BR102018011834A2

BR102018011834A2 - flaviviral polypeptide for vaccine and diagnostic purposes produced in plant

Info

Publication number: BR102018011834A2
Application number: BR102018011834A
Authority: BR
Inventors: Bezerra Da Silva Bruno; Ferreira De Oliveira Danielle; Orlando Pereira Tramontina Florean Eridan; Érika Carlos Marques Lívia; Izabel Florindo Guedes Maria
Original assignee: Fundacao Univ Estadual Do Ceara Funece
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2019-12-24

Abstract

polipeptídeo flaviviral com finalidade vacinal e diagnostica produzido em planta. a presente invenção descreve a construção e otimização de genes sintéticos de um polipeptídio quimérico contendo o domínio iii da proteína do envelope dos quatro sorotipos do vírus dengue denv1, denv2, denv3 e denv4, sua clonagem e expressão em planta. a utilização de diferentes estratégias para obtenção de altos níveis de um novo polipeptídeos quimérico baseado na proteína do envelope do vírus dengue em planta para sua utilização na formulação de uma vacina tetravalente de subunidade, bem como em imunoensaios que vão desde a sua utilização até mesmo o uso de anticorpos produzidos através destes polipeptídeos em aplicações de diagnóstico.flaviviral polypeptide for vaccination and diagnostics produced in a plant. the present invention describes the construction and optimization of synthetic genes of a chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of the four dengue virus serotypes denv1, denv2, denv3 and denv4, their cloning and expression in plant. the use of different strategies to obtain high levels of a new chimeric polypeptide based on the envelope protein of the dengue virus in plants for its use in the formulation of a tetravalent subunit vaccine, as well as in immunoassays ranging from its use to use of antibodies produced by these polypeptides in diagnostic applications.

Description

POLIPEPTÍDEO FLAVIVIRAL COM FINALIDADE VACINAL E DIAGNOSTICA PRODUZIDO EM PLANTAFLAVIVIRAL POLYPEPTIDE WITH VACCINE AND DIAGNOSTIC PURPOSE PRODUCED IN PLANT

Campo da Invenção [1] A presente invenção se situa no campo da biotecnologia, notadamente o de preparações para finalidade médicas a base de peptídeos, e descreve a construção e otimização de genes sintéticos de um polipeptídio quimérico contendo o domínio III da proteína do envelope dos quatro sorotipos do vírus dengue, sua clonagem e expressão em planta para uso na prevenção e diagnóstico de infecção por flavivírus.Field of the Invention [1] The present invention is in the field of biotechnology, notably that of preparations for medical purposes based on peptides, and describes the construction and optimization of synthetic genes of a chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of four serotypes of the dengue virus, their cloning and expression in plants for use in the prevention and diagnosis of flavivirus infection.

Antecedentes da Invenção [2] Para a produção de vacinas de subunidade, uma plataforma adequada de expressão de proteínas recombinantes deve ser escolhida. Dentre as quais, bactérias, leveduras, células de insetos e de mamíferos, a plataforma mais utilizada para esse processo são as bactérias, no entanto para expressão de proteínas de humanos ou mesmo de vírus que infectam humanos seu uso não é o favorito devido a diferenças existentes entre elas e as células eucarióticas no folding (dobragem) das proteínas, ausência de modificações pós-traducionais semelhantes a mamíferos, como a glicosilação e risco de contaminação bacteriana por endotoxina do produto final.Background of the Invention [2] For the production of subunit vaccines, a suitable platform for expression of recombinant proteins must be chosen. Among which, bacteria, yeast, insect and mammalian cells, the most used platform for this process are bacteria, however for the expression of human proteins or even viruses that infect humans, their use is not the favorite due to differences between them and eukaryotic cells in the folding of proteins, absence of post-translational changes similar to mammals, such as glycosylation and risk of bacterial contamination by endotoxin from the final product.

[3] Apesar das vacinas serem competitivas em custo, algumas delas podem ter certas limitações relacionadas à manutenção da cadeia de frio, custos de processamento, risco de administração e escalonamento[3] Although vaccines are cost competitive, some of them may have certain limitations related to cold chain maintenance, processing costs, administration risk and escalation.

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Página 2 de 15 dispendioso. O uso do sistema vegetal combinado com o método de expressão transiente surge como plataforma alternativa de produção mais segura, com escalabilidade e modificação pós-traducional das proteínas alvo. Revisado em Joung, Y. H., Park, S. H., Moon, K., Jeon, J. & Cho, H. The Last Ten Years of Advancements in Plant-Derived Recombinant Vaccines against Hepatitis B. 1-29 (2016).Page 2 of 15 expensive. The use of the plant system combined with the transient expression method appears as an alternative safer production platform, with scalability and post-translational modification of the target proteins. Reviewed in Joung, Y. H., Park, S. H., Moon, K., Jeon, J. & Cho, H. The Last Ten Years of Advancements in Plant-Derived Recombinant Vaccines against Hepatitis B. 1-29 (2016).

[4] A expressão transiente usa uma bactéria do solo, Agrobacterium tumefaciens, que na natureza causa a doença galha-da-coroa, para fornecer sequências exógenas de interesse às plantas, onde uma parte de seu plasmídeo Ti (indutor de tumor) é transferido para a célula vegetal e se integra ao genoma do hospedeiro. Em contraste com a transformação estável o gene estranho não se torna parte do genoma ou hereditário através de gerações sucessivas. O gene de interesse é inserido na região do T-DNA do plasmídeo binário e será então expresso temporariamente na célula da planta. Esse processo em que uma solução de Agrobacterium tumafaciens contendo o DNA de interesse é inserido nas folhas de plantas por meio de seringa (pequena escala) ou utilização de uma câmara a vácuo (média e larga escala) é denominado “agroinfiltração”. Essa metodologia permite a expressão das proteínas de interesse em aproximadamente 4 dias. Tal metodologia vem sendo descrita há décadas e juntamente com o uso de vetores virais tem permitido o aumento dos níveis de expressão das proteínas de interesse como descrito na patente US 2008/0057563 A1.[4] The transient expression uses a soil bacterium, Agrobacterium tumefaciens, which in nature causes crown gall disease, to provide exogenous sequences of interest to plants, where a portion of its Ti (tumor-inducing) plasmid is transferred to the plant cell and integrates with the host genome. In contrast to the stable transformation, the foreign gene does not become part of the genome or hereditary through successive generations. The gene of interest is inserted into the T-DNA region of the binary plasmid and will then be expressed temporarily in the plant cell. This process in which a solution of Agrobacterium tumafaciens containing the DNA of interest is inserted into the leaves of plants by means of a syringe (small scale) or use of a vacuum chamber (medium and large scale) is called "agroinfiltration". This methodology allows the expression of the proteins of interest in approximately 4 days. This methodology has been described for decades and, together with the use of viral vectors, it has allowed an increase in the levels of expression of proteins of interest as described in US patent 2008/0057563 A1.

[5] A dengue é uma infecção viral sistêmica transmitida entre humanos por mosquitos, cuja disseminação tem alcançado as regiões temperadas devido às drásticas mudanças climáticas. Assim, a infecção pelo vírus dengue tornou-se um problema significativo de saúde pública,[5] Dengue is a systemic viral infection transmitted between humans by mosquitoes, whose spread has reached temperate regions due to drastic climate changes. Thus, dengue virus infection has become a significant public health problem,

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Página 3 de 15 com uma carga econômica que atualmente não é atendida por vacinas licenciadas, agentes terapêuticos específicos ou estratégias eficientes de controle de vetores. O controle de vetores é a base da prevenção da dengue, mas essa abordagem não conseguiu impedir a transmissão de doenças em quase todos os países onde a dengue é endêmica. Ver Bonner, K. Review article. Community Dev. J. 34, 78-80 (1999) e Castro, M. C., Wilson, M. E. & Bloom, D. E. Disease and economic burdens of dengue. Lancet Infect. Dis. 17, e70-e78 (2017).Page 3 of 15 with an economic burden that is currently not served by licensed vaccines, specific therapeutic agents or efficient vector control strategies. Vector control is the basis of dengue prevention, but this approach has failed to prevent disease transmission in almost all countries where dengue is endemic. See Bonner, K. Review article. Community Dev. J. 34, 78-80 (1999) and Castro, M. C., Wilson, M. E. & Bloom, D. E. Disease and economic burdens of dengue. Lancet Infect. Dis. 17, e70-e78 (2017).

[6] A vacina Dengvaxia desenvolvida pela Sanofi Pasteur, licenciada em alguns países, é uma vacina de vírus atenuado baseada no vírus da febre amarela. Vacinas desse tipo não se apresentam tão seguras quanto as de subunidade. Pois, vírus atenuados potencialmente podem sofrer mutações e tornar-se patogênico novamente. Vacinas de vírus atenuado também são contraindicadas para indivíduos imunocomprometidos, bem como para segmentos da população normal, com por exemplo, grávidas, recém-nascidos e idosos.[6] The Dengvaxia vaccine developed by Sanofi Pasteur, licensed in some countries, is an attenuated virus vaccine based on the yellow fever virus. Such vaccines are not as safe as subunit vaccines. For, attenuated viruses can potentially mutate and become pathogenic again. Attenuated virus vaccines are also contraindicated for immunocompromised individuals, as well as for segments of the normal population, such as pregnant women, newborns and the elderly.

[7] O vírus dengue possui quatro sorotipos relacionados: 1-4. No entanto, a infecção com um sorotipo pode conferir imunidade duradoura a esse sorotipo, mas apenas imunidade transitória aos outros três sorotipos. Após o indivíduo ser infectado uma vez, as infecções subsequentes estão epidemiologicamente associadas ao aumento do risco de doença grave, o que tem sido atribuído a ADE do inglês, Antibody Dependent Enhancement. Todavia, uma vacina ideal deve impedir a ADE oferecendo proteção contra todos os quatro sorotipos e seu desenvolvimento tem sido um desafio para pesquisadores ao redor do mundo.[7] The dengue virus has four related serotypes: 1-4. However, infection with one serotype can confer long-lasting immunity to that serotype, but only transient immunity to the other three serotypes. After the individual is infected once, subsequent infections are epidemiologically associated with an increased risk of serious illness, which has been attributed to ADE in English, Antibody Dependent Enhancement. However, an ideal vaccine should prevent ADE by offering protection against all four serotypes and its development has been a challenge for researchers around the world.

Petição 870180050056, de 12/06/2018, pág. 24/36Petition 870180050056, of 6/12/2018, p. 24/36

Página 4 de 15 [8] No âmbito patentário, foram localizados alguns documentos parcialmente relevantes, que serão descritos a seguir. O documento KR20140090502 A revela uma vacina produzida em planta para o vírus da dengue usando como antígeno uma proteína do domínio III do envelope do vírus da dengue fusionada a subunidade B da toxina da cólera (CTB). A presente invenção difere deste documento por compreender a produção de um polipeptídio quimérico contendo o domínio III da proteína do envelope dos quatro sorotipos do vírus dengue.Page 4 of 15 [8] In the patent scope, some partially relevant documents were found, which will be described below. The document KR20140090502 A discloses a plant-produced vaccine for the dengue virus using as an antigen a domain III protein in the envelope of the dengue virus fused to the cholera toxin B subunit (CTB). The present invention differs from this document in that it comprises the production of a chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of the four serotypes of the dengue virus.

[9] O documento US 8,337,857 B2 refere-se à construção de um polipeptídeo quimérico compreendendo um subdomínio da proteína E fusionada a um subdomínio da proteína M para utilização na prevenção ou tratamento de infecção por flavivirus. Bem como, a produção de vetores virais recombinantes, em que um vetor viral do sarampo para atuar como uma vacina. A presente invenção difere deste documento por compreender uma construção de um polipeptídio quimérico contendo o domínio III da proteína do envelope dos quatro sorotipos do vírus dengue, cujos os códons foram otimizados para expressão em planta.[9] US 8,337,857 B2 refers to the construction of a chimeric polypeptide comprising a subdomain of protein E fused to a subdomain of protein M for use in preventing or treating flavivirus infection. As well as, the production of recombinant viral vectors, in which a measles viral vector to act as a vaccine. The present invention differs from this document in that it comprises a construction of a chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of the four serotypes of the dengue virus, whose codons have been optimized for plant expression.

[10] O documento CA2812306A fornece uma vacina tetravalente contra o vírus da dengue, e um métodos de induzir uma resposta imune contra flavivírus, como o vírus dengue dos sorotipos 1-4 usando a vacina. O documento também relata métodos de produção de uma vacina, introduzindo em uma célula hospedeira um transgene que codifica uma proteína compreendendo polipeptídios do domínio III do vírus dengue, em célula hospedeira é proveniente de inseto, ou, através de polipeptídios do DIII purificados específicos para os sorotipos de dengue 1-4 e outros flavivirus. A presente invenção embora se refira a produção[10] CA2812306A provides a tetravalent vaccine against the dengue virus, and a method of inducing an immune response against flavivirus, such as serotypes 1-4 dengue virus using the vaccine. The document also reports methods of producing a vaccine, introducing into a host cell a transgene that encodes a protein comprising polypeptides of domain III of the dengue virus, in a host cell it comes from an insect, or, through purified DIII polypeptides specific for serotypes of dengue 1-4 and other flaviviruses. The present invention, while referring to the production

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Página 5 de 15 de proteínas recombinantes EDIII do vírus da dengue dos quatro sorotipos e sua aplicação, difere deste documento por compreender uma sequência quimérica de DNA sintético com códons otimizados especialmente para expressão em célula vegetal. A proteína recombinante é expressa utilizando um sistema de expressão transiente em planta e pode ser purificada utilizando métodos cromatográficos ou métodos mais simples e de menor custo como o Ciclo de Transição Inversa, em inglês Inverse transition Cycling (ITC).Page 5 of 15 of the recombinant EDIII proteins of the dengue virus of the four serotypes and their application differs from this document in that it comprises a chimeric sequence of synthetic DNA with codons optimized especially for expression in a plant cell. The recombinant protein is expressed using a transient plant expression system and can be purified using chromatographic methods or simpler and less expensive methods such as the Inverse Transition Cycle, in English Inverse transition Cycling (ITC).

[11] Atualmente não existe uma vacina para dengue totalmente produzida em planta contendo o DIII dos quatro sorotipos do vírus. A expressão transiente do polipeptídeo viral quimérico (EDIII 1-4) possibilita o desenvolvimento de uma vacina recombinante de subunidade utilizando planta como bioreator. Tal vacina será utilizada na prevenção da dengue, uma doença endêmica, a qual milhões de pessoas são infectadas e milhares morrem a cada ano. Além disso, este polipeptídio viral, poderá auxiliar a suprir demanda por reagentes utilizados na fabricação de kits de diagnóstico, uma vez que há uma necessidade de produção de testes imunológicos acessíveis e em larga escala para confirmação do diagnóstico clínico e vigilância, o que permitiria intervenção para tratar pacientes, prevenir e/ou controlar epidemias.[11] There is currently no dengue vaccine produced entirely in a plant containing the DIII of the four serotypes of the virus. The transient expression of the chimeric viral polypeptide (EDIII 1-4) enables the development of a subunit recombinant vaccine using plant as a bioreactor. This vaccine will be used to prevent dengue, an endemic disease, in which millions of people are infected and thousands die each year. In addition, this viral polypeptide may help meet the demand for reagents used in the manufacture of diagnostic kits, since there is a need to produce affordable and large-scale immunological tests to confirm the clinical diagnosis and surveillance, which would allow intervention to treat patients, prevent and / or control epidemics.

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Breve Descrição das FigurasBrief Description of the Figures

Figura 1 - Mostra a sequencia de nucleotídeos sintetizada da quimera EDIII1-4 do vírus dengue (1365 pb) (SEQ ID NO: 1) com códons otimizados para expressão em planta.Figure 1 - Shows the nucleotide sequence synthesized from the chimera EDIII1-4 of the dengue virus (1365 bp) (SEQ ID NO: 1) with codons optimized for plant expression.

Figura 2 - (A) Mostra a sequencia de 455 aminoácidos da proteína quimérica EDIII1-4 (SEQ ID NO: 2) deduzidos para gene sintético com códons otimizados para expressão em planta; (B) Mostra a sequencia de 641 aminoácidos da proteína quimérica EDIII1-4 fusionada a ELP (488627 aa), SEQ ID NO 3.Figure 2 - (A) Shows the sequence of 455 amino acids of the chimeric protein EDIII1-4 (SEQ ID NO: 2) deduced for synthetic gene with codons optimized for plant expression; (B) Shows the 641 amino acid sequence of the ELP chimeric EDIII1-4 protein (488627 aa), SEQ ID NO 3.

Figura 3 - Mostra a sequencia de nucleotídeos sintetizada da proteína não estrutural do vírus dengue NS1 do sorotipo 1 (SEQ ID NO: 4) com códons otimizados para expressão em planta.Figure 3 - Shows the nucleotide sequence synthesized from the non-structural protein of the dengue virus NS1 serotype 1 (SEQ ID NO: 4) with codons optimized for plant expression.

Figura 4 - Mostra a sequencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) deduzidos da proteína NS1 do DENV para gene sintético com códons otimizados para expressão em planta.Figure 4 - Shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) deduced from the NSEN protein of DENV for synthetic gene with codons optimized for expression in plant.

Figura 5 - Representação esquemática de um dos cassetes de expressão de EDIII dos quatro sorotipos do DENV contendo: tCUP, upstream promotor do tabaco intensificador da tradução; Pr1b, peptídeo sinal secretor da proteína 1b relacionada com a patogênese do tabaco; cMyc tag de detecção / purificação; KDEL, tetrapeptídeo de direcionamento ao retículo endoplasmático; ELP, elastina like polipeptídio. p35S, promotor 35S duplamente melhorado do gene 35S doFigure 5 - Schematic representation of one of the EDIII expression cassettes of the four DENV serotypes containing: tCUP, upstream promoter of translation-enhancing tobacco; Pr1b, signal peptide secreting protein 1b related to the pathogenesis of tobacco; cMyc detection / purification tag; KDEL, tetrapeptide targeting the endoplasmic reticulum; ELP, elastin like polypeptide. p35S, doubly improved 35S promoter of the 35S gene of the

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Página 7 de 15 vírus do Mosaico da Couve-flor e nos, terminador de transcrição de nopalina-sintase (não mostrados). Figura criada com SnapGene.Page 7 of 15 Cauliflower Mosaic virus and nos, nopaline synthase transcription terminator (not shown). Figure created with SnapGene.

Figura 6 - Análise por meio de Western blotting em condições não reduzidas de quimera EDIII1-4 direcionada o reticulo endoplasmático (ER) com e sem a fusão a cauda de elastina (ELP) em N. benthamiana (4 dias após a infecção) e detectada com anticorpo anti-c-Myc. Foram utilizadas quantidades conhecidas de uma proteína padrão marcada com c-Myc (25-200 ng) como referência e o tecido infiltrado com p19 foi usado como controle negativo.Figure 6 - Analysis by means of Western blotting in non-reduced conditions of chimera EDIII1-4 directed to the endoplasmic reticulum (ER) with and without fusion to the elastin tail (ELP) in N. benthamiana (4 days after infection) and detected with anti-c-Myc antibody. Known amounts of a standard protein labeled with c-Myc (25-200 ng) were used as a reference and the tissue infiltrated with p19 was used as a negative control.

Figura 7 - Análise dos níveis de acumulação de quimera EDIII1-4 utilizando infiltração a vácuo por meio de Western blotting. Folhas de Nicotiana bentamiana infiltradas com quimera EDIII1-4 direcionada o reticulo endoplasmático (ER) com e sem fusão a cauda de elastina (ELP) e analisadas por Western blotting. As proteínas recombinantes foram quantificadas utilizando o software Totallab TL100.Figure 7 - Analysis of chimera accumulation levels EDIII1-4 using vacuum infiltration using Western blotting. Nicotiana bentamian leaves infiltrated with EDIII1-4 chimera directed to the endoplasmic reticulum (ER) with and without fusion to the elastin tail (ELP) and analyzed by Western blotting. Recombinant proteins were quantified using the Totallab TL100 software.

Descrição Detalhada da Invenção [12] A presente invenção descreve um polipeptídio quimérico recombinante contendo o domínio III da proteína do envelope dos quatro sorotipos do vírus dengue para ser utilizado na formulação de uma vacina de subunidade contra infecção por dengue vírus e no diagnostico da dengue e/ou outras doenças causadas por flavivirus em diferentes tipos de plataformas, com por exemplo teste de ELISA, biosensor, etc.Detailed Description of the Invention [12] The present invention describes a recombinant chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of the four dengue virus serotypes for use in formulating a subunit vaccine against dengue virus infection and in the diagnosis of dengue and / or other diseases caused by flavivirus on different types of platforms, with for example ELISA test, biosensor, etc.

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Página 8 de 15 [13] A presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico com códons otimizados para expressão em plantas e os usos da mesma (figura 1).Page 8 of 15 [13] The present invention provides a nucleic acid molecule with codons optimized for expression in plants and the uses of it (figure 1).

[14] É, portanto, um objeto da presente invenção, o processo de produção de material biológico do vírus da dengue em um sistema vegetal.[14] It is, therefore, an object of the present invention, the process of producing biological material from the dengue virus in a plant system.

[15] A invenção será detalhada por meio de exemplos descritos a seguir. Os exemplos mostrados têm o intuito somente de exemplificar algumas das inúmeras maneiras de se realizar a invenção sem limitar, contudo, o seu escopo.[15] The invention will be detailed by means of examples described below. The examples shown are intended only to exemplify some of the numerous ways of carrying out the invention without limiting, however, its scope.

[16] Processo de produção de peptídeos do vírus da dengue. Para a expressão do polipeptideo quimérico recombinante do vírus dengue a sequência codificadora foi sintetizada quimicamente pela empresa BioBasic Inc. As sequencias do domínio III da proteína E de DENV foram obtidas no National Center for Biotechnology Information (NCBI) a partir da utilização dos genomas do vírus. Foram utilizadas as sequências do domínio III da proteína E dos sorotipos DENV 1, DENV 2, DENV 3 e DENV 4, onde se encontram as regiões mais variáveis de cada sorotipo.[16] Dengue virus peptide production process. For the expression of the recombinant chimeric polypeptide of the dengue virus, the coding sequence was chemically synthesized by the company BioBasic Inc. The DENV protein E domain III sequences were obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) from the use of the virus genomes . Sequences of protein III domain E of the serotypes DENV 1, DENV 2, DENV 3 and DENV 4 were used, where the most variable regions of each serotype are found.

[17] O polipeptídeo quimérico contendo o domínio III da proteína do envelope dos sorotipos 1,2,3 e 4 foi denominado EDIII1-4 (figuras 2 e 5), por conter fragmentos gênicos do domínio III do envelope de cada um dos quatros sorotipo do vírus dengue ligados entre si por linkers (ligantes), que consistem em um peptídeo natural multifuncional da proteína NS3 do vírus dengue (DENV).[17] The chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of serotypes 1,2,3 and 4 was named EDIII1-4 (figures 2 and 5), because it contains gene fragments of domain III of the envelope of each of the four serotype of the dengue virus linked together by linkers (ligands), which consist of a natural multifunctional peptide of the NS3 protein of the dengue virus (DENV).

-Aminoácidos 22 a 125 da SEQ ID NO: 3 referente ao sorotipo 1; -Aminoácidos 138 a 242 da SEQ ID NO: 3 referente ao sorotipo 2; -Aminoácidos 256 a 359 da SEQ ID NO: 3 referente ao sorotipo 3;-Amino acids 22 to 125 of SEQ ID NO: 3 regarding serotype 1; -Amino acids 138 to 242 of SEQ ID NO: 3 for serotype 2; -Amino acids 256 to 359 of SEQ ID NO: 3 for serotype 3;

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-Aminoácidos 373 a 476 da SEQ ID NO: 3 referente ao sorotipo 4;-Amino acids 373 to 476 of SEQ ID NO: 3 for serotype 4;

[18] Preferencialmente, o polipeptídeo quimérico da invenção compreende ainda um segmento de ligação (linker) que liga os peptídeos do domínio III da proteína E dos quatros sorotipos do DENV entre si. O referido segmento de ligação é preferencialmente um peptídeo com a sequência de aminoácidos: NERIGEPDYEVDG. Todavia, a presente invenção não está limitada ao uso dos linker mencionado, outras sequencias de peptídeos podem ser usadas em junções entre os domínios proteicos.[18] Preferably, the chimeric polypeptide of the invention further comprises a linker segment that links peptides from protein III domain E of the four DENV serotypes to each other. Said linker segment is preferably a peptide with the amino acid sequence: NERIGEPDYEVDG. However, the present invention is not limited to the use of the mentioned linker, other peptide sequences can be used at junctions between protein domains.

[19] O linker utilizado na presente invenção é peptídeo natural multifuncional da proteína NS3 do vírus dengue (DENV). Sendo esse referido como twistable, capaz de girar o domínio de protease de NS3 por aproximadamente 161° em relação ao domínio helicase, descrito por Luo, D., Wei, N., Doan, D.N., Paradkar, P.N., Chong, Y., Davidson, A.D., Kotaka, M., Lescar, J. and Vasudevan, S.G. Flexibility between the protease and helicase domains of the dengue virus NS3 protein conferred by the linker region and its functional implications. J. Biol. Chem. 285, 18817-18827(2010) e Sainsbury F, Varennes-Jutras P, Goulet MC, D'Aoust MA, Michaud D: Tomato cystatin SICYS8 as a stabilizing fusion partner for human serpin expression in plants. Plant Biotechnol J, 11:1058-1068 (2013).[19] The linker used in the present invention is a multifunctional natural peptide from the dengue virus NS3 protein (DENV). This being referred to as twistable, capable of rotating the NS3 protease domain by approximately 161 ° in relation to the helicase domain, described by Luo, D., Wei, N., Doan, DN, Paradkar, PN, Chong, Y., Davidson, AD, Kotaka, M., Lescar, J. and Vasudevan, SG Flexibility between the protease and helicase domains of the dengue virus NS3 protein conferred by the linker region and its functional implications. J. Biol. Chem. 285, 18817-18827 (2010) and Sainsbury F, Varennes-Jutras P, Goulet MC, D'Aoust MA, Michaud D: Tomato cystatin SICYS8 as a stabilizing fusion partner for human serpin expression in plants. Plant Biotechnol J, 11: 1058-1068 (2013).

[20] Clonagem e expressão. A invenção relata qualquer clonagem e / ou vetor de expressão e hospedeiro celular (eucarioto) transformado por tal vetor e compreendendo elementos de regulação que permitem a expressão da sequencia de nucleotídeos codificadora do polipeptídeo quimérico da invenção. Em que esse hospedeiro celular é uma planta.[20] Cloning and expression. The invention relates to any cloning and / or expression vector and cell host (eukaryote) transformed by such a vector and comprising regulatory elements that allow the expression of the nucleotide sequence encoding the chimeric polypeptide of the invention. In which this cellular host is a plant.

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Esses vetores são preparados por meio de métodos rotineiros de biologia molecular usados pelos especialistas na área, e os clones resultantes podem ser introduzido em um hospedeiro apropriado usando métodos padrão. Tais como, eletroporação ou choque térmico, entre outros.These vectors are prepared using routine molecular biology methods used by experts in the field, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host using standard methods. Such as electroporation or thermal shock, among others.

[21] A sequencia codificadora da EDIII1-4 recombinante da invenção foi clonada em uma séries de vetores pCamGate (um dos possíveis cassetes de expressão está representado na figura 5) para expressão transiente em N. benthamina, seguindo a metodologia descrito em Pereira, E. O., Kolotilin, I., Conley, A. J. & Menassa, R. Production and characterization of in planta transiently produced polygalacturanase from Aspergillus niger and its fusions with hydrophobin or ELP tags. BMC Biotechnol. 14, 1-11 (2014).[21] The coding sequence of the recombinant EDIII1-4 of the invention was cloned into a series of pCamGate vectors (one of the possible expression cassettes is shown in figure 5) for transient expression in N. benthamina, following the methodology described in Pereira, EO , Kolotilin, I., Conley, AJ & Menassa, R. Production and characterization of in planta transiently produced polygalacturanase from Aspergillus niger and its fusions with hydrophobin or ELP tags. BMC Biotechnol. 14, 1-11 (2014).

[22] Para expressão transiente foi realizada a agroinfiltração, em que uma solução de Agrobacterium tumafaciens contendo o DNA de interesse é injetada nas folhas de plantas, então as células englobam o DNA alvo e em aproximadamente 4 dias a proteína recombinante podem ser produzidas. Dessa forma, a expressão transiente é capaz de produzir grandes quantidades de proteínas em um curto período.[22] For transient expression, agroinfiltration was performed, in which a solution of Agrobacterium tumafaciens containing the DNA of interest is injected into the leaves of plants, then the cells encompass the target DNA and in approximately 4 days the recombinant protein can be produced. In this way, transient expression is capable of producing large amounts of proteins in a short period.

[23] Estratégias de direcionamento subcelular por meio da adição de tag de fusão, a elastina like polipeptídeo (ELP) e hidrofobina (HFBI) foram utilizadas a fim de obter os melhores níveis de acumulação da EDIII1-4 em planta e facilitar a sua purificação. A presente invenção pode conter uma tag de direcionamento para o reticulo endoplasmático (ER) e a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ELP. Folhas de N. benthamiana foram utilizadas para expressão do polipeptideo da presente invenção, tais plantas devem ser preferencialmente cultivadas em câmara de crescimento a 22°C com[23] Subcellular targeting strategies through the addition of a fusion tag, elastin like polypeptide (ELP) and hydrophobin (HFBI) were used in order to obtain the best levels of accumulation of EDIII1-4 in the plant and to facilitate its purification . The present invention may contain a targeting tag for the endoplasmic reticulum (ER) and the presence of a nucleotide sequence that encodes an ELP. N. benthamiana leaves were used to express the polypeptide of the present invention, such plants should preferably be grown in a growth chamber at 22 ° C with

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Página 11 de 15 fotoperíodo de 16 h por 6 a 7 semanas. Após este período, a suspensão de Agrobacterium tumefaciens transportando as construções para expressão do polipeptídeo quimérico do DENV deve ser misturada com uma mesma quantidade de cultura de A. tumefaciens contendo o supressor de silenciamento de genes pós-transcricional p19 e coinfiltrada nas folhas da planta. A p19, é um supressor do silenciamento gênico do vírus Cymbidium ringspot (CymRSV), descrito em Silhavy, D., Molnar, A., Lucioli, A., Szittya, G., Hornyik, C., Tavazza, M. and Burgyan, J. (2002) A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencinggenerated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO J. 21, 3070-3080.Page 11 of 15 photoperiod of 16 h for 6 to 7 weeks. After this period, the suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the constructions for expression of the chimeric DENV polypeptide must be mixed with the same amount of A. tumefaciens culture containing the post-transcriptional gene silencing suppressor p19 and co-filtered in the leaves of the plant. P19, is a suppressor of gene silencing of the Cymbidium ringspot virus (CymRSV), described in Silhavy, D., Molnar, A., Lucioli, A., Szittya, G., Hornyik, C., Tavazza, M. and Burgyan , J. (2002) A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencinggenerated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO J. 21, 3070-3080.

[24] Expressão transitória em plantas de Nicotiana benthamiana. As culturas de Agrobacterium tumefaciens devem ser cultivadas até uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,5-0,8 e recuperadas por centrifugação a 3000 rpm por 30 min. Após centrifugação ressuspender o pellet em solução de infiltração (3,2 g / L solução de Gamborg B5 e vitaminas, 20 g / L de sacarose, 10 mM de MES pH 5,6, 200 mM de acetoceringona) até um OD600 final de 0,5 seguido de incubação temperatura ambiente com leve agitação durante 1 h.[24] Transient expression in Nicotiana benthamiana plants. Cultures of Agrobacterium tumefaciens should be grown to an optical density at 600 nm (OD600) of 0.5-0.8 and recovered by centrifugation at 3000 rpm for 30 min. After centrifugation, resuspend the pellet in an infiltration solution (3.2 g / L Gamborg B5 solution and vitamins, 20 g / L sucrose, 10 mM MES pH 5.6, 200 mM acetoceringone) until a final OD600 of 0 , 5 followed by incubation at room temperature with gentle shaking for 1 h.

[25] Plantas podem ser infiltradas com a utilização de seringa ou uma câmara à vácuo (media e larga escala). A infiltração com utilização de seringa pode realizada manualmente através da parte inferior das folhas, para análises em escala de bancada. Para testar o escalonamento das proteínas recombinante do DENV da presente invenção foi realizada infiltração a vácuo, onde 10 L de cada cultura de Agrobacterium transformada foram misturados a 5 L de cultura de p19 e posteriormente diluídos para um volume final de 30 L em água destilada. A cultura foi[25] Plants can be infiltrated using a syringe or a vacuum chamber (medium and large scale). Infiltration using a syringe can be carried out manually through the bottom of the sheets, for bench scale analysis. To test the scaling of the recombinant DENV proteins of the present invention, vacuum infiltration was performed, where 10 L of each transformed Agrobacterium culture was mixed with 5 L of p19 culture and subsequently diluted to a final volume of 30 L in distilled water. Culture was

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Página 12 de 15 então transferida para um aparelho de infiltração a vácuo consistindo de uma bomba VPD3 ligada à câmara de acrílico selada (VIOT, Champagne, E.U.A.). Bandejas com aproximadamente trinta plantas de N. benthamiana foram invertidas na câmara contendo a solução de Agrobacterium. O vácuo foi então aplicado a 25 cm Hg por 1 min. e liberado lentamente para permitir a infiltração completa das folhas. As plantas foram mantidas em uma câmara de crescimento controlada por 4 dias antes da coleta.Page 12 of 15 then transferred to a vacuum infiltration device consisting of a VPD3 pump connected to the sealed acrylic chamber (VIOT, Champagne, USA). Trays with approximately thirty plants of N. benthamiana were inverted in the chamber containing the Agrobacterium solution. The vacuum was then applied at 25 cm Hg for 1 min. and released slowly to allow complete infiltration of the leaves. The plants were kept in a controlled growth chamber for 4 days before collection.

[26] Após a recuperação do material vegetal contendo a sequencia codificadora do EDIII1-4 recombinante do DENV foi realizada extração das proteínas totais solúveis. Extração de proteínas recombinantes pode ser feita utilizando diferentes tipos de tampões com objetivo de recuperar níveis elevados as proteínas recombinantes expressas pela planta. Dentre estes o tampão de extração proteica (TEP) contendo tampão fosfato gelado (PBS), pH 7,4 com 0,1% de Tween-20, 2% polivinilpirrolidona (PVPP), 1 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), 100 mM ascorbato de sódio, 1mM fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF) e Ipg/ml de leupeptina.[26] After recovering the plant material containing the coding sequence for the recombinant DENV EDIII1-4, extraction of total soluble proteins was performed. Extraction of recombinant proteins can be done using different types of buffers in order to recover high levels of the recombinant proteins expressed by the plant. Among these, the protein extraction buffer (TEP) containing cold phosphate buffer (PBS), pH 7.4 with 0.1% Tween-20, 2% polyvinylpyrrolidone (PVPP), 1 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) , 100 mM sodium ascorbate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and Ipg / ml leupeptin.

[27] A presente invenção é caracterizada por fornecer uma composição composta por polipeptídeo contendo o domínio III da proteína E dos sorotipos 1-4 produzido em planta minimamente processado, como por exemplo o extrato bruto, uma composição contendo EDIII1-4 recombinante parcialmente purificado ou composição contendo EDIII1-4 purificado que tenha sido expressa em planta, utilizando técnicas padrão de biologia molecular como o exemplo descrito anteriormente.[27] The present invention is characterized by providing a composition composed of a polypeptide containing domain III of protein E of serotypes 1-4 produced in a minimally processed plant, such as crude extract, a composition containing partially purified recombinant EDIII1-4 or composition containing purified EDIII1-4 that has been expressed in plants, using standard molecular biology techniques as the example described above.

[28] A análise das proteínas expressadas transitoriamente em N. benthamiana é realizada a partir do extrato de proteínas totais das folhas[28] The analysis of proteins transiently expressed in N. benthamiana is performed from the extract of total leaf proteins

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Página 13 de 15 por meio de técnicas padronizadas de análise de proteínas. Por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE, Western blotting e enzyme-linked immunoassay ELISA.Page 13 of 15 using standardized protein analysis techniques. For example, SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting and enzyme-linked immunoassay ELISA.

[29] Para a proteína descrita primeiramente foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (10%), seguida da transferência das proteínas para membrana de PVDF. Para detectar a proteína recombinante a membrana foi incubada com o anticorpo monoclonal antic-Myc produzido em camundongo juntamente com ONE-HOUR Western Basic Kit Mouse (GeneScript, Piscataway, EUA) e visualizadas utilizando o kit de detecção ECL (GE healthcare, Mississauga, Canadá) e feita a autoradiografia como descrito pelo fabricante (figuras 6 e 7). A proteína em questão pode ser detectada com anticorpos monoclonais e policlonais para o vírus dengue e anticorpos secundários específicos.[29] For the protein described first, polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (10%) was performed, followed by the transfer of proteins to the PVDF membrane. To detect the recombinant protein the membrane was incubated with the anti-Myc monoclonal antibody produced in mouse together with ONE-HOUR Western Basic Kit Mouse (GeneScript, Piscataway, USA) and visualized using the ECL detection kit (GE healthcare, Mississauga, Canada ) and autoradiography is performed as described by the manufacturer (figures 6 and 7). The protein in question can be detected with monoclonal and polyclonal antibodies to the dengue virus and specific secondary antibodies.

[30] Os polipeptídeos da presente invenção podem também ser utilizados para preparar anticorpos policlonais ou monoclonais capazes de se ligarem especificamente aos mesmo e a proteínas virais nativas. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos por técnicas conhecidas de imunização como descrito por Florindo, M. I.; Aragão, M. E.F.; Silva, A. C. M.; Otoch, M.L.; Melo, D. F.; Lima, J. A.; Lima, M. G. Immune response induced in mice by oral immunization with Cowpea severe mosaic virus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 35, p. 827-835, 2002.[30] The polypeptides of the present invention can also be used to prepare polyclonal or monoclonal antibodies capable of specifically binding to them and to native viral proteins. Polyclonal antibodies can be obtained by known immunization techniques as described by Florindo, M. I .; Aragon, M. E.F .; Silva, A. C. M .; Otoch, M.L .; Melo, D. F .; Lima, J. A .; Lima, M. G. Immune response induced in mice by oral immunization with Cowpea severe mosaic virus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 35, p. 827-835, 2002.

[31] Quantificação de proteínas recombinantes do DENV. As transferências de Western foram analisadas por meio da densitometria de imagem com software TotalLab TL100 (Nonlinear Dynamics, Durhan, EUA). As intensidades foram determinadas por comparação com quantidades conhecidas de uma proteína sintética utilizada como[31] Quantification of DENV recombinant proteins. Western transfers were analyzed using image densitometry with TotalLab TL100 software (Nonlinear Dynamics, Durhan, USA). The intensities were determined by comparison with known amounts of a synthetic protein used as

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Página 14 de 15 controle positivo contendo o domínio de ligação à celulose (CBD) e a tag C-myc (sintetizado por GenScript, Piscataway, EUA).Page 14 of 15 positive control containing the cellulose binding domain (CBD) and the C-myc tag (synthesized by GenScript, Piscataway, USA).

[32] Os melhores níveis de acumulação foram obtidos quando a proteína foi direcionada ao ER. O polipeptídio EDIII dos quatro sorotipos do DENV fusionada a ELP e direcionada ao ER (EDIII1-4::ELP) mostrou um aumento de aproximadamente sete vezes (195 pg /g) em níveis de acumulação por peso fresco de folha comparada a proteína não fusionada direcionada ao ER (figuras 6 e 7). Diante dos resultados aqui apresentados a expressão de proteínas do vírus dengue de até 195 pg/g de peso fresco de folha aqui estabelecida é uma quantidade de sólida base econômica, o que facilita o processamento, a purificação, bem como a formulação da vacina e produção de antígenos a serem utilizados como reagentes em kits de diagnóstico de baixo custo.[32] The best levels of accumulation were obtained when the protein was directed to the ER. The EDIII polypeptide of the four serotypes of DENV fused to ELP and directed to ER (EDIII1-4 :: ELP) showed an increase of approximately seven times (195 pg / g) in accumulation levels by fresh leaf weight compared to un-fused protein directed to the ER (figures 6 and 7). In view of the results presented here, the expression of dengue virus proteins of up to 195 pg / g of fresh leaf weight established here is an amount of solid economic base, which facilitates the processing, purification, as well as the formulation of the vaccine and production of antigens to be used as reagents in low-cost diagnostic kits.

[33] Para a verificação da integridade e o efeito das fusões dos peptídeos com a elastina foi feita a análise em nível de tradução da proteína no tecido vegetal sendo realizada por Western blotting, utilizando o anticorpo policlonal anti-domínio III do envelope do vírus dengue, bem como ELISA utilizando soro humano de pacientes positivos para a dengue.[33] To verify the integrity and the effect of peptide fusions with elastin, the analysis at the level of translation of the protein in the plant tissue was carried out by Western blotting, using the polyclonal anti-domain III antibody of the dengue virus envelope , as well as ELISA using human serum from dengue positive patients.

[34] Métodos e Uso. A presente invenção refere-se à utilização de uma poliproteína recombinante do DENV para a preparação de uma composição imunogênica destinada à prevenção da dengue em espécies suscetíveis a infecção por flavivirus, por exemplo, um ser humano. Os meios para preparar e administrar serão os métodos padrão. A presente invenção também se refere à composição imunogênica, ou seja, uma formulação que contenha elementos com capacidade para induzir resposta imune celular e / ou humoral in vivo ou in vitro. Tal, formulação[34] Methods and Use. The present invention relates to the use of a DENV recombinant polyprotein for the preparation of an immunogenic composition for the prevention of dengue in species susceptible to flavivirus infection, for example, a human. The means to prepare and administer will be the standard methods. The present invention also relates to the immunogenic composition, that is, a formulation that contains elements capable of inducing cellular and / or humoral immune response in vivo or in vitro. Such, formulation

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Página 15 de 15 deve ser farmaceuticamente aceitável, podendo estar em qualquer forma, sendo ela sólida, líquida ou aerossol e sua administração pode ser feita por via oral, nasal ou injetável. A formulação além de conter o polipeptídeo quimérico EDIII1-4 do DENV pode conter outras proteínas recombinantes do vírus, como a proteína NS1 proposta nesta invenção (figuras 3 e 4). Além disso, incluir outros peptídeos imunogênicos e adjuvantes.Page 15 of 15 must be pharmaceutically acceptable, and can be in any form, whether solid, liquid or aerosol and its administration can be done orally, nasal or injectable. The formulation, in addition to containing the chimeric polypeptide EDIII1-4 of DENV, may contain other recombinant proteins of the virus, such as the NS1 protein proposed in this invention (figures 3 and 4). In addition, include other immunogenic peptides and adjuvants.

Claims

1. Synthetic deoxyribonucleic acids, characterized by comprising a sequence of nucleotides (as set out in SEQ ID NO: 1) that encode a chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of the four serotypes of the dengue virus;

The plant-optimized codon nucleic acid molecule of claim 1, characterized by comprising a nucleotide sequence that shares similarity with SEQ ID NO: 1 of at least 70%;

The chimeric polypeptide according to claim 1, characterized in that it comprises an amino acid sequence containing domain III of the envelope protein of serotypes 1, 2, 3 and 4 of the dengue virus (SEQ ID NO: 2 and 3);

4. Sequence coding for the chimeric polypeptide containing domain III of the envelope protein of the four serotypes of the dengue virus, according to claim 1, characterized by also comprising a nucleotide sequence that encodes an elastin like polypeptide (ELP), tags for subcellular targeting or a combination thereof;

A plant, its portion, or a plant cell, characterized by expressing the nucleic acid of claim 1;

6. A method for expressing recombinant domain III protein from the DENV envelope in a plant, characterized by including a plant, its

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A portion, or a plant cell containing the nucleic acid of claim 1, to grow the plant, its portion or the plant cell, expressing chimeric polypeptide containing domain III of the DENV envelope protein in said plant;

The method of claim 6, characterized in that, after the expression step, the plant expressed polypeptide is minimally processed, partially purified or purified;

8. Immunogenic composition with or without adjuvant, characterized in that it contains the chimeric polypeptide according to claim 1 or a combination thereof with the non-structural protein 1 of DENV, as established in SEQ ID NO: 4, produced in a plant and a pharmaceutically acceptable carrier;

9. A tetravalent vaccine containing the chimeric polypeptide according to claim 1, characterized by its use being given orally, nasal, injectable;

10. A differential diagnostic method containing chimeric viral polypeptide according to claim 1, characterized by comprising the dengue virus of the four different serotypes and other flaviviruses.