperature of 1 to 200 ° C, more specifically from 35 to 45 ° C and flow rate from 0.00001 mL to 1000

Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 10/39

2/3 mL / min milliliter per minute, more specifically from 0.9 to 1.1 milliliter per minute, using as solvents hexane, ethyl acetate and ethanol;

4. EXTRACTION, according to claims 1,2 and 3 CHARACTERIZED IN that step (3) involves obtaining said extract, using ultrasound at atmospheric pressure and / or pressurized fluids, preferably the extraction must be carried out by pressurized fluids and ultrasound in a single step, using different plant parts such as root, seed, fruit, bark and leaves, preferably the leaves of Spondia mombim x Spondia tuberosa, dry or fresh, more specifically its dry leaves.

5. SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES PRESENT IN THE LEAVES OF Spondia mombim x Spondia tuberosa, according to claim 1a

4, FEATURE THAT step (4) involves obtaining the extract using only solvent, preferably using n-hexane, ethyl acetate and ethanol, and sequential extraction can also be applied, first with more non-polar solvent (volume of 0.001 to 1000 mL), then ethyl acetate (volume from 0.001 to 1000 mL) and finally the most polar solvent, ethanol (volume from 0.001 to 1000 mL), and, before extractions with ethyl acetate and ethanol, must be passed low-pressure carbon dioxide to ensure that the leaves are dried again, removing as much as possible the hexane and ethyl acetate solvents that could be impregnated in the leaves by the sequential process;

6. SIMULTANEOUS PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION PROCESS WITH ULTRASOUND TO OBTAIN MORE CONCENTRATED FRACTIONS OF ACTIVE SUBSTANCES PRESENT IN THE LEAVES OF Spondia mombim x Spondia tuberosa, according to claim 1 a

5, CHARACTERIZED BY step (4) involving drying of the extracts, where, after extraction, and, regardless of the method chosen, all extracts

Petition 870180134142, of 09/25/2018, p. 11/39

3/3 must be dried in greenhouses with air circulation at a temperature of 30 to 30 ° C, more specifically from 35 to 40 ° C, and also, using greenhouses or a rotary evaporator, with the objective of completely evaporating the solvent used and , at the end of the process, obtain the pure extract of umbu-cajá leaves with a high content of phenolic compounds and with antioxidant activity;

7. ACTIVE SUBSTANCES, obtained from the process of claims 1 to 6, CHARACTERIZED BY being used as a pharmacologically active component in different pharmaceutical, cosmetic and food formulations.