BR102018013335A2

BR102018013335A2 - BLACK FUNGAL CELL LYSATE IN HEALING CUTANEOUS INJURIES

Info

Publication number: BR102018013335A2
Application number: BR102018013335-7A
Authority: BR
Inventors: Sâmela Miranda Da Silva; Naila Ferreira Da Cruz; Aline Barral Takahashi; Moises Batista Da Silva; Claudio Guedes Salgado
Original assignee: Universidade Federal Do Pará
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2020-01-07

Abstract

lisado celular de fungos negros na cicatrização de lesões cutâneas a cicatrização cutânea é um processo dinâmico que envolve uma combinação sincronizada e coordenada de vários tipos celulares e que tem como objetivo o restabelecimento da função protetora da pele. diferentes organismos e moléculas vêm sendo investigados por conta dos seus efeitos benéficos na estimulação do processo de cicatrização. achados decorrentes de exames histopatológicos do tecido das lesões de pacientes com cromoblastomicose, causada por fungos negros, demonstram infiltrado inflamatório granulomatoso denso, com acentuada fibrose sugerindo que os agentes etiológicos podem influenciar no processo de cicatrização. a aplicação tópica dos lisados fúngicos, e suas frações, das diferentes formas celulares em lesões cutâneas promoveram o estímulo de cicatrização de segunda intenção in vivo em camundongos balb/c, estimulando a reepitelização de forma semelhante a utilização de creme com antibiótico. estes resultados demonstram que os lisados celulares apresentam uma potencial propriedade cicatrizante no reparo de lesões cutâneas que podem ser aproveitadas em formulações cosméticas, de caráter terapêutico.cell lysate of black fungi in the healing of skin lesions skin healing is a dynamic process that involves a synchronized and coordinated combination of various cell types and aims to restore the protective function of the skin. different organisms and molecules have been investigated because of their beneficial effects in stimulating the healing process. findings from histopathological examinations of the tissue of lesions of patients with chromoblastomycosis, caused by black fungi, demonstrate a dense granulomatous inflammatory infiltrate, with marked fibrosis suggesting that the etiological agents may influence the healing process. the topical application of fungal lysates, and their fractions, of different cell forms in skin lesions promoted the stimulation of second intention healing in mice in balb / c mice, stimulating reepithelization in a similar way to the use of antibiotic cream. these results demonstrate that cell lysates have a potential healing property in the repair of skin lesions that can be used in cosmetic formulations, of a therapeutic nature.

Description

LISADO CELULAR DE FUNGOS NEGROS NA CICATRIZAÇÃO DE LESÕES CUTÂNEAS [001] A presente patente de invenção refere-se ao uso tópico de lisado fúngico dos agentes etiológicos da cromoblastomicose para regeneração de tecidos e cicatrização de lesões cutâneas que encontra destacado benefício na área de saúde, no tratamento de patologias cicatriciais; além de descrever seu processo de obtenção e aplicações. A referida invenção se situa nos campos da química, microbiologia, biologia celular, farmacologia, bioquímica e medicina.BLACK FUNGAL CELL LYSATE IN THE CICATRIZATION OF SKIN INJURIES [001] The present invention patent refers to the topical use of fungal lysate of the etiological agents of chromoblastomycosis for tissue regeneration and healing of cutaneous lesions, which has an outstanding benefit in the health area, in the treatment of cicatricial pathologies; in addition to describing its procurement process and applications. This invention is located in the fields of chemistry, microbiology, cell biology, pharmacology, biochemistry and medicine.

[002] A pele é o maior órgão do ser humano, sendo essencialmente composta por duas camadas, uma camada externa (epiderme) e um mesênquima interno (derme), ricamente inervada e vascularizada, e é preenchida por folículos pilosos e glândulas sebáceas que surgem de células da pele durante o desenvolvimento¹. Possui uma gama de funções², entre elas: ser a primeira linha de defesa do corpo contra organismos infecciosos e danos físicos³, e proporcionar uma barreira protetora contra a desidratação, perda de carboidratos e proteínas entre as vísceras do corpo e o mundo externo, além da termorregulação corporal⁴.[002] The skin is the largest organ of the human being, being essentially composed of two layers, an outer layer (epidermis) and an internal mesenchyma (dermis), richly innervated and vascularized, and is filled with hair follicles and sebaceous glands of skin cells during development ¹ . It has a range of functions ² , including: being the body's first line of defense against infectious organisms and physical damage ³ , and providing a protective barrier against dehydration, loss of carbohydrates and proteins between the viscera of the body and the outside world, in addition to body thermoregulation ⁴ .

[003] Essa função protetora pode ser comprometida por uma perda de continuidade nas células epiteliais da pele ou mucosa resultante de danos físicos ou térmicos, por exemplo, como ocorre em punções e cortes⁵. Considera-se como lesão cutânea toda ruptura de tecido de estrutura anatômica normal com perda consecutiva de função². O reparo pode ocorrer de duas formas dependendo da quantidade de tecido lesado ou danificado e a presença ou não de infecção. No caso de uma lesão asséptica, incisiva, sem complicações e com pouca perda de tecido cujas bordas são aproximadas por sutura, a lesão é curada por cicatrização de primeira intenção, onde ocorre reepitelização e reparo do tecido conjuntivo, resultando em reparo anatômico rápido e adequado. Já nos casos de lesões das camadas profundas da pele, mais amplas e de bordas afastadas, se faz necessário a formação de tecido de granulação para então ocorrer a reepitelização e assim fechar a lesão. O processo de cicatrização neste caso é lento e resulta na formação de tecido cicatricial, sendo conhecido por cicatrização[003] This protective function can be compromised by a loss of continuity in the epithelial cells of the skin or mucosa resulting from physical or thermal damage, for example, as occurs in punctures and cuts ⁵ . A skin lesion is considered to be any rupture of tissue of normal anatomical structure with consecutive loss of function ² . Repair can occur in two ways depending on the amount of tissue injured or damaged and the presence or absence of infection. In the case of an aseptic, incisive lesion, without complications and with little loss of tissue whose edges are approached by suture, the lesion is cured by healing of first intention, where reepithelization and repair of the connective tissue occurs, resulting in rapid and adequate anatomical repair. . In the case of lesions of the deep layers of the skin, which are broader and with distant edges, it is necessary to form granulation tissue to re-epithelialize and then close the lesion. The healing process in this case is slow and results in the formation of scar tissue, known as healing

Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 7/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 7/33

2/10 de segunda intenção. E, em alguns casos, podem ser contaminadas, colonizadas ou infectadas por bactérias^6,7.2/10 second intention. And in some cases, they can be contaminated, colonized or infected by bacteria ^6,7 .

[004] A cicatrização começa diretamente após a lesão e pode durar anos, e é um processo complexo e dinâmico que envolve uma combinação sincronizada e coordenada de componentes da matriz extracelular (MEC), diferentes tipos celulares, fatores bioquímicos, incluindo proteases e inibidores de proteases, citocinas e fatores de crescimento^8-10, consistindo em quatro fases contínuas: hemostasia, inflamação, proliferação celular e remodelação ou maturação de tecidos, sobrepostas em tempo e espaço precisamente, e moduladas por interações sinérgicas entre a derme e a epiderme^1,11-14 [005] Os métodos atualmente utilizados para acelerar ou pelo menos evitar o retardo da cicatrização cutânea incluem debridamento, administração de antibióticos¹⁵, oxigenoterapia hiperbárica¹⁶, estimulação elétrica, e coberturas proteicas¹⁷, todas, porém, com altos custos do tratamento¹⁸.[004] Healing begins directly after the injury and can last for years, and is a complex and dynamic process that involves a synchronized and coordinated combination of components of the extracellular matrix (ECM), different cell types, biochemical factors, including proteases and inhibitors of proteases, cytokines and growth factors ^8-10 , consisting of four continuous phases: hemostasis, inflammation, cell proliferation and tissue remodeling or maturation, overlapping in time and space precisely, and modulated by synergistic interactions between the dermis and epidermis ^{1, 11-14} [005] The methods currently used to accelerate or at least avoid delayed skin healing include debridement, administration of antibiotics ¹⁵ , hyperbaric oxygen therapy ¹⁶ , electrical stimulation, and protein coatings ¹⁷ , all, however, with high treatment costs. ¹⁸ .

[006] Considerando o campo de aplicação, mesmo com os aprimoramentos no diagnóstico e na terapia das cicatrizes e feridas, o tratamento destas, além de demorado, comporta poucas abordagens sistematicamente bem sucedidas, fazendo das patologias cicatriciais verdadeiros problemas de saúde pública, com grande impacto sobre os custos de assistência à saúde. Além do mais, os transtornos estéticos e funcionais impostos pelas patologias cicatriciais proporcionam importantes limitações físicas e emocionais.[006] Considering the field of application, even with the improvements in the diagnosis and therapy of scars and wounds, the treatment of these, in addition to being time-consuming, involves few systematically successful approaches, making cicatricial pathologies real public health problems, with great impact on health care costs. Furthermore, the aesthetic and functional disorders imposed by cicatricial pathologies provide important physical and emotional limitations.

[007] Apesar de vários preparados tópicos comerciais para o manejo de lesões cutâneas, a maioria dos produtos disponíveis tem atividade antimicrobiana em vez de efeito cicatrizante, e por vezes toxicidade ou perfomance negativas, como no caso de sulfadiazina de prata em fibroblastos¹⁹.[007] Despite several commercial topical preparations for the management of skin lesions, most of the available products have antimicrobial activity instead of healing effect, and sometimes negative toxicity or performance, as in the case of silver sulfadiazine in fibroblasts ¹⁹ .

[008] Novas metodologias e moléculas que estimulem o processo de cicatrização conduzindo para um melhor reparo tecidual, ou redução de custos, e a prevenção de cicatrizes hipertróficas ou quelóides vem sendo pesquisadas. Vários produtos naturais e vegetais mostraram efeitos em uma ou mais etapas do processo de cicatrização de lesões, contribuindo especialmente para desinfecção,[008] New methodologies and molecules that stimulate the healing process leading to better tissue repair, or cost reduction, and the prevention of hypertrophic scars or keloids have been researched. Various natural and vegetable products have shown effects in one or more stages of the wound healing process, contributing especially to disinfection,

Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 8/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 8/33

3/10 debridamento e fornecimento de um ambiente para incentivar o estabelecimento de um processo de cicatrização eficaz^20,21. Além do mais, apresentam baixo custo, disponibilidade e menos efeitos colaterais^19,22,23. Tratamentos com células ou substâncias que aumentam a capacidade reparativa do corpo, usados em lesões agudas ou crônicas complexas atuam promovendo microambientes que incentivam a proliferação das células do estroma e de células endoteliais no local da lesão, além da formação de uma rede vascular sobre o tecido recémformado²⁴.3/10 debridement and providing an environment to encourage the establishment of an effective healing process ^20,21 . In addition, they have low cost, availability and fewer side effects ^19,22,23 . Treatments with cells or substances that increase the body's reparative capacity, used in complex acute or chronic lesions work by promoting microenvironments that encourage the proliferation of stromal cells and endothelial cells at the injury site, in addition to the formation of a vascular network over the tissue recently graduated ²⁴ .

[009] Embora boa parte dos estudos investiguem a ação de produtos vegetais na cicatrização, já existe na literatura científica ensaios com biopolímeros de outras fontes, como por exemplo os pedidos de patente PI 0504952-0 A, depositado em 25/11/2005 que descreve o uso de quitina e quitosana na preparação de membranas para regeneração de tecidos e cicatrizações em ferimentos e queimaduras, o BR 10 2012 033126-8 A2, depositado 21/12/2012 que trata de um processo de obtenção de produtos a base de quitosana e enriquecidos com extrato de Arrabidaea chica, que tem como produtos finais nanoparticulas, filmes, hidrogeis e esponjas que são aplicados na cicatrização de úlceras cutâneas, úlceras de mucosa causadas por agentes químicos e/ou físicos, além de úlceras do trato gastrointestínal, ou ainda o PI 1004841-3 A2, depositado em 19/10/2010 que descreve o uso de uma membrana composta por quitosona e alginato podendo ou não estar associada a agentes antimicrobianos.[009] Although most studies have investigated the action of plant products on healing, there are already studies in the scientific literature with biopolymers from other sources, such as patent applications PI 0504952-0 A, filed on 11/25/2005 that describes the use of chitin and chitosan in the preparation of membranes for tissue regeneration and healing in wounds and burns, BR 10 2012 033126-8 A2, deposited 12/21/2012 that deals with a process of obtaining products based on chitosan and enriched with Arrabidaea chica extract, whose final products are nanoparticles, films, hydrogels and sponges that are applied in the healing of skin ulcers, mucosal ulcers caused by chemical and / or physical agents, in addition to ulcers of the gastrointestinal tract, or even PI 1004841-3 A2, deposited on 10/19/2010 which describes the use of a membrane composed of chitosone and alginate, which may or may not be associated with antimicrobial agents.

[010] Outro exemplo de biopolímero investigado com ação cicatrizante é a melanina. A função da melanina na pele está bem definida quanto à pigmentação, mas outras propriedades como a condutância elétrica, a fotoproteção e a atividade antioxidante já foram determinadas. Um ensaio recente mostrou que a incorporação de melanina em hidrogéis esponjosos resultou no recrutamento de queratinócitos e controle da inflamação, sem efeitos colaterais citotóxicos²⁵. A melanina não é exclusiva da pele humana, podendo ser isolada de outros seres vivos como plantas, bactérias e fungos, como exemplo, no Fonsecaea pedrosoi, um fungo negro que é um dos agentes etiológicos da cromoblastomicose (CBM).[010] Another example of a biopolymer investigated with healing action is melanin. The role of melanin in the skin is well defined in terms of pigmentation, but other properties such as electrical conductance, photoprotection and antioxidant activity have already been determined. A recent trial showed that the incorporation of melanin in spongy hydrogels resulted in the recruitment of keratinocytes and control of inflammation, without cytotoxic side effects ²⁵ . Melanin is not exclusive to human skin, and can be isolated from other living beings such as plants, bacteria and fungi, for example, in Fonsecaea pedrosoi, a black fungus that is one of the etiological agents of chromoblastomycosis (CBM).

Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 9/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 9/33

4/10 [011] Na CBM, o comprometimento de tecidos cutâneos e subcutâneos está associado com o aspecto papilomatoso característico das lesões, que pode ser acompanhado por hiperceratinização levando ao aspecto verrucoso da lesão e fibrose cicatricial. Na histopatologia, são observados o espessamento do estrato córneo, hiperqueratose e hiperplasia pseudoepiteliomatosa, e mais profundamente na derme e no tecido subcutâneo observa-se infiltrado não específico e difuso^26-29, com acentuada fibrose, associada a células mononucleares (histiócitos, linfócitos e células plasmáticas), células epiteliais, células gigantes e células polimorfonucleares³⁰, com a presença in situ de TGF-β, inclusive em alguns vasos (provavelmente em plaquetas) e nas áreas fibróticas (macrófagos), sem detecção de células secretoras de IFN-γ. O TGF-β é um importante regulador da proliferação celular, diferenciação e formação de MEC, desempenhando um papel na regulação da matriz extracelular e participando da formação de granulomas e fibrose³¹. A partir dessas observações, foi pensado na utilização do lisado de fungos negros para acelerar o processo de cicatrização.4/10 [011] In CBM, the involvement of cutaneous and subcutaneous tissues is associated with the papillomatous aspect characteristic of the lesions, which can be accompanied by hyperkeratinization leading to the verrucous aspect of the lesion and scar fibrosis. In histopathology, thickening of the stratum corneum, hyperkeratosis and pseudoepitheliomatous hyperplasia are observed, and more deeply in the dermis and subcutaneous tissue there is a non-specific and diffuse infiltrate ^26-29 , with marked fibrosis, associated with mononuclear cells (histiocytes, lymphocytes and plasma cells), epithelial cells, giant cells and polymorphonuclear cells ³⁰ , with the presence in situ of TGF-β, including in some vessels (probably in platelets) and in fibrotic areas (macrophages), without detection of IFN-γ secreting cells . TGF-β is an important regulator of cell proliferation, differentiation and formation of ECM, playing a role in the regulation of the extracellular matrix and participating in the formation of granulomas and fibrosis ³¹ . From these observations, it was thought about the use of black fungus lysate to accelerate the healing process.

Obtenção dos Lisados Fúngicos [012] Foram utilizadas cepas de agentes etiológicos da cromoblastomicose que apresentam bom crescimento em meio de cultura, com grande formação de conídios, e que apresenta rápida diferenciação em células muriformes quando comparada a outras cepas da micoteta do Laboratório de Dermato-Imunologia (LDI).Obtaining the Fungal Lysates [012] Strains of etiological agents of chromoblastomycosis were used, which show good growth in culture medium, with great conidia formation, and which show rapid differentiation in muriform cells when compared to other strains of the laboratory of Dermato- Immunology (LDI).

[013] Utilizando o processo descrito para o cultivo e isolamento das células germinativas e indução das formas parasitarias³² como descrito no pedido de patente PI 0520730-4 A2, mantidos em temperatura ambiente por 48 horas.[013] Using the process described for the cultivation and isolation of germ cells and induction of parasitic forms ³² as described in patent application PI 0520730-4 A2, kept at room temperature for 48 hours.

[014] Após a contagem de 6x10⁴ conídios ou células muriformes em câmara de Neubauer ou por densidade óptica com o auxílio de espectrofotometria (0,15 a 0,17 D.O), os inóculos foram diluídos em soro fisiológico separadamente até completar 3 ml e ultrasonicados (BANDELIN Sonoplus, Ultrasonic Homogenizers, HD 2070) e posteriormente filtrados por filtro de membrana PES 0,22 μΜ.[014] After counting 6x10 ⁴ conidia or muriform cells in a Neubauer chamber or by optical density with the aid of spectrophotometry (0.15 to 0.17 OD), the inoculants were diluted in saline separately to make up to 3 ml and ultrasonic (BANDELIN Sonoplus, Ultrasonic Homogenizers, HD 2070) and subsequently filtered through a 0.22 μΜ PES membrane filter.

Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 10/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 10/33

5/10 [015] As composições geradas podem ser apresentadas na forma do próprio lisado ou incluídas em formulações nas formas de spray, saponáceos, creme, pomada, gel ou em formulações para embeber curativos, entre outras dependendo da necessidade de aplicação e do veiculo utilizado. O uso tópico de medicamentos para cicatrização é fortemente indicado por ser de fácil aplicação, sendo normalmente utilizados em ambiente domiciliar, não estando associada a processos invasivos como a utilização de injetáveis, sendo capazes de proporcionar resultados progressivos, de fácil acompanhamento e controle, além de apresentar baixos índices de complicações. Essa invenção pode, entretanto, ser expressa em diferentes formas e concentrações não devendo ser interpretada como limitada à modalidade aqui apresentada.5/10 [015] The generated compositions can be presented in the form of the lysate itself or included in formulations in the forms of spray, soaps, cream, ointment, gel or in formulations for soaking dressings, among others depending on the need for application and the vehicle used. The topical use of medicines for healing is strongly indicated because it is easy to apply, being normally used in the home environment, not being associated with invasive processes such as the use of injectables, being able to provide progressive results, easy to follow and control, in addition to low complication rates. This invention can, however, be expressed in different forms and concentrations and should not be interpreted as limited to the modality presented here.

Avaliação da atividade cicatrizante [016] Foram utilizados camundongos isogênicos BALB/c, machos, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área de Ciência de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Campinas e mantidos no biotério de manutenção do Laboratório de Dermato-imunologia (LDI), alimentados com ração e água ad libitium, e isolados em gaiolas com fluxo laminar individual e filtro HEPA.Evaluation of healing activity [016] Male BALB / c isogenic mice, from the Multidisciplinary Center for Biological Research in the Laboratory Animal Science Area of the State University of Campinas and maintained in the maintenance laboratory of the Dermato-immunology Laboratory ( LDI), fed with food and water ad libitium, and isolated in cages with individual laminar flow and HEPA filter.

[017] Durante os procedimentos, os camundongos foram conduzidos mediante anestesia da associação de Cloridrato de Cetamina 10% (Dopalen, Agribrands Brasil Ltda) [1pl/peso(g)] e Cloridrato de Xilazina (Anasedan, Vetbrands Brasil Ltda) [0,5pl/peso (g)]. Após a anestesia, os animais foram posicionados em decúbito ventral e submetidos a tricotomia do dorso, seguida de antissepsia com álcool etílico 70%. As lesões cirúrgicas foram realizadas com utilização de um punch de 8 mm de diâmetro, até a exposição da fáscia muscular dorsal 33.[017] During the procedures, the mice were conducted under anesthesia by the association of Ketamine Hydrochloride 10% (Dopalen, Agribrands Brasil Ltda) [1pl / weight (g)] and Xylazine Hydrochloride (Anasedan, Vetbrands Brasil Ltda) [0, 5pl / weight (g)]. After anesthesia, the animals were placed in prone position and submitted to trichotomy of the back, followed by antisepsis with 70% ethyl alcohol. Surgical injuries were performed using a 8 mm diameter punch until the dorsal muscle fascia was exposed 33.

[018] Após a confecção da lesão excisional, os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos para aplicação dos tratamentos diferenciados para cada um dos grupos:[018] After making the excisional lesion, the animals were randomly assigned to groups for the application of different treatments for each group:

1°- grupo CM: aplicação tópica do lisado celular de células muriformes;1st - CM group: topical application of the cell lysate of muriform cells;

2°- grupo C: aplicação tópica do lisado celular de conídios;2nd - group C: topical application of the conidial cell lysate;

Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 11/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 11/33

6/106/10

3°- grupo CP: aplicação tópica de sulfato de neomicina e bacitracina zíncica (controle positivo);3rd - CP group: topical application of neomycin sulfate and zinc bacitracin (positive control);

4°- grupo CN: aplicação tópica de soro fisiológico (controle negativo);4th - CN group: topical saline application (negative control);

[019] Todos os grupos receberam aplicações de 20 pL dos seus respectivos tratamentos desde o pós operatório imediato (POi) até o último dia dos experimentos, diretamente às lesões, sem nenhum curativo; e para analgesia, foi administrado 20 gotas de paracetamol a cada 250 mL de água, ad libitum.[019] All groups received applications of 20 pL of their respective treatments from the immediate postoperative period (POi) until the last day of the experiments, directly to the lesions, without any dressing; and for analgesia, 20 drops of paracetamol were administered for every 250 mL of water, ad libitum.

[020] Os animais foram acompanhados por fotodocumentação no POi e nos terceiro, sétimo, décimo, décimo quarto e vigésimo primeiro dias pós operatório (3°PO, 7°PO, 10°PO, 14°PO e 21°PO), as imagens foram analisadas no software ImageJ®, para aferição dos diâmetros das lesões. Para a determinação da reepitelização das lesões de cada grupo utilizou-se a seguinte equação (reepitelização = área do POi - área do último dia de experimento) quantificando assim a contração da lesão.[020] The animals were accompanied by photocumentation in the POi and in the third, seventh, tenth, fourteenth and twenty-first postoperative days (3rd PO, 7th PO, 10th PO, 14th PO and 21 ° PO), the images were analyzed using the ImageJ® software to measure the diameter of the lesions. To determine the reepithelization of the lesions in each group, the following equation (reepithelization = area of POi - area of the last day of the experiment) was used, thus quantifying the contraction of the lesion.

[021] As lesões tratadas com lisados de conídios e células muriformes apresentaram uma contração semelhantemente ao grupo controle positivo (Figura 1). As diferenças puderam ser observadas a partir do 7°PO onde a contração da lesão do grupo tratato com conídios lisados foi estatisticamente maior ao grupo controle negativo. Nos 14°PO e 21°PO foi observado contrações estatisticamente superiores nos grupos tratados com conídios e células muriformes lisados, bem como no controle positivo comparados ao controle negativo (Figura 2). O tempo de contração da lesão dos animais do controle negativo estendeu-se até o 26° dia.[021] Lesions treated with conidia and muriform cell lysates contracted similarly to the positive control group (Figure 1). The differences could be observed from the 7th PO where the contraction of the lesion in the treatment group with lysed conidia was statistically greater than in the negative control group. On the 14th PO and 21st PO, statistically higher contractions were observed in the groups treated with conidia and lysed muriform cells, as well as in the positive control compared to the negative control (Figure 2). The time of contraction of the lesion of the animals of the negative control extended until the 26th day.

[022] Após 21 dias de tratamento das lesões, a aplicação tópica do lisado fúngico gerou áreas de reepitelização maiores quando comparados ao grupo controle negativo e semelhante aos achados no controle positivo (Figura 3). A aplicação tópica do lisado fúngico mostrou aumento significativo no fechamento percentual das lesões quando comparado ao controle negativo. Assim, períodos de epitelização mais curtos em animais tratados com os lisados fúngicos reforçam a[022] After 21 days of treatment of the lesions, the topical application of the fungal lysate generated larger areas of reepithelization when compared to the negative control group and similar to the findings in the positive control (Figure 3). The topical application of the fungal lysate showed a significant increase in the percentage closure of the lesions when compared to the negative control. Thus, shorter periods of epithelialization in animals treated with fungal lysates reinforce the

Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 12/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 12/33

7/10 idéia de que estes possuem possível potencial como agentes de cicatrização de lesões.7/10 idea that these have possible potential as injury healing agents.

[023] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica. Logo, o invento Lisado celular de agentes etiológicos da cromoblastomicose para cicatrização de lesões cutâneas é provido de aplicabilidade industrial, farmacêutica e biológica, sendo economicamente viável e, portanto, atendendo ao rigor dos requisitos de patenteabilidade, notadamente como patente de invenção, conforme disposto nos ditames dos artigos 8° e 13 ° da Lei 9.279.[023] From what can be inferred from the researched literature, no documents were found anticipating or suggesting the teachings of the present invention, so that the solution proposed here has novelty and inventive activity in view of the state of the art. Therefore, the invention Cellular lysate of etiological agents of chromoblastomycosis for the healing of skin lesions has industrial, pharmaceutical and biological applicability, being economically viable and, therefore, meeting the rigor of patentability requirements, notably as an invention patent, as provided in the dictates of articles 8 and 13 of Law 9.279.

Descrição das Figuras [024] Figura 1. Acompanhamento da regressão lesional nos camundongos BALB/c. Lesões excisionais cutâneas tratadas com células muriformes lisadas (CM), conídios lisados (C), sulfato de neomicina e bacitracina zíncica (CP) e soro fisiológico (CN) nos POi, 3°PO, 7°PO, 10°PO, 14°PO e 21°PO.Description of Figures [024] Figure 1. Monitoring of lesion regression in BALB / c mice. Excision cutaneous lesions treated with lysed muriform cells (CM), lysed conidia (C), neomycin sulfate and zincic bacitracin (CP) and saline (CN) in POi, 3rd PO, 7th PO, 10th PO, 14th PO and 21 ° PO.

[025] Figura 2. Contração da lesão (%) nos grupos controle negativo (CN), controle positivo (CP), lisados de conídios (C) e de células muriformes (CM) no decorrer do tempo. *p=0,0317 e **p=0,0079.[025] Figure 2. Contraction of the lesion (%) in the negative control (CN), positive control (CP), conidial lyses (C) and muriform cell (CM) groups over time. * p = 0.0317 and ** p = 0.0079.

[026] Figura 3. Reepitelização das lesões até o 21° PO, calculada usando o software ImageJ® com a área das lesões expressas em mm², revelando diferença estatística entre o grupo controle negativo (CN) versus controle positivo (CP), lisados de conídios (C) e de células muriformes (CM). **p=0,0079[026] Figure 3. Reepithelialization of the lesions until the 21st PO, calculated using the ImageJ® software with the area of the lesions expressed in mm ² , revealing statistical difference between the negative control group (CN) versus positive control (CP), lysates conidia (C) and muriform cells (CM). ** p = 0.0079

ReferênciasReferences

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Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 13/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 13/33

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Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 14/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 14/33

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Petição 870180055895, de 28/06/2018, pág. 15/33Petition 870180055895, of 06/28/2018, p. 15/33

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Claims

1. BLACK FUNGAL CELL LYSATE IN THE HEALING OF SKIN INJURIES characterized by using components of the fungal lysate for tissue regeneration, re-epithelialization and healing of skin lesions.

2. BLACK FUNGAL CELL LYSATE IN THE CICATRIZATION OF SKIN INJURIES characterized by obtaining the fungal lysate from ultrasonication and filtration.

3. BLACK FUNGAL CELL LYSATE IN THE HEALING OF SKIN INJURIES characterized by the application of an adequate volume to the lesion extension and / or depth.